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JP2017518040A - 新規の抗ｒｎｆ４３抗体および使用方法 - Google Patents

新規の抗ｒｎｆ４３抗体および使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗体薬物コンジュゲートを含む新規の抗ＲＮＦ４３抗体およびその誘導体、ならびにがんを診断および処置するためのこのような抗ＲＮＦ４３抗体および抗体薬物コンジュゲートを使用する方法を開示する。

Description

相互参照出願
この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１４年４月２１日に出願された米国仮出願第６１／９８２，２９４号の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年４月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、ｓｃ３７０１ｐｃｔ＿Ｓ６９６９７＿１２１０ＷＯ＿ＳＥＱＬ＿０４２１１５．ｔｘｔと名付けられ、大きさが２７８，０７０（２７１ＫＢ）である。
発明の分野
本発明は、一般に、新規の抗ＲＮＦ４３抗体またはこの免疫反応性断片ならびにこれらを含む、がんおよびがんの再発または転移の処置、診断または予防のための組成物、例えば、抗体薬物コンジュゲートに関する。本発明の選択された実施形態は、このような抗ＲＮＦ４３抗体または抗体薬物コンジュゲートの、がんの処置のための、例えば腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少のための、使用を提供する。
幹細胞および始原細胞の分化および増殖は、器官形成、細胞修復および細胞置換の間の組織成長を支援するために協調して働く通常の進行プロセスである。この機構は、生物の必要性に基づいて適切なシグナルのみが生成されることが確実となるように厳しく制御されている。細胞増殖および分化は、通常、損傷のあるもしくは瀕死の細胞の置換のためまたは成長のために必要なときにのみ生じる。しかしながら、これらのプロセスの破壊は、様々なシグナル伝達化学物質の過小もしくは過剰な量、微小環境の変化の存在、遺伝子変異またはそれらの組合せなどの多くの要因によって引き起こされ得る。正常な細胞の増殖および／または分化の撹乱は、様々な障害、例えばがんのような増殖性疾患を導き得る。
がんに対する従来の処置療法としては、化学療法、放射線療法および免疫療法が含まれる。これらの処置は効果を奏しないことも多く、外科的切除は有効な臨床的代替手段を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、第１選択処置を行った後に再発した患者の場合に特に明白である。このような場合に、不応性腫瘍は、侵襲性で不治であることが多く、頻繁に発生する。多くの固形腫瘍の全体的な生存率は、長年にわたり大きく変化しておらず、少なくともこの原因の１部は、既存の治療法が、再発、腫瘍の再発および転移を防ぎそこなっていることによる。したがって、増殖性障害に対するより標的化された効能の高い治療法を開発することが依然として強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
本発明は、一般に、抗体、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）ならびにがんの予防、診断または処置に使用され得る医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、本発明は式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬物コンジュゲートまたはそれらの医薬的に許容される塩を含む（式中、Ｍは、抗ＲＮＦ４３抗体を含み、Ｌは、リンカーを含み、Ｄは、細胞毒を含み、ｎは、１から２０の整数である。）。
別の実施形態において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、内在化抗体である抗ＲＮＦ４３抗体を含む。別の態様において、本発明は、内在化抗体である抗ＲＮＦ４３抗体に関する。
さらなる実施形態において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体またはヒト化抗体である抗ＲＮＦ４３抗体またはこの断片を含む。さらなる態様において、本発明は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体またはヒト化抗体である抗ＲＮＦ４３抗体に関する。
本発明の一態様において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、腫瘍開始細胞に結合する抗ＲＮＦ４３抗体を含む。別の態様において、本発明は、腫瘍開始細胞に結合する抗ＲＮＦ４３抗体を指す。
本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ヒトＺＮＲＦ３（配列番号６）に結合しない抗ＲＮＦ４３抗体を含む抗ＲＮＦ４３ＡＤＣを含む。別の態様において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ヒトＺＮＲＦ３（配列番号６）に結合しない抗ＲＮＦ４３抗体に関する。
ＲＮＦ４３は、ＷＮＴシグナル伝達経路の負のフィードバック制御因子であることが示されており、したがってＲＮＦ４３に結合する抗体はＲＮＦ４３の作用に干渉する能力を有する可能性がある。本明細書で使用するとき、抗ＲＮＦ４３抗体は大きく３つに分類される。これらはＷＮＴシグナル伝達に対する「中和抗体」であり、ＷＮＴシグナル伝達経路に影響を与えない抗体と、ＷＮＴシグナル伝達を増加させる抗体と、ＷＮＴシグナル伝達を減少させる抗体とがある。したがって一態様において、本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体を含む抗ＲＮＦ４３ＡＤＣであって、抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達を減少させる、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣに関する。さらなる態様において、本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体を含む抗ＲＮＦ４３ＡＤＣであって、抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達を増加させる、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣに関する。さらに別の態様において、本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体を含む抗ＲＮＦ４３ＡＤＣであって、抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達に影響を与えない、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣに関する。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、ＷＮＴシグナル伝達に対して「中和抗体」である抗ＲＮＦ４３抗体を含む。さらなる態様において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ＷＮＴシグナル伝達を増加させる、減少させるまたはＷＮＴシグナル伝達に影響を与えない抗ＲＮＦ４３抗体に関する。
Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）は、ＷＮＴシグナル伝達経路に関与しているタンパク質であり、ＲＮＦ４３をブロックし、したがってＷＮＴリガンド産生の上方調節とＷＮＴシグナル伝達の増加を導く。一実施形態において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ＲＮＦ４３へのＲ−スポンジンの結合をブロックする、抗ＲＮＦ４３抗体を含む。別の態様において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ＲＮＦ４３へのＲ−スポンジンの結合をブロックしない、抗ＲＮＦ４３抗体に関する。
本発明の別の態様において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する抗ＲＮＦ４３抗体を含み、当該抗体の結合はＲ−スポンジンで刺激されたＷＮＴシグナル伝達をブロックしない。さらなる実施形態において、本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣは、真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する抗ＲＮＦ４３抗体を含み、当該抗体の結合はＲ−スポンジンで刺激されたＷＮＴシグナル伝達をブロックする。
一実施形態において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、ヒトＲＮＦ４３に対する結合について、（１）配列番号７８に示す軽鎖可変領域および配列番号８０に示す重鎖可変領域、または（２）配列番号１１０に示す軽鎖可変領域および配列番号１１２に示す重鎖可変領域を含む抗体と競合する、単離抗体に関する。
別の実施形態において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）：ＣＤＲＬ１：配列番号２８８；ＣＤＲＬ２：配列番号２８９；ＣＤＲＬ３：配列番号２９０を含む軽鎖、および以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）：ＣＤＲＨ１：配列番号２９１；ＣＤＲＨ２：配列番号２９２；ＣＤＲＨ３：配列番号２９３を含む重鎖を含む単離抗体に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）：ＣＤＲＬ１：配列番号２９４；ＣＤＲＬ２：配列番号２９５；ＣＤＲＬ３：配列番号２９６を含む軽鎖、および以下のＣＤＲＨ：ＣＤＲＨ１：配列番号２９７；ＣＤＲＨ２：配列番号２９８；ＣＤＲＨ３：配列番号２９９を含む重鎖を含む単離抗体に関する。
本発明の一態様は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合するヒト化抗体であって、配列番号２７３に示す軽鎖および配列番号２７５に示す重鎖を含む抗体に関する。
本発明の別の態様は、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合するヒト化抗体であって、
配列番号２７６に示す軽鎖および配列番号２７８に示す重鎖を含む抗体に関する。
本発明のさらなる態様は、配列番号２７３もしくは２７６に示す軽鎖または配列番号２７５もしくは２７８に示す重鎖をコードする核酸である。別の態様において、本発明は、上記核酸を含むベクターを含む宿主細胞である。
別の態様において、本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体または本明細書に記載のＡＤＣのいずれかを含む医薬組成物に関する。
一実施形態において、本発明は、本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの処置方法に関する。いくつかの態様において、がんは、結腸直腸がんまたは肺がんから選択される。
正常組織および患者由来異種移植（ＰＤＸ）腫瘍細胞に由来するＲＮＡの、全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）配列決定を使用して測定されたＲＮＦ４３の発現レベルを示す図である。 正常組織および患者由来異種移植（ＰＤＸ）腫瘍細胞に由来するＲＮＡの、全トランスクリプトーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）配列決定を使用して測定されたＲＮＦ４３の発現レベルを示す図である。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、正常組織および様々なＰＤＸ腫瘍から単離されたＲＮＡ試料におけるＲＮＦ４３転写産物の相対的発現レベルを示す図である。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、様々な正常組織およびがん幹細胞（ＣＳＣ）から単離されたＲＮＡ試料ならびに様々なＰＤＸ腫瘍から単離された非腫瘍形成性（ＮＴＧ）細胞におけるＲＮＦ４３転写産物の相対的発現レベルを示す図である。 正常組織および様々なＰＤＸ細胞株におけるマイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定されるＲＮＦ４３転写産物発現の正規化強度値を示す図である。 正常組織および公的に利用可能なデータセットであるがんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）からの原発性腫瘍におけるＲＮＦ４３転写産物の発現を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 例示的抗ＲＮＦ４３抗体の様々な生理学的および機能的特徴を示す図である。 ＲＮＦ４３（配列番号３）とＺＮＲＦ３（配列番号４）との細胞外ドメインのアラインメントを示す図である。 古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の単純化した形式における遺伝的相互作用の概略を示す図である。 ＷＮＴ３Ａを含むまたは含まない訓化培地を用いた処置に応答した、ＲＮＦ４３の過剰発現を伴うまたは伴わない、一対の古典的ＷＮＴシグナル伝達レポーター細胞株の挙動を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２２〜２６８、偶数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂにおける抗ＲＮＦ４３抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２１〜２６９、奇数）を示す図である。 全長ヒト化抗体ｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７、ｈＳＣ３７．１７ｓｓ１、ｈＳＣ３７．３９、ｈＳＣ３７．３９ｓｓ１、ｈＳＣ３７．６７およびｈＳＣ３７．６７バリアント１のアミノ酸配列を示す図である。 全長ヒト化抗体ｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７、ｈＳＣ３７．１７ｓｓ１、ｈＳＣ３７．３９、ｈＳＣ３７．３９ｓｓ１、ｈＳＣ３７．６７およびｈＳＣ３７．６７バリアント１のアミノ酸配列を示す図である。 マウス抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．２の軽鎖および重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従って番号付け）を示す図である。ここでＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法論を使用して誘導されている。 マウス抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．１７の軽鎖および重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従って番号付け）を示す図である。ここでＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法論を使用して誘導されている。 マウス抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．３９の軽鎖および重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従って番号付け）を示す図である。ここでＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法論を使用して誘導されている。 マウス抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．６７の軽鎖および重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらに従って番号付け）を示す図である。ここでＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法論を使用して誘導されている。 電気化学発光サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されたヒトＲＮＦ４３の相対的タンパク質発現を示す図である。 インサイチュハイブリダイゼーションにより決定された様々なＰＤＸ腫瘍細胞株におけるＲＮＦ４３のＲＮＡ発現を示す図である。 フローサイトメトリにより決定される代表的ＰＤＸ細胞株におけるＲＮＦ４３の表面タンパク質発現（黒線）を、がん幹細胞（ＣＳＣ）（黒色実線）または非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）（黒色点線）におけるアイソタイプ対照染色集団（固形灰色）と比較して示す図である。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および抗ＲＮＦ４３抗体について、それぞれ試験したＰＤＸ株に関して示す。 ＲＮＦ４３タンパク質を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞に内在化し、このような細胞を殺傷する、選択された抗ＲＮＦ４３ヒト化抗体（サポリンに直接コンジュゲートされたヤギ抗ヒトとの組合せ）の能力を示す図である。
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、組織化を目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
ＲＮＦ４３は、驚くべきことに、いくつかの腫瘍の生物学的マーカーとなることが見出された。この関係はそのような腫瘍の処置に利用し得る。さらに予期されなかったことに、ＲＮＦ４３が、腫瘍形成性細胞に関連し、それらの阻害または除去に効果的に利用し得ることが見出された。腫瘍形成性細胞は、下記にさらに詳細に記載されるが、従来の多くの処置に耐性を示すことが知られている。先行技術の教唆とは対照的に、開示された化合物および方法は、この固有の耐性を有効に克服する。
本発明は、特定の作用機構または特異的に標的化された細胞もしくは分子成分にかかわらず、様々なＲＮＦ４３関連がんの後診断、診断、診断治療、処置および／または予防のための抗ＲＮＦ４３抗体（抗体薬物コンジュゲートを含む）およびこの使用を提供する。
Ｉ．ＲＮＦ４３生理学
ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３；Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＲＮＦ４３またはＲＮＦ１２４としても知られる。）は、一回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、ＷＮＴシグナル伝達の重要なフィードバック制御因子として機能する。代表的なＲＮＦ４３タンパク質オルソログとしては、限定されないが、ヒト（ＮＰ＿０６０２３３）、チンパンジー（ＸＰ＿００１１７２６１１）、アカゲザル（ＸＰ＿００１１０６５７４）、ラット（ＮＰ＿００１１２９３９３）およびマウス（ＮＰ＿７６６０３６）が挙げられる。ヒトにおいて、ＲＮＦ４３遺伝子は、染色体１７の細胞遺伝学的位置１７ｑ２２にある約６３．９ｋＢｐに及ぶ１０個のエクソンからなる。ヒトＲＮＦ４３遺伝子座の転写により、７８３アミノ酸のプレタンパク質（ＮＰ＿０６０２３３）をコードする、スプライシングされた４．６ｋＢｐの成熟ｍＲＮＡ転写産物（ＮＭ＿０１７７６３）が得られる。ＲＮＦ４３プレタンパク質のプロセシングは、分泌シグナルペプチドを含む最初の２３アミノ酸の除去を含むと予測される。成熟ＲＮＦ４３タンパク質は、細胞外ドメインに１７４アミノ酸（アミノ酸２４〜１９７）、２１アミノ酸のらせん膜貫通ドメインに（アミノ酸１９８〜２１８）および５６５アミノ酸の細胞質ドメイン（アミノ酸２１９〜７８３）を含み、細胞質ドメインの一部に、このタンパク質の名前の由来となった不定型のＲＩＮＧドメイン亜鉛フィンガー（アミノ酸２７２〜３１３）を含むと予測される。ＲＩＮＧドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する亜鉛フィンガー構造の形成に結びついた配列定義ドメインであり、ユビキチン化プロセスに参加するタンパク質で一般的に見出される。
タンパク質のユビキチン化は、７６アミノ酸の熱安定性タンパク質であるユビキチン（Ｕｂ）が、標的タンパク質の様々なリジン残基に共有結合する、生物学的コンジュゲーションプロセスである。Ｕｂは、このＣ−末端グリシン残基（ＵｂＧ７６）を介して、標的タンパク質におけるリジンのエプシロン−アミノ基に付け加えられる（概要について、Ｓｈｅｎら、２０１３；ＰＭＩＤ ２３８２２８８７参照）。さらに、Ｕｂはそれ自体７つのリジン（ＵｂＫ６、ＵｂＫ１１、ＵｂＫ２７、ＵｂＫ２９、ＵｂＫ３３、ＵｂＫ４９およびＵｂＫ６３）を含んでいるので、標的タンパク質は、最初に１つのユビキチン化が標的タンパク質の所与のリジンで生じた後に次々にＵｂ部分が連結することによって、ポリユビキチン化され得る。細胞は、Ｕｂ共有結合の性質およびＵｂタグの多量体状態に依存して、ユビキチン化されたタンパク質をどのように整理するかのシグナルとして、Ｕｂタグを利用する。例えば、誤って折り畳まれた、酸化されたまたは短命のタンパク質の２６Ｓプロテオソームへの標的化、いわゆるユビキチン−プロテアソームシステムは、タンパク質がＵｂＧ７６−ＵｂＫ４８連結（Ｄｉｋｉｃら、２００９；ＰＭＩＤ：１９７７３７７９）を含有するポリＵｂ鎖によってタグ化されたときに生じる。対照的に、複数のモノユビキチン化は、様々な飲食作用区画を介して細胞表面タンパク質、例えばチロシンキナーゼ受容体またはセルペンチン受容体に関与し、最終的にリソソームでの分解を導く（Ｒａｉｌｂｏｒｇ ａｎｄ Ｓｔｅｎｍａｒｋ、２００９、ＰＭＩＤ：１９３２５６２４；Ｍｕｋａｉら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０４９５５３０；Ｈａｇｌｕｎｄ ａｎｄ Ｄｉｋｉｃ、２０１２；ＰＭＩＤ：２２３５７９６８）。
Ｕｂの標的タンパク質への生物学的コンジュゲーションは、３つの別個の酵素が関与する酵素カスケードによって媒介される：Ｕｂ活性化酵素（Ｅ１）、この酵素はＵｂＧ７６を化学的に活性化する；Ｕｂコンジュゲート酵素（Ｅ２）、この酵素は、活性化されたＵｂの担体として作用する；ならびにＵｂタンパク質リガーゼ（Ｅ３）、この酵素は、Ｅ２タンパク質および標的タンパク質の両方と複合体を形成し、活性化されたＵｂのＥ２からタンパク質標的への移行を媒介する。ヒトゲノム内には、このプロセスに特異性を与える数百のＥ３ Ｕｂタンパク質リガーゼがあり、各Ｅ３タンパク質は特異的なまたは限定された一揃いのタンパク質を認識する。ＲＩＮＧフィンガーＥ３タンパク質は、最も豊富な種類のＥ３ Ｕｂタンパク質リガーゼであり、近傍のタンパク質基質を活性なＥ２Ｕｂ複合体に移行させる足場として機能する。ＲＮＦ４３は、保存されたＲＩＮＧ配列に基づき、ほぼ確実なＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼとして同定され（Ｙａｇｙｕら、２００４、ＰＭＩＤ：１５４９２８２４）、ＲＮＦ４３の過剰発現が、様々な細胞表面分子のユビキチン−媒介下方調節を促進させることを示した後続の研究によりこのことが確認された（Ｋｏｏら、２０１２、ＰＭＩＤ：２２８９５１８７）。
Ｅ３ Ｕｂ−タンパク質リガーゼの適切な発現および機能は、多様な生物学的プロセスに関与するタンパク質のトラフィッキング、機能および制御された分解に不可欠であるようである（Ｈａｇｌｕｎｄ ａｎｄ Ｄｉｋｉｃ、前掲）。しかしながら、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼの発現調節不全または機能不全は、がんの発達の一因となり得る（概要について、Ｍａｎｉ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎｎ、２００５、ＰＭＩＤ：１６０３４０５４；Ｈｏｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｄｉｋｉｃ、２００９、ＰＭＩＤ：１９３２５６２３；Ｎａｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｎａｋａｙａｍａ、２００６、ＰＭＩＤ：１６６３３３６５を参照）。ＲＮＦ４３は、結腸直腸がんで上方調節されていることが発現プロファイリングで同定されているが、この文献の著者は、ＲＮＡブロッティングで測定するときに、胎性腎臓および肺でわずかな発現があること、さらに正常の成人組織では発現が検出されないことも報告している（Ｙａｇｙｕら、２００４、ＰＭＩＤ：１５４９２８２４）。いくつかの初期研究は、小胞体および核におけるタンパク質（Ｓｕｇｉｕｒａら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３１３０４９）または分泌タンパク質として（Ｙａｇｙｕら、２００４、ＰＭＩＤ：１５４９２８２４）の検出を報告している。しかしながら、より最近の研究は、ＲＮＦ４３を細胞表面に配置させ、この機能をＷＮＴシグナル伝達の調節と関連付け、適切な細胞表面に位置していることがＷＮＴシグナル伝達の調節におけるその機能活性に必要であることを示唆している（Ｈａｏら、２０１２、ＰＭＩＤ：２２５７５９５９；Ｋｏｏら、２０１２、ＰＭＩＤ：２２８９５１８７；Ｊｉａｎｇら、２０１３、ＰＭＩＤ：２３８４７２０３；Ｔｓｕｋｉｙａｍａら、２０１５、ＰＭＩＤ：２５８２５５２３）。
１．ＷＮＴシグナル伝達におけるＲＮＦ４３の役割
ＷＮＴ経路は、細胞の成長と分化を制御する重要な発生および幹細胞関連シグナル伝達経路であり（Ｓｅｉｆｅｒｔ ａｎｄ Ｍｌｏｄｚｉｋ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２３０１９９；ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００９、ＰＭＩＤ：１８８０８３２７；Ｎｉｈｅｒｓ、２０１２、ＰＭＩＤ：２３１５１６６３）、この異常な再活性化または過剰な活性化はがんと結びついている（Ｂａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００６、ＰＭＩＤ：１７１３９２８５；Ｋｒａｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｋｏｒｉｎｅｋ、２０１３、ＰＭＩＤ：２４３０８９６３）。ヒトゲノムには、１９の異なるＷＮＴ遺伝子があり、１９のＷＮＴタンパク質リガンドをコードしている。ＷＮＴタンパク質リガンドは、様々な細胞表面受容体に結合してリガンド／受容体複合体を形成し、ＷＮＴシグナル伝達経路として知られる特別なタンパク質−タンパク質相互作用の経路を介して、細胞の外側から細胞の内部にシグナルを送る。３つの十分に特徴付けされたＷＮＴシグナル伝達経路がある：（１）古典的ＷＮＴシグナル伝達経路、（２）非古典的平面内細胞極性経路および（３）非古典的ＷＮＴ／カルシウム経路。３つのＷＮＴシグナル伝達経路は全て、ＷＮＴタンパク質リガンドが細胞表面にあるＦｒｉｚｚｅｄ（ＦＺＤ）タンパク質受容体に結合することによって活性化され、この後、細胞膜の内側のＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＶＬ）タンパク質にシグナル伝達が行われるが、古典的経路は、ＷＮＴのＦＺＤおよび低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５または６（ＬＲＰ５／６）共受容体への結合を介して作動し、下流のタンパク質の相互作用を生じさせ、転写コアクチベータータンパク質β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）の安定化をもたらす。安定化されたβ−カテニンは、核へ移動し、ＴＣＦ／ＬＥＦタンパク質とパートナーとなり、ＷＮＴ標的遺伝子の転写を活性化して細胞成長および分化を促進するとともにシグナル伝達経路の負のフィードバック制御因子を活性化することができる。古典的ＷＮＴ経路の単純化されたマップは、図６Ａに示される。対照的に、非古典的平面内細胞極性経路は、β−カテニン中間体の安定化を介して進行せず、代わりにＤＶＬタンパク質は、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）またはｖａｎ Ｇｏｇｈ様タンパク質（ＶＡＮＧＬ１、ＶＡＮＧＬ２）のような代替的な細胞表面共受容体の活性を制御し、結果として、アクチンおよび細胞の細胞骨格の挙動を調節する。同様に、非古典的ＷＮＴ／カルシウムシグナル伝達経路は、安定化されたβ−カテニン中間体を介して進行せず、代わりに、ＤＶＬタンパク質および関連Ｇ−タンパク質からシグナル伝達されるとき、細胞内カルシウムモデルを調節し、最終的に、細胞接着、遊走および組織分離における変化を導く。
Ｅ３ Ｕｂ−タンパク質リガーゼであるＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３は、ＷＮＴシグナル伝達の重要な制御因子であることが示されてきた。機能的に類似しているが配列が異なるこれらのタンパク質（同一性は、全体でたったの２６％、外部ドメインで４０％、不定型ＲＩＮＧドメイン亜鉛フィンガーで６９％）はいずれも、ＷＮＴシグナル伝達の負のフィードバック制御因子であり、このことはＡＸＩＮ２（ＷＮＴシグナル伝達の負のフィードバック制御因子として作用することが知られる既知のＷＮＴ応答遺伝子）の発現との正の相関（Ｌｕｓｔｉｇら、２００２、ＰＭＩＤ：１１８０９８０９）、β−カテニンの異常活性シグナル伝達を有する原発性結腸直腸腫瘍における発現上昇およびβ−カテニンに対してｓｉＲＮＡで処置された細胞における発現減少（Ｈａｏら、前掲）により推測することができる。最近、２つのＷＮＴ応答要素が、ＲＮＦ４３遺伝子のイントロンに位置しており、β−カテニンのシグナル伝達をＲＮＦ４３上方調節に直接的に結び付けていることが報告された（Ｔａｋａｈａｓｋｉら、２０１４、ＰＭＩＤ：２４４６６１５９）。ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３はそれぞれ細胞表面受容体ＦＺＤおよびＬＲＰのレベルを、これらの受容体のユビキチン化の調整によって調節している（Ｋｏｏら、前掲；Ｈａｏら、前掲）。ＲＮＦ４３の場合、外部ドメインと機能的ＲＩＮＧドメインの両方が、ＦＺＤをユビキチン化して、古典的ＷＮＴシグナル伝達を調節する能力のために必要である。微調整古典的ＷＮＴシグナル伝達におけるＲＮＦ４３の生物学的機能は、Ｒ−スポンジンタンパク質が、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼとの物理的会合を通じて、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼのレベルを抑制し、細胞表面におけるＷＮＴ受容体発現を上昇させ、結果としてＷＮＴシグナル伝達を明確に増強させることを実証した一連の研究により（Ｃｈｅｎら、２０１３、ＰＭＩＤ：２３７５６６５１；Ｈａｏら、前掲）、さらに示された。膵管腺癌におけるＲＮＦ４３を機能的に不活性化させる変異は、これらの腫瘍にＷＮＴ依存性を与えた（Ｊｉａｎｇら、前掲）。最後に、幹細胞およびがんにおける調節不全ＲＮＦ４３発現とこのＷＮＴシグナル伝達に与える影響との関連が、Ｋｏｏら（前掲）により実証された。ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３の発現は、マウスの小腸におけるＬＧＲ５＋幹細胞区画に限定されていることが見出された。ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３遺伝子の腸のダブルノックアウトを有するマウスは、急速に成長するアデノーマを発症し、β−カテニンのシグナル伝達の過剰活性化に一致する表現型とＰａｎｅｔｈ細胞および腸幹細胞過形成に一致する形態を有する。ＲＮＦ４３が、ＤＶＬタンパク質との相互作用を介して非古典的ＷＮＴシグナル伝達も調節し得ることが最近報告されている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａら、２０１５、ＰＭＩＤ：２５８２５５２）。
上記研究は、ＲＮＦ４３が、ＷＮＴシグナル伝達に対する精巧なアゴニスト、アンタゴニストおよびアンチアンタゴニストのフィードバックネットワークの中枢であり、がんの発達を示唆する可能性を有することを実証している。β−カテニン過剰活性化は、多数の過形成およびがんの共通の属性であり、したがってこれらのがんは、β−カテニン過剰活性化に応じた恒常性（ｈｏｍｏｓｔａｔｉｃ）の破綻の一環としてＲＮＦ４３発現上昇を示す可能性がある。
２．ＷＮＴシグナル伝達の測定
古典的ＷＮＴシグナル伝達のタンパク質調節因子の機能は、以下のアッセイを使用して解明することができる：（１）天然にＤＮＡ結合部位を含有する「ＷＮＴ応答性」遺伝子（例えば、ＡＸＩＮ２、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＡＳＣＬ２）（ＷＮＴ応答要素またはＷＲＥとも呼ばれる）のＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子に関する転写上昇を直接的に評価する；または（２）ＴＣＦ／ＬＥＦ因子のＷＲＥへの結合により転写を導く合成レポーター遺伝子構築物を使用し、レポーター遺伝子産物（例えば、活性を容易に測定し得るＧＦＰ、ルシフェラーゼ、もしくはレポーター酵素）の活性を評価する。一実施形態において、ＷＮＴ活性は、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイまたはその誘導体を使用して測定することができる（Ｋｏｒｉｎｅｋら、１９９７、ＰＭＩＤ：９０６５４０１；Ｖｅｅｍａｎら、２００３、ＰＭＩＤ：１２６９９６２６）。別の実施形態において、ＷＮＴシグナル伝達経路に必要な全てのタンパク質を含み、ＷＲＥを含有するＤＮＡ配列の制御下において、レポーター遺伝子、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するように操作されているＷＮＴ応答性レポーター細胞株を使用してもよい。本発明において、ＷＮＴ応答性レポーター細胞株は、２９３．ＴＣＦとも称し、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体または抗体薬物コンジュゲートが古典的ＷＮＴシグナル伝達を調節する能力を決定するように生成され、使用された（実施例８参照）。２９３．ＴＣＦ細胞株は、４つのＷＲＥの下流において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現する。ＷＮＴリガンド（例えば、ＷＮＴ３Ａ）または代替的に「ＷＮＴ活性化因子」の存在下において、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子はＷＲＥに結合し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写を活性化させ、究極的に、ルシフェラーゼの適切な基質とコファクターが添加されて測定されるときのルシフェラーゼ酵素活性（例えば、光の生成）を増加させる。本明細書で使用するとき、「ＷＮＴ活性化因子」は、ＷＮＴシグナル伝達カスケードを活性化する化合物（例えば、ＷＮＴリガンド）を意味する。ＷＮＴ活性化因子は、例えば、ＷＮＴ応答性レポーター細胞株（例えば、２９３．ＴＣＦ細胞）を使用して、ＷＮＴ活性化因子化合物（例えば、ＷＮＴ３Ａ）を単に添加し、このようなＷＮＴ活性化因子に曝露させなかった２９３．ＴＣＦ細胞と比較してルシフェラーゼ活性の増加があるかを観察することにより、例えば様々な物理化学的技術（例えば、リポフェクション、エレクトロポレーションなど）を使用して作用剤をＷＮＴ応答性レポーター細胞株に導入することによりまたは化合物（例えば、膜結合または膜貫通タンパク質）をコードするＤＮＡ構築物をＷＮＴ−応答性レポーター細胞株にトランスフェクションさせて、細胞の天然の機構に化合物を生じさせることにより同定することができる。一実施形態において、２９３．ＴＣＦ細胞株は、ＷＮＴ３Ａ過剰発現細胞からの上清（例えば、Ｌ／ＷＮＴ３Ａ細胞からの訓化培地）で処理することができ、ルシフェラーゼ活性（つまり、ＷＮＴシグナル伝達）は、ＷＮＴ３Ａ処理細胞を、ＷＮＴ３Ａで処理していない細胞（例えば、ＷＮＴ３Ａを発現していない親Ｌ細胞からの、訓化培地に曝露させた細胞）と比較して測定することができる。
ＷＮＴ活性化因子とは対照的に、本明細書で“ＷＮＴ調節因子”と記載される様々な化合物（例えば、Ｒ−スポンジン；ＦＺＤ）は、ＷＮＴ活性化因子（例えば、ＷＮＴ３ＡまたはＬ／ＷＮＴ３Ａ細胞からの訓化培地）の存在下でＷＮＴシグナル伝達を増加または減少させることによってＷＮＴシグナル伝達経路の活性に影響を与えることができるが、ＷＮＴ活性化因子と独立してＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することはできない。ＷＮＴ調節因子は、例えば、ＷＮＴ応答性レポーター細胞株（例えば、２９３．ＴＣＦ）を使用し、これらの細胞を、有効なＷＮＴ調節因子に、ＷＮＴ活性化因子化合物（例えば、ＷＮＴ３Ａ）と組み合わせて曝露させ、ＷＮＴ活性化因子のみに曝露させた２９３．ＴＣＦ細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性に測定可能な有意な変化があるかを観察することによって同定することができる。ＷＮＴ調節因子を同定するための他の方法としては、有効なＷＮＴ調節因子作用剤を、様々な物理化学的技術（例えば、リポフェクション、エレクトロポレーションなど）を使用して、ＷＮＴ応答性レポーター細胞に導入することまたは化合物（例えば、膜結合または膜貫通タンパク質）をコードするＤＮＡ構築物をＷＮＴ−応答性レポーター細胞株にトランスフェクションさせて、細胞の天然の機構にＷＮＴ調節因子を生じさせ、次いで、この処理された細胞を、ＷＮＴ活性化因子化合物（例えば、ＷＮＴ３Ａ）に曝露させて、ＷＮＴ調節因子を発現していない対照ＷＮＴ−応答性レポーター細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性に測定可能な有意な変化があるかを観察することが挙げられる。一実施形態において、２９３．ＴＣＦ細胞は、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３タンパク質を過剰発現するように操作され（例えば、ＲＮＦ４３の場合は２９３．ＴＣＦ．３７）、これらの株のルシフェラーゼ活性と、ＲＮＦ４３を発現しない対照２９３．ＴＣＦ細胞株のルシフェラーゼ活性とを、両方の株を適切なＷＮＴ活性化因子（例えば、訓化培地）に曝露させた後で、比較し得る。このようにして、ＲＮＦ４３の生物学的活性が最初に示され（Ｋｏｏら、前掲）、この活性の観察は本発明者によって確認され、この確認において、ＲＮＦ４３を発現する２９３．ＴＣＦ．３７ＷＮＴ応答性レポーター細胞株のルシフェラーゼ活性がＲＮＦ４３を発現しない２９３．ＴＣＦ細胞株のルシフェラーゼ活性と比較して低下していることの観察から決定されるように、ＲＮＦ４３は、ＷＮＴシグナル伝達を減少させる（またはアンタゴナイズする）ＷＮＴ調節因子であることが実証される。（実施例８；図６Ｂ参照）。ＷＮＴのＲＮＦ４３媒介減少または拮抗は、Ｅ３−ユビキチンリガーゼであるＲＮＦ４３が、ＦＺＤタンパク質に結合し、特異的にタグ化して分解し、細胞表面におけるＷＮＴ受容体密度を減少させ、活性なＷＮＴシグナル（例えば、ＷＮＴ３Ａリガンド）に対する応答を減少させる能力と関連付けられてきた。ＷＮＴ調節因子は、より複雑な条件で試験してもよく、複数の調節因子を添加した条件でＷＮＴシグナル伝達におけるそれらの相加的効果を決定してもよい。一実施形態において、既知のＷＮＴ調節因子を過剰発現するように操作された２９３．ＴＣＦ細胞（例えば、ＲＮＦ４３過剰発現２９３．ＴＣＦ．３７細胞）は、さらなるＷＮＴ調節因子に曝露させて、このような曝露が、さらなるＷＮＴ調節因子に曝露させていない対照細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の測定可能なおよび顕著な変化をもたらすかどうかを測定してもよい。
Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）タンパク質ファミリーは、ＷＮＴシグナル伝達経路に関与することが知られている（Ｋｉｍら、２００８；ＰＭＩＤ：１８４００９４２；図６Ｂ参照）が、本発明者によって、ＷＮＴシグナル伝達を増加させるＷＮＴ調節因子であることが確認された。これは、２９３．ＴＣＦ．３７（例えば、ＲＮＦ４３過剰発現）ＷＮＴ応答性レポーター細胞株のＷＮＴ３ＡおよびＲ−スポンジン（例えば、ＲＳＰＯ３）の存在下におけるルシフェラーゼ活性を、ＷＮＴ３Ａは存在するがＲ−スポンジンは不在下での同じ細胞株２９３．ＴＣＦ．３７のルシフェラーゼ活性と比較した増加を観察することによって実証された（データ示さず）。公開されている分子細胞生物学研究により、（１）Ｒ−スポンジンがＷＮＴ調節因子であり、単独では、例えば、ＷＮＴリガンドの不在下では、ＷＮＴシグナル伝達を活性化しないが、ＷＮＴリガンドの存在下では、ＷＮＴシグナル伝達を肯定的に調節する（つまり、増加させる）ことと、（２）Ｒ−スポンジンのＷＮＴシグナル伝達を増加させる能力は、ＬＧＲ受容体とＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３との相互作用を促進させる能力に関連し、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３の膜クリアランスを生じさせ、続いて細胞表面に存在するＦＺＤの増加を促進させ、それにより、ＷＮＴシグナル伝達を上方調節させるまたは増加させることとの両方が示された。
本明細書で使用するとき、相対的用語、例えば「ＷＮＴシグナル伝達を増加させる」、「ＷＮＴシグナル伝達を減少させる」または「ＷＮＴシグナル伝達に影響を与えない」は、様々なＷＮＴ調節因子またはＷＮＴ活性化因子（例えば、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体または抗体薬物コンジュゲート）の、単独でまたは組合せでの、対照条件または参照化合物と比較したＷＮＴシグナル伝達経路を調節する能力を示す。一実施形態において、ある特定の化合物（例えば、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体または抗体薬物コンジュゲート）のＷＮＴシグナル伝達を調節する能力は、ＷＮＴリガンド（例えば、ＷＮＴ３Ａ、実施例８参照）の存在下で、２９３．ＴＣＦＷＮＴ応答性レポーター細胞株を、そのような化合物に曝露させることにより決定することができる。ＷＮＴリガンドのみに曝露させて観測される場合を上回ってルシフェラーゼ活性を増加させる化合物は、「ＷＮＴシグナル伝達を増加させる」化合物と表され（例えば、抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．２３１；図５Ａ参照）、一方でＷＮＴリガンドのみに曝露させて観測される場合と比較してルシフェラーゼ活性を変化させない化合物は、「ＷＮＴシグナル伝達に影響を与えない」化合物と表され（例えば、抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．１７０；図５Ａ参照）、ＷＮＴリガンドのみに曝露させて観測される場合を下回ってルシフェラーゼ活性を低下させる化合物は、「ＷＮＴシグナル伝達を減少させる」化合物と表される（例えば、抗ＲＮＦ４３抗体ＳＣ３７．２３１；図５Ａ参照）。ＷＮＴシグナル伝達の変化は、「ＴＣＦ活性倍率」として表すことができ、これは試験条件におけるＷＮＴレポーター株で測定されたＴＣＦ活性を、対照条件におけるＷＮＴレポーター株に対して観察されたＴＣＦ活性で割ったものである。ＷＮＴシグナル伝達における増加および減少は、対照と比較して、当業者に周知の標準的な統計学的技術（例えば、スチューデントＴ−検定；ｐ値）に基づいて、「有意」と決定され、したがって、測定可能な変化は、実験的アッセイに対する通常の生物学的変動の範囲を超えた場合に統計学的に有意とみなされる。例えば、アッセイが、試験集団と対照集団との統計学的に有意な差異を容易に区別できる場合、各集団の平均の差異は他の集団から２以上の倍率で異なり、つまり２倍の差異がある。「ＷＮＴシグナル伝達を顕著に増加させる」ＷＮＴ調節因子は、ＷＮＴシグナル伝達（例えば、ＴＣＦ活性）を２．０倍以上増加させるということができる（例えば、試験および対照集団の２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０以上の割合）。同様に、「ＷＮＴシグナル伝達を顕著に減少させる」ＷＮＴ調節因子は、ＷＮＴシグナル伝達（例えば、ＴＣＦ活性）を２倍以上減少させるということができる（例えば、試験および対照集団の０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の割合）。「ＷＮＴシグナル伝達に顕著な影響を与えない」ＷＮＴ調節因子（例えば、中和抗体）は、例えば、ＷＮＴシグナル伝達の変化（ＷＮＴシグナル伝達の増加またはＷＮＴシグナル伝達の減少のいずれか）が２．０倍未満であるということができる。
３．抗ＲＮＦ４３抗体および抗体薬物コンジュゲートによるＷＮＴシグナル伝達の調節
古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の単純化されたマップが、図６Ａに示される。抗ＲＮＦ４３抗体がＷＮＴシグナル伝達を調節する能力は様々な方法を使用して決定することができ、このいくつかは、本明細書の上記項目Ｉ．２に記載されている。上記のように、ＷＮＴ調節因子としての抗体の活性は、ＷＮＴレポーターアッセイを使用して測定することができ、これによりＷＲＥ活性化転写の直接の読み取りができ、したがってＷＮＴシグナル伝達が直接測定される。本発明において、ＷＮＴ３Ａリガンドおよび抗ＲＮＦ４３抗体の存在下におけるＴＣＦ活性と、ＷＮＴ３Ａリガンドは存在するが抗ＲＮＦ４３抗体は不在下でのＴＣＦ活性と比較する測定（図５Ａ）は、ＷＮＴシグナル伝達におけるＷＮＴ調節因子の効果の直接測定の一例である。
さらに、当該技術分野で認識されている他のアッセイ方法を使用し、ＷＮＴシグナル伝達経路におけるタンパク質に関する生物学の既知の理解に基づいて、ＷＮＴ調節を推論することもできる。例えば、ＷＮＴ受容体であるＦＺＤ５の発現レベルを細胞表面で測定してもよく、なぜなら細胞表面に存在するＦＺＤ５受容体の量の変化が、ＷＮＴシグナル伝達の変化と直接的に相関することが既知であるためである（Ｋｏｏら、前掲、参照）。
ＲＮＦ４３は、ＲＮＦ４３とＦＺＤ受容体との間の物理的相互作用を含むメカニズムを介してＷＮＴシグナル伝達を減少させ、細胞表面におけるＦＺＤのレベル減少を生じさせ、ＷＮＴシグナル伝達の減少を導くＷＮＴ調節因子であることは既知である（Ｋｏｏら、前掲；Ｈａｏら、前掲、参照）。ＲＮＦ４３のＦＺＤとの相互作用を機能的にブロックする抗体（図６Ａで群Ｉの抗体と標識）は、細胞表面におけるＦＺＤ受容体の密度を増加させ、ＷＮＴシグナル伝達の増加させることが予期される。一実施形態において、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣのＷＮＴシグナル伝達を増加させる能力は、このような抗ＲＮＦ４３抗体およびＡＤＣが、ＦＺＤへの結合についてＲＮＦ４３と競合し、ＦＺＤの分解を抑制して、ＷＮＴシグナル伝達を増加させる能力により、間接的に測定することができる。このような競合実験は、本明細書の項目ＩＶ．５により詳細に記載されるように、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他の競合アッセイを使用して実施することができ、ここで抗ＲＮＦ４３抗体が、ＲＮＦ４３の単離ＦＺＤタンパク質、ＦＺＤエクトドメインまたはＦＺＤ過剰発現細胞への結合をブロックする能力が測定される。
同様に、Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）が機能的にＲＮＦ４３の活性をブロックすることは当業者にとって既知である。ＲＮＦ４３の表面発現は、ＲＮＦ４３がＦＺＤ受容体を調節する能力にとって重要である。ＲＳＰＯは、ＬＧＲ４受容体をＲＳＰＯ、ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４からなる三元複合体に組み入れてＲＮＦ４３の活性をブロックし、それによりＲＮＦ４３をＦＺＤから隔離し、細胞表面におけるＦＺＤ（ＷＮＴ受容体）のレベルを増加させ、ＷＮＴシグナル伝達の増加を導く（Ｈａｏら、前掲；Ｚｅｂｉｓｃｈら、２０１３、ＰＭＩＤ ２４２２５７７６；Ｘｉｅら、２０１３、ＰＭＩＤ：２４１６５９２３）。したがって、ＲＳＰＯとＲＮＦ４３（図６Ａで群ＩＩ抗体と標識）との相互作用を機能的にブロックする抗体は、細胞表面におけるＦＺＤ受容体の密度を減少させ、抗体の不在下でＲＳＰＯを存在させる条件の対照と比較してＷＮＴシグナル伝達の減少をもたらすと予測される。一実施形態において、抗ＲＮＦ４３抗体およびＡＤＣによるＷＮＴ調節因子活性は、このような抗ＲＮＦ４３抗体およびＡＤＣが、ＲＮＦ４３への結合について、Ｒ−スポンジンと競合して、Ｒ−スポンジンのＲＮＦ４３への結合をブロックする能力によって、間接的に測定することができる。このような競合実験は、例えば本質的に以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施することができる：抗ＲＮＦ４３抗体を、組み換えＲＮＦ４３細胞外ドメインタンパク質に加え、混合物を、Ｒ−スポンジンで被覆させたＥＬＩＳＡプレートに添加して（実施例８、図５Ａ参照）、抗体がＲ−スポンジンとＲＮＦ４３との相互作用をブロックするかを測定してもよい。Ｒ−スポンジンとＲＮＦ４３との相互作用をブロックする抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは、Ｒ−スポンジンのＲＮＦ４３に対する結合を、抗体が存在しない場合のＲ−スポンジンのＲＮＦ４３に対する結合と比較して、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはより多くの減少を示す抗体の意味を保持する。他の実施形態において、本明細書の項目ＩＶ．５により詳細に記載されるように、さらなる競合アッセイが実施され得る。ＷＮＴ調節因子（例えば、Ｒ−スポンジンおよびＦＺＤ）の活性によって測定されるＷＮＴシグナル伝達の間接測定は、本明細書の項目Ｉ．２．に記載される直接的ＷＮＴシグナル伝達アッセイを使用して確認することができる。
最終的に、抗ＲＮＦ４３抗体およびＡＤＣが存在すると予期することができ、これらは、上記のように、群Ｉまたは群ＩＩの抗体のいずれの特性も示さない、つまり、この抗体またはＡＤＣは、Ｒ−スポンジンとＲＮＦ４３との相互作用をブロックせず、ＲＮＦ４３とＦＺＤとの相互作用もブロックしない。この抗体またはＡＤＣの群は、依然としてＲＮＦ４３に特異的に結合することができるが、ＷＮＴシグナル伝達に対して影響を与えないという事実に基づき、「中和抗体」と称することができる。
ＩＩ．がん幹細胞
現在のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫不全マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。腫瘍形成性細胞は、本明細書で「腫瘍開始細胞」（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＴＩＣ）とも称され、腫瘍の細胞集団の０．１−４０％を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）と交換可能に参照される腫瘍永続化細胞（ｔｕｍｏｒ ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＴＰＣ）と、腫瘍始原細胞（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＴＰｒｏｇ）との両方を包含している。
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。ＣＳＣは、腫瘍形成性後代と非腫瘍形成性後代の両方を生成することができ、連続的単離および少数の単離されたＣＳＣの免疫不全マウスへの移植によって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、原発性移植片における腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、少数の高精製ＴＰｒｏｇの免疫不全マウスへの連続移植により実証されるように、一般に限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇとに分けることができ、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞構造を再現する能力の差異によって区別され得る。いずれもＣＳＣと同程度に腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇの方が、後期ＴＰｒｏｇよりも、親腫瘍の特徴を再現する能力が高い。前述の区別にかかわらず、一部のＴＰｒｏｇ集団は稀に、ＣＳＣに通常属する性質である自己再生能力を獲得し、それ自体がＣＳＣになることができる。
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期および後期ＴＰｒｏｇの両方）ならびに（ｉｉ）非腫瘍形成性細胞、例えば、腫瘍−浸潤性細胞、例えば、ＣＳＣから誘導され、通常バルクの腫瘍を含む、線維芽細胞／間質、内皮および造血性細胞よりも高い腫瘍形成性を示し、比較的さらに静止している。従来の治療およびレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、より急速に増殖するＴＰｒｏｇおよび他のバルクな腫瘍細胞集団、例えば非腫瘍形成性細胞よりも、従来の治療およびレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズムおよび抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。ＣＳＣにおけるこれらの特性は、進行した病期の新生物を有する多くの患者に対して長期利益を確保するための腫瘍学的標準処置レジメンが失敗する主な理由となる。なぜなら標準的化学療法は、継続的な腫瘍成長および再発を実際に促進しているＣＳＣを標的としていないためである。
驚くべきことに、ＲＮＦ４３発現が、様々な腫瘍形成性細胞小集団と関連していることが分かった。本発明は、特に腫瘍形成性細胞を標的化するために有用であり、腫瘍形成性細胞を鎮静する、敏感にする、中和する、出現頻度を減少させる、ブロックする、破棄する、干渉する、減少させる、妨害する、抑制する、制御する、枯渇させる、和らげる、介在する、縮小させる、再プログラムする、消去するまたは他の方法で阻害する（集約して、「阻害する」）ために使用することができ、したがって増殖性障害（例えば、がん）の処置、管理および／または予防を容易にする抗ＲＮＦ４３抗体を提供する。有利には、本発明の新規の抗ＲＮＦ４３抗体は、対象に投与した際に、ＲＮＦ４３の決定因子の型（例えば、表現型または遺伝子型）にかかわらず、腫瘍形成性細胞の出現頻度または腫瘍形成性を好ましくは減少させるように選択してもよい。腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害もしくは根絶、（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大もしくは再発の制御、（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持または増殖の中断または（ｉｖ）これら以外の腫瘍形成性細胞の生存、再生および／もしくは転移を妨げることの結果として生じ得る。いくつかの実施形態において、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害、腫瘍形成性細胞の能力の改変（例えば、分化もしくはニッチ破壊の誘導による）または腫瘍形成性細胞が腫瘍環境もしくは他の細胞に影響する能力の他の方法での干渉のいずれによるものであっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持および／または転移ならびに再発の阻害により、より有効にＲＮＦ４３関連障害を処置することを可能にする。
腫瘍形成性細胞の出現頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、限定されないが、細胞数測定または免疫組織化学的分析、好ましくはインビトロまたはインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２およびＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。
インビトロ限界希釈分析は、断片化または非断片化腫瘍細胞（例えば、それぞれ処置または未処置細胞）を固体培地で培養してコロニーを形成させ、成長したコロニーを計数し、特徴付けることにより行ってもよい。または腫瘍細胞を、プレート上でウェルに液体培地を含有させて段階希釈し、各ウェルを、接種後、好ましくは接種から１０日より後の任意の時点において、コロニー形成について陽性であるか陰性であるかでスコア化してもよい。
インビボ限界希釈分析は、未処置対照または選択した治療剤に曝露した腫瘍のいずれかからの腫瘍細胞を、免疫不全マウスに段階希釈で移植し、この後、各マウスの腫瘍形成について陽性であるか陰性であるかをスコア化することによって実施される。スコア化は、移植した腫瘍が検出可能となった後の任意の時点で行ってよいが、好ましくは移植から６０日以上経過した後で行う。腫瘍形成性細胞の出現頻度を決定するための限界希釈実験の結果の解析は、好ましくは、ポアソン分布統計を使用してまたは腫瘍がインビボで生成されるか否かの能力のような予め定義された確定事象を評価することにより（Ｆａｚｅｋａｓら、１９８２、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）、行われる。
フローサイトメトリおよび免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の出現頻度を決定するために使用され得る。両方の技術が、腫瘍形成性細胞を濃縮することが知られている、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質またはマーカーに結合する１つ以上の抗体または試薬を利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリ（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を特徴付け、単離、精製、濃縮または分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリは、細胞の混合集団が懸濁されている流体の流れを、秒あたり最大何千もの粒子の物理的および／または化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体または試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。
本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化またはＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、特徴付け、監視、単離、薄片化または集団もしくは小集団の富化に有用であり得る。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される信頼性のある方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴付けおよび操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６および１２／７５７，６４９において見ることができる。
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離または特徴付けるために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ｅｅｄ、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、Ｎａｎｏｇ、ＮＢ８４、ネスチン、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、オンコスタチンＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｓｍａｒｃＡ５、Ｓｏｘ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、トランスフェリン受容体、ＴｒｋＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１およびβ−カテニン。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６および２０１１／００２０２２１参照。
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋ならびに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。本発明に関して特に関心がもたれるのは、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型を含むＣＳＣ調製物である。
「正」、「低」および「負」の発現レベルがマーカーまたはマーカー表現型に適用されるとき、以下のように定義される。負（つまり、「−」）の発現を有する細胞は、本明細書において、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義される。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を引いた蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）」または「ＦＭＯ」染色として参照されることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「＋」）と定義される。本明細書で定義するとき、様々な細胞集団が広範に「正」と定義される。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞は正として定義される。正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ｌｏ」）の細胞と称され得る。代替的に、正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができ、特に好ましい実施形態において、パーセンタイルは９９％より大きくなり得る。
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋マーカー表現型およびすぐ上に例示された表現型は、標準的フローサイトメトリ解析ならびにさらなる解析のためにＴＩＣおよび／またはＴＰＣ細胞または細胞集団を、特徴付け、単離、精製または濃縮する細胞選別技術と組み合わせて使用され得る。
したがって、腫瘍形成性細胞の発生頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術およびマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＲＮＦ４３抗体は、腫瘍形成性細胞の発生頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の発生頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、開示された化合物は、腫瘍形成性細胞の発生頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の出現頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性および新生物の攻撃性の対応する減少をもたらし得ることが理解される。
ＩＩＩ．抗体
１．抗体の構造
抗体ならびにそのバリアントおよび誘導体は、承認されている命名法および番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「無傷な抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合および非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖に分類される。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合にＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む。）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、可変長のプロリンおよびシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（一般的に、ＩｇＧにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間および鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテインおよびバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）ならびにＦｃ融合および他の修飾を含むそれらの誘導体、ならびに決定因子との優先的会合または結合を示す限り、あらゆる他の免疫反応分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、用語はさらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）ならびに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γおよびμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識および結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である。）。ＶＨおよびＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、またはより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨおよびＶＬ領域間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。ＳｃＦｖ断片（一本鎖可変部断片の場合）は、遺伝子操作によって取得することができ、単一のポリペプチド鎖中でペプチドリンカーによって分離された抗体のＶＨおよびＶＬ領域と会合している。
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域およびＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ ＣｏまたはＡｂＭ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供される番号付けスキームの１つに従い得る。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）およびＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基は、下記に示されている。
Figure 2017518040
抗体配列における可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則に従って（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔら番号付けシステム）または既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）およびｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されているまたはこれらを通じてアクセスされ得る。好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔら、ＩＭＧＴおよびタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ ｂｏｏｋ ｃｈａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。本明細書に添付の図７Ｅ−７Ｈは、いくつかの例示的な抗体の重鎖および軽鎖可変領域の注釈におけるこのような解析での結果を示す。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８−８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥＵインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックス」、「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」または「ＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１ Ｅｕ抗体に基づいた残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
Figure 2017518040
同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
Figure 2017518040
当業者は、開示された定常領域配列が、標準的な分子生物学的技術を使用して開示される重鎖および軽鎖可変領域と連結されて、このまま使用され得るまたは本発明の抗ＲＮＦ４３ＡＤＣに組み込まれ得る全長抗体を提供できることを理解する。
本発明の抗体または免疫グロブリンは、任意の関連する決定因子（すなわち、ＲＮＦ４３）を特異的に認識するまたはこれと会合する抗体から生成され得る。本明細書で使用される場合「決定因子」または「標的」は、特定の細胞、細胞集団または組織で同定可能的に伴われるまたはこれらにおいてもしくはこれらの上で特異的に見出される任意の検出可能な形質、特性、マーカーまたは因子を意味する。決定因子または標的は、形態学的、機能的または生化学的性質であってもよく、好ましくは表現型である。ある特定の好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点におけるまたは特定の微小環境における細胞）によって異なって発現（過剰発現または過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＲＮＦ４３タンパク質またはそのスプライスバリアント、アイソフォームもしくはファミリーメンバーまたはこれらの特異的ドメイン、領域もしくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」または「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入されたときに免疫応答を刺激できるおよび免疫応答により生じる抗体によって認識される任意のタンパク質または任意の断片、領域もしくはドメインを意味する。本明細書で検討される決定因子の存在または不在は、細胞、細胞小集団または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞またはＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋または結合、つまり鎖間および鎖内ジスルフィド結合がある。当該分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置および数は、免疫グロブリンのクラスおよび種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラスまたは特定のサブクラスに限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンが、例示のために、本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合がある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖間に存在し、さらにそれぞれの重鎖からそれぞれの軽鎖に存在するジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に必須ではないことが実証された。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えとともにＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６およびＣ２２９（Ｅｕナンバリング）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖および重鎖間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパまたはラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
２．抗体生成および産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
Ａ．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）は抗原性タンパク質または抗原性タンパク質を含む細胞もしくは調製物で免疫化する。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清が、動物を出血させ、または屠殺することにより取得される。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、または抗体を部分的もしくは完全に精製して免疫グロブリン分画もしくは単離された抗体調製物を得てもよい。
任意の形態の抗原または抗原を含有する細胞もしくは調製物を、決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片または選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメインまたは全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、これらの表面上の抗原の少なくとも一部を発現している細胞で免疫化されている）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分のみで免疫化されている）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なタンパク質の少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドおよびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
Ｂ．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらの何らかの組合せを含む、様々な技術を使用して調製され得る。例えば、好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第１版 ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、第１版 ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ、第２版 １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマおよび生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合するいくつかのモノクローナル抗体を生成した後、特に適切な抗体を、例えば、決定因子に対するその親和性または内在化速度に基づいた様々なスクリーニングプロセスによって選択してもよい。特定の好ましい実施形態において、本明細書に記載されるように産生されるモノクローナル抗体は「出所」抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的への親和性を改善するため、細胞培養における産生性を向上させるため、インビボでの免疫原性を減少させるため、多重特異性構築物を生成するために修飾してもよい。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングのより詳細な説明は、下記および添付の実施例に示される。
Ｃ．ヒト抗体
抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）および／または下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
一実施形態において、組換えヒト抗体は、ファージディスプレイを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージまたは酵母ディスプレイライブラリである。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、抗体生成が観察され、この産生は、遺伝子再配列、アセンブリおよび完全ヒト抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および６，１５０，５８４；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、１９９５、ＰＭＩＤ：７４９４１０９）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得るまたはインビトロで免疫化され得る。）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
Ｄ．誘導された抗体
出所抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＲＮＦ４３抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、出所抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように既知の分子操作技術を使用して修飾または改変されてもよい。
Ｅ．キメラおよびヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＲＮＦ４３に結合するマウス抗体を含む。この抗体は、本開示の目的に関して、「出所抗体」とみなされ得る。選択された実施形態において、本発明に適合する抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域および／または抗原結合アミノ酸配列の場合による修飾を通じて誘導され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは全重鎖および軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるまたはアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導された」抗体は、標準的な分子生物学的技術を使用して、下記に記載されるように、例えば、決定因子に対する親和性を改善するために、抗体安定性を向上させるために、細胞培養における産生および収率を向上させるために、インビボにおける免疫原性を下げるために、毒性を下げるために、活性部分のコンジュゲーションを容易にするためにまたは多重特異的抗体を作製するために生成され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
一実施形態において、本発明のキメラ抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種またはクラス由来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片の対応する配列と同一または相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖および重鎖定常領域に操作可能に連結されている選択されたマウス重鎖および軽鎖可変領域の全てまたはほとんどを含んでもよい。他の特定の好ましい実施形態において、抗ＲＮＦ４３抗体は、本明細書に開示のマウス抗体から「誘導された」ものであり得る。
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種から誘導されるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属しており、抗体の残りは別の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。特定の好ましい実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナーまたは出所抗体）から誘導された１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のＦＲが、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性および抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。本発明に適合するＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体は、下記実施例１０に示されるように提供される。
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明にしたがってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂およびそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、それぞれ全体として本明細書に組み込まれるＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ １４：４６２８−４６３８に開示されている。ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４、２００５）を使用して適合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列も適合するアクセプター配列であり得、本教示にしたがって使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、出所抗体およびアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖および軽鎖可変領域の操作された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
例として、ＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体ならびに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および７，０８７，４０９を参照。
ＣＤＲグラフト化またはヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性またはホモロジーは、本明細書で議論したように決定され、本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％または６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
添付の図面に示される注釈の付されたＣＤＲおよびフレームワーク配列は、専売のＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらにしたがって定義されたものであることが理解される。しかしながら、本明細書で議論するように、当業者は、ＣｈｏｔｈｉａらまたはＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される番号付けスキームにしたがって、容易にＣＤＲを同定することもできる。
Ｆ．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒または他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製にとって、抗体上の細胞毒の位置および薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」または「部位特異的構築物」は、重鎖または軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変または（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体またはその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒または他の化合物とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の好ましい実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。操作された抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤであり得、これらのクラス内において、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得る。ＩｇＧ１構築物に関して、抗体の軽鎖は、それぞれＣ２１４が組み込まれたカッパまたはラムダのいずれかのアイソタイプを含んでよく、Ｃ２１４は、好ましい実施形態において、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であり得る。
一実施形態において、操作された抗体は、鎖内または鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失または置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖の間または抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖または軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失または置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換または欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖または重鎖の単一のシステインの変異または欠失によって、操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、スレオニンもしくはグリシン）または親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンもしくはイソロイシン）残基での置き換えを生じ得る。１つの特に好ましい実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失または置換システイン残基は、軽鎖（カッパまたはラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失または置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリにおける無傷な抗体の軽鎖または重鎖のいずれかの単一システインの欠失または置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
１つの特に好ましい実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失または置換されている。別の好ましい実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失または置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位または２２９位のシステインが欠失または置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。実施例１７においてこのような部位特異的構築物を示す。これらの好ましい構築物の概要を直下の表２に示す。ここで、全てのナンバリングはＫａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」または天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステインが欠失していることを示す。）。
Figure 2017518040
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジーと薬物負荷の化学量論は、抗体の保存された定常領域の操作に主に関わるので、全ての抗ＲＮＦ４３抗体に広く適用可能である。抗体の各クラスおよびサブクラスのアミノ酸配列および天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々な抗体の操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。
Ｇ．定常領域の修飾または改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換または修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異および／または修飾を含んでもよく、この置換または修飾により、化合物に好ましい特徴、例えば、限定されないが、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増強または減少、糖鎖結合および／またはジスルフィド結合の変化ならびに結合特異性の変更がもたらされる。
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＢ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、血清半減期の延長のような細胞毒性の増加および／または薬物動態の変化が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）を参照。
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長い、１０日より長い、１５日より長い、好ましくは２０日より長い、２５日より長い、３０日より長い、３５日より長い、４０日より長い、４５日より長い、２カ月より長い、３カ月より長い、４カ月より長いまたは５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、従って、抗体の投与頻度を減少させるおよび／または投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株またはバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイし得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上したまたは減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照。
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の増強または低下が導かれ得る。当該分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親もしくは非修飾抗体または天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強または減少している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんどまたは全く有さず、例えば、天然配列と比較してＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、開示された抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合および／もしくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターンまたは改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照。操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強または減少、標的に対する抗体の親和性の増加または抗体の産生促進のために有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能または改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体または二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、操作されたまたはバリアント発現系統を使用することにより、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現により、様々な生物または様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることによりまたはＦｃ領域を含む分子を発現させた後、炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
Ｈ．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体でまたは抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示にしたがって使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原またはこの免疫原性断片に免疫特異的に結合または反応し、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。
例示的な部位特異的断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質または受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の様式でそれらを修飾する（ただしおそらくはやや効率が劣る）、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、１つ以上の遊離システインを含むようにさらに操作されてもよい。
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常関連している少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子操作技術によりまたは無傷のもしくは完全な抗体もしくは抗体鎖の化学的もしくは酵素的処置（例えばパパインもしくはペプシン）を介してまたは組み換え手段により、取得することができる。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
Ｉ．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体およびコンジュゲートは、一価または多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子または特異的位置もしくは座位に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置またはエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じまたは異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合してもよい。）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物およびそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５ならびにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０およびＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合することができるまたは異種性ポリペプチドもしくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合することができる。好ましい実施形態は２つの抗原にのみ結合する（つまり、二重特異的抗体である）が、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３およびＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれかの都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
さらに他の実施形態において、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列、例えば、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域の少なくとも１部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインに、当業者に周知の方法を使用して、融合される。
Ｊ．抗体の組換え産生
抗体およびその断片は、抗体産生細胞から取得された遺伝子材料および組換え技術を使用して産生または修飾され得る（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２巻 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（編集）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１参照）。
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で周知の他のものを使用して分離されるとき、「単離される」または実質的に純粋にされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡおよびこの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖もしくは二本鎖またはＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖および重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸が、ライブラリから収集され得る。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。例示的ＩｇＧ１定常領域は、配列番号２に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。この点に関して、例示的な適合するカッパ軽鎖定常領域は、配列番号１に示されている。
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原または抗体）が検討される。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ・ウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
追加的にまたは代替的に、本発明のタンパク質配列は、公的データベースに対して検索を行い、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用されてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセントまたは類似度を上昇するように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、好ましい実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能または活性を保持する。
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。
本発明は、プロモーターに操作可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節およびプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞および宿主発現系も提供する。
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））または哺乳動物細胞もしくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターでコトランスフェクトされていてもよい。
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１および４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォームまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれかを使用することができ、例えば、ある特定の条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的または部分的にＥＰ ０ ２１６ ８４６、ＥＰ ０ ２５６ ０５５、ＥＰ ０ ３２３ ９９７およびＥＰ ０ ３３８ ８４１ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
本発明の抗体が、組換え発現または任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製または単離されてもよく、このことは、これが同定されることならびにその天然環境から分離および／もしくは回収されることならびに抗体の診断的または治療的用途に干渉する混入物から分離されることを意味する。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーションおよび親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。
Ｋ．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は選択され、クローン化され、所望の特徴、例えば、堅固な成長、抗体高産生および目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロでまたは同系遺伝子免疫不全動物においてインビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択、クローニングおよび拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学および生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作および発現させてもよい。
ナイーブなライブラリ（天然または合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）および抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージまたは酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリがファージまたは酵母で合成されるファージまたは酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージまたは酵母を単離して、これらから抗体または免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージまたは酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングに使用され得る他の方法および試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
ＩＶ．抗体の特徴
選択された実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローン化され、ならびに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生および下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物の接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＲＮＦ４３アイソフォーム）または標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、上記のように操作されて、免疫化学的特徴、例えば親和性または薬物動態が増強または洗練されてもよい。
１．中和抗体
選択された実施形態において、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」または「中和」抗体であり得、このことは、抗体が決定因子と会合して、前記決定因子の活性を、直接的にまたは決定因子と結合パートナー、例えば、リガンドまたは受容体（例えば、ＲＳＰＯ）との会合を予防することにより、阻止または阻害し得ることを意味し、それにより、そうしなければ分子の相互作用から生じる生物学的応答は中断され得る。過剰な抗体が、決定因子に結合する結合パートナーの量を、例えば、標的分子活性またはインビトロ競合結合アッセイにより測定するとき、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはより多く減少させる場合、中和またはアンタゴニスト抗体は、決定因子がそのリガンドまたは基質に結合することを実質的に阻害する。修飾された活性は、当該技術分野で認識されている技術を使用して直接的に測定され得るまたは変化した活性が下流で有する影響（例えば、腫瘍形成または細胞生存）により測定され得ることが理解される。
２．内在化抗体
発現されたＲＮＦ４３タンパク質の実質的に一部が腫瘍形成性細胞表面に関連して残っており、開示された抗体またはＡＤＣの局在化および内在化を可能にしているという証拠がある。好ましい実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と関連付けられるまたはコンジュゲートされる。特に好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
本明細書で使用するとき、「内在化する」抗体は、関連する抗原または受容体に結合する際に、細胞によって（任意の細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。治療的適用について、内在化は、好ましくは、それを必要とする対象においてインビボで生じる。内在化するＡＤＣの数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現がん幹細胞を殺傷するために十分な数であり得る。細胞毒またはＡＤＣの全体としての効力に依存して、一部の場合に、単一抗体分子の細胞への取込みは、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに十分である。例えば、いくつかの薬物は非常に強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化は、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳動物細胞に結合して内在化するかどうかは、下記実施例に記載されているものを含め、当該技術分野で認識されている様々なアッセイにより決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
３．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上または細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導する、促進するまたは生じさせる抗体を指す。好ましい実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＲＮＦ４３発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％を殺傷することができる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、濃縮された、区分された、精製されたまたは単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料またはがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術にしたがって監視および定量されてもよい。
４．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＲＮＦ４３に対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数または見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満または５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＲＮＦ４３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＲＮＦ４３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満または１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法およびフローサイトメトリを使用して決定され得る。
５．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）およびエピトープマッピング
本明細書で使用するとき、用語「ビニング」は、抗体を、抗原結合特性および互いに競合するかに基づいて、「ビン」に群分けするために使用する方法を指す。ビンの初期測定は、エピトープマッピングおよび本明細書に記載の他の技術を使用してさらに精査または確認されてもよい。ただし、抗体の各ビンへの実験的割り当てにより、開示された抗体の治療効能の指標となり得る情報が提供されることが理解される。図５Ａに示されるように、開示されたＲＮＦ４３抗体は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦと標識された少なくとも６つのビンに存在する。
より詳細には、選択された参照抗体（またはこの断片）が、二次試験抗体（つまり、同じビンにある抗体）との結合に対して競合するかは、当該技術分野で既知の方法および本明細書の実施例に記載の方法を用いて、決定することができる。一実施形態において、参照抗体は、飽和条件下でＲＮＦ４３抗原と関連付けられ、次いで、二次または試験抗体がＲＮＦ４３に結合する能力が、標準的免疫化学技術を使用して決定される。もし試験抗体が、ＲＮＦ４３に、抗ＲＮＦ４３参照抗体と同時に実質的に結合可能である場合、二次または試験抗体は、一次または参照抗体と異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が、同時にＲＮＦ４３に実質的に結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープまたは一次抗体によって結合されたエピトープと密接に（少なくとも立体的に）関連するエピトープと結合する。つまり、試験抗体は、抗原結合について競合し、参照抗体と同じビンとなる。
用語「競合」または「競合抗体」は、開示された抗体に関する内容で使用するとき、試験される抗体または免疫学的に機能的な断片が参照抗体の共通の抗原に対する特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される抗体間の競合を意味する。そのようなアッセイは典型的には、固体表面または細胞、非標識試験抗体および標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＲＮＦ４３またはこのドメインもしくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面または細胞に結合したラベルの量を決定することにより測定される。通常、試験抗体は過剰に存在するおよび／または最初に結合される。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の実施例で提供される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、抗ＲＮＦ４３抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
一般に、ビニングまたは競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；およびＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ参照）。
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；または、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリビーズアレイが挙げられる。
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体とともに群分けする。検出因子ｍＡｂと捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じまたは密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。好ましい実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７または０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９または１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（またはそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原および／または抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力および解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用を解析することのできる光学的現象を指す。
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層および内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中または異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１およびＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１およびＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。好ましい実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、ビンにおける抗体が結合する抗原上の特異的ドメインまたはエピトープを決定するためにさらなる特徴付けを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコールを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。 用語「エピトープ」は、一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体によって認識され、特異的に結合することが可能な標的抗原の一部を指す。ある特定の実施形態において、エピトープまたは免疫原性決定因子は、化学的に活性な表面分子基、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含み、ある特定の実施形態において、特別な３次元構造特徴および／または特別な電荷特徴を有し得る。ある特定の実施形態において、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物における標的抗原を優先的に認識するとき、その抗原に特異的に結合すると称される。
抗原がポリペプチド、例えばＲＮＦ４３であるとき、エピトープは、一般的に、連続アミノ酸と非連続アミノ酸の両方から、タンパク質の三次元折り畳みの並置により形成され得る（「配座エピトープ」）。このような配座エピトープにおいて、相互作用点は、互いに線状に分離されたタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。連続アミノ酸から形成されたエピトープ（しばしば「線状」または「連続」エピトープと呼ばれる）は、通常、タンパク質変性に際して保持されるが、一方で、三次元折り畳みから形成されたエピトープは、通常、タンパク質変性に際して失われる。抗体エピトープは、通常少なくとも３、より一般的には少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を、特有の空間的立体配置に含む。エピトープの決定方法または「エピトープマッピング」は、当該技術分野で周知であり、本開示と組み合わさって、開示された抗体により結合されたＲＮＦ４３上のエピトープを同定するために使用され得る。
適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−６３）またはペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出および抗原の化学的修飾のような方法も利用され得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。他の適合する方法としては、酵母ディスプレイ方法が挙げられる。他の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても知られる改変援用プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類する方法を提供する（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。この技術は、遺伝的に別個の抗体に着目して特徴付けを行うことができ、遺伝的に別個の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ＭＡＰを使用して本発明の抗ＲＮＦ４３抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に分類することが好ましい。
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対する抗体を、例えば、本発明に記載の技術を使用してエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。代替的に、ディスカバリ工程の間に、抗体の生成および特徴付けは、特別なドメインまたはモチーフに位置する所望のエピトープについての情報を解明し得る。この情報に基づいて、同じエピトープに結合する抗体を、競合的にスクリーニングすることができる。このことを達成するためのアプローチは、抗原に対する結合について競合する抗体を見出すための競合試験を行うことである。交差競合に基づいて抗体をビニングするためのハイスループットプロセスは、ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。ビニングまたはドメインレベルの他の方法または抗体競合もしくは酵母上の抗原断片発現を含むエピトープマッピングも、当該技術分野で周知である。
Ｖ．抗体コンジュゲート
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、医薬として活性なまたは診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）または「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法に関わらず、任意の医薬として活性なまたは診断的成分と本発明の抗体との共有結合的または非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシンまたはシステイン残基を通じて達成される。特に好ましい実施形態において、医薬として活性なまたは診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲーションされ得る。開示されるＡＤＣは、治療および診断目的のために使用され得る。
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒または他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞および／またはＲＮＦ４３を発現している細胞）に送達し得る。本明細書で使用される場合、用語「薬物」または「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」は相互に交換可能に使用でき、生物学的に活性なまたは検出可能な分子もしくは化合物、例えば、下記に記載された抗がん剤を意味する。「ペイロード」は、場合によるリンカー化合物と組み合わせた薬物または弾頭を含み得る。コンジュゲート上の弾頭は、ペプチド、タンパク質またはインビボで代謝されて活性薬剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子および放射性同位体を含み得る。有利な実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロードを、ペイロードの放出および活性化の前に、比較的非反応性の非毒性の状態で標的部位に向かわせる。ペイロードのこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステインを介して）および過剰にコンジュゲートされた毒性種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物を通じて達成される。ペイロードを大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合されて腫瘍部位に送達されると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的な毒性を実質的に低減し得る。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞および組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
本発明の好ましい実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）のペイロードを含むが、診断剤および生体適合性修飾剤のような他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより、提供される標的化放出から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤または生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的にまたは非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。本発明のコンジュゲートは、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＲＮＦ４３抗体を含み、
ｂ）Ｌは、場合によるリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、１から２０の整数である）
またはその医薬として許容される塩によって表され得る。
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカーおよび薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システインまたはリシン）と会合する任意の薬物または薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対する部位特異的コンジュゲーションを可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明の特に好ましい実施形態は、薬物または薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび混入物がより少なく、対応して毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。本発明の教示と適合する例示的なペイロードは、以下に記載される：
１．治療剤
本発明の抗体は、治療成分または抗がん剤のような薬物である、医薬として活性な成分、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、融合または他の方法で関連付けられてもよい。
好ましい例示的な抗がん剤（それらのホモログおよび誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリチアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（免疫原）のようなマイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカインならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩もしくは溶媒和物、酸、もしくは誘導体が挙げられる。
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチンおよびオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチンまたはε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾もしくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体または誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブ（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体およびパクリタキセルおよびＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシンおよびエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビンおよび５−フルオロウラシル デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチンおよびアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシンならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を含む。
ある特定の選択された実施形態において、開示された抗体は、１つ以上のカリケアミシンにコンジュゲートされる。本明細書で使用するとき、用語「カリケアミシン」は、カリケアミシンγ１Ｉ、カリケアミシンβ１Ｂｒ、カリケアミシンγ１Ｂｒ、カリケアミシンα２Ｉ、カリケアミシンα３Ｉ、カリケアミシンβ１ｉおよびカリケアミシンδ１のいずれか１つならびにそれらのｎ−アセチル誘導体およびスルフィドアナログの意味とされる。ある特定の実施形態において、開示された抗体薬物コンジュゲートのカリケアミシン成分は、Ｎ−アセチルカリケアミシンγ１Ｉを含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒおよび２１１Ａｔが挙げられる。他の放射性核種も診断剤および治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤおよびその医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を、弾頭として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（および場合によるリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７およびＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６およびＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。
本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にもコンジュゲートされ得る。例えば、特に好ましい実施形態において、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（または別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）およびＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
２．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォアまたは放射性同位体であり得る診断剤もしくは検出剤、マーカーまたはレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生もしくは進行を監視するのに、または開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するためのもしくは処置の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として有用であり得る。このようなマーカーまたはレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合または抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離もしくは単離するためにまたは前臨床的手法もしくは毒性研究においても、有用であり得る。
このような診断、解析および／または検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオンおよび特定の放射性同位体に放射標識またはコンジュゲートした分子にカップリングすることによって行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
他の実施形態において、抗体またはその断片は、マーカー配列または化合物、例えば、ペプチドまたはフルオロフォアに融合またはコンジュゲートされて、精製または診断または分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７６７）および「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善または緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体または融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量および分子構造で取得され得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じてまたはリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーありまたはなしで、抗体または抗体断片または誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状または分岐ポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体もしくは抗体断片をインビボでより安定にするためにまたはインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；およびＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示にしたがって容易に同定され得る。
４．リンカー化合物
多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステインまたはリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的またはそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
多数の適合リンカーは、求核性である還元されたシステインおよびリシンに有利に結合し得る。還元されたシステインおよびリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィドおよびチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、この速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、および抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失または移行である。しかしながら、好ましい実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、実施例１３において本明細書で示される選択的還元および部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィドおよびピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホンおよびチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
好ましい実施形態において適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体および単量体状態における自由な可溶性を保持する。細胞への移動または送達の前に、ＡＤＣは、好ましくは安定であり、無傷のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断または分解されるように設計されている。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達または輸送されるまで、安定および無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；および（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果または細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣならびに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体および薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。２つ以上の機能的または生物学的に活性な部分を結合するために有用である２価のリンカー試薬、例えば、ＭＭＡＥおよび部位特異的抗体は公知であり、それらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されてきた。
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカーおよび非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能リンカーおよびジスルフィドリンカーを含み得、好ましくは標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出および活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾンまたはオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーマル−特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標および抗体標的に依存する。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマルまたはエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の好ましい実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されているようなＶａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−ＡｌａリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、薬剤がコンジュゲートされると通常減弱化され、コンジュゲートの血清安定性が通常高いことである。
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ｐＨ５．５または５．０未満のほぼリソソームのｐＨで不安定である。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
特に好ましい実施形態において（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される）適合ペプチジルリンカーは、
Figure 2017518040
 （式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡは抗ＲＮＦ４３抗体であり、Ｌ１はリンカーであり、ＡはＬ１を抗体上の反応性残基に連結する連結基（場合によってスペーサーを含む）であり、Ｌ２は共有結合であるまたは−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は切断可能なリンカーである。）を含む。
Ｌ１は、好ましくは切断可能リンカーであり、切断のためのリンカーの活性化のための引き金と称され得る。
存在する場合、Ｌ１およびＬ２の性質は、広く変動し得る。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸もしくは塩基不安定性）、温度の変化または放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元または酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含み得る。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
さらに、カルボキシルまたはアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕおよびＬｙｓに対して、ＣＯおよびＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、それにより薬物の放出を可能にする。
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基から誘導され得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基から誘導され得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基から誘導され得る。
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチンおよびシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体および天然に存在するアミノ酸の誘導体；ならびに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態およびそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒になって基：
Figure 2017518040
 （式中、アスタリスクは、薬物または細胞毒性剤の位置に対する（任意選択的にスペーサーを介した）結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である。）を形成する。フェニレン環は、本明細書に記載の１、２または３つの置換基で置換されていてもよい。
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
一実施形態において、ｎは０または１である。好ましくは、ｎは０である。
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
別の特に好ましい実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカーおよびジペプチドを含み、一緒になって、以下に図示される基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し得る：
Figure 2017518040
 （式中、アスタリスクは、選択された細胞傷害性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す。）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、保護された化合物（すなわち細胞毒）を、以下に示す流れに沿って進み、明確な放出を可能にする：
Figure 2017518040
 （式中、Ｌ＊は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である。）。薬物の明確な放出により、確実に所望の毒性活性が維持される。別の好ましい実施形態において、リンカーは、−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣを含む。
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
Ｌ１およびＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰまたは本明細書に記載の穏やかな還元剤での処置によってリンカー試薬とコンジュゲーションするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システインおよび（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている、糖のヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられる。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；および（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルが挙げられ、それらのいくつかは、以下のように例示される：
Figure 2017518040
特に好ましい実施形態において、部位特異的抗体と薬物−リンカー部分との連結は、部位特異的抗体の遊離システインのチオール残基およびリンカー上に存在する末端マレイミド基を通じる。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、
Figure 2017518040
 （式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す。）である。この実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインから誘導される。他の適合リンカーに関して、結合部分は、活性化残基と反応して所望のコンジュゲートを提供し得る末端ヨードアセトアミドを含む。いずれにしても、当業者は、開示された薬物−リンカー化合物のそれぞれと適合抗ＲＮＦ４３抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートし得る。
５．コンジュゲーション
いくつかの当該技術分野で認識されている様々な反応を使用して、薬物部分および／またはリンカーが選択された抗体に結合してもよいことが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。特に好ましい実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニンおよびセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて開示されたペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るために仕立てられる。
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミドおよびヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインのシステインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよくまたはリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件および試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；および（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、および化合物と共有または非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処置により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオールまたはリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬または化合物−リンカー中間体または薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物またはリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分またはリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられる。
好ましいコンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホラミダイトが挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類またはハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８および９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできるイソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
化合物をスレオニンまたはセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリンまたはスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的におよび迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
特に好ましい実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（またはその断片）に、１、２、３、４またはより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位および／または新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体または改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性および実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内または鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全または部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元およびそれに対する薬物リンカーの方向をさらに提供する。部位の改変および選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなる。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作および選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物および非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物および開示された新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態および／または薬力学ならびに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、遊離システインは還元されると、例えば、上記で開示するものなどのリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる、求核性であるチオール基を含む。本発明の好ましい抗体は、還元可能な不対の鎖間または鎖内システイン、すなわちこのような求核性基を提供するシステインを有する。したがって、ある特定の実施形態において、還元された不対のシステインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミドまたはハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処置により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にしてもよい。各遊離システインは、したがって論理的に、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬が適合する一方、部位位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に公知の様々な反応、条件および試薬を使用して達成され得ることが理解される。
さらに、操作された抗体の遊離システインは、天然の鎖間または鎖内のジスルフィド結合から導入または誘導された場合でも、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上および望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内または分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」または「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、選択的還元は、特定の還元剤により影響を受け得る。他の好ましい実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒で選択的に還元された操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤の使用は、抗体重鎖および軽鎖のコンジュゲーションの程度ならびに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節および／または立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を形成（水素結合および静電相互作用を介して）することが知られており、好ましい構造変化を生じさせ得るおよび／または好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させ得る安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（および分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、これにより、本明細書に示すように作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルは相当に減少する。
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の好ましい実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の好ましい実施形態において、アミン部分は、三級アミンまたはグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリンおよびシステインを含み得る。さらに適合安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の好ましい実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の好ましい実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算または決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションのための遊離の部位特異的システインの還元を生じる任意の化合物を含み得る。このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤または還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」または「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（場合によって安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質または条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤または条件は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく遊離システインを効果的に還元（チオールを提供）することができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。好ましい実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、特に好ましい実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオールおよび２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（本発明では、軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはそれ以上である。
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生または保存されるときに、阻止またはキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることがさらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオンおよびスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防または阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じまたは異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、無キャップ反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元または選択的還元）中に生じることが理解される。
６．ＤＡＲ分布および精製
本発明の部位特異的抗体とのコンジュゲーションの利点の１つは、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力である。この点に関して、開示された構築物および／または選択的コンジュゲーションにより、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点で試料内のＡＤＣ種の均質性が提供される。上記で簡単に述べたように、用語「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」は、抗体に対する薬物のモル比を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、調製物内で、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関しても均一である特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明のある特定の実施形態において、部位特異的抗体および／または選択的還元ならびにコンジュゲーションの使用を通じて所望の均質性を達成することができる。他の好ましい実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の特に好ましい実施形態において、調製物は、分析的または分取クロマトグラフィー技術を使用してさらに精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）またはキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）または混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
開示されたＡＤＣおよびその調製物は、抗体の構成および少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分および抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１〜２０の弾頭を含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である。）。他の選択された実施形態は、１〜１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１〜１２の弾頭、またはより好ましくは１〜１０の弾頭を含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性および弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物および他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞６は、凝集、不溶性、毒性またはある特定の抗体薬物コンジュゲートの細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される実際の薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る。）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４または６であり、特に好ましい実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
本発明により提供される均質性の比較的高いレベルにもかかわらず、開示される組成物は、１から８の範囲の薬物化合物とのコンジュゲートの混合物（ＩｇＧ１の場合）を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成抗体のほとんどは１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（選択的還元のコンジュゲート特異性にもかかわらず）この薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合し得る。つまり、以下の本発明のコンジュゲートＡＤＣ組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するコンジュゲートの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされるある特定の反応混入物を含む）。選択的還元および作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値または特異度、平均値、範囲または分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
したがって、ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の好ましい実施形態において、本発明は、２、４、６または８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された好ましい実施形態において、本発明は、２＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲または偏差は、ある特定の好ましい実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７もしくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６もしくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２もしくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、またはさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６または８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。特に好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２）は、他のＤＡＲ種に対して測定するとき、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度またはさらに９７％超の濃度で存在する。
下記実施例に詳述されるように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、従来手段、例えば、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡおよび電気泳動法により特徴付けられ得る。抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も決定され得る。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値が決定され得る。しかしながら、抗体あたりの薬物の分布の値は、抗体−抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界により識別可能でない。さらに、抗体−薬物コンジュゲートの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体に結合する場所、例えば、重鎖もしくは軽鎖断片または特定のアミノ酸残基を判別しない。
ＶＩ．診断およびスクリーニング
１．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断または監視するためのインビトロまたはインビボの方法ならびに患者からの細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞（例えば、ＣＳＣ）を含む腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。このような方法は、がんの処置または進行監視のためのがんを有する個体を同定することであって、患者また患者から取得した試料（つまり、インビボまたはインビトロのいずれか）を本明細書に記載の抗体と接触させることおよび試料中の標的分子に結合または遊離している抗体の存在もしくは不在または結合のレベルを検出することを含む、同定することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、本明細書に記載の検出可能な標識とレポーター分子とを含む。
いくつかの実施形態において、抗体と試料中の特定の細胞との関連は、試料が、本発明の抗体の標的であるタンパク質（例えば、ＲＮＦ４３）を発現し、したがって、がんを有する個体が、本明細書に開示の抗体または抗体薬物コンジュゲートで有効に処置され得ることを示すことを指し得る。試料は、多数のアッセイを使用して、例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫吸着法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析およびフローサイトメトリーアッセイを使用して解析され得る。インビボの適合する診断治療または診断に適合するアッセイは、当該分野で認識されている画像化または監視技術を含むことができ、例えば、当業者に知られているような磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子放射断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波などを含む。
別の実施形態において、本発明は、がんの進行および／または病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、がんの進行および／または病因のインビボでの解析は、腫瘍の進行の程度を決定することを含む。さらなる実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍の進行の解析が、原発性腫瘍に対して行われる。別の実施形態において、解析は、当業者にとって既知のように、がんの種類に応じて経時的に行われる。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移性細胞に起因する二次性腫瘍の解析が、さらにインビボで行われる。別の実施形態において、二次性腫瘍の大きさと形状が解析される。いくつかの実施形態において、さらにエクスビボの解析が行われる。
別の実施形態において、本発明は、がんの進行および／または病因をインビボで解析する方法であって、細胞の転移を決定することまたは循環腫瘍細胞のレベルを検出することおよび定量することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の解析は原発性腫瘍から不連続の部位において、細胞の進行性成長を測定することを含む。別の実施形態において、細胞転移の解析部位は、新生物の拡散経路を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、血管、リンパ、体腔内またはそれらの組合せを通じて分散することができる。別の実施形態において、細胞転移解析は、細胞遊走、播種、血管外漏出、増殖またはそれらの組合せの結果として行われる。
したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血漿または血液）中のＲＮＦ４３レベルを検出および定量するために使用することができ、同様に、増殖性障害を含むＲＮＦ４３関連障害を、検出、診断または監視するために使用することができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボまたはインビトロのいずれかで検出、監視および／または定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。
本発明のある特定の実施形態において、対象または対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療またはレジメンのベースラインが確立される前に、開示された抗体を使用して評価または特徴付けされ得る。他の例において、腫瘍形成性細胞は、処置された対象から誘導される試料から評価され得る。いくつかの例において、試料は、対象が処置を開始または終了してから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６カ月、９カ月、１２カ月または＞１２カ月後の対象から得られる。ある特定の実施例において、腫瘍形成性細胞は、一定数の投与の後（例えば、治療の１、２、３、４、５、１０、２０、３０回以上の投与の後）に、評価または特徴付けされる。他の例において、腫瘍形成性細胞は、１回以上の治療を受けてから１週、２週、３週、１カ月、６週、２カ月、１年、２年、３年、４年以上後に、特徴付けまたは評価される。
別の態様において、下記にさらに詳細に記載されるように、本発明は、過剰増殖障害の検出、監視または診断のための、可能性のある処置のためにそのような障害を有する個体を同定するためのまたは患者の障害の進行（または退行）を監視するためのキットを提供し、ここで、キットは、本明細書に記載の抗体および試料に対する抗体の影響を検出するための試薬を含む。
本発明のさらに別の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）における使用のための標識された抗ＲＮＦ４３抗体の使用を含む。この点に関して、ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断を補助するためのおよび抗ＲＮＦ４３抗体療法を含む処置に対する可能性のある応答を監視するための診断ツールとして使用することができる。適合する診断アッセイは、化学的に固定された（例えば、限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロムおよびピクリン酸）ならびに包埋された（例えば、限定されないが、グリコールメタクリレート、パラフィンおよび樹脂）または凍結を介して保存された、組織に対して実施され得る。このようなアッセイは、処置の決定に対する道筋をたて、投与レジメンおよびタイミングを決定するために使用され得る。
２．スクリーニング
ある特定の実施形態において、抗体は、決定因子との相互作用により腫瘍細胞の機能または活性を変化させる化合物または薬剤（例えば、抗体またはＡＤＣ）を同定するために、試料をスクリーニングするために使用され得る。一実施形態において、腫瘍細胞は、抗体またはＡＤＣと接触され、この抗体またはＡＤＣは、ある特定の標的（例えばＲＮＦ４３）を発現する細胞について腫瘍をスクリーニングするために使用され、このような細胞を例えば限定されないが診断目的などの目的のために同定すること、このような細胞を監視して処置の有効性を決定することまたはこのような標的発現細胞のための細胞集団を濃縮することができる。
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験薬剤または化合物に直接的または間接的に接触させることと、試験薬剤または化合物が、決定因子関連腫瘍細胞の活性または機能を調節するかどうか、例えば、細胞の形態または生存性の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、細胞の呼吸作用、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟性、増殖性、生存性、アポトーシスまたは細胞死を調節するかどうかを決定することとを含む。直接的相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方で、間接的相互作用としては、例えば、参照実体（例えば、細胞または細胞培養物）に順に作用する中間的分子に対する組成物の作用が挙げられる。
スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングを含み、この方法は、例えば、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラボトルまたはプレート上に、任意選択的に所定の位置において、配置されたまたは置かれた細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。ハイスループットのロボットまたは手作業による方法は、化学的相互作用を調べ、短期間に多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナルを利用する、例えば、フルオロフォアまたはマイクロアレイを介する技術（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）が開発され、さらに情報を非常に迅速に処理する解析（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）が自動化されてきた。スクリーニングされ得るライブラリは、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリおよびアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
ＶＩＩ．医薬調製物および治療的使用
１．製剤および投与経路
本発明の抗体またはＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまままたは最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で場合によって適切な医薬として許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「医薬として許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバントおよび希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照）。
適切な医薬として許容される担体は、比較的不活性である物質を含み、抗体の投与を容易にすることができるまたは活性化合を作用部位に送達するために医薬として最適化された調製物に処理することを補助し得る。
このような医薬として許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集または溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤および皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびこれらの組合せを含む。全身投与のための抗体は、経腸的、非経口的または局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的および経口的薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。
経腸投与のために適切な製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤およびこれらの制御放出形態を含む。
非経口投与（例えば、注射による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化または他の方法で（例えば、リポソームまたは他の微小粒子系で）提供される水性または非水性、等張性、発熱物質不含、滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の医薬として許容される抗体、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤および製剤を対象とするレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。 このような製剤に使用するための適切な等張の医薬として許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液または乳酸リンゲル注射剤を含む。
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合する製剤は、約１０μｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの濃度のＡＤＣまたは抗体を含み得る。ある特定の選択された実施形態において、抗体またはＡＤＣの濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬを含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣの濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬを含む。
本発明の化合物および組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮およびくも膜下腔内またはそれ以外に移植もしくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体または気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルが挙げられる。適切な製剤および投与経路は、意図する適用および治療レジメンにより選択され得る。
２．投与量
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体ならびに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態および処置される状態の重症度、処置される対象の年齢および全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能および投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害または状態のマーカーに基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、評価は、触診または視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善および腫瘍試料の顕微鏡検査、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）または本明細書に記載の方法により特定された抗原、増殖性または腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少または転移の発生の遅延の測定を含む。
本発明のＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重および用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
選択された実施形態において、ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは、用量あたりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内に）投与される。他の実施形態は、用量あたり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｇ／ｋｇ体重でのＡＤＣの投与を含む。他の好ましい実施形態において、開示されたコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり１２、１４、１６、１８または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察ならびに標準的な医学および生化学的技術および測定に基づいて、様々なＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されているような．体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、彼または彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投与量および１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与され得る。当該分野で認識されているまたは実験技術が適切な投与量を決定するために使用され得ることも理解される。
抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは特別なスケジュールで投与されてもよい。一般に、ＲＮＦ４３コンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、ＡＤＣの有効量は、対象に、１カ月に１回、１カ月に２回以上または１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年または数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６もしくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８週間）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８カ月間）またさらには１もしくは数年間が、開示された抗体またはＡＤＣの投与間に経過し得る。
ある特定の好ましい実施形態において、コンジュゲート抗体を含む処置の過程は、数週間または数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与することを含む。より詳細には、本発明の抗体またはＡＤＣは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週毎に１回、１０日毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、１カ月毎に１回、６週毎に１回、２カ月毎に１回、１０週毎または３カ月毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答および診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。
投与量およびレジメンも、開示された組成物を個体に１回以上投与して実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたまたは観察された副作用または毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加または減少または減弱化してもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害または状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。がんに関して、これらには、触診または視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善および腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）または本明細書に記載の方法により特定された腫瘍形成性抗原、疼痛または麻痺の減少、会話、視力、呼吸もしくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増加または容認された試験もしくは生存の延長によって測定される生活の質の向上の測定が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移ならびに過去および現在に使用している処置に依存して変わることを認識する。
３．併用療法
併用療法は、がんの予防または処置およびがんの転移または再発の予防に有用であり得る。「併用療法」は、本明細書で使用するとき、少なくとも１つの抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣと少なくとも一つの治療成分（例えば、抗がん剤）との組合せ投与を意味し、ここで組合せは、好ましくは、がんの処置において、（ｉ）抗ＲＮＦ４３抗体もしくはＡＤＣの単独使用、（ｉｉ）治療成分の単独使用または（ｉｉｉ）抗ＲＮＦ４３抗体もＡＤＣも含まない別の治療成分と組み合わせた治療成分の使用を上回る治療的相乗作用を有するまたは測定可能な治療効果を改善する。用語「治療的相乗作用」は、本明細書で使用される場合、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せの相加的効果よりも大きい治療効果を有する、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せを意味する。
開示された組合せの所望の転帰は、対照またはベースラインの測定に対する比較によって定量される。本明細書で使用される場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」または「減少させる」は、対照、例えば、本明細書に記載の処置の開始前の同じ個体の測定値または本明細書に記載の抗ＲＮＦ４３抗体もＡＤＣも不在であるが、標準治療処置などの他の治療成分の存在下における対照個体（もしくは複数の対照個体）の測定値に対する値を示す。代表的な対照個体は、処置されている個体と同じ形態のがんに罹患しており、処置されている個体とほぼ同じ年齢の個体である（処置される個体および対照個体の疾患の病期が同等であることを確実にするため）。
治療に応答した変化または改善は、一般に、統計学的に有意である。本明細書で使用される場合、用語「有意性」または「有意」は、２つ以上の実体間に非ランダムな関係がある確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるまたは「有意性」を有するかどうかを決定するために「ｐ値」が計算され得る。ユーザー定義のカットオフ点を下回るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。
相乗的治療効果は、単一の治療成分もしくは抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣにより誘発される治療効果よりもまたは所与の組合せの抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣもしくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計よりも少なくとも約２倍大きいまたは少なくとも約５倍大きいまたは少なくとも約１０倍大きいまたは少なくとも約２０倍大きいまたは少なくとも約５０倍大きいまたは少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。また相乗的治療効果は、単一の治療成分もしくは抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣにより誘発される治療効果または所与の組合せの抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣもしくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％以上の治療効果の増加として観察され得る。相乗的効果は、組合せで使用したときに、治療剤の投与量の減少を可能にする効果でもある。
併用療法の実施において、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣおよび治療成分は、単一の組成物または同じもしくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物において、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣでの処置は、例えば、数分から数週間の間隔で、治療成分による処置に先行または追随してもよい。一実施形態において、治療成分と、抗体またはＡＤＣとの両方が互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）が、抗体と治療成分の投与の間に経過してもよい。
併用療法は、状態が処置されるまで、緩和されるまで、または治癒されるまで、様々なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回もしくは３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、投与されてもよくまたは連続的に投与されてもよい。抗体および治療成分は、１日おきにもしくは１週間おきに投与されてもよく、または一連の抗ＲＮＦ４３抗体もしくはＡＤＣ処置を行い、後にさらなる治療成分で１回以上処置してもよい。一実施形態において、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは１つ以上の治療成分と組み合わせて短期処置サイクルで投与される。他の実施形態において、組合せ処置は、長期処置サイクルで投与される。併用療法は、任意の経路を介して投与され得る。
本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣと放射線療法との組合せも提供する。用語「放射線療法」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを意味する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本明細書に開示の抗ＲＮＦ４３抗体と組み合わせてまたは抗ＲＮＦ４３抗体のコンジュゲートとして使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。場合によって、放射線療法は、単独用量としてまたは複数回の連続用量として投与されてもよい。
他の実施形態において、抗ＲＮＦ４３抗体またはＡＤＣは、下記の化学療法剤の１つ以上と組み合わせて使用され得る。
４．抗がん剤
用語「抗がん剤」または「化学療法剤」は、本明細書で使用される場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり、「医薬として活性な成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細には、「抗がん剤」は、細胞増殖性障害、例えば、がんを処置するために使用することができる任意の薬剤を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤が挙げられる。上記で議論した選択された実施形態において、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことができ、投与前に抗体と結合していてもよいことが理解される。ある特定の実施形態において、開示された抗がん剤は、抗体と連結されて、本明細書に開示のＡＤＣを提供する。
用語「細胞毒性剤」は、抗がん剤である場合もあり、細胞に毒性があり、細胞の機能を減少もしくは阻害するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。典型的には、物質は、生存生物に由来する天然に存在する分子（または合成的に調製された天然産物）である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素または酵素的に活性な細菌毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス菌体内毒素および菌体外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセン）または動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片および／またはバリアントを含む）が挙げられる。
抗がん剤としては、がん性細胞またはがん性になる可能性のある細胞もしくは腫瘍形成性後代（例えば、腫瘍形成性細胞）を生じる可能性のある細胞を、阻害または阻害するよう設計されている任意の化学薬剤が挙げられ得る。このような化学薬剤は、細胞成長または分裂に必要な細胞内処理に向かうことが多く、したがって一般的に急速に成長または分裂するがん性細胞に特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合し、したがって細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。このような薬剤は、例えばＣＨＯＰ製剤など、組合せで投与されることが多く、最も有効であることが多い。繰り返すが、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、開示された抗体とコンジュゲーションされ得る。
本発明の抗体と組み合わせて（またはコンジュゲートして）使用し得る抗体の例は、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カンフォスファミド、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、トルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン，ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファーニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリゴマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラパマイン、ロドルビシン、ゾラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎物質、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖錯体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロエチルアミン；トリコテシン類（Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ−Ａ阻害ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩または溶媒和物、酸もしくは誘導体を含む。腫瘍に対するホルモンの作用を調節するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤ならびに抗アンドロゲン剤ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビンおよびエスペラミシンならびに上記のうちのいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体なども本定義に含まれる。
さらなる抗がん剤は、商業的または臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的または臨床的に利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
用語「医薬として許容される塩」または「塩」は、分子または巨大分子の有機または無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。医薬として許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、医薬として許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が医薬として許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、医薬として許容される塩は、１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。
「医薬として許容される溶媒和物」または「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子または巨大分子との会合物を指す。医薬として許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
他の実施形態において、本発明の抗体またはＡＤＣは、現在臨床試験にあるまたは市販のいくつかの抗体（または免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。開示された抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＤＸ−１１０５およびＭＥＤＩ４７３６ならびにこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
他の特に好ましい実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
５．放射線療法
本発明は、抗体またはＡＤＣと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組み合わせも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、開示された抗体またはＡＤＣは、標的抗がん剤または他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６から７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量としてまたは複数回の連続用量として投与されてもよい。
ＶＩＩＩ．適応症
本発明は、本発明の抗体およびＡＤＣの、様々な障害、例えば、新生物、炎症性、血管新生および免疫学的障害ならびに毒素によって引き起こされる障害の診断、診断治療、処置および／または予防のための使用を提供する。特に、処置の主要な標的は、固形腫瘍を含む新生物障害であるが、液悪性腫瘍も本発明の範囲内である。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、特定の決定因子（例えば、ＲＮＦ４３）を発現する腫瘍または腫瘍形成性細胞を処置するために使用される。好ましくは、処置される「対象」または「患者」はヒトであるが、本明細書で使用するとき、それらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むものとして表される。
本発明にしたがった新生物状態の処置対象は、良性または悪性であり得、固形腫瘍および血液新生物であり得、限定されないが、以下の群から選択され得る；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ−関連がん、胞状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がんおよび移行上皮がん）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ ｂｏｎｅ ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨外性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢および胆管がん、胃がん、胃腸、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がんおよび子宮がん（子宮頚部癌、子宮内膜癌および平滑筋腫）。
他の好ましい実施形態において、開示された抗体およびＡＤＣは、肺がん、例えば、以下のサブタイプ：小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がんまたは扁平上皮小細胞肺がん）の処置に特に有効である。選択された実施形態において、抗体およびＡＤＣは、限定された病期の疾患または広範囲の病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の好ましい実施形態において、開示されたコンジュゲート抗体は、不応性患者（つまり、初期治療の全工程中または直後に疾患を再発する患者）、感受性のある患者（つまり、再発が一次治療から２〜３カ月後より長い患者）；または白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）および／もしくはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセルもしくはカバジタキセル）に耐性を示す患者に投与される。
他の特に好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣは、結腸直腸がんを処置するために使用され得る。本明細書で使用するとき、用語「結腸直腸がん」は、小腸より下の腸管（つまり、大腸（結腸）、例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸ならびに直腸）の細胞のがんによって特徴付けられる医学的病態として結腸直腸がんを定義する十分に容認された医学的定義を含むことを意味する。さらに、本明細書で使用するとき、用語「結腸直腸がん」は、十二指腸および小腸（空腸および回腸）の細胞のがんによって特徴付けられる医学的病態を含むことを意味する。本明細書で使用するとき、結腸直腸がんの定義は、一般的な医学的定義よりも拡大しているが、ただしそれは、十二指腸および小腸の細胞も、本発明の方法に適用され得るためである。さらに、本発明の化合物は、病期Ｉの結腸直腸がん、病期ＩＩの結腸直腸がん、病期ＩＩＩの結腸直腸がんまたは病期ＩＶの結腸直腸がんを処置するために使用することができる。
また本発明は、良性または前がん性腫瘍が存在する対象の防止または予防的処置を提供する。いかなる特定の種類の腫瘍または増殖性障害も、本発明の抗体を使用する処置から排除されない。
ＩＸ．製品
本発明は、１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体またはＡＤＣを含み得る。ある特定の実施形態において、パックまたはキットは、単位用量を含み、単位用量とは、例えば、本発明の抗体またはＡＤＣを、１つ以上の添加剤および場合によって１つ以上の抗がん剤を伴ってまたは伴わずに含む組成物の所定の量を意味する。
本発明のキットは、一般的に、適切な容器内に、本発明の抗体またはＡＤＣの医薬として許容される製剤を含有し、場合によって、同じまたは異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断または併用療法のいずれかのために、他の医薬として許容される製剤または装置を含んでもよい。診断装置または機器の例としては、細胞または増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化またはプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの全ての列挙について、上記参照）。特に好ましい実施形態において、装置は、インビボまたはインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視および／または定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の好ましい実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体またはＡＤＣを抗がん剤または診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９を参照）。
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、または適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の医薬として許容されるバッファーまたは他の希釈剤、例えば、注射用滅菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液またはデキストロース液を含み得る。キットが、本発明の抗体またはＡＤＣをさらなる治療薬または薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、または一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体またはＡＤＣおよび任意の場合による抗がん剤または他の薬剤は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
キットは、１つまたは複数の容器、および封入される組成物が選択される疾患状態の診断または処置に使用されることを示す標識または添付文書を、容器内に、容器上にまたは容器に付随して含んでもよい。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラスまたはプラスチックなどで形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを含んでもよく、例えば、容器は、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、抗体および任意の場合による成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射もしくは導入するまたは身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針またはシリンジ（充填済または空）、点眼器、ピペットまたは他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアルまたはそれと同様のもの、および市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアルおよび他の装置を配置および保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
Ｘ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点および終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
一般的に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学および化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法および技術は、一般的に、当該技術分野で周知のおよび本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
ＸＩ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願および出版物ならびに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦにおけるアミノ酸配列提出物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込む」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かに関わらず、参照により組み込む。前述の詳細な説明および以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
ＸＩＩ．ＸＶ．配列表の要約
本出願には、いくつかの核酸配列およびアミノ酸配を含む配列表を添付している。以下の表３は、含まれる配列の概要を提供する。
Figure 2017518040
なお、ｈＳＣ３７．６７ｖ１は、ヒト化抗体ｈＳＣ３７．６７から誘導されたバリアントであり、この軽鎖領域におけるＣＤＲＬ３の１アミノ酸でのみｈＳＣ３７．６７と異なっている。ｈＳＣ３７．６７とｈＳＣ３７．６７ｖ１の重鎖は同一である。下記実施例１０は、これらの抗体の生成をより詳細に説明する。
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施される全てまたは唯一の実験であると表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０−ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプおよびサブタイプの略称が以下の通り表４に示される：
Figure 2017518040
Figure 2017518040
［実施例１］
全トランスクリプトーム配列決定を使用したＲＮＦ４３発現の同定
がん患者に存在する固形腫瘍の細胞異質性を特徴付け、臨床的に関連する治療標的を同定するために、当該技術分野で認識されている技術を使用して、大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の個別の腫瘍細胞株を含むＰＤＸ腫瘍バンクは、様々な固形腫瘍悪性病変に罹患しているがん患者から初めに取得した腫瘍細胞の複数回継代により免疫不全マウスで増殖させた。低継代ＰＤＸ腫瘍は、天然環境にある腫瘍を表し、腫瘍の成長および現行治療に対する耐性を駆動させる根底のメカニズムに臨床的に関連する洞察を与える。
腫瘍細胞は、２つの種類の細胞小集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）と腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）とに大きく分けることができる。ＴＩＣは、免疫不全マウスに移植されたとき、腫瘍を形成する能力を有する。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍開始細胞の一区分であり、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）も、ＴＩＣの一区分であり、ＣＳＣと同様に、１次移植の腫瘍成長を亢進させる能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、一般に限定された数の細胞分裂しかできないからである。全トランスクリプトーム解析を実施するために、腫瘍バンクからのＰＤＸ腫瘍を、８００〜２，０００ｍｍ３に達した後でマウスから切除した。切除したＰＤＸ腫瘍を、当該技術分野で認識されている酵素消化技術（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４参照）を使用して、単一細胞懸濁液に解離した。解離されたバルク腫瘍細胞を、死細胞を検出するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、マウス細胞を同定するための抗マウスＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄ抗体ならびにヒト細胞を同定するための抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共にインキュベートした。さらに腫瘍細胞を蛍光コンジュゲート抗ヒトＣＤ４６および／またはＣＤ３２４抗体と共に、いくつかの場合にはＣＤ６６ｃと共に、インキュベートして、ＣＤ４６＋ＣＤ３２４＋ＣＳＣおよびＣＤ４６−ＣＤ３２４−ＮＴＧを同定し、この後、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１３／０２６０３８５、２０１３／００６１３４０および２０１３／００６１３４２）参照。ＣＲ４の場合、ＴＰｒｏｇ集団はＣＤ４６＋／ＣＤ３２４＋／ＣＤ６６ｃ＋と同定され、一方でＣＳＣ集団はＣＤ４６＋／ＣＤ３２４＋／ＣＤ６６ｃ−として同定された。
ＲＮＡを、１％の２−メルカプトエタノールを補足したＲＬＴプラスＲＮＡ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中の細胞に溶解させることによって、腫瘍細胞または正常組織から抽出し、溶解物を−８０℃で凍結させ、次いで、ＲＮＡを抽出するためにＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解物を解凍した。ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。得られた全ＲＮＡ調製物を、遺伝子配列決定および遺伝子発現解析により評価した。
高品質ＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定を、２つの異なるシステムを使用して実施した。いくつかの試料は、Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）４．５またはＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ次世代配列決定システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）配列決定を使用して解析した。他の試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００または２５００次世代シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して解析した。
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム解析を、バルク腫瘍試料由来の１ｎｇのＲＮＡから生成したｃＤＮＡで、低インプット全ＲＮＡについて設計したＡＢＩからの改変全トランスクリプトームプロトコールまたはＯｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して実施した。得られたｃＤＮＡライブラリを断片化し、配列決定実施の間の異なる試料からの断片ライブラリのプールを可能にするためにバーコードアダプターを加えた。ＳＯＬｉＤプラットフォームにより生成したデータは、公開されたヒトゲノムのＮＣＢＩバージョンｈｇ１９．２を用いたＲｅｆＳｅｑバージョン４７により注釈の付された３４，６０９遺伝子にマッピングされ、ほとんどの試料においてＲＮＡレベルの検証可能な測定を提供した。ＳＯＬｉＤプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域にマッピングされた測量単位ＲＰＭ（１００万あたりのリード数）またはＲＰＫＭ（１００万あたりキロベースあたりのリード数）を使用した転写産物発現値として名目上表され、基本的な遺伝子発現解析を、ＲＰＭ＿転写産物またはＲＰＫＭ＿転写産物として正規化および計数することが可能になっている。試験した全正常細胞の平均と比較して、ＲＮＦ４３ ｍＲＮＡは、ＣＲ ＰＤＸ腫瘍細胞株ＣＲ４、ＣＲ４２およびＣＲ４３で上昇していた（図１Ａ）。試験した正常組織は、結腸、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓および卵巣であった。ＣＳＣにおけるＲＮＦ４３ ｍＲＮＡの発現は、同じＣＲ ＰＤＸ株のＮＴＧ細胞の場合と比較して高かった。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞の小集団を含んでいるＣＲ４ ＰＤＸ株もＲＮＦ４３ ｍＲＮＡを発現し（図１Ａ）、この発現は、ＣＳＣおよびＮＴＧ細胞で観察されたレベルの中間程度と観察された。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ全トランスクリプトーム解析を、ＣＲおよびＬＵ ＰＤＸ腫瘍細胞から抽出した５ｎｇの全ＲＮＡを使用して生成したｃＤＮＡを用いて行った。腫瘍細胞を、ＣＳＣおよびＮＴＧ細胞集団について選別し、ＲＮＡを、ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム解析について記載したように抽出した。ライブラリを、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して作製した。得られたｃＤＮＡライブラリを断片化し、バーコード付加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域にマッピングされた測量単位ＦＰＭ（１００万あたりの断片数）またはＦＰＫＭ（１００万あたりキロベースあたりの断片数）を使用した断片発現値として名目上表され、基本的な遺伝子発現解析を、ＦＰＭ＿転写産物またはＦＰＫＭ＿転写産物として正規化および計数することが可能になっている。ＮＴＧ集団と比較して、ＲＮＦ４３ ｍＲＮＡの発現は、ＬＵ−ＳＣＣ（ＬＵ１２８）、ＬＵ−Ａｄ（ＬＵ１２３）のＣＳＣ腫瘍細胞小集団およびＣＲ ＰＤＸ腫瘍細胞株（ＣＲ１６、ＣＲ４３、ＣＲ６７、ＣＲ７８）で上昇していた（図１Ｂ）。ＲＮＦ４３ ｍＲＮＡ発現は、次の器官：食道、気管、胃、脾臓、皮膚、膵臓、肺、肝臓、腎臓、心臓および結腸においても、関連する正常組織と比較して、ＣＳＣの方が高かった（図１Ｂ）。
ＣＲ、ＬＵ−ＡｄおよびＬＵ−ＳＣＣ腫瘍で上昇したＲＮＦ４３ ｍＲＮＡ発現が特定されることは、ＲＮＦ４３が、有望な診断および／または免疫療法標的としてさらに評価する価値があることを表していた。さらに、ＣＲ、ＬＵ−ＡｄおよびＬＵ−ＳＣＣ腫瘍においてＲＮＦ４３の発現はＣＳＣの方がＮＴＧと比較して増加しており、このことは、ＲＮＦ４３がこれらの種類の腫瘍における腫瘍形成性細胞の良好なマーカーであることを示している。
［実施例２］
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した腫瘍におけるＲＮＦ４３ｍＲＮＡの発現
腫瘍細胞におけるＲＮＦ４３のｍＲＮＡ発現を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを使用して、産業上の標準プロトコールにしたがって様々なＰＤＸ細胞株に対して行った。ＲＮＡを、実施例１に記載のバルクおよび選別したＰＤＸ腫瘍細胞から抽出した。１ｎｇのＲＮＡを、高性能ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ材料は、ＲＮＦ４３特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して事前に増幅し、次いで後のｑＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
正常組織におけるＲＮＦ４３の発現（脂肪細胞、脳、メラノサイト、ＰＢＭＣおよび選別Ｂ、単球、ＮＫおよびＴ細胞、正常骨髄、唾液腺、精巣、胸腺、甲状腺、副腎、動脈、静脈、結腸、後根神経節、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、気管および血管平滑筋細胞）は、以下のＰＤＸ腫瘍細胞株のサブセット：ＢＲ、ＣＲ、ＥＭ、ＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＰＡおよびＯＶの発現と比較して低かった（図２Ａ）。さらに、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析を、上記のように、ＣＲ、ＧＡ、ＬＵおよびＰＡ ＰＤＸ腫瘍細胞株に実施し、実施例１に記載のようにＣＳＣおよびＮＴＧ細胞に選別した。試験したＣＲ（ＣＲ９１、ＣＲ６７、ＣＲ２）、ＧＡ（ＧＡ９）、ＬＵ−ＳＣＣ（ＬＵ２２）およびＰＡ（ＰＡ３３、ＰＡ５５）ＰＤＸ株は、ｍＲＮＡ発現が、ＣＳＣの方がＮＴＧと比較して増加しており、実施例１の知見、つまり、ＲＮＦ４３が腫瘍形成性がん細胞の良好なバイオマーカーであることが確認される（図２Ｂ）。まとめるに、これらのデータは、ＲＮＦ４３が、いくつかの腫瘍で発現しており、これらの適応症の抗体ベースの治療法の開発における良好な標的となり得ることを実証している。
［実施例３］
マイクロアレイを使用した腫瘍におけるＲＮＦ４３ ｍＲＮＡ発現の決定
ＲＮＦ４３発現を、マイクロアレイ解析を使用して決定し、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび全トランスクリプトーム解析を使用して得た結果を確認した。１〜２μｇの全腫瘍の全ＲＮＡを、実質的に実施例１に記載されるように、様々な種類のがんを含むＰＤＸ細胞株から取得した。試料を、ヒトゲノムにおける２７，９５８遺伝子および７，４１９ｌｎｃＲＮＡに対して設計された５０，５９９個の生物学的プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ＧＥヒト８×６０ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して解析した。標準的産業手段を使用して、強度値を正規化し、変換し、各試料について遺伝子発現を定量した。各試料におけるＲＮＦ４３発現の正規化強度を図３にプロットし、各腫瘍タイプに由来する幾何平均を水平棒で示す。
図３は、ＲＮＦ４３ ｍＲＮＡ発現が、正常組織（胃、脾臓、皮膚、ＰＢＭＣ、膵臓、卵巣、肺、肝臓、腎臓、心臓、結腸および乳と比較して、ＣＲとＥＭ、ＧＡ、ＫＤＹ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＰＡおよびＯＶのサブセットにおいて上昇していることを示している。様々なＰＤＸ腫瘍細胞株におけるＲＮＦ４３発現の上昇が観察されることは、実施例１および２の結果を確認するものである。このような知見は、ＲＮＦ４３発現レベルと、腫瘍細胞、特に、ＣＲおよびＧＡ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＯＶおよびＰＡ腫瘍のサブセットにおける腫瘍細胞との間で観測された関連性をさらに支持する。
［実施例４］
がんゲノムアトラスを使用した腫瘍におけるＲＮＦ４３の発現
様々な腫瘍におけるＲＮＦ４３ ｍＲＮＡの過剰発現を、がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）として知られる大規模な公的に利用可能な原発腫瘍および正常試料のデータセットを使用して確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームおよびＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからのＲＮＦ４３発現データを、ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードし、解析して各遺伝子の個々のエクソンからのリードを集計し、マッピングされたリード１００万あたりエクソンのキロベースあたりの単一値のリードを生成した（ＲＰＫＭ）。図４は、ＲＮＦ４３発現が、原発性ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＣＲ、ＧＡおよびＰＲ腫瘍において、ＴＣＧＡデータベースで見出される正常組織と比較して、上昇していることを示している。これらのデータは実施例１〜３の結果を確認するものであり、正常組織を上回る良好な治療指数が存在することを示唆し、したがって抗ＲＮＦ４３抗体およびＡＤＣが、これらの腫瘍の処置のための有用な治療薬となり得ることを示唆する。
［実施例５］
ＲＮＦ４３タンパク質のクローニングおよび組換え発現ならびに細胞表面ＲＮＦ４３タンパク質を過剰発現している細胞株の操作
ヒトＲＮＦ４３タンパク質をコードするＤＮＡ断片
ヒトＲＮＦ４３（ｈＲＮＦ４３）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６０２３３）に関連するすべての細胞材料を生成するために、全長ｈＲＮＦ４３オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡクローンを購入した（ＲＣ２１４０１３；Ｏｒｉｇｅｎｅ）。このｃＤＮＡクローンを、この後の全ての成熟ｈＲＮＦ４３タンパク質またはこの断片を発現する構築物の操作に使用した。
ｈＲＮＦ４３タンパク質をコードするレンチウイルスベクタープラスミドを作製するために、ｈＲＮＦ４３オープンリーディングフレームを上記テンプレートからＰＣＲを使用して増幅させ、得られたＰＣＲ産物を、レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位（ＭＣＳ）にサブクローニングした。このベクターには、Ｉｇκシグナルペプチド、次いでＤＤＤＫエピトープタグをコードするヌクレオチド配列をＭＣＳの上流に導入する修飾を予め行っていた。ＭＣＳ下流のＴ２Ａ配列は、ペプチド結合縮合のリボソームスキッピングを促進し、２つの独立したタンパク質の発現を生じさせる。つまり、Ｔ２Ａペプチドの上流でコードされるＤＤＤＫ−タグ化細胞表面タンパク質の高レベル発現と、Ｔ２Ａペプチドの下流でコードされるＧＦＰマーカータンパク質の共発現である。このクローニングステップにより、レンチウイルスベクタープラスミドｐＬ１２０−ｈＲＮＦ４３−ＮＦｌａｇが得られた。
ラットおよびカニクイザルＲＮＦ４３タンパク質をコードするＤＮＡ断片
ラットＲＮＦ４３タンパク質（ｒＲＮＦ４３）に関連して本発明で必要とする全ての分子および細胞材料を生成するために、ラットＲｅｆＳｅｑ ＲＮＦ４３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２９３９３）と同一のタンパク質をコードする合成ｃＤＮＡクローンを設計し、ＧｅｎｅＷｉｚから購入した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＲＮＦ４３タンパク質（ｃＲＮＦ４３）に関連する本発明で要求される全ての分子および細胞材料を生成するために、まずｈＲＮＦ４３タンパク質をコードするＤＮＡ配列対カニクイザル全ゲノムショットガンコンティグ配列データベースをＮＣＢＩでＢＬＡＳＴ検索することによりｃＲＮＦ４３オープンリーディングフレーム配列を推測し、ヒトおよびカニクイザル遺伝子間で保存されているエクソン／イントロン境界を観察し、ｃＲＮＦ４３をコードする推定カニクイザルオープンリーディングフレームを構築した。結果の解析から、ｈＲＮＦ４３とｃＲＮＦ４３タンパク質とが９６．２％同一であることが示された。この予測されるｃＲＮＦ４３タンパク質をコードする合成ＤＮＡクローンを設計し、ＧｅｎｅＷｉｚから購入した。
ラットおよびカニクイザルＤＮＡクローンを、様々なＰＣＲ反応の鋳型として使用して、ｒＲＮＦ４３またはｃＲＮＦ４３ ＥＣＤおよびヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２ Ｆｃタグのいずれかについてのキメラ融合遺伝子を生成した。簡単に述べると、データベースの注釈またはｈＲＮＦ４３タンパク質との配列アラインメントにより推測されるｒＲＮＦ４３またはｃＲＮＦ４３についての予測されるＥＣＤドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、インフレームで、Ｉｇκシグナルペプチド配列の下流におよびヒスチジンタグまたはヒトＩｇＧ２ Ｆｃ ｃＤＮＡのいずれかの上流に、標準的分子技術を使用してサブクローニングした。これらのＣＭＶ駆動発現ベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において高レベルの一過性発現を可能にする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の懸濁または付着培養物を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンポリマーを使用して、これらの発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションから３から５日後に、組み換えＨｉｓ−タグ化またはＦｃ−タグ化タンパク質を、清澄化した細胞上清から、ＡＫＴＡエクスプローラならびにＮｉｃｋｅｌ−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムまたはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）タンパク質Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムのいずれかをそれぞれ使用して精製した。
細胞株操作
ｈＲＮＦ４３タンパク質を過剰発現する操作された細胞株を、上記のｐＬ１２０−ｈＲＮＦ４３−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターを使用し、当業者に周知の標準的なレンチウイルス形質導入技術を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に形質導入して、構築した。ｈＲＮＦ４３発現細胞は、高発現ＨＥＫ２９３ＴサブクローンのＦＡＣＳ（例えば、ＧＦＰおよびＤＤＤＫエピトープタグの両方に強い陽性を示した細胞）を用いて選択した。
［実施例６］
抗ＲＮＦ４３抗体の生成
抗ＲＮＦ４３マウス抗体は、以下のように２つの異なる免疫化で産生した。第１の免疫化では、１匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、足蹠を介して、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）に乳化させた１０μｇの組換えヒトＲＮＦ４３−Ｆｃタンパク質（ｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；番号７９６４−ＲＮ）およびＣｐＧアジュバントを接種した。初回の接種後、マウスに、Ａｌｕｍで乳化した５μｇのｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃタンパク質、ＰＢＳおよびＣｐＧを７回（１週あたり２回）注射した。最終接種では、ＰＢＳ中の５μｇのｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃタンパク質を含めた。第２の免疫化では、６匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢの系統からそれぞれ２匹）を、１０μｇのｈＲＮＦ４３−Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ）で１週あたり２回、４週間かけて免疫化し、この２週間後に最終接種を行った。
マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径および内腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞（６０ｘ１０６細胞）の単一細胞懸濁液を、非分泌Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８０）と、１：１の比率で、エレクトロセルフュージョンにより、ＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅシステム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）モデルを使用して融合した。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清、１０％のＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＨＥＰＥ、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、１００ｍＬの選択培地を含むＴ２２５フラスコで培養した。フラスコを、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータ内に６日間配置した。
融合の６日後、ハイブリドーマライブラリ細胞を、フラスコから回収し、液体窒素中で凍結した。凍結バイアルをＴ７５フラスコ中に解凍し、翌日、ハイブリドーマ細胞を、９０μＬの補足ハイブリドーマ選択培地（上記の通り）中のウェルあたり１個の細胞（ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉ細胞ソーターを使用）で、１２Ｆａｌｃｏｎ ３８４ウェルのプレートに蒔いた。
ハイブリドーマを１０日間培養し、以下の通りに実施したフローサイトメトリを使用して、ｈＲＮＦ４３に特異的な抗体について上清をスクリーニングした。ｈＲＮＦ４３が安定に形質導入されたウェルあたり１ｘ１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５μＬのハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで洗浄し、次いで試料あたり２５μＬの１５分間ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで１：３００希釈したＦｃ断片二次特異的、ＤｙｅＬｉｇｈｔ６４９標識化ヤギ−抗マウスＩｇＧとインキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で再懸濁し、アイソタイプ対照抗体で染色した細胞の蛍光を超える蛍光について、フローサイトメトリにより分析した。未使用のハイブリドーマライブラリ細胞の残りは、今後のライブラリ試験およびスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
［実施例７］
抗ＲＮＦ４３抗体の特徴
実施例６で生成された抗ＲＮＦ４３抗体を、（ｉ）アイソタイプ、（ｉｉ）ＲＮＦ４３に対する親和性および（ｉｉｉ）ＺＮＲＦ３との交差反応性の点で特徴付けた。さらに、抗体を、ヒトＲＮＦ４３タンパク質の結合に対して互いに競合するかに基づいて、ビンに群分けした。
代表的な数の抗体のアイソタイプを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘマウス免疫グロブリン・アイソタイピング・キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、製造業者の指示にしたがって、決定した。明確なシグナルが得られない抗体は、当該分野の標準的プロトコールに従って配列解析に基づき、アイソタイプを割り当てた。特有のＲＮＦ４３特異的抗体についてのアイソタイピング分析の結果を図５Ａに示す。
ｈＲＮＦ４３タンパク質に対する選択された抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）マシンを使用して表面プラズモン共鳴により決定した。抗マウス抗体捕捉キットを使用してＣＭ５バイオセンサーチップ上にマウス抗ＲＮＦ４３抗体を固定化した。各抗原の注射サイクルの前に、マウス抗体を濃度０．０５〜１μｇ／ｍＬで、接触時間１分および流速５μＬ／分で表面上に捕捉させた。ベースラインからの捕捉抗体負荷は、８０〜１４０応答単位であった。抗体捕捉および１分間のベースライン後、実施例５で生成した単量体ｈＲＮＦ４３−Ｈｉｓ抗原を、濃度１０〜２００ｎＭの範囲で表面上に流し、１．５分の会合段階、次いで５分の解離段階を、流速１０μＬ／分で実施した。抗ヒト抗体捕捉キットを使用したことを除いて同様のプロトコールを使用して、ヒト化抗体の結合親和性を測定した。データは、特異的な抗体表面応答から対照非結合抗体表面応答を差し引いて処理し、データを会合および解離段階へ切り詰めた。得られた応答曲線を用いて、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを当てはめ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、計算したｋｏｎおよびｋｏｆｆ動態定数を用いて見かけの親和性を算出した。選択された抗体は、ｈＲＮＦ４３に対してナノモル範囲の親和性を示した（図５Ａ）。
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームを使用するＥＬＩＳＡアッセイを実施して、実施例６で生成した選択抗ＲＮＦ４３抗体が、ＲＮＦ４３の機能的ホモログであるＺＮＲＦ３に結合する能力を試験した。ＺＮＲＦ３は、機能的にＲＮＦ４３と類似しているが、全体的な配列相同性は２０％にすぎず（図５Ｂ）、したがって、抗ＲＮＦ４３抗体のＺＮＲＦ３との交差反応性は予期されなかった。プレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬのヒトＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３（いずれもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、３５μｌのＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて、６０分間室温でブロックした。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、１０μｌの用量設定した抗ＲＮＦ４３抗体（５００ｎｇ／ｍｌ〜０．０３２ｎｇ／ｍｌ、ＰＳＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）（ＰＢＳＴＡ）中に希釈）をプレートに添加し、６０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、１０μＬ／ウェルでＰＢＳＴＡ中０．５μｇ／ｍｌのスルホタグ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、番号Ｒ３２ＡＣ−５）を３０分間室温で添加した。ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ ＮＨＳ−エステルは、タンパク質の第一アミン基に弱塩基性条件下で容易に結合して安定なアミド結合を形成するアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴを界面活性剤と共に水中に１倍希釈して、３５μＬを各ウェルに加えた。プレートは、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００を使用して読み取った。試験した全ての抗体（例えば、ＳＣ３７．２、ＳＣ３７．４、ＳＣ３７．８、ＳＣ３７．１０、ＳＣ３７．１７、ＳＣ３７．２８、ＳＣ３７．３９、ＳＣ３７．２２６およびＳＣ３７．２３６）が、ＲＮＦ４３に結合したが、ＺＮＲＦ３への結合は示さなかった。さらに、陰性対照のマウスＩｇＧ１はいずれのタンパク質にも結合しなかった。対照的に、ヒトＦＣに融合したまたはマウス抗ヒトＦＣ抗体に融合したＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３タンパク質は、両方のタンパク質への結合を示した（ポジティブコントロール）。
抗体を、マルチプレックス競合イムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用してビンに群分けした。１００μｌの各特有の抗ＲＮＦ４３抗体（捕捉ｍＡｂ）を、１０μｇ／ｍＬの濃度で、抗マウスカッパ抗体（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）にコンジュゲートした磁気ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）とともに１時間インキュベートした。捕捉ｍＡｂ／コンジュゲート化ビーズ複合体を、ＰＢＳＴＡバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）で洗浄し、次いでプールした。残渣洗浄バッファーの除去後、ビーズを１時間、２ｇ／ｍＬのｈＲＮＦ４３−Ｈｉｓタンパク質と共にインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳＴＡに再懸濁した。プールされたビーズ混合物を９６ウェルプレートに分配し、各ウェルに特有の抗ＲＮＦ４３抗体（検出因子ｍＡｂ）を含有させ、振盪しながら１時間インキュベートした。洗浄工程の後、ＰＥにコンジュゲートされた抗マウスカッパ抗体（上記で使用したものと同じ）を５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、１時間インキュベートした。ビーズを再度洗浄し、ＰＢＳＴＡに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸ装置で測定した。抗体対合は、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数から計算した距離マトリックスの樹状図として視覚化した。ビニングは、樹状図と抗体の対のＭＦＩ値の解析とに基づいて決定した。図５Ａに示される結果は、スクリーニングされた代表的抗体が少なくとも６つの固有のビン（Ａ−Ｆ）に群分けすることができることを実証しており、ここで各ビンのメンバーはｈＲＮＦ４３タンパク質の結合について互いに競合する。
［実施例８］
ＷＮＴシグナル伝達に対する抗ＲＮＦ４３抗体の効果
ＷＮＴ経路は、細胞成長および分化を制御する重要な発生および幹細胞関連シグナル伝達経路である。古典的ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達経路（図６Ａ）において、ＷＮＴリガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体とＬＲＰ５／６共受容体との複合体に結合し、シグナル伝達カスケードを開始させて、タンパク質ＧＳＫ３の阻害を生じさせる。この結果の１つは、細胞質でみられる通常は不安定なβ−カテニンタンパク質の安定化である。安定化されたβ−カテニンは、次いで蓄積され、核に入り、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子と複合体を形成して、これらの転写活性化因子のための結合部位を含有する遺伝子を活性化することができる。古典的ＷＮＴ経路は、受容体−リガンドレベルで広範囲に制御されており、様々な可溶性デコイ受容体（例えば、ＳＦＲＰおよびＦＲＺＢ）を含む複数の活性化および阻害フィードバックループと、ＷＮＴ自体に結合するまたはその生物活性を調節する因子（例えば、ＷＩＦおよびＮＯＴＵＭ）またはＦＺＤ受容体ターンオーバーを調節する因子（例えば、ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３）および調節因子を調節するタンパク質（例えば、ＬＧＲおよびＲＳＰＯ）で構成されるさらに精巧なループとを有する。これらのアゴニストと一緒になって、アンタゴニストおよびアンチアンタゴニストのネットワークは、強力で多面的なシグナル伝達経路の強さおよび期間を細かく調節することを可能にする。本発明に詳細に関連するのは、２つのアンタゴニストおよびアンチアンタゴニスト相互作用である：１つ目は、拮抗的相互作用であり、この作用では、ＲＮＦ４３が、ＦＺＤ受容体のエンドサイトーシスを促進する能力により、ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位を含むＷＮＴ−媒介遺伝子活性化を下方調節する、つまり、ＷＮＴシグナル伝達を減少させる；そして２つ目は、反拮抗相互作用であり、この作用では、Ｒ−スポンジンとＲＮＦ４３との相互作用により、ＲＮＦ４３の膜クリアランスが導かれ、これにより細胞表面でのＦＺＤ存在の増加が促進され、ＷＮＴシグナル伝達が上方調節されるまたは増加する。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、実施例６で生成された抗ＲＮＦ４３抗体が、ＲＮＦ４３のヒトＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）への結合をブロックする能力を試験した。Ｒ−スポンジンのＲＮＦ４３との相互作用を機能的にブロックする抗体は、図６Ａに群ＩＩとして示す。プレートを、ＲＳＰＯタンパク質ファミリーの代表的メンバーであるヒトＲＳＰＯ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号３５００ ＲＳ／ＣＦ）において、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍＬの濃度で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、それらを、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにおいて、９０分間、３７℃でブロックした。ブロッキングプロセスの間に、５ｎｇ／ｍｌのｒｈＲＮＦ４３Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；番号７９６４−ＲＮ）を、１０μｇ／ｍＬの抗ＲＮＦ４３抗体を伴ってまたは伴わずに、６０分間、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＡ）中で、インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、１００μｌの抗体／タンパク質混合物をプレートに添加し、９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＡ中で１：２，０００希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを、１時間室温で添加した。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５分間、室温で添加して顕色させた。等体積の１ＭのＨ２ＳＯ４を加え、基質の展開を止めた。次いで試料を分光光度計によりＯＤ４５０で解析した。例示的なＲＮＦ４３特異的抗体の結果を、図５Ａに表形式で示す。広範囲のブロッキング活性がこのアッセイの抗体で観察されることが分かる。
本発明の抗ＲＮＦ４３抗体が古典的ＷＮＴシグナル伝達経路を調節するかどうかを判断するために、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化のためのレポーターを含有する安定な細胞集団を様々な抗体機能試験で使用した。２９３．ＴＣＦ細胞と称されるこれらの細胞は、レンチウイルスベクターｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１−ＴＣＦ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入を行うことにより生成した。このベクターは、ＴＣＦファミリーの転写因子（例えば、ＷＲＥ）のための転写応答エレメントの４つのタンデムリピートに連結された最小ＣＭＶレポーターの制御下、二機能性ＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーターカセットをコードしている。したがって、これらの細胞における古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化は、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子と複合体形成するβ−カテニンの安定化をもたらし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を導き、適切なルシフェラーゼ基質とコファクターが添加されると結果として発光を生じる。２９３．ＴＣＦ細胞を、以下のように、ＷＮＴ３Ａ古典的シグナル伝達アッセイで使用した。２．５ｘ１０４の２９３．ＴＣＦ細胞を、５０μＬの血清不含ＤＭＥＭ培地に入れて、９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに蒔いた。血清飢餓の２４時間後、２５μＬの様々な希釈度のＬ／ＷＮＴ３Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７；Ｗｉｌｌｅｒｔ、２００３）由来訓化培地（ＣＭ）または未希釈の親Ｌ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４８）由来ＣＭを、２５μＬのＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳと共に、各ウェルに添加した。ＣＭの添加から１８時間後、１００μＬのｏｎｅ−Ｇｌｏ溶液（ＰｒｏＭｅｇａ Ｃｏｒｐ）を各ウェルに添加した。各ウェルの含有物を徹底して混合して細胞を溶解させ、１００μＬの溶解物を、黒色の９６−ウェルプレートに移し、各ウェルの発光を５分後に、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ）を使用して読み取った。ＷＮＴ３Ａを含有する、異なる濃度のＣＭに曝露した細胞は、Ｌ細胞対照ＣＭに曝露した細胞と比較して、通常、２−６倍のルシフェラーゼシグナル誘導を示した（図６Ｂに代表データを示す）。さらに、２９３．ＴＣＦ細胞は、次のように予期されるように応答した：（１）ＷＮＴ３Ａ＋ＣＭ培地の２５％から３％への希釈により、ＷＮＴレポーター活性化の減少と発光の低下に至ったまたは（２）非常に効率的にＧＳＫ３を阻害し、したがって古典的ＷＮＴシグナル伝達応答遺伝子を活性化することが既知の化学物質である２０ｍｍ ＬｉＣｌでの処置により、Ｌ細胞対照ＣＭでの処置にわたって１２倍の発光増加が示された（データ示さず）。
２９３．ＴＣＦ細胞を、上記実施例５に記載したｐＬ１２０−ｈＲＮＦ４３−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターを使用して２９３．ＴＣＦ細胞の形質導入を行うことによってさらに改変し、２９３．ＴＣＦ．３７株を生成した。２９３．ＴＣＦ．３７細胞株は、ＲＮＦ４３を過剰発現する。２９３．ＴＣＦ．３７細胞のバルク集団を、ＷＮＴ３Ａ＋ＣＭまたは対照ＣＭで処置した。ＲＮＦ４３の生物学的機能に関して予期されるように、ＷＮＴ３Ａ−活性化ルシフェラーゼ活性レポーター発現は、親の２９３．ＴＣＦ細胞と比較してブロックされた（図６Ｂ）。２９３．ＴＣＦ．３７細胞の２０ｍＭのＬｉＣｌでの処置により、ルシフェラーゼレポーター発現が刺激されて、対照ＣＭで観察された発現を上回った（データ示さず）。
様々な抗ＲＮＦ４３抗体がＷＮＴシグナル伝達活性を調節する能力について、以下のように決定した。２．５ｘ１０４の２９３．ＴＣＦ．３７細胞を、５０μＬの血清不含ＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルの組織培養プレートの各ウェルに蒔いた。２４時間の血清飢餓後、ＷＮＴ３Ａ＋ＣＭ中の５μｇ／ｍｌの抗ＲＮＦ４３抗体を細胞に添加した。図５Ａは、ＷＮＴ３Ａ＋ＣＭ単独の場合と比較した抗体処置後のルシフェラーゼレポーター活性の増加倍数を、表形式で示す。本発明のいくつかの抗体は、ＷＮＴ３Ａ−媒介ルシフェラーゼシグナルの上昇をもたらし（例えば、ＳＣ３７．２３１、この抗体はルシフェラーゼシグナルの３倍増加をもたらす）、一方で他の抗体はＷＮＴ３Ａ−媒介ルシフェラーゼシグナルを減少させ（例えば、ＳＣ３７．７７、この抗体はルシフェラーゼシグナルの約２倍の減少をもたらす）、さらに他の抗体は、ＷＮＴ３Ａ−媒介ルシフェラーゼシグナルを変化させなかった（例えば、ＳＣ３７．１７０）。まとめると、これらのデータは、様々な抗ＲＮＦ４３抗体が、異なる機能的効果で得られたことを示している。
［実施例９］
抗ＲＮＦ４３抗体の配列決定
抗ＲＮＦ４３抗体を上記のように決定し、配列決定した。全ＲＮＡを、選択されたハイブリドーマ細胞から、製造業者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した。試料あたり、１０４から１０５個の間の細胞を使用した。ＲＮＡ調製物の質は、３μＬの１％アガロースゲル中で分画して決定した後、使用するまで−８０℃で保存した。
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組合せて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した３２の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ＶＨおよびＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を、各ハイブリドーマについて実施し、４つはＶκ軽鎖に対して、４つはＶγ重鎖に対して行った。ラムダ軽鎖を含有する抗体について、Ｖλリーダー配列をプライムするように設計された３つの５’プライマーを、マウスラムダ定常領域に特異的な１つのリバースプライマーと組み合わせて使用して増幅を実施した。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０．５μＬの１００μＭの重鎖または軽鎖いずれかのプライマー（ＩＤＴによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックスならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分、９５℃で１５分、続いて３０サイクル×（９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで、最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
抽出したＰＣＲ産物は、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。直接的ＤＮＡ配列決定のためにＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡを、５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムから溶出し、次いで両方の鎖から直接配列決定した。ヌクレオチド配列は、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを同定した。誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−およびＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
図７Ａは、抗ＲＮＦ４３抗体由来の多数の新規マウス軽鎖可変領域および代表的なマウス抗ＲＮＦ４３抗体の可変軽鎖から誘導される例示的ヒト化軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を示す。図７Ｂは同じ抗ＲＮＦ４３抗体由来の新規マウス重鎖可変領域およびヒト化軽鎖を提供する同じマウス抗体由来のヒト化重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を示す。特有のマウス軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号２２〜２５２、偶数、に示し、一方で、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号２５４〜２７０、偶数に示す。
図７Ａおよび７Ｂはまとまって、多数の特有のマウス抗ＲＮＦ４３抗体の注釈の付された配列を示す。但し、多数の重複抗体が生成され、図７Ａおよび７Ｂに列挙されている特有の抗体と同じ可変領域軽鎖および可変領域重鎖を有する抗体は、関連する特有の抗体の後に括弧書きで示している。抗体は次のように名付けた：ＳＣ３７．１、ＳＣ３７．２、ＳＣ３７．３、ＳＣ３７．４、ＳＣ３７．６、ＳＣ３７．７、ＳＣ３７．８、ＳＣ３７．９（ＳＣ３７．５９およびＳＣ３７．６９と同一）、ＳＣ３７．１０、ＳＣ３７．１１、ＳＣ３７．１２、ＳＣ３７．１３、ＳＣ３７．１５、ＳＣ３７．１６、ＳＣ３７．１７、ＳＣ３７．１９（ＳＣ３７．３３、ＳＣ３７．３５、ＳＣ３７．５２、ＳＣ３７．５５、ＳＣ３７．５８およびＳＣ３７．７１と同一）、ＳＣ３７．２０（ＳＣ３７．３０、ＳＣ３７．３４、ＳＣ３７．３６、ＳＣ３７．３８、ＳＣ３７．５０、ＳＣ３７．６０およびＳＣ３７．６６と同一）、ＳＣ３７．２１（ＳＣ３７．５３、ＳＣ３７．５４およびＳＣ３７．６８と同一）、ＳＣ３７．２２、ＳＣ３７．２３、ＳＣ３７．２８（ＳＣ３７．３２と同一）、ＳＣ３７．２９、ＳＣ３７．３７（ＳＣ３７．７８と同一）、ＳＣ３７．３９、ＳＣ３７．４０、ＳＣ３７．４１、ＳＣ３７．４４（ＳＣ３７．４６と同一）、ＳＣ３７．４５（ＳＣ３７．６７と同一）、ＳＣ３７．４７（ＳＣ３７．５７と同一）、ＳＣ３７．４８、ＳＣ３７．５１、ＳＣ３７．７２、ＳＣ３７．７５、ＳＣ３７．７７、ＳＣ３７．１０８、ＳＣ３７．１２２、ＳＣ３７．１２７、ＳＣ３７．１３６（ＳＣ３７．２０８と同一）、ＳＣ３７．１４１、ＳＣ３７．１５０、ＳＣ３７．１６０、ＳＣ３７．１６３、ＳＣ３７．１６９、ＳＣ３７．１７０、ＳＣ３７．１７７、ＳＣ３７．１８５、ＳＣ３７．１９１、ＳＣ３７．１９３、ＳＣ３７．１９６、ＳＣ３７．２０２、ＳＣ３７．２１２、ＳＣ３７．２２３、ＳＣ３７．２２６、ＳＣ３７．２３１、ＳＣ３７．２３３、ＳＣ３７．２３６、ＳＣ３７．２３９、ＳＣ３７．２４３およびＳＣ３７．２４４；ならびにｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７、ｈＳＣ３７．３９、ｈＳＣ３７．６７およびｈＳＣ３７．６７ｖ１と名付けられたヒト化抗体。
先のパラグラフで関連する抗体の後に括弧書きで示すような同一の軽鎖および重鎖可変領域を有する抗体に加えて、次のような同一の軽鎖可変領域を共有するいくつかの抗体があった：ＳＣ３７．１７（ＳＣ３７．２１、ＳＣ３７．５３、ＳＣ３７．５４、ＳＣ３７．６８と同一の軽鎖）、ＳＣ３７．２３（ＳＣ３７．２８およびＳＣ３７．３２と同一の軽鎖）、ＳＣ３７．２０８（ＳＣ３７．２１７、ＳＣ３７．２３２、ＳＣ３７．１３６およびＳＣ３７．１７２と同一の軽鎖）、ＳＣ３７．１２２（ＳＣ３７．１９８と同一の軽鎖）。さらに、以下のように同一の重鎖可変領域を共有するいくつかの抗体がある：ＳＣ３７．２０（ＳＣ３７．３０、ＳＣ３７．３４、ＳＣ３７．３６、ＳＣ３７．３８、ＳＣ３７．５０、ＳＣ３７．６０、ＳＣ３７．６６およびＳＣ３７．７４と同一の重鎖）、ＳＣ３７．２３（ＳＣ３７．３６と同一の重鎖）、ＳＣ３７．４７（ＳＣ３７．５７およびＳＣ３７．７５と同一の重鎖）、ＳＣ３７．１２２（ＳＣ３７．１２７と同一の重鎖）、ＳＣ３７．１６０（ＳＣ３７．１９８と同一の重鎖）。上記の特有のマウス抗体の多くがラムダ軽鎖を含むことが目立つ。特有の配列のみを図７Ａおよび７Ｂに示した。つまり、図７Ａおよび７Ｂは、重複配列を含まない。
アミノ酸配列に注釈を付けてフレームワーク領域（つまり、ＦＲ１−ＦＲ４＿）を同定し、相補性決定領域（つまり、図７ＡのＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３または図７ＢのＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３）を、Ｋａｂａｔにしたがって定義する。可変領域配列を、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売バージョンを使用して解析し、ＣＤＲおよびＦＲを指定した。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔにしたがって定義するが、当業者は、同じデータベースを使用して、ＣｈｏｔｈｉａまたはＭｃＣａｌｌｕｍにしたがったＣＤＲおよびＦＲの指定ができることを理解する。図７Ｃは、図７Ａおよび７Ｂに示す重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す表である。
［実施例１０］
キメラおよびヒト化抗ＲＮＦ４３抗体の生成
キメラ抗ＲＮＦ４３抗体を、当該技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。全ＲＮＡを、実施例１に記載のようにハイブリドーマから抽出し、ＰＣＲで増幅させた。マウス抗体：ＳＣ３７．２、ＳＣ３７．１７、ＳＣ３７．３９およびＳＣ３７．６７のＶＨおよびＶＬ鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータを、対象の核酸配列の解析から取得した（核酸配列について、図７Ｃ参照）。抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のフレームワーク配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片に対してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片に対してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＨおよびＶＬ消化ＰＣＲ産物を精製し、ＩｇＨまたはＩｇκ発現ベクターにそれぞれ連結した。ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物ならびに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。形質転換受容性のあるＥ．コリＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬのライゲーション産物を用いて４２℃での熱ショックを介して形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンプレート上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製および消化後、ＶＨ断片を、ＨｕＩｇＧ１を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、Ｈｕ−カッパ軽鎖定常領域を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
全マウス重および軽鎖可変領域ならびにヒト定常領域を含むキメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることにより、発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５０ｍｍプレートで、標準条件下、１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％集密度まで成長させた。各１２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクション試薬に加えた。ミックスを３０分間室温でインキュベートし、蒔いた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａビーズを用いて精製した。
マウス抗ＲＮＦ４３抗体をＣＤＲグラフト化または専売のコンピュータ支援ＣＤＲグラフト化方法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）と標準的な分子操作技術を以下のように使用してヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列およびＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらの番号付けに従って行った。この点に関し、図７Ｅから７Ｈは、マウス抗体ＳＣ３７．２、ＳＣ３７．１７、ＳＣ１７．３９およびＳＣ３７．６７についての様々な解析スキームを使用して誘導された重および軽ＣＤＲを示す。マウスＫａｂａｔ ＣＤＲおよび選択されたヒトフレームワークを含む可変領域が設計されたら、それらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。次いで、ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
ヒト化抗体ｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７、ｈＳＣ１７．３９、ｈＳＣ３７．６７およびｈＳＣ３７．６７ｖ１のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列（図７Ａおよび７Ｂ；配列番号２５４〜２７０、偶数）は、対応するマウス抗体のＶＬおよびＶＨ配列に由来する（例えば、ｈＳＣ３７．２はＳＣ３７．２に由来する。）。ＶＬおよびＶＨの対応する核酸配列を図７Ｃに示す（配列番号２５３〜２７１、奇数）。表５は、選択された抗体の好ましい特性を維持するために、フレームワーク変化はほとんど全く必要でなかったことを示す。
１つのヒト化クローンについて、安定性の懸念に対処するために、保存的変異がＣＤＲに導入された。この点に関して、ｈＳＣ３７．６７の軽鎖のＣＤＲＬ３（Ｎ９１Ｑ）における単一のアミノ酸変化により、ｈＳＣ３７．６７バリアント１（ｈＳＣ３７．６７ｖ１）が導かれる。各ヒト化構築物に対して、抗体の結合親和性を調べて、確実に対応するキメラまたはマウス抗体のいずれかと同等であるようにした。
Figure 2017518040
上記で選択された抗体のヒト化後、得られたＶＨおよびＶＬ鎖アミノ酸配列を解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプター軽鎖および重鎖可変領域に関する相同性を決定した。表６に示される結果は、ヒト化構築物が、一貫して、マウスドナー配列よりもヒトアクセプター配列に対して高い相同性を示したことを明らかにしている。マウス重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト化抗体とドナーハイブリドーマタンパク質配列との相同性（７７％〜８８％）と比較して、全体的に類似した相同性パーセンテージを示し、ヒト生殖系列遺伝子に対して最も近い一致を示した（８２％〜９１％）。
Figure 2017518040
［実施例１１］
部位特異的抗ＲＮＦ４３抗体の生成
天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域および重鎖（ＨＣ）定常領域を含む操作されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＲＮＦ４３部位特異的抗体を構築した。この抗体において、ＬＣのシステイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を形成するＨＣの上方ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）がセリンと置換されている（Ｃ２２０Ｓ）。構築されたとき、ＨＣおよびＬＣは、治療剤とのコンジュゲーションに適切である２つの遊離システイン（軽鎖の２１４位）を含む抗体を形成する。他に記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示される番号付けスキームに従っている。
改変抗体は、以下のように生成した。ヒト化抗ＲＮＦ４３抗体ｈＳＣ３７．１７ＨＣ（配列番号２７４）またはｈＳＣ３７．３９ＨＣ（配列番号２７７）をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位特異的変異誘発の鋳型として使用した。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示書にしたがってＱｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
ｈＳＣ３７．１７（配列番号２７５）またはｈＳＣ３７．３９（配列番号２７８）のＣ２２０Ｓ ＨＣ変異体をコードするベクターを、それぞれ、天然のｈＳＣ３７．１７のＩｇＧ１カッパＬＣ（配列番号２７３）またはｈＳＣ３７．３９のカッパＬＣ（配列番号２７６）とＣＨＯ−Ｓ細胞中に同時トランスフェクションし、哺乳類一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体を含む操作された抗ＲＮＦ４３部位特異的抗体を、ｈＳＣ３７．１７ｓｓ１およびｈＳＣ３７．３９ｓｓ１と名付けた。ｈＳＣ３７．１７ｓｓ１（配列番号２７３および２７５）の全長ＬＣおよびＨＣのアミノ酸配列ならびにｈＳＣ３７．３９ｓｓ１（配列番号２７６および２７８）部位特異的抗体は、図７Ｄに示されている。改変抗ＲＮＦ４３抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在および不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した。還元条件下、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のＣ末端における遊離システインにより予測される。
［実施例１２］
抗ＲＮＦ４３抗体−薬物コンジュゲートの調製
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＲＮＦ４３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が調製され、ここでＡｂは抗ＲＮＦ４３抗体を指し、Ｌはリンカー（例えば、遊離スルフヒドリル基を有する末端マレイミド部分）を指し、Ｄは薬物または細胞毒（例えば、オーリスタチン、カリケアミシンなど）を指す。各ＡＤＣは、リンカー薬物に共有結合で連結した抗ＲＮＦ４３抗体を含む。ＡＤＣは、当該分野で既知の技術、例えば、本質的に下記に記載されている技術を使用して、合成および精製される。抗ＲＮＦ４３抗体のシステイン結合を、抗体１モルあたり所定のモル添加率のモル数のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）で９０分間、２０℃で、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で部分的に還元する。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に溶解させたリンカー−薬物を、３ｍｏｌ／ｍｏｌ抗ＲＮＦ４３抗体の割合で添加する。反応は３０分間、進行させる。水中で調製された１０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）原液を使用して、過剰のＮＡＣをリンカー−薬物に添加することにより、反応をクエンチする。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを６．０に調整し、３０ｋＤａの膜を使用してダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いでダイアフィルトレーションした抗ＲＮＦ４３ ＡＤＣをショ糖およびポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にする。得られた抗ＲＮＦ４３ ＡＤＣを、タンパク質濃度（ＵＶで測定）、凝集（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による薬物抗体比（ＤＡＲ）およびインビトロ細胞傷害性について解析する。
［実施例１３］
選択的還元プロセスを使用した部位特異的抗ＲＮＦ４３抗体のコンジュゲーション
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＲＮＦ４３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を上述の実施例１２のように調製する。ここで、Ａｂ部分は、部位特異的抗体、例えば、上記実施例１１に示すように生成されたｈＳＣ３７．１７ｓｓ１またはｈＳＣ３７．３９ｓｓ１である。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（ＩｇＧ１部位特異的抗体の場合にＣ２１４またはＩｇＧ４部位特異的抗体の場合にＣ１２７）に最大限コンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）または２未満（ＤＡＲ＜２）である薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣが最小である一方、ＤＡＲが２（ＤＡＲ＝２）であるＡＤＣが最大である、ＡＤＣである。
コンジュゲーションの特異性および最終部位特異的ＡＤＣの均質性をさらに改善するために、部位特異的抗体（例えば、「ｈＳＣ３７．１７ｓｓ１」または「ｈＳＣ３７．３９ｓｓ１」）を、例えば、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して選択的に還元した後、リンカー薬物でコンジュゲーションし、その後、分取疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して異なるＤＡＲ種を分離する。上記手法は、例えば、本質的に下記に記載されるように実施する。
部位特異的抗体の調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有するバッファーで最低１時間、室温で部分的に還元する。次いで全ての調製物を、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）を使用して、２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２バッファーにバッファー交換し、還元バッファーを除去する。次いで、得られた部分還元調製物を、リンカー（例えば、マレイミドリンカー）を介して、最低３０分間、細胞毒（例えば、オーリスタチン、カリケアミシンなど）とコンジュゲーションする。次いで水中で調製した１０ｍＭのＮＡＣ原液を使用して過剰のＮＡＣを薬物をリンカー薬物に添加することにより、反応をクエンチする。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを６．０に調整する。部位特異的ＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を使用してダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換する。次いで部位特異的ＡＤＣ調製物を高塩バッファーで希釈して伝導率を増加させて樹脂への結合を促進させ、次いでブチルＨＰ樹脂クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填する。次いで塩勾配の低下を利用して、疎水性に基づいて異なるＤＡＲ種を分離し、この分離では、ＤＡＲ＝０種が最初に溶出され、次いでＤＡＲ＝１、ＤＡＲ＝２、この後にＤＡＲのより高い種が溶出される。
最終ＡＤＣ「ＨＩＣ精製ＤＡＲ＝２」調製物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用して解析し、ＨＣおよびＬＣに関するコンジュゲーションパーセントならびにＤＡＲ分布を決定する。解析用ＨＩＣを使用して試料を解析し、望ましくないＤＡＲ＞２およびＤＡＲ＜２の種に対するＤＡＲ＝２の種の量も決定する。
［実施例１４］
腫瘍におけるＲＮＦ４３タンパク質発現
実施例１〜３に記載される様々な腫瘍と関連したＲＮＦ４３ ｍＲＮＡ転写レベルの上昇を考慮して、ＲＮＦ４３タンパク質発現が、ＰＤＸ腫瘍においても上昇しているかを調べる作業を行った。ＲＮＦ４３のタンパク質発現を検出および定量するために、電気化学発光ＲＮＦ４３サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを、ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して展開した。
ＰＤＸ腫瘍をマウスから切り出し、ドライアイス／エタノールで急速凍結した。タンパク質抽出バッファー（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、解凍した腫瘍片に加え、腫瘍を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して微粉砕した。溶解物を、遠心分離（２０，０００ｇ、２０分、４℃）により清澄化し、各溶解物中の全タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量化した。タンパク質溶解液を５ｍｇ／ｍＬに正規化して、アッセイするまで−８０℃で保存した。正常組織は市販品を購入し、上記のように処理した。
溶解物試料由来のＲＮＦ４３タンパク質濃度は、ヒスチジンタグ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１６１０８−Ｈ０８Ｈ）を有する精製組換えＲＮＦ４３タンパク質を使用して生成した標準タンパク質濃度曲線からの値を内挿することによって決定した。ＲＮＦ４３タンパク質標準曲線およびタンパク質定量アッセイを以下のように実施した：
ＭＳＤ３８４ウェル標準プレートを、一晩４℃で、１５μＬのＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの抗ＲＮＦ４３捕捉抗体で被覆した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、３５μＬのＭＳＤ３％ブロッカーＡ溶液中で１時間、振盪しながらブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ中で再び洗浄した。ＭＳＤ１％ブロッカーＡ含有１０％タンパク質抽出バッファー中１０μＬの５倍希釈溶解物または段階希釈組換えＲＮＦ４３標準をウェルに加え、振盪しながら２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び洗浄した。次いで、抗ＲＮＦ４３検出抗体を、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ ＮＨＳエステルを製造業者のプロトコールに従って使用して、スルホタグ化した。１０μＬのタグ化抗ＲＮＦ４３検出抗体を、ＭＳＤ１％ブロッカーＡ中０．５μｇ／ｍＬで、洗浄したプレートに１時間室温で振盪しながら加えた。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄した。ＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴを界面活性剤と共に水中に１倍希釈し、３５μＬを各ウェルに加えた。プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００で、組み込まれたソフトウェア解析プログラムを使用して読み取り、標準曲線からの内挿を介して溶解物試料におけるＲＮＦ４３濃度を導き出した。次いで値を全タンパク質濃度で除算して、全溶解タンパク質のミリグラムあたりのＲＮＦ４３のナノグラムを得た。結果を図８に示し、ここで各スポットは、単一ＰＤＸ腫瘍株由来のＲＮＦ４３タンパク質濃度を表す。各スポットは、単一のＰＤＸ株から誘導しているが、ほとんどの場合、複数の生物学的試料を同じＰＤＸ株から試験し、値を平均してデータ点を得た。
図８は、正常組織と比較してＲＮＦ４３タンパク質高発現を示した代表的ＧＡおよびＣＲ ＰＤＸ腫瘍細胞株を示す。試験した正常組織は、副腎、動脈、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、末梢および坐骨神経、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、気管、赤血球および白血球ならびに血小板、膀胱、脳、乳房、眼、リンパ節、卵巣、下垂体、前立腺および脊髄を含んでいた。以下のＰＤＸ株において、ＲＮＦ４３タンパク質発現とｍＲＮＡ発現との間に良好な相関があった（マイクロアレイまたはｑＰＣＲのいずれかで測定）：ＣＲ８８、ＣＲ６４、ＣＲ１０４、ＣＲ７６およびＣＲ９９。これらのデータは、上記で示したＲＮＦ４３発現についてのｍＲＮＡ転写データと組み合わされて、ＲＮＦ４３決定因子が治療介入に対する魅力的な標的であるという説を、強力に支持する。
［実施例１５］
インサイチュハイブリダイゼーションを使用した腫瘍表面上のＲＮＦ４３の検出
ＲＮＦ４３ ｍＲＮＡについてのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．０試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｗａｎｇら、２０１２、ＰＭＩＤ：２２１６６５４４）を使用して実施した。ＲＮＦ４３のために使用したＲＮＡｓｃｏｐｅプローブは、ヌクレオチド３４５１〜４４８９の間で設計した。各試料は、全ての細胞の小胞体内に局在するシクロスポリン結合タンパク質のペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）に特異的なＲＮＡｓｃｏｐｅプローブを用いて、ＲＮＡ完全性のためのクオリティコントロールを行った（データ示さず）。ＤｉＡｍｉｎｏＰｉｍｅｌａｔｅ（ｄａｐＢ）ＲＮＡに特異的なプローブを使用してバックグラウンド染色を決定した（データ示さず）。簡単に述べると、２１個の原発性結腸直腸腫瘍患者試料の５μｍホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を、熱およびプロテアーゼで前処理した後、ＲＮＦ４３オリゴプローブでハイブリダイゼーションした。次いで、前増幅因子、増幅因子およびＨＲＰ−標識オリゴを連続してハイブリダイゼーションし、この後、３，３’−ジアミノベンジジンで、色素生産性沈殿顕色を行った。特異的なＲＮＡ染色シグナルが、茶色の点状ドットとして特定された。ＦＦＰＥスライドを、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡下で解析した。染色は、０から４の尺度で、手作業でスコア化し、ここで０＝染色なしまたは１０細胞あたり１個未満のドット；１＝細胞あたり１〜３個のドット；２＝細胞あたり４〜１０個のドット；３＝細胞あたり１０個を超えるドットおよびクラスターで見られるドットを有する陽性細胞が１０％未満；４＝細胞あたり１０個を超えるドットおよびクラスターのドットを有する陽性細胞が１０％超である。図９は、試験した２１個のＰＤＸ株全てが、ある程度でＲＮＦ４３を発現し、５２．３％の腫瘍がスコア４の発現をしていたことを示す。
［実施例１６］
抗ＲＮＦ４３抗体はフローサイトメトリにより腫瘍におけるＲＮＦ４３タンパク質発現を検出する
フローサイトメトリを使用して、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体が、ＣＲ ＰＤＸ腫瘍細胞株表面の抗ＲＮＦ４３タンパク質の存在を特異的に検出する能力を評価した。
ＣＲ ＰＤＸ腫瘍細胞を採取し、当該技術分野で認識されている酵素組織消化技術を使用して解離し、単一細胞懸濁液を取得した（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４参照）。腫瘍細胞を、マウス全ＩｇＧ（２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）と共に１０分間インキュベートして非特異的抗体結合をブロックした後、蛍光コンジュゲートした市販の抗マウスＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄ抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭおよび抗ヒトＣＤ４６および／またはＣＤ３２４とともに共染色して、ＮＴＧ（ＣＤ４６−細胞）およびＣＳＣ／ＴＩＣ（ＣＤ４６ｈｉ／ＣＤ３２４＋細胞）集団を同定した（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ２０１３／０２６０３８５、２０１３／００６１３４０および２０１３／００６１３４２）。次いで腫瘍細胞を、ビオチン化抗ＲＮＦ４３抗体（ビオチン−ＳＣ３７．６７、１０μｇ／ｍｌ、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中）と共にまたはＩｇＧアイソタイプ一致対照抗体と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で２回洗浄した。細胞を、ＡＰＣ−標識ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中）ともに１５分間インキュベートし、１ｍＬのＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中でＤＡＰＩ（死細胞を検出するため）とともに再懸濁した。ヒト生細胞に結合する抗体は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータで解析するとき、ｍＣＤ４５−Ｈ２ｋｄ−ＥｐＣＡＭ＋ＤＡＰＩ−事象に対してＡＰＣシグナルを保持していると解釈された。図１０は、本発明の抗ＲＮＦ４３抗体（黒線）が、ヒトＣＲ ＰＤＸ腫瘍生細胞（ＣＲ１４、ＣＲ８１、ＣＲ９１、ＣＲ９９、ＣＲ１０４、ＣＲ１１５）に対して、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色塗りつぶしヒストグラム）よりも有意に大きな強度で、特異的に結合できたことを示している。さらに、試験したＰＤＸ株の大半において、ＲＮＦ４３発現は、ＣＳＣ（黒色実線）の方がＮＴＧ（黒色破線）と比較して高く、ＲＮＦ４３発現が腫瘍形成性集団と関連していることを示している。図１０は、抗ＲＮＦ４３抗体の染色強度を対照抗体の染色強度と比較した表を含んでおり、幾何平均蛍光強度として数値化された発現が、アイソタイプ対照抗体で観察された強度よりも低かったことを示している（ΔＭＦＩ）。
［実施例１７］
抗ＲＮＦ４３抗体は、細胞毒性剤の送達を容易にする
本発明の抗ＲＮＦ４３抗体が、細胞毒性剤の細胞への送達を媒介するために内在化できるかどうかを判断するために、選択された抗ＲＮＦ４３抗体および二次抗マウス抗体ＦＡＢ断片に連結したサポリンを用いて、インビトロ細胞殺傷アッセイを行った。サポリンは、リボソームを不活性化させ、それによりタンパク質合成を阻害し、細胞を死に至らせる植物毒素である。サポリンは、リボソームにアクセスを行う細胞内でのみ細胞毒性であり、それ自体で内在化することはできない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介細胞内細胞毒性は、結合したマウスまたはヒト化抗ＲＮＦ４３抗体が標的細胞に結合して内在化する際に、抗マウスＦＡＢ−サポリン構築物が内在化される能力を表すものである。
ｈＲＮＦ４３を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ウェルあたり５００細胞で、ＢＤ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に蒔いた。１日後、様々な濃度の精製抗ＲＮＦ４３抗体（マウスまたはヒト化抗体のいずれか）を、一定濃度の２ｎＭの抗マウスＩｇＧ ＦＡＢ−サポリンコンジュゲート（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウス抗体の試験について）または２ｎＭの抗ヒトＩｇＧ ＦＡＢ−サポリンコンジュゲート（ヒト化抗体の試験について）とともに培地に加えた。９６時間インキュベーションした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示書に従って使用して、生存細胞を数えた。二次ＦＡＢサポリンコンジュゲートとのみインキュベートした細胞を含有する培養物を使用した素の発光カウント数を１００％の参照値に設定し、他のカウント数は全てこの参照値に対するパーセンテージとして計算した。大きなサブセットの抗ＲＮＦ４３マウス抗体は、２５０ｐＭの濃度で、ｈＲＮＦ４３過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を様々な効力で有効に殺傷したが（図５Ａ）、一方で、同じ濃度のマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ２ｂ）は有効に殺傷しなかった（データ示さず）。さらに、抗ＲＮＦ４３ヒト化抗体（ｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７、ｈＳＣ３７．３９およびｈＳＣ３７．６７ｖ１）は、ＲＮＦ４３を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞を有効に殺傷した。ヒト化抗体は、それらが誘導されたキメラ抗体（ｈＳＣ３７．２、ｈＳＣ３７．１７およびｈＳＣ３７．３９の場合）またはマウス抗体（ｈＳＣ３７．６７ｖ１の場合）と匹敵する効果を示した（図１１）。
上記の結果は、抗ＲＮＦ４３抗体が内在化を媒介する能力および細胞傷害性ペイロードを送達する能力を実証し、抗ＲＮＦ４３抗体がＡＤＣに対する標的部分として治療有用性を有し得るという仮説を支持する。
［実施例１８］
抗ＲＮＦ４３抗体−薬物コンジュゲートによる腫瘍開始細胞の出現頻度の減少
上記の実施例１で実証されるように、ＲＮＦ４３発現は、がん幹細胞と関連している。したがって、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣを用いた処置が薬物耐性であり、腫瘍再発および転移を亢進させることが既知の腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の出現頻度を減少させることを実証するために、インビボ限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を、例えば、以下に要約して説明するように行う。
ＰＤＸ腫瘍（例えば、結腸直腸）を、免疫不全マウスの皮下で成長させる。腫瘍体積が、平均して１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３である場合、マウスを２つの群にランダムに分離する。一つの群には、薬物にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ１を陰性対照として腹腔内注射し、他の群には、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣ（例えば、実施例１６および１８で調製したもの）を腹腔内注射する。投与から１週間後に、各群からの２匹の代表的マウスを安楽死させ、次いで腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に分散させる。次いで、各処置群の腫瘍細胞を回収し、プールし、実施例１で前述したように分解する。細胞を、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗マウスＨ２Ｋｄおよび抗マウスＣＤ４５抗体で標識してマウス細胞を検出し、ＥｐＣＡＭでヒト細胞を検出し、次いでＤＡＰＩで死細胞を検出する。次いで得られた懸濁液を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータを使用してＦＡＣＳにより選別し、ヒト腫瘍生細胞を単離し、回収する。
マウスの４つのコホートに、抗ＲＮＦ４３ＡＤＣで処置した腫瘍由来の１２５０、３７５、１１５または３５の選別したヒト生細胞を移植する。陰性対照として、マウスの４つのコホートに、対照ＩｇＧ１ ＡＤＣで処置した腫瘍由来の１０００、３００、１００または３０の選別したヒト生細胞を移植する。レシピエントマウスの腫瘍は毎週測定し、腫瘍が１５００ｍｍ３に達する前に個々のマウスを安楽死させる。レシピエントマウスは、陽性または陰性の腫瘍成長を有することでスコア化する。陽性の腫瘍成長は、１００ｍｍ３を超える腫瘍の成長として定義される。
ポアソン分布統計（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各集団におけるＴＩＣの出現頻度を決定する。
当業者は、本発明が、その趣旨および中心的属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化し得ることをさらに理解する。本発明の前述の説明は、本発明の例示的実施形態を開示しているにすぎないことから、他の変形も本発明の範囲内にあることが意図されていることは理解される。したがって本発明は、本明細書に詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲に参照がなされるべきである。

Claims (23)

  1. 式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
    （式中、
    Ｍは、抗ＲＮＦ４３抗体を含み、
    Ｌは、リンカーを含み、
    Ｄは、細胞毒を含み、
    ｎは、１から２０の整数である）
    の抗体薬物コンジュゲートまたはそれらの医薬的に許容される塩。
  2. 抗ＲＮＦ４３抗体が、内在化抗体である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. 抗ＲＮＦ４３抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの断片である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. 抗ＲＮＦ４３抗体が、腫瘍開始細胞に結合する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. 抗ＲＮＦ４３抗体が、ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ヒトＺＮＲＦ３（配列番号６）に結合しない、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  6. 抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達を減少させる、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. 抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達を増加させる、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＷＮＴシグナル伝達に影響を与えない、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. 抗ＲＮＦ４３抗体がヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ＲＮＦ４３へのＲ−スポンジンの結合をブロックする、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 抗ＲＮＦ４３抗体がヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ＲＮＦ４３へのＲ−スポンジンの結合をブロックしない、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. 抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＲ−スポンジンで刺激されたＷＮＴシグナル伝達をブロックしない、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  12. 抗ＲＮＦ４３抗体が真核細胞の表面上のヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合し、ここで抗体の結合はＲ−スポンジンで刺激されたＷＮＴシグナル伝達をブロックする、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  13. ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、ヒトＲＮＦ４３に対する結合について、
    （１）配列番号７８に示す軽鎖可変領域および配列番号８０に示す重鎖可変領域、または
    （２）配列番号１１０に示す軽鎖可変領域および配列番号１１２に示す重鎖可変領域
    を含む抗体と競合する、単離抗体。
  14. ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）：ＣＤＲＬ１：配列番号２８８；ＣＤＲＬ２：配列番号２８９；ＣＤＲＬ３：配列番号２９０を含む軽鎖、および以下の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）：ＣＤＲＨ１：配列番号２９１；ＣＤＲＨ２：配列番号２９２；ＣＤＲＨ３：配列番号２９３を含む重鎖を含む、単離抗体
  15. ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合する単離抗体であって、以下の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）：ＣＤＲＬ１：配列番号２９４；ＣＤＲＬ２：配列番号２９５；ＣＤＲＬ３：配列番号２９６を含む軽鎖、および以下のＣＤＲＨ：ＣＤＲＨ１：配列番号２９７；ＣＤＲＨ２：配列番号２９８；ＣＤＲＨ３：配列番号２９９を含む重鎖を含む、単離抗体。
  16. ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合するヒト化抗体であって、配列番号２７３に示す軽鎖および配列番号２７５に示す重鎖を含む、ヒト化抗体。
  17. ヒトＲＮＦ４３（配列番号５）に結合するヒト化抗体であって、配列番号２７６に示す軽鎖および配列番号２７８に示す重鎖を含む、ヒト化抗体。
  18. 配列番号２７３または２７６に示す軽鎖および配列番号２７５または２７８に示す重鎖をコードする核酸。
  19. 請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
  20. 請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  21. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む医薬組成物。
  22. 請求項２１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの処置方法。
  23. がんが、結腸直腸がんまたは肺がんである、請求項２２に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024537766A (ja) * 2021-09-28 2024-10-16 パウル・シェラー・インスティトゥート Ｃｃｋ２－ｒを標的とする化合物による治療および／またはイメージングに対する癌と診断された患者の応答を予測する方法、ならびに癌を選択的に治療および／またはイメージングする方法に使用する化合物

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI3434767T3 (fi) 2010-11-30 2026-02-12 Chugai Seiyaku Kk Sytotoksisuutta aiheuttava terapeuttinen aine
WO2017201440A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-ascl1 antibodies and methods of use
US11993645B2 (en) 2017-01-11 2024-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions comprising R-Spondin (RSPO) surrogate molecules
WO2018140821A1 (en) * 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
US20200123256A1 (en) * 2017-05-02 2020-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP3765054A4 (en) * 2018-01-19 2022-01-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING GAMMA DELTA T LYMPHOCYTES USING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
US12466884B2 (en) 2018-07-09 2025-11-11 Surrozen Operating, Inc. Tissue-specific WNT signal enhancing molecules and uses
EP3877399A4 (en) * 2018-11-06 2022-10-19 Alsatech, Inc. CELL-BASED GENE THERAPY FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES
WO2020257758A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of decreased bone mineral density with zinc and ring finger 3 (znrf3) inhibitors
EP4243878A4 (en) 2020-11-16 2025-05-14 Surrozen Operating, Inc. Liver-specific WNT signal-enhancing molecules and their uses
WO2022109443A1 (en) * 2020-11-23 2022-05-27 The Regents Of The University Of Michigan Single-chain antibody against flavivirus ns1 protein
CN112480250B (zh) * 2020-12-23 2022-03-15 上海交通大学 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
CN117222667A (zh) * 2021-03-16 2023-12-12 Jn生物科学有限责任公司 用于治疗免疫失调的双功能分子
CN113372447A (zh) * 2021-05-26 2021-09-10 重庆中元汇吉生物技术有限公司 抗pivka-ii单克隆抗体及其应用
CA3262929A1 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research PREPARATION PROCESSES FOR ADOPTIVE CELL THERAPIES
CN116120444A (zh) * 2023-02-28 2023-05-16 中国人民解放军军事科学院防化研究院 一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的纳米抗体及检测卡制备
CN117801108B (zh) * 2023-12-06 2024-06-07 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗人mdm2蛋白单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
CN118652345B (zh) * 2024-06-28 2025-04-15 杭州华葵金配生物科技有限公司 幽门螺旋杆菌b型尿素酶抗体及其应用
CN119462949B (zh) * 2025-01-09 2025-04-01 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种抗β-内酰胺酶的抗体或其抗原结合片段、生物产品及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013054307A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Novartis Ag Antibodies and methods for wnt pathway-related diseases

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101613405A (zh) * 2002-06-06 2009-12-30 肿瘤疗法科学股份有限公司 与人结肠癌相关的基因和多肽
BRPI0711249A2 (pt) * 2006-05-30 2012-03-13 Genentech, Inc. Anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeira, métodos para fabricar um anticorpo, para detectar a presença de cd2 em uma amostra biológica, para tratar uma disfunção proliferativa de células b, para inibir proliferaçõa de células b, para tratar câncer, para fabricar um composto conjugado anti-corpo-droga. imunoconjugados,composições farmacêuticas, formulações farmacêuticas, conjugado anticorpo-droga, compostos conjugados anti-corpo-droga, teste para detectar células b e artigo de fabricação
RU2017120287A (ru) * 2012-02-28 2018-11-15 АйАрЭм ЭлЭлСи ОТБОР БОЛЬНЫХ РАКОМ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ Wnt НА ОСНОВАНИИ СТАТУСА МУТАЦИИ RNF43

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013054307A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Novartis Ag Antibodies and methods for wnt pathway-related diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENES & DEVELOPMENT, vol. 28, JPN6019007732, February 2014 (2014-02-01), pages 305 - 316, ISSN: 0003990377 *
RESEARCH COMMUNICARION, vol. 27, JPN6019007730, 2013, pages 1345 - 1350, ISSN: 0003990376 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024537766A (ja) * 2021-09-28 2024-10-16 パウル・シェラー・インスティトゥート Ｃｃｋ２－ｒを標的とする化合物による治療および／またはイメージングに対する癌と診断された患者の応答を予測する方法、ならびに癌を選択的に治療および／またはイメージングする方法に使用する化合物

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