JP2016519144A - 最小限の単量体の分離を伴う組換えポリクローナル多量体の分離 - Google Patents

Abstract

本発明は、単量体の比を狭い範囲内に維持しながら、組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）の製剤から多量体を除去する方法を提供する。本発明は、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの分離プロセスに付すことにより、実質的に多量体を含まない抗体単量体製剤を製造するステップを含む方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）の製剤からの抗体多量体（多量体）の分離に関する。

組換え生物製剤中の様々な多量体の制御は、このような種が、潜在的に安全及び免疫原性上の懸念をもたらすことから、関心を集めている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓ．（２００６）ＡＡＰＳＪ ８：５９；Ｇ．Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：５５５；Ｃｏｒｄｏｂａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．（２００８）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｉｎｔ．２１：４４）。組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）について、多量体の分離は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて達成されることが多く、その場合、最終抗体製剤の単量体純度は、往々にして９９％を超える（Ｓｕｄａ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１２１６：５２５６；Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１１７５：６９；Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４２１）。ヒト血漿から得られるポリクローナルＩｇＧ製剤の場合、ＩｇＧ多量体のレベルは、より高く、ＩＶＩＧ製剤についてのある研究では５〜１８％の範囲である（Ｋｎｅｚｅｖｉｃ−Ｍａｒａｍｉｃａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４３：１４６０）。ｍＡｂと比較して、市販のポリクローナルＩＶＩＧ製剤に、より高いレベルの多量体が認められるのは、一部には、材料の多様な性質（例えば、様々な等電点及びＩｇＧサブクラス）のためである。血漿由来のＩＶＩＧの完全な多様性を維持することは治療のために重要であるが、またこれによって、電荷などの特徴に基づいて異なるＩｇＧ単量体を同時に分離することなく、多量体を分離することが極めて難しくなる（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１２１４：５９）。

組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）は、複数の抗原をターゲティングすることができる新規のクラスの生物製剤を指す。コストを削減するため、治療用途のｒｐＡｂは、単一バッチで製造することが考えられ、この場合、個々の成分ｍＡｂは、同じバイオリアクター内で共発現され、一緒に精製される（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６：１３９）。

ｍＡｂと同様に、ｒｐＡｂの場合、低レベルの多量体種を制御することが望ましい。ｍＡｂとは異なり、ｒｐＡｂの精製には、個々の成分ｍＡｂの相対比を狭い範囲内で制御しなければならないというさらなる制約が加わる（Ｔ．Ｐ．Ｆｒａｎｄｓｅｎ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８：２１７１）。この問題は、ｒｐＡｂ混合物を代表する多様なｍＡｂを同時に分離することなく、不要な種（多量体）を分離し、これによって、抗体の相対比を狭い範囲内に維持することを確実にする必要があるため、大きな課題となる。別の言い方をすれば、ポリクローナル混合物の成分ｍＡｂを一緒に同時精製しなければならないが、多量体種はそうしてはならない。このように困難な分離のためには、イオン交換クロマトグラフィーなどの、ｍＡｂに用いられる従来の手法は適切ではない場合がある。

驚くことに、本発明者らは、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体の分離を達成する方法をみいだした。

本発明は、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの分離プロセスに付すことにより、実質的に多量体を含まない抗体単量体製剤を製造するステップを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも２つの分離プロセスに付すことにより、実質的に多量体を含まない抗体単量体製剤を製造する。

他の実施形態において、分離プロセスは、マルチモードクロマトグラフィー単独である。別の実施形態では、分離プロセスは、アパタイトクロマトグラフィー単独である。また別の実施形態では、分離プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー単独である。

一部の実施形態では、分離プロセスは、マルチモードクロマトグラフィーとアパタイトクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、分離プロセスは、マルチモードクロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、分離プロセスは、アパタイトクロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことにより、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する。

一部の実施形態では、本方法により製造される抗体製剤は、多量体を少なくとも９０％〜９１％含まない。別の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９２％〜９３％含まない。別の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９４％〜９５％含まない。別の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９６％〜９７％含まない。別の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９８％〜９９％含まない。別の実施形態では、抗体製剤は、多量体を１００％含まない。

一部の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、４０％未満変化する。他の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、３０％未満変化する。別の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、２０％未満変化する。別の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、１０％未満変化する。別の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、５％未満変化する。別の実施形態では、ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量は、０％変化する。

本発明はまた、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、マルチモードクロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及びバッファー種と０〜１Ｍの塩とを含む少なくとも１つの溶出バッファーを用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法も提供する。

本発明はさらに、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、アパタイトクロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及び導電率を、１ｍＳ／ｃｍ未満から９０ｍＳ／ｃｍ超に、又は１ｍＳ／ｃｍ〜９０ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で上昇させる塩の段階的変化又は直線勾配を用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法も提供する。例えば、５ｍＳ／ｃｍから２０ｍＳ／ｃｍまで導電率を上昇させる塩の段階的変化を用いて、カラムを溶出させてもよい。

さらにまた、本発明は、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及び導電率を、２００ｍＳ／ｃｍ超から１ｍＳ／ｃｍ未満に、又は２００ｍＳ／ｃｍ〜１ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で低下させる塩の段階的変化又は直線勾配を用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法も提供する。例えば、６０ｍＳ／ｃｍから１０ｍＳ／ｃｍまで導電率を低下させる塩の段階的変化を用いて、カラムを溶出させてもよい。

概略比１：１：１でｍＡｂＡ、Ｂ、及びＣを含有するｒｐＡｂ混合物のＰＯＲＯＳ ５０ＨＳクロマトグラフィーを示す。 概略比１：１：１でｍＡｂＡ、Ｂ、及びＣを含有するｒｐＡｂ混合物のＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィーを示す。 概略比１：１でｍＡｂＡ及びＢを含有するｒｐＡｂ混合物のＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィーを示す。 概略比１：１でｍＡｂＡ及びＢを含有するｒｐＡｂ混合物のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを示す。 概略比１：１でｍＡｂＡ及びＢを含有するｒｐＡｂ混合物のブチルクロマトグラフィーを示す。

概論
ｒｐＡｂの精製は、複数のモノクローナル抗体を細胞培養物において共発現させると、様々な種の多量体、又は多量体が生成され得るという具体的課題を提示する。細胞培養物からモノクローナル抗体を精製するための様々な技術が知られているが、これらの技術のいずれも、モノクローナル抗体の相対比を狭い範囲内に維持しながら、等電点（ｐＩ）、疎水性、及びサイズなど、異なる化学的及び物理的性質を有するポリクローナル抗体混合物（ａｄｍｉｘｔｕｒｅ）（又は混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）？）中のモノクローナル抗体の単量体を精製することができるとは考えられなかった。

定義
本明細書で用いる場合、「抗体」は、１抗原の抗原決定基の特徴と相補的な内面形状及び電荷分布を備えた３次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチド又はポリペプチド群を意味する。抗原は、典型的に、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含む４量体の形態を有し、それぞれの対は、１つの軽鎖と１つの重鎖を有する。それぞれの軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、二重特異性抗体も包含する。

本明細書で用いる場合、「アパタイトクロマトグラフィー」は、被検タンパク質と、固定相アパタイト樹脂上の陽荷電カルシウムイオン及び陰荷電リン酸イオンとの間の非特異的相互作用を利用するタイプの分離を意味する。このタイプのクロマトグラフィーとしては、例えば、ハイドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトがあり、これらは、カルシウム及びリン酸イオンとの非特異的相互作用を通してタンパク質と相互作用する。

本明細書で用いる場合、「疎水性相互作用クロマトグラフィー」とは、高塩濃度条件下で、樹脂と結合するが、低塩濃度の条件下では溶出する被検タンパク質の疎水性部分を利用するタイプの分離を意味する。

本明細書で用いる場合、「最小限の単量体の分離」とは、元の混合物からの抗体単量体の除去が、該混合物中の任意の他の単量体に対して少量に過ぎないことを指す。一般に、この分離の量は、元の混合物からの単量体が、任意の他の単量体に対して４０％未満である。好ましくは、上記の量は、３０％未満である。より好ましくは、上記の量は、２０％未満である。さらに好ましくは、上記の量は、１０％未満である。さらにまた好ましくは、上記の量は、５％未満である。一部の実施形態では、単量体の分離はない（０％）。

本明細書で用いる場合、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」は、クローン製剤中の抗体を指し、ここで、製剤中の抗体の各々は、同一のエピトープに結合する単一特異性を有する。

本明細書で用いる場合、「単量体」とは、多量体を含まない単一の抗体分子を意味する。

本明細書で用いる場合、「多量体」とは、抗体の高分子量凝集体を意味する。

本明細書で用いる場合、「マルチモードクロマトグラフィー」とは、分離を実施するために、固定相と被検体との間の２モード以上の相互作用を利用する技術を指す。例えば、マルチモードクロマトグラフィーは、以下のタイプのクロマトグラフィーの１つ又は複数と、これら相互作用のうちのもう１つを組み合わせて用いてもよい：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。

本明細書で用いる場合、「組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）」とは、混合物中の複数の単量体抗体を意味する。本発明の方法では、個々の成分ｍＡｂを同じバイオリアクター内で共発現させた後、一緒に精製するか、又は個別のバイオリアクター内で発現させた後、精製工程中の任意の時点でこれらを混合する。

本明細書で用いる場合、「段階的変化」とは、溶出条件に関するとき、ｒｐＡｂ混合物を樹脂から溶出させるために、典型的には１カラム体積未満で起こる、即時若しくは極めて急激な導電率の変化を意味する。

本明細書で用いる場合、「直線勾配」とは、溶出条件に関するとき、一定期間にわたって、典型的には、１〜５０カラム体積で起こる、導電率の漸進的変化を意味する。

本明細書で用いる場合、「バッファー種」とは、ｐＨ変化に抵抗することができる弱酸及びその共役塩基又は弱塩基及びその共役塩基を指す。バッファー種は、限定するものではないが、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、トリス、及びビス−トリスを含むリストから選択してよい。

本明細書で用いる場合、「塩」は、陰イオンと陽イオンとの組み合わせである。陽イオンは、限定するものではないが、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムを含むリストから選択してよい。陰イオンは、限定するものではないが、塩化物、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、及び硫酸塩を含むリストから選択してよい。

本明細書で用いる場合、「及び／又は」という用語は、記載された２つの特徴又は要素の各々を他方と一緒に、又は他方なしで明確に開示するものとして解釈すべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々を、本明細書にそれぞれが個別に記載されているのと全く同様に、明確に開示するものとして解釈すべきである。

（Ａ）ｒｐＡｂの分離
多様なモノクローナル抗体を含む組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）（各々は、その付随する化学的性質を有する）は、精製に関して重要な課題を提示する。驚くことに、いくつかの分離技術（具体的には、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー及びアパタイトクロマトグラフィー）が、単独で又は組み合わせて、高い単量体純度で個々のモノクローナル抗体の比を狭い範囲に維持しながら、上記抗体の多量体の種を含む混合物から単量体を分離することができることがわかった。

一般に、ｒｐＡｂの混合物を初めに１つ又は複数のクロマトグラフィー分離技術に付して、プロセス由来不純物を除去した後、多量体を除去する。当分野において一般的なクロマトグラフィー技術の選択肢としては、清澄化細胞培地からｒｐＡｂ混合物を捕捉するためのプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、さらなるプロセス由来種を除去するための陰イオン交換がある。これらの初期精製ステップは、個々のｍＡｂ成分の比を変化させないため、これによってｒｐＡｂ混合物中の多量体のレベルが有意に低下することはない。

（Ｂ）分離技術
１．マルチモードクロマトグラフィー
マルチモードクロマトグラフィーは、市販の樹脂（例えば、「Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ」の名称でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されているものなど）を用いて、当分野では公知の任意のマルチモードバッファー系により実施することができる。本発明の方法では、マルチモードクロマトグラフィーは、イオン交換及び疎水性相互作用基を含有する樹脂を使用する。用いる樹脂をカラムに充填し、流動床カラム又はバッチ調製物として調製してよい。マルチモードクロマトグラフィーは、単量体と多量体の両方をカラムに結合させた後、塩濃度及び／若しくはｐＨの変化により単量体を選択的に溶出させる結合及び溶出条件下か、又は、多量体は、カラムに結合するが、個々の単量体は、大部分がカラムフロースルー中に残るフロースルー条件下で操作することができる。当業者は、両選択肢のための条件を選択することができよう。

フロースルー条件下で操作される非限定的例として、平衡化バッファーは、２５ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）からなるものでよい。一部の実施形態では、バッファーは、５〜２００ｍＭ酢酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、１０〜１００ｍＭ酢酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、１５〜３５ｍＭ酢酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、２５ｍＭ酢酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、０〜１Ｍ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、０〜１Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、５０〜５００Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、８０〜１２０Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、９０〜１１０Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、１００Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約３．０〜６．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜５．５の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約５．０である。

フロースルー条件下で操作される別の非限定的例において、用いることができる平衡化バッファーは、５０ｍＭトリス、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ＝７．２５）からなる。一部の実施形態では、バッファーは、５〜２００ｍＭトリスを含む。一部の実施形態では、バッファーは、１０〜１００ｍＭトリスを含む。一部の実施形態では、バッファーは、４０〜６０ｍＭトリスを含む。一部の実施形態では、バッファーは、５０ｍＭトリスを含む。一部の実施形態では、バッファーは、０〜１Ｍ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、０〜１Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、５０〜５００Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、８０〜１２０Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、９０〜１１０Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、１００Ｍ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．０〜１０．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．０〜９．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．１〜７．５の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．２５である。

ローディングバッファーは、平衡化バッファーと実質的に同じである（ｒｐＡｂを含む）。

樹脂は、ローディングバッファーと実質的に同じバッファーで洗浄してもよい（ｒｐＡｂは含まない）。

カラムフロースルー中のタンパク質は、生成物ピークのリーディング側及びテーリング側での２５ｍＡＵの吸光度に基づいて収集してよい。

２．アパタイトクロマトグラフィー
アパタイトクロマトグラフィーは、ローディング、洗浄及び溶出に様々なバッファーを用いて実施してよい。用いる樹脂をカラムに充填し、流動床カラム又はバッチ調製物として調製してよい。アパタイトクロマトグラフィーは、単量体と多量体の両方をカラムに結合させた後、塩濃度及び／若しくはｐＨの変化により単量体を選択的に溶出させる結合及び溶出条件下か、又は、多量体は、カラムに結合するが、個々の単量体は、大部分がカラムフロースルー中に残るフロースルー条件下で操作することができる。当業者は、両選択肢のための条件を選択することができよう。

結合及び溶出条件下の非限定的例として、用いることができる平衡化バッファーは、１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）からなる。一部の実施形態では、バッファーは、約１〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、２〜５０ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約５〜１５ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約１０ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約０〜１００ｍＭ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約０〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、１〜５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、５〜１５ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．８〜７．２の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．０である。

ローディングバッファーは、平衡化バッファーと実質的に同じである（ｒｐＡｂを含む）。

樹脂は、ローディングバッファーと実質的に同じバッファーで洗浄してもよい（ｒｐＡｂは含まない）。

溶出のために、バッファーは、約０．０５〜３Ｍ ＮａＣｌを含み、約６．２〜８．０の範囲のｐＨを有する、イオン強度がより高い（平衡化及びローディングバッファーより高い）リン酸バッファーであってもよい。一部の実施形態では、バッファーは、約１〜１００ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、２〜５０ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、１０ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の塩を用いて溶出するが、その場合、段階的又は直線勾配は、約０Ｍ〜３Ｍ塩である。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の塩化ナトリウムを用いて溶出するが、その場合、段階的又は直線勾配は、約０Ｍ〜３Ｍ塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の塩化ナトリウムを用いて溶出するが、その場合、段階的又は直線勾配は、約１ｍＭ〜１Ｍ塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．５〜７．５の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．８〜７．２の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、７．０である。

３．疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ローディング、洗浄及び溶出に様々なバッファーを用いて実施してよい。用いる樹脂をカラムに充填し、流動床カラム又はバッチ調製物として調製してよい。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、単量体と多量体の両方をカラムに結合させた後、塩濃度及び／若しくはｐＨの変化により単量体を選択的に溶出させる結合及び溶出条件下か、又は、多量体は、カラムに結合するが、個々の単量体は、大部分がカラムフロースルー中に残るフロースルー条件下で操作することができる。当業者は、両選択肢のための条件を選択することができよう。

結合及び溶出条件下の非限定的例として、用いることができる平衡化バッファーは、０．６Ｍ硫酸ナトリウム及びｐＨ７．０を含むリン酸塩バッファーからなる。一部の実施形態では、バッファーは、約５〜２００ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約１０〜１００ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約１５〜２５ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、２０ｍＭリン酸塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約０．２〜２Ｍ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約０．３〜１Ｍ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、約０．５〜０．７Ｍ塩を含む。一部の実施形態では、バッファーは、０．５〜０．７Ｍ硫酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、バッファーは、０．６Ｍ硫酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．８〜７．２の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約７．０である。

ローディングバッファーは、平衡化バッファーと実質的に同じである（ｒｐＡｂを含む）。

樹脂は、ローディングバッファーと実質的に同じバッファーで洗浄してもよい（ｒｐＡｂは含まない）。

溶出のために、バッファーは、約０〜０．６ｍＭ硫酸ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する、イオン強度がより低い（すなわち、平衡化及びローディングバッファーより低い）リン酸バッファーであってもよい。一部の実施形態では、バッファーは、０．１〜０．５ｍＭ塩を含む。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の塩減少を用いて溶出するが、その場合、段階的又は勾配は、約１Ｍから０Ｍ塩である。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の硫酸ナトリウム減少を用いて溶出するが、その場合、階段又は勾配は、約０．８Ｍから０Ｍ塩である。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の硫酸ナトリウム減少を用いて溶出するが、その場合、階段又は勾配は、約０．６Ｍから０Ｍ塩である。一部の実施形態では、段階的又は直線勾配の硫酸ナトリウム減少を用いて溶出するが、その場合、階段又は勾配は、約０．６Ｍから０Ｍ硫酸ナトリウムである。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、約６．８〜７．２の範囲である。一部の実施形態では、ｐＨは、７．０である。

生成物は、ピークのリーディング側での２５ｍＡＵ及びピークのテーリング側での２５ｍＡＵの吸光度に基づいて回収してよい。

本発明の方法において、抗体製剤が、多量体を少なくとも９０％含まないように、多量体を除去する。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９１％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９２％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９３％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９４％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９５％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９６％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９７％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９８％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を少なくとも９９％含まない。一部の実施形態では、抗体製剤は、多量体を１００％含まない。

本発明の方法で用いることができる樹脂は、当分野では公知であり、市販のものが入手可能である。

組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法では、マルチモードクロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、その場合、ｒｐＡｂを樹脂と接触させて、多量体を樹脂に結合させると共に、カラムフロースルー中で単量体を収集する。

組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法は、マルチモードクロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、その場合、ｒｐＡｂを樹脂に結合させると共に、少なくとも１種の溶出バッファーを用いて、樹脂から単量体を溶出させるが、ここで、溶出バッファーは、バッファー種と、０〜１Ｍの塩を含んでいる。

組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法では、マルチモードクロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、その場合、ｒｐＡｂを樹脂と接触させて、多量体を樹脂に結合させると共に、カラムフロースルー中で単量体を収集する。

組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法では、アパタイトクロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、その場合、ｒｐＡｂを樹脂に結合させると共に、少なくとも１種の溶出バッファーを用いて、樹脂から単量体を溶出させるが、ここで、溶出バッファーは、１ｍＳ／ｃｍ未満から９０ｍＳ／ｃｍ超に、又は１ｍＳ／ｃｍ〜９０ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で導電率を上昇させる塩の段階的変化又は直線勾配である。

組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を使用してもよく、その場合、ｒｐＡｂを樹脂に結合させると共に、少なくとも１種の溶出バッファーを用いて、樹脂から単量体を溶出させるが、ここで、溶出バッファーは、２００ｍＳ／ｃｍ超から１ｍＳ／ｃｍ未満に、又は２００ｍＳ／ｃｍ〜１ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で導電率を低下させる塩の段階的変化又は直線勾配である。

本方法はまた、上記の具体的条件下での上記３つの分離技術の組み合わせを含んでもよい。

一般に、当業者には周知であるように、結合及び溶出条件並びにフロースルー条件を誘導するように、抗体のｐＩ及び疎水性相互作用プロフィールを考慮する。

開示内容を概略的に説明するが、以下の実施例を参照にすることによって、より容易に理解されよう。尚、これらの実施例は、本発明の特定の態様及び実施形態を説明することを目的にするに過ぎず、開示を限定する意図はない。例えば、本発明に開示する特定の構造及び実験設計は、適切な機能を確認するための例示的手段及び方法を示すものである。

Ａ．材料及び方法
１．化学物質
化学物質は全て、ＵＳＰグレード又はそれと同等である。

２．ｍＡｂ及びｒｐＡｂ混合物
モノクローナル抗体を発現させた後、生物工学で一般に使用されている細胞培養物及び精製技術を用いて精製した。ＣＨＯ又はＮＳ０などの広く入手可能な細胞株を用いた標準的細胞培養手順の後、各ｍＡｂの精製は、少なくともプロテインＡ回収と、プロセス由来不純物除去のためのイオン交換カラムを含んだ。個々のｍＡｂ特性を以下の表１にまとめる。ｒｐＡｂ混合物を作製するために、個々のｍＡｂを、２及び３ｍＡｂ ｒｐＡｂ混合物について、それぞれ１：１又は１：１：１（質量）の概略比で混合した。ｒｐＡｂ混合物において要望されるレベルの個々のｍＡｂの多量体を得るために、初めに高又は低多量体レベルを含む精製済みｍＡｂを、正しい多量体レベルを得るように適切な比で合わせた後、個々のｍＡｂと合わせる。これにより、ｍＡｂ比及び多量体レベルの明確な組成を有するｒｐＡｂ混合物が得られた。

３．ｒｐＡｂの総タンパク質濃度測定
ｒｐＡｂ混合物のタンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）製のＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃを用いて、２８０ｎｍの吸光度で測定した。それぞれ混合物について、個々のｍＡｂ成分（１：１又は１：１：１混合物）の計量した重量平均を用いて、吸光係数を推定した。個々のｍＡｂの吸光係数を表１に示す。

４．陽イオン交換クロマトグラフィー
ＰＯＲＯＳ ＨＳ５０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，所在地）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを、２０ｃｍベンチ高さの小規模クロマトグラフィーカラムにおいて、典型的な結合及び溶出条件下で実施した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて、全てのランを実施し、３００ｃｍ／時でカラムを作動させた。２５ｍＭ酢酸塩、２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０でカラムを平衡化した後、総タンパク質濃度を用いて、樹脂１Ｌ当たり３０ｇのタンパク質までロードした。ローディングの後、カラムを再平衡化してから、２０カラム体積にわたって２５ｍＭから２６０ｍＭへの塩化ナトリウムの直線勾配で溶出させた。生成物ピークのリーディング及びテーリング側での２５ｍＡＵの吸光度基準に基づいて生成物ピークを収集した。

５．マルチモードクロマトグラフィー
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）を用いたマルチモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を、２０ｃｍベッド高さまで充填した小型クロマトグラフィーカラムにおいて、典型的なフロースルー条件下で実施した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて、全てのランを実施し、３００ｃｍ／時でカラムを作動させた。２５ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０（ｍＡｂＡ、Ｂ、及びＣの混合物の場合）、又は５０ｍＭトリス、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２５（ｍＡｂＡ及びＢ混合物の場合）でカラムを平衡化した。総タンパク質濃度を用いて、樹脂１Ｌ当たり５０ｇのタンパク質までロードした。生成物ピークのリーディング及びテーリング側での２５ｍＡＵの吸光度基準に基づいて生成物ピークを収集した。

６．疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ ＵＳＡ）製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを、２０ｃｍベンチ高さの小規模クロマトグラフィーカラムにおいて、典型的な結合及び溶出条件下で実施した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて、全てのランを実施し、３００ｃｍ／時でカラムを作動させた。２５ｍＭリン酸塩、０．６Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．４でカラムを平衡化した。１（容量）部のタンパク質溶液を１部の２５ｍＭリン酸塩、１．２Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で希釈することによりロードを調製した後、（前述の）総タンパク質濃度を用いて、カラムを樹脂１Ｌ当たり１０ｇのタンパク質までロードした。ローディングの後、カラムを平衡化バッファーにより再平衡化してから、２０カラム体積にわたって０．６Ｍから０ｍＭ硫酸ナトリウムへの硫酸ナトリウムの直線勾配で溶出させた。ピークのリーディング側での２５ｍＡＵ、及び生成物ピークのテーリング側での１００ｍＡＵの吸光度基準に基づいて生成物ピークを収集した。

７．ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＣｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉを用いたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、２０ｃｍベンチ高さの小規模クロマトグラフィーカラムにおいて、典型的な結合及び溶出条件下で実施した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステムを用いて、全てのランを実施し、３００ｃｍ／ｈでカラムを作動させた。１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０でカラムを平衡化した後、（前述の）総タンパク質濃度を用いて、樹脂１Ｌ当たり２０ｇのタンパク質までロードした。ローディングの後、カラムを再平衡化してから、２０カラム体積にわたって０から１Ｍ塩化ナトリウムへの塩化ナトリウムの直線勾配で溶出させた。ピークのリーディング側での２５ｍＡＵ、及び生成物ピークのテーリング側での５０ｍＡＵの吸光度基準に基づいて生成物ピークを収集した。

８．分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）により、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（所在地）から得られたＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ_XLを用いて、分析用高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を実施した。移動相は、２０分にわたり１ｍＬ／分で、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８であった。４５ｕｇのサンプルをそのまま注射し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）製の分子量標準を用いて、カラムを較正した。２８０ｎｍで分光光度計を用いて、溶出プロフィールをモニターした後、データを収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエアを用いて分析した。

９．分析用逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏシステム（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に接続したＭｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したＰＬＲＰ−Ｓカラム（８μｍ粒子、４０００Ａ、２．０×１５０ｍｍ）を用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを実施した。各タイプのタンパク質混合物に合わせて調整した適切な移動相及び勾配を作製するために、３つの溶出剤を用いた。これらは、水（溶出剤Ａ）、アセトニトリル（溶出剤Ｂ）及び水中の２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶出剤Ｃ）であった。それぞれの溶出の間、溶出剤Ｃの割合（％）を一定に維持した（ＴＦＡ濃度：０．０２〜０．１％）のに対し、要望される勾配を形成するように、溶出剤Ａに対する溶出剤Ｂの割合を増加した。流速を０．２ｍｌ／分に設定し、カラム温度を７０℃に維持した。各タンパク質混合物の溶出をフォトダイオードアレイ検出器でモニターし、２８０ｎｍ又は２２０ｎｍのいずれかで取得したピーク応答を定量のために選択した。サンプル中の各タンパク質の濃度を、同じタンパク質の参照標準を用いて調製した標準溶液を注入することにより決定した。

実施例１：陽イオン交換クロマトグラフィー（ｍＡｂ Ａ／Ｂ／Ｃ）
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、ｍＡｂ多量体除去のために用いられることが多い。典型的な結合及び溶出条件下で、多量体種は、カラム上に単量体種より強度に保持されるため、溶出するのに、より高い濃度の塩を必要とする。単量体／多量体分離のために、最も一般的な溶出技術は、塩増加の段階的変化又は直線勾配であり、これを用いて、様々な種と樹脂との結合のわずかな差を利用することができる。あまり一般的ではない技術は、ｐＨの上昇によって、単量体を溶出させた後、多量体を溶出させるものである。単量体／多量体分離の難度に応じて、多量体は、個別のピークとして（完全な分離）、又は単量体ピークのテーリング側でのショルダーとして（低分離度）出現し得る。いずれの場合にも、多量体は、多量体を含まないように生成物ピークを切断することにより、混合物から除去することができる。

ＣＥＸの場合、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ｒｐＡｂ混合物中の単量体から多量体を除去するために、同じ技術を使用することができる。陽イオン交換を用いて、ｍＡｂ Ａ、Ｂ及びＣの混合物を含むｒｐＡｂ精製の例を図１に示し、表２にまとめる。このｒｐＡｂ混合物の場合、個々のｍＡｂは、１：１：１の適切な比で組み合わされ、多量体は、大部分がｍＡｂ Ｃに由来し、ｍＡｂ Ｂ多量体は非常に低レベルであり、またｍＡｂ Ａ多量体は無視できるレベルである。ｒｐＡｂ混合物をロードし、カラムから溶出すると、３つの主要ピークが観察され、それぞれのピークは、個々のｍＡｂに対応する。このｒｐＡｂ混合物の場合、ｍＡｂ Ｃが最初に溶出し、続いてｍＡｂ Ａ、最後にｍＡｂ Ｂが溶出した。ｒｐＡｂ混合物の代わりに個々のｍＡｂを注入することにより、溶出の順序を確認した。図１のクロマトグラムでは、ｒｐＡｂ混合物中の多量体の分離（主に、ｍＡｂ Ｃから）は容易に観察されないが、ｍＡｂ Ｃ単独の注入によって、予想通り、勾配において、最初に単量体が溶出し、その後多量体が溶出したことが確認された。これらの条件下で、ｍＡｂ Ｃの多量体は、ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂのモノマーと一緒に同時溶出するため、ｒｐＡｂ混合物中のｍＡｂ比を有意に変えることなく除去することが難しくなる。全溶出プールが収集された（溶出ピークの上昇及び下降側で、＞２５ｍＡＵの吸光度収集基準で）ことに留意すべきである。表２からわかるように、ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂ単量体とｍＡｂ Ｃ多量体の同時溶出のために予想された通り、多量体レベルは、ロードからプールまで比較的不変のままである。ｍＡｂ Ｃの多量体を除去するためには、ｍＡｂ Ａ及び／又はｍＡｂ Ｂの単量体も除去しなければならないであろう（これらの種が、ｍＡｂ Ｃの多量体と同時溶出するため）。これらの結果は、陽イオン交換クロマトグラフィーが、このｒｐＡｂ混合物に関して実行可能な選択肢ではないことを示唆している。

実施例２：マルチモードクロマトグラフィー（ｍＡｂ Ａ／Ｂ／Ｃ）
マルチモードクロマトグラフィーは、２つ（又はそれ以上）の異なるモードのクロマトグラフィーのハイブリッドであるユニークなモードのクロマトグラフィーであり、どのようにカラムを操作するかに応じていずれのモードで使用することもできる。文献において、最も一般的なマルチモードクロマトグラフィー樹脂は、両方のイオン交換特性、並びに広範囲のｐＨ値にわたって疎水性相互作用特性を備えるリガンドを含有する。これらのリガンドのユニークなイオン及び疎水性相互作用特性のために、マルチモード樹脂は、ｍＡｂモノマーからのｍＡｂ多量体の分離に用いられてきた。典型的なｍＡｂは、塩基性等電点を有することから、ＣＥＸ／ＨＩＣリガンドを有するマルチモード樹脂は、典型的に、結合及び溶出モードで操作され、その場合、低ｐＨ及びより低い塩濃度で生成物をカラムに結合させた後、塩濃度の増加及び／又はｐＨの上昇によって溶出させる。ミニボディ精製についての一例では、二量体及び多量体を強度に結合させ、高塩濃度ストリップピークで溶出させたことが示されている（Ｐ．Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．８：２６）。ＡＥＸ／ＨＩＣリガンドを有するマルチモード樹脂の場合、ｍＡｂは、結合及び溶出モード又はフロースルーモードで処理することができる。フロースルーモードで操作する場合、ｍＡｂ単量体は樹脂に結合しないが、多量体は強度に結合し、これにより、供給流から多量体を除去するように、操作条件を選択する。文献中の例はよく知られており、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．及びＥｒｉｋｃｃｏｎ ｅｔ ａｌ．はいずれも、高分子量種を除去するためのＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅフロースルーステップを記載している（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｊ（２０２０）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１２１７：２１６；Ｅｒｉｋｃｃｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．７：５２）。マルチモードクロマトグラフィーを用いた多量体の除去は、ｍＡｂ精製において一般的ではあるが、ｒｐＡｂ混合物中の多量体を除去するためのマルチモードクロマトグラフィーの適用は、それほど簡単ではない。ｒｐＡｂ混合物中の個々のｍＡｂ種とマルチモードリガンドとの相互作用の複雑な性質のために、ｍＡｂ比を一定に保ちながら、単量体から多量体を選択的に除去するように条件を最適化できるかは明らかではない。

ｒｐＡｂ混合物中の多量体を除去するマルチモードクロマトグラフィーの能力を試験するために、フロースルーモードのＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅを用いて、ｍＡｂ Ａ、Ｂ及びＣ（概略比１：１：１）の混合物の精製を調べた。この混合物の場合、多量体は、大部分がｍＡｂ Ｃに由来し、ｍＡｂ Ｂ多量体は非常に低レベルであり、またｍＡｂ Ａは無視できるレベルである。この混合物は、ＣＥＸクロマトグラフィーのために実施例１で用いた混合物とほぼ同じである。図２は、ｒｐＡｂ混合物のＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラムを示す。結合及び溶出ＣＥＸとは異なり、図２のＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラムは、ｍＡｂ種の分離のはっきりとした兆候を全く示さないが、このことは、ｍＡｂ比が比較的一定のままでなければならないため、ｒｐＡｂ精製において重要である。表３に、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィーランについてのロード及びプール分析データをまとめる。表３からわかるように、多量体は、ロードの３．４％から、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅプールの０．８％へと減少した。これらの最適化条件（ｐＨ５．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）下で、多量体は、より強度に保持され、クロマトグラムに認められる低ｐＨストリップピークに出現するようだ。表３からわかるように、ｍＡｂ Ｂ及びＣとｍＡｂ Ａの比（Ｂ：Ａ及びＣ：Ａ）は、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅ精製の前後に１．００に極めて近いままである。これらの比は、個々のｍＡｂのＲＰ−ＨＰＬＣ濃度に基づくものであり、単量体及び多量体のいずれの寄与も含むことは留意すべきである。従って、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィー工程中のｍＡｂ Ｃ多量体の除去は、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィー前後のＣ：Ａの比の若干の減少に表れている。

実施例３：マルチモードクロマトグラフィー（ｍＡｂ Ａ／Ｂ）
フロースルーモードのマルチモードクロマトグラフィーを用いたｒｐＡｂ混合物からの多量体の除去のためのマルチモードクロマトグラフィーの使用をさらに明らかにするために、第２のｒｐＡｂ混合物を調べた。図３は、ｍＡｂ及びＢの１：１混合物についてのＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラムを示す。図３からわかるように、クロマトグラムは、選択した操作条件（ｐＨ７．２５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）下で観察される個々のｍＡｂ種の明瞭な分離がなく、典型的なフロースルークロマトグラムのように見える。図２と比較すると、再生ステップ（０．１Ｍ酢酸）に吸光度ピーク（主に多量体を表す）を有し、プロフィールが酷似している。

表４に、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィーについてのロード及びプールサンプルをまとめる。この実施例では、総多量体レベルが、前の実施例より高く、混合物中の多量体は、同様のレベルで（すなわち、各ｍＡｂから約３．５％の多量体）両方のｍＡｂに由来する。ロード中に測定した合計多量体レベルは、６．９％であった。前の実施例と同様に、Ｃａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラフィーは、このｍＡｂ混合物について多量体の除去に非常に有効である。表４からわかるように、多量体レベルは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、６．９％から０．４％に減少しており、単量体収率は高い（９６．１％）。これは、様々なｍＡｂ（この場合、ｍＡｂ Ａ又はＢ）からの多量体を、単量体ステップの収率を損なうことなく、同時に除去できることを示している。同時に、ｍＡｂ ＢとｍＡｂ Ａの比は、比較的一定のままである（ロード中の０．９９に対しプール中の０．９７）。この分離の実施例は、個々のｍＡｂ比を一定に保ちながら、ｒｐＡｂ混合物から多量体を除去するためのマルチモードクロマトグラフィーの新規性及び重要性をさらに裏打ちするものである。

実施例４：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ｍＡｂ Ｃ／Ｄ）
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、カルシウムとリン酸塩からなるユニークなクロマトグラフィー媒体であり、これは、陽イオン交換（樹脂中のリン酸イオンを介して）により、並びに金属配位を通して（樹脂中のカルシウムイオンを介して）、タンパク質と結合することができる。ハイドロキシアパタイトは、しばらく前から、タンパク質の精製に広く使用され、近年では、ハイドロキシアパタイトは、ｍＡｂ精製において多量体を除去する上で人気の高い選択肢となっている（Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．（２００９）Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：２８７；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．３２：３８５７）。ｍＡｂ精製で用いる場合、典型的には、中性又はほぼ中性ｐＨで、低濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸バッファーを用いて、カラムを平衡化する。これらの条件下で、単量体及び多量体は、一般に、カラムに結合し、その際、多量体はより強度に結合する。勾配又は段階的にリン酸塩若しくはＮａＣｌ濃度（ＮａＣｌの方が、溶出技術において広く用いられる傾向がある）を増加することにより、生成物をカラムから溶出させる。最適化されていれば、モノマー及び多量体の分離は非常に有効となり得る。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた多量体の除去は、ｍＡｂ精製において一般的であるが、ｒｐＡｂ混合物中の多量体を除去するためのマルチモードクロマトグラフィーの適用は、それほど簡単ではない。ＣＥＸと同様に、陽イオン相互作用だけに基づいて多量体ｍＡｂ又は他のｍＡｂ種からの単量体ｍＡｂの分離を先験的に予測するのは難しい。ハイドロキシアパタイト中の金属配位相互作用の複雑さが加わると、どのようにしてｒｐＡｂ分離が起こるかを予測するのはさらに困難になる。従って、ｍＡｂ比を一定に保ちながら、多量体を除去するように、最適な条件を選択することができるかは明らかではない。

ｒｐＡｂ混合物中の多量体を除去するハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの能力を試験するために、ＮａＣｌ直線勾配溶出法による結合及び溶出モードのセラミックハイドロキシアパタイト（タイプＩ）を用いて、ｍＡｂ Ｃ及びＤ（概略比１：１）の混合物の精製を調べた。この混合物の場合、多量体は、ほとんどがｍＡｂ Ｃに由来し、ｍＡｂ Ｄ由来の多量体はわずかな寄与しかもさない。図４は、ｒｐＡｂ混合物のＣａｐｔｏ Ａｈｄｅｒｅクロマトグラムを示す。クロマトグラムからわかるように、ｍＡｂ単量体は、単一ピークで同時溶出し、ｍＡｂの分離は全く観察されない。個々のｍＡｂの分離があれば、ほぼ同様の面積を有する複数のピークが観察されるはずである（図１のＣＥＸプロフィールに見られるように）。個々のｍＡｂの注入により、ＮａＣｌ勾配内の類似した溶出位置を確認する（データは示していない）。単量体ピーク後に溶出する小さなピークが観察されたが、このピークは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより多量体であることがわかった。クロマトグラムに基づき、ハイドロキシアパタイトは、個々のｍＡｂを分離することなく、単量体から多量体を分離することができる。また、分離は、依然として高い単量体収率（９６．８％）をもたらした条件下でこのように実施されたことにも留意すべきである。表５に、ロード及びプール分析データをまとめる。表５からわかるように、多量体は、ロード中の４．１％から、ハイドロキシアパタイトプール中の０．４％に減少した。同時に、ｍＡｂ ＤとｍＡｂ Ｃの比（Ｄ：Ｃ）は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前（０．９６）と後（１．０１）で比較的一定を維持した。前述したように、単量体及び多量体種の両方を含むＲＰ−ＨＰＬＣ濃度を用いて、上記比を決定したことから、多量体の除去によって上記比には幾分の変化がある。全体として、ハイドロキシアパタイトは、ｒｐＡｂ混合物中の多量体の除去に有効な手段であることが明らかにされた。

実施例５：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｍＡｂ Ａ／Ｂ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、疎水性の差に基づいてタンパク質を分離する一般的モードのクロマトグラフィーである。ＨＩＣは、しばらく前からタンパク質の精製に広く用いられ、ｍＡｂ精製を目的とする多量体除去のための選択肢として記載されている（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１１７７：２７２）。ｍＡｂ多量体の除去に用いられる場合、典型的には、カオトロピック塩（硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムが最も一般的である）を含有する中性バッファーで、カラムを平衡化する。また、同様の濃度のカオトロピック塩を有するように、ロードも調整し、これらの条件下で、単量体及び多量体は、ＨＩＣ樹脂に結合することができる。典型的には、より低い濃度のカオトロピック塩を含有する（若しくは塩を全く含まない）バッファーまでの直線勾配又は階段を用いて、生成物をカラムから溶出させる。一般に、多量体は、カラムにより強力に結合し、個別の分離ピーク又は単量体ピークのテーリング側のショルダーのいずれかとして、より低い塩濃度で溶出する。ＨＩＣはまた、多量体がカラムに強度に結合するのに対し、単量体生成物は、ほとんど又は全く結合せずにカラムを通過する条件下で、フロースルーモードで操作することもできる。ＨＩＣクロマトグラフィーを用いた多量体の除去は、ｍＡｂ精製において一般的であるが、ｒｐＡｂ混合物中の多量体除去のためのＨＩＣモードクロマトグラフィーの適用は、それほど簡単ではない。それぞれのｍＡｂは、異なる数の疎水性アミノ酸、又はまちまちの表面疎水性プロフィールを有することから、多量体は除去されるが、個々のｍＡｂはｒｐＡｂ混合物から選択的に除去されないように、最適な条件を選択することができるかは明らかではない。

ｒｐＡｂ混合物中の多量体を除去するＨＩＣクロマトグラフィーの能力を試験するために、Ｔｈｏｙｏｐｅｒｌ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍ樹脂を用いて、ｍＡｂ Ａ及びＢ（概略比１：１）の混合物の精製を調べた。０．６Ｍから０Ｍ硫酸ナトリウムに減少する硫酸ナトリウム濃度の直線勾配を有する結合及び溶出モードで、カラムを操作した。この実施例では、混合物中の多量体は、両ｍＡｂに由来し、同様のレベル（すなわち、それぞれのｍＡｂから約３．２％の多量体）である。ロード中で促成した合計多量体レベルは、６．３％であった。図５は、ｒｐＡｂ混合物のブチル（Ｂｕｔｙｌ）クロマトグラムを示す。クロマトグラムからわかるように、個々のｍＡｂは、単一ピークで同時溶出し、ｍＡｂの分離は全く観察されない。個々のｍＡｂの分離があれば、ほぼ同様の面積を有する複数のピークが観察されるはずである（図１のＣＥＸプロフィールに認められるように）。モノマーピークのテーリング側で溶出する小さなピークが観察されるが、このピークは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより多量体であることがわかった。この実施例は、９３．２％の単量体収率を有した。表６に、ロード及びプール分析データをまとめる。表６からわかるように、多量体は、ロード中の６．３％から、ＨＩＣプール中の０．３％に減少した。同時に、ｍＡｂ ＢとｍＡｂ Ａの比（Ｂ：Ａ）は、ブチル（Ｂｕｔｙｌ）６５０Ｍクロマトグラフィーの前（０．９８）と後（１．００）で比較的一定を維持した。従って、ＨＩＣは、個々のｍＡｂを同時に分離することなく、単量体から多量体を分離することができる。

ｍＡｂ精製中の多量体種の制御は、多量体種の免疫原性が知られているために重要である。多量体種の制御は、ヒトに使用するためのｒｐＡｂの製造に必要となると考えられる。ｍＡｂとは異なり、ｒｐＡｂ治療薬は、個々のｍＡｂの比を狭い範囲に制御しなければならないという別の制約を有することが予想される。従って、個々の成分ｍＡｂの比を維持しながら、様々な多量体を除去しなければならない。

ｍＡｂの製造のために、多量体のレベルは、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、常用の方法で制御する；しかし、ＣＥＸを用いたｒｐＡｂ混合物中の多量体の制御は、個々のｍＡｂ同士の電荷不均質性のために、多くの場合実現不可能であろう。これまで、疎水性相互作用、アパタイト、及びマルチモードクロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー技術が、ｍＡｂ多量体除去のために使用されてきたが、これらの様式は、イオン交換より選択性が高い傾向があるため、上記の技術では、多量体種を分離しようとすると、ｒｐＡｂ混合物の成分単量体が分離されるであろうと考えられた。かなり意外なことに、本発明者らは、逆の結果が観測されることをみいだした。実験により、疎水性相互作用、アパタイト、及びマルチモードクロマトグラフィーは、不要な多量体を分離すると同時に、ｒｐＡｂ混合物中の個々のｍＡｂ比を狭い範囲内に保持できることが立証された。

この研究において、本発明者らは、マルチモード、アパタイト、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ｒｐＡｂ多量体除去に用いることができることを明らかにした。２つ又は３つのｍＡｂ混合物を用いて、本発明者らは、それぞれのモードのクロマトグラフィーが、２．５％超の多量体除去（場合によっては、複数のｍＡｂ種からの多量体）を除去して、＞９９％単量体であるｒｐＡｂ生成物を製造することができることを明らかにした。同時に、本発明者らは、要望されるｍＡｂ比（クロマトグラフィーの前及び後に）を１０％以内に維持することができる。

本明細書に記載する全ての刊行物及び特許は、それぞれの刊行物又は特許が、参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に記載されているのと同様に、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

主題の開示の具体的実施形態について論じてきたが、以上の記載内容は、例示的であって、限定的ではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を吟味すれば、本開示の様々な変更形態が当業者には明らかであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、及びそれらの均等物の全範囲、並びに本明細書、及び上記のような変更形態を参照にすることにより決定すべきである。

Claims (31)

1. 最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの分離プロセスに付すことにより、実質的に多量体を含まない抗体単量体製剤を製造するステップを含む方法。
2. 前記混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも２つの分離プロセスに付すことにより、実質的に多量体を含まない抗体単量体製剤を製造する、請求項１に記載の方法。
3. 前記分離プロセスが、マルチモードクロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
4. 前記分離プロセスが、アパタイトクロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
5. 前記分離プロセスが、疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
6. 前記分離プロセスが、マルチモードクロマトグラフィーとアパタイトクロマトグラフィーである、請求項２に記載の方法。
7. 前記分離プロセスが、マルチモードクロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項２に記載の方法。
8. 前記分離プロセスが、アパタイトクロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項２に記載の方法。
9. 前記混合物を、マルチモードクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことにより、最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する、請求項１に記載の方法。
10. 前記抗体製剤が、多量体を少なくとも９０％〜９１％含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抗体製剤が、多量体を少なくとも９２％〜９３％含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記抗体製剤が、多量体を少なくとも９４％〜９５％含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記抗体製剤が、多量体を少なくとも９６％〜９７％含まない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記抗体製剤が、多量体を少なくとも９８％〜９９％含まない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記抗体製剤が、多量体を１００％含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、４０％未満変化する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、３０％未満変化する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、２０％未満変化する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、１０％未満変化する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、５％未満変化する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ｒｐＡｂ混合物中の任意の抗体単量体の、他の任意の抗体単量体に対する量が、０％変化する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、マルチモードクロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及びバッファー種と０〜１Ｍの塩とを含む少なくとも１つの溶出バッファーを用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法。
23. 前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、疎水性及びイオン交換部分の両方を備えるリガンドを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記マルチモードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー樹脂である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記単量体を直線又は段階的勾配の塩で溶出させる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記単量体を、単一濃度の塩を用いて前記カラムから溶出させる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
27. 単量体の分離なしで、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物をアパタイトクロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及び導電率を、１ｍＳ／ｃｍ未満から９０ｍＳ／ｃｍ超に、又は１ｍＳ／ｃｍ〜９０ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で上昇させる塩の段階的変化又は直線勾配を用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法。
28. 前記アパタイトクロマトグラフィーが、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. 最小限の単量体の分離で、組換えポリクローナル抗体多量体を分離する方法であって、複数のモノクローナル抗体を含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させるステップ、及び導電率を、２００ｍＳ／ｃｍ超から１ｍＳ／ｃｍ未満に、又は２００ｍＳ／ｃｍ〜１ｍＳ／ｃｍの間の任意の範囲で低下させる塩の段階的変化又は直線勾配を用いて、前記樹脂から抗体単量体を溶出させるステップを含む方法。
31. 前記塩が、硫酸ナトリウムである、請求項３０に記載の方法。

Images