JP2018052842A - Hyaluronan synthase expression promoter, hyaluronan production promoter, and anti-skin aging composition containing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、加齢に伴う皮膚の外観的老化症状（シワ、皮膚のたるみ、肌のハリの低下等）を予防または改善するために有用な組成物に関する。 The present invention relates to a composition useful for preventing or ameliorating skin aging symptoms (wrinkles, sagging skin, reduction of skin elasticity, etc.) associated with aging.
ヒアルロン酸やその塩類は、人の肌を滑らかにしたり、肌のシワを延ばしたりするなどの効果があることから、従来から化粧品や医薬品の成分として使用されている。 Hyaluronic acid and its salts have been conventionally used as ingredients in cosmetics and pharmaceuticals because they have effects such as smoothing human skin and extending wrinkles on the skin.
生体内のヒアルロン酸、特に皮膚内のヒアルロン酸は水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つとして知られており、表皮角化細胞に加え真皮線維芽細胞からも合成されることが知られている。また、真皮のヒアルロン酸の機能として、水分保持、弾力性維持、線維芽細胞の増殖、創傷治癒にも関与していることが知られている（非特許文献１）。 Hyaluronic acid in the body, especially hyaluronic acid in the skin, is known as one of the major extracellular matrices that are deeply involved in moisture retention and viscoelasticity, and is synthesized from dermal fibroblasts in addition to epidermal keratinocytes. It is known that In addition, it is known that the function of hyaluronic acid in the dermis is involved in water retention, elasticity maintenance, fibroblast proliferation, and wound healing (Non-patent Document 1).
生体内でのヒアルロン酸合成は、低分子の原料物質からヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳとも称する）により合成される。生体内のヒアルロン酸合成に関与している酵素は、３つのアイソフォームからなるＨＡＳのみであり、３種それぞれのＨＡＳをコードする遺伝子として、ＨＡＳ１ｍＲＮＡ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ、ＨＡＳ３ｍＲＮＡが知られている。これらのＨＡＳ遺伝子は、ヒト皮膚線維芽細胞とヒト表皮角化細胞で発現パターンが異なり、ヒト皮膚線維芽細胞では主にＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっており（非特許文献１）、またヒト表皮角化細胞ではＨＡＳ３ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっている（非特許文献２）。 Hyaluronic acid synthesis in vivo is synthesized from a low-molecular raw material by hyaluronic acid synthase (hereinafter also referred to as HAS). Only the HAS consisting of three isoforms is involved in the synthesis of hyaluronic acid in vivo, and HAS1 mRNA, HAS2 mRNA, and HAS3 mRNA are known as genes encoding each of the three types of HAS. These HAS genes have different expression patterns between human dermal fibroblasts and human epidermal keratinocytes, and it has been clarified that hyaluronic acid synthesis is regulated mainly through expression of HAS2 mRNA in human dermal fibroblasts. In addition, it has been clarified that hyaluronic acid synthesis is regulated through expression of HAS3 mRNA in human epidermal keratinocytes (Non-patent Document 2).
しかし、ヒアルロン酸は加齢や紫外線照射などによる皮膚の生理的老化に伴い減少することが知られており、真皮内のヒアルロン酸量の減少が、弾力性の低下、シワ形成等の老化現象に関与している可能性が示唆されている（非特許文献３）。 However, hyaluronic acid is known to decrease with physiological aging of the skin due to aging, ultraviolet irradiation, etc., and a decrease in the amount of hyaluronic acid in the dermis causes aging phenomena such as reduced elasticity and wrinkle formation. The possibility of being involved is suggested (Non-patent Document 3).
このような線維芽細胞によるヒアルロン酸等の産生を促進させるために、従来から様々な研究がなされている。例えば、特許文献１には、吹雲草からの抽出物を用いることで、線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進できることが記載されている。また、特許文献２には、ザゼンソウの地上部位から得られた抽出物を用いることで、ヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進した実験結果が示されている。さらに、特許文献３には、マイタケから得られた抽出物を用いることで、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加を介してヒアルロン酸産生を促進した結果が示されている。また特許文献４には、ソウジュツから得られた抽出物を用いることで、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現増加を介してヒアルロン酸産生を促進した結果が示されている。 In order to promote the production of hyaluronic acid and the like by such fibroblasts, various studies have been conventionally conducted. For example, Patent Document 1 describes that hyaluronic acid production of fibroblasts can be promoted by using an extract from Fumosil grass. Patent Document 2 shows the results of an experiment in which hyaluronic acid production of human dermal fibroblasts was promoted by using an extract obtained from a ground part of genus genus. Furthermore, Patent Document 3 shows the result of promoting hyaluronic acid production through increased expression of HAS2 mRNA in human skin fibroblasts by using an extract obtained from maitake. Patent Document 4 shows a result of promoting hyaluronic acid production through increased expression of HAS2 mRNA in human dermal fibroblasts by using an extract obtained from Sojitsu.
本発明は、加齢や紫外線照射などによる皮膚の老化に伴い減少するヒアルロン酸の産生を増加ないし促進することで、シワを防止したり、肌のたるみ及びハリの低下を抑制して外観的老化を改善することが可能なヒアルロン酸合成酵素発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、並びに加齢や紫外線照射に伴う皮膚の上記諸症状の予防または改善に有効な組成物を提供することを目的にする。 The present invention increases or accelerates the production of hyaluronic acid which decreases with aging and ultraviolet irradiation, etc., thereby preventing wrinkles and suppressing the decrease in skin sagging and firmness. It is intended to provide a hyaluronic acid synthase expression promoter, hyaluronic acid production promoter, and a composition effective for preventing or ameliorating the above-mentioned various skin symptoms associated with aging and ultraviolet irradiation. To do.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねていたところ、オイデスモールにヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素（HAS2）のmRNA発現を促進する作用があることを見出し、またこれによって当該皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸の産生を促進させる作用があることを確認し、本発明を完成するに至った。本発明はこれらの知見に基づいて、完成したものであり、下記の実施形態を有するものである。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that Eudesmol has an action of promoting the expression of hyaluronan synthase (HAS2) mRNA in human dermal fibroblasts. As a result, it was confirmed that the skin fibroblasts had an action of promoting hyaluronic acid production, and the present invention was completed. The present invention has been completed based on these findings and has the following embodiments.
（Ｉ）ヒアルロン酸合成酵素（HAS2）発現促進剤及びその用法
（Ｉ−１）オイデスモールを有効成分とするヒアルロン酸合成酵素発現促進剤。
（Ｉ−２）ヒアルロン酸合成酵素がＨＡＳ２である（Ｉ−１）記載のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤。
（Ｉ−３）皮膚細胞にオイデスモールを適用する工程を有する、皮膚細胞内でのヒアルロン酸合成酵素の発現を促進する方法。
（Ｉ−４）上記皮膚細胞が皮膚線維芽細胞である（Ｉ−３）記載のヒアルロン酸合成酵素発現促進方法。
(I) Hyaluronic acid synthase (HAS2) expression promoter and usage thereof (I-1) Hyaluronic acid synthase expression promoter containing eudesmol as an active ingredient.
(I-2) The hyaluronic acid synthase expression promoter according to (I-1), wherein the hyaluronic acid synthase is HAS2.
(I-3) A method for promoting the expression of hyaluronic acid synthase in skin cells, comprising the step of applying eudesmol to skin cells.
(I-4) The method for promoting hyaluronic acid synthase expression according to (I-3), wherein the skin cells are dermal fibroblasts.
（ＩＩ）ヒアルロン酸産生促進剤及びその用法
（ＩＩ−１）オイデスモールを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
（ＩＩ−２）皮膚細胞にオイデスモールを適用する工程を有する、皮膚細胞におけるヒアルロン酸産生を促進する方法。
（ＩＩ−３）上記皮膚細胞が皮膚線維芽細胞である（ＩＩ−２）記載のヒアルロン酸産生促進方法。
(II) Hyaluronic acid production promoter and usage thereof (II-1) Hyaluronic acid production promoter comprising eudesmol as an active ingredient.
(II-2) A method of promoting hyaluronic acid production in skin cells, comprising a step of applying eudesmol to skin cells.
(II-3) The method for promoting hyaluronic acid production according to (II-2), wherein the skin cells are dermal fibroblasts.
（ＩＩＩ）抗皮膚老化用組成物及びその使用方法
（ＩＩＩ−１）オイデスモールを有効成分とする加齢又は紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化症状）を抑制または改善するための組成物（抗皮膚老化用組成物）。
（ＩＩＩ−２）加齢又は紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化）がシワ、肌のたるみ、及びハリの低下からなる群から選択される少なくとも１つである（ＩＩＩ−１）に記載する組成物。
（ＩＩＩ−３）皮膚外用剤である（ＩＩＩ−１）または（ＩＩＩ−２）に記載する組成物。
（ＩＩＩ−４）化粧料である（ＩＩＩ−３）に記載する組成物。
（ＩＩＩ−５）上記（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−４）のいずれかに記載する組成物を皮膚に適用する工程を有する肌劣化症状を抑制または改善する美容方法。
（ＩＩＩ−６）加齢又は紫外線照射による肌劣化（皮膚老化）を抑制または改善する美容方法である（ＩＩＩ−５）に記載する美容方法（アンチエイジング方法）。
（ＩＩＩ−７）肌劣化症状（皮膚老化症状）がシワ、ハリの低下、及び肌のたるみからなる群から選択される少なくとも１つの皮膚老化症状である、（ＩＩＩ−６）に記載する美容方法。
(III) Anti-skin aging composition and method of use thereof (III-1) Composition for suppressing or improving skin deterioration symptoms (skin aging symptoms) due to aging or ultraviolet irradiation, comprising eudesmol as an active ingredient Skin aging composition).
(III-2) The composition described in (III-1), wherein the skin deterioration symptom (skin aging) due to aging or ultraviolet irradiation is at least one selected from the group consisting of wrinkles, sagging skin, and reduced elasticity. object.
(III-3) The composition described in (III-1) or (III-2), which is an external preparation for skin.
(III-4) The composition described in (III-3), which is a cosmetic.
(III-5) A cosmetic method for suppressing or improving a skin deterioration symptom having a step of applying the composition described in any one of (III-1) to (III-4) to the skin.
(III-6) A cosmetic method (anti-aging method) described in (III-5), which is a cosmetic method for suppressing or improving skin deterioration (skin aging) due to aging or ultraviolet irradiation.
(III-7) The cosmetic method according to (III-6), wherein the skin deterioration symptom (skin aging symptom) is at least one skin aging symptom selected from the group consisting of wrinkles, reduced elasticity, and sagging skin. .
本発明によれば、皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を促進することができるヒアルロン酸合成酵素発現促進剤を提供することができる。また本発明によれば、かかる皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素の発現促進を介して、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進させることができるヒアルロン酸産生促進剤を提供することができる。また、本発明によれば、こうしたヒアルロン酸合成酵素発現促進作用に基づいてヒアルロン酸産生促進作用を発揮することで、加齢又は紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化）を改善又は抑制することが可能な抗皮膚老化用組成物、特に皮膚外用剤を提供することが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the hyaluronic acid synthase expression promoter which can accelerate | stimulate the expression of HAS2 mRNA of a skin fibroblast can be provided. Moreover, according to this invention, the hyaluronic acid production promoter which can accelerate | stimulate the hyaluronic acid production of a skin fibroblast through the expression promotion of the hyaluronic acid synthase in this skin fibroblast can be provided. In addition, according to the present invention, by exhibiting hyaluronic acid production promoting action based on such hyaluronic acid synthase expression promoting action, skin deterioration symptoms (skin aging) due to aging or ultraviolet irradiation can be improved or suppressed. It is possible to provide a possible anti-skin aging composition, particularly a skin external preparation.
（Ｉ）ヒアルロン酸合成酵素発現促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤
本発明のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤はいずれもオイデスモール（β-eudesmol）を有効成分とする。
(I) Hyaluronic acid synthase expression promoter, hyaluronic acid production promoter Each of the hyaluronic acid synthase expression promoter and hyaluronic acid production promoter of the present invention contains eudesmol (β-eudesmol) as an active ingredient.
オイデスモールはユーカリや生姜などの植物に含まれている精油成分（セスキテルペノイド）であり、従来胃酸の分泌を抑制して潰瘍を予防するH２ブロッカー様作用、抗血管新生作用、抗菌作用が知られている。 Eudesmol is an essential oil component (sesquiterpenoid) contained in plants such as eucalyptus and ginger, and has traditionally been known for its H2 blocker-like action, antiangiogenic action, and antibacterial action that inhibits gastric acid secretion to prevent ulcers. ing.
本発明のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤におけるオイデスモールの含有割合は、これを皮膚線維芽細胞に適用することで、当該細胞でのヒアルロン酸合成酵素mRNAの発現が促進され、ヒアルロン酸合成酵素量を増加させることができる割合であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではなく、通常０．００００１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素mRNAの発現量の測定及び評価方法は、後述する実験例１に記載の通りであり、この記載に従って実施することができる。なお、ここでヒアルロン酸合成酵素としては、好適にはヒアルロン酸合成酵素２（Hyaluronan Synthase 2：HAS2)を挙げることができる。 The content ratio of eudesmol in the hyaluronic acid synthase expression promoter of the present invention is applied to dermal fibroblasts to promote the expression of hyaluronic acid synthase mRNA in the cells, and the amount of hyaluronic acid synthase The ratio is not particularly limited as long as the ratio can be increased, and can be appropriately selected from the range of 0.00001 to 100% by weight. The method for measuring and evaluating the expression level of hyaluronic acid synthase mRNA in skin fibroblasts is as described in Experimental Example 1 described later, and can be performed according to this description. In addition, as a hyaluronic acid synthase here, hyaluronic acid synthase 2 (HAS2) can be mentioned suitably.
本発明のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤は、後述する抗皮膚老化用組成物、好ましくは皮膚老化を抑制または改善する作用を有する皮膚外用剤を調製するための原料（有効成分含有原料）として用いることができる。また、皮膚細胞、特に皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素（好ましくはHAS2）の発現を促進する方法に好適に使用することができる。かかる方法は、本発明のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤を皮膚細胞に適用することで実施することができる。なお、当該方法はヒアルロン酸合成酵素発現促進剤の有効成分（オイデスモール）が皮膚細胞に浸透すればよく、その限りにおいて皮膚表皮の上から適用する方法であってもよい。 The hyaluronic acid synthase expression promoter of the present invention is used as a raw material (active ingredient-containing raw material) for preparing an anti-skin aging composition described later, preferably a skin external preparation having an action of suppressing or improving skin aging. be able to. Further, it can be suitably used in a method for promoting the expression of hyaluronic acid synthase (preferably HAS2) in skin cells, particularly skin fibroblasts. Such a method can be carried out by applying the hyaluronic acid synthase expression promoter of the present invention to skin cells. In addition, the said method should just apply the active ingredient (eudesmol) of a hyaluronic acid synthase expression promoter to skin cells, and may be the method of applying from the skin epidermis as long as it is.
また本発明のヒアルロン酸産生促進剤におけるオイデスモールの含有割合は、これを皮膚線維芽細胞に適用することで、当該細胞でのヒアルロン酸産生が促進され、ヒアルロン酸量を増加させることができる割合であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではなく、通常０．００００１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸の量の測定及び評価方法は、後述する実験例２に記載の通りであり、この記載に従って実施することができる。 In addition, the content ratio of eudesmol in the hyaluronic acid production promoter of the present invention is a ratio in which hyaluronic acid production in the cells can be promoted and the amount of hyaluronic acid can be increased by applying this to dermal fibroblasts. There is no particular limitation as long as it is limited, and it can be appropriately selected from the range of 0.00001 to 100% by weight. The method for measuring and evaluating the amount of hyaluronic acid in dermal fibroblasts is as described in Experimental Example 2 described later, and can be performed according to this description.
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、後述する抗皮膚老化用組成物、好ましくは皮膚老化を抑制または改善する作用を有する皮膚外用剤を調製するための原料（有効成分含有原料）として用いることができる。また、皮膚細胞、特に皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸の産生を促進する方法に好適に使用することができる。かかる方法は、本発明のヒアルロン酸産生促進剤を上記皮膚細胞に適用することで実施することができる。なお、当該方法はヒアルロン酸産生促進剤の有効成分（オイデスモール）が皮膚細胞に浸透すればよく、その限りにおいて皮膚表皮の上から適用する方法であってもよい。 The hyaluronic acid production promoter of the present invention is used as a raw material (active ingredient-containing raw material) for preparing an anti-skin aging composition described later, preferably a skin external preparation having an action of suppressing or improving skin aging. it can. Moreover, it can use suitably for the method of promoting the production of hyaluronic acid in skin cells, particularly skin fibroblasts. Such a method can be carried out by applying the hyaluronic acid production promoter of the present invention to the skin cells. In addition, the said method should just apply the active ingredient (eudesmol) of a hyaluronic acid production promoter to skin cells, and may be the method of applying from the skin epidermis as long as it is.
本発明のヒアルロン酸合成酵素発現促進剤及びヒアルロン酸産生促進剤は、オイデスモールを精製された状態で含むものであってもよいが、前述するように、オイデスモールはユーカリや生姜などの植物に含まれている精油成分（セスキテルペノイド）であるため、オイデスモールをオイデスモール含有植物から粗精製した状態で含むものであってもよい。粗精製物としては、上記するオイデスモール含有植物のオイデスモール含有画分（セスキテルペノイド含有画分）、特にオイデスモールを含有する精油を挙げることができる。好ましくは精製されたオイデスモールであるか、またはオイデスモールを分画し濃縮した状態で含むオイデスモール含有画分である。 The hyaluronic acid synthase expression promoter and hyaluronic acid production promoter of the present invention may contain eudesmol in a purified state, but as described above, eudesmol is added to plants such as eucalyptus and ginger. Since it is an essential oil component (sesquiterpenoid) contained, it may contain eudesmol in a state of being roughly purified from an eudesmol-containing plant. Examples of the crude product include an eudesmol-containing fraction of the above-described eudesmol-containing plant (sesquiterpenoid-containing fraction), particularly an essential oil containing eudesmol. Preferably, it is a purified eudesmol or an eudesmol-containing fraction containing eudesmol in a fractionated and concentrated state.
（ＩＩ）抗皮膚老化用組成物
本発明の抗皮膚老化用組成物は、ヒト皮膚線維芽細胞のＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を増加させることで、ヒアルロン酸産生を促進し、これによって加齢や紫外線照射によるヒアルロン酸の減少により生じる外観変化（肌劣化症状）を抑制し、あるいは改善する作用を奏するものである。また、本発明の抗皮膚老化用組成物は、皮膚に適用した場合の使用感及び安全性にも優れた組成物である。
(II) Anti-skin aging composition The anti-skin aging composition of the present invention promotes hyaluronic acid production by increasing the expression of HAS2 mRNA in human skin fibroblasts, thereby aging or ultraviolet irradiation. It has the effect of suppressing or improving appearance changes (skin deterioration symptoms) caused by a decrease in hyaluronic acid. In addition, the anti-skin aging composition of the present invention is a composition having excellent usability and safety when applied to the skin.
ここで加齢または紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化症状）としては、真皮層内に存在する間質成分であるヒアルロン酸の減少に起因して生じる真皮じわ、肌のたるみ、及び肌のハリ低下からなる群より選択される少なくとも１つの症状を挙げることができる。 Here, skin deterioration symptoms due to aging or ultraviolet irradiation (skin aging symptoms) include dermis wrinkles, sagging skin caused by a decrease in hyaluronic acid, which is an interstitial component present in the dermis layer, and skin sag. Mention may be made of at least one symptom selected from the group consisting of reduced elasticity.
本発明の抗皮膚老化用組成物中に含まれるオイデスモールの割合は、皮膚線維芽細胞のHAS2mRNAの発現を促進増加させる作用、並びに皮膚線維芽細胞でのヒアルロン酸産生を促進し増加させる作用を有し、その作用に基づいて、加齢または紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化症状）が抑制または／および改善できる量であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。通常、０．００００１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは０．０００１〜３０重量％、より好ましくは０．００１〜２０重量％である。 The ratio of eudesmol contained in the anti-skin aging composition of the present invention has the effect of promoting and increasing the expression of HAS2 mRNA in dermal fibroblasts, and the action of promoting and increasing hyaluronic acid production in dermal fibroblasts. As long as it has an amount that can suppress or / and improve skin deterioration symptoms (skin aging symptoms) due to aging or ultraviolet irradiation, it is not particularly limited. Usually, it can select suitably from the range of 0.00001-100 weight%. Preferably it is 0.0001 to 30 weight%, More preferably, it is 0.001 to 20 weight%.
本発明の組成物には、本発明の効果を妨げないことを限度として他の成分を配合することができる。かかる成分は、本発明の組成物が医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品からなる群から選択されるいずれの組成物であるか、またその剤型（固形状、半固形状、液状、乳液状等）によっても異なり、各種の態様に応じて、適宜選択し設定することができる。 The composition of the present invention can contain other components as long as the effects of the present invention are not hindered. The component is any composition selected from the group consisting of pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and foods and beverages, and its dosage form (solid, semi-solid, liquid Depending on various aspects, and can be appropriately selected and set.
例えば、オイデスモール以外のヒアルロン酸合成酵素発現促進作用を有する物質、または／及びヒアルロン酸産生促進作用を有する物質を組み合わせて配合することもできる。かかる成分としては、制限されないが、前述するように吹雲草、ザゼンソウ、及びマイタケなどの植物抽出物を挙げることができる。 For example, a substance other than eudesmol having a hyaluronic acid synthase expression promoting action and / or a substance having a hyaluronic acid production promoting action may be combined. Such components include, but are not limited to, plant extracts such as blown grass, zelkova, and maitake as described above.
また本発明の組成物が外用の医薬品、医薬部外品または化粧品（これらを総称して「皮膚外用剤」ともいう）である場合、さらに皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）を配合してもよい。皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）としては、オイデスモールの経皮浸透性を高め、皮膚細胞への吸収を促進する作用を有するものを使用することができる。かかるものとして、例えば、各種の界面活性剤（アニオン性、カチオン性、ノニオン性界面活性剤）、脂肪酸・脂肪酸エステル（オレイン酸、ミリスチン酸イソプロピル、中鎖脂肪酸トリグリセライド等）、生分解性促進剤（アルキルエステル、アミノカプロン酸）、その他、アミノ酸、テルペン類、ピロリドン類、尿素、リン脂質、各種の溶媒（ポリオール、低級アルコール、高級アルコール、ジメチルスルフォキシド等）を制限なく例示することができる。 Further, when the composition of the present invention is an externally used pharmaceutical, quasi-drug or cosmetic (collectively referred to as “skin external preparation”), a skin absorption enhancer (skin penetration enhancer) is further added. Also good. As a skin absorption enhancer (skin penetration enhancer), one having an action of enhancing the transdermal permeability of eudesmol and promoting absorption into skin cells can be used. For example, various surfactants (anionic, cationic, nonionic surfactants), fatty acids / fatty acid esters (oleic acid, isopropyl myristate, medium chain fatty acid triglycerides, etc.), biodegradable accelerators ( Alkyl esters, aminocaproic acid), amino acids, terpenes, pyrrolidones, urea, phospholipids, various solvents (polyol, lower alcohol, higher alcohol, dimethyl sulfoxide, etc.) can be exemplified without any limitation.
オイデスモールをかかる皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）と併用することで、オイデスモールを効率的に真皮層に到達させることができ、当該真皮層においてより有効に皮膚線維芽細胞に働きかけることができ、本発明の効果を発揮させることができる。制限されないものの、本発明の抗皮膚老化用組成物中、当該皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）は、０．５〜７０重量％の範囲で配合することができる。 By using Eudesmol together with such a skin absorption enhancer (skin penetration enhancer), Eudesmol can efficiently reach the dermis layer, and it can work on skin fibroblasts more effectively in the dermis layer. And the effects of the present invention can be exhibited. Although it does not restrict | limit, the said skin absorption enhancer (skin penetration enhancer) can be mix | blended in the range of 0.5 to 70 weight% in the composition for anti-skin aging of this invention.
本発明の組成物は、その使用目的（医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品）及び投与経路等に応じて、固形剤、半固形剤、液剤、乳液剤、クリーム剤等の各種剤形の組成物に調製することが可能である。 The composition of the present invention has various dosage forms such as solid preparations, semi-solid preparations, solutions, emulsions, creams, etc., depending on the intended use (pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food and drink) and administration routes. It is possible to prepare the composition.
外用の医薬品または医薬部外品としての形態としては、例えば、硬膏剤、軟膏剤、クリーム剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、乳液剤、液剤、エアゾール剤を挙げることができる。好ましくは、制限されないものの、使用感の良さ（しっとり感が良く、べたつき感が少ない）から、乳液やクリーム等の乳化物の製剤形態を有する組成物である。 Examples of the form as an external medicine or quasi-drug include plasters, ointments, creams, poultices, liniments, lotions, emulsions, liquids, and aerosols. Although it is not limited, it is a composition having a preparation form of an emulsion such as an emulsion or cream because of a good feeling of use (moist feeling and less sticky feeling).
化粧品としての形態は特に限定されるものではないが、例えばスキンケア化粧品として化粧水、美容液、パック、マッサージクリーム、乳液、モイスチャークリーム、リップクリーム等；メーキャップ化粧品としてファンデーション、白粉、口紅、ほほ紅、アイシャドウ等とすることができる。上記化粧品には、一般に化粧品に用いられている各種化粧品成分を適宜配合することができる。好ましくは、制限されないものの、上記の理由から乳液やクリーム等の乳化物の形態を有する組成物である。 The form as a cosmetic is not particularly limited. For example, skin care cosmetics such as lotion, beauty liquid, pack, massage cream, milky lotion, moisture cream, lip balm, etc .; makeup cosmetics such as foundation, white powder, lipstick, cheek red It can be an eye shadow or the like. Various cosmetic ingredients generally used in cosmetics can be appropriately blended in the cosmetic. Although it is not limited, it is preferably a composition having a form of an emulsion such as a milky lotion or a cream for the above reasons.
本発明の組成物には、所望の効果を損なわない範囲で、通常の外用組成物に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、アミノ酸類、ビタミン類、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、抗炎症剤、抗しわ剤、肌荒れ改善剤、ニキビ用薬剤、アルカリ類、キレート剤の成分を配合することもできる。 In the composition of the present invention, fats and oils, waxes, hydrocarbons, fatty acids, alcohols, esters, amino acids, which are components used in ordinary external compositions, as long as the desired effects are not impaired. Vitamins, surfactants, pH adjusters, antiseptics, fragrances, moisturizers, powders, UV absorbers, thickeners, pigments, antioxidants, whitening agents, anti-inflammatory agents, anti-wrinkle agents, rough skin improvers Ingredients for acne, alkalis and chelating agents can also be blended.
また本発明の組成物は皮膚の深部（真皮層）にまでオイデスモールが浸透するような形態を有していてもよい。かかる形態としては、制限されないものの、リポソーム形態、マイクロエマルション形態、またはマイクロニードル形態を例示することができる（例えば、最新・化粧品の機能創製・素材開発・応用技術（技術教育出版社発行）288-293頁、及び日本香粧品学会誌（40周年記念誌）39巻, 2015, 112-115頁等参照）。本発明の組成物を例えばリン脂質でできたナノカプセルに封入して調製してリポソーム形態に調製したり、また各種の界面活性剤を利用することでW/O型、O/W型またはW/O/W型のマイクロエマルション形態にすることで、本発明の組成物を皮膚への浸透（吸収）を高め、オイデスモールを真皮層にまで到達しやすくすることができる。また本発明の組成物そのものをマイクロニードル形態に調製しそれを皮膚に貼付するか、または本発明の組成物を例えばシリコン、金属、または生分解性高分子により形成された長さ15μm程度の微細な針を用いて皮膚に適用することで、本発明の組成物に含まれるオイデスモールを皮膚の深部（真皮層）にまで効率的に浸透（到達）させることが可能になる（例えば、COSME TECH JAPAN, Vol.1, No.5(2011), 20-24等参照）。 Further, the composition of the present invention may have a form in which Eudesmol penetrates deep into the skin (dermis layer). Examples of such forms include, but are not limited to, liposome form, microemulsion form, or microneedle form (for example, latest functional creation / material development / applied technology (published by Technical Education Publishing Company) 288- 293 pages, and Journal of the Japan Cosmetic Science Society (40th Anniversary Magazine) 39, 2015, pages 112-115). The composition of the present invention is prepared, for example, by encapsulating in a nanocapsule made of phospholipid to prepare a liposome form, or by using various surfactants, W / O type, O / W type or W By making the form of the / O / W type microemulsion, the penetration (absorption) of the composition of the present invention into the skin can be enhanced, and the eudesmol can easily reach the dermis layer. Alternatively, the composition of the present invention itself is prepared in the form of a microneedle and affixed to the skin, or the composition of the present invention is made of a fine material having a length of about 15 μm formed of, for example, silicon, metal, or a biodegradable polymer. By applying to the skin using a simple needle, it becomes possible to efficiently penetrate (reach) the eudesmol contained in the composition of the present invention to the deep part (dermis layer) of the skin (for example, COSME TECH JAPAN, Vol.1, No.5 (2011), 20-24 etc.).
さらにまた本発明の組成物は、皮膚の深部（真皮層）にまでオイデスモールが効率的に浸透するような物理的方法を用いて、皮膚に適用することもできる。かかる方法としては、制限されないものの、閉鎖密封法（ODT：Occulusive Dressing Therapy）、エレクトロポレーション、及びソノフォレーシスを例示することができる（例えば、ファルマシア,49巻,5号,(2013),pp.400-404；および「皮膚科学 考え方学び方」金原出版株式会社、平成2年6月10日発行,p.29等）。なお、閉鎖密封法は外用剤の塗布部分をプラスチックやラップなどで覆うことにより（半日〜２日）、角質層をふやけさせ、これにより角質細胞を膨潤、角質細胞間脂質の水分量を増加させることにより角質バリア機能を低下させ、経皮吸収性を増加させる方法である。またこの際、加温すると温熱効果により血流が増加しさらに経皮吸収性を増加させることができる。また、エレクトロポレーションは、高い電圧を短時間に適用し、可逆的な穴を皮膚に形成させることで、皮膚に適用した組成物の経皮吸収を促進する方法である。また、ソノフォレーシスは、超音波振動を利用して皮膚に微細な穴を空けて皮膚に適用した組成物の経皮吸収を促進する方法である。 Furthermore, the composition of the present invention can be applied to the skin using a physical method in which Eudesmol efficiently penetrates deep into the skin (dermis layer). Examples of such methods include, but are not limited to, Occulusive Dressing Therapy (ODT), electroporation, and sonophoresis (eg, Pharmacia, Vol. 49, No. 5, (2013), pp. 400). -404; and "How to learn dermatological thinking" published by Kanbara Publishing Co., Ltd., June 10, 1990, p.29). In addition, the closed sealing method covers the application part of the external preparation with plastic or wrap (half day to 2 days) to swell the stratum corneum, thereby swelling the corneocytes and increasing the water content of the corneocyte lipids. This is a method for decreasing the keratin barrier function and increasing the transdermal absorbability. At this time, when heated, the blood flow increases due to the thermal effect, and the transdermal absorbability can be further increased. Electroporation is a method for promoting percutaneous absorption of a composition applied to the skin by applying a high voltage in a short time to form a reversible hole in the skin. In addition, sonophoresis is a method of promoting transdermal absorption of a composition applied to the skin by making fine holes in the skin using ultrasonic vibration.
（III）肌劣化症状（皮膚老化症状）を抑制または改善する美容方法
また本発明は、加齢または紫外線照射による肌劣化症状（皮膚老化症状）を有する被験者に対して、オイデスモールを有効成分とする組成物を適用し、当該被験者の上記肌劣化症状を抑制または改善する美容方法に関する。なお、本発明が対象とする方法は、美容方法であり、ヒトに対する治療方法ではない。
(III) A cosmetic method for suppressing or improving skin deterioration symptoms (skin aging symptoms), and the present invention provides eudesmol as an active ingredient for subjects having skin deterioration symptoms (skin aging symptoms) due to aging or ultraviolet irradiation. The present invention relates to a cosmetic method for applying a composition to suppress or improve the above skin deterioration symptoms of the subject. Note that the method targeted by the present invention is a cosmetic method, not a treatment method for humans.
加齢または紫外線照射による肌劣化症状としては、真皮じわ、肌のたるみ及びハリ低下からなる群から選択される少なくとも１つの症状を挙げることができる。ここで肌のたるみ及びハリ低下は、真皮層に存在する間質成分（ヒアルロン酸）の量の減少に伴って生じる肌のたるみ及びハリ低下を意味し、真皮じわは当該間質成分の減少に起因して生じるしわ（大しわ、深いしわ）を意味する。 Examples of the skin deterioration symptom caused by aging or ultraviolet irradiation include at least one symptom selected from the group consisting of dermis wrinkles, skin sagging and firmness reduction. Here, skin sagging and firmness reduction mean skin sagging and firmness caused by a decrease in the amount of interstitial component (hyaluronic acid) present in the dermis layer. It means wrinkles (large wrinkles, deep wrinkles) caused by
対象とする被験者は、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を有する者、好ましくは加齢による肌劣化症状（肌老化症状）を有する者である。通常、男女ともに３０歳を超えると当該該当の被験者になる可能性がある。好ましくは４０歳以上、より好ましくは４５歳以上、さらに好ましくは５０歳以上である。 The test subjects are those who have skin deterioration symptoms due to aging or ultraviolet irradiation, preferably those who have skin deterioration symptoms due to aging (skin aging symptoms). In general, if both men and women are over 30 years old, there is a possibility of becoming the subject concerned. Preferably it is 40 years old or more, More preferably, it is 45 years old or more, More preferably, it is 50 years old or more.
ここで、オイデスモールを有効成分とする組成物としては、上記（II）で説明した本発明の組成物を好適に挙げることができる。これらの組成物には医薬品、医薬部外品、化粧品及び飲食品が含まれる。 Here, as the composition containing eudesmol as an active ingredient, the composition of the present invention described in the above (II) can be preferably mentioned. These compositions include pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and foods and drinks.
外用の医薬品、医薬部外品及び化粧品は、その形態によっても異なるが、硬膏、軟膏、クリーム、リニメント、ローション、乳液、液、エアゾール等の形態を有する場合、当該外用医薬部外品及び化粧品を被験者の所望の部位の皮膚に塗布または噴霧することによって使用することができる。また外用の医薬品、医薬部外品及び化粧品がパップ剤の形態を有する場合、当該外用の医薬品、医薬部外品及び化粧品を被験者の所望の部位の皮膚に貼付することによって使用することができる。皮膚への適用は、１日１回または複数回行ってよく、例えば朝と晩（寝る前）に適用する方法を挙げることができる。 External medicines, quasi-drugs, and cosmetics vary depending on their forms, but if they have forms such as plasters, ointments, creams, liniments, lotions, emulsions, liquids, aerosols, etc. It can be used by applying or spraying on the skin of a desired site of a subject. Moreover, when external medicine, a quasi-drug, and cosmetics have the form of a poultice, it can be used by sticking the external medicine, a quasi-drug, and a cosmetic to the skin of a desired part of a subject. Application to the skin may be performed once or a plurality of times a day, and examples thereof include a method of applying in the morning and evening (before going to bed).
飲食品には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、及び液剤（ドリンク剤）など製剤形態を有するサプリメント、並びに機能性表示食品及び特定保健用食品が含まれる。服用は、１日に１回または複数回行ってよく、例えば朝と晩（寝る前）に服用する方法を挙げることができる。 The foods and drinks include supplements having pharmaceutical forms such as tablets, capsules, granules, powders, and liquids (drinks), functional display foods, and foods for specified health use. The dosing may be performed once or a plurality of times a day, and examples thereof include a method of taking in the morning and evening (before going to bed).
斯くして加齢または紫外線照射による肌劣化症状（特に肌老化症状）の発生を抑制し（予防）、また改善することが可能になる。 Thus, it is possible to suppress (prevent) and improve the occurrence of skin deterioration symptoms (particularly skin aging symptoms) due to aging or ultraviolet irradiation.
以下、本発明を実験例及び実施例に基づいて説明する。但し、当該実験例及び実施例は、本発明の一例であり、本発明はこれらの実験例や実施例に制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described based on experimental examples and examples. However, the experimental examples and examples are examples of the present invention, and the present invention is not limited to these experimental examples and examples.
実験例１ ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用評価試験
オイデスモールについて、以下のようにしてヒアルロン酸合成酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。オイデスモールは、和光純薬工業（株）から購入したβ−eudesmolを使用した。
Experimental Example 1 HAS2 mRNA expression promoting effect evaluation test Eudesmol was tested for hyaluronic acid synthase mRNA expression promoting action as follows. Eudesmol used β-eudesmol purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
（１）細胞培養と試料の添加
0.5％FBS（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、GIBCO社製)を含むDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、直径35mmディッシュ5枚に、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ2×105個となるように播種し、37℃、5％CO2の下で一晩培養した。
(1) Cell culture and sample addition
Using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO) medium containing 0.5% FBS (Fetal bovine serum, GIBCO), normal human skin fibroblasts (NHDF) (Manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) was seeded so as to be 2 × 10 5 cells each, and cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 .
また、オイデスモールを、各0.125、0.25，及び0.5mg/mLの濃度になるようにDMSOとPBSの混合液（容量比50:50）に溶解し、さらにこれを、0.5％FBSを含むDMEM培地に、当該培地量の1/100量になるように溶解し、これらをそれぞれ実施例１〜３の被験試料（被験試料１〜３）とした。また、対照例１として、0.5％FBSを含むDMEM培地に、オイデスモールを溶解しないDMSOとPBSの混合液(容量比50:50)を、培地量の1/100量になるように添加した試料（対照試料１）を準備した。 Eudesmol was dissolved in a mixture of DMSO and PBS (volume ratio 50:50) to a concentration of 0.125, 0.25, and 0.5 mg / mL, and this was further added to DMEM medium containing 0.5% FBS. Then, they were dissolved so as to be 1/100 of the amount of the medium, and these were used as test samples (test samples 1 to 3) of Examples 1 to 3, respectively. In addition, as a control example 1, a sample solution in which DMSO and PBS mixture (volume ratio 50:50) that does not dissolve eudesmol was added to DMEM medium containing 0.5% FBS so as to be 1/100 volume of the medium volume. (Control sample 1) was prepared.
ヒト皮膚線維芽細胞の培養から24時間後、被験試料１〜３または対照試料１を、それぞれ上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したディッシュに2 mLずつ添加し、37℃で、5％CO2の下でさらに24時間培養した。 24 hours after culturing human dermal fibroblasts, test samples 1 to 3 or control sample 1 were each added to each 2 mL dish in which normal human dermal fibroblasts were seeded, and at 37 ° C., 5% CO 2. Incubate under 2 for an additional 24 hours.
培養終了後、総RNAを抽出した。総RNAの抽出は、ディッシュから培地を吸引除去した後、Rneasy Mini Kit（QIAGEN製）を用いて、当該キットの操作マニュアルに従って行った。 After completion of the culture, total RNA was extracted. Extraction of total RNA was performed using the Rneasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the operation manual of the kit after removing the medium from the dish by suction.
（２）ｃＤＮＡの合成
cDNAの合成は、cDNA合成キット（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,ライフテクノロジーズ社製）及びマスターサイクラー（ep realplex，エッペンドルフ社製）を使用して行った。具体的には、上記抽出により得られた総RNA（40ng/μL）を、被験試料１〜３及び対照試料1をそれぞれ10μLずつ用いて、cDNA合成キットの使用マニュアルに従って反応液を調製し、マスターサイクラーにより25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5分間反応させ、HAS2mRNA発現量を測定するリアルタイムPCRの鋳型に使用するcDNAを合成した。
(2) cDNA synthesis
cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Life Technologies) and a master cycler (ep realplex, Eppendorf). Specifically, using the total RNA (40 ng / μL) obtained by the above extraction, 10 μL each of test samples 1 to 3 and control sample 1, prepare a reaction solution according to the cDNA synthesis kit use manual, A cycler was reacted at 25 ° C. for 10 minutes, 37 ° C. for 120 minutes, and 85 ° C. for 5 minutes to synthesize cDNA to be used as a template for real-time PCR for measuring the expression level of HAS2 mRNA.
（３）サイバーグリーン法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
HAS2遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：5’-ACAGACAGGCTGAGGACGACTT-3’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5’-AAGCAGCTGTGATTCCAAGGA-3’（配列番号２）
また、内部標準としてのGAPDH遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：5’-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5’-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3’（配列番号４）
被験試料１〜３及び対照試料１のそれぞれについて、培養細胞から調製したcDNAについて、上記プライマーセットを使用して、リアルタイムPCR装置（Applied Biosystems 7500 FastリアルタイムPCRシステム，ライフテクノロジーズ社製）及びリアルタイムPCRキット（Fast SYBR Green Master Mi、ライフテクノロジーズ社製）によりリアルタイムPCR反応を行った。反応は、95℃で20秒間保温の後、95℃で3秒間、60℃で30秒間の反応を40サイクル繰り返し、１サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量を測定した。
(3) Real-time PCR reaction using the Cyber Green method
As primers for amplifying the HAS2 gene, sense primers and antisense primers having the following sequences were used.
Sense primer: 5'-ACAGACAGGCTGAGGACGACTT-3 '(SEQ ID NO: 1)
Antisense primer: 5'-AAGCAGCTGTGATTCCAAGGA-3 '(SEQ ID NO: 2)
In addition, sense primers and antisense primers having the following sequences were used as GAPDH gene amplification primers as internal standards.
Sense primer: 5'-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 3)
Antisense primer: 5'-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3 '(SEQ ID NO: 4)
For each of the test samples 1 to 3 and the control sample 1, for the cDNA prepared from the cultured cells, using the above primer set, a real-time PCR device (Applied Biosystems 7500 Fast real-time PCR system, manufactured by Life Technologies) and a real-time PCR kit (Fast SYBR Green Master Mi, manufactured by Life Technologies) was used for real-time PCR reaction. The reaction was held at 95 ° C. for 20 seconds, followed by 40 cycles of 95 ° C. for 3 seconds and 60 ° C. for 30 seconds, and the amount of luminescence of the cyber green dye was measured for each cycle.
（４）解析
各サイクルごとのサイバーグリーン色素の発光量にもとづいて、HAS2及びGAPDHのそれぞれをコードするDNA断片の増幅曲線を作成し、GAPDHを内部標準遺伝子として、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて上記発光量を相対的に定量した（Applied Biosystems User Bulletin #2．11−15，2001参照）。
(4) Analysis Based on the amount of luminescence of the cyber green dye for each cycle, create amplification curves of DNA fragments encoding HAS2 and GAPDH, and use the comparative Ct method (ΔΔCt method) with GAPDH as an internal standard gene. The amount of luminescence was relatively quantified (see Applied Biosystems User Bulletin # 2.11-15, 2001).
以上の試験を、被験試料１〜３（実施例１〜３）及び対照試料１（対照例１）について、それぞれ３回行った。そして、対照試料１（オイデスモールを含有しない対照）のHAS2mRNA発現量の平均値を基準（100とする）とし、被験試料１〜３におけるHAS2mRNA発現量の換算値にもとづいて、HAS2mRNA発現量（相対値）を算出した。結果を表１に示す。同表において、各実施例のHAS2mRNA発現量は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。 The above test was performed three times for each of test samples 1 to 3 (Examples 1 to 3) and control sample 1 (Control Example 1). Then, using the average value of HAS2 mRNA expression level of control sample 1 (control not containing eudesmol) as a reference (100), based on the converted value of HAS2 mRNA expression level in test samples 1 to 3, the HAS2 mRNA expression level (relative Value). The results are shown in Table 1. In the same table, the expression level of HAS2 mRNA in each example represents an average value obtained by performing three tests.
表1に示すように、試料添加濃度が0μg/mLの場合（対照例１）のHAS2mRNA発現量を100％とすると、試料添加濃度が1.25μg/mLの場合のHAS2mRNA発現量は122％、試料添加濃度が2.5μg/mLの場合のHAS2mRNA発現量は294％、試料添加濃度が5μg/mLの場合のHAS2mRNA発現量は305％であった。これらの結果から、ヒト皮膚線維芽細胞にオイデスモールを作用させることで、用量依存的にヒアルロン酸合成酵素のmRNA発現が促進されることが判明した。特に、オイデスモール1μg/mL以上の濃度で有意にHAS2mRNA発現を促進することが認められた。 As shown in Table 1, assuming that the HAS2 mRNA expression level is 100% when the sample addition concentration is 0 μg / mL (control example 1), the HAS2 mRNA expression level is 122% when the sample addition concentration is 1.25 μg / mL. The HAS2 mRNA expression level when the addition concentration was 2.5 μg / mL was 294%, and the HAS2 mRNA expression level when the sample addition concentration was 5 μg / mL was 305%. From these results, it was found that mRNA expression of hyaluronan synthase is promoted in a dose-dependent manner by allowing Eudesmol to act on human skin fibroblasts. In particular, it was found that HAS2 mRNA expression was significantly promoted at a concentration of Eudesmol of 1 μg / mL or more.
実験例２ ヒアルロン酸産生促進作用評価試験
オイデスモール（和光純薬工業（株）製）について、以下のようにしてヒアルロン酸産生促進作用を試験した。
Experimental Example 2 Hyaluronic acid production promoting action evaluation test Eudesmol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was tested for hyaluronic acid production promoting action as follows.
（１）細胞培養と試料の添加
0.5％FBS（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum)、GIBCO社製）を含むDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium、GIBCO社製）培地を用いて、24ウェルプレートに、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ１ウェルあたり8×104個となるように播種し、37℃、5％CO2の下で一晩培養した。
(1) Cell culture and sample addition
Normal human skin fibroblasts (NHDF, Kurashiki) were added to 24-well plates using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO) containing 0.5% FBS (Fetal bovine serum, GIBCO). Spinning Co., Ltd.) was seeded at 8 × 10 4 cells per well and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
また、オイデスモールを、各0.125、0.25，及び0.5mg/mLの濃度になるようにDMSOとPBSの混合液（容量比50:50）に溶解し、さらにこれを、0.5％FBSを含むDMEM培地に、当該培地量の1/100量になるように溶解し、これらをそれぞれ実施例４〜６の被験試料（被験試料４〜６）とした。また、対照例２として、0.5％FBSを含むDMEM培地に、オイデスモールを溶解しないDMSOとPBSの混合液(容量比50:50)を、培地量の1/100量になるように添加した試料（対照試料２）を準備した。 Eudesmol was dissolved in a mixture of DMSO and PBS (volume ratio 50:50) to a concentration of 0.125, 0.25, and 0.5 mg / mL, and this was further added to DMEM medium containing 0.5% FBS. Then, they were dissolved so as to be 1/100 of the amount of the medium, and these were used as test samples of Examples 4 to 6 (test samples 4 to 6), respectively. In addition, as a control example 2, a sample solution in which DMSO and PBS mixture (volume ratio 50:50) that does not dissolve eudesmol was added to a DMEM medium containing 0.5% FBS so as to be 1/100 volume of the medium volume. (Control sample 2) was prepared.
ヒト皮膚線維芽細胞の培養から24時間後、被験試料４〜６または対照試料２を、それぞれ上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したディッシュに500μLずつ添加し、37℃で、5％CO2の下でさらに48時間培養した。 24 hours after culturing human dermal fibroblasts, test samples 4 to 6 or control sample 2 were added to each dish in which normal human dermal fibroblasts were seeded, 500 μL each, and at 37 ° C., 5% CO 2. And further cultured for 48 hours.
（２）ヒアルロン酸の測定
培養終了後、被験試料４〜６及び対照試料２ごとに、培養上清を回収してプロナーゼ処理を行った後、ヒアルロン酸結合タンパクを用いたサンドイッチELISA法により、培養上清中のヒアルロン酸量を測定した。同時に細胞数を計測し、細胞当たり（1×104個当たり）のヒアルロン酸産生量を算出した。プロナーゼ処理、サンドイッチELISA法、及び細胞数の計測は、一般的な手法により行った。
(2) Measurement of hyaluronic acid After completion of the culture, the culture supernatant was collected and treated with pronase for each of test samples 4 to 6 and control sample 2, and then cultured by sandwich ELISA using hyaluronic acid binding protein. The amount of hyaluronic acid in the supernatant was measured. At the same time, the number of cells was counted, and the amount of hyaluronic acid produced per cell (per 1 × 10 4 cells) was calculated. Pronase treatment, sandwich ELISA, and cell count were performed by general techniques.
以上の試験を、被験試料４〜６（実施例４〜６）及び対照試料２（対照例２）について、それぞれ３回行った。そして、対照例２（試料を含有しない対照）のヒアルロン酸産生量の平均値を基準とし、各実施例におけるヒアルロン酸産生量の換算値にもとづいて、ヒアルロン酸産生量を算出した。その結果を表２に示す。同表において、各実施例のヒアルロン酸産生量は、それぞれ３回の試験を実施して得られた平均値を示している。 The above test was performed three times for each of the test samples 4 to 6 (Examples 4 to 6) and the control sample 2 (Control Example 2). And based on the converted value of the hyaluronic acid production amount in each Example, the hyaluronic acid production amount in each Example was calculated based on the average value of the hyaluronic acid production amount of Control Example 2 (control containing no sample). The results are shown in Table 2. In the same table, the amount of hyaluronic acid produced in each example represents an average value obtained by performing three tests.
表２に示すように、オイデスモール添加濃度が0μg/mLの場合（対照例２）のヒアルロン酸産生量を100％とすると、オイデスモール添加濃度が1.25μg/mLの場合のヒアルロン酸産生量は119％、試料添加濃度が2.5μg/mLの場合のヒアルロン酸産生量は169％、試料添加濃度が5μg/mLの場合のヒアルロン酸産生量は202％であった。 As shown in Table 2, assuming that the hyaluronic acid production amount is 100% when the eudesmol addition concentration is 0 μg / mL (control example 2), the hyaluronic acid production amount when the eudesmol addition concentration is 1.25 μg / mL is When the sample addition concentration was 2.5 μg / mL, the production amount of hyaluronic acid was 169%, and when the sample addition concentration was 5 μg / mL, the hyaluronic acid production amount was 202%.
これらの結果から、ヒト皮膚線維芽細胞にオイデスモールを作用させることで、用量依存的にヒアルロン酸産生が促進され、その量が増加することが判明した。特に、オイデスモール1μg/mL以上の濃度で有意に高いヒアルロン酸産生促進作用が認められた。なお、試験した濃度範囲内において細胞毒性は認められなかった。 From these results, it was found that when eudesmol is allowed to act on human dermal fibroblasts, hyaluronic acid production is promoted in a dose-dependent manner and the amount thereof is increased. In particular, a significantly high hyaluronic acid production promoting effect was observed at a concentration of Eudesmol of 1 μg / mL or more. No cytotoxicity was observed within the concentration range tested.
以上の通り、本発明のHAS2mRNA発現促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤によれば、ヒト線維芽細胞におけるHAS2mRNAの発現を促進することができ、またヒト線維芽細胞にヒアルロン酸産生を大きく促進できることが明らかとなった。したがって、これらのHAS2mRNA発現促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤を配合してなる組成物、特に皮膚外用剤によれば、ヒト皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生を促進することにより、皮膚の老化に伴う外観変化（肌劣化症状）を改善できることがわかる。 As described above, the HAS2 mRNA expression promoter and hyaluronic acid production promoter of the present invention can promote the expression of HAS2 mRNA in human fibroblasts, and can greatly promote hyaluronic acid production in human fibroblasts. Became clear. Therefore, according to a composition comprising these HAS2 mRNA expression promoter or hyaluronic acid production promoter, particularly a skin external preparation, it accompanies aging of the skin by promoting hyaluronic acid production of human skin fibroblasts. It can be seen that appearance changes (skin deterioration symptoms) can be improved.
実験例３ 使用感評価試験
表３に記載する組成からなるクリーム状の外用組成物（クリーム剤）を調製し、使用感（べたつき感、しっとり感）を評価した。なお、表３の組成の単位は「ｇ」である。
Experimental Example 3 Usability Evaluation Test A creamy external composition (cream agent) having the composition described in Table 3 was prepared and evaluated for use feeling (stickiness, moist feeling). The unit of composition in Table 3 is “g”.
使用感の評価は専門パネル10名で行った。具体的には、各クリーム剤の１回適量を上腕内側部に塗布し、塗った直後の使用感（べたつき感、しっとり感）を各自に下記の基準（５段階）に従って評価してもらい、１０名の各２項目の合計スコアに基づいて３段階で総合評価を行った。 The feeling of use was evaluated by 10 specialist panels. Specifically, the appropriate amount of each cream is applied to the inner part of the upper arm, and the feeling of use (stickiness, moist feeling) immediately after application is evaluated according to the following criteria (5 levels). Based on the total score of each two items of the name, a comprehensive evaluation was performed in three stages.
［べたつき感］
５：べたつかない
４：あまりべたつかない
３：どちらでもない
２：ややべたつく
１：べたつく。
[A feeling of stickiness]
5: Not sticky 4: Not very sticky 3: Neither of them 2: Slightly sticky 1: Sticky
［しっとり感］
５：良い
４：やや良い
３：どちらでもない
２：やや悪い
１：悪い。
[Moist feeling]
5: Good 4: Slightly good 3: Not good 2: Slightly bad 1: Bad
［総合評価］
合計スコアが
○：８０以上１００未満
△：６０以上８０未満
×：６０未満。
[Comprehensive evaluation]
Total score: O: 80 or more and less than 100 Δ: 60 or more and less than 80 ×: Less than 60
結果を表３に纏めて示す。 The results are summarized in Table 3.
上記表３に示すように、クリーム等の乳化製剤に調製した場合、オイデスモールは、ソウジュツ50％エタノール抽出物と比較して、肌への馴染みがよく、しっとり感も高い一方、べたつき感が格段に少なく、使用感に優れていることが判明した。 As shown in Table 3 above, when prepared into an emulsified preparation such as a cream, Eudesmol is well-familiar to the skin and has a moist feeling compared to a 50% ethanol extract of sojutsu, but has a much more sticky feeling. It was found to be excellent in usability.
（処方例）オイデスモールを用いたクリーム形態を有する皮膚外用剤
表４に記載する成分を配合混合して、クリーム形態を有する皮膚外用剤を調製する。当該皮膚外用剤は加齢又は紫外線照射による肌劣化症状を予防又は改善するために有用である。
(Formulation example) Skin external preparation having a cream form using eudesmol The ingredients described in Table 4 are blended and mixed to prepare a skin external preparation having a cream form. The external preparation for skin is useful for preventing or ameliorating symptoms of skin deterioration due to aging or ultraviolet irradiation.
配列番号１はHAS2遺伝子増幅用のセンスプライマーの塩基配列、配列番号２はHAS2遺伝子増幅用のアンチセンスプライマーの塩基配列、配列番号３はGAPDH遺伝子増幅用のセンスプライマーの塩基配列、配列番号４はGAPDH遺伝子増幅用のアンチセンスプライマーの塩基配列を、それぞれ示す。 SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the sense primer for amplifying the HAS2 gene, SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the antisense primer for amplifying the HAS2 gene, SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the sense primer for amplifying the GAPDH gene, and SEQ ID NO: 4 is The base sequences of the antisense primers for GAPDH gene amplification are shown respectively.
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| JP2016189418A JP2018052842A (en) | 2016-09-28 | 2016-09-28 | Hyaluronan synthase expression promoter, hyaluronan production promoter, and anti-skin aging composition containing the same |
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