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JP2017504598A - 脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンｆｃ−領域融合ポリペプチド - Google Patents

脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンｆｃ−領域融合ポリペプチド Download PDF

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JP2017504598A
JP2017504598A JP2016540669A JP2016540669A JP2017504598A JP 2017504598 A JP2017504598 A JP 2017504598A JP 2016540669 A JP2016540669 A JP 2016540669A JP 2016540669 A JP2016540669 A JP 2016540669A JP 2017504598 A JP2017504598 A JP 2017504598A
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

ｉ）1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及びii）1つのヒト免疫グロブリンFc-領域を含む、融合ポリペプチドが報告される。前記では、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは脂質に共有結合により連結したアミノ酸を含み、さらに該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、該ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結しており、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結する。

Description

（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願No.61/918,950（2013年12月20日出願：前記の内容は参照によりその全体が本出願に含まれる）の優先権を主張する。
（電子提出資料の参照による包含）本出願に併せて同時に提出され、以下のように認証されるコンピュータ読み出し可能ヌクレオチド/アミノ酸配列リストは参照によりその全体が包含される：2014年12月18日作成のファイル。
（技術分野）
脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンFc-領域融合ポリペプチド及び前記の使用が本明細書で報告される。
インスリン分泌性ポリペプチドはインスリン分泌性活性を有する。すなわち前記は、インスリンホルモンの合成若しくは発現を刺激するか又は前記の合成若しくは発現の刺激を惹起する能力を有する。インスリン分泌性ペプチドには、GLP-1、エキセンジン-3、エキセンジン-4、及び前記の前駆体、誘導体又はフラグメントが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
プログルカゴン誘導ペプチド（グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）を含む）は、種々の生理学的機能（例えばインスリン分泌及び食物摂取の調節）で必要とされる多くの代謝経路で見出される。
プレプログルカゴンは158アミノ酸のポリペプチドであり、多くの様々な活性化合物にプロセッシングされる。例えば、GLP-1はプレプログルカゴンのアミノ酸残基72から108に一致する。他の機能の中でとりわけGLP-1は、インスリン合成及び分泌の刺激並びに食物摂取の阻害をもたらす。GLP-1は、糖尿病患者で高血糖症（グルコースレベル上昇）を軽減することが示された。
グルコース依存インスリン分泌性ペプチド（GIP）は、グルコース存在下で膵ベータ細胞のインスリン分泌を刺激する42アミノ酸の胃腸系調節ペプチドである。前記は、133アミノ酸前駆体（プレプロGIP）からタンパク分解性プロセッシングによって誘導される。
WO2010/011439では、代謝異常及び肥満治療用GIP系混合アゴニストが報告されている。自然のままのグルカゴン配列の改変は、自然のままのグルカゴンの活性に等しいか又はそれより優れた強力なグルカゴン活性、自然のままのGIPの活性に等しいか又はそれより優れた強力なGIP活性、及び/又は自然のままのGLP-1の活性に等しいか又はそれより優れた強力なGLP-1活性を示すことができるグルカゴンペプチドを生じることが報告された。提供されたデータは、GIP活性及びGLP-1活性の両方を有するペプチドは、特に体重低下の誘発又は体重増加の防止の他に高血糖症（肥満を含む）の治療に特に有益であることを示し、それによってGIPアゴニスト活性とGLP-1アゴニスト活性との組合せはGLP-1単独よりも体重低下でより強い作用を生じることが報告された。
インスリン分泌性ポリペプチドと抗体との連結が、例えばWO2010/011439、US6,329,336及びUS7,153,825で仮説的に概略されている。
インクレチン受容体の二元作用性膜結合調節物質の発見がFortinら（PlosOne 6(2011) e24694）によって報告されている。Finanらは、単分子二元性インクレチンはげっ歯類、サル及びヒトで代謝有益性を最大にすることを報告している（Sci. Transl. Med. 5(2013) 209ra151）。
本明細書で報告されるある特徴は、
−1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、
を含む融合タンパク質であって、ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは脂質に共有結合によって連結したアミノ酸を含み、さらに
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結しており、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結される。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは内因性ポリペプチドとin vivoで結合する。
ある実施態様では、脂質との連結は該アミノ酸の側鎖の官能基を介する。
ある実施態様では、脂質に共有結合によって連結したインクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基である。
ある実施態様では、該脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質及びポリケチドを含む群から選択される。
ある実施態様では、脂質との連結は、ミリストイル化（14:0）、パルミトイル化（16:0）、プレニル化、オクタノイル化、アーケオリ化、コレステリル化を含む群から選択される。
ある好ましい実施態様では、脂質との連結はパルミトイル化である。
ある実施態様では、
i）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのC-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域と連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端との間に存在し；さらに
ii）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのN-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域と連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のC-末端との間に存在する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、天然に存在するインクレチン受容体リガンドポリペプチド又は合成インクレチン受容体リガンドポリペプチドである。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、配列番号:1−39、76、77及び120−125から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列とヒト免疫グロブリンFc-領域のアミノ酸配列との間にアミノ酸配列LPETG（配列番号:74）を含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、ポリペプチドGly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号:85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:90）の1つをLPETGのC-又はN-末端に含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは配列番号:57−67のいずれか1つを含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、Gly又はGly-GlyをLPXTG（配列番号:75）のC-又はN-末端に含む。
ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンFc-領域は、329位のアミノ酸残基の変異並びに228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及び331位のアミノ酸残基を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の異なる残基への少なくとも1つのさらに別の変異を有するヒト免疫グロブリンFc-領域であり、ここでFc-領域の残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号付けされる。
ある実施態様では、該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、野生型ヒト免疫グロブリンIgG Fc-領域を含むヒト免疫グロブリンFc-領域融合ポリペプチドと比較して、ヒトFcγRIIIA及び/又はFcγRIIA及び/又はFcγRIに対する親和性の低下を有する。
ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンFc-領域は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G及びP331Sを含む群から選択される少なくとも1つの変異を含む。
ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンFc-領域は、該Fc-領域がヒトIgG1アイソタイプならば変異L234A、L235A及びP329Gを含み、該Fc-領域がヒトIgG4アイソタイプならば変異S228P、L235E及びP329Gを含む。
ある実施態様では、該ヒト免疫グロブリンFc-領域によって誘発される血小板凝集は、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域によって誘発される血小板凝集と比較して軽減される。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む。
ある好ましい実施態様では、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、該ヒト免疫グロブリンFc-領域の1つのポリペプチド鎖のN-末端に連結している。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の1つのポリペプチド鎖のC-末端に連結している。
ある実施態様では、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GIP、GLP-1、エキセンジン-3、エキセンジン-4、二元性GIP-GLP-1アゴニスト、三元性GIP-GLP-1-グルカゴン受容体アゴニスト、キメラGIP/GLPアゴニスト、及び前記の前駆体、誘導体又は機能的フラグメントから互いに独立に選択される。
ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42−56から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンFc-領域とインクレチン受容体リガンドポリペプチドとの間にリンカーを含み、ここで、該リンカーは配列番号:57−69及び82−94から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GLP-1(7-37)（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG、配列番号:01）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GLP-1(7-36)（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR、配列番号:02）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-3（HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS、配列番号:03）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-4（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号:04）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは配列番号:01−04のいずれか1つから誘導され、ここで配列番号:01−04と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変が実施されてあり、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-4(1-31)desGlu(17)Tyr(32)（HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY、配列番号:05）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-4(1-30)Tyr(31)（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY、配列番号:06）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-4(9-39)（DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号:07）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:08）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:09）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:10）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:11）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:12）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:13）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:14）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:15）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:16）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:17）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:18）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:19）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:20）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS（配列番号:21）（ハイブリッドGLP-1/エキセンジンポリペプチド）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号:22）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号:23）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号:24）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号:25）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY（配列番号:26）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY（配列番号:27）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS（配列番号:28）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは自然のままのグルカゴン（配列番号:76）から誘導され、配列番号:76と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGLP-1（配列番号:1又は2）から誘導され、配列番号:1又は2と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGIP（配列番号:77）から誘導され、配列番号:77と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはエキセンジン-3又は-4（配列番号:3又は4）から誘導され、配列番号:3又は4と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある好ましい実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはグルカゴン（配列番号:76）から誘導され、該アナローグは、（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、（b）該アナローグのC-末端部分（アミノ酸12−29）のアルファへリックス構造を安定化させる改変、及び（c）場合によって配列番号:76と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のさらに別のアミノ酸改変を有する配列番号:76を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある種の実施態様では、アルファへリックス構造を安定化させる改変は、分子内架橋（例えば共有結合分子内架橋、例えばWO2010/011439に記載されたもののいずれかを含む）を提供又は導入する改変である。いくつかの実施態様の共有結合分子内架橋はラクタムブリッジである。これらの実施態様のアナローグのラクタム-ブリッジは本明細書に記載のラクタムブリッジでありうる。例えば、WO2010/011439の“Stablization of the Alpha Helix Structure（アルファへリックス構造の安定化）”のパラグラフのラクタムブリッジに関する教示を参照されたい。例えば、ラクタム-ブリッジは、i及びi＋4位のアミノ酸の側鎖間又はj及びj＋3位のアミノ酸の側鎖間に存在するものでありうる（ここでiは12、13、16、17、20又は24であり、jは17である）。ある種の実施態様では、ラクタム-ブリッジは16及び20位のアミノ酸の間に存在でき、ここで、16及び20位のアミノ酸の一方はGluで置換され、16及び20位の他方のアミノ酸はLysで置換される。
また別の実施態様では、アルファへリックス構造を安定化させる改変は、該アナローグの16、20、21及び24位への1つ、2つ、3つ又は4つのα,α-二置換アミノ酸の導入である。いくつかの実施態様では、α,α-二置換アミノ酸はAIBである。ある種の特徴では、α,α-二置換アミノ酸（例えばAIB）は20位に存在し、さらに16位のアミノ酸は陽性荷電アミノ酸（例えば式IVのアミノ酸（前記は本明細書に記載される））で置換される。式IVのアミノ酸はホモLys、Lys、Orn又は2,4-ジアミノ酪酸（Dab）でありうる。
本発明の具体的な特徴では、1位のアミノ酸改変は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸（例えば大きな芳香族アミノ酸（例えばTyr））によるHisの置換である。
ある種の特徴では、グルカゴンのアナローグは、27、28及び29位の1つ、2つ又は全部のアミノ酸改変を含む。例えば、27位のMetは大きな脂肪族アミノ酸（場合によってLeu）で置換でき、28位のAsnは小さな脂肪族アミノ酸（場合によってAla）で置換でき、29位のThrは小さな脂肪族アミノ酸（場合によってGly、又は前述の2つまたは3つの組合せ）で置換できる。具体的な実施態様では、グルカゴンのアナローグは、27位のLeu、28位のAla、及び29位のGly又はThrを含む。
本発明のある種の実施態様では、グルカゴンのアナローグは、29位のアミノ酸のC-末端に1から21アミノ酸の延長部を含む。この延長部は、例えばGPSSGAPPPS（配列番号:78）又はXGPSSGAPPPS（配列番号:79）のアミノ酸配列を含むことができる。加えて或いはまた別に、該グルカゴンアナローグは、延長部の1−6アミノ酸が陽性荷電アミノ酸である延長部を含むことができる。該陽性荷電アミノ酸は下記式Iのアミノ酸でありうる:
（式I）
式中、nは1から16、又は1から10、又は1から7、又は1から6、又は2から6であり、R1及びR2の各々はH、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から独立に選択され、ここでR7はH又はOHであり、式IVのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。典型的な特徴では、式IVのアミノ酸はLys、ホモLys、Orn又はDabである。
さらにまた、いくつかの実施態様では、グルカゴン（配列番号:76）のアナローグは、配列番号:76と比較して以下の改変のいずれか1つ又は組合せを含む:
（a）2位のSerのD-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、AIB、Val又はα-アミノ-N-酪酸による置換；
（b）10位のTyrのTrp、Orn、Glu、Phe又はValによる置換；
（c）12位のLysのArg又はIleによる置換；
（d）16位のSerのGlu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly又はAIBによる置換；
（e）17位のArgのGlnによる置換；
（f）18位のArgのAla、Ser,Thr又はGlyによる置換；
（g）20位のGlnのSer、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、Orn又はAIBによる置換；
（h）21位のAspのGlu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸による置換；
（i）23位のValのIleによる置換；
（j）24位のGlnのAsn、Ser、Thr、Ala又はAIBによる置換；
（k）並びに2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8 19、20、21、24、27、28及び29位のいずれかにおける保存的置換。
典型的な実施態様では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号:76）のアナローグは、以下の改変：
（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
（b）i及びi＋4位のアミノ酸の側鎖間又はj及びj＋3位のアミノ酸の側鎖間のラクタムブリッジ（式中iは12、13、16、17、20又は24であり、jは17である）、
（c）27、28及び29位の1つ、2つ又は全部のアミノ酸改変、例えば、27及び/又は28位のアミノ酸改変、及び
（d）配列番号:76と比較して、1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸改変、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸改変を含み、
さらに、GIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。典型的な特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50と約50倍未満異なる。
これらの実施態様のアナローグのラクタム-ブリッジは本明細書に記載のラクタムブリッジでありうる（例えば、WO2010/011439の“Stablization of the Alpha Helix Structure（アルファへリックス構造の安定化）”のパラグラフのラクタムブリッジに関する教示を参照されたい）。例えば、ラクタム-ブリッジは16及び20位のアミノ酸の間で存在することができ、ここで16及び20位のアミノ酸の一方はGluで置換され、16及び20位の他方のアミノ酸はLysで置換される。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGIPアゴニスト活性を有するグルカゴンのアナローグであり、前記は以下の改変：
（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
（b）該アナローグの16、20、21及び24位のアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は全部のα,α-二置換アミノ酸による置換、
（c）27、28及び29位の1つ、2つ又は全部のアミノ酸改変、例えば、27及び/又は28位のアミノ酸改変、及び
（d）自然のままのグルカゴン（配列番号:76）と比較して、1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸改変、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸改変を含み、
ここで、GIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。典型的な特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50と約50倍未満異なる。
これらの実施態様のアナローグのα,α-二置換アミノ酸は、以下を含む任意のα,α-二置換アミノ酸でありうる（ただしこれらに限定されない）：アミノイソ酪酸（AIB）、メチル、エチル、プロピル及びn-ブチルから選択される同じ若しくは異なる基で、又はシクロオクタン若しくはシクロペンタン（例えば1-アミノシクロオクタン-1-カルボン酸）で二置換されたアミノ酸。ある実施態様では、α,α-二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸（aib）である。
さらにまた他の典型的な実施態様では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号:76）のアナローグは、以下の改変：
（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
（b）下記式Iのアミノ酸による16位のSerのアミノ酸置換：
（式I）
（式中、nは1から16、又は1から10、又は1から7、又は1から6、又は2から6であり、R1及びR2の各々はH、C1-C18アルキル、(C1-C18アルキル)OH、(C1-C18アルキル)NH2、(C1-C18アルキル)SH、(C0-C4アルキル)(C3-C6)シクロアルキル、(C0-C4アルキル)(C2-C5複素環)、(C0-C4アルキル)(C6-C10アリール)R7、及び(C1-C4アルキル)(C3-C9ヘテロアリール)から成る群から別個に選択され、ここでR7はH又はOHであり、式IVのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む）
（c）20位のGlnのアルファ、アルファ-二置換アミノ酸によるアミノ酸置換、
（d）27、28及び29位の1つ、2つ又は全部のアミノ酸改変、例えば、27及び/又は28位のアミノ酸改変、及び
（e）1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸改変、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸改変を含み、
さらに、GIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。典型的な特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50と約50倍未満異なる。
これらの実施態様のアナローグの式IVのアミノ酸は任意のアミノ酸、例えば、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は16である式IVのアミノ酸でありうる。ある種の実施態様では、nは2、3、4又は5であり、その場合、アミノ酸はそれぞれDab、Orn、Lys又はホモLysである。
これらの実施態様のアナローグのアルファ、アルファ-二置換アミノ酸は、以下を含む任意のアルファ、アルファ-二置換アミノ酸でありうる（ただしこれらに限定されない）：アミノイソ酪酸（AIB）、メチル、エチル、プロピル及びn-ブチルから選択される同じ若しくは異なる基で、又はシクロオクタン若しくはシクロペンタン（例えば1-アミノシクロオクタン-1-カルボン酸）で二置換されたアミノ酸。ある種の実施態様では、アルファ、アルファ-二置換アミノ酸はAIBである。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:29、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:30、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:31、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG（配列番号:32、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGG G（配列番号:33、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:34、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:35、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:36、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列がYXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:37、Xはaib）で配列番号:37の残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列がYXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:38、Ｘはaib）で配列番号:38の残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列がYXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG（配列番号:39、Ｘはaib）で配列番号:39の残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有する。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はY-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS（配列番号:120）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はdesAmino-Tyr-AEGTFISDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:121）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:122）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:123）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAC-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:124）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:125）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はY-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS（配列番号:109）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はdesAminoTyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:110）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:111）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:112）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:113）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:114）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS（配列番号:115）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドであり、前記はAc-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS（配列番号:116）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に報告されるある特徴は融合ポリペプチドであって、前記は、
−1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互に独立に共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む群から選択され、さらに
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結される。
本明細書に報告されるある特徴は融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドは、
−1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互に独立に共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））含む群から選択され、さらに
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結される。
本明細書に報告されるある特徴は融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドは、
−1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、i）配列番号:49の2つのアミノ酸配列又はii）配列番号:52の1つのアミノ酸配列及び配列番号:53の1つのアミノ酸配列を含み、
該1つ又は2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端にリンカーペプチドを介して共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、(GGGS)4（配列番号:58）、(GGGGS)3（配列番号:62）、及び(GGGGGS)o（o＝2−3（配列番号:65−66））含む群から選択され、さらに
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結される。
本明細書に報告されるある特徴は、本明細書に報告される融合ポリペプチドを含む医薬組成物である。
本明細書に報告されるある特徴は、本明細書に報告される融合ポリペプチドを医薬として使用することである。
本明細書に報告されるある特徴は、本明細書に報告される融合ポリペプチドを疾患治療のための医薬の製造に使用することであり、ここで、野生型ヒトIgGのFc-領域の変種Fc-領域を含む融合ポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgGのFc-領域を含む融合ポリペプチドによって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することは有益である。
本明細書に報告されるある特徴は、野生型ヒトIgGのFc-領域の変種Fc-領域を含む本明細書に報告される融合ポリペプチドを使用することであり、ここで、該野生型ヒトIgGのFc-領域のPro329はグリシンで置換され（残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号付けされる）、該融合ポリペプチドは、ヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対する親和性軽減を示して、野生型ヒトIgGのFc-領域を含む融合ポリペプチドによって誘発されるADCCの少なくとも20% のADCCダウン-モジュレーション、及び/又はADCPダウン-モジュレーションをもたらす。
ある実施態様では、該疾患は2型糖尿病である。
ある実施態様では、該疾患は肥満である。
ある実施態様では、該疾患はインスリン耐性である。
ある実施態様では、該疾患は1型糖尿病である。
ある実施態様では、該疾患は骨粗しょう症である。
ある実施態様では、該疾患は脂肪性肝炎である。
ある実施態様では、該疾患は非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）である。
ある実施態様では、該疾患は代謝症候群である。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドはさらに別の2型糖尿病薬と併用して投与される。
ある実施態様では、さらに別の2型糖尿病薬はインスリンである。
本明細書に報告されるある特徴は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びLPXTG（配列番号:75）を含むポリペプチドである（Xは任意のアミノ酸である）。
ある実施態様では、Xは酸性アミノ酸である。
ある実施態様では、酸性アミノ酸はGluである。
ある実施態様では、該ポリペプチドは、LPETG（配列番号:74）のC-末端にGly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号:85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:90）を含む。
ある実施態様では、該ポリペプチドは、(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む。
ある実施態様では、該ポリペプチドは配列番号:57−67のいずれか1つを含む。
ある実施態様では、該ポリペプチドはLPXTG（配列番号:75）のN-末端にGly又はGly-Glyを含む。
本明細書に報告されるある特徴は、疾患を治療するための医薬の製造で本明細書に報告されるポリペプチドを使用することである。
ある実施態様では、該医薬の製造はソルターゼAの使用を含む。
ソルターゼ媒介ペプチド転移反応のSDS-PAGE分析を示す。 オスのDIOマウスに化合物、ペプチド-ロング24A-G3Fc及びペプチド-ショート24A-G3Fc（20nmol/kg, sc）を1回投与した後の体重低下の経過（パートa）及び5日間の累積食物摂取（パートb）を示す。ビヒクル：三角/1；ヒトIgG1 Fc-領域コントロール：丸/2；ペプチド-ショート24A-G3Fc：逆三角/3；ペプチド-ロング24A-G3Fc：四角/4。 オスのdb/dbマウスへの化合物、ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート24A-G3Fc（20nmol/kg, sc）の投与後の腹腔内グルコースチャレンジに対する応答におけるグルコース変動経過を示す（a：ipGTT；b：AUC ipGTT）。ビヒクル：三角/1；ヒトIgG1 Fc-領域コントロール：丸/2；ペプチド-ショート24A-G3Fc：逆三角/3；ペプチド-ロング24A-G3Fc：四角/4。 オスのdb/dbマウスへの化合物、ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fc（20nmol/kg, sc）の投与後の腹腔内グルコースチャレンジに対する応答におけるグルコース変動の用量依存経過を示す（a：ipGTT；b：AUC ipGTT）。ヒトIgG1 Fc-領域コントロール：丸/1；ペプチド-ロング24A-G3Fc（1nmol/kg）：逆三角/2；ペプチド-ロング24A-G3Fc（3nmol/kg）：三角/3；ペプチド-ロング24A-G3Fc（10nmol/kg）：四角/4。 本明細書報告の被験融合ポリペプチド及びPEG化参照構築物をマウスの皮下に20nmol/kgで1回適用した後の血中濃度/時間プロフィールの概要を示す。（1/暗い菱形）本明細書報告の脂質化Fc-融合物；（2/三角）非脂質化PEG化インクレチン受容体リガンドポリペプチド参照ペプチド5；（3/四角）非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチド参照1；（4/明るい菱形）非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチド参照2；（5/明るい丸）非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチド参照3；（6/暗い丸）非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチド参照4。 種々の化合物を適用した後の体重（BW）の変化を示す。白丸：ビヒクルコントロール（1）；大きな黒丸：ペプチド-ロング24C（10nmol）（2）；小さな黒丸：ペプチド-ロング24N（10nmol）（3）；大きな塗りつぶし四角：デュラグルチド（1nmol）（4）；小さな塗りつぶし四角：デュラグルチド（10nmol）（5）；大きな塗りつぶし三角：化合物42（1nmol）（6）；小さな塗りつぶし三角：化合物42（10nmol）（7）；大きな塗りつぶし逆三角：化合物45（1nmol）（8）；小さな塗りつぶし逆三角：化合物45（10nmol）（9）。 種々の化合物を適用した後の7日目の体重（BW）の総変化及び累積食物摂取（FI）を示す。(1)/白丸：ビヒクルコントロール；(2)/黒丸：ペプチド-ロング24C（10nmol）；(3)/菱形：ペプチド-ロング24N-G3Fc（10nmol）；(4)/大きな塗りつぶし四角：デュラグルチド（1nmol）；(5)/小さな塗りつぶし四角：デュラグルチド（10nmol）；(6)/大きな塗りつぶし三角：化合物42（1nmol）；(7)/小さな塗りつぶし三角：化合物42（10nmol）；(8)/大きな塗りつぶし逆三角：化合物45（1nmol）；(9)/小さな塗りつぶし逆三角：化合物45（10nmol）。 14日目の体重（BW）の総変化を示す。（1）コントロールN-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117（10nmol）；（2）化合物42（10nmol）；（3）ペプチド-ロング-G3Fc（LALAPG）（10nmol）；（4）化合物74（1nmol）；（5）化合物74（10nmol）；（6）化合物77（1nmol）；（7）化合物77（10nmol）；（8）化合物80（1nmol）；（9）化合物80（10nmol）。 種々の化合物のin vivo半減期を示す。(1)/外枠が黒い丸：ペプチド-ロング-ヒトIgG1 Fc-領域融合ポリペプチド；(2)/四角：ペプチド-ロングG4S3-Fc-領域融合ポリペプチド；(3)/塗りつぶし菱形：ペプチド-ショート-G4S3-Fc-領域融合ポリペプチド；(4)/三角：ペプチド-ロング；(5)/黒丸：化合物42；(6)/白菱形：ペプチド-ロング-G3Fc（LALAPG）。
I．定義
本明細書及び特許請求の範囲では、免疫グロブリン重鎖Fc-領域の残基の番号付けはKabatのEUインデックスの番号付けである（Kabat, E.A. et al., Sequences of `roteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242（参照により明確に本明細書に含まれる））。“KabatのEUインデックス”という用語は、ヒトIgG1 EU抗体の残基の番号付けを示す。
“親和性”という用語は、ある分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原又はFc受容体)との間の非共有結合性相互作用を全て合計した強さを指す。特段の指示がなければ、本明細書で用いられる“結合親和性”は、結合対のメンバー（例えば抗体/Fc受容体又は抗体及び抗原）間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。ある分子XのそのパートナーYに対する親和性は、概ね解離定数（KD）によって表すことができる。親和性は当業界で公知の一般的な方法(本明細書に記載されるものを含む)によって測定できる。
“改変”という用語は、例えば、抗体又は融合ポリペプチド（少なくともFc-領域のFcRn結合部分を含む）の親アミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸残基の変異、付加、又は欠失を指し、前記によって変種抗体又は融合ポリペプチドが得られる。
“アミノ酸変異”という用語は、親アミノ酸配列のアミノ酸配列における改変を指す。典型的な改変にはアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失が含まれる。ある実施態様では、アミノ酸変異は置換である。“当該位置のアミノ酸変異”という用語は、指定残基の置換若しくは欠失、又は指定残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。“指定残基に隣接する挿入”という用語は、その1つから2つの残基内の挿入を指す。挿入は指定残基のN-末端でもC-末端でもよい。
“アミノ酸置換”という用語は、予め定められた親アミノ酸配列の少なくとも1つのアミノ酸残基の異なる“入れ替え”アミノ酸残基による入れ替えを指す。1つの入れ替え残基又は複数の入れ替え残基は、“天然に存在するアミノ酸残基”（すなわち遺伝暗号でコードされる）でありうる。前記は以下から成る群から選択される：アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）及びバリン（Val）。ある実施態様では、入れ替え残基はシステインではない。1つ以上の天然に存在しないアミノ酸残基による置換もまた本明細書のアミノ酸置換の定義に包含される。“天然に存在しないアミノ酸残基”は、上記に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を指し、前記はポリペプチド鎖の隣接アミノ酸残基と共有結合できる。天然に存在しないアミノ酸残基の例には以下が含まれる:ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aib、及び他のアミノ酸残基アナローグ（例えば以下に記載されたもの：Ellman, et al., Meth. Enzym. 202(1991) 301-336）。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Norenら（Science 244(1989) 182）及び/又はEllmanら（上掲書）の手順を用いることができる。略記すれば、これらの手順は、サプレッサーtRNAを天然に存在しないアミノ酸残基で化学的に活性化し、続いて当該RNAをin vitroで転写及び翻訳することを必要とする。天然に存在しないアミノ酸はまた化学的なペプチド合成を介してペプチドに取り込まれ、続いてこれらのペプチドは組換え生成ポリペプチド（例えば抗体又は抗体フラグメント）と融合させることができる。
“アミノ酸挿入”という用語は、少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の予め定められた親アミノ酸配列への取り込みを意味する。挿入は通常1つ又は2つのアミノ酸残基の挿入から成るが、本出願はより大きな“ペプチド挿入”、例えば約3から約5又は約10までものアミノ酸残基の挿入を意図する。挿入される残基は上記に定義した天然に存在するものでも存在しないものでもよい。
“アミノ酸欠失”という用語は、あるアミノ酸配列の予め定められた位置の少なくとも1つのアミノ酸の除去を指す。
“抗体変種”という用語は親抗体（例えば野生型抗体）の変種を指し、前記変種は、親アミノ酸配列に対応する配列内の少なくとも1つの改変が該抗体変種アミノ酸配列内に存在することを特徴とする（前記は例えば親抗体の1つ以上のアミノ酸残基の変異によって誘発される）。
本出願では、アミノ酸改変が記述されるときは常に、該改変は意図的なアミノ酸改変であり無作為のアミノ酸改変ではない。
“抗体依存細胞媒介性細胞傷害”（略して“ADCC”）は、FcRを発現する抗原非特異的な細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー細胞（NK細胞）、好中球、及びマクロファージ）が、免疫グロブリンFc-領域に結合することによって標的細胞を認識し、続いて該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を指す。ADCCを媒介する一次細胞のNK細胞はFcγRIIIのみを発現し、一方、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcRの発現は以下の文献の464ページの表3に要約されている（Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492）。
“抗体依存細胞食作用”（略して“ADCP”）という用語は、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンFc-領域に結合する食作用性免疫細胞（例えばマクロファージ、好中球又は樹状突起細胞）によって完全に又は部分的に内在化される過程を指す。
“Fc受容体に結合する”という用語は、例えばBIAcore(R)アッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）でFc-領域がFc受容体に結合することを指す。
BIAcore(R)アッセイでは、Fc受容体はある表面に結合し、分析物（例えば融合ポリペプチド又は抗体を含むFc-領域）の結合は表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される。結合親和性は以下の用語によって定義される：ka（結合定数：Fc-領域/Fc受容体複合体を形成するFc-領域融合ポリペプチドの結合速度定数）、kd（解離定数：Fc-領域/Fc受容体複合体を形成するFc-領域融合ポリペプチドの解離速度定数）、及びKD（kd/ka）。また別には、共鳴シグナルの高さ及び解離態様に関して、SPRセンサーグラムの結合シグナルを参照物の応答シグナルと直接比較してもよい。
“C1q”という用語は、免疫グロブリンのFc-領域に対する結合部位を含むポリペプチドを指す。C1qは、2つのセリンプロテアーゼ（C1r及びC1s）と一緒に複合体、C1（補体依存細胞傷害（CDC）経路の第一の成分）を形成する。ヒトC1qは、例えばQuidel（San Diego, Calif）から市場で購入できる。
“インクレチン受容体リガンドポリペプチド”という用語は、天然に存在するか又は合成のポリペプチドであってグルカゴン受容体（GCGR）、及び/又はグルカゴン様ペプチド-I（GLP-1）受容体（GLP-1R）、及び/又はグルコース依存インスリン分泌性ペプチド（GIP）受容体（GIPR）と結合するもの（すなわち、これらの受容体の少なくとも1つに対してアゴニスト活性を有する分子）を指す。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン分泌性ペプチド受容体と結合する。ある好ましい実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン分泌性ペプチド受容体及びグルカゴン様ペプチド-I受容体と結合する。ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン分泌性ペプチド受容体及びグルカゴン様ペプチド-I受容体及びグルカゴン受容体と結合する。
血糖が下降し始めるとき、グルカゴン（膵臓によって生成されるホルモン）は、グリコーゲンを分解してグルコースを放出し、血糖を正常レベルに上昇させるように肝臓にシグナルを送る。GLP-Iはグルカゴンと比較して異なる生物学的活性を有する。その作用は、インスリン合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取の阻害を含む。GLP-Iは、糖尿病患者で高血糖症（グルコースレベルの上昇）を軽減することが示された。エキセンジン-4（トカゲ毒由来のペプチドでありGLP-Iと50%のアミノ酸配列同一性を共有する）はGLP-I受容体を活性化し、同様に高血糖症を糖尿病患者で軽減することが示された。グルコース依存インスリン分泌性ペプチド（GIP）は、グルコースの存在下で膵ベータ細胞のインスリン分泌を刺激する、42アミノ酸の胃腸系調節ペプチドである。前記は、133アミノ酸の前駆体（プレプロGIP）のタンパク分解性プロセッシングによって誘導される。
本明細書に報告される融合ポリペプチドは自然のままのグルカゴン配列に対して改変を有するインクレチン受容体リガンドを含み、前記は、自然のままのグルカゴンの活性と等価若しくは前記より優れた強力なグルカゴン活性、自然のままのGIPの活性と等価若しくは前記より優れた強力なGIP活性、及び/又は自然のままのGLP-Iの活性と等価の若しくは前記より優れた強力なGLP-I活性を示す。
本明細書に報告される融合ポリペプチドの作用には、グルコース恒常性、インスリン分泌、胃内容排出、腸増殖、食物摂取の調節が含まれる。GIP活性及びGLP-I活性の両方を有するペプチドは、体重低下又は体重増加防止の誘発の他に高血糖症（糖尿病を含む）の治療に特に有益である。
インクレチン受容体リガンドポリペプチドには、GLP-1、エキセンジン-3、エキセンジン-4及び前記の前駆体、誘導体又はフラグメントが含まれる（ただしこれらに限定されない）。典型的なインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、US5,574,008、US5,424,286、US6,514,500、US6,821,949、US6,887,849、US6,849,714、US6,329,336、US6,924,264、WO2003/103572、US6,593,295、WO2001/109784、WO2010/011439、US6,329,336及びUS7,153,825に報告されている。
“CH2ドメイン”という用語は、約EU231位からEU340位（KabatのEU番号付けシステム）に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を指す。ある実施態様では、CH2ドメインは以下のアミノ酸配列を有する：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK（配列番号:40）。CH2ドメインは、もう一方のドメインと緊密に対合しないという点で特有である。それどころか、2つのN-結合分枝炭水化物鎖が無傷で自然のままのFc-領域の2つのCHドメイン間に介在する。該炭水化物は、ドメイン-ドメイン対合のための代用物を提供し、CH2ドメインの安定化に役立ちうると推測されている（Burton, Mol. Immunol. 22(1985) 161-206）。
“CH3ドメイン”という用語は、約EU341位からEU446位に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を指す。ある実施態様では、CH3ドメインは以下のアミノ酸配列を有する：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号:41）。
抗体の“クラス”という用語は、その重鎖が保持する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。ヒトの抗体には5つの主要なクラス（IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM）が存在し、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1に分けられる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
“補体依存細胞傷害”（略して“CDC”）という用語は、標的に結合したFc-領域融合ポリペプチドが一連の酵素反応を活性化し該標的細胞の膜に穴を形成することで終わる、細胞死を誘発するメカニズムを指す。典型的には、抗原-抗体複合体（例えば抗体被覆標的細胞上のもの）は、補体成分C1qと結合してこれを活性化し、前記は順に補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす。補体の活性化はまた標的細胞表面に補体成分の沈積を生じ、前記は白血球の補体受容体（例えばCR3）と結合することによってADCC又はADCPを促進することができる。
“エフェクター機能”という用語は、抗体のFc-領域に起因せしめうる生物学的活性を指し、当該生物学的活性は抗体のアイソタイプにしたがって変動する。抗体エフェクター機能の例には以下が含まれる：C1q結合及び補体依存細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、食作用（ADCP）、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びB細胞活性化。そのような機能は例えば、Fc-領域と食作用性又は溶解性活性を有する免疫細胞上のFc受容体との結合によって、又はFc-領域と補体系の成分との結合によって引き起こされうる。
“エフェクター機能の低下”という用語は、ある分子に随伴する特異的なエフェクター機能（例えばADCC又はCDC）がコントロール分子（例えば野生型Fc-領域を有するポリペプチド）と比較して少なくとも20%低下することを指す。“強く低下したエフェクター機能”という用語は、ある分子に随伴する特異的なエフェクター機能（例えばADCC又はCDC）がコントロール分子と比較して少なくとも50%低下することを指す。
薬剤（例えば医薬処方物）の“有効な量”という用語は、所望の治療成果又は予防成果を達成するために必要な投薬及び期間における有効な量を指す。
“Fc-領域”という用語は免疫グロブリンのC-末端領域を指す。Fc-領域は、ジスルフィド結合で連結された抗体重鎖フラグメントを含むダイマー分子（Fc-領域ポリペプチド鎖）であり、場合によって1つ、2つ、3つ以上のジスルフィド結合を含む。Fc-領域は、無傷（完全長）の抗体のパパイン消化、又はIdeS消化、トリプシン消化によって生成することができ、又は組換えによって製造することができる。
完全長抗体又は免疫グロブリンから入手できるFc-領域は、完全長重鎖の残基226（Cys）からC-末端までを含み、したがってヒンジ領域の一部及び2つ又は3つの定常ドメイン（すなわちCH2ドメイン、CH3ドメイン、及び場合によってCH4ドメイン）を含む。US5,648,260及びUS5,624,821から、Fc-領域中の規定のアミノ酸残基の改変は表現型効果を生じることが知られている。
２つの同一の又は同一でない抗体重鎖フラグメントを含むFc-領域ダイマーの形成は、含まれるCH3ドメインの非共有結合型ダイマー化によって媒介される（必要とされるアミノ酸残基については例えば以下を参照されたい：Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273）。Fc-領域は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の形成によって共有結合的に安定化される（例えば以下を参照されたイ:Huber et al., Nature 264 (1976) 415-420；Thies et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79）。CH3-CH3ドメインダイマー化の相互作用の破壊を目的とする、CH3ドメイン内へのアミノ酸残基変更の導入は、新生児型Fc受容体（FcRn）結合に有害な影響を与えない。なぜならば、CH3-CH3ドメインダイマー化に必要とされる残基の位置はCH3ドメインの内部境界面に配置され、一方、Fc-領域-FcRn相互作用に必要とされる残基はCH2-CH3ドメインの外側に配置されるからである。
Fc-領域のエフェクター機能に関連する残基は、完全長抗体分子のために決定されるようにヒンジ領域、CH2、及び/又はCH3ドメインに位置する。Fc-領域関連/媒介機能は以下である:
（i）抗体依存細胞媒介性細胞障害（ADCC）、
（ii）補体（C1q）結合、活性化及び補体依存細胞傷害（CDC）、
（iii）抗原-抗体複合体の食作用/除去、
（iv）いくつかの事例ではサイトカイン放出、及び
（v）抗体及び抗原-抗体複合体の半減期/除去速度。
Fc-領域関連エフェクター機能は、Fc-領域とエフェクター機能特異的分子又は受容体との相互作用によって開始される。大抵は、IgG1アイソタイプの抗体は受容体活性化を達成できるが、IgG2及びIgG4アイソタイプの抗体はエフェクター機能を持たないか又は限定されたエフェクター機能を有する。
エフェクター機能を引き出す受容体は、FcγRI、FcγRII及びFcγRIII Fc受容体タイプ（及びサブタイプ）である。IgG1アイソタイプと密接に関連するエフェクター機能は、下部ヒンジ領域に特定のアミノ酸変化（例えばL234A及び/又はL235A）を導入することによって低下させることができる（前記はFcγR及びC1q結合に必要とされる）。さらにまたある種のアミノ酸残基（本質的にCH2及び/又はCH3ドメインに位置する）は、血流中の抗体分子又はFc-領域融合ポリペプチドの循環半減期と密接に関連する。循環半減期は、Fc-領域と新生児型Fc受容体（FcRn）との結合によって決定される。
Fc-領域の糖構造に存在するシアリル残基は、Fc-領域の抗炎症媒介活性に必要とされる（例えば以下を参照されたい：Anthony, R.M., et al. Science 320 (2008) 373-376）。
抗体の定常領域のアミノ酸残基の番号付けはKabatのEUインデックスにしたがって実施される（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242）。
“ヒト起源のFc-領域”という用語は、ヒンジ領域の少なくとも一部分、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、ヒト起源の免疫グロブリン重鎖のC-末端領域を指す。ある実施態様では、ヒトIgG重鎖Fc-領域は約Cys226（又は約Pro230）から該重鎖のカルボキシ末端に及ぶ。しかしながら、Fc-領域のC-末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。
“変種Fc-領域”という用語は、少なくとも1つの“アミノ酸改変/変異”のゆえに“親の”、“自然のままの”又は“野生型の”Fc-領域アミノ酸配列のものとは異なるアミノ酸配列を指す。ある実施態様では、変種Fc-領域は、自然のままのFc-領域又は親ポリペプチドのFc-領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸変異（例えば約1つから約10アミノ酸変異）を有し、さらにある実施態様では、自然のままのFc-領域又は親ポリペプチドのFc-領域に約1つから約5つのアミノ酸変異を有する。ある実施態様では、（変種）Fc-領域は、野生型Fc-領域及び/又は親ポリペプチドのFc-領域と少なくとも80%の相同性を有し、さらにある実施態様では、変種Fc-領域は少なくとも約90%の相同性を有し、ある実施態様では、変種Fc-領域は少なくとも95%の相同性を有する。
本明細書に報告される変種Fc-領域は含まれるアミノ酸改変によって規定される。したがって例えば、P329Gという用語は、親（野生型）Fc-領域と比較してアミノ酸329位にプロリンからグリシンへの変異を有する変種Fc-領域を指す。当該野生型アミノ酸が何であるかは特定できないが、その場合は上述の変種は329Gと称される。本発明で考察されるすべての位置について、番号付けはEUインデックスにしたがう。EUインデックス又はKabatのEUインデックス又はEU番号付け体系はEU抗体の番号付けを指す（Edelman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85）。改変は付加、欠失、又は変異でありうる。“変異”という用語は、天然に存在するアミノ酸への変更の他に天然に存在しないアミノ酸への変更を指す。例えば以下を参照されたい：US6,586,207、WO98/48032、WO03/073238、US2004/0214988、WO2005/35727、WO2005/74524、Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027；Cin, J.W. and Schultz, P.Z., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137；Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024；及びWang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10。
IgG1アイソタイプの野生型ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:42）。
変異L234A、L235Aを有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:43）。
ホール（hole）変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:44）。
ノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:45）。
L234A、L235A及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:46）。
L234A、L235A及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:47）。
P329G変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:48）。
L234A、L235A及びP329G変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:49）。
P329G及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:50）。
P329G及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:51）。
L234A、L235A、P329G及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:52）。
L234A、L235A、P329G及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:53）。
IgG4アイソタイプの野生型ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:54）。
S228P及びL235E変異を有する、IgG4アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:55）。
S228P、L235E及びP329G変異を有する、IgG4アイソタイプの変種ヒトFc-領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:56）。
“Fc受容体”（略して“FcR”）という用語はFc-領域に結合する受容体を指す。ある実施態様では、FcRは自然のままの配列のヒトFcRである。さらにまた、ある実施態様では、FcRはIgG抗体（Fcガンマ受容体）と結合するFcRであり、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含む（前記には対立遺伝子変種及びまた別にそのスプライス型が含まれる）。FcγRII受容体はFcγRIIA（“活性化型受容体”）及びFcγRIIB（“阻害型受容体”）を含み、前記は、主としてその細胞質ドメインに相違を有する類似のアミノ酸配列を有する。活性化型受容体FcγRIIAは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ITAM）をその細胞質ドメイン内に含む。阻害型受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ITIM）を含む（例えば以下を参照されたい：Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234）。FcRは以下で概括されている：Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341）。他のFcR（将来同定されるものを含む）も本明細書の“FcR”という用語に包含される。前記用語はまた新生児型受容体（FcRn）を含み、前記は母親のIgGの胎児への移行に必要である（例えば以下を参照されたい：Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587；Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249）。
“IgG Fcリガンド”という用語は、IgG抗体のFc-領域に結合してFc-領域/Fcリガンドを形成する任意の生物由来の分子（ある実施態様ではポリペプチド）を指す。Fcリガンドには、FcγR、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスタンパク質A、ストレプトコッカスタンパク質G、及びウイルスFcγRが含まれるが、ただしこれらに限定されない。FcリガンドにはまたFc受容体ホモローグ（FcRH）が含まれ、前記はFcγRと同種のFc受容体ファミリーである（例えば以下を参照されたい：Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136）。Fcリガンドは、Fcと結合する未発見の分子を含むことができる。ある実施態様ではIgG FcリガンドはFcRn及びFcガンマ受容体である。
“Fcガンマ受容体”（略して“FcγR”）という用語は、IgG抗体のFc-領域と結合し、さらにFcγR遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを指す。ヒトでは、このファミリーには、FcγRI（CD64）（アイソフォームFcγRIA、FcγRIB及び FcγRICを含む）、FcγRII（CD32）（アイソフォームFcγRIIA（アロタイプH131及びR131を含む）、FcγRIIB（FcγRIIB-１及び FcγRIIB-2を含む）、及びFcγRIICを含む）、及びFcγRIII（CD16）（アイソフォームFcγRIIIA（アロタイプV158及びF158を含む）及びFcγRIIIB（アロタイプFcγRIIB-NA1及び FcγRIIB-NA2を含む）を含む）（例えば以下を参照されたい：Jefferis, et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65）の他に、任意の未発見ヒトFcγR又はFcγRアイソフォーム若しくはアロタイプが含まれるが、ただしこれらに限定されない。FcγRは、任意の生物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれるが、ただしこれらに限定されない）に由来しうる。マウスFcγRには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、及びFcγRIII-2（CD16-2）の他に、任意の未発見マウスFcγR又はFcγRアイソフォーム若しくはアロタイプが含まれるが、ただしこれらに限定されない。Fc-領域-FcγR相互作用に必要とされるアミノ酸残基は、234−239（下部ヒンジ領域）、265−269（B/Cループ）、297−299（D/Eループ）、及び327−332（F/G）ループである（Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273）。FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、及び/又はFcγRIIIAに対する結合/親和性の低下をもたらすアミノ酸変異には、N297A（免疫原性低下及び結合/親和性半減期延長が同時に生じる）（Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847；Friend, et al., Transplantation 68 (1999) 1632；Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591-6604）、残基233−236が含まれる（Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77；Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。いくつかの典型的なアミノ酸置換はUS7,355,008及びUS7,381,408に記載されている。
“新生児型Fc受容体”（略して“FcRn”）という用語は、IgG抗体のFc-領域と結合し、さらに少なくとも部分的にFcRn遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。FcRnは、任意の生物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれるが、ただしこれらに限定されない）に由来しうる。当業界で公知のように、機能的なFcRnタンパク質は2つのポリペプチド（しばしば重鎖及び軽鎖と称される）を含む。軽鎖はベータ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はFcRn遺伝子によってコードされる。本明細書では特段の規定がなければ、FcRn又はFcRnタンパク質は、FcRn重鎖とベータ-2-ミクログロブリンとの複合体を指す。FcRnと相互作用するFc-領域のアミノ酸残基はCH2とCH3ドメインの結合部近くに存在する。Fc-領域-FcRn接触残基はいずれも単一IgG重鎖内に存在する。必要とされるアミノ酸残基は、248、250−257、272、285、288、290−291、308−311及び314（いずれもCH2ドメイン）並びにアミノ酸残基385−387、428及び433−436（いずれもCH3ドメイン）である。FcRnに対する結合/親和性の増加をもたらすアミノ酸変異には、T256A、T307A、E380A、及びN434Aが含まれる（Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。
“野生型ポリペプチド”又は“親ポリペプチド”という用語は出発ポリペプチドを指し（前記は未改変（野生型）であるか又は野生型（親ポリペプチド）から前記を区別させる少なくとも1つの改変をすでに含む）、続いて改変されて変種を生じるものを指す。“野生型ポリペプチド”という用語は、ポリペプチドそれ自体、ポリペプチドを含む組成物、又は該ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。したがって、“野生型Fc-領域ポリペプチド”という用語は、天然に存在するFc-領域を含むFc-領域融合ポリペプチドを指し、前記は改変されて変種を生じる。
“完全長抗体”という用語は、自然のままの抗体構造とともに本明細書に報告されるFc-領域を含むポリペプチドと実質的に同一である構造及びアミノ酸配列を有する抗体を指す。
“ヒンジ領域”という用語は、CH1ドメインとCH2ドメインを結合させる抗体重鎖ポリペプチドの部分、例えば、KabatのEU番号系にしたがえば約216位から約230位を指す。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、IgG1アイソタイプ配列のヒンジ領域システイン残基を用いてアラインメントを実施することによって決定できる。
ヒンジ領域は通常同一のアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドから成るダイマー分子である。ヒンジ領域は概して約25アミノ酸残基を含み、可撓性であって抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は3つのドメイン（上部、中央及び下部ヒンジドメイン）にさらに分割することができる（例えば以下を参照されたい：Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083）。
Fc-領域の“下部ヒンジ領域”という用語は、ヒンジ領域C-末端直近の一続きのアミノ酸残基、すなわちKabatのEU番号付けにしたがえばFc-領域の残基233から239を指す。
“野生型Fc-領域”という用語は、天然で見出されるFc-領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指す。野生型ヒトFc-領域は、自然のままのヒトIgG1 Fc-領域（非Aアロタイプ及びAアロタイプ）、自然のままのヒトIgG2 Fc-領域、自然のままのヒトIgG3 Fc-領域、及び自然のままのヒトIgG4 Fc-領域の他に天然に存在する前記の変種を含む。
参照ポリペプチド配列に関して“パーセント（%）アミノ酸配列同一性”は、配列をアラインメントし、必要ならばギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成し、さらにいずれの保存的置換も配列同一性の部分とみなさなかったとき、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的とするアラインメントは、当業者の技量の範囲内の多様な方法で達成できる。前記は、例えば公開コンピューターソフト（例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフト）を用いる。当業者は、配列のアラインメントのために適切なパラメーターを決定でき、前記は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む。しかしながら、本明細書の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を用いて作成される。ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社（Genentech, Inc.）によって著され、ソースコードは利用者文書で米国著作権局（Washington D.C., 20559）に申請され、米国著作権登録No.TXU510087として登録されている。ALIGN-2はジェネンテック社（South San Francisco, California）から公開され、又はソースコードからコンパイルできる。ALIGN-2プログラムはUNIXオペレーティングシステム（デジタルUNIX V4.0Dを含む）での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメーターはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、あるアミノ酸配列Aのあるアミノ酸配列Bに対するアミノ酸配列同一性（前記語句はまた別には、あるアミノ酸配列Bに対してある％アミノ酸配列同一性を有するか又は含むあるアミノ酸配列と表現されうる）は、以下のように計算される：
比X/Yの100倍
式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって当該プログラムのA及びBのアラインメントで同一対と評価されたアミノ酸残基数であり、YはBのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する％アミノ酸配列同一性は、BのAに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないであろうということは理解されよう。特段の指定がない場合には、本明細書で用いられる全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN-2コンピュータープログラムを用い直近のパラグラフに記載したように入手される。
“医薬処方物”という用語は調製物を指し、前記調製物は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態を有し、さらに前記処方物が投与される対象動物にとって許容不能な毒性を有する追加成分を含まない。
“医薬的に許容できる担体”は医薬処方物中の活性成分以外の成分を指し、前記は対象動物にとって非毒性である。医薬的に許容できる担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤又は保存料が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
“位置”という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の場所を指す。位置は、連続的に又は確立された様式（例えば抗体の番号付けのためのKabatのEUインデックス）にしたがって番号付けされる。
“治療”という用語（又はその文法的変型（例えば“治療する”又は“治療の”））は、治療される個体の自然な経過を改変する試みにおける臨床的介入を意味し、予防のために又は臨床的病変の経過中に実施されうる。望ましい治療効果には、疾患の発生又は再発の予防、徴候の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的帰結の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、症状の緩和又は軽減、及び緩解又は予後改善が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発達を遅らせるか又は疾患の進行を緩やかにするために用いられる。
“変種”という用語は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。典型的には、そのような分子は１つ以上の改変、挿入又は欠失を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は、親アミノ酸配列に関し100%未満の配列同一性を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に関し約75%から100%未満のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は約80%から100%未満、ある実施態様では約85%から100%未満、ある実施態様では約90%から100%未満、ある実施態様では約95%から100%未満のアミノ酸配列同一性を親ポリペプチドのアミノ酸配列に関して有する。
“改変された”FcR結合親和性又はADCC活性という用語は、親ポリペプチド（例えば野生型Fc-領域を含むポリペプチド）と比較して、FcR結合活性及び/又はADCC活性の強化又は低下を有するポリペプチドを意味する。FcRとの“結合増加を有する”変種ポリペプチドは、親又は野生型ポリペプチドよりも低い解離定数（すなわちより良好な/より高い親和性）で少なくとも１つのFcRと結合する。FcRとの“結合低下を有する”変種ポリペプチドは、親又は野生型ポリペプチドよりも高い解離定数（すなわちより劣る/より低い親和性）で少なくとも１つのFcRと結合する。FcRとの結合低下を示す変種は、野生型又は親IgG Fc-領域と比較して、例えば本明細書に記載する実施例で決定されるように、FcRとの評価しうる結合をほとんど又は全く保持し得ない（例えばFcRとの0−20%の結合）。
親又は野生型ポリペプチドと比較したとき、“低下した親和性”でFcRと結合するポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して（実質的に）低下した結合親和性で上記に認定した任意の1つ以上のFcRと結合するポリペプチドである（このとき結合アッセイ中の変種ポリペプチド及び親ポリペプチドの量は（本質的に）ほぼ同じである）。例えば、FcR結合親和性が低下したポリペプチド変種は、親ポリペプチドと比較して、約1.15倍から約100倍、例えば約1.2倍から約50倍のFcR結合親和性の低下を示すことができ、ここでFcR結合親和性は、例えば本明細書に開示する実施例で開示するように決定される。
変種Fc-領域を含むポリペプチド（前記は“ヒトエフェクター細胞の存在下で親ポリペプチドよりも低い効力で抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を媒介する”）は、in vitro又はin vivoでのADCC媒介効力が（実質的に）低いポリペプチドである（このときアッセイで用いられる変種ポリペプチド及び親ポリペプチドの量は（本質的に）ほぼ同じである）。概して、そのような変種は、本明細書で開示されるin vitroのADCCアッセイを用いて同定されるが、ADCC活性を決定する他のアッセイ又は方法（例えば動物モデルなど）も意図される。ある実施態様では、変種は、例えば本明細書に開示されるin vitroアッセイで親よりもADCC媒介効力が約1.5倍から約100倍、例えば約2倍から約50倍低い。
“受容体”という用語は、少なくとも1つのリガンドと結合することができるポリペプチドを意味する。ある実施態様では、受容体は細胞表面受容体であり、前記は、細胞外リガンド結合ドメイン及び場合によって他のドメイン（例えばトランスメンブレンドメイン、細胞内ドメイン及び/又は膜アンカー）を有する。本明細書に記載するアッセイで評価される受容体は、無傷の受容体又はそのフラグメント若しくは誘導体（例えば1つ以上の異種ポリペプチドに融合された受容体の結合ドメインを含む融合タンパク質）でありうる。さらにまた、その結合特性について評価される受容体は、細胞内に存在していても、又は単離され場合によってアッセイプレート若しくは他の固相に被覆されていてもよい。
“受容体結合ドメイン”という用語は受容体のための任意の自然のリガンドを意味し、前記には、細胞接着分子、又はそのような自然のリガンドの任意の領域若しくは誘導体であって対応する自然のリガンドの少なくとも定性的な受容体結合能力を維持するものが含まれる。とりわけ前記の定義は、上述の受容体のためのリガンドの結合配列を特に含む。
II．インクレチン受容体リガンドポリペプチド及び前記を含むFc-領域融合ポリペプチド
本明細書では、1つから4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド及び変種Fc-領域を含むFc-領域融合ポリペプチドが報告される。
脂質化はインクレチン受容体リガンドポリペプチドの生物学的活性を高めうることが見出された。したがって、これらのペプチドは本発明の特徴である。受容体結合における種々の化合物の脂質化の影響が下記の表に示される。
表1
脂質化（Fc-領域に別個に連結）によって生物学的活性（例えばEC50値）が改善されうることが分かる。脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、天然に存在する受容体リガンドGLP及びGIP-1と同様な活性をそれぞれヒトGLP受容体及びヒトGIP-1受容体で有する。
したがって、脂質化とFc-領域融合の組合せは、インクレチン受容体リガンドポリペプチドの生物学的活性を損なわないことがさらに見出された。比較の結果は下記の表に示されている。
本理論に拘束されないが、脂質化インクレチン受容体ポリペプチドは、適用後にin vivoで（又は対応する結合パートナーが存在する場合にはin vitroでも）内因性ポリペプチド（例えばヒト血清アルブミン）によって複合体化されると仮定される。インクレチン受容体リガンドポリペプチドは複合体を形成する内因性ポリペプチドのサイズと比較して小さいので、複合体形成は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドの生物学的活性をそのアクセス能力の低下につれて低下させると予想される。さらにまた、インクレチン受容体リガンドポリペプチドがヒト免疫グロブリンFc-領域（又はその変種）にさらに融合されると、さらに問題となるであろう。
しかしながら、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは脂質化され（したがって大きなポリペプチドと複合体を形成する）、さらにヒト免疫グロブリンFc-領域と融合されるが、生物学的活性は、脂質が付加されずFc-領域と融合されないインクレチン受容体リガンドポリペプチドに少なくとも匹敵するか又は増加しさえすることが今や見出された。さらにまた、暴露半減期及びin vivo半減期は、非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチド及びPEG化インクレチン受容体リガンドポリペプチドと比較して延長される。対応するデータは下記の表に示される。
本明細書報告の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド（単離又はFc-領域融合ポリペプチドとして）は二元性GLP/GIPアゴニストとして機能し、他の非脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド又は誘導体（PEG化又はFc-領域融合ポリペプチド）と比較してin vivoで生物学的活性の改善を示す（図6から8を参照）。さらにまた、暴露半減期及びin vivo半減期が改善される（図9）。
所望される使用は細胞結合標的（＝受容体）の拮抗であり、したがって非エフェクター機能誘引性Fc-領域アイソタイプ又はFc-領域変種が選択されるべきである。
したがって、Fc-領域関連エフェクター機能の完全な低下をもたらすFc-領域含有融合ポリペプチドのFc-領域内の限定位置の変異が、融合ポリペプチドのヒト免疫グロブリンFc-領域に導入される。
Fc-領域融合ポリペプチドの循環半減期は、Fc-領域-FcRn相互作用を調整することによって影響を受けうる。これは、Fc-領域内の特定のアミノ酸残基を変更することによって達成できる（Dall'Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524；Petkova, S.B., et al., Internat. Immunol. 18 (2006) 1759-1769；Vaccaro, C., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (2007) 18709-18714）。
抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）及び補体依存細胞傷害性（CDC）の最小化又は除去さえも、いわゆるヒンジ領域のアミノ酸変更/置換によって達成できる。置換のために選択されるアミノ酸残基は、Fc-領域とヒトFc-受容体（ただしFcRnではない）との結合に関与すると予想される残基である。この/これらのアミノ酸残基の変更は、野生型IgG Fc-領域を含むFc-領域融合ポリペプチドと比較して安全性プロフィールの改善をもたらす。
古典的な補体カスケードは、抗原/IgG免疫複合体によるC1qの結合及び活性化によって開始される。この活性化は炎症性及び/又は免疫調節性応答を生じる。古典的補体カスケードの活性化の最小化又は除去さえも、いわゆるヒンジ領域のアミノ酸変更/置換によって達成できる。置換のために選択されるアミノ酸残基は、Fc-領域とC1q成分との結合に関与すると予想される残基である。C1q結合が低下又は排除されたある典型的なFc-領域変種は、L234A及びL235A（LALA）変異を含むFc-領域変種である。
Fc-領域融合ポリペプチドと新生児型受容体（FcRn）との結合は、胎盤を貫通するポリペプチドの輸送を生じ、さらにFc-領域融合ポリペプチドの循環半減期に影響を与える。Fc-領域融合ポリペプチドの循環半減期の延長は、有効性の改善、投与用量若しくは頻度の削減、又は標的への局在の改善をもたらす。Fc-領域融合ポリペプチドの循環半減期の短縮は、全身暴露の削減又は標的対非標的結合比の改善をもたらす。
種の間で保存されるFcRn結合のために必要なアミノ酸残基は、Fc-領域の310位及び435位のヒスチジン残基である。これらの残基は、Fc-領域FcRn相互作用のpH依存に必要である（例えば以下を参照されたい：Victor, G., et al., Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640；Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol. 169 (2002) 5171-5180）。FcRnとの相互作用を減弱させるFc-領域の変異は抗体半減期を短縮しうる。
概して、本明細書に報告される融合ポリペプチドは変種Fc-領域を含む。しかしながら、融合ポリペプチドのヒト免疫グロブリンFc-領域は、野生型Fc-領域と比較して既に1つ以上のアミノ酸配列変更を有し得る。例えば、親Fc-領域のC1q又はFcγR結合活性はすでに改変されていることがある（他のタイプのFc-領域改変は下記でより詳細に記載される。
ある実施態様では、融合ポリペプチドの親Fc-領域をコードする核酸は改変されて、融合ポリペプチドのFc-領域変種をコードする変種核酸配列を生成する。
融合ポリペプチドのFc-領域変種のアミノ酸配列をコードする核酸は当業界で公知の多様な方法によって調製できる。これらの方法には、位置指定（又はオリゴヌクレオチド媒介）変異導入、PCR変異導入、及び融合ポリペプチドのFc-領域をコードする以前に調製しておいたDNAのカセット変異導入が含まれ（ただしこれらに限定されない）、或いはDNA合成によって化学的に生成することもできる。
位置指定変異導入は置換変種の調製に適切な方法である。この技術は当業界では周知である（例えば以下を参照されたい：Carter, et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4431-4443；Kunkel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488）。略記すれば、DNAの位置指定変異導入の実施に際して、出発DNAは、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをそのような出発DNAの一本鎖とまず初めにハイブリダイズすることによって改変される。ハイブリダイゼーションの後で、プライマーとして前記ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチド及び鋳型として前記出発DNAの一本鎖を用い、DNAポリメラーゼにより完全な第二の鎖を合成する。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは生成二本鎖DNAに取り込まれる。
PCR変異導入もまた出発ポリペプチドのアミノ酸配列変種の作製に適切である（例えば以下を参照されたい：Higuchi, in PCR Protocols, Academic Press (1990) pp. 177-183, Vallette, et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989) 723-733）。略記すれば、少量の鋳型DNAがPCRの出発材料として用いられるとき、鋳型DNAの対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と相違する位置でのみ鋳型配列と相違する特異的なDNAフラグメントを比較的大量に生成することができる。
変種を調製する別の方法（カセット変異導入）は、Wellら（Gene 34 (1985) 315-323）が記載した技術に基づく。
本明細書で報告されるある特徴は、ヒト免疫グロブリンFc-領域及び1つから4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチドでは、少なくとも1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは脂質に共有結合により連結したアミノ酸残基を含み、さらにヒト免疫グロブリンFc-領域の少なくとも1つのアミノ酸残基は付加、変異又は欠失によって改変されてあり、親又は野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドと比較して、少なくとも1つのFc受容体に対する当該融合ポリペプチドの親和性の低下又は停止を生じる。
Fc-領域は、多数の受容体又はリガンド（Fc受容体（例えばFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA）、補体タンパク質C1q、及び他の分子（例えばタンパク質A及びG）を含むが、ただしこれらに限定されない）と相互作用する。これらの相互作用は、多様なエフェクター機能及び下流のシグナリング事象（抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、抗体依存細胞性食作用（ADCP）及び補体依存細胞傷害（CDC）を含むが、ただしこれらに限定されない）のために必須である。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、親又は野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドと比較して、Fc受容体に対する親和性が低下又は停止しているヒト免疫グロブリンFc-領域（エフェクター機能を引き出すことができる）を含み、ここで、変種ヒト免疫グロブリンFc-領域のアミノ酸配列は、親のヒト免疫グロブリンFc-領域のアミノ酸配列と少なくとも1つのアミノ酸残基の少なくとも1つの付加、変異、又は欠失によって相違する。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは少なくとも1つ以上の以下の特性を有する：エフェクター機能（ADCC及び/又はCDC及び/又はADCP）の低下又は停止、Fc受容体との結合の低下又は停止、C1qとの結合の低下又は停止、或いは毒性の低下又は停止。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは変種ヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、前記ヒト免疫グロブリンFc-領域は、KabatのEUインデックスにしたがえば329位のプロリンアミノ酸残基の少なくとも1つ変異又は欠失を有する。
1つのアミノ酸残基がアミノ酸配列から欠失する場合、複合的変異を有するFc-領域中の固有のアミノ酸残基の正確な識別を可能にするために、アミノ酸配列中の実際の位置は変化するけれども残余のアミノ酸残基はそれらのEUインデックス番号を維持する。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、KabatのEUインデックスにしたがえば329位にアミノ酸変異を有する野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む。ある実施態様では、Fc-領域のアミノ酸329位のプロリン残基は、プロリンより小さいか又は大きいアミノ酸残基に変異する。ある実施態様では、該アミノ酸残基はグリシン、アラニン又はアルギニンに変異する。ある好ましい実施態様では、Fc-領域のKabatのEUインデックスによれば329位のアミノ酸残基プロリンはグリシンに変異する。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは、少なくとも1つのさらに別のアミノ酸変異を該ヒト免疫グロブリンFc-領域に含む。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、少なくとも3つのアミノ酸変異、付加、又は欠失を有する野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンFc-領域に以下を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、及びP331S。
ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンFc-領域はヒトIgG1 Fc-領域又はヒトIgG4 Fc-領域である。
ある実施態様では、Fc-領域がIgG4アイソタイプならば、ヒト免疫グロブリンFc-領域のアミノ酸残基のさらに別の付加、変異又は欠失は、Fc-領域の228位及び/又は235位に存在する。ある実施態様では、228位のアミノ酸残基セリンはプロリン残基に置換され、さらに235位のアミノ酸残基ロイシンはグルタミン酸残基に置換される。
ある実施態様では、融合ポリペプチドはヒト免疫グロブリンFc-領域に3つのアミノ酸変異を含む。ある実施態様では、該3つのアミノ酸変異はP329G、S228P、及びL235E（SPLEPG）である。
ある実施態様では、Fc-領域がIgG1アイソタイプならば、本明細書に報告されるFc-領域融合ポリペプチドのアミノ酸残基のさらに別の付加、変異又は欠失は、Fc-領域の234位及び/又は235位に存在する。ある実施態様では、234位のアミノ酸残基ロイシンはアラニン残基に置換され、さらに235位のアミノ酸残基ロイシンはアラニン残基に置換される。
ある実施態様ではFcγRとの結合が改変されるが、新生児型受容体（FcRn）に対する結合親和性が改変された融合ポリペプチドもまた、本明細書に報告される特徴の実施態様である。
FcRnに対する親和性が増したFc-領域変種はより長い血清半減期を有し、そのような分子は、投与された融合ポリペプチドの半減期延長が所望される、哺乳動物の治療方法（例えば慢性疾患又は慢性異常の治療）で有益に適用されるであろう。
FcRn結合親和性が低下したFc-領域変種はより短い血清半減期を有し、そのような分子は、投与された融合ポリペプチドの半減期短縮が所望される、哺乳動物の治療方法（例えば毒性副作用の回避又はin vivo診断用画像化のための適用）で有益に適用されるであろう。FcRn結合親和性が低下したFc-領域は胎盤を通過する蓋然性が低く、したがって妊娠女性の疾患又は異常の治療に利用できる。
FcRn結合親和性が改変されたFc-領域は、ある実施態様では、アミノ酸238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439及び/又は447位の１つ以上にアミノ酸改変を有するFc-領域を含むものである。
FcRnとの結合が低下したFc-領域は、ある実施態様ではアミノ酸252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439及び/又は447位に１つ以上のアミノ酸改変を有するFc-領域を含む。
FcRnとの結合増加を示すFc-領域は、ある実施態様ではアミノ酸238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及び/又は434位に１つ以上のアミノ酸改変を有するFc-領域を含む。
融合ポリペプチドは、任意のクラス（例えばIgG、IgM及びIgEであるが、ただしこれらに限定されない）のヒト免疫グロブリンFc-領域を含むことができる。ある実施態様では、融合ポリペプチドはIgGクラスのヒト免疫グロブリンFc-領域を含む。ある実施態様では、融合ポリペプチドは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブクラスのヒト免疫グロブリンFc-領域を含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドはIgG1サブクラスのヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、さらに該Fc-領域にアミノ酸変異P329G、及び/又はL234A及びL235Aを含む。
ある実施態様では、融合ポリペプチドはIgG4サブクラスのヒト免疫グロブリンFc-領域を含む。ある実施態様では、融合ポリペプチドはIgG4サブクラスのヒト免疫グロブリンFc-領域を含み、さらに該Fc-領域にアミノ酸変異P329G、及び/又はS228P及びL235Eを含む。
ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドを、本明細書に報告されるアミノ酸変異の1つ以上を含むヒト免疫グロブリンFc-領域と連結することによって製造される。ある実施態様では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、本明細書に報告されるアミノ酸変異の1つ以上を導入することにより親Fc-領域融合ポリペプチドを改変することによって製造される。
ソルターゼAを用いる酵素的連結
Fc-領域及び1つ以上の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む連結物は、酵素ソルターゼAを用いることによって入手できる。
ソルターゼA（SrtA）は膜結合酵素であって、タンパク質と共有結合して細菌細胞壁に付着する。SrtA上の特異的な認識モチーフはLPXTG（配列番号:75）であり、それによって該酵素は残基スレオニンとグリシンの間を切断する。ペプチドグリカン上の認識モチーフはペンタグリシンモチーフである。N-末端のトリグリシン及びジグリシンさえもSrtA反応の促進に十分であることが示された（Clancy, K.W., et al., Peptide science 94 (2010) 385-396）。当該反応はチオエステルアシル-酵素中間体を介して進行する（前記中間体はオリゴグリシン（タンパク質基質にペプチドグリカンを共有結合により連結する）の求核アミンの攻撃によって分解され、SrtAを再生する）。SrtAを用いて、化学合成ペプチドを組換え発現タンパク質に共有結合により連結させることができる。
脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド（例えばGIP受容体及びGLP-1受容体二元性アゴニスト活性を有する）とサブクラスIgG1のヒト免疫グロブリンFc-領域との酵素的連結のために、可溶性SrtA（黄色ブドウ球菌（Staph. Aureus）SrtAのアミノ酸残基60−206）を用いることができる。該酵素は大腸菌（E. coli）で製造できる。連結されるべき重鎖の対応するN-末端を三重Gモチーフで、さらに連結されるべき重鎖の対応するC-末端をSrtA認識モチーフで改変したヒト免疫グロブリンFc-領域を、真核細胞（例えばHEK293細胞、CHO細胞）で発現させることができる。該当する三重Gモチーフ又はSrtA認識モチーフは、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの対応するN-末端又はC-末端に導入される。
本明細書に報告されるある特徴は、酵素ソルターゼAを用いて、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドをヒト免疫グロブリンFc-領域に連結することによって入手される、脂質化インクレチン受容体リガンドFc-領域融合ポリペプチドであり、ここで、ソルターゼ認識配列は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端及び/又は一方又は両方のFc-領域重鎖フラグメントのC-末端に位置し、さらに三重グリシンモチーフは、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端、及び/又は一方又は両方のFc-領域重鎖フラグメントのN-末端に位置する。
したがって、本発明は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びソルターゼ認識配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。典型的な特徴では、本発明は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びLPXTG（配列番号:75）（式中Xは任意のアミノ酸である）を含むポリペプチドを提供する。典型的な特徴では、Xは酸性アミノ酸（例えばAsp、Glu）である。典型的な特徴では、XはGluである。典型的な特徴では、該ポリペプチドはLPXTG（配列番号:75）のN-末端に1つ以上のGly残基を含む（式中Xは任意のアミノ酸である）。また別の或いは追加の実施態様では、該ポリペプチドは、Gly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly（配列番号:99）、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:79）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号:80）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:81）をLPXTG（配列番号:73）のC-末端に含む。典型的な特徴では、該ポリペプチドは、(GGS)n（式中n＝1−4）（配列番号:82−84）、又はGn（式中n＝2−6）（配列番号:85−87）、(GGGS)n（式中n＝1−6）（配列番号:57−60、88及び89）、(GGGGS)m（式中m＝1−6）（配列番号:61-64、90及び91）、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6）（配列番号:65−67及び92−94）を含む。
ある実施態様では、Fc-領域重鎖フラグメントの一方又は両方はリンカーポリペプチドを含み、前記は、三重GモチーフのC-末端とFc-領域重鎖のN-末端との間及び/又はFc-領域重鎖のC-末端とSrtA認識モチーフのN-末端との間に位置する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはリンカーポリペプチドを含み、前記はSrtA認識配列のN-末端とインクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端との間に位置する。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはリンカーポリペプチドを含み、前記は三重G認識配列のC-末端とインクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端との間に位置する。
ある実施態様では、リンカーポリペプチドは9から25アミノ酸残基の長さを有する。ある実施態様では、リンカーポリペプチドは、(GGGS)3（配列番号:57）、(GGGS)4（配列番号:58）、(GGGS)5（配列番号:59）、(GGGS)6（配列番号:60）、(GGGGS)2（配列番号:61）、(GGGGS)3（配列番号:62）、(GGGGS)4（配列番号:63）、(GGGGS)5（配列番号:64）、(GGGGGS)2（配列番号:65）、(GGGGGS)3（配列番号:66）、及び(GGGGGS)4（配列番号:67）から選択される。
典型的な特徴では、本発明は、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びリンカー（例えば配列番号:57−67のいずれかのアミノ酸配列を含むリンカー）を含むポリペプチドを提供する。
ある実施態様では、融合ポリペプチドは1つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む。この実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、Fc-領域の単一N-末端又はC-末端に連結される。さらにまたこの実施態様では、Fc-領域は2つの抗体重鎖Fc-領域フラグメントのヘテロダイマーであり、その一方のみがインクレチン受容体リガンドポリペプチド（連結後）又はオリゴグリシン/SrtA認識モチーフ（連結前）を含む。脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたヒトIgG1 Fc-領域を含む連結物（GIP受容体及びGLP-1受容体を活性化することによって二元性アゴニスト特性を有する）を、血糖レベルの制御及び激烈な脂肪量の低下のために用いることができる。
そのような連結物は糖尿病db/dbマウスで腹腔内グルコースチャレンジ後の血糖変動の減少をもたらすことが示された。加えて、食餌性肥満（DIO）マウスでは、そのような脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc-領域融合ポリペプチドの投与は、一回投与後に食物摂取の減少及び激烈な体重低下を誘発できることが観察された。
インクレチン受容体（例えばGLP-1受容体及びGIP受容体）の活性化は、膵臓ベータ細胞のグルコース依存インスリン分泌、増殖、及び脂肪毒性からの保護、並びにアポトーシス（PKA及び/又はEPAC活性化の下流経路によって媒介される）の予防をもたらす（Dzhura, I., et al., Islets 3 (2011) 121-128；Ehses, J.A., et al., Endocrin. 144 (2003) 4433-4445；Kang, G., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 8279-8285；Miura, Y. and Matsui, H., Tox. Appl. Pharmacol. 216 (2006) 363-372；Mukai, E., et al., Diabetes 60 (2011) 218-226；Natalicchio, A., et al., Endocrin. 151 (2010) 2019-2029；Quoyer, J., et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 1989-2002；Uhles, S., et al., Diabetes Obes. Metabol. 13 (2010) 326-336）。
さらにまた、インクレチン受容体（例えばGLP-1受容体及びGIP受容体）は、グルカゴンを分泌する膵臓アルファ細胞で検出されている。
インクレチン受容体（例えばGLP-1受容体）の存在は、迷走神経の他にCNSにおける広範囲の分布が報告されている。門脈のGLP-1受容体の活性化は、グルコース恒常性で決定的な役割を果たすことが報告されている（Burcelin, R., et al., Diabetes 50 (2001) 1720-1728; Vahl, T.P., et al., Endocrin. 148(2007) 4965-4973）。加えて、弓状核で発現されるGLP-1受容体はグルコースレベルの調節に関係している（Sandoval, D.A., et al., Diabetes 57 (2008) 2046-2054）。
後脳及び視床下部におけるGLP-1受容体の活性化は、食物消費の制限及び肥満予防で重要な役割を果たす（Hayes, M.R., et al., Endocrinol. 150 (2009) 2654-2659；McMahon, L.R. and Wellman, P.J., Am. J. Physiol. 274 (1998) R23-29；Turton, M.D., et al., Nature 379 (1996) 69-72）。
GIP及びGIP受容体はCNSに存在する。CNS中のGIPは神経形成及び記憶に役割を果たすと考えられる（Figueiredo, C.P., et al., Behav. Pharmacol. 21 (2010) 394-408；Nyberg, J., et al., J. Neurosci. 25 (2005) 1816-1825）。
インクレチン受容体（例えばGIP受容体）は脂肪細胞に存在し、脂肪分解及び脂肪酸の再エステル化を誘発する（Getty-Kushik, L., et al., Obesity 14 (2006) 1124-1131）。加えて、GIP受容体の活性化はヒト脂肪細胞でのLPL発現増加をもたらす（Kim, S.J., et al., J. Biol. Chem. 282 (2007) 8557-8567；Kim, S.J., et al., J. Lipid Res. 51 (2010) 3145-3157）。
III．組換え方法
本明細書に報告される融合ポリペプチドの部分を組換え方法及び組換え組成物を用いて製造することができる（例えばUS4,816,567を参照されたい）。
ある特徴では、そのような核酸を含む1つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
ある特徴では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。ある実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば以下により形質転換されてある）：（1）融合ポリペプチドの第一の重鎖Fc-領域を含むアミノ酸配列及び融合ポリペプチドの第二の重鎖Fc-領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（2）融合ポリペプチドの第一の重鎖Fc-領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び融合ポリペプチドの第二の重鎖Fc-領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター。
ある実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばヒト胎児腎細胞（HEK）細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又はリンパ系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。
ある特徴では、本明細書に報告される融合ポリペプチドを作製する方法が提供され、前記方法は、上記で提供される融合ポリペプチドのFc-領域部分をコードする核酸を含む宿主細胞を該ポリペプチドのFc-領域部分の発現に適切な条件下で培養する工程、及び場合によって宿主細胞（又は宿主細胞培養媒体）から融合ポリペプチドFc-領域部分を回収する工程、及び融合ポリペプチドの組換え生成Fc-領域部分を融合ポリペプチドの対応する他の脂質化インクレチン受容体リガンド部分と化学的又は酵素的に連結する工程を含む。融合ポリペプチドの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド部分は組換えにより製造しその後で改変するか、又は完全に合成により製造できる。
融合ポリペプチドの部分の組換え製造のために、融合ポリペプチドの部分をコードする核酸（例えば上記に記載のもの）を単離し、宿主細胞での更なるクローニング及び/又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、通常の手順を用いて容易に単離及び作製できる。
ポリペプチドをコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞には本明細書記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能が不要の時は細菌で製造できる（例えば以下を参照されたい：US5,648,237、US5,789,199、及びUS5,840,523；Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254（B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ）（前記は大腸菌での抗体フラグメントの発現を記載する））。発現後に、ポリペプチドを可溶性分画で細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。
原核細胞に加えて、真核微生物（例えば糸状菌又は酵母）も、ポリペプチドコードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路がヒト化されてあり部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生産をもたらす菌類及び酵母株が含まれる（例えば以下を参照されたい：Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215）。
グリコシル化ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞もまた多細胞生物（非脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。非脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定され、前記は昆虫細胞と一緒に、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために用いることができる。
植物細胞培養もまた宿主として利用できる（例えば以下を参照されたい：US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978、及びUS6,417,429（トランスジェニック植物で抗体を生産するPLANTIBODIESTM技術を記載する））。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、浮遊増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は以下である：SV40で形質転換したサル腎CV1株（COS-7）；ヒト胎児腎株（293）又は腎細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば以下の文献に記載されたTM4細胞（Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251））；サル腎細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA）；イヌ腎細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（Hep G2）；マウス乳房腫瘍（MMT060562）；TRI細胞（例えば以下の文献に記載：Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68）；MRC5細胞；及びFS4細胞。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には以下が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（DHFR陰性CHO細胞を含む（Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216））；及び骨髄腫細胞株（例えばY0、NS0及びSp2/0）。ポリペプチド製造に適切なある種の哺乳動物宿主細胞の概略については例えば以下を参照されたい：Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268（B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ）。
IV．医薬処方物
本明細書に報告される融合ポリペプチドの医薬処方物は、所望の純度を有するそのような融合ポリペプチドを1つ以上の任意の医薬的に許容できる担体と混合することによって凍結乾燥処方物又は水溶液として調製される（Osol, A., (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, 1980）。医薬的に許容できる担体は、受容者にとって用いられる投薬量及び濃度でおおむね非毒性であり、以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：緩衝剤（例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン）；カテコール（レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）のポリペプチドぺプ；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリ(ビニルピロリドン)）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えばEDTA）；糖類（例えばシュクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；錯塩（例えばZn-タンパク質複合物）；及び/又は非イオン性界面活性剤（例えばポリエチレングリコール（PEG））。本明細書の典型的な医薬的に許容できる担体には以下が含まれる：腸内薬剤分散剤、例えば可溶性の中性で活性なヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20（HYLENEX(商標)、Baxter International, Inc.）。ある典型的なsHASEGP及び使用方法（rHuPH20を含む）は、US2005/0260186及びUS2006/0104968に記載されている。ある特徴では、sHASEGPは1つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼ）と組み合わされる。
典型的な凍結乾燥抗体処方物はUS6,267,958に記載されている。水性抗体処方物にはUS6,171,586及びWO2006/044908に記載されたものが含まれ、後者の処方物はヒスチジン-酢酸緩衝剤を含む。
本明細書の処方物はまた、治療される具体的な適応症に必要な1つ以上の活性成分、特に互に有害な影響をもたない補完的活性を有するものを含む。そのような活性成分は、意図される目的のために有効な量で適切に一緒にされて存在する。
活性成分はマイクロカプセルに閉じ込めることができ、前記は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）によって、コロイド薬剤デリバリー系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）として、又はマクロエマルジョンとして調製される。そのような技術は以下で開示されている：Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A., (ed.), 1980。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、前記マトリックスは、成型品(例えばフィルム又はマイクロカプセル)の形態を有する。
in vivo投与で使用される処方物は概して無菌的である。無菌性は、例えば無菌的なろ過膜を通してろ過することによって容易に達成できる。
V．治療方法及び組成物
本明細書に報告される融合ポリペプチドのいずれも治療方法で用いることができる。
本発明のある特徴では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは疾患の治療に用いられる。ある実施態様では、当該疾患は、該融合ポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドと比較して強力に、少なくとも50%、ある実施態様では95%を超えて低下することが好ましい疾患である。
ある特徴では、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、疾患を治療する医薬の製造に用いられ、ここで、該融合ポリペプチドのエフェクター機能は、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドと比較して強力に低下し、ある好ましい実施態様では該エフェクター機能は95%を超えて低下することが好ましい。
本明細書に報告されるある特徴は疾患を有する個体を治療する方法であり（ここで、本明細書に報告される融合ポリペプチドのエフェクター機能は、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドと比較して強力に低下する）、前記方法は、本明細書に報告される融合ポリペプチドの有効量を当該個体に投与する工程を含む。
エフェクター機能の強力な低下は、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域を含む融合ポリペプチドによって誘発されるエフェクター機能の少なくとも50%のエフェクター機能の低下である。
そのような疾患は、例えば、標的細胞が例えばADCC、ADCP又はCDCによって破壊されるべきではない全ての疾患である。
本明細書に報告される融合ポリペプチドで治療できる症状は代謝性異常を含む多くの疾患である。
本明細書に報告される融合ポリペプチドは、以下を含む任意の適切な手段によって投与される：腸内（経口又は直腸的）、胃腸内、舌下、口唇下、非経口、皮下、静脈内、皮内、肺内、及び鼻内。ある実施態様では、投与は錠剤、カプセル又は点滴によって行われる。
疾患の予防又は治療について、融合ポリペプチドの適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重篤度及び経過、融合ポリペプチドの投与が予防目的又は治療目的のどちらであるか、以前の施療、患者の臨床歴及び融合ポリペプチドへの応答、並びに主治医の判断に左右されるであろう。融合ポリペプチドは、一度に又は一連の治療を通して患者に適切に投与される。
疾患のタイプ及び重篤度に応じて、融合ポリペプチドの約1μg/kgから15mg/kg（例えば0.1−20mg/kg）が、患者への投与の最初の候補投薬量であり、例えば1回以上に分けて投与するか又は連続輸液による。典型的な1日の投薬量は、上述の要件にしたがって約1μg/kgから100mg/kg以上の範囲でありうる。数日にわたる又はそれよりも長期の反復投与については、症状に応じて、治療は疾患の徴候の所望の抑制が生じるまで維持される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用でありうる。この治療方法の経過は通常の技術及びアッセイによって容易に追跡監視される。
代謝症候群（またメタボリックシンドロームX、インスリン耐性症候群又はリーベン症候群としても知られている）は、５千万を超えるアメリカ人が罹患する疾患である。代謝症候群は、典型的には以下のリスク因子の少なくとも3つ以上の集合を特徴とする：（1）腹部肥満（腹腔内又は腹部周辺の過剰な脂肪組織）、（2）アテローム形成性異脂肪血症（動脈壁プラークの蓄積を増強する高トリグリセリド、低HDLコレステロール及び高LDLコレステロールを含む血中脂肪異常）、（3）血圧上昇、（4）インスリン耐性又はグルコース不耐性、（5）血栓形成促進状態（血中の高いフィブリノゲン又はプラスミノゲン活性化因子阻害剤-1）、及び（6）前炎症状態（例えば血中のC-反応性タンパク質上昇）。他のリスク因子には加齢、ホルモンの不均衡及び遺伝的素因が含まれうる。
代謝症候群は、冠動脈性心疾患及び血管プラーク蓄積に関連する他の異常（例えば卒中及び末梢血管疾患（アテローム硬化症性心脈管系疾患（ASCVD）と称される））のリスク上昇と密接に関係する。代謝症候群を有する患者は、その初期にはインスリン耐性状態から進行し、ASCVDのリスクがさらに高まった完全なII型糖尿病に至りうる。いずれの特定の理論にも拘束されないが、インスリン耐性、代謝症候群、及び血管系疾患の関係は、1つ以上の同時に発生する病理メカニズムが関与し、前記病理メカニズムには、インスリン刺激性血管拡張の障害、インスリン耐性と密接に関係するNO利用能力の低下（酸化ストレスによる）、及び脂肪細胞由来ホルモン（例えばアジポネクチン）の異常が含まれうる（Lteif and Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B) (2004) 66B-76B）。
2001年の国内コレステロール教育プログラム成人治療パネル（National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel（ATP III））によれば、同一個体で以下の属性の3つがあればいずれも代謝症候群の基準を満たす：（a）腹部肥満（男性で102cmを超え、女性で88cmを超える腹囲）；（b）血清トリグリセリド（150mg/dl以上）；（c）HDLコレステロール（男性で40mg/dl以下、女性で50mg/dl以下）；（d）血圧（130/85以上）；及び（e）空腹時血糖（110mg/dl以上）。世界保健機関（WHO）によれば、高インスリンレベル（空腹時血糖の上昇又は食後グルコース単独上昇）を有する個体であって、下記基準の少なくとも2つを有する者は代謝症候群の基準を満たす：（a）腹部肥満（0.9を超えるウエストヒップ比、少なくとも30kg/m2のボディマス指数、又はウエスト測定が約94.0cm（37インチ）を超える）；（b）トリグリセリドレベルが少なくとも150mg/dl又はHDLコレステロールが35mg/dl未満を示すコレステロールパネル；（c）血圧が140/90以上又は高血圧の治療中（例えば以下を参照されたい：Mathur, Ruchi, “Metabolic Syndrome,” ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009）。
本明細書の目的のためには、ある個体が、2001年の国内コレステロール教育プログラム成人治療パネル又はWHOによって示された基準セットの一方又は両方の基準を満たした場合、当該個体は代謝症候群に罹患していると考えられる。
いずれの特定の理論にも拘束されないが、本明細書に記載される融合ポリペプチドは代謝症候群の治療に有用である。したがって、本発明は、対象動物で代謝症候群を予防若しくは治療する方法、又はその1つ、2つ、3つ又は4つ以上のリスク因子を削減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の融合ポリペプチドを、代謝症候群又はそのリスク因子の予防若しくは治療に有効な量で当該対象動物に投与する工程を含む。
本明細書に報告されるある特徴は、糖尿病又は肥満を有する個体の治療方法で使用される本明細書に報告される融合ポリペプチドであり、前記使用は、本明細書に報告される融合ポリペプチドの有効量を個体に投与することを含む。ある実施態様では、前記方法はさらに、少なくとも1つの追加の治療薬剤の有効量を個体に投与する工程を含む。
ある特徴は、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、個体のインスリン合成及び/又は分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、食物摂取の抑制、及び/又は高血糖症の軽減における使用のために提供され、前記は、本明細書に報告される融合ポリペプチドの有効用量を個体に投与して、個体でインスリン合成及び/又は分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害し、食物摂取を抑制し、及び/又は高血糖症を軽減する工程を含む。ある実施態様では、個体はヒトである。
ある特徴では、体重低下を誘発するか又は体重増加を予防する方法が提供され、前記方法は、その必要がある患者に本明細書に報告される融合ポリペプチドの有効量を投与する工程を必要とし、前記融合ポリペプチドはGIP受容体及びGLP-1受容体の両方で活性を示し、さらに場合によってグルカゴン受容体でもまた活性を示す。そのような化合物には本明細書に記載のGIP/GLP-1コアゴニスト及びグルカゴン/GIP/GLP-1トリアゴニストが含まれる。
本明細書に報告されるある特徴は、本明細書に報告される融合ポリペプチドの医薬の製造又は調製における使用である。ある実施態様では、前記医薬は、糖尿病又は肥満の治療用である。さらに別の実施態様では、該医薬は糖尿病又は肥満を治療する方法で使用され、前記方法は、糖尿病又は肥満を有する個体に前記医薬の有効量を投与する工程を含む。ある実施態様では、前記方法はさらに、少なくとも1つの追加の治療薬剤の有効量を個体に投与する工程を含む。さらに別の実施態様では、該医薬は、インスリン合成及び/又は分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、食物摂取の抑制、及び/又は高血糖症の軽減用である。
さらに別の実施態様では、該医薬は、インスリン合成及び/又は分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害し、食物摂取を抑制し、及び/又は高血糖症を軽減する方法で使用され、前記は、個体に該医薬の有効量を投与して、インスリン合成及び/又は分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害し、食物摂取を抑制し、及び/又は高血糖症を軽減する工程を含む。上記実施態様のいずれかに記載の“個体”はヒトでありうる。
非アルコール性脂肪肝症（NAFLD）は広域な肝疾患を指し、その範囲は単純な脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬変（不可逆性の進行した肝の瘢痕化）に及ぶ。NAFLDの病期は全て共通して肝臓の細胞（肝細胞）に脂肪の蓄積を有する（脂肪浸潤）。単純な脂肪肝は、炎症又は瘢痕化を伴わないある種のタイプの脂肪（トリグリセリド）の肝臓細胞における異常な蓄積である。NASHでは、脂肪の蓄積は、肝臓の様々な程度の炎症（肝炎）及び瘢痕化（線維症）を伴う。炎症細胞は肝細胞を破壊することができる（肝細胞壊死）。“脂肪性肝炎（steatohepatitis）”及び“脂肪壊死（steatonecrosis）”という用語で、“steato”は脂肪浸潤を指し、“hepatitis”は肝の炎症を指し、“necrosis”は破壊された肝細胞を指す。NASHは、最終的には肝の瘢痕化（線維症）、続いて不可逆的な進行した瘢痕化（肝硬変）に至る。NASHによって引き起こされる肝硬変は、NAFLDスペクトルの最後のかつ最も重篤な病期である（Mendler, Michel, “Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH),” ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005）。
アルコール性肝疾患（又はアルコール誘発肝疾患）は、過剰なアルコール消費と関連する又は前記によって引き起こされる3つの病理学的に別個の肝疾患（脂肪肝（脂肪症）、慢性又は急性肝炎及び肝硬変）を包含する。アルコール性肝炎は、軽度の肝炎（並外れた実験室検査によってのみ疾患が示唆される）から重篤な肝機能不全まで範囲が広く、後者は、合併症（例えば黄疸（ビリルビン保持によって引き起こされる黄色の皮膚）、肝性脳症（肝不全によって引き起こされる神経学的機能不全）、腹水（腹腔の液体蓄積）、食道静脈瘤（食道の静脈瘤）の出血、異常な血液凝固及び昏睡）を伴う。組織学的には、アルコール性肝炎は、肝細胞の気球変性を有する特徴的な外観、好中球及び時にマロリー小体（細胞性中間径フィラメントタンパク質の異常な凝集）を伴う炎症を示す。肝硬変は、解剖学的には線維症を併発した肝の広範囲に拡散した結節を特徴とする（例えば以下を参照されたい：Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, Columbia University Medical Center website）。
いずれの特定の理論にも拘束されないが、本明細書に報告される融合ポリペプチドは、アルコール性肝疾患、NAFLD、又は前記の任意の病期（例えば脂肪症、脂肪性肝炎、肝炎、肝臓の炎症、NASH、肝硬変、又は前記の合併症を含む）の治療に有用である。したがって、本発明は、アルコール性肝疾患、NAFLD、又は前記の任意の病期を対象動物で予防又は治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の融合ポリペプチドをアルコール性肝疾患、NAFLD、又は前記の病期の予防又は治療に有効な量で対象動物に投与する工程を含む。そのような治療方法は以下の1つ、2つ、3つ又は4つ以上の軽減を含む：肝の脂肪含有量、肝硬変の発生又は進行、肝細胞癌の発生、炎症の徴候（例えば異常な肝の酵素レベル（例えばアスパルテートアミノトランスフェラーゼAST及び/又はアラニンアミノトランスフェラーゼALT、又はLDH））、血清フェリチンの上昇、血清ビリルビンの上昇、及び/又は線維症の徴候（例えばTGF-ベータレベルの上昇）。好ましい実施態様では、融合ポリペプチドを用いて患者（単純な脂肪肝（脂肪症）より症状が進行し、炎症又は肝炎の徴候を示す）が治療される。そのような方法は、例えばAST及び/又はALTレベルの低下をもたらすことができる。
本明細書のある特徴では、本明細書に報告される融合ポリペプチドのいずれかを含む医薬処方物が、例えば上記の治療方法で使用するために提供される。ある実施態様では、医薬処方物は、本明細書に提供される融合ポリペプチドのいずれか及び医薬的に許容できる担体を含む。ある実施態様では、医薬処方物は、本明細書に提供される融合ポリペプチドのいずれか及び少なくとも1つの追加の治療薬剤を含む。
本明細書に報告される融合ポリペプチドは、単独又は他の薬剤と併用して治療で用いることができる。例えば、本明細書に報告される融合ポリペプチドは少なくとも1つの追加の治療薬剤と一緒に投与できる。
上記に特記したそのような併用療法は、合体投与（2つ以上の治療薬剤は同じ処方物又は分離処方物に含まれる）及び分離投与（その場合には本発明の抗体の投与は追加の治療薬剤又はアジュバントの前、同時及び/又は後で生じ得る）を包含する。
本明細書に報告される融合ポリペプチドは、医療実施ガイドラインに合致する態様で処方され用量決定され、さらに投与されよう。この関係で考慮しなければならない要件には、治療される個々の疾患、治療される個々の哺乳動物、それぞれの患者の臨床症状、疾患の原因、薬剤のデリバリー部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実施者に公知の他の要件が含まれる。融合ポリペプチドは、問題の疾患で現在予防又は治療に用いられる1つ以上の薬剤と必ずというわけではないが、場合によって一緒に処方することができる。そのような他の薬剤の有効量は、処方物に存在する融合ポリペプチドの量、疾患又は治療のタイプ、及び上記で考察した他の要件に左右される。これらは、概して、本明細書に記載の同じ投薬量及び投与ルートで、又は本明細に記載の投薬量の約1%から99%で、又は経験的に/臨床的に適切と決定される任意の投薬量及び任意のルートで用いられる。
疾患の予防又は治療のために、本明細書に報告される融合ポリペプチドの適切な投薬量（単独で又は1つ以上の他の追加の治療薬剤と併用して用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、融合ポリペプチドのタイプ、疾患の重篤度及び経過、融合ポリペプチドの投与が予防目的又は治療目的のどちらであるか、以前の施療、患者の臨床歴及び融合ポリペプチドへの応答、並びに主治医の判断に左右されるであろう。融合ポリペプチドは、一度に又は一連の治療を通して患者に適切に投与される。融合ポリペプチドのある典型的な投薬量は、約0.05mg/kgから約10mg/kgの範囲であろう。したがって、0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kgの用量（又は前記の任意の組合せ）を1回以上患者に投与できる。そのような用量は、間歇的に、例えば毎週又は3週毎に投与できる（例えば、患者は融合ポリペプチドの用量を約2から約20回、又は例えば6回受容する）。最初により高い加重用量、続いてより低用量を1回以上投与できる。しかしながら、他の投薬レジメンも有用でありうる。この治療方法の経過は通常の技術及びアッセイで容易に追跡監視される。
VI．製品
本発明の別の特徴では、上記に記載の治療及び/又は予防に有用な物質を含む製品が提供される。該製品は、容器及び容器上の又は容器に結合したラベル及びパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、注射器、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は多様な物質、例えばガラス又はプラスチックから形成できる。容器は組成物を保持する。前記組成物は、そのものだけで存在するか又は当該症状の治療及び/又は予防に有効な別の組成物と一緒にされ、さらに無菌的なアクセスポートを有することができる（例えば容器は静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって刺し通すことができるストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤が本明細書に報告される融合ポリペプチドである。ラベル及びパッケージ挿入物は、選択された症状の治療に使用されることを表示する。さらにまた、当該製品は、（a）その中に収納された組成物を有する第一の容器（前記組成物は本明細書に報告される融合ポリペプチドを含む）、及び（b）その中に収納される組成物を有する第二の容器（前記組成物はさらに別の治療薬剤を含む）を含む。本発明のこの実施態様の製品はさらにパッケージ挿入物を含むことができ、前記パッケージ挿入物は、具体的な症状を治療するために該組成物を用いることができることを表示する。また別に或いは前記に加えて、該製品はさらに第二の（又は第三の）容器を含むことができ、前記容器は、医薬的に許容できる緩衝剤、例えば注射用静菌水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む。前記はさらに商業的及び使用者の観点から所望される他の物質（他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針及び注射器を含む）を含むことができる。
本明細書に引用された全ての特許及び学術文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に明確に取り込まれる。
具体的な実施態様：
１．
−1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、
を含む融合ポリペプチドであって、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは脂質に共有結合により連結したアミノ酸を含み、さらに
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、該ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結される、前記融合ポリペプチド。
２．該融合ポリペプチドが内因性ポリペプチドとin vivoで結合することを特徴とする、項目１に記載の融合ポリペプチド。
３．脂質との連結がアミノ酸の側鎖内の官能基を介することを特徴とする、項目1又は2のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
４．脂質と共有結合により連結したインクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸残基が天然に存在しないアミノ酸残基であることを特徴とする、項目1から3のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
５．該脂質が、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質及びポリケチドを含む群から選択されることを特徴とする、項目1から4のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
６．脂質との連結が、ミリストイル化（14:0）、パルミトイル化（16:0）、プレニル化、オクタノイル化、アーケオリ化、コレステリル化を含む群から選択されることを特徴とする、項目1から5のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
７．脂質との連結がパルミトイル化であることを特徴とする、項目6に記載の融合ポリペプチド。
８．以下の（i）及び（ii）を特徴とする、項目1から7のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド：
i）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのC-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域に連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端との間に存在し；さらに
ii）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのN-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域に連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のC-末端との間に存在する。
９．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、天然に存在するインクレチン受容体リガンドポリペプチド又は合成のインクレチン受容体リガンドポリペプチドであることを特徴とする、項目1から8のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
10．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、配列番号:1−39、76、77及び120−125から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目1から9のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
11．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列とヒト免疫グロブリンFc-領域のアミノ酸配列との間にアミノ酸配列LPETG（配列番号:74）を含むことを特徴とする、項目1から10のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
12．LPETG（配列番号:74）のC-末端又はN-末端に、ポリペプチドGly-Gly又は Gly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号:85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:90）の1つを含むことを特徴とする、項目8から11のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
13．(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含むことを特徴とする、項目8から12のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
14．配列番号:57−67のいずれか1つを含む、項目8から12のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
15．LPXTG（配列番号:75）のC-又はN-末端にGly又はGly-Glyを含む、項目8から14のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
16．該ヒト免疫グロブリンFc-領域が、329位のアミノ酸残基の変異並びに228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及び331位のアミノ酸残基を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の異なる残基への少なくとも1つのさらに別の変異を有するヒト免疫グロブリンFc-領域であることを特徴とし、ここでFc-領域の残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号付けされる、項目1から15のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
17．該ヒト免疫グロブリンFc-領域が、野生型ヒト免疫グロブリンIgG Fc-領域を含むヒト免疫グロブリンFc-領域融合ポリペプチドと比較して、ヒトFcγRIIIA及び/又はFcγRIIA及び/又はFcγRIに対する親和性の低下を有することを特徴とする、項目1から16のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
18．該ヒト免疫グロブリンFc-領域が、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G及びP331Sを含む群から選択される少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする、項目1から17のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
19．該ヒト免疫グロブリンFc-領域が、当該Fc-領域がヒトIgG1アイソタイプならば変異L234A、L235A及びP329Gを含み、当該Fc-領域がヒトIgG4アイソタイプならば変異S228P、L235E及びP329Gを含むことを特徴とする、項目1から18のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
20．該ヒト免疫グロブリンFc-領域によって誘発される血小板凝集が、野生型ヒト免疫グロブリンFc-領域によって誘発される血小板凝集と比較して軽減されることを特徴とする、項目1から19のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
21．1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1から20のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
22．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々が、ヒト免疫グロブリンFc-領域の1つのポリペプチド鎖のN-末端に連結していることを特徴とする、項目21に記載の融合ポリペプチド。
23．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々が、ヒト免疫グロブリンFc-領域の1つのポリペプチド鎖のC-末端に連結していることを特徴とする、項目21に記載の融合ポリペプチド。
24．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、GIP、GLP-1、エキセンジン-3、エキセンジン-4、二元性GIP-GLP-1アゴニスト、三元性GIP-GLP-1-グルカゴン受容体アゴニスト、キメラGIP/GLPアゴニスト、及び前記の前駆体、誘導体又は機能的フラグメントから互いに独立に選択されることを特徴とする、項目1から23のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
25．該ヒト免疫グロブリンFc-領域が、配列番号:42−56から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目1から24のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
26．該融合ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンFc-領域とインクレチン受容体リガンドポリペプチドとの間にリンカーを含み、ここで、該リンカーは配列番号:57−69及び82−94から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、項目1から25のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
27．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、GLP-1(7-37)（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG、配列番号:01）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
28．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、GLP-1(7-36)（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR、配列番号:02）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
29．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、エキセンジン-3（HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS、配列番号:03）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
30．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エキセンジン-4（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号:04）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
31．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが配列番号:01−04のいずれか1つから誘導され、ここで配列番号:01−04と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変が実施されてあり、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
32．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、エキセンジン-4(1-31)desGlu(17)Tyr(32)（HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY、配列番号:05）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
33．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、エキセンジン-4(1-30)Tyr(31)（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY、配列番号:06）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
34．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、エキセンジン-4(9-39)（DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号:07）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
35．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:08）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
36．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:09）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
37．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:10）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
38．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:11）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
39．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:12）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
40．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:13）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
41．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:14）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
42．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:15）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
43．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:16）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
44．インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:17）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
45．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:18）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
46．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:19）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
47．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号:20）（XはK又はR）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
48．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS（配列番号:21）（ハイブリッドGLP-1/エキセンジンポリペプチド）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
49．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号:22）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
50．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号:23）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
51．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号:24）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
52．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号:25）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
53．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY（配列番号:26）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
54．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY（配列番号:27）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
55．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS（配列番号:28）から誘導され、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
56．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが自然のままのグルカゴン（配列番号:76）から誘導され、配列番号：76と比較して１から１０（例えば１、２、３、４，５，６，７，８，９．１０）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
57．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドがGLP-1（配列番号:1又は2）から誘導され、配列番号:1又は2と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
58．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドがGIP（配列番号:77）から誘導され、配列番号:77と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
59．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドがエキセンジン-3又は-4（配列番号:3又は4）から誘導され、配列番号:3又は4と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
60．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドがグルカゴン（配列番号:76）から誘導され、該アナローグが、（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、（b）該アナローグのC-末端部分（アミノ酸12−29）のアルファへリックス構造を安定化させる改変、及び（c）場合によって配列番号:76と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のさらに別のアミノ酸改変を有する配列番号:76を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
61．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:29、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
62．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:30、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
63．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:31、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
64．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG（配列番号:32、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
65．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGG G（配列番号:33、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
66．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:34、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
67．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:35、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
68．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号:36、Xはaib）であるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
69．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列がYXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:37、Xはaib）で残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
70．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列がYXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号:38、Ｘはaib）で残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
71．該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、アミノ酸配列がYXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG（配列番号:39、Ｘはaib）で残基16及び20の側鎖の間にラクタム環を有するものであるか、又は前記配列を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、項目1から26のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド。
72．Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS（配列番号:120）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
73．desAmino-Tyr-AEGTFISDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:121）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
74．Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:122）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
75．Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:123）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
76．AC-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:124）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
77．Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:125）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
78．Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS（配列番号:109）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
79．desAminoTyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:110）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
80．Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:111）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
81．Ac-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:112）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
82．Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:113）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
83．Ac-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS（配列番号:114）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
84．Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS（配列番号:115）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
85．Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS（配列番号:116）のアミノ酸配列を含む脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
86．
−1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互いに独立に共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む群から選択され、さらに
該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結している、前記融合ポリペプチド。
87．
−1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互いに独立に共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む群から選択され、さらに
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結している、前記融合ポリペプチド。
88．
−1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
−1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、i）配列番号:49の2つのアミノ案配列又はii）配列番号:52の1つのアミノ酸配列及び配列番号:53の1つのアミノ酸配列を含み、
該1つ又は2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端にリンカーペプチドを介して共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、(GGGS)4（配列番号:58）、(GGGGS)3（配列番号:62）、及び(GGGGGS)o（o＝2−3（配列番号:65−66））含む群から選択され、さらに
該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結している、前記融合ポリペプチド。
89．項目 1から88のいずれか1つに記載の融合ポリペプチドを含む医薬組成物。
90．項目 1から88のいずれか1つに記載の融合ポリペプチドの医薬としての使用。
91．項目 1から88のいずれか1つに記載の融合ポリペプチドの疾患治療用医薬の製造のための使用であって、ここで、野生型ヒトIgG Fc-領域の変種Fc-領域を含む融合ポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc-領域を含む融合ポリペプチドによって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することが有益である、前記使用。
92．野生型ヒトIgG Fc-領域の変種Fc-領域を含む、項目 1から88のいずれか1つに記載の融合ポリペプチド連結物の使用であって、ここで、該野生型ヒトIgG Fc-領域のPro329がグリシンで置換され（残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号付けされる）、該融合ポリペプチドが、ヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対する親和性軽減を示して、野生型ヒトIgG Fc-領域を含む融合ポリペプチドによって誘発されるADCCの少なくとも20%のADCCダウン-モジュレーション、及び/又はADCPダウン-モジュレーションをもたらす、前記使用。
93．該疾患が2型糖尿病であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
94．該疾患が肥満であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
95．該疾患がインスリン耐性であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
96．該疾患が1型糖尿病であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
97．該疾患が骨粗しょう症であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
98．該疾患が脂肪性肝炎であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
99．該疾患が非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
100．該疾患が代謝症候群であることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
101．項目1から88のいずれか1つに記載の融合ポリペプチドがさらに別の2型糖尿病薬と併用して投与されることを特徴とする、項目90から92のいずれか1つに記載の使用。
102．さらに別の2型糖尿病薬がインスリンであることを特徴とする、項目101に記載の使用。
103．脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びLPXTG（Xは任意のアミノ酸）を含むポリペプチド。
104．Xが酸性アミノ酸である、項目103に記載のポリペプチド。
105．該酸性アミノ酸がGluである、項目103から104のいずれか1つに記載のポリペプチド。
106．LPETG（配列番号:74）のC-末端にGly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号:85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号:90）を含むことを特徴とする、項目103から105のいずれか1つに記載のポリペプチド。
107．(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含むことを特徴とする、項目103から106のいずれか1つに記載のポリペプチド。
108．配列番号:57−67のいずれか1つを含むことを特徴とする、項目103から107のいずれか1つに記載のポリペプチド。
109．LPXTG（配列番号:75）のN-末端にGly又はGly-Glyを含むことを特徴とする、項目103から107のいずれか1つに記載のポリペプチド。
110．疾患を治療するための医薬の製造における、項目102から109のいずれか1つに記載のポリペプチドの使用。
111．該医薬の製造がソルターゼAの使用を含むことを特徴とする、項目110に記載の使用。
実施例
以下の実施例は本発明の方法及び組成物の例である。上記で提供された一般的な記述を条件として、多様な他の実施態様を実行できることは理解されよう。
明確な理解を目的として、解説及び例示によって上述の発明をある程度詳細に述べてきたが、当該記述及び例示は、本発明の範囲を制限するものと解してはならない。
Fc-領域及びインクレチン受容体リガンドポリペプチドのソルターゼA連結
G3-Fc：
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:68）
G4S3-Fc：
GGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:69）
ペプチド-ロング24A：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-アミド（配列番号:70）
ペプチド-ショート24A：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGGLPETGGSGS-アミド（配列番号:71）
ペプチド-ロング24N：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-アミド（配列番号:118）
ペプチド-ショート24N：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGGLPETGGSGS-アミド（配列番号:119）
ソルターゼ媒介ペプチド転移反応のために、N-末端切端黄色ブドウ球菌ソルターゼAを用いた（Δ1-59）。反応は以下を含む緩衝液（ソルターゼ緩衝液）で実施された：50mMトリス-塩酸、150mM NaCl、5mM CaCl（pH 7.5）。この反応では、そのC-末端にソルターゼモチーフを保持する化学合成ペプチド（LPETGGSGS、配列番号:72）及びそのN-末端にオリゴ-グリシンモチーフを保持するFc-領域が連結され、接続配列ペプチド-LPETGGG-重鎖Fc-領域を生じた。反応を実施するために、全ての試薬はソルターゼ緩衝液中の溶液とした。最初の工程では、GGG-Fc及びペプチドを混合し、その後のソルターゼAの添加によって反応を開始させた。ピペット操作又はボルテックスミキサーによって成分を混合し、37℃でペプチドに応じて1時間及び24時間インキュベートした。続いて、ペプチド移転反応の後ですぐに連結生成物を精製するか、又は反応混合物の凍結によって反応を停止させ精製まで-20℃で保存した。ペプチド：Fc-領域：ソルターゼのモル比＝8：10：8。
結果
ソルターゼ媒介ペプチド転移により、長い合成ペプチド及び短い合成ペプチドの両ペプチドをIgG-Fc-領域フラグメント（N-末端にそれぞれ短いトリグリシンモチーフ又はより長いGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号：62）配列を保持する）に結合させた。組合せは表1に示される。
表1：Fc-領域とペプチドの連結
Fc-領域-インクレチン受容体リガンドポリペプチド連結物は、ロングペプチド-G3-Fc、ショートペプチド-G3-Fc、ロングペプチド-G4S3-Fc、及びショートペプチドG4S3-Fcについてそれぞ配列番号:95−98のアミノ酸配列を有していた。
ソルターゼ媒介ペプチド転移の分析
ペプチド転移反応のアリコットをSDS-PAGEによって分析した。一例を図1に示す。図1は、ロング又はショートペプチドとG3-Fcとの連結の結果を示している。ゲルから連結効率が濃度測定により概算された。表2に示すように、最終精製生成物ではFc-領域の約5%はペプチドと連結されなかったが、逆相分析HPLCによって概算されるように、およそ90%のFc-領域が2つのペプチド部分と連結された。
表2：ペプチドとG3-Fcのソルターゼ媒介ペプチド転移の精製後の最終収量
種々の連結物の生物学的活性は表3に示される。
表3：ソルターゼ媒介ペプチド転移によって生成されたペプチド-Fc-領域融合分子のin vitro有効性
環状AMPアッセイ
以下の材料を用いた：cAMP HunterTM CHO-K1 GLP-1又はGIP細胞株（DiscoveRx Corporation）、ハムF-12（Ham's F-12、Gibco Cat.# 21765）、10%熱不活化FBS（Gibco Cat # 16000）、ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン（Gibco Cat# 10378）及び800 μg/mL G418（ジェネチシン、Gibco Cat. # 10131）。
GLP-1又はGIP受容体を発現するCHO-K1細胞を10mLのアッセイ緩衝液に100,000細胞/mLの密度で懸濁した。アッセイ緩衝液は、0.5mM IBMX（Sigma-Aldrich Cat# 17018）及び0.1% BSA（Sigma-Aldrich Cat. # A-2153）を含むクレブス-リンゲル重炭酸緩衝液（Krebs-Ringer bicarbonate buffer, Sigma-Aldrich Cat.# K4002）である。細胞懸濁物（25μL）を続いてハーフエリアプレート（Costar Cat.# 3694）に移し、薬剤溶液（25μL）をウェルに適切な濃度で添加した。プレートシェーカー上で細胞を30分間室温でインキュベートした。cAMP含有量は、製造業者（Cisbio Bioassays, France）の指示にしたがい当該シスビオ（Cisbio）社の“cAMPダイナミックキット（cAMP dynamic kit）”を用いて決定した。全ての実験をデュープリケートで行い、薬剤は少なくとも2回試験された（N≧2）。
急性DIOマウス試験
オスのC57Bl/6マウス（約7カ月齢；Jackson laboratories（Bar Harbor, ME, USA））を12時間照明：12時間消灯サイクル下の温度及び湿度が管理された環境に収容した。マウスは、8週齢から水及び高脂肪固形飼料（HFD；食物kcalの58%が脂肪とシュクロース、Research Diets D12331）を自由に摂取し、この自由は試験を通して維持された。治療期間の開始前にマウスを体重及び食物摂取によって分類し1ケージ4匹ずつ収容した。使用前少なくとも6日間マウスを環境に馴らした。消灯サイクルの開始前にマウスにビヒクル（s.c.）、コントロール（ヒトIgG1-Fc；s.c.）又は化合物（ペプチド-ロング-G3Fc又はペプチド-ショート-G3Fcのどちらか20nmol/kg；s.c.）を1回投与した。その後で、体重及び食物摂取を5日間毎日追跡監視した（N＝8マウス/グループ）。
データ分析：
表示した全てのデータは平均±標準誤差（s.e.m.）である。データの統計的評価は、一元配置分散分析とその後のダンネット検定を用いて実施し、ビヒクルグループと薬剤治療グループとの間に統計的に有意な相違が存在するか否かを決定した。P＜0.05で相違は統計的に有意とみなされた。データ分析はグラフパッドソフト（GraphPad software；GraphPad Prism）により実施した。
結果：
オスのDIOマウスの化合物（ペプチド-ロング-G3Fc又はペプチド-ショート-G3Fc（20nmol/kg；s.c.））の単回投与は、ビヒクル処置動物に対し体重増加の顕著な低下を誘発し、さらに累積食物摂取を低下させた（図2）。
急性db/dbマウス試験
10週齢のオスのdb/dbマウス（C57BLKS; BKS. Cg-m+/+ Lepr（000642）；Jackson Laboratories, USA）を12時間照明：12時間消灯サイクル下の温度及び湿度が管理された環境に収容し、通常の固形飼料及び水を自由に摂取させた（固形飼料は脂肪として5% kcal、Harlan 7912）。マウス（〜42g）を任意の血糖レベルを基準に多様な処置グループに任意抽出した。消灯サイクルの開始前にマウスにビヒクル（s.c.）、コントロール（s.c.）又は化合物（20nmol/kg；s.c.）を投与した。次の日、腹腔内グルコースチャレンジ試験の前に6時間マウスを絶食させた（N＝8マウス/グループ）。6時間絶食後に尾部クリップから血液サンプルを収集し、携帯用グルコースメーター（FreeStyle Freedom Lite glucose meter；Abbott）を用いて基準値（t＝0分）を決定した。続いて、マウスの腹腔内に大量グルコースを注射し（1g/kg；25 %デキストロース溶液）、グルコース測定のために追加の血液サンプルを定期的な間隔で収集した（t＝15、30、60及び120分）。腹腔グルコース耐性に対する化合物の影響を分析するために、台形法を用いて血糖変動曲線下の面積（AUC0-120min）を決定した。
データ分析：
表示した全てのデータは平均±標準誤差（s.e.m.）である。データの統計的評価は、一元配置分散分析とその後のダンネット検定を用いて実施し、ビヒクルグループと薬剤治療グループとの間に統計的に有意な相違が存在するか否かを決定した。P＜0.05で相違は統計的に有意とみなされた。データ分析はグラフパッドソフト（GraphPad Prism）により実施した。
結果：
オスdb/dbマウスへの化合物（ペプチド-ロング-G3Fc又はペプチド-ショート-G3Fc（20nmol/kg；s.c.））の急激な投与は、腹腔内グルコースチャレンジに応答するグルコース変動を顕著に減少させた（ipGTT；AUC ipGTT）（図3）。その効果は用量依存性である（図4）。
ソルターゼタグ付加組換え抗体Fc-フラグメントの組成、発現及び精製
組換えDNA技術
Sambrookが記載した標準的な方法を用いてDNAを操作した（Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）。分子生物学的試薬は製造業者の指示にしたがって用いた。
遺伝子及びオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントはジーンアート社（Geneart GmbH, Regensburg, Germany）で化学合成によって調製された。この合成遺伝子フラグメントを増殖/増幅のために大腸菌プラスミドでクローニングした。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列はDNA配列決定で立証された。また別には、化学合成オリゴヌクレオチドのアニーリング又はPCRを介して短い合成DNAフラグメントをまとめた。対応するオリゴヌクレオチドはメタビオン社（metabion GmbH, Planegg-Martinsried, Germany）によって調製された。
試薬
全ての市販の化学物質、抗体及びキットは、特段の記載がなければ製造業者のプロトコルの規定にしたがって用いられた。
発現プラスミド
ヒトIgG1 Fc-領域（ヒンジ、CH2、CH3）を含む遺伝子をコードするFc-領域部分及び対応する三重Gモチーフ又はSrtA認識モチーフ（介在リンカーペプチドを含むもの又は含まないもの）は、対応するエレメントをコードするDNAフラグメントを融合させてまとめた。
ヒトIgG1 Fc-領域のアミノ酸配列：
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK（配列番号:42）
変異L234A、L235A及びP329Gを有するヒトIgG1 Fc-領域のアミノ酸配列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK（配列番号:49）
変異L234A、L235A、P329G及びホール変異を有するヒトIgG1 Fc-領域のアミノ酸配列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK（配列番号:52）
変異L234A、L235A、P329G及びノブ変異を有するヒトIgG1 Fc-領域のアミノ酸配列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALGA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK（配列番号:53）
三重Gモチーフ：GGG（配列番号:99）
ソルターゼ認識モチーフ：LPETGGSGS（配列番号:72）
リンカーペプチド：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号:62）
N-末端の三重Gモチーフ並びに変異L234A、L235A及びP329Gを有するヒトIgG1 Fc-領域のアミノ酸配列：
GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LGAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK（配列番号:117）
発現ベクターはまた、ベクターpUC18の複製起点（このプラスミドの大腸菌での複製を可能にする）及びベータ-ラクタマーゼ遺伝子（大腸菌でのアンピシリン耐性を付与する）を含んでいた。
転写ユニットは以下の機能的エレメントを5’から3’方向に含む：
−イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルスの最初期エンハンサー及びプロモーター（P-CMV）、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’-非翻訳領域（5’UTR）、
−ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−Fc-領域部分をコードする核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（BGH pA）。
抗体Fc-フラグメント及びソルターゼタグを有する誘導体の発現
抗体は、一過性にトランスフェクトされたF17培養液（Invitrogen Corp.）培養HEK293細胞（ヒト胎児腎細胞株293から派生）で産生された。実施例6に記載の対応するベクターのトランスフェクションのために、“293-フリー”トランスフェクション試薬（Novagen）が用いられた。抗体及び抗体-血液脳関門-シャトル-融合物を個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは製造業者の指示で指定されたように実施した。組換え抗体を含む細胞培養上清をトランスフェクションの7日後に採集した。上清は精製まで低温（例えば-80℃）で保存した。
例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は以下で提供される：Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。
ソルターゼタグを有する抗体の精製
組換えヒト免疫グロブリンFc-領域（又は誘導体）を以下の二工程で上清から精製した：タンパク質A-セファロースTMアフィニティクロマトグラフィー（GE Healthcare, Sweden）及びスーパーデックス200サイズ排除クロマトグラフィー。略記すれば、ヒト免疫グロブリンFc-領域（又は誘導体）を含む清澄化培養上清を、PBS緩衝液で平衡化したMabSelectSuReタンパク質A（5−50mL）カラムに適用した（PBS緩衝液：10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び2.7mM KCl（pH 7.4））。未結合タンパク質を平衡緩衝液で洗い流した。Fc-領域（又は誘導体）は25−50mMクエン酸緩衝液（pH3.2）で溶出させた。タンパク質を含む分画を0.1mLの2Mトリス緩衝液（pH9.0）で中和した。続いて、溶出タンパク質分画をプールし、アミコン（Amicon）超遠心分離フィルター装置（MWCO：10K, Millipore）で濃縮し、以下（20mMヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））で平衡化させたスーパーデックス200ハイロード（Superdex200 HiLoad）26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にロードした。精製Fc-領域（又は誘導体）のタンパク質濃度は、280nmで光学密度を決定することによって得られた（バックグラウンド改変として320nmを用いる）。文献（Pace et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423）にしたがってアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いた。モノマーFc-領域の分画をプールし、瞬間冷凍して-80℃で保存した。このサンプルの部分がその後のタンパク質分析及び特徴の決定に提供された。
このヒト免疫グロブリンFc-領域（又は誘導体）の均質性は、還元剤の存在下及び非存在下でのSDS-PAGE並びにクーマシーブリリアントブルー染色によって確認された。NuPAGE(商標)プレカーストゲル系（Invitrogen, USA）を製造業者の指示にしたがって用いた（4−20%トリス-グリシンゲル）。
還元条件下で、ヒト免疫グロブリンFc-領域関連ポリペプチド鎖は、SDS-PAGEの後で計算分子量と類似する見かけの分子サイズで識別された。全ての構築物の発現レベルはタンパク質Aによって分析された。平均タンパク質収量は、そのような最適化されていない一過性発現実験では細胞培養1リットル当たり32mgから174mgの精製タンパク質であった。
脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの合成
略語：
Ac：アセチル
Aib：アミノイソ酪酸
Aloc：アリルオキシカルボニル
C16：パルミチン酸
DBU：1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DCM：ジクロルメタン
DDE：N-(1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル)
desAminoTyr：3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸
d-y：D-チロシン
d-h：D-ヒスチジン
DIPEA：N,N-ジイソプロピルアミン
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
Fmoc：9-フルオレニルメトキシカルボニル
gE：γ-グルタミン酸d
HBTU：O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチル -ウロニウム-ヘキサフルオロホスフェート
HOTB：N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
MeCN：アセトニトリル
NMP：N-メチルピロリドン
ペプチド合成：
ペプチドの合成は、CS Bio CS136XTペプチド合成装置で実施した。合成ペプチドは、合成容器へのアミノ酸溶液（0.05mol/L HOBtを含むNMP中の0.33mol/L）の連続添加によって構築された。具体的には、合成は、COMU/DIPEA活性化（4eqアミノ酸、4eq COMU、8eq DIPEA（eq＝反応当量））単一カップリングを用いて実施された。カップリング工程の終了時に、（標準的にはRTで30分）、ペプチジル-樹脂をピペリジン溶液(DMF中に40%、1x 10分＋2ｘ 5分)で処理して、N-末端Fmoc保護基を除去した。樹脂をジメチルホルムアミド（DMF）で繰り返し洗浄し、この反復サイクルを所望の数のカップリング工程について繰り返した。DMF中の18eqの無水酢酸/DIPEAの過剰量により30分間RTでペプチジル-樹脂を処理することによってN-キャップペプチドを生成した。ソルターゼフラグメントペプチドのN-末端にブロモアシル基を導入するために、DCM中のDIPEA（30%）及び活性化ブロモ酢酸の混合物を樹脂に添加した。活性化は、1.1eqのブロモ酢酸及びDCM中の1.1eqのDCC（1.5gの樹脂のために10mL）を10分間かき混ぜ、その後でろ過することによって達成された。得られた清澄な溶液を樹脂に添加しRTで1時間振盪した。
DDE保護基の存在下でのアシル化及びFmoc切断並びにDDE切断：
脂質化ユニット（例えばパルミチン酸、C16）の結合のために、上記に記載した標準的な条件を用いて1つ又は2つのDde-Lys(Fmoc)-OHを所望の位置に導入した。定量的なカップリングの後で、DBU/DMF 2% 処理（3x 3分、連続流、DMFによる反復洗浄、前記手順を5回反復）によってFmocを除去した。アシル化基のカップリングは上記カップリング条件を用いて達成した。アシル化基の定量的カップリングの後で、DMF 2%中の20%のヒドラジン一水和物（64%）によって（5x 3分、連続流、DMFによる反復洗浄）、N-末端のDde保護基を除去した。残りのカップリング工程を上記のように実施した。
切断：
ジクロロメタン（DCM）を用いて、全合成の終了時にペプチジル-樹脂を乾燥させ、さらに試薬K（TFA/チオアニソール/水/フェノール/TISが82.5/5/5/5/2.5）をRTで2時間用い樹脂からペプチドを切断し、これによって典型的には約250mg（〜50%の収量）の粗脱保護ペプチドが得られた。具体的には、ペプチジル-樹脂（30mgから200mg）を焼結カートリッジに入れ、続いて試薬K（1.2gの樹脂に対して〜20mL）を加え、前記樹脂をRTで2時間撹拌した。液体をろ過した後、樹脂を5mLの試薬K及び3mLのDCMで2回洗浄した。生成物を冷エーテル（-18℃）で沈殿させた。懸濁物を遠心分離し、液体をろ過し、粗ペプチドを水/CANに再溶解し凍結乾燥して約250mg（〜50%の収量）の粗ペプチドを得た。
精製：
粗ペプチドは、調製用逆相カラム（Dr. Maisch Reprosil Gold 120 C18, 5μm, 16x150 mm）による調製用HPLCを用いて精製し、分析系と同じ移動相を用いて溶出させた（流速1.80mL/分で190分かけて5−10%のBのグラジエント）。得られた分画のHPLC分析は純粋な分画を生じ、前記分画を一緒にして凍結乾燥させて白色粉末を得た。
ソルターゼフラグメントペプチドによる連結：
精製ペプチド（C-末端システインを含む）及びソルターゼフラグメントペプチド（N-末端ブロモアシル化）を水/AcCN混合物に溶解した（70/30、1mL/10mgペプチド）。水（1mL/30mgぺプチド）及び1000eq尿素を添加し、溶液のpHを緩衝液（7M尿素、0.05Mトリス）で8.4から8.5に設定した。反応混合物をRTで撹拌し、HPLCでモニターした。最終生成物を調製用HPLCで上記のように単離した。
分析（HPLC）：
分析用HPLCによる分析を以下の条件下で実施した: 4.6ｘ150mmのポロシェル（Poroshell）120 SB-C18、1.0mL/分、220nm UVモニタリング。溶出系:緩衝液A（0.1% トリフルオロ酢酸/10%アクリロニトリル/90%水）、緩衝液B（0.1% TFA/10%水/90%ACN、30分かけて5−100%のBのグラジエント）。
上記のような化学的連結によりソルターゼフラグメントを導入することは強制されない。ペプチドはまた、化合物17について記載されているように直線的に生成して全アミド型を得ることができる。これらのペプチドはそれらのチオエーテル連結アナローグと類似の能力を示す。
下記に列挙するすべての他のペプチドを上記のように合成した。
化合物１
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:100）。
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4671.22；観察 1558.3 (1/3 + H)
化合物２
desAmino-Tyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:101）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4655.3；観察1552.7 (1/3 + H)、1164.8 (1/4 + H)
化合物３
Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:102）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4655.3；観察1552.7 (1/3 + H)、1164.8 (1/4 + H)
化合物４
Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:103）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4683.3；観察1562.1 (1/3 + H)、1171.8 (1/4 + H)
化合物５
Ac-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:104）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dHis(1-Trt)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4685.3；観察1562.8 (1/3 + H)、1172.3 (1/4 + H)
化合物６
Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-NH2（システインアミド）（配列番号:105）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想 4711.3；観察1571.4 (1/3 + H)、1178.8 (1/4 + H)
化合物７
BrAc-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:106）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、及びブロモ酢酸。
MS (M+H+)：予想1095.9；観察1096.9 (M+H)
化合物８
BrAc-LPETGGSGS-COOH（配列番号:107）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、及びブロモ酢酸。
MS (M+H+)：予想 924.7；観察925.7 (M+H)
化合物9から15は上記に記載したようにフラグメント連結により生成された。
化合物９
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:108）
以下のフラグメントが用いられた：化合物1及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5686.23；観察1895.2 (1/3)、1421.6 (1/4)
化合物10
NH2-Y-Aib-EGTFTSDK-(γE-γE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-LPETGGSGS-COOH（配列番号:109）
以下のフラグメントが用いられた：化合物1及び化合物8。
MS (M+H+)：予想5672.17；観察1417.3 (1/4)、1134.2 (1/5)
化合物11
desAminoTyr-AEGTFTSDK-(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:110）
以下のフラグメントが用いられた：化合物2及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5674.13；観察1891.4 (1/3)、1418.5 (1/4)
化合物12
Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:111）
以下のフラグメントが用いられた:化合物3及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5711.8；観察1428.7 (1/4 + 4H)
化合物13
Ac-d-YAVGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:112）
以下のフラグメントが用いられた：化合物4及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5700.2；観察1900.1 (1/3)
化合物14
Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:113）
以下のフラグメントが用いられた：化合物5及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5703.2；観察1901.1 (1/3)、1425.8 (1/4)
化合物15
Ac-d-YAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSC-(S-CH2-CO)-GGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:114）
以下のフラグメントが用いられた：化合物6及び化合物7。
MS (M+H+)：予想5729.2；観察1432.3 (1/4)、1145.8 (1/5)
化合物16及び17は、上記に記載したように直線的態様で合成された。
化合物16
Ac-d-HAQGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLGGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:115）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dHis(1-Trt)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想4519.3；観察4519.3
化合物17
Ac-d-YALGTFTSDK(γE-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPSGGGLPETGGSGS-COOH（配列番号:116）
以下のアミノ酸が用いられた：Fmoc-Gly-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu-O(tBu)、Fmoc-dTyr(tBu)-OH及びパルミチン酸。
MS (M+H+)：予想 5550.7；観察5550.7
ヒト免疫グロブリンFc-領域と脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドのソルターゼ媒介酵素連結による共有結合連結物の生成
一般的方法：
酵素的ソルターゼ媒介連結によるヒト免疫グロブリンFc-領域と脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの連結物の生成は、規定された化学量論を有する連結物を生じ、これらの連結物中の化合物がそれらの活性を保持することを担保できる（過酷な条件及び変性/副反応の危険性がない）。脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドと対応するヒト免疫グロブリンFc-領域との連結物の生成のために、前記ポリペプチドを100%DMF中で最終濃度16mMに溶解させた。Fc-領域を以下の媒体（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5 mM CaCl2（pH7.5））で10mg/mLの濃度にした。ポリペプチド、Fc-領域及びソルターゼを8：1：0.8のモル比（ポリペプチド：Fc-領域：ソルターゼ）で混合し、ソルターゼは最後に加え、ピペットで上下させた。反応混合物中のDMFの最終濃度は10%（v/v）以下であった。反応混合物を37℃及び350rpmで60から180分インキュベートした。
Fc-領域と化合物9（＝化合物42）
C-末端ソルターゼタグを含む化合物9の連結物を生成するために、46mgの化合物9を500μLのDMFに15.6mMの濃度に溶解させた。50mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2（pH7.5））に17.9mg/mL（約0.35mM）の濃度で用いられた。化合物9及び配列番号:117のFc-領域を8:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ14.1mg、及び1415μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのヒト免疫グロブリンFc-領域の最終濃度を提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なペプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（37.5mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計86%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61570）と同定され、14%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたヒト免疫グロブリンFc-領域（平均質量56248）であった。
Fc-領域と化合物10（＝化合物45）
化合物10の連結物を生成するために、10.90mgの化合物10を、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2（pH7.5））に12.1mg/mL（約0.24mM）の濃度で10mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）を含む溶液に溶解した。この混合物は8:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）に一致する。続いて17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ2.8mgを加えた。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（8.8mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計85%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61227）と同定され、14%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたヒト免疫グロブリンFc-領域（平均質量56075）であった。
Fc-領域と化合物11（＝化合物74）
化合物11の連結物を生成するために、9.2mgの化合物11を、100μLのDMFに15.6mMの濃度に溶解させた。10mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2（pH7.5））に20.6mg/mL（約0.40mM）の濃度で用いられた。化合物11及びFc-領域を8:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ合計2.8mg、及び357μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのFc-領域の最終濃度をこの混合物で提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なパプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（2.1mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計55%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61543）と同定され、45%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量56233）であった。
Fc-領域と化合物12（＝化合物80）
化合物12の連結物を生成するために、20.0mgの化合物12を、144μLのDMFに23.5mMの濃度に溶解させた。合計28.7mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、240mMシュクロース（pH7.5））に17.9mg/mL（約0.35mM）の濃度で用いられた。化合物12及びFc-領域を6:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。続いて17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ8.1mg、及び812μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのFc-領域の最終濃度をこの混合物で提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なパプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（24.2mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計84%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61625）と同定され、16%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量56274）であった。
Fc-領域と化合物13（＝化合物77）
化合物13の連結物を生成するために、9.3mgの化合物13を、100μLのDMFに15.6mMの濃度に溶解させた。合計10mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2（pH7.5））に15.4mg/mL（約0.30mM）の濃度で用いられた。化合物13及びFc-領域を8:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。続いて17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ2.8mg、及び193μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのFc-領域の最終濃度をこの混合物で提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なパプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（7.5mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計90%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61597）と同定され、10%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量56261）であった。
Fc-領域と化合物14（＝化合物808）
化合物14の連結物を生成するために、4.1mgの化合物14を、61μLのDMFに11.7mMの濃度に溶解させた。合計6.1mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、240mMトレハロース（pH7.5））に15.4mg/mL（約0.30mM）の濃度で用いられた。化合物14及びFc-領域を6:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。続いて17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ1.7mg、及び117μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのFc-領域の最終濃度をこの混合物で提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なパプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（3.3mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計81%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61657）と同定され、19%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量56288）であった。
Fc-領域と化合物15（＝化合物809）
化合物15の連結物を生成するために、3.3mgの化合物15を、49μLのDMFに11.7mMの濃度に溶解させた。合計4.9mgのFc-領域（N-末端三重GモチーフLALAPG Fc-領域；配列番号:117）が、以下を含む緩衝液（50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、240mMトレハロース（pH7.5））に15.4mg/mL（約0.30mM）の濃度で用いられた。化合物15及びFc-領域を6:1のモル比（ポリペプチド：Fc-領域）で混合した。続いて17.8mg/mL（約0.99mM）の濃度のソルターゼ1.4mg、及び95μLの緩衝液を加えて、10mg/mLのFc-領域の最終濃度をこの混合物で提供した。反応混合物を37℃及び350rpmで3時間インキュベートした。
過剰なパプチド、ソルターゼ及び未結合Fc-領域は、平衡化（20mヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0））スーパーデックス200ハイロード26/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）のサイズ排除クロマトグラフィーで除去した。
得られた連結物（1.5mg）は質量分析法で分析した。検出物質種の合計78%が、2つの脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量61605）と同定され、22%が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドに連結されたFc-領域（平均質量56264）であった。
環状AMP（cAMP）アッセイ：CHO細胞で安定的に発現されるヒトGIP-、GLP-1-及びGCG-受容体のための細胞懸濁アッセイ様式
以下の材料が細胞系cAMPアッセイで用いられた：
−プレート：アッセイには96ウェルのハーフエリアプレート（Costar #3694）及び化合物の希釈には96ウェルの表面非結合性プレート（Corning #3600）、
−ストック溶液用の管：タンパク質低結合管（Protein LoBind tube；Eppendorf #02243108）、
−ピペットチップ：最大回収性チップ（Axygen #TF-100-L-R-S）、
−細胞：cAMP HunterTM CHO-K1 GIP（DiscoveRx #95-0146C2）、cAMP HunterTM CHO-K1 GLP-1R（DiscoveRx #95-0062C2）、cAMP HunterTM CHO-K1 GCGR（DiscoveRx #95-0042C2）Gs細胞株（DiscoveRx Corp.）、
−増殖培地： ハムF-12（Gibco #21765）、10%ウシ胎児血清（FBS；Gibco 16000、熱不活化）、2mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン（PSG；Gibco #10378)、500μg/mL G418（ジェネチシン；Gibco #11811-031)、
−アッセイ緩衝液：クレブス-リンゲル（Sigma-Aldrich # K4002；重炭酸ナトリウム（Sigma # S8761）でpHを調整（pH7.3)、0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（Sigma #I7018）及び0.1%のウシ血清アルブミン（Sigma #A2153）を含む）、
−アッセイキット：cAMPダイナミック2キット（Cisbio #62AM4PEC）、
−化合物：化合物のストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma #D2650）で調製し、-20℃で保存し、アッセイ直前に溶液を5−10分間室温（RT）で融解し、アッセイ緩衝液に前希釈した（1μMから60μM）。連続希釈はアッセイ緩衝液で実施した、
細胞をT150フラスコで80%コンフルエンシーに増殖させ、実験の24時間前に培養液を取替えた。実験の日に、培養液を除去し、フラスコ当たり10mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞単層を洗浄した。PBSを除去した後、細胞を5mLの細胞解離溶液（Gibco #13151）とともに5分間37℃でインキュベートし、細胞を取り除けた。フラスコを穏やかに叩き、細胞懸濁物をプールした。前記細胞懸濁物を150ｘgで3分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットをアッセイ緩衝液に再懸濁し、細胞数を決定した。細胞濃度を2ｘ105細胞/mLに調整した。細胞懸濁物の25μLアリコットを96ウェルプレートの各ウェルにマルチドロップディスペンサーを用いて移した（5000細胞/ウェル）。希釈化合物の25μLアリコットをこの細胞プレートに移し、細胞懸濁物をプレートシェーカー（450rpm）上にてRTで30分間インキュベートした。反応を溶解緩衝液の添加によって停止させ、生成されたcAMPを製造業者の指示にしたがいcAMPダイナミック2キット（Cisbio）を用いて決定した。エンビジョン（EnVision；PerkinElmer)を用いて時間分解蛍光シグナルを決定した。環状AMPの産生を各実験について並行して実施した標準曲線を基準にして計算した。データはエクセルフィットソフトを用いて分析した。
薬物動態学
生存時部分：
成熟オスDIOマウス（体重約60g）を業者（Charles River, Lion, France）から入手し、管理された（温度、湿度及び12時間照明/12時間消灯サイクル）環境下に収容して飼料及び水に自由にアクセスさせた。げっ歯類の実験は、動物保護に関するスイス連邦規制及び国際実験動物評価認証協会（AAALAC）の規則を厳密に遵守する地元の獣医機関の承認を得て実施された。マウスの皮下に化合物を1mL/kgの注射体積として20nmol/kgで投与した。投与後2、4、8、24、48、80及び168時間に、軽度のイソフルラン麻酔下で舌下穿刺によって血液をK2EDTA被覆ポリプロピレン管に収集し、氷上に静置した。30分以内に4℃にて3000gで5分間遠心分離することによって血漿を調製し、直ちに凍結して-20℃で保存した。血漿中の試験品目の濃度を連続酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA、下記の記述を参照）によって評価した。ToxKinソフト（Version 3.5.3, Entimo AG, 2008）を用いて、融合ポリペプチドの非区画型薬物動態分析を実施した。薬物動態の結果は図5及び表4に報告される。
ELISAの原理：
マウスの1%血漿中の融合ポリペプチドを定量するために、連続酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）を確立した。前記アッセイでは、精査対象ポリペプチドを捕捉する抗体（捕捉mAb＜ポリペプチド＞IgG-Bi）、続いて連結Fc-領域に対する抗体（mAb＜h-Fc-pan＞IgG-Dig）及び抗ジゴキシゲニン抗体-POD連結物を検出のために用いる。
捕捉抗体、融合ポリペプチド又は希釈血漿サンプルの検定標準物、mAb＜h-Fc-pan＞IgG-Dig、及び抗ジゴキシゲニン抗体-POD連結物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（SA-MTP）に連続的に添加し、各試薬を450rpmのMTPシェーカー上で1時間インキュベートした。各工程後にMTPを4回洗浄し、さらに残留液を除去した。最後に、形成された固定免疫複合物をTMB溶液、POD基質（前記は着色された反応生成物に変換される）の添加によって可視化した。発色を測光法でモニターし（655nmで吸収/492nm参照波長）、最高検定値がOD 0.75に達した時に1MのH2SO4の添加によって発色を停止させた。最後に色の強さを測光法で決定し（450nmで吸収/690nm参照波長）、前記は血漿サンプル中の分析物の濃度に比例した。融合ポリペプチドの定量は、非線形4パラメーターウィーマー-ロドバード曲線フィッティング関数によって、対応する較正曲線を用いて吸光度を逆算することによって実施した。
薬物動態学の結果：
皮下適用後の血中暴露：図5及び表4に示すように、PEG連結物及び試験した4つの非脂質化融合ポリペプチドと比較して、高いCmax及びAUCが脂質化融合ポリペプチドについてマウスで観察された。
皮下適用後の血中半減期（T1/2）：87時間という顕著に長い血中半減期が、脂質化融合ポリペプチドについてマウスで観察された。対照的に、試験した4つの非脂質化融合ポリペプチドは、約25時間という顕著に短いT1/2を示した。T1/2はまた、対応するPEG-40k連結物について以前に観察されたもの（41時間）よりも2倍長かった。
＊サンプリングが合体試験形式のために、PKパラメーターは平均血中濃度/時間プロフィールを示す。各構築物についての平均血中濃度/時間プロフィールは各時点の３つの濃度値から得られた。

Claims (30)

  1. −1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
    −1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、
    を含む融合ポリペプチドであって、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは脂質に共有結合により連結したアミノ酸を含み、さらに
    該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、該ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結されており、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結した、前記融合ポリペプチド。
  2. 融合ポリペプチドが内因性ポリペプチドとin vivoで結合することを特徴とする、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  3. 脂質との連結がアミノ酸の側鎖内の官能基を介することを特徴とする、請求項1又は2のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  4. 脂質と共有結合により連結したインクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸残基が天然に存在しないアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  5. 以下の（i）及び（ii）を特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド：
    i）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのC-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域に連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端との間に存在し；さらに
    ii）インクレチン受容体リガンドポリペプチドがそのN-末端を介してヒト免疫グロブリンFc-領域に連結する場合には、アミノ酸配列LPXTG（配列番号:75）、場合によってLPETG（配列番号:74）が、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端とヒト免疫グロブリンFc-領域のC-末端との間に存在する。
  6. インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、配列番号:1−39、76、77及び120−125から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  7. インクレチン受容体リガンドポリペプチドが自然のままのグルカゴン（配列番号:76）から誘導され、配列番号:76と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  8. インクレチン受容体リガンドポリペプチドがGLP-1（配列番号:1又は2）から誘導され、配列番号:1又は2と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  9. インクレチン受容体リガンドポリペプチドがGIP（配列番号:77）から誘導され、配列番号:77と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  10. インクレチン受容体リガンドポリペプチドがエキセンジン-3又は-4（配列番号:3又は4）から誘導され、配列番号:3又は4と比較して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸改変を有し、ここで、少なくとも1つのアミノ酸残基は脂質に連結しているか、又は脂質に連結した天然に存在しないアミノ酸残基に変更され、さらに該誘導ポリペプチドはインクレチン受容体リガンド活性を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
  11. Y-Aib-EGTFTSDK-(γEγE-C16)-SIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS（配列番号:120）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  12. desAmino-Tyr-AEGTFISDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:121）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  13. Ac-d-YALGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:122）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  14. Ac-d-YAVGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:123）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  15. AC-d-HAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:124）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  16. Ac-d-YAQGTFTSDK-(γE-C16)-SKYLDERAAQDFVQWLLEGGPSSGAPPPS（配列番号:125）のアミノ酸配列を含む、脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチド。
  17. −1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
    −1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
    ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
    該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
    該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互いに独立に共有結合により連結され、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む群から選択され、さらに
    該1つ、2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結しており、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結した、前記融合ポリペプチド。
  18. −1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
    −1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
    ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
    該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、配列番号:42から53のヒト免疫グロブリンFc-領域の群から選択され、
    該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端に直接的に又はリンカーペプチドを介して互に独立に共有結合により連結しており、それによって該リンカーペプチドは、それが存在する場合には(GGS)n（n＝1−4（配列番号:82−84））、Gn（n＝2−6（配列番号:85−87））、(GGGS)n（n＝1−6（配列番号:57−60、88及び89））、(GGGGS)m（m＝1−6（配列番号:61−64、90及び91））、及び(GGGGGS)o（o＝1−6（配列番号:65−67及び92−94））を含む群から選択され、さらに
    該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結され、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結した、前記融合ポリペプチド。
  19. −1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド、及び
    −1つのヒト免疫グロブリンFc-領域、を含む融合ポリペプチドであって、
    ここで、該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号:120から125の脂質化インクレチン受容体リガンドポリペプチドの群から選択され、
    該ヒト免疫グロブリンFc-領域は、i）配列番号:49の2つのアミノ酸配列又はii）配列番号:52の1つのアミノ酸配列及び配列番号:53の1つのアミノ酸配列を含み、
    該1つ又は2つ、3つ又は4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域のN-末端にリンカーペプチドを介して共有結合により連結しており、それによって該リンカーペプチドは、(GGGS)4（配列番号:58）、(GGGGS)3（配列番号:62）、及び(GGGGGS)o（o＝2−3（配列番号:65−66））含む群から選択され、さらに
    該1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、ヒト免疫グロブリンFc-領域の末端にペプチド結合によって共有結合で連結しており、それによってヒト免疫グロブリンFc-領域の各末端に単一インクレチン受容体リガンドポリペプチドのみが連結した、前記融合ポリペプチド。
  20. 請求項1から19のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドを含む医薬組成物。
  21. 請求項1から19のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの医薬としての使用。
  22. 疾患が2型糖尿病であることを特徴とする、請求項21に記載の使用。
  23. 疾患が肥満であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  24. 疾患がインスリン耐性であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  25. 疾患が1型糖尿病であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  26. 疾患が骨粗しょう症であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  27. 疾患が脂肪性肝炎であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  28. 疾患が非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  29. 疾患が代謝症候群であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  30. 請求項1から19のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドがさらに別の2型糖尿病薬と併用して投与されることを特徴とする、請求項22から29のいずれか1項に記載の使用。
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