JP2017102032A - 光計測方法および装置 - Google Patents

Abstract

【課題】光を用いて被検物を計測する際の計測誤差を低減することができる技術を提供する。
【解決手段】本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得し、前記対応関係データと前記反射光の強度とを用いて前記被検物のサイズを取得する。また本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度を表す検出信号から、被検物の容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する。
【選択図】図１６

Description

本発明は、光を用いて被検物を計測する技術に関する。

近年、光を用いて観測対象の表面構造や内部構造を反映した画像を取得する光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）が注目を集めている。ＯＣＴは人体に対する侵襲性を持たないので、特に医療分野や生物学分野への応用が期待されており、眼科分野においては眼底や角膜などの画像を形成する装置が実用化段階に入っている。ＯＣＴ計測においては、光源からの光を、観測対象に照射して得られた信号光と、観測対象に照射せずに参照光ミラーで反射させる参照光とに２分岐し、観測対象から反射された信号光を参照光と合波させ干渉させることにより検出信号を得る。

ＯＣＴは、測定位置の光軸方向における走査方法により、大きくタイムドメインＯＣＴとフーリエドメインＯＣＴとに分けられる。タイムドメインＯＣＴにおいては、光源として低コヒーレンス光源を使用し、測定時に参照光ミラーを走査することにより光軸方向へ走査する。これにより信号光に含まれる参照光と光路長が一致する成分のみが干渉し、得られた干渉信号に対して包絡線検波を実施することにより、所望の信号が復調される。一方、フーリエドメインＯＣＴはさらに波長走査型ＯＣＴとスペクトルドメインＯＣＴとに分けられる。波長走査型ＯＣＴにおいては、出射光の波長を走査することが可能な波長走査型光源を使用し、測定時に波長を走査することにより光軸方向への走査がなされ、検出された干渉光強度の波長依存性（干渉スペクトル）をフーリエ変換することにより所望の信号が復調される。スペクトルドメインＯＣＴにおいては、広帯域光源を用い、生成された干渉光を分光器により分光し、波長成分ごとの干渉光強度（干渉スペクトル）を検出することが光軸方向への走査に対応している。得られた干渉スペクトルをフーリエ変換することにより所望の信号が復調される。
下記特許文献１には、対物レンズを物理的に走査するとともに、信号光と干渉光の干渉を位相条件の異なる４つの検出器で受光することにより、タイムドメインＯＣＴにおけるミラーの走査による参照光の位相調整を不要とする技術が開示されている。
下記特許文献２には、タンパク質試料の散乱角度分布と顕微鏡観察による粒子追跡を応用し、ブラウン運動による位置ゆらぎの測定結果を合わせて試料の粒径分布を計測する技術が開示されている。

ＵＳ２０１４／０２０４３８８ ＵＳ２０１４／０１５２９７８

ＯＣＴで計測が可能な生体組織の種類としては、細胞や組織、および細胞の生成物であるタンパク質の凝集体がある。計測項目としては、健康状態などによって変化する生体のマクロな組織構造、培養条件によって変化する細胞やその生成物であるタンパク質の凝集体の数、大きさなどがある。以下、本発明では観測対象である細胞や組織、および細胞の生成物であるタンパク質の凝集体を、単に細胞と呼ぶことにする。また、技術内容としては培養条件によって変化する細胞やその生成物であるタンパク質の凝集体の数、大きさなどの計測に着目して述べる。

一般に、培養された細胞の大きさは、これらの観測対象に対して透過率の高い波長領域、すなわち生体の窓と呼ばれる可視〜赤外のレーザ光の波長に比較して小さい。このため特許文献２に記載されるように、これらの大きさは散乱角度分布と粒子の拡散量の光学的な計測結果から最尤的な推定を実施して計測する方法が用いられている。

散乱角度分布を扱う理論としては良く知られたＭｉｅ散乱理論が採用されているが、一般に同理論はあらかじめ観測対象の光学的屈折率が既知であり、かつ観測対象の粒径が波長に比較して同程度以上に大きな場合を扱うものである。したがって例えば、観測対象の粒径が広範に分布する場合には、測定誤差が大きくなるという課題がある。

細胞に蛍光分子を付着させた後、励起レーザ光を照射し、蛍光分子から発せられる蛍光を顕微鏡で撮像し、画像処理によって粒子追跡・解析（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施して個別の粒子のブラウン運動による時間的な位置のゆらぎ量を測定する場合には、理論としてストークス−アインシュタインの式を用いた流体力学径を推定することになる。個別粒子の位置揺らぎを精度よく測定するためには、個別の観測対象に対する多くの計測データが必要となり、測定時間が長く必要であるという課題がある。また、レーザ波長よりも小さな細胞を観測するためには、蛍光分子を観測対象である細胞に付着させるという前処理が必要であり、処理時間、試薬コスト、および前処理条件による細胞の状態（特にタンパク質凝集体のサイズ）の変化の影響を受けて測定誤差が生じるという課題がある。

また、ＯＣＴを用いて細胞を測定する場合、一般的に観測対象からの反射光は観測対象と培養容器等との間の境界で発生する反射光に比較して極めて小さい。ＯＣＴを用いた計測においては、これらの反射光の和と参照光を干渉させることにより画像情報を取得するので、境界で発生する反射光（以下、境界反射光）は、観測対象の内部反射光の観測に対して、ノイズもしくはクロストークとして振る舞う。かかる境界反射光は、観測精度を低下させる不要光成分である。こうした境界反射光による観測精度の低下は、細胞の数や大きさ密度の計測値のバラツキとなる。

本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものであり、光を用いて被検物を計測する際の計測誤差を低減することができる技術を提供することを目的とする。

本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得し、前記対応関係データと前記反射光の強度とを用いて前記被検物のサイズを取得する。

また本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度を表す検出信号から、被検物の容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する。

本発明によれば、光を用いて被検物を計測する際に計測精度を低下させる要因を効果的に低減し、計測精度を高めることができる。上記した以外の課題、構成、効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

培養液で満たされた透明な容器内で培養された細胞を測定する様子を示す摸式図である。 境界反射の影響を計算した結果を示す。 容器と光軸が直交していない場合の摸式図である。 ｘｙ像に関するシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較したものである。 培養容器の境界に細胞が張り付いている場合の計算モデルである。 シミュレーション結果の１例である。 実施形態１における光計測方法を説明するフローチャートである。 図６とは別のシミュレーション結果の１例である。 検出信号のシミュレーション結果と本実施形態１に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。 実施形態２に係る光計測方法を説明するフローチャートである。 検出信号のシミュレーション結果と本実施形態２に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。 培養容器の境界に細胞が張り付いている場合の別の計算モデルを示す。 検出信号のシミュレーション結果の１例である。 実施形態３に係る光計測方法を説明するフローチャートである。 検出信号のシミュレーション結果と本実施形態３に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。 培養容器の境界から十分に離れた位置にそれぞれ大きさの異なる複数の細胞が存在する場合の計算モデルを示す摸式図である。 細胞の直径と信号強度の関係を示すシミュレーション結果である。 実施形態４に係る光計測方法を説明するフローチャートである。 異なる大きさの細胞に対して、焦点位置を変化させながらｘｙ走査により取得した２次元観察像を示すシミュレーション結果である。 焦点ずれと検出信号および細胞サイズの関係を示す摸式図である。 実施形態４に係る光計測方法の別例を示すフローチャートである。 実施形態５に係る光計測装置の構成を示す模式図である。 実施形態６に係る光計測装置の構成を示す模式図である。 実施形態６に係る光計測方法を説明するフローチャートである。

＜実施の形態１：境界反射光の影響について＞
本発明の理解を容易にするため、以下ではまず実施形態１の説明に先立ち境界反射光の影響により計測精度が低下することついて説明する。本発明の種々の効果を定量的に示すために光線追跡法に干渉効果を含めた計算法（以下、波動的光線追跡法）を用いるが、ここでは同時に、実験結果との対比によって波動的光線追跡法の精度について考察する。その後、本発明の実施形態１に係る構成について説明する。

図１は、培養液で満たされた透明な容器内で培養された細胞を測定する様子を示す摸式図である。培養液の屈折率を１．３３、細胞の屈折率を１．３８としたとき、フレネルの式により細胞核の反射率は約０．０３４％となる。一方、典型的な培養容器の屈折率を１．５９としたとき、培養容器と培養液もしくは細胞質との間の境界における反射率は０．７９％となり、1桁以上大きな強度の不要光が境界反射光として発生することが判る。実際には、細胞は３次元構造を有しているので、その表面の形状によって信号光が広がって反射される。したがって、１つの細胞により反射された光のうち信号光として検出されるものは、０．０３４％より小さくなり、境界反射光の影響はさらに大きくなる。

以下、本発明の記載においては図に記載したように、光軸方向をｚ軸にとる座標系に統一して説明を進める。

一般に、ＯＣＴで得られる検出信号Ｓは、信号光の複素振幅をＥ_ｓｉｇ、参照光の複素振幅をＥ_ｒｅｆとすると下記式１で表すことができる。θ_ｓｉｇおよびθ_ｒｅｆはそれぞれ信号光と参照光の光路長に基づく位相である。

次に境界反射光の振る舞いを定量化する。光源の波長をλ、対物レンズの開口数をＮＡ、培養容器と観測対象の境界位置をｚ＝０、対物レンズの焦点位置からのずれをｚとして、信号光に含まれるデフォーカス波面収差を考慮し、位相ダイバーシティ検出方式を実施した場合の検出信号Ｓ（ｚ）は、下記式２で表される。

図２は、境界反射の影響を計算した結果を示す。式１において、光源の波長λ＝７８０ｎｍ、対物レンズの開口数ＮＡ＝０．５２とし、上に示した各屈折率を用いて、観測対象がない（培養液だけが容器内に満たされている）条件で得られる検出信号Ｓを計算した。図２の横軸は対物レンズの焦点位置ｚを表している。図２に見られるように、境界反射光の影響は、境界だけにとどまらず、ｓｉｎｃ関数にしたがって細胞からなる観測領域にも広がっており、細胞からの反射信号に対して大きなクロストークを生じることが判る。以下、特に断らない限り、光源の波長は７８０ｎｍ、対物レンズの開口数は０．５２として統一して説明を進める。

特許文献１には、信号光および参照光の光路長に基づく位相を変化させる技術が開示されている。しかしこれら文献においては、観測対象からの反射光量に応じた検出信号を得ているので、図２に例示するような境界反射光の影響を低減することは困難であると考えられる。

図３は、容器と光軸が直交していない場合の摸式図である。一般に培養容器と光軸は必ずしも直交するとは限らない。こうした状況は、例えば図示しない容器フォルダーの機械的な精度や、プラスチック製の培養容器を利用した場合の培養容器の形成精度に応じて発生する。

図３中の走査方向に沿って対物レンズもしくは培養容器を走査しながら信号を取得する場合、ｘ方向の位置に応じて培養容器の境界と観測対象のｚ方向の距離が変化する。したがって、ｘ方向の走査位置に応じて境界反射光の影響の大きさが変化する。ここでは１次元走査の場合を示したが、一般的には光をｘｙ方向に２次元的に走査し計測結果として２次元画像を取得する。本実施形態１においては、培養容器と光軸が直交していない一般の場合を含めて、境界反射光の影響を低減し、細胞の数と大きさを高精度に計測することを目的とする。

本実施形態１においては、説明の簡素化のために特許文献１に記載のいわゆる位相ダイバーシティ検出方式によって検出信号を得る場合について記載する。ＯＣＴ装置は、信号光と参照光を合波した後、検出レンズにより光検出器に集光する光学系を用いる。光軸方向にｚ軸をとった場合、検出レンズの開口はｘｙ平面上に形成される。対物レンズの焦点のｚ座標をｚ、検出レンズのｚ座標をｚ_０とし、信号光と参照光の干渉を検出レンズの開口上の各点（ｘ，ｙ，ｚ_０）における干渉の重ね合わせとして定式化すると、検出信号Ｓは下記式３で表すことができる。

式３は、検出レンズ開口における信号光の空間分布、および参照光の空間分布を扱うように一般化した表現をしている。特許文献１において、参照光は平面波として光路長に基づく位相のみを考慮しているので、振幅Ａ、光路長Ｌを定数として下記式４で表される参照光Ｅ_ｒｅｆを用いている。（２π／λ）Ｌは参照光の光路長に基づく位相である。

信号光Ｅ_ｓｉｇは、境界反射光と複数の細胞からの反射光の和として、下記式５で表される。右辺第１項はデフォーカス波面収差を考慮した平面状の境界反射光を表す。Ｅ_ｂは振幅反射率、Ｒは検出レンズの開口半径である。右辺第２項は生体内の各組織からの反射光の和を表しており、各組織が３次元形状をもつことを反映して、境界反射光に比較して多くの波数成分を有する波動である。

式４と式５において、位相ダイバーシティ方式で検出する場合には、Ｌ＝０とすることができる。このとき、式５の右辺第２項をゼロとして、式４と式５を式３に代入し、Ｅ_ｂをＥ_ｓｉｇに書き直して整理した結果は、式２に一致する。

境界反射の影響を定量化するためには式３を数値的に解く手法が必要である。ここでは、モンテカルロ法を応用し光線追跡法を基本として、光線の軌跡から波面情報を抽出して干渉計算を可能とし、位相ダイバーシティ方式に対応したシミュレーション方法を開発した。基本的には、各光線に付随する情報として位置および速度情報に加えて、光路長に応じた位相情報および振幅に応じた強度情報を算出することによって、検出レンズの開口にて式３を数値的に解くことが可能となる。本方法では、（ａ）物体の表面における屈折による光線ベクトルの変化と、（ｂ）フレネルの法則に従う入射角度と偏光に依存した振幅反射率と透過率を算出する。以下、本方法を波動的光線追跡法と呼ぶことにする。

波動的光線追跡法の計算精度を検証するため、特許文献１の図４と同じ光学系のＯＣＴ装置（波長７８０ｎｍ、対物レンズ開口数０．５２）と、測定サンプルとして市販のポリスチレン製の擬似血球（屈折率役１．５９）を用いた試料を準備した。疑似血球は、屈折率が異なるが上に述べた細胞と同等の大きさをもっている。

図４は、ｘｙ像に関するシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較したものである。ここでは試料として、ガラス基板とカバーガラスの間に水と単層の疑似血球を分散させたものを用いた。シミュレーションは、疑似血球を直径１０μｍの球体として扱い、１３個の疑似血球を規則的に配置にした条件で実施した。

図４（ａ）は、１００ｘ１００μｍの領域を０．５μｍ間隔のメッシュ点で対物レンズの焦点位置を変えながら検出信号強度を計算した結果である。各メッシュ点の計算に用いた光線数は１００万である。疑似血球中央部は信号強度が低く、周辺が高い特性となっている。図４（ｂ）は、測定結果の一例である。図４（ａ）（ｂ）から、計算結果と測定結果の特性は概ね一致しており、波動的光線追跡法の計算によってＯＣＴの取得画像データの計算が可能なことが判る。また図４（ｂ）に見られるように、測定結果においてはｙ方向に画像の平均輝度が高い部分と低い部分が計測されているが、これは上に述べた容器面が光軸に対して斜めになっている影響である。

図５は、培養容器の境界に細胞が張り付いている場合の計算モデルである。ここでは培養容器の境界が光軸（ｚ軸）に直交していない場合を示す。このモデルにおいて、図５中に示すようにｘ方向に焦点位置を走査する場合を考える。

図６は、シミュレーション結果の１例である。ここでは、計算条件としては容器境界の傾きをｘｚに対して１／１００の比率とし、観測対象である細胞は直径１μｍでｘ方向に１０μｍ間隔で配置した。焦点のｚ位置は走査領域中央（ｘ＝０）における培養容器と細胞の境界位置で一定とした。その他の条件は前述と同じである。縦軸の信号強度は反射率に相当するものである。

図６に見られるように、信号強度は細胞位置に対応して合計１１個のピークを有するが、破線で示す境界反射レベルに対して＋側と−側にバラツキを持ったピークとなることが判る。これは、境界反射と細胞の下面および上面における反射光が波動的に干渉している影響であり、図４に示した疑似血球（直径１０μｍ）と比較して細胞の大きさが小さいことに起因して干渉の影響が顕著に表れたことによる。こうした計測信号または画像に対しては、固定の閾値を設けて計測信号を２値化することによって細胞を検出することは困難である。

＜実施の形態１：計測手順＞
図７は、本実施形態１における光計測方法を説明するフローチャートである。以下図７の各ステップについて説明する。

（図７：ステップＳ０１１）
ＯＣＴ装置の対物レンズの焦点位置ｚＦＰ＝ｚ０にセットし、検出光をｘｙ方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、ｘｙ平面上における観察像である２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を取得する。

（図７：ステップＳ０１２）
Ｉｍａｇｅ（ｘ，ｙ）に対して例えば２次関数による最小２乗フィッティングを実施することにより、境界反射信号レベルＬＳＦ（ｘ，ｙ）を求める。ＬＳＦ（ｘ，ｙ）は、図６における境界反射レベルを近似した関数に相当する。

（図７：ステップＳ０１３）
下記式６を用いて補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）を求める。補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）を用いることにより、検出信号から境界反射の影響を除去し、細胞から反射された＋値のピークを有する信号を得ることができる。

（図７：ステップＳ０１４）
適当な閾値を用いて細胞を同定し、その数を計測する。例えば閾値以上の信号値を有する箇所に細胞が存在しているものとみなし、その個数をカウントすることにより、細胞個数を計測することができる。

（図７：ステップＳ０１５）
（ａ）Ｉｍａｇｅ（ｘ，ｙ）、（ｂ）Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）、（ｃ）計測された細胞数のうち１つ以上を適宜選択し、例えばディスプレイ上で表示する。

図８は、図６とは別のシミュレーション結果の１例である。ここでは、計算条件として容器境界の傾きを図６の１０倍（ｘｚに対して１０／１００の比率）とした。細胞の直径は１μｍ、周期５μｍ、計算間隔０．５μｍ、焦点のｚ位置は図５と同様にｘ＝０における容器境界位置とした。図６に比較して容器境界の傾きが大きいため、ｘ値に対する容器境界の信号強度の変化、および細胞信号の変化が大きいことが確認される。

図９は、検出信号のシミュレーション結果と本実施形態１に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。ここでは１例として焦点のｚ位置をｘ＝０における容器境界位置から上側に２μｍずらした結果を示している。

図９（ａ）は、検出信号のシミュレーション結果である。容器境界の傾きの影響により、右端（ｘ方向＋側）では検出信号の反転が発生しており、左端（ｘ方向−側）では検出信号が小さくコントラストが低い結果となっている。

図９（ｂ）は、図７の手順にしたがって求めた補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）である。中央から右側に亘る領域において細胞のコントラストが向上し、検出が容易となるようなデータの質的改善が確認される。左端については良好な検出ができる状態とまでは言えないが、これは基板境界の傾きを１０／１００と大きくした影響であり、傾きが小さい場合には、図６のように細胞のピークが明瞭となるので、本方法により高精度に細胞の数を計測することができる。

＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係る光計測方法によれば、容器の境界から反射する信号の影響を低減することにより、細胞の数と大きさを高精度に計測することができる。

＜実施の形態２＞
図１０は、本発明の実施形態２に係る光計測方法を説明するフローチャートである。以下図１０の各ステップについて説明する。

（図１０：ステップＳ１０１）
ＯＣＴ装置の対物レンズの焦点位置ｚＦＰ＝ｚ０にセットし、検出光をｘｙ方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、ｘｙ平面上における観察像である２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を取得する。

（図１０：ステップＳ１０２）
下記式７を用いて補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）を求める。式７は、点（ｘ，ｙ）の周辺領域（Δｘ，Δｙ）における検出信号の平均値をＩｍａｇｅ２から減算した後に絶対値を取得するものである。実施形態１とは異なり周辺領域における検出信号の平均値を減算するのみであるため、実施形態１と比較して少ない演算量で境界反射の影響を除去することができる。補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）は、実施形態１と同様に細胞から反射された＋値のピークを有する信号となる。ここでΔｘ，Δｙの値としては概略、観測対象である細胞の大きさよりも大であって、観測対象の密度（濃度）より定まる平均的な細胞間の距離よりも小とすることが望ましい。

（図１０：ステップＳ１０３〜Ｓ１０４）
これらステップは、実施形態１のステップＳ０１４〜Ｓ０１５と同様である。

図１１は、検出信号のシミュレーション結果と本実施形態２に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。計算条件は図９と同じであり、Δｘ＝Δｙ＝４μｍとしている。

図１１（ａ）は、検出信号のシミュレーション結果である。図１１（ｂ）は、図１０の手順にしたがって求めた補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）である。図９（ｂ）に比較して、左端（ｘ方向−側）におけるコントラストが大幅に改善されていることが判る。

一方、細胞の位置を表す信号ピーク周辺にリング状の明るい領域が伴っている。これは周辺領域の検出信号平均を減算するという性質上避けられない。しかし、ピークからリングまでの距離は（Δｘ，Δｙ）に基づいて算術的に定まるので、パターンマッチング等を利用した閾値処理によって、容易に細胞箇所を特定することができる。また、細胞位置中央の輝点と周辺のリングはともに細胞からの検出信号により生じるものなので、例えばデコンボリューション処理によってリングを消すことができる。これらの処理は、ＯｐｅｎＣＶに代表される汎用画像処理ツールなどを用いて容易に実施することができる。

＜実施の形態２：まとめ＞
本実施形態２に係る光計測方法は、実施形態１に比較して最小２乗法などによる境界面のフィッティングを実施しないので、演算量を小さく抑えることができる。またコントラストの低い検出信号に対する改善量が大きい利点がある。

＜実施の形態３＞
本発明の実施形態３では、検出光の光軸方向における焦点位置が異なる複数の検出結果を取得し、それら検出結果を組み合わせて用いることにより被検物を計測する手法について説明する。

図１２は、培養容器の境界に細胞が張り付いている場合の別の計算モデルを示す。実施形態１〜２と同様に、ｘ＝０における培養容器の境界位置をｚ＝０とする座標系をとる。ｚ軸は光軸に平行としている。このモデルにおいて、図１２中に破線で示すように、ｚ軸方向における２つ以上の焦点位置をセットし、各焦点位置において検出光をｘ方向へ走査して検出信号を取得する。

図１３は、検出信号のシミュレーション結果の１例である。ここでは対物レンズの焦点位置ｚＦＰ＝−２μｍ、−１μｍ、０μｍ、＋１μｍ、＋２μｍの５つの条件におけるｘと検出信号の関係を示している。基板境界の傾きは図６と同じ値（ｘｚに対して１／１００の比率）とした。細胞の直径は１μｍ、周期１０μｍ、計算間隔０．５μｍである。

境界反射信号レベルに着目すると、ｚＦＰ＝０μmの場合にはｘ軸に対して対称な特性であり、ｚＦＰが正の場合には右上がり単調増加の特性であり、ｚＦＰが負の場合には右下がりの単調減少の特性であることが判る。さらにｚＦＰ＝±１μｍの組、±２μｍの組はそれぞれｘ軸に対して反対称となっていることが判る。これらは式２および図２に示したＳｉｎｃ関数型のｚ方向の選択性がｚ軸に対して偶関数であることを反映したものとなっている。細胞からの反射光に対応するピークは境界面での反射光との干渉の影響によって正負のピークとなることは実施形態１〜２と同様である。

２つ以上のｚＦＰによる計測結果（例えば、ｚＦＰ＝±１μｍの組）を利用することにより、ｚＦＰの増加に対して検出光が右下がり特性から右上がり特性に変化することを認識すれば、培養容器の境界が右上がりの傾斜を有することが分かる。また、これらの検出信号のｘ方向への増加率／減衰率と式２のＳｉｎｃ関数を利用することにより、容器境界の傾斜量を計測することができる。細胞の反射光に対応する正負のピークの大きさは、容器境界からの反射光に対応する検出信号の大きさと同様にｚＦＰの絶対値が大きくなる（すなわち焦点が観測対象からずれる）のにしたがって減少する特性となっていることにも留意する必要がある。この点については後述のステップＳ１４３で説明する。

図１４は、本実施形態３に係る光計測方法を説明するフローチャートである。以下図１４の各ステップについて説明する。

（図１４：ステップＳ１４１）
ＯＣＴ装置および測定条件を初期化するとともに補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）をゼロクリアし、ｎ＝１に初期化する。ｎはループカウンタであり、各ループにおいてそれぞれ異なる焦点位置（ｚ方向）をセットしてｘｙ像を取得する。

（図１４：ステップＳ１４２）
ＯＣＴ装置の対物レンズの焦点位置をｎ回目の指定値にセットし（ｚＦＰ＝ｚｎ）、ｘｙ走査により信号強度の２次元データＩｍａｇｅｎ（ｘ，ｙ）を取得する。

（図１４：ステップＳ１４３）
本実施形態３においては、焦点位置が異なる複数の検出信号を組み合わせて用いる。しかし図１３に例示するように、焦点位置が観測対象からｚ方向に向かってずれるのにともない、信号ピークが減少する。そこで本ステップにおいては、各焦点位置の信号ピークを互いに揃えるため、計測データを規格化したＮｏｒｍＩｍａｇｅｎ（ｘ，ｙ）を求める。規格化方法としては、（ａ）検出信号の強度の最大値を所定値に揃える方法、（ｂ）検出信号の強度の平均値を所定値に揃える方法、などを用いることができる。図１４においては最大値を用いる方法を例示した。

（図１４：ステップＳ１４４〜Ｓ１４５）
最小２乗フィッティングなどを用いて、容器境界から反射された検出信号ＮｏｒｍＬＳＦｎ（ｘ，ｙ）を求める（Ｓ１４４）。式６を用いて補正信号強度ＮｏｒｍＩｍａｇｅ２ｎ（ｘ，ｙ）を求める（Ｓ１４５）。

（図１４：ステップＳ１４６）
ｚ方向における焦点位置が細胞の位置に合っているとき、検出信号は最大になると考えられる。そこで本ステップにおいて、各焦点位置の検出信号のなかで最大値を残す。具体的には、Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）とＮｏｒｍＩｍａｇｅ２ｎ（ｘ，ｙ）を比較して値の大きい方をＩｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）に格納する。

（図１４：ステップＳ１４７〜Ｓ１４９）
ループカウンタの最大値Ｎに到達していない場合はステップＳ１４２に戻る（Ｓ１４７）。到達した場合は、実施形態１のステップＳ０１４〜Ｓ０１５と同様の処理を実施する（Ｓ１４８〜Ｓ１４９）。

図１５は、検出信号のシミュレーション結果と本実施形態３に係る計測方法を実施した結果を示すｘｙ像の例である。計算条件は図９および図１１と同じとし、容器境界の傾きはｘｚに対して１０／１００の比率とした。細胞の直径は１μｍ、周期５μｍ、計算間隔０．５μｍ、焦点のｚ位置は５つ（ｚＦＰ＝−２μｍ、−１μｍ、０μｍ、＋１μｍ、＋２μｍ）とした。計測数Ｎ＝５である。強度の最大値を輝度２５５として計測データを規格化した。

図１５（ａ）は、検出信号のシミュレーション結果である。図１５（ｂ）は、図１４の手順にしたがって求めた補正信号強度Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ）である。計測領域全域で明瞭なコントラストの信号が得られることが判る。図９（ｂ）および図１１（ｂ）と比較すると、本方法が最も高精度に細胞の数を計測することができると言える。

＜実施の形態３：まとめ＞
本実施形態３に係る光計測方法は、対物レンズの焦点位置が異なる２つ以上の検出信号データセットを取得することにより、容器境界の傾斜量と傾斜の向きを検出することができる。容器境界の傾斜量は一定であるので、２つ以上の焦点位置による計測結果を組み合わせて用いることにより、例えば図１に示したｘｙ像の最小２乗フィッティングの精度を向上することができる。

＜実施の形態４＞
本発明の実施形態４では、実施形態３と同様に検出光の光軸方向における焦点位置が異なる複数の検出結果を取得し、それら検出結果を用いて被検物のサイズを計測する手法について説明する。

図１６（ａ）は、培養容器の境界から十分に離れた位置にそれぞれ大きさの異なる複数の細胞が存在する場合の計算モデルを示す摸式図である。ここでは、細胞の中心位置をｚ＝０とする座標系をとる。このモデルにおいて、図中に破線で示すように、ｚ軸方向における２つ以上の焦点位置をセットし、各焦点位置において検出光をｘ方向へ走査して検出信号を取得する。

図１６（ｂ）は、本発明のＯＣＴ装置で計測した信号の摸式図を示す。細胞の大きさが光源の波長／対物レンズ開口数で定まる光スポットサイズに比較して小さい場合、取得される信号は細胞のサイズに応じた最大値を持ち、半値幅がスポットサイズに概略等しいガウス分布状の特性となる。したがって、光スポットサイズと同等かそれより小さい観測対象の大きさは、得られる信号の最大値によって定量化することが可能である。本実施例では、細胞のサイズに応じた信号の最大値を予めデータベースやテーブルとして保持し、光スポットをｘ、ｙ、ｚ方向に走査して、光スポットの中心が細胞の中心に概略一致した場合に得られる信号の最大値を細胞ごとに決定して前記データベースと比較することによって、光スポットと同等か小さな細胞の大きさを計測する方法について説明する。

図１７は、細胞の直径と信号強度の関係を示すシミュレーション結果である。細胞の大きさに依存して入射側表面と裏面における反射光の干渉が発生するが、ここでは細胞の大きさによる依存性のみを説明するため、光は細胞の入射側表面（レンズに近い側の半球面）でのみ反射する場合について計算した結果を示す。レンズの焦点位置はｚ＝０としている。計算結果から、信号強度は細胞サイズ（＝直径）に依存して増加することが判る。なお、図中に併記しているように、こうした特性は光スポットサイズの２〜３倍程度まで連続した特性として利用可能である。

光源の波長λ＝０．７８μｍ、対物レンズの開口数ＮＡ＝０．５２としたとき、焦点面における光スポットの大きさはλ／ＮＡ＝１．５μｍとなる。観測する細胞の大きさが光スポットの大きさよりも大きい（すなわち略１．５μｍよりも大きい）場合、細胞の大きさは検出信号の強度の半値幅などを用いて計測する。観測する細胞の大きさが光スポットの大きさよりも小さい（すなわち略１．５μｍよりも小さい）場合、ｘ方向に走査して得られる検出信号の強度はガウス分布状となり、細胞の大きさを半値幅などによって計測することはできない。これに対し、図１７に示すように検出信号の強度の最大値は細胞サイズによって定まるので、半値幅に依拠することなく細胞サイズを計測することができる利点がある。

図１８は、本実施形態４に係る光計測方法を説明するフローチャートである。本フローチャートの前提として、あらかじめ図１７で説明した信号強度と細胞サイズとの間の対応関係を校正データとして取得しておくこととする。以下図１８の各ステップについて説明する。

（図１８：ステップＳ１８１〜Ｓ１８３）
ステップＳ１８１〜Ｓ１８２は、図１４のステップＳ１４１〜Ｓ１４２と同様である。ループカウンタの最大値Ｎに到達していない場合はステップＳ１８２を繰り返し、到達した場合はステップＳ１８４へ進む（Ｓ１８３）。

（図１８：ステップＳ１８４〜Ｓ１８５）
観測対象である細胞は、必ずしも静止している訳ではなく、ブラウン運動等により常に微小量の移動を乱雑に繰り返している。そこで、いわゆる物体認識アルゴリズムを用いて観測対象を追跡し（Ｓ１８４）、個々の細胞ごとに焦点ずれと検出信号の大きさの変化に基づき検出信号の最大値を抽出する（Ｓ１８５）。

（図１８：ステップＳ１８５：補足）
検出信号の最大値を求める方法としては、（ａ）機械的な最大値を求める方法、（ｂ）多項式近似と最小２乗法用いてブラウン運動による位置揺らぎを織り込んだ最尤的なフィッティングを実施して最大値を求める方法、を用いることができる。前者は簡便さに優れるが、ｚ方向の焦点移動ステップ量を式２で定まる焦点深度（概ね波長程度）よりも十分に小さくする必要がある。後者は、観測データを全て有効に用いるため、演算は煩雑になるがｚ方向の焦点移動ステップ量が前者に比較して大きくても構わない点が優れている。

（図１８：ステップＳ１８６）
検出信号の最大値を用いて、図１７で例示した校正テーブルを参照することにより、細胞サイズを同定する。検出信号の最大値は主としてその屈折率に応じて変化するので、あらかじめ既知のサイズの細胞試料から求めた検出信号に基づいて校正テーブルを作成しておくとよい。校正テーブルの別の作成方法としては、例えば比重測定、元素分析、光散乱特性等の従来の評価方法に基づいてマクロな屈折率を求め、前述の計算方法、もしくは従来のＦＤＴＤ（Ｆｉｎｉｔｅ Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｏｍａｉｎ）法等の計算方法を用いて数値的に求めた結果を利用することもできる。

（図１８：ステップＳ１８７）
画像化した検出信号と計測した細胞サイズおよびサイズ分布を適宜選択して、ディスプレイなどに表示する。

レンズの焦点位置と観測する細胞の中心位置は必ずしも一致しないので、計測結果から直接図１７の関係を用いて細胞の大きさを計測することが困難である場合も考えられる。そこで以下では、本実施形態４の別例として、実施形態３と同様に複数の焦点位置における計測結果を組み合わせて細胞の大きさを計測する方法を説明する。

図１９は、異なる大きさの細胞に対して、焦点位置を変化させながらｘｙ走査により取得した２次元観察像を示すシミュレーション結果である。ここでは、細胞の直径としてｘ方向左から０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、１．５μｍとしている。ｙ方向の細胞サイズは同じである。細胞と細胞の間隔はｘ、ｙ方向にそれぞれ５μｍとしている。本発明の骨子の理解を簡便にするため、ここでは図１９の結果を反映して各細胞に対する検出信号強度はｚ＝０における最大信号強度で規格化している。

図１９（ａ）から（ｆ）はそれぞれレンズの焦点位置ｚＦＰ＝０、−０．１、−０．２、−０．５、−１．０、−１．５μｍにおけるシミュレーション結果である。これらから、細胞サイズが小さい場合には焦点位置のずれに対して検出信号の強度の減衰が大きく、焦点付近でのみ明瞭なコントラストのデータが取得できるのに対して、細胞サイズが大きい場合には、焦点位置のずれに対して検出信号の強度の減衰が小さく、焦点ずれが大きい条件でも細胞からの検出信号が得られることが判る。この関係を利用すれば、２つ以上の焦点位置における計測結果から、焦点位置ずれに対する検出信号の減衰率を求めることによって、細胞サイズを定めることができる。

図２０は、焦点ずれと検出信号および細胞サイズの関係を示す摸式図である。図２０（ａ）は、小さな細胞に対して焦点ずれがある場合の光学系を幾何的に示すものである。細胞のｚ位置における幾何的なビームサイズは、対物レンズの開口数と焦点ずれ量によって幾何的に定まる。幾何的ビームの面積内における細胞の投影面積の比率に応じて、検出信号が減衰する。この投影面積の比は反応断面積に相当するものであるので、細胞サイズが小さい場合は図２０（ｂ）に示す細胞サイズが大きい場合に比較して、反応断面積が小さくなる。したがって、細胞サイズに応じて検出信号の減衰率が異なることになる。

図２０（ｃ）は、検出信号の減衰率と細胞サイズの関係を模式的に示す図である。波動的光線追跡によるシミュレーションは光線追跡法に基づくので、Ｍｉｅ散乱やＲａｙｌｅｉ散乱を正確に扱うことはできないが、焦点ずれが大きくなった場合の反応断面積は幾何的近似に漸近することは自明である。あらかじめ、図２０（ｃ）の関係を実際の観測対象に対して測定して取得した校正データを用意しておき、焦点位置のずれに対する検出信号の減衰を測定することにより、細胞サイズを同定することができる。

図２１は、本実施形態４に係る光計測方法の別例を示すフローチャートである。本フローチャートの前提として、あらかじめ図１９〜図２０で説明した対応関係を校正データとして取得しておくこととする。以下図２０の各ステップについて説明する。

（図２１：ステップＳ２１１〜Ｓ２１４）
これらステップは、図１８で説明したステップＳ１８１〜Ｓ１８４と同様である。

（図２１：ステップＳ２１５〜Ｓ２１６）
個々の細胞ごとに焦点ずれと検出信号の大きさの変化を抽出する（Ｓ２１５）。取得した検出信号の減衰率と焦点ずれ量を用いて、図２０（ｃ）に例示した校正データを参照することにより、細胞のサイズを同定する（Ｓ２１６）。

（図２１：ステップＳ２１７）
画像化した検出信号と計測した細胞サイズを適宜選択して、ディスプレイなどに表示する。

＜実施の形態４：まとめ＞
本実施形態４に係る光計測方法により、細胞へ蛍光分子を付着する処理を実施することなく、非侵襲的に直接細胞の大きさや分布を測定することができる。

＜実施の形態５＞
図２２は、本発明の実施形態５に係る光計測装置の構成を示す模式図である。光源５０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ５０２によって平行光に変換され、光学軸方向を調整可能なλ／２板５０３によって偏光を回転させられた後、偏光ビームスプリッタ５０４によって信号光と参照光に２分岐される。偏光ビームスプリッタ５０４によって反射された信号光は光学軸方向が水平方向に対して約２２．５に設定されたλ／４板５０５を透過して偏光状態をｓ偏光から円偏光に変換された後、対物レンズ５０６によって観測対象５０８に集光して照射される。対物レンズ５０６は対物レンズアクチュエータ５０７によってｘｚ方向に走査が可能であり、観測対象５０８は図示しない可動ステージによりｙ方向に移動可能である。こうした構成によって観測対象に対して対物レンズの焦点位置がｘｙｚ方向への走査がなされる。

観測対象から反射された信号光は対物レンズ５０６を透過し、λ／４板５０５によって偏光状態を円偏光からｐ偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ５０４へ入射する。参照光はλ／４板５０９を透過し、偏光状態をｐ偏光から円偏光に変換され、ミラー５１０により反射された後、λ／４板５０９によって偏光状態を円偏光からｓ偏光へ変換されて偏光ビームスプリッタ５０４へ入射する。信号光と参照光は偏光ビームスプリッタ５０４によって合波され、合成光が生成される。合成光はハーフビームスプリッタ５１２、λ／２板５１３、λ／４板５１４、検出レンズ５１５、５１６、ウォラストンプリズム５１７、５１８から成る干渉光学系５１１へ導かれる。干渉光学系５１１へ入射した合成光は、ハーフビームスプリッタ５１２によって透過光と反射光に２分岐される。

透過光は、光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板５１３を透過した後、検出レンズ５１５によって集光され、ウォラストンプリズム５１７によって偏光分離されることにより互いに位相関係が１８０度異なる第１干渉光と第２干渉光が生成される。第１干渉光と第２干渉光は電流差動型の光検出器５１９によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号５２１が出力される。

反射光は、光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板５１４を透過した後、検出レンズ５１６によって集光され、ウォラストンプリズム５１８によって偏光分離されることにより、互いに位相関係が約１８０度異なる第３干渉光と第４干渉光が生成される。第３干渉光は第１干渉光に対して位相が約９０度異なる。第３干渉光と第４干渉光は電流差動型の光検出器５２０によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号５２２が出力される。

差動出力信号５２１、５２２（以下、Ｉ、Ｑと称する）は信号処理部５２３に入力され、演算処理を施される。画像化信号５２４を元に形成された観測対象からの反射光に対応した検出信号、および実施例１から４の方法にしたがって計測した細胞の数や大きさは、画像および数値データとして表示部５２５に表示される。

仮想開口１５０は、偏光ビームスプリッタ５０４によって合波された信号光と参照光の光束に検出レンズ５１５および５１８の開口を投影した実体のない仮想的な検出レンズ開口を表しており、前述の検出レンズ開口と等価なものである。

干渉光学系５１１の動作原理は、特許文献１に記載されたいわゆる位相ダイバーシティ検出法を実装したものである。説明の簡略化のために詳細は省略するが、差動信号ＩおよびＱは下記式８〜式９で表される。ｘｙは仮想開口１５０上の位置、Ｅ_ｓｉｇは観測対象５０８から反射された信号光の複素電場振幅、Ｅ_ｒｅｆは参照光の複素電場振幅、φ_ｓｉｇおよびφ_ｒｅｆは光源５０１から仮想開口１５０までの光路長に対応する信号光と参照光の位相をそれぞれ表しており、積分は仮想開口上の信号光と参照光の相関積分を意味している。

検出信号Ｓは、φ_ｓｉｇ、φ_ｒｅｆに依らず下記式１０で求めることができる。式１０が式３と等価であることは言うまでもない。

＜実施の形態６＞
一般に２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）の取得は光学システムを用いて式１に示した信号をＡＤ変換器によりデジタル値として取得する。実施形態１〜５においては、２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）の取得は１回であるので、ＡＤ変換器の出力が飽和しないようにゲインを設定すると、信号強度が小さい部位において十分な分解能が得られない場合がある。こうした場合には、２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を複数回取得しながら、積算することによって、実効的にＡＤ変換器の分解能とＳＮＲを向上する方法が有効である。例えば、ＡＤ変換器が８ビット（２５６レベル）の場合、６４回取得によって積算された２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）は実効的に１４ビット（１６３８４レベル）とすることができ、十分な分解能とＳＮＲを確保することが可能になる。ただし、６４回連続で２次元データを取得するためには計測時間が長くなり、この間に観測対象である細胞がブラウン運動等によって大きく移動すると、積算された２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）の信頼性が失われる。そこで本発明の実施形態６では、主としてＡＤ変換器の実効的な分解能を向上する方法について示す。

図２３は、本実施形態６に係る光学計測装置の摸式図である。光学系６００から出射したレーザ光は観測対象５０８に照射され、反射光は光学系６００内で信号７００として検出される。信号７００はゲイン切替器７０１によって指定された増幅率によって増幅され、ＡＤ変換器７０２によってデジタル値に変換された後、信号処理部５２３において図示しない可動ステージによりｙ方向に移動可能である。こうした構成によって２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）として取得され、表示部５２５はその画像を表示する。

図２４は、本実施形態６に係る光計測方法を説明するフローチャートである。以下図２４の各ステップについて説明する。

（図２４：ステップＳ２４１）
ＯＣＴ装置の信号のゲインを標準値に設定する。これは図２３に示したゲイン切替器７０１に対して標準のゲインを選択することに相当する。
（図２４：ステップＳ２４２）
ＯＣＴ装置の対物レンズの焦点位置ｚＦＰ＝ｚ０にセットし、検出光をｘｙ方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、ｘｙ平面上における観察像である２次元データＩｍａｇｅＮ（ｘ，ｙ）を取得する。

（図２４：ステップＳ２４３）
ＯＣＴ装置の信号のゲインを標準値のＧ倍に設定する。これは図２３に示したゲイン切替器７０１に対して標準ゲインのＧ倍を選択することに相当する。

（図２４：ステップＳ２４４）
ＯＣＴ装置の対物レンズの焦点位置を同様にｚＦＰ＝ｚ０にセットし、検出光をｘｙ方向に走査することにより得られる信号強度を用いて、ｘｙ平面上における観察像である２次元データＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）を取得する。

（図２４：ステップＳ２４５）
取得したＩｍａｇｅＮ（ｘ，ｙ）およびＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）から信号強度が小さい部位の分解能を向上したＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を合成する。ＡＤ変換器の出力の最大値をＭＡＸ＿ＶＡＬとすると、例えばＡＤ変換器が８ビットの場合にはＭＡＸ＿ＶＡＬ＝２５５である。本ステップにおいては、ＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）＜ＭＡＸ＿ＶＡＬ、すなわち高ゲインで取得したデータが飽和していない場合には、Ｉｍａｇｅ（ｘ，ｙ）＝１／Ｇ×ＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）として、高ゲイン条件で取得したデータをゲイン補正して採用する。一方、高ゲインで取得したデータが飽和している場合（ＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）≧ＭＡＸ＿ＶＡＬ）には、標準ゲインの取得データを採用し、Ｉｍａｇｅ（ｘ，ｙ）＝ＩｍａｇｅＮ（ｘ，ｙ）とする。以上により信号が小さい領域において分解能を向上した２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を２回の測定で取得することができる。

本方法によって取得した２次元データＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）を例えば図１０のステップＳ１０１や図１４のＳ１４２や図１８のＳ１８２等で取得するものに置き換えることによって、分解能を向上したデータを利用した高精度の細胞の大きさと位置の計測が可能になる。なお、Ｉｍａｇｅ（ｘ，ｙ）として、例えば整数を用いる制御プログラムを実装する場合には、飽和がないときにＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）＝ＩｍａｇｅＨ（ｘ，ｙ）、飽和があるときＩｍａｇｅ（ｘ，ｙ）＝Ｇ×ＩｍａｇｅＮ（ｘ，ｙ）とすればよい。

＜本発明の変形例について＞
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

本発明の光計測方法および装置は、ＯＣＴのもつ焦点方向への反射光の選択性と物体からの多重反射による干渉性を利用して、細胞の数および大きさを計測するものである。良く知られているように、同様な焦点方向への選択性は共焦点顕微鏡においても得られるので、本発明の光計測方法は共焦点顕微鏡装置に対しても適応することができる。

以上の実施形態においては、検出光の焦点位置を走査することを説明したが、観測対象を走査することによっても同様な結果が得られるので、どちらを選択するかは装置構成により任意に決めることができる。

実施形態４は細胞サイズの測定に特化して説明したが、例えば実施形態１〜３で説明した方法を実施形態４と併せて実施することもできる。これにより、細胞の数を同時に計測することもできる。細胞以外の被検物のサイズや個数を計測する場合においても、本発明を適用することができる。

信号処理部５２３は、その一部や全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。あるいは、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリ、ハードディスク、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｒｉｖｅ）等の記録装置、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に格納することができる。

１５０：仮想開口
５０１：光源
５０２：コリメートレンズ
５０３、５１３：λ／２板
５０４：偏光ビームスプリッタ
５０５、５０９、５１４：λ／４板
５０６：対物レンズ
５０７：対物レンズアクチュエータ
５０８：観測対象
５１０：ミラー
５１１：干渉光学系
５１２：ハーフビームスプリッタ
５１５、５１６：検出レンズ
５１７、５１８：ウォラストンプリズム
５１９、５２０：電流差動型の光検出器
５２３：信号処理部
５２５：表示部

Claims (13)

1. 光を集光して光スポットを生成し、前記光スポットのサイズの略３倍以下の被検物を計測する光計測方法であって、
   少なくとも前記光の焦点位置を光軸方向に動かしながら前記被検物に対して照射することにより前記被検物から反射される反射光を検出する信号取得ステップ、
   前記反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得するステップ、
   前記反射光の強度を用いて前記対応関係データを照会することにより前記被検物のサイズを取得するサイズ算出ステップ、
   を有することを特徴とする光計測方法。
2. 前記信号取得ステップにおいては、各前記焦点位置における前記反射光の強度のうち最も大きい最大信号値を取得し、
   前記サイズ算出ステップにおいては、前記最大信号値を用いて前記対応関係データを照会することにより前記被検物のサイズを取得する
   ことを特徴とする請求項１記載の光計測方法。
3. 前記対応関係データは、前記焦点位置が前記被検物の中心からずれている量を表すずれ量、前記ずれ量に応じて前記反射光の強度が減衰する量、および前記被検物のサイズの間の対応関係を記述しており、
   前記信号取得ステップにおいては、前記焦点位置を前記光軸方向においてずらすことにより前記反射光の強度が減衰する量を表す減衰量を取得し、
   前記サイズ算出ステップにおいては、前記信号取得ステップにおいて前記減衰量を取得する際に前記焦点位置をずらした量と前記減衰量を用いて、前記対応関係データを照会することにより、前記被検物のサイズを取得する
   ことを特徴とする請求項１記載の光計測方法。
4. 前記信号取得ステップにおいては、容器上に載置された被検物に対して前記光を照射することにより前記容器と前記被検物からそれぞれ反射される反射光を検出し、
   前記光計測方法はさらに、
   前記反射光の強度を表す検出信号から、前記容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する補正ステップ、
   前記容器の傾きを補正した後の前記検出信号を用いて前記被検物を計測する計測ステップ、
   を有することを特徴とする請求項１記載の光計測方法。
5. 光を用いて被検物を計測する光計測方法であって、
   容器上に載置された被検物に対してレーザ光を照射することにより前記容器と前記被検物からそれぞれ反射される反射光を検出する信号取得ステップ、
   前記反射光の強度を表す検出信号から、前記容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する補正ステップ、
   前記容器の傾きを補正した後の前記検出信号を用いて前記被検物を計測する計測ステップ、
   を有することを特徴とする光計測方法。
6. 前記補正ステップにおいては、前記検出信号から、前記容器と前記被検物の境界部分において反射された反射光の成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する
   ことを特徴とする請求項５記載の光計測方法。
7. 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
   前記補正ステップにおいては、前記信号曲線を近似する近似曲線を算出し、前記近似曲線を前記信号曲線から減算することにより、前記容器の傾きを補正する
   ことを特徴とする請求項６記載の光計測方法。
8. 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
   前記補正ステップにおいては、第１照射位置から第２照射位置までにおける前記検出信号の平均値を前記検出信号から減算することにより、前記容器の傾きに起因する成分を前記検出信号から減算する
   ことを特徴とする請求項５記載の光計測方法。
9. 前記信号取得ステップにおいては、光軸方向における焦点位置がそれぞれ異なる複数の前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより前記被検物から反射される反射光をそれぞれ検出し、
   前記補正ステップにおいては、各前記焦点位置における前記検出信号から前記容器の傾きに起因する成分を減算した値の絶対値を求めることにより、前記容器の傾きを補正し、
   前記計測ステップにおいては、各前記焦点位置における前記絶対値のなかの最大値を用いて前記被検物を計測する
   ことを特徴とする請求項５記載の光計測方法。
10. 前記信号取得ステップにおいては、前記光軸方向に対して直交する方向に照射位置を走査しながら前記レーザ光を前記被検物に対して照射することにより、前記照射位置と前記検出信号との間の対応関係を表す信号曲線を取得し、
    前記補正ステップにおいては、各前記焦点位置における前記信号曲線の最大値を規格化した後、前記信号曲線を近似する近似曲線を算出し、前記近似曲線を前記信号曲線から減算することにより、前記容器の傾きを補正する
    ことを特徴とする請求項９記載の光計測方法。
11. 前記計測ステップにおいては、前記検出信号が所定閾値以上であるか否かに基づき前記被検物の個数をカウントし、その結果を出力する
    ことを特徴とする請求項５記載の光計測方法。
12. 前記信号取得ステップは、
    所定の標準ゲイン値を適用した上で前記反射光の強度を表す第１強度信号を取得するステップ、
    前記標準ゲイン値よりも大きいゲイン値を適用した上で前記反射光の強度を表す第２強度信号を取得するステップ、
    前記第２強度信号が所定の上限値を超えていない場合は前記第２強度信号を前記検出信号として採用し、超えている場合は前記第１強度信号を前記検出信号として採用するステップ、
    を有することを特徴とする請求項５記載の光計測方法。
13. 光を用いて被検物を計測する光計測装置であって、
    レーザ光を被検物に対して照射する光源、
    前記被検物から反射される反射光を検出する検出器、
    請求項１から１２のいずれか１項記載の光計測方法を実施するプロセッサ、
    を備えることを特徴とする光計測装置。

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