JP2017120263A - Medicine sensitivity prediction method with tumor derived microvesicle marker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより薬物感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断する方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting / determining the presence or absence of drug sensitivity or the presence or absence of resistance using a protein marker expressed in tumor-derived microvesicles.
ＣＤ２０はプレＢ細胞から成熟Ｂ細胞に至るＢ細胞において発現される３３〜３７ｋＤａの分子量を有する膜貫通型タンパク質であり、正常細胞だけでなく、大部分のＢ細胞性リンパ腫においても発現が認められる。 CD20 is a transmembrane protein having a molecular weight of 33-37 kDa expressed in B cells ranging from pre-B cells to mature B cells, and is expressed not only in normal cells but also in most B cell lymphomas .
今日、Ｂ細胞性リンパ腫の治療においては、このＣＤ２０を標的とする抗ＣＤ２０抗体医薬品が用いられている。中でもリツキシマブ（リツキサン（登録商標））は第一選択薬となっており、広く世界中において利用されている。 Today, anti-CD20 antibody drugs targeting CD20 are used in the treatment of B-cell lymphoma. Among them, rituximab (Rituxan (registered trademark)) has become a first-line drug and is widely used all over the world.
一方で、抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療に対して抵抗性を有する患者が報告されており、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も確認されている。リツキシマブに対する抵抗性のメカニズムは全て解明されてはいないものの、腫瘍細胞からのＣＤ２０抗原の消失や、補体不活性化因子（例えば、ＣＤ５５、ＣＤ５９等）の発現による補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の低下等による要因が挙げられる（非特許文献１、２）。リツキシマブは、免疫組織染色法又はフローサイトメトリー法等によりＣＤ２０抗原の検査を行い、陽性であることが確認されている患者のみに投与するとされているが（非特許文献３）、ＣＤ２０が陽性であることが確認された患者であっても、リツキシマブ治療に対して抵抗性を有する患者も認められる。
On the other hand, patients with resistance to treatment with anti-CD20 antibody drugs have been reported, and patients with resistance to rituximab treatment have also been confirmed. Although the mechanism of resistance to rituximab has not been fully elucidated, complement-dependent cytotoxicity (complementation) due to disappearance of CD20 antigen from tumor cells or expression of complement inactivating factors (eg, CD55, CD59, etc.) -Factors due to a decrease in dependent cytotoxity (CDC), etc. (
このため、当該分野においては、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法が切望されていた。 Therefore, in this field, it is possible to predict and judge whether a patient has sensitivity or resistance to an anti-CD20 antibody drug such as rituximab. There has been a strong demand for a new technique that enables selection of patients with the disease.
本発明は、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者の選別を可能とする新たな手法を提供することを目的とする。 The present invention can predict and judge whether a patient is sensitive or resistant to an anti-CD20 antibody drug such as rituximab, and the patient who is sensitive or resistant to the drug. The object is to provide a new technique that enables sorting.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を指標にして、当該腫瘍に罹患する患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used the expression level of a protein marker expressed in a tumor-derived microvesicle as an index, and whether or not the patient suffering from the tumor has sensitivity to an anti-CD20 antibody drug. Or, the inventors have found that the presence or absence of resistance can be predicted and determined, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法。
［２］ 腫瘍患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品の感受性を予測する、［１］の方法。
［３］ 抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである、［１］又は［２］の方法。
［４］ 腫瘍患者由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいてリツキシマブに対する該患者の感受性の有無を予測する工程を含む、［３］の方法。
［５］ ＣＤ２０陽性である微小胞がエキソソームである、［４］の方法。
［６］ 解析の結果において、基準値と比べてＣＤ２０の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］又は［５］のいずれかの方法。
［７］ 解析の結果において、基準値と比べてＣＤ５９の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ 解析の結果において、基準値と比べてＣＤ８１の発現量が低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ 解析の結果において、基準値と比べてＰＤ−Ｌ１の発現量が増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する、［４］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ 発現量の解析をフローサイトメトリー法によって行う、［４］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］ 患者由来の細胞又は体液由来のＣＤ２０陽性である微小胞における、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を解析し、該解析の結果に基づいて抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する該患者の感受性の有無を予測する方法において使用するためのキットであって、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーのそれぞれに対する抗体を含む、上記キット。
［１２］ さらに、ＣＤ２０陽性である微小胞を捕捉するための、固相担体に結合された抗ＣＤ２０抗体を含む、［１１］のキット。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A method for predicting drug sensitivity of a tumor patient by a protein marker expressed in a tumor-derived microvesicle.
[2] The method according to [1], wherein the sensitivity of an anti-CD20 antibody drug in a tumor patient is predicted.
[3] The method of [1] or [2], wherein the anti-CD20 antibody drug is rituximab.
[4] The expression level of one or a plurality of protein markers selected from CD20, CD59, CD81 and PD-L1 in a CD20 positive microvesicle derived from a tumor patient is analyzed, and based on the results of the analysis, [3] The method of [3] including the process of estimating the presence or absence of the sensitivity of this patient.
[5] The method according to [4], wherein the CD20-positive microvesicle is an exosome.
[6] In the result of the analysis, if the expression level of CD20 is reduced compared to the reference value, it is determined that the patient is not sensitive to rituximab, either [4] or [5] Method.
[7] In the result of the analysis, if the expression level of CD59 is increased compared to the reference value, it is determined that the patient is not sensitive to rituximab, any of [4] to [6] Method.
[8] If the expression level of CD81 is lower than the reference value in the result of the analysis, the patient is determined not to be sensitive to rituximab, any of [4] to [7] Method.
[9] If the expression level of PD-L1 is increased compared to the reference value in the analysis results, the patient is determined not to be sensitive to rituximab. Any of [4] to [8] That way.
[10] The method according to any one of [4] to [9], wherein the expression level is analyzed by a flow cytometry method.
[11] Analyzing the expression level of one or more protein markers selected from CD20, CD59, CD81 and PD-L1 in patient-derived cells or body fluid-derived CD20-positive microvesicles; A kit for use in a method for predicting the presence or absence of sensitivity of a patient to an anti-CD20 antibody pharmaceutical based on an antibody against each of one or more protein markers selected from CD20, CD59, CD81 and PD-L1 A kit as described above.
[12] The kit according to [11], further comprising an anti-CD20 antibody bound to a solid phase carrier for capturing microvesicles that are CD20 positive.
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することを可能とする新たな手法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a new technique that makes it possible to predict and judge whether a patient has sensitivity or resistance to an anti-CD20 antibody drug such as rituximab.
本発明によれば、患者がリツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性又は抵抗性を有するか否か予測・判断することができ、当該医薬品に対して感受性を有する患者、または抵抗性を有する患者を選別することができる。これにより、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有さない患者に対して、当該医薬品による治療を用いることを回避して、別の治療を適用することができ、患者の時間的及び経済的な負担を軽減することができる。 According to the present invention, it is possible to predict / determine whether or not a patient is sensitive or resistant to an anti-CD20 antibody drug such as rituximab, and the patient is sensitive or resistant to the drug. Patients can be screened. Thereby, for patients who are not sensitive to the anti-CD20 antibody drug, it is possible to avoid using the therapy with the drug and to apply another therapy. The burden can be reduced.
１．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測する方法
本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーにより、腫瘍患者の薬物感受性を予測する方法に関する。
1. Method for predicting the presence or absence of susceptibility or resistance of a patient to anti-CD20 antibody drugs, the protein marker expressed by tumor-derived microvesicles, to a method of predicting tumor patient drug sensitivity.
より詳細には、本発明は、腫瘍由来の微小胞にて発現するタンパク質マーカーの発現量を解析し、次いで、得られた当該解析の結果に基づいて、当該腫瘍に罹患する患者の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することを含む、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する当該患者の感受性又は抵抗性の予測方法に関する。 More specifically, the present invention analyzes the expression level of a protein marker expressed in a tumor-derived microvesicle, and then, based on the obtained result of the analysis, an anti-CD20 antibody of a patient suffering from the tumor The present invention relates to a method for predicting the sensitivity or resistance of a patient to an anti-CD20 antibody drug, comprising predicting / determining whether or not drug is sensitive or resistant.
（タンパク質マーカー発現量の解析）
本発明において「腫瘍」とは、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部位の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、輪卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくは抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療対象となる腫瘍が挙げられ、例えば、リンパ腫（ＣＤ２０陽性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ増殖性疾患等）、ヴェゲナ肉芽腫症等が挙げられる。
(Analysis of protein marker expression level)
In the present invention, “tumor” refers to lymphoma, lymphocytic leukemia, lung cancer, non-small cell lung cancer, bronchioloalveolar cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterus Cancer, ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, cancer of the oviduct, endometrial cancer, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, Endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney or ureteral cancer, renal cell cancer, renal pelvis cancer, mesothelioma, hepatocellular carcinoma , Biliary tract cancer, central nervous system neoplasm, spinal cord tumor, brain stem glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, schwannoma, ventricular ependymoma, medulloblastoma, meningioma , Squamous cell carcinoma, pituitary adenoma and the like (but not limited to), preferably a therapeutic target of anti-CD20 antibody drug Cited becomes tumors, e.g., lymphoma (CD20 positive B-cell non-Hodgkin's lymphoma, CD20 positive B-cell lymphoproliferative disorders, etc.), include Vegena granulomatous disease, and the like.
本発明において「患者」とは、上記腫瘍の患者が挙げられるが、好ましくは抗ＣＤ２０抗体医薬品の治療対象となるヒト患者、より好ましくはリツキシマブ投与による治療対象となるヒト患者が挙げられる。 In the present invention, the “patient” includes a patient having the above-mentioned tumor, preferably a human patient to be treated with an anti-CD20 antibody drug, more preferably a human patient to be treated with rituximab administration.
本発明において「微小胞」とは、腫瘍細胞より放出される微粒子、エクトソーム、アルゴソーム、エキソソーム、腫瘍小胞等の膜小胞体を意味する。微小胞は腫瘍細胞にて発現されるｍｉＲＮＡやタンパク質を含む。特に、腫瘍細胞の膜表面上に発現するタンパク質と微小胞の膜表面上に発現するタンパク質とは相関関係を有し、微小胞の膜表面上に発現するタンパク質の発現プロファイルを得ることによって、腫瘍細胞のプロファイルを得ることができる。好ましくは「微小胞」は、ＣＤ２０陽性である微小胞である。 In the present invention, the “microvesicle” means a membrane vesicle such as a microparticle, ectosome, argosome, exosome, tumor vesicle or the like released from a tumor cell. Microvesicles contain miRNA and proteins expressed in tumor cells. In particular, there is a correlation between the protein expressed on the membrane surface of the tumor cell and the protein expressed on the membrane surface of the microvesicle, and by obtaining the expression profile of the protein expressed on the membrane surface of the microvesicle, Cell profiles can be obtained. Preferably, the “microvesicle” is a microvesicle that is CD20 positive.
本発明において、微小胞は患者における腫瘍細胞又は体液由来のものを利用することができる。 In the present invention, microvesicles derived from tumor cells or body fluids in patients can be used.
「患者における腫瘍細胞」としては、上記腫瘍由来の細胞を利用することができる。 As the “tumor cells in a patient”, cells derived from the tumor can be used.
また、患者の「体液」としては、腫瘍由来の微小胞を含み得る体液であればよく、このような体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、血液、血清、又は血漿であり、より好ましくは血清である。 The patient's “body fluid” may be any body fluid that can contain tumor-derived microvesicles, such as blood, serum, plasma, lymph fluid, spinal fluid, urine, semen, saliva, sweat, Examples include, but are not limited to, tears, ascites, amniotic fluid, and the like. Preferred is blood, serum or plasma, and more preferred is serum.
本発明においては、採取された腫瘍細胞又は体液をそのまま微小胞を含む試料として利用してもよいし、あるいは採取された腫瘍細胞又は体液より精製もしくは粗精製された形態の微小胞を試料として利用してもよい。 In the present invention, collected tumor cells or body fluids may be used as they are as samples containing microvesicles, or microvesicles purified or roughly purified from the collected tumor cells or body fluids are used as samples. May be.
腫瘍細胞又は体液からの微小胞の精製もしくは粗精製は、微小胞の精製もしくは粗精製に一般的に用いられる手法により行うことができ、細胞を破砕して得られた破砕液又は体液中に含まれる微小胞を、例えば、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過カラム、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）、フィルター法、ポリマーによる沈殿法、抗体やレクチンによる吸着法等の一又は複数を組み合わせた手法により行うことができる。 Purification or rough purification of microvesicles from tumor cells or body fluids can be performed by techniques commonly used for purification or rough purification of microvesicles, and are included in the disruption fluid or body fluid obtained by crushing cells. For example, ultracentrifugation method, ultrafiltration method, gel filtration column, high performance liquid chromatography (HPLC), filter method, polymer precipitation method, adsorption method using antibody or lectin, etc. It can be performed by a technique combining one or more.
特に、ＣＤ２０陽性の微小胞の精製もしくは粗精製には抗ＣＤ２０抗体を「捕捉手段」として用いた吸着法を含む手法を利用することができる。抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０陽性の微小胞を高効率に、捕捉、精製又は分離するために用いることができる。すなわち、ＣＤ２０陽性の微小胞を含む試料と抗ＣＤ２０抗体とを接触させて、試料中のＣＤ２０陽性の微小胞を抗ＣＤ２０抗体で捕捉し、当該試料から分離することにより、ＣＤ２０陽性の微小胞をより精製された形態で得ることができる。 In particular, for purification or rough purification of CD20-positive microvesicles, a technique including an adsorption method using an anti-CD20 antibody as a “capturing means” can be used. Anti-CD20 antibodies can be used to capture, purify or separate CD20 positive microvesicles with high efficiency. That is, by contacting a sample containing CD20 positive microvesicles with an anti-CD20 antibody, capturing the CD20 positive microvesicles in the sample with the anti-CD20 antibody, and separating from the sample, the CD20 positive microvesicles are separated. It can be obtained in a more purified form.
本発明において「捕捉手段」として利用可能な抗ＣＤ２０抗体は、微小胞上に発現するＣＤ２０と結合可能なものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、ＣＤ２０の特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。抗ＣＤ２０抗体には、微小胞上に発現するＣＤ２０と結合することが可能な抗体断片も含まれる、本発明において利用可能な「抗体断片」には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｃｂ、Ｆｄ等が含まれるが、これらに限定はされない。 The anti-CD20 antibody that can be used as the “capturing means” in the present invention may be any antibody that can bind to CD20 expressed on microvesicles, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Preferably, it is a monoclonal antibody that enables specific detection of CD20. The type of antibody is not particularly limited, and any type of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD can be used. Anti-CD20 antibodies also include antibody fragments capable of binding to CD20 expressed on microvesicles. “Antibody fragments” usable in the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, Facb, Fd and the like, but are not limited thereto.
本発明において抗ＣＤ２０抗体は、後述する手法によって製造されたものを用いても良いし、あるいは市販のものを用いても良い。 In the present invention, as the anti-CD20 antibody, one produced by the method described later may be used, or a commercially available one may be used.
抗ＣＤ２０抗体は、固相担体に結合されていてもよい。固相担体には、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等（これらに限定はされない）の材質、ならびにこれらの組み合わせからなるものを利用することができる。固相担体の形状は特に限定されることなく、ビーズ、プレート、球、スティック等の形状とすることができ、好ましくは、ビーズである。ビーズの大きさは特に限定されないが、例えば、直径７．０から８．０μｍ程度、例えば７．５μｍ程度の大きさのものを利用することができる。具体的には、ラテックスビーズ、磁性体ビーズ等が挙げられる。固相担体への抗ＣＤ２０抗体の結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。 The anti-CD20 antibody may be bound to a solid phase carrier. Examples of solid phase carriers include latex, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics, magnetic materials, etc. Material) and a combination of these can be used. The shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and may be a shape such as a bead, a plate, a sphere, or a stick, and is preferably a bead. The size of the beads is not particularly limited. For example, beads having a diameter of about 7.0 to 8.0 μm, for example, about 7.5 μm can be used. Specific examples include latex beads and magnetic beads. The anti-CD20 antibody can be bound to the solid phase carrier by a method well known to those skilled in the art, for example, a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or the like.
本発明において「タンパク質マーカー」とは、微小胞の膜表面にて発現するタンパク質を意味し、このようなタンパク質にはＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＰＤ−Ｌ１等が挙げられ、これらより選択される一又は複数のタンパク質を「タンパク質マーカー」として利用することができる。なお、ここで「複数」とは、２、３、又は４つの組み合わせを意味する。このような組み合わせには、ＣＤ２０及びＣＤ５９；ＣＤ２０及びＣＤ８１；ＣＤ２０及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ５９及びＣＤ８１；ＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ２０、ＣＤ５９及びＣＤ８１；ＣＤ２０、ＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１；；ＣＤ２０、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１；ならびにＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１、が含まれる。 In the present invention, the “protein marker” means a protein expressed on the membrane surface of the microvesicle. Examples of such a protein include CD20, CD59, CD81, PD-L1, and the like. Alternatively, a plurality of proteins can be used as “protein markers”. Here, “plurality” means 2, 3, or 4 combinations. Such combinations include CD20 and CD59; CD20 and CD81; CD20 and PD-L1; CD59 and CD81; CD59 and PD-L1; CD81 and PD-L1; CD20, CD59 and CD81; CD20, CD59 and PD-L1. CD20, CD81 and PD-L1; CD59, CD81 and PD-L1; and CD20, CD59, CD81 and PD-L1.
微小胞における各タンパク質マーカーの発現量の定量は、タンパク質の定量解析において一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、各タンパク質マーカーに結合可能な抗体を「標識抗体」として利用する免疫学的手法を用いた定量解析方法により行うことができる。 The expression level of each protein marker in the microvesicle can be quantified by a technique generally used in quantitative analysis of proteins. For example, immunology using an antibody capable of binding to each protein marker as a “labeled antibody”. It can be performed by a quantitative analysis method using a statistical method.
「標識抗体」として利用する、各タンパク質マーカーに対する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、各タンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。各タンパク質マーカーの抗体には、微小胞上に発現する各タンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。このような抗体断片には、上述したものが挙げられる。 The antibody against each protein marker used as a “labeled antibody” may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody that enables specific detection of each protein marker. The type of antibody is not particularly limited, and any type of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD can be used. The antibody of each protein marker also includes an antibody fragment capable of binding to each protein marker expressed on the microvesicle. Such antibody fragments include those described above.
各タンパク質マーカーに対する抗体の製造は、抗体製造において一般的に用いられる手法（Ｋｅｎｎｅｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）に基づいて行うことができる。 The production of an antibody against each protein marker can be performed based on a technique generally used in antibody production (Kennet et al., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, Plenum Press, New York, 1980).
すなわち、各タンパク質マーカーについて、免疫原（抗原）となるタンパク質又はポリペプチド（以下、「抗原ペプチド」と記載する）を調製する。ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースにその遺伝子配列情報及びアミノ酸配列情報等が開示されている。例えば、ヒトＣＤ２０はＣＢＧ７６６９５．１やＸ１２５３０．１に、ヒトＣＤ５９はＣＡＧ４６５２３．１やＡＨ００３３５２．１に、ヒトＣＤ８１はＥＡＸ０２５０８．１やＢＣ０９３０４７．１に、ヒトＰＤ−Ｌ１はＱ９ＮＺＱ７．１やＢＣ０６９３８１．１に、それぞれ登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。抗原ペプチドのアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列情報に基づいて決定することができ、予測される二次構造、表面への露出のしやすさ、柔軟性、抗原性、溶媒との接触率、親水性、極性等の要素を考慮して、さらに他のタンパク質との配列同一性がないかまたは低い領域から、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなる領域を選択することができる。抗原ペプチドは、公知のペプチド合成手法（例えば固相ペプチド合成法等）を利用して合成されたものを用いてもよい。あるいは、抗原ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターにより形質転換された微生物より産生された抗原ペプチドを精製して用いてもよい。 That is, for each protein marker, a protein or polypeptide to be used as an immunogen (antigen) (hereinafter referred to as “antigen peptide”) is prepared. CD20, CD59, CD81 and PD-L1 have their gene sequence information and amino acid sequence information disclosed in a known database such as GenBank. For example, human CD20 is CBG769695.1 and X12530.1, human CD59 is CAG46523.1 and AH003352.1, human CD81 is EAX02508.1 and BC093047.1, and human PD-L1 is Q9NZQ7.1 and BC069381.1. In the present invention, these sequence information can be used. The amino acid sequence of the antigen peptide can be determined based on the amino acid sequence information. The predicted secondary structure, ease of exposure to the surface, flexibility, antigenicity, contact rate with solvent, hydrophilicity Considering factors such as sex, polarity, etc., from regions where there is no or low sequence identity with other proteins, from 6, 7, 8, 9, 10 or more consecutive amino acids Can be selected. An antigen peptide synthesized using a known peptide synthesis method (for example, a solid phase peptide synthesis method) may be used. Alternatively, an expression vector containing DNA encoding the antigen peptide may be constructed, and the antigen peptide produced from a microorganism transformed with the expression vector may be purified and used.
ポリクローナル抗体は、抗原ペプチドを用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等の動物を免疫感作し、一定期間経過後血清を採取し、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原ペプチドなどを固相化したカラムなどを用いて、各タンパク質に結合する抗体を精製することにより得ることができる。 Polyclonal antibodies use antigenic peptides to immunize mice, rats, rabbits, goats, sheep, donkeys, and other animals. After a certain period of time, serum is collected and protein A, protein G, antigenic peptides, etc. are immobilized. It can be obtained by purifying antibodies that bind to each protein using a phased column or the like.
モノクローナル抗体は、上記と同様に動物を免疫感作して一定期間経過した後、例えば脾臓細胞を採取し、当該脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたハイブリドーマをスクリーニングし、各タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマから抗体を採取・精製することにより得ることができる。 A monoclonal antibody is obtained by immunizing an animal in the same manner as described above, and after lapse of a certain period, for example, spleen cells are collected, the spleen cells and myeloma cells are fused, and the obtained hybridomas are screened. It can be obtained by obtaining a hybridoma producing an antibody that binds to, and collecting and purifying the antibody from the hybridoma.
各タンパク質マーカーに対する抗体は上述のとおり製造されたものだけでなく、市販の抗体も使用することができる。 The antibody against each protein marker is not limited to those produced as described above, and commercially available antibodies can also be used.
「標識抗体」として利用される抗体は、検出可能な標識化合物により標識されていてもよい。このような標識化合物としては、例えば蛍光色素（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリオジニンクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性物質、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。 The antibody used as the “labeled antibody” may be labeled with a detectable labeling compound. Examples of such labeling compounds include fluorescent dyes (FITC (fluorescein isocyanate), PE (phycoerythrin), PerCP (periodinine chlorophyll protein), APC (allophycocyanin), Alexa Fluor (registered trademark)), enzyme ( Peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase and the like), radioactive substances, biotin and the like, but are not limited thereto.
なお、本発明において、ＣＤ２０陽性の微小胞を捕捉するための「捕捉手段」として利用される抗ＣＤ２０抗体と、当該微小胞におけるＣＤ２０の発現量を定量解析するための「標識抗体」として利用される抗ＣＤ２０抗体とは、ＣＤ２０に対する互いの結合が干渉しないように両者の結合部位（エピトープ）は異なるものであることが好ましい。また、本発明において、当該「捕捉手段」として利用される抗ＣＤ２０抗体と、当該「標識抗体」として利用される抗ＣＤ２０抗体とは、両者を区別して検出できるように、異なる動物種から産生されたものを利用することができる。 In the present invention, an anti-CD20 antibody used as a “capturing means” for capturing CD20-positive microvesicles and a “labeled antibody” for quantitatively analyzing the expression level of CD20 in the microvesicles. The anti-CD20 antibody preferably has a different binding site (epitope) so that mutual binding to CD20 does not interfere. In the present invention, the anti-CD20 antibody used as the “capturing means” and the anti-CD20 antibody used as the “labeled antibody” are produced from different animal species so that they can be detected separately. Can be used.
免疫学的手法を用いたタンパク質マーカーの定量解析方法としては、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、ナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標）)等を利用する方法が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくは迅速かつ簡便であり、また定量性に優れたフローサイトメトリー法やナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標）)を利用することができる。 Methods for quantitative analysis of protein markers using immunological techniques include methods using ELISA, flow cytometry, western blotting, nanotracking (nanosite (registered trademark)), etc. The flow cytometry method or the nano-tracking method (Nanosite (registered trademark)), which is preferably quick and simple and excellent in quantification, can be used.
本発明の一例においては、固相担体であるビーズに結合された「捕捉抗体」である抗ＣＤ２０抗体を、ＣＤ２０陽性の微小胞を含む試料と接触させ、また、ＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体である「標識抗体」を接触させ、これにより捕捉抗体−ＣＤ２０陽性の微小胞−標識抗体からなるサンドイッチ複合体を形成する。次いで、当該複合体における標識抗体をフローサイトメーターを用いて検出・定量することによって、ＣＤ２０陽性の微小胞にて発現するＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１より選択される一又は複数のタンパク質マーカーの発現量を定量することができる。標識抗体の検出は、標識抗体に付された標識化合物を当該化合物の検出に適した方法で検出することによって行ってもよいし、あるいは標識抗体に結合することが可能な二次抗体を上述した標識化合物で標識し、当該二次抗体を用いて標識抗体を検出してもよい。「二次抗体」としては、標識抗体を産生した動物種の免疫グロブリンに対する、別の動物種によって産生された抗体を利用することができる。 In one example of the present invention, an anti-CD20 antibody that is a “capture antibody” bound to a bead that is a solid phase carrier is contacted with a sample containing CD20 positive microvesicles, and CD20, CD59, CD81, and PD− A “labeled antibody” that is an antibody capable of binding to one or more protein markers selected from L1 is contacted, thereby forming a sandwich complex consisting of a capture antibody-CD20 positive microvesicle-labeled antibody. . Next, one or more protein markers selected from CD20, CD59, CD81 and PD-L1 expressed in CD20 positive microvesicles by detecting and quantifying the labeled antibody in the complex using a flow cytometer Can be quantified. The labeled antibody may be detected by detecting the labeled compound attached to the labeled antibody by a method suitable for the detection of the compound, or the secondary antibody capable of binding to the labeled antibody is described above. It may be labeled with a labeling compound, and the labeled antibody may be detected using the secondary antibody. As the “secondary antibody”, an antibody produced by another animal species against the immunoglobulin of the animal species that produced the labeled antibody can be used.
（判定基準）
上述の手法により、定量解析されたＣＤ２０陽性の微小胞における、タンパク質マーカーの発現量の値を、「基準値」と比較することによって、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができる。
(Criteria)
By comparing the expression level of the protein marker in the CD20 positive microvesicle quantitatively analyzed by the above-mentioned method with the “reference value”, the presence or absence of the patient's sensitivity to the anti-CD20 antibody drug or the resistance Presence / absence can be predicted and judged.
本発明において「抗ＣＤ２０抗体医薬品」としては、リツキシマブ、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１等が挙げられるが、好ましくはリツキシマブである。 In the present invention, examples of the “anti-CD20 antibody drug” include rituximab, BM-ca, ofatumumab, AME133v, GA101 and the like, preferably rituximab.
本発明の一例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。 In one example of the present invention, the “reference value” is derived from cells that are known to be sensitive to anti-CD20 antibody drugs, or human-derived cells or body fluids that are known to be sensitive to anti-CD20 antibody drugs. The expression level of the protein marker in the CD20-positive microvesicle can be determined. The expression level can be a value obtained using the same quantitative analysis technique as the expression level of each protein marker in CD20 positive microvesicles derived from a patient to be tested. The reference value can also be an average value based on the expression level, a median value, or a cut-off value obtained by creating an ROC curve.
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有することが公知である、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＬ細胞、Ｕ２９３２細胞、Ｇｒａｎｔａ細胞、ＨＢＬ−２細胞、Ｊｅｋｏ−１細胞、Ｍｉｎｏ細胞、Ｒｅｃ１細胞、Ｚ−１３８細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＳＵ−ＤＨＬ−４細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有することが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有することが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められた患者等が挙げられる。 Here, as “cells known to have sensitivity to anti-CD20 antibody pharmaceuticals”, for example, SU-DHL-4 cells, Raji cells, RL cells, U2932 cells, which are known to have sensitivity to rituximab, Granta cells, HBL-2 cells, Jeko-1 cells, Mino cells, Rec1 cells, Z-138 cells and the like can be mentioned (but not limited to), and SU-DHL-4 cells are preferable. In addition, “a human known to be sensitive to an anti-CD20 antibody drug” includes a human known to be sensitive to rituximab, for example, a history of treatment with rituximab, and the effects of rituximab treatment. Examples of such patients are recognized.
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ）ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉ）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉｉ）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；ならびに、
（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
When the anti-CD20 antibody pharmaceutical is rituximab, the patient's sensitivity to rituximab or resistance can be determined based on one or more of the following criteria.
(I) If the expression level of CD20 is decreased compared to the reference value, it is determined that the patient is not sensitive to rituximab;
(Ii) If the expression level of CD59 is increased compared to the reference value, it is determined that the patient is not sensitive to rituximab;
(Iii) if the expression level of CD81 is reduced compared to the reference value, the patient is judged not to be sensitive to rituximab; and
(Iv) If the expression level of PD-L1 is increased compared to the reference value, it is determined that the patient is not sensitive to rituximab.
ここで「低下している」とは、基準値の発現量未満又は以下であること、例えば、基準値の発現量に対して、例えば、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又はそれ以下に発現量が低下していることを意味する。また、「増加している」とは、基準値の発現量を超える又は以上であること、例えば、基準値の発現量に対して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、５００％以上、又はそれ以上に発現量が増大していることを意味する。なお、本明細書において「低下している」と「低い」なる用語は、相互互換的に用いることができる。また、本明細書において「増加している」と「高い」なる用語は、相互互換的に用いることができる。 Here, “decreased” means that the expression level is less than or less than the reference value, for example, 99% or less, 95% or less, 90% or less, 80% with respect to the expression value of the reference value. Hereinafter, it means that the expression level is reduced to 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, or less. Further, “increased” means that it exceeds or exceeds the expression level of the reference value, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more with respect to the expression level of the reference value , 50% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, 400% or more, 500% or more, or more. In the present specification, the terms “decreased” and “low” can be used interchangeably. Further, in this specification, the terms “increased” and “high” can be used interchangeably.
あるいは、本発明の別の例において、「基準値」とは、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞、あるいは抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、又はＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。 Alternatively, in another example of the present invention, the “reference value” is known to be a cell that is known not to be sensitive to an anti-CD20 antibody drug, or is not sensitive to an anti-CD20 antibody drug. It can be the expression level of the protein marker in CD20 positive microvesicles derived from human-derived cells or body fluids. The expression level can be a value obtained using the same quantitative analysis technique as the expression level of each protein marker in CD20 positive microvesicles derived from a patient to be tested. The reference value can also be an average value based on the expression level, a median value, or a cut-off value obtained by creating an ROC curve.
ここで「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知である細胞」としては、例えば、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるＲＣ−Ｋ８細胞、Ｒａｊｉ−２Ｒ細胞、Ｒａｊｉ ４ＲＨ細胞、ＲＬ−４ＲＨ細胞、Ｕ２９３２−４ＲＨ細胞等が挙げられるが（これらに限定はされない）、好ましくはＲＣ−Ｋ８細胞である。また、「抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する感受性を有さないことが公知であるヒト」としては、リツキシマブに対する感受性を有さないことが公知であるヒトが挙げられ、例えば、リツキシマブによる治療歴を有し、リツキシマブ治療による効果が認められなかった患者等が挙げられる。 Here, “cells known not to be sensitive to anti-CD20 antibody pharmaceuticals” include, for example, RC-K8 cells, Raji-2R cells, Raji 4RH cells known to have no sensitivity to rituximab. , RL-4RH cells, U2932-4RH cells, and the like (but not limited thereto), preferably RC-K8 cells. In addition, “a human known not to be sensitive to an anti-CD20 antibody drug” includes a human known to have no sensitivity to rituximab, for example, having a history of treatment with rituximab, Examples include patients in whom the effect of rituximab treatment was not recognized.
抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ’）ＣＤ２０の発現量が基準値と比べて、増加している場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉ’）ＣＤ５９の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；
（ｉｉｉ’）ＣＤ８１の発現量が基準値と比べて、増加している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する；ならびに、
（ｉｖ’）ＰＤ−Ｌ１の発現量が基準値と比べて、低下している場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有すると判断する。
When the anti-CD20 antibody pharmaceutical is rituximab, the patient's sensitivity to rituximab or resistance can be determined based on one or more of the following criteria.
(I ′) If the expression level of CD20 is increased compared to the reference value, it is determined that the patient is sensitive to rituximab;
(Ii ′) If the expression level of CD59 is reduced compared to the reference value, the patient is judged to be sensitive to rituximab;
(Iii ′) If the expression level of CD81 is increased compared to the reference value, the patient is judged to be sensitive to rituximab;
(Iv ′) If the expression level of PD-L1 is lower than the reference value, the patient is judged to be sensitive to rituximab.
ここで「低下している」及び「増加している」とは、上述したとおりである。
あるいは、本発明の別の一例において、「基準値」とは、対照となる健常者又は患者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるタンパク質マーカーの発現量とすることができる。当該発現量は、試験対象となる患者由来のＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質マーカーの発現量と同じ定量解析手法を用いて得られた値とすることができる。基準値はまた、当該発現量に基づく平均値、中央値、ＲＯＣ曲線を作製して得られたカットオフ値とすることができる。あるいは、基準値は各タンパク質マーカーの発現量の測定値の分布における、１０パーセンタイル、又は５パーセンタイルに対応する値、あるいは９０パーセンタイル、又は９５パーセンタイルに対応する値とすることができる。
Here, “decreasing” and “increasing” are as described above.
Alternatively, in another example of the present invention, the “reference value” can be the expression level of the protein marker in CD20 positive microvesicles derived from cells or body fluids derived from healthy subjects or patients as controls. The expression level can be a value obtained using the same quantitative analysis technique as the expression level of each protein marker in CD20 positive microvesicles derived from a patient to be tested. The reference value can also be a cut-off value obtained by preparing an average value, median value, or ROC curve based on the expression level. Alternatively, the reference value may be a value corresponding to the 10th percentile or 5th percentile, or a value corresponding to the 90th percentile or 95th percentile in the distribution of the measured value of the expression level of each protein marker.
例えば、基準値として以下のものを用いることができる：
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ２０の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０（１０パーセンタイルに対応する値）、又は３．６０（５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ５９の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、５．１１（９０パーセンタイルに対応する値）、又は５．２５（９５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＣＤ８１の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．０４（１０パーセンタイルに対応する値）、又は３．０２（５パーセンタイルに対応する値）とすることができる；
健常者由来の細胞又は体液に由来するＣＤ２０陽性の微小胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現量として、対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０（９０パーセンタイルに対応する値）、又は３．７３（９５パーセンタイルに対応する値）とすることができる。
For example, the following can be used as reference values:
When the expression level of CD20 in CD20 positive microvesicles derived from healthy human cells or body fluids is displayed as a common logarithm with a logarithmic function base value of 10, it is 3.70 (value corresponding to 10th percentile) ), Or 3.60 (value corresponding to the 5th percentile);
When the expression level of CD59 in CD20 positive microvesicles derived from cells or body fluids derived from healthy subjects is displayed as a common logarithm with the base value of the logarithmic function being 10, 5.11 (value corresponding to the 90th percentile) ), Or 5.25 (value corresponding to the 95th percentile);
When the expression level of CD81 in CD20 positive microvesicles derived from cells or body fluids derived from healthy subjects is displayed as a common logarithm with the base value of the logarithmic function being 10, the value corresponding to the 10th percentile is 3.04. ), Or 3.02 (value corresponding to the 5th percentile);
When the expression level of PD-L1 in CD20-positive microvesicles derived from cells or body fluids derived from healthy subjects is displayed in the common logarithm with the base value of the logarithmic function being 10, it corresponds to 3.70 (90th percentile) Value), or 3.73 (value corresponding to the 95th percentile).
この場合、抗ＣＤ２０抗体医薬品がリツキシマブである場合、リツキシマブに対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無は、以下の一又は複数の基準に基づいて行うことができる。
（ｉ）ＣＤ２０の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０未満、好ましくは３．６０以下である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉ）ＣＤ５９の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、５．１１を超える、好ましくは５．２５以上である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
（ｉｉｉ）ＣＤ８１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．０４未満、好ましくは３．０２以下である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；ならびに、
（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数で表示した場合に、３．７０を超える、好ましくは３．７３以上である場合、患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
In this case, when the anti-CD20 antibody drug is rituximab, the presence or absence of the patient's sensitivity to rituximab or the presence or absence of resistance can be determined based on one or more of the following criteria.
(I) If the expression level of CD20 is expressed as a common logarithm with the base value of the logarithmic function as 10, the patient is sensitive to rituximab if it is less than 3.70, preferably less than 3.60 Decide not to do;
(Ii) When the expression level of CD59 is expressed as a common logarithm with the base value of the logarithmic function as 10, the patient is more sensitive to rituximab if it exceeds 5.11, preferably 5.25 or more. Judge not to have;
(Iii) If the expression level of CD81 is expressed as a common logarithm with the base value of the logarithmic function as 10, the patient is sensitive to rituximab if it is less than 3.04, preferably less than 3.02. As well as;
(Iv) When the expression level of PD-L1 is expressed in the common logarithm with the base value of the logarithmic function as 10, the patient is against rituximab when it exceeds 3.70, preferably 3.73 or more. Judged not to be sensitive.
なお、上記基準値はいずれも毎回測定する必要はなく、一旦、基準値が得られれば、以降は当該基準値に基づいて、抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性、又は抵抗性の有無の予測・判断に用いることができる。 In addition, it is not necessary to measure any of the above-mentioned reference values every time. Once the reference value is obtained, the patient is sensitive to anti-CD20 antibody drug or the presence or absence of resistance based on the reference value. Can be used for judgment.
また、いずれの例においてもＣＤ２０陽性の微小胞における各タンパク質の発現量は、平均値又は中央値とすることができる。 In any example, the expression level of each protein in CD20 positive microvesicles can be an average value or a median value.
（患者の選別・治療の最適化）
本発明は、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性の有無、又は抵抗性の有無を予測・判断することができることから、本発明方法を利用することにより、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体医薬品に対して感受性を有する患者、又は抵抗性を有する患者を選別することができる。
(Optimization of patient selection and treatment)
Since the present invention can predict / determine whether or not a patient is sensitive or resistant to an anti-CD20 antibody drug such as rituximab, the method of the present invention can be used to obtain an anti-CD20 antibody drug such as rituximab. Patients who are sensitive or resistant can be screened.
本発明により、リツキシマブに対して感受性を有さない、またはリツキシマブに対して抵抗性を有すると予測・判断された患者の治療には、リツキシマブに代えて、別の抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＢＭ−ｃａ、オファツムマブ、ＡＭＥ１３３ｖ、ＧＡ１０１）を当該患者に投与して治療することができる。 According to the present invention, for the treatment of patients who are predicted to be insensitive to rituximab or resistant to rituximab, another anti-CD20 antibody (eg, BM- ca, ofatumumab, AME133v, GA101) can be administered to the patient and treated.
２．抗ＣＤ２０抗体医薬品に対する患者の感受性又は抵抗性の有無を予測するためのキット
本発明はまた、上述の方法において使用するためのキットに関する。本キットには、上述の標識手段としての抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体より選択される一又は複数の抗体を含めることができる。本キットにはまた、上述の捕捉手段としての抗ＣＤ２０抗体、好ましくは固相担体に結合されている抗ＣＤ２０抗体を含めることができる。本キットにはさらに、患者由来の細胞又は体液由来の微小胞を抽出するのに適当な緩衝液、非特異的な抗体結合を阻害するためのブロッキング試薬等を含めることができる。
2. Kits for Predicting Patient Sensitivity or Resistance to Anti-CD20 Antibody Drugs The present invention also relates to kits for use in the methods described above. This kit may contain one or more antibodies selected from the anti-CD20 antibody, anti-CD59 antibody, anti-CD81 antibody, and anti-PD-L1 antibody as the labeling means described above. The kit can also include an anti-CD20 antibody as the capture means described above, preferably an anti-CD20 antibody bound to a solid support. The kit may further contain a buffer suitable for extracting patient-derived cells or body fluid-derived microvesicles, a blocking reagent for inhibiting nonspecific antibody binding, and the like.
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１：細胞からのエキソソームの抽出
細胞はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞を用いた。細胞をそれぞれ細胞培養用フラスコにて培養し、回収の前日に無血清培地に培地交換し、一晩培養した。次いで、細胞１×１０７個をそれぞれ回収し、遠心分離を行い（２０℃、１，０００ｇ、５分間）、上清を回収した。
Example 1: Extraction of exosomes from cells As cells, SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab and RC-K8 cells not sensitive to rituximab were used. Each cell was cultured in a cell culture flask, and the medium was replaced with a serum-free medium on the day before collection, followed by overnight culture. Next, 1 × 10 7 cells were collected and centrifuged (20 ° C., 1,000 g, 5 minutes), and the supernatant was collected.
回収した上清に対して、その半分量のＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で一晩静置した後、遠心分離を行い（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去してペレットを回収した。得られたペレットを、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、ペレットを溶解した。次いで、このペレット溶解液を遠心分離し（２〜８℃、１０，０００ｇ、１時間）、上清を除去して再びペレットを回収した。 Half of the total amount of Exosome Isolation (from cell culture media) (Invitrogen) was added to the collected supernatant and mixed until uniform. The obtained mixed solution was allowed to stand at 2 to 8 ° C. overnight, and then centrifuged (2 to 8 ° C., 10,000 g, 1 hour), and the supernatant was removed to recover the pellet. The resulting pellet was suspended in an equal volume of sterile PBS to dissolve the pellet. Subsequently, this pellet solution was centrifuged (2-8 ° C., 10,000 g, 1 hour), the supernatant was removed, and the pellet was collected again.
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、各細胞由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。 The obtained pellet was suspended in an equal volume of sterilized PBS to obtain a suspension containing exosomes derived from each cell.
実施例２：抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製
抗ＣＤ２０抗体がビーズに固定化されてなる抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｅａｄ Ａ４ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ.５５８５７８）とＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅａｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ.５５８５５６）を製造元の指示書に従い使用して作製した。すなわち、直径７．５μｍのラテックスビーズ（ベクトン・ディッキンソン）７５μＬに１Ｍ ＤＴＴ（１．９μＬ）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加して混合した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）を添加して、ビーズを再浮遊させビーズ懸濁液を調製した。
Example 2: Preparation of anti-CD20 antibody beads Preparation of anti-CD20 antibody beads in which an anti-CD20 antibody is immobilized on beads was made with Functional Bead A4 beads (BD Biosciences Catalog No. 558578) and Functional bead conjugate buffer set Catalog No. 558556) was made according to the manufacturer's instructions. That is, 1M DTT (1.9 μL) was added to 75 μL of latex beads (Becton Dickinson) having a diameter of 7.5 μm, mixed, and then incubated for 1 hour at room temperature, protected from light. Coupling Buffer (1 mL) was added and mixed, and then centrifuged (900 × g, 3 minutes) to discard the supernatant. After repeating this operation three times, a coupling buffer (20 μL) was added to resuspend the beads to prepare a bead suspension.
ＰＢＳに抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍｇ／ｍＬの量にて加え、そこに２μＬのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＤＩ Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、未反応のＳＭＣＣをスピンカラムを用いて除去し、抗ＣＤ２０抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を調製した。 After adding anti-CD20 antibody (BD Biosciences) in an amount of 1 mg / mL to PBS, 2 μL of Sulfo-SMCC (prepared at 2 mg / mL in DI H 2 O) was added thereto and mixed. Incubated for 1 hour at room temperature, protected from light. After the incubation, unreacted SMCC was removed using a spin column to prepare an anti-CD20 antibody / Sulfo-SMCC solution.
ビーズ懸濁液に、抗ＣＤ２０抗体／Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液の全量を添加して混合した後、遮光して、室温にて１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、２μＬ ＮＥＭ（ＤＭＳＯ中にＮ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを２ｍｇ／ｍＬにて調製されたもの）を添加して混合した後、遮光して、室温にて１５間、インキュベーションした。Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を添加した後、遠心分離（９００×ｇ、３分間）して上清を捨てた。本操作を３回繰り返した後、Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＬ）を添加して、抗ＣＤ２０抗体が結合したビーズ（抗ＣＤ２０抗体ビーズ）を再浮遊させ、抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液を調製した。得られた抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液は使用するまで４℃にて保管した。 To the bead suspension, the whole amount of the anti-CD20 antibody / Sulfo-SMCC solution was added and mixed, and then incubated for 1 hour at room temperature, protected from light. After incubation, 2 μL NEM (N-Ethylmalimide prepared in DMSO at 2 mg / mL) was added and mixed, and then incubated for 15 minutes at room temperature, protected from light. After addition of Storage Buffer (1 mL), the supernatant was discarded by centrifugation (900 × g, 3 minutes). After repeating this operation three times, Storage Buffer (500 μL) was added to resuspend the beads bound with the anti-CD20 antibody (anti-CD20 antibody beads) to prepare an anti-CD20 antibody bead suspension. The resulting anti-CD20 antibody bead suspension was stored at 4 ° C. until use.
実施例３：エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの作製
実施例１で調製した各エキソソーム懸濁液（２５μＬ）をマイクロチューブに分取し、そこに実施例３で調製した抗ＣＤ２０抗体ビーズ懸濁液（１μＬ）をそれぞれ加えて、プレートミキサーを使い８００ｒｐｍにて攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。
Example 3 Production of Exosome-Binding Anti-CD20 Antibody Beads Each exosome suspension (25 μL) prepared in Example 1 was dispensed into a microtube, and the anti-CD20 antibody bead suspension prepared in Example 3 ( 1 μL) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes while stirring at 800 rpm using a plate mixer.
次いで、１０ｍＭ ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、エキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させた。 Next, 10 mM PBS (1 mL) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes with gentle agitation using a rotator to bind exosomes and anti-CD20 antibody beads.
インキュベート後、１００ｍＭグリシン（１ｍＬ）及び、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。 After incubation, 100 mM glycine (1 mL) and 2% BSA / PBS (1 mL) were added, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes while gently stirring using a rotator.
インキュベート後、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、再び遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ローテーターを使い緩やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートし、ビーズのブロッキングを行った。
After incubation, centrifuge (20 ° C., 14,800 × g, 1 minute), discard the supernatant, add 2% BSA / PBS (1 mL), and centrifuge again (20 ° C., 14,800 ×
次いで、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、ピペッティングして沈降したビーズをリンスした後、再び、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨てた後、１００μＬ ＰＢＳを添加して沈降したビーズを懸濁し、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。 Subsequently, the supernatant is discarded by centrifugation (20 ° C., 14,800 × g, 1 minute), 2% BSA / PBS (1 mL) is added, and the precipitated beads are rinsed and rinsed again. After centrifugation (20 ° C., 14,800 × g, 1 minute) and discarding the supernatant, 100 μL PBS was added to suspend the sedimented beads to prepare a suspension of exosome-bound anti-CD20 antibody beads. did.
実施例４：エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの標識
エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液に、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された以下のいずれかの抗体の溶液（２０μＬ）を添加して、ローテーターを使い攪拌しながら、４℃にて３０分間、インキュベートした。
Example 4: Labeling of exosome-bound anti-CD20 antibody beads To a suspension of exosome-bound anti-CD20 antibody beads, a solution (20 μL) of any of the following antibodies labeled with phycoerythrin (PE) was added: The mixture was incubated at 4 ° C. for 30 minutes with stirring using a rotator.
抗体：
抗ＣＤ２０抗体：Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ５９抗体：Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ５９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＣＤ８１抗体：Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ８１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
抗ＰＤ−１抗体：Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ２７４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
陰性対照には、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
antibody:
Anti-CD20 antibody: Mouse anti-human CD20 (BD Biosciences)
Anti-CD59 antibody: Mouse anti-human CD59 (BD Biosciences)
Anti-CD81 antibody: Mouse anti-human CD81 (BD Biosciences)
Anti-PD-1 antibody: Mouse anti-human CD274 (BD Biosciences)
Mouse IgG2a (BD Biosciences) was used as a negative control.
インキュベーション後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、遠心分離（２０℃、１４，８００×ｇ、１分間）して上清を捨て、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、上清を捨てた後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。 After incubation, add 2% BSA / PBS (1 mL), centrifuge (20 ° C., 14,800 × g, 1 minute), discard the supernatant, add 10% BSA / PBS (1 mL) After discarding the supernatant, 2% BSA / PBS (1 mL) was added to prepare a complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody.
実施例５：フローサイト測定
（方法）
フローサイトメトリーを使用して、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体をそれぞれ検出・定量した。
Example 5: Flow site measurement (method)
Using flow cytometry, the complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody was detected and quantified.
測定条件は、Ｌａｓｅｒ：４８８ｎｍ（Ｂｌｕｅ Ｌａｓｅｒ） ５０ｍＷ ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅで励起し、検出器（ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、５３３±１５ｎｍまたは、５８５±２０ｎｍで検出した。５３３±１５ｎｍはＦＩＴＣ検出用フィルターとして、５８５±２０ｎｍはＰＥ検出用フィルターとして用いた。 Measurement conditions were excited at Laser: 488 nm (Blue Laser) 50 mW solid state, and detected at 533 ± 15 nm or 585 ± 20 nm using a detector (BD Accu ™ C6 Flow Cytometer, BD Biosciences). 533 ± 15 nm was used as a FITC detection filter, and 585 ± 20 nm was used as a PE detection filter.
（結果）
リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞、及びリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞のそれぞれ由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図１に示す。
(result)
FIG. 1 shows the measurement results of the expression levels of CD20, CD59, CD81 and PD-L1 in CD20 positive exosomes derived from SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab and RC-K8 cells not sensitive to rituximab, respectively. Shown in
ＣＤ２０の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて高いことが確認された（図１（Ａ））。 Regarding the expression level of CD20, it was confirmed that the expression level of SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab was higher than the expression level of RC-K8 cells not sensitive to rituximab (FIG. 1 (A )).
ＣＤ５９の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて低いことが確認された（図１（Ｂ））。 Regarding the expression level of CD59, it was confirmed that the expression level of SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab was lower than the expression level of RC-K8 cells not sensitive to rituximab (FIG. 1 (B )).
ＣＤ８１の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の発現量は、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞の発現量と比べて高いことが確認された（図１（Ｃ））。 Regarding the expression level of CD81, it was confirmed that the expression level of SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab is higher than the expression level of RC-K8 cells not sensitive to rituximab (FIG. 1 (C )).
ＰＤ−Ｌ１の発現量に関し、リツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞において発現は認められず、リツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞においては発現が確認された（図１（Ｄ））。 Regarding the expression level of PD-L1, no expression was observed in SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab, and the expression was confirmed in RC-K8 cells not sensitive to rituximab (FIG. 1 (D) ).
なお、上記タンパク質に加えて、ＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ５５及びＣＤ４６の発現量を測定したが、これらタンパク質の発現量はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞及びＲＣ−Ｋ８細胞において違いは認められなかった。 In addition to the above proteins, the expression levels of CD55 and CD46 in CD20 positive exosomes were measured, but no difference was observed in the expression levels of these proteins in SU-DHL-4 cells and RC-K8 cells.
これらの結果より、リツキシマブに対する感受性の有無によって、ＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量には違いがあり、これらタンパク質の発現量を指標にして、リツキシマブに対する感受性の有無を判定できることが明らかになった。 From these results, there are differences in the expression levels of CD20, CD59, CD81 and PD-L1 in CD20 positive exosomes depending on the sensitivity to rituximab, and the presence or absence of sensitivity to rituximab using the expression level of these proteins as an index. It became clear that it could be judged.
実施例６：血清からのエキソソームの抽出
リンパ腫患者（Ｎｏ．２３及びＮｏ．３０）から採取した血液を遠心分離（２０℃、２，０００ｇで３０分間）して血清を採取した。
Example 6: Extraction of exosomes from serum Blood collected from lymphoma patients (No. 23 and No. 30) was centrifuged (20 ° C., 2,000 g for 30 minutes) to collect serum.
得られた血清２，０００μＬに対して、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００μＬを添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で３０分静置した後、遠心分離を行い（室温、１０，０００ｇ、１０分間）、上清を除去してペレットを回収した。 To the obtained serum (2,000 μL), Total Exosome Isolation (from serum) (Invitrogen) (200 μL) was added and mixed until uniform. The obtained mixed solution was allowed to stand at 2-8 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged (room temperature, 10,000 g, 10 minutes), and the supernatant was removed to recover the pellet.
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、血清由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。 The obtained pellet was suspended in an equal amount of sterilized PBS to obtain a suspension containing serum-derived exosomes.
次いで、上記実施例３に記載した手法と同様にして、各エキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させ、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。得られたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を、上記実施例４に記載した手法と同様にして、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体及び抗ＰＤ−１抗体とそれぞれ反応させ、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。 Subsequently, each exosome and anti-CD20 antibody beads were bound in the same manner as described in Example 3 to prepare a suspension of exosome-bound anti-CD20 antibody beads. The suspension of the obtained exosome-bound anti-CD20 antibody beads was treated in the same manner as described in Example 4 above with anti-CD20 antibody, anti-CD59 antibody, anti-CD81 antibody labeled with phycoerythrin (PE) and Each was reacted with an anti-PD-1 antibody to prepare a complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody.
得られた各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体における各タンパク質マーカーついて、上記実施例５に記載した手法と同様にして、フローサイトメトリーを使用してそれぞれ検出・定量した。 Each protein marker in the complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody thus obtained was detected and quantified using flow cytometry in the same manner as described in Example 5 above.
（結果）
患者ＮＯ．２３に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図２に示す。また、患者ＮＯ．３０に由来するＣＤ２０陽性エキソソームにおけるＣＤ２０、ＣＤ５９、ＣＤ８１及びＰＤ−Ｌ１の発現量の測定結果を図３に示す。
(result)
Patient NO. The measurement result of the expression level of CD20, CD59, CD81 and PD-L1 in CD20 positive exosome derived from No. 23 is shown in FIG. In addition, patient NO. The measurement result of the expression level of CD20, CD59, CD81, and PD-L1 in CD20 positive exosome derived from 30 is shown in FIG.
ＣＤ２０の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差は認められなかった（図２（Ａ）及び図３（Ａ））。 Regarding the expression level of CD20, patient NO. 23 and patient NO. No significant difference was observed with respect to 30 (FIGS. 2A and 3A).
ＣＤ５９の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差が認められ、患者ＮＯ．３０における発現量が、患者ＮＯ．２３における発現量と比べて高いことが確認された（図２（Ｂ）及び図３（Ｂ））。 Regarding the expression level of CD59, patient NO. 23 and patient NO. A large difference was observed between the patient NO. 30, the expression level in patient NO. It was confirmed that the expression level was higher than that in FIG. 23 (FIG. 2B and FIG. 3B).
ＣＤ８１の発現量に関し、患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で大きな差は認められなかった（図２（Ｃ）及び図３（Ｃ））。 Regarding the expression level of CD81, patient NO. 23 and patient NO. No significant difference was observed with respect to 30 (FIG. 2 (C) and FIG. 3 (C)).
ＰＤ−Ｌ１の発現量に関し、患者ＮＯ．３０における発現量が、患者ＮＯ．２３における発現量と比べて高いことが確認された（図２（Ｄ）及び図３（Ｄ））。 Regarding the expression level of PD-L1, patient NO. 30, the expression level in patient NO. It was confirmed that the expression level was higher than that in FIG. 23 (FIG. 2D and FIG. 3D).
患者ＮＯ．２３と患者ＮＯ．３０との間で差異が認められたＣＤ５９及びＰＤ−Ｌ１の発現量を、上記ＲＣ−Ｋ８細胞及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞におけるそれらの発現量（図１）と比較すると、患者ＮＯ．３０の発現パターンはリツキシマブに感受性を有さないＲＣ−Ｋ８細胞における発現パターンとより近似していること、また患者ＮＯ．２３はリツキシマブに感受性を有するＳＵ−ＤＨＬ−４細胞における発現パターンとより近似していることが示された。 Patient NO. 23 and patient NO. When the expression levels of CD59 and PD-L1 in which differences were observed with respect to 30 were compared with their expression levels in the RC-K8 cells and SU-DHL-4 cells (FIG. 1), patient NO. The expression pattern of 30 is more similar to the expression pattern in RC-K8 cells that are not sensitive to rituximab, and patient NO. 23 was shown to be more similar to the expression pattern in SU-DHL-4 cells sensitive to rituximab.
以上の結果より、患者ＮＯ．３０はＲＣ−Ｋ８細胞と同様に、リツキシマブに対して感受性を有さないことが示唆され、また患者ＮＯ．２３はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞と同様に、リツキシマブに対して感受性を有することが示唆された。 From the above results, patient NO. 30 is suggested to be insensitive to rituximab, similar to RC-K8 cells, and patient NO. 23 was suggested to be sensitive to rituximab, similar to SU-DHL-4 cells.
実施例７：健常者血清からのエキソソームの抽出
健常者１９名（２５歳から７０歳）から採取した血液を遠心分離（２０℃、２，０００ｇで３０分間）して血清を採取した。
Example 7: Extraction of exosomes from serum of healthy subjects Blood collected from 19 healthy subjects (25 to 70 years old) was centrifuged (20 ° C, 2,000 g for 30 minutes) to collect serum.
得られた血清１，０００μＬに対して、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００μＬを添加し、均一になるまで混合した。得られた混合溶液を２〜８℃で３０分静置した後、遠心分離を行い（室温、１０，０００ｇ、１０分間）、上清を除去してペレットを回収した。 To 1,000 μL of the obtained serum, 200 μL of Total Exosome Isolation (from serum) (Invitrogen) was added and mixed until uniform. The obtained mixed solution was allowed to stand at 2-8 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged (room temperature, 10,000 g, 10 minutes), and the supernatant was removed to recover the pellet.
得られたペレットは、等量の滅菌済みＰＢＳに懸濁し、血清由来のエキソソームを含む懸濁液を得た。 The obtained pellet was suspended in an equal amount of sterilized PBS to obtain a suspension containing serum-derived exosomes.
次いで、上記実施例３に記載した手法と同様にして、各懸濁液中のエキソソームと抗ＣＤ２０抗体ビーズとを結合させ、エキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を調製した。得られたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの懸濁液を、上記実施例４に記載した手法と同様にして、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ８１抗体及び抗ＰＤ−１抗体とそれぞれ反応させ、各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体を調製した。 Next, in the same manner as described in Example 3 above, exosomes in each suspension and anti-CD20 antibody beads were bound to prepare a suspension of exosome-bound anti-CD20 antibody beads. The suspension of the obtained exosome-bound anti-CD20 antibody beads was treated in the same manner as described in Example 4 above with anti-CD20 antibody, anti-CD59 antibody, anti-CD81 antibody labeled with phycoerythrin (PE) and Each was reacted with an anti-PD-1 antibody to prepare a complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody.
得られた各抗体により標識されたエキソソーム結合抗ＣＤ２０抗体ビーズの複合体における各タンパク質マーカーついて、上記実施例５に記載した手法と同様にして、フローサイトメトリーを使用してそれぞれ検出・定量した。 Each protein marker in the complex of exosome-bound anti-CD20 antibody beads labeled with each antibody thus obtained was detected and quantified using flow cytometry in the same manner as described in Example 5 above.
（結果）
図４は健常者血清における各タンパク質マーカーについての測定値とパーセンタイルを示す図である。図４中、各タンパク質マーカーの測定値は点で示している。各測定値に付された箱の下端部及び上端部はそれぞれ２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示しており、そして、下端部及び上端部に付されたひげはそれぞれ５パーセンタイル及び９５パーセンタイルに配置されている。箱内の線は、中央値を示している。
(result)
FIG. 4 is a diagram showing measured values and percentiles for each protein marker in normal serum. In FIG. 4, the measured values of each protein marker are indicated by dots. The lower and upper ends of the boxes attached to each measurement indicate the 25th and 75th percentiles, respectively, and the whiskers attached to the lower and upper ends are arranged at the 5th and 95th percentiles, respectively. . The line in the box shows the median value.
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ２０をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ２０発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で４．０２であった。また、９５パーセンタイルが４．４７に、１０パーセンタイルが３．７０に、５パーセンタイルが３．６０にそれぞれ対応した。 When CD20 expressed in microvesicles in healthy human serum was labeled with a PE-labeled antibody, the median value of CD20 expression was 4.02 in common logarithmic notation with a logarithmic function base value of 10. The 95th percentile corresponds to 4.47, the 10th percentile corresponds to 3.70, and the 5th percentile corresponds to 3.60.
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ５９をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ５９発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で４．２７であった。また、９０パーセンタイルが５．１１に、９５パーセンタイルが５．２５に、５パーセンタイルが３．３１にそれぞれ対応した。 When CD59 expressed in microvesicles in healthy human serum was labeled with a PE-labeled antibody, the median value of CD59 expression was 4.27 in the common logarithm format with a logarithm function base value of 10. The 90th percentile corresponds to 5.11, the 95th percentile corresponds to 5.25, and the 5th percentile corresponds to 3.31.
健常者血清中の微小胞に発現しているＣＤ８１をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＣＤ８１発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．３０であった。また、９５パーセンタイルが３．７３に、１０パーセンタイルが３．０４に、５パーセンタイルが３．０２にそれぞれ対応した。 When CD81 expressed in microvesicles in healthy human serum was labeled with a PE-labeled antibody, the median value of CD81 expression was 3.30 in common logarithm with a logarithm function base value of 10. The 95th percentile corresponds to 3.73, the 10th percentile corresponds to 3.04, and the 5th percentile corresponds to 3.02.
健常者血清中の微小胞に発現しているＰＤ−Ｌ１をＰＥ標識抗体で標識した場合、ＰＤ−Ｌ１発現量の中央値は対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．２３であった。また、９０パーセンタイルが３．７０に、９５パーセンタイルが３．７３に、５パーセンタイルが２．９９にそれぞれ対応した。 When PD-L1 expressed in microvesicles in healthy human serum is labeled with a PE-labeled antibody, the median value of PD-L1 expression is 3.23 in common logarithm with a logarithm function base value of 10. Met. The 90th percentile corresponds to 3.70, the 95th percentile corresponds to 3.73, and the 5th percentile corresponds to 2.99.
これらの結果より、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ２０の発現量が低いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を基準値として、判断することができる。 From these results, it is possible to determine whether or not the expression level of CD20 in the microvesicle positive for CD20 is low, using the common logarithm display with the base value of the logarithmic function as 10. .
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ５９の発現量が高いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で５．１１を基準値として、判断することができる。 Further, whether or not the expression level of CD59 in the microvesicle positive for CD20 is high can be determined using 5.11 as a reference value in the common logarithmic display with the base value of the logarithmic function being 10.
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＣＤ８１の発現量が低いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．０４を基準値として、判断することができる。 Also, whether the expression level of CD81 in CD20 positive microvesicles is low or not can be determined using a common logarithm display with a base value of 10 as the base value of the logarithmic function and 3.04 as a reference value.
また、ＣＤ２０陽性である微小胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現量が高いか否かは、対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を基準値として、判断することができる。 Further, whether or not the expression level of PD-L1 in CD20-positive microvesicles is high can be determined using a common logarithm display with a base value of 10 in the logarithmic function and 3.70 as a reference value.
これら基準値を用いて、各タンパク質マーカーの発現量の高低を判定することができ、当該判定結果に基づいて、試験対象となる患者におけるリツキシマブに対する感受性の有無を判定することができる。 Using these reference values, the level of expression level of each protein marker can be determined, and based on the determination result, the presence or absence of sensitivity to rituximab in the patient to be tested can be determined.
実施例８：基準値に基づく患者のリツキシマブに対する感受性の有無の評価
上記実施例５の各タンパク質マーカー発現量の高低の結果、及び実施例７にて求めた基準値より、患者のリツキシマブに対する感受性は以下のとおり評価することができる：
・解析の結果において、ＣＤ２０の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０未満である場合、当該発現量は低いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＣＤ５９の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で５．１１を超える場合、当該発現量は高いと判断され、当該者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＣＤ８１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．０４未満である場合、当該発現量は低いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する；
・解析の結果において、ＰＤ−Ｌ１の発現量が対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で３．７０を超える場合、当該発現量は高いと判断され、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断する。
Example 8: Evaluation of presence / absence of sensitivity of patient to rituximab based on reference value From the results of the expression level of each protein marker in Example 5 above and the reference value obtained in Example 7, the sensitivity of patient to rituximab is The following can be evaluated:
In the result of analysis, when the expression level of CD20 is less than 3.70 in the common logarithm display with the base value of the logarithmic function being 10, the expression level is judged to be low, and the patient is sensitive to rituximab It is judged that it does not have
-In the analysis results, if the expression level of CD59 exceeds 5.11 in the common logarithm display with the base value of the logarithmic function as 10, the expression level is judged to be high, and the person is sensitive to rituximab. Judge not to have;
-In the result of analysis, when the expression level of CD81 is less than 3.04 in the common logarithm display with the base value of the logarithmic function being 10, the expression level is judged to be low, and the patient is sensitive to rituximab It is judged that it does not have
In the result of analysis, when the expression level of PD-L1 exceeds 3.70 in the common logarithm display with the base value of the logarithmic function being 10, the expression level is judged to be high, and the patient is compared with rituximab Judged not to be sensitive.
上記判定のいずれか一以上に該当する場合、当該患者はリツキシマブに対して感受性を有さないと判断することができる。 If any one or more of the above determinations are true, it can be determined that the patient is not sensitive to rituximab.
上記判定に基づいて、実施例６に記載のリンパ腫患者（Ｎｏ．２３及びＮｏ．３０）を評価した。 Based on the above determination, the lymphoma patients (No. 23 and No. 30) described in Example 6 were evaluated.
実施例６で得られた、各患者における各タンパク質マーカー発現量の測定値（中央値）を対数関数の底の値を１０とする常用対数表示で以下の表１に示す。 The measured value (median value) of each protein marker expression level in each patient obtained in Example 6 is shown in the following Table 1 in common logarithmic display with the base value of the logarithmic function being 10.
この結果、患者Ｎｏ．２３は上記判定のいずれにも該当しないことから、患者Ｎｏ．２３はリツキシマブに対して感受性を有することが示唆される。 As a result, patient no. 23 does not correspond to any of the above determinations. 23 is suggested to be sensitive to rituximab.
一方、患者Ｎｏ．３０は上記判定のうちＰＤ−Ｌ１の判定項目に該当することから、患者Ｎｏ．３０はリツキシマブに対して感受性を有さないことが示唆される。
この結果は、上記実施例６の判定結果に矛盾しない。
On the other hand, patient no. 30 corresponds to the determination item of PD-L1 among the above determinations. 30 is suggested to be insensitive to rituximab.
This result is consistent with the determination result of the sixth embodiment.
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