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JP2016519068A - Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法 - Google Patents

Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法 Download PDF

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Abstract

本技術は、概して免疫学の分野に関し、部分的には、Ｔ細胞、例えば、治療用Ｔ細胞の増殖をコントロールするための組成物および方法に関する。それらの方法は、被験体において免疫応答を誘導するための組成物および方法にさらに関する。一局面では、誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物が提供され、ここで、上記誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＣＤ３ゼータ鎖およびＯＸ４０からなる群より選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。

Description

分野
本技術は、概して免疫学の分野に関し、部分的には、Ｔ細胞、例えば、治療用Ｔ細胞の増殖をコントロールするための組成物および方法に関する。それらの方法は、被験体において免疫応答を誘導するための組成物および方法にさらに関する。
関連特許出願
優先権は、２０１３年３月１４日に出願され、「Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法」との表題の米国特許出願第６１／７８３，４４５号（これは、その全体が全て本明細書に言及され、参考として援用される）に対して主張される。
背景
Ｔ細胞の活性化は、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌および寄生生物）、外来タンパク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において重要な工程である。Ｔ細胞は、その表面上に、抗原提示細胞の表面上に提示された抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）を発現している。正常な免疫応答では、これらの抗原がＴ細胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、Ｔ細胞の活性化に至る。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的な構成要素、膜貫通の構成要素および細胞内の構成要素を含む。キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞は、癌治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。これらの治療は、腫瘍に対して有効であるが、場合によっては、健康な組織に対する非特異的な攻撃に部分的に起因して、副作用をもたらした。強力な免疫療法反応をもたらし、かつ有毒な副作用を回避する、コントロール可能なＴ細胞治療のための方法が必要とされている。
要旨
例えば、免疫応答を誘導するためまたは増大させるために使用され得る、ＣＩＤによって誘導可能なキメラシグナル伝達分子（ＣＳＭ）が、部分的に提供される。ＣＳＭは、単独でまたはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）と組み合わせて使用され得、特定の腫瘍細胞に対する免疫応答を特異的に生じさせる。コントロールされたＴ細胞活性化の方法は、以前のＣＡＲに基づく処置の有毒な副作用の多くを回避する。
本明細書中で論じられるキメラシグナル伝達分子は、細胞内で共発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の持続的で調節されたコントロールを可能にする。ある疾患または状態に関係している細胞性抗原を標的化するようにデザインされた抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、リガンド誘導物質の投与に依存する。そのリガンド誘導物質は、キメラシグナル伝達分子を多量体化することによってＣＡＲ発現細胞を活性化し、次に、細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーＴ細胞を活性化するＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化する。（例えば、図２０を参照のこと）。リガンド誘導物質の非存在下では、Ｔ細胞は、静止状態であるか、または基底レベルの活性を有する。そのリガンドの定期的な投薬スケジュールは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖および活性化の速度および規模を決定する。
完全な活性化および腫瘍細胞殺傷は、依然として、抗原認識、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達を介したＮＦＡＴのさらなる活性化に依存している。完全奏効（ＣＲ）が達成されると、リガンドの投薬を終了する。疾患または状態が再発した場合、リガンドの投薬を再開し、腫瘍を標的にしている静止状態のＴ細胞の再拡大および再活性化がもたらされる。
細胞治療の１つの例において、キメラ抗原レセプターをコードする核酸を形質導入されたＴ細胞が、癌を処置するために患者に投与された（Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．−Ｓ．，（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：４１３−４２０）。例えば、ヒト化モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に基づくキメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞が、癌患者を処置するために使用された。しかしながら、有害事象が生じる可能性があり、少なくとも１つの報告された症例では、その治療は、患者に対して致命的結果をもたらした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：８４３−８５１）。本明細書中に提示されるように、コントロール可能で誘導可能な安全スイッチを細胞に形質導入することにより、リガンド誘導物質の投与を停止することによって有害事象が進行するのを阻止できる安全スイッチが提供され得る。低レベルの基底活性が残るかもしれないが、その誘導物質の存在を除去することにより、有害事象の症状は、無くなるとまではいかなくとも、大幅に減少するはずである。
細胞治療の別の例において、Ｔ細胞は、非機能性のＴＧＦ−ベータレセプターを発現するように改変され、それにより、そのＴ細胞は、ＴＧＦ−ベータに抵抗性になる。これにより、その改変されたＴ細胞が、ＴＧＦ−ベータによって引き起こされる細胞傷害を回避することが可能になり、それらの細胞を細胞治療において使用できるようになる（Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｊ．ら（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９：３１７９−３１８７；Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｍ．ら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．２００：１６２３−１６３３）。しかしながら、それは、Ｔ細胞リンパ腫、または改変されたＴ細胞が正常な細胞コントロールの一部を欠くときは他の有害作用ももたらし得；これらの治療用Ｔ細胞自体が、悪性になり得る。本明細書中に提示されるように、これらの改変されたＴ細胞に、誘導可能なＣＳＭポリペプチドに基づく安全スイッチを形質導入することにより、この結果を回避できる安全スイッチが提供され得る。
したがって、誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物が、いくつかの実施形態において特徴付けられ、ここで、その誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＣＤ３ゼータ鎖およびＯＸ４０からなる群より選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態において、膜標的化領域は、レセプター由来の、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸ Ｂｏｘ）、タンパク質間相互作用モチーフおよび膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）からなる群より選択される。ある特定の態様において、膜標的化領域は、ミリストイル化標的化配列である。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＣＤ３ゼータ鎖およびＯＸ４０からなる群より選択される第２の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域は、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域および４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態において、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域は、ＯＸ４０細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドおよび４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、ＦＫＢ１２領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５７の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５８もしくは配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号５７もしくは配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、マウス白血病ウイルスベクターは、ＭｏＭＬＶベクターである。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、上記核酸は、プラスミド内に含まれている。
本願の組成物のいずれかで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞もまた本願において特徴付けられる。いくつかの実施形態において、その細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、骨髄から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、臍帯血から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
他の実施形態において、上記細胞は、シグナルペプチド、一本鎖可変フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でさらに形質転換されるかまたは形質導入される。いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントは、腫瘍細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントは、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントは、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αメソテリン、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントは、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである。
免疫応答を誘導するための方法もまた提供され、その方法は、インビトロまたはエキソビボにおいて、本願の組成物で細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドと細胞を接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、二量体である。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態において、上記方法は、トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞を被験体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、その細胞は、静脈内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、インビボにおいて免疫応答を誘導するための方法が提供され、その方法は、本願の組成物を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドを含む組成物を被験体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、二量体である。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である。
いくつかの実施形態において、本願の組成物または細胞で処置される被験体は、過剰増殖性疾患と診断されている。他の実施形態において、被験体は、腫瘍と診断されている。他の実施形態において、被験体は、癌を有する。他の実施形態において、被験体は、固形腫瘍を有する。他の実施形態において、細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である。他の実施形態において、細胞は、腫瘍床に送達される。他の実施形態において、癌は、被験体の血液中または骨髄中に存在する。他の実施形態において、被験体は、血液または骨髄の疾患を有する。他の実施形態において、被験体は、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている。他の実施形態において、被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている。他の実施形態において、被験体は、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている。他の実施形態において、被験体は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される状態と診断されている。いくつかの実施形態において、被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている。
被験体における白血病を処置するための方法もまた提供され、その方法は、本願の細胞を投与する工程（ここで、その細胞は、誘導可能なＣＳＭおよび一本鎖可変フラグメントを含むキメラ抗原レセプターで形質導入されるかまたはトランスフェクトされる）および多量体リガンドを被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、一本鎖可変フラグメントは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、上記方法は、さらなる用量の多量体リガンドが、被験体に投与されるべきであるか否かを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程をさらに含み、ここで、上記疾患または状態の症状は、症状が減少した後に残っているかまたは検出される。いくつかの実施形態において、上記被験体は、本願の組成物または細胞を投与する前に、疾患または状態と診断されており、多量体リガンドを投与した後に、その疾患または状態が検出され、さらなる用量の多量体リガンドが、被験体に投与される。
いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体における状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージを特定する工程、および多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示、または被験体において特定された状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージに基づいて患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記状態は、癌である。いくつかの実施形態において、上記状態は、白血病である。いくつかの実施形態において、上記状態は、固形腫瘍である。
他の実施形態において、上記方法は、多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合に、被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数は、多量体リガンドの投与前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、多量体リガンドの投与後に減少する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べたときの、被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合に、被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルは、多量体リガンドの投与前のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、多量体リガンドの投与後に減少する。
ある特定の実施形態が、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに説明される。
図面は、本技術の実施形態を図示しており、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の比率で拡大縮小して作成されておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張または拡大されて示されていることがある。
図１は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の遺伝子移入の図示を提供している。 図２は、ＣＡＲの改善および関連する毒性の図示を提供している。 図３は、自殺（アポトーシス）遺伝子も発現しているＣＡＲ発現細胞と比べて、ＣＩＤによってコントロールされるキメラシグナル伝達分子の理論的解析のグラフ描写を提供している。 図４は、ＣＩＤによってコントロールされるＣＳＭのいくつかの例の図示を提供している。 図５は、ＣＳＭのＣＩＤ誘導、およびＣＡＲを含むＴ細胞の誘導可能なＣＳＭ活性化の図示を提供している。 図６は、ＣＩＤによってコントロールされるＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷の図示を提供している。 図７は、改変されたＴ細胞のＦＡＣｓ選別解析の結果を提供している。 図８は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンガンマのレベルの棒グラフを提供している。 図９は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１３のレベルの棒グラフを提供している。 図１０は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−５のレベルの棒グラフを提供している。 図１１は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−６およびＩＬ−８のレベルの棒グラフを提供している。 図１２は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−１βおよびＩＬ−１２−ｐ７０のレベルの棒グラフを提供している。 図１３は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＰ−１０およびＭＩＰ１αのレベルの棒グラフを提供している。 図１４は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳのレベルの棒グラフを提供している。 図１５は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＴＮＦ−αレベルの棒グラフを提供している。 ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）またはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物をフローサイトメトリーによってＧＦＰ＋腫瘍細胞（Ｘ軸）について解析した。 図１７は、図１６について論じた実験と類似の、異なるドナーに対する実験の結果を示している。 ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）またはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物をフローサイトメトリーによってＧＦＰ＋腫瘍細胞について解析した（ｎ＝２）。 ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）またはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物を蛍光顕微鏡法によって解析したところ、１０ｎＭ ＡＰ１９０３で活性化されたとき、Ｔ細胞芽球の活性化（右の２つのパネル）およびＧＦＰ＋腫瘍細胞の排除が示された。 図２０は、キメラ抗原レセプターを形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞（左）および本明細書中に提供されるようなキメラシグナル伝達分子の例の模式図である。 図２１は、キメラ抗原レセプターで形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞（左）および本明細書中に提供されるようなキメラシグナル伝達分子の例の模式図である。 図２２は、誘導可能なキメラ抗原レセプターのプラスミドマップである。
詳細な説明
一般に、Ｔ細胞治療は、注入された細胞のインビボでの拡大が不良であるという困難を伴っていた。この問題に対処する１つの方法は、高用量のＩＬ−２を患者に投与することによるものである。この治療は、Ｔ細胞の成長および抗腫瘍機能を助けるが、患者にとって非常に有毒でもある。高用量のＩＬ−２は、メラノーマに対する標準治療法（ｓｔａｎｄａｒｄ−ｏｆ−ｃａｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ）であると考えられているので、これは、その疾患において広く使用されてきた。他のほとんどのＴ細胞治療の適用は、有毒作用に起因して、Ｔ細胞治療とともにＩＬ−２を使用してこなかった。Ｔ細胞治療において生じている別の問題は、注入されたＴ細胞の生着および存続が不良であること（インビボでの増殖の機能）であり、これは、Ｔ細胞を注入する前にリンパ球枯渇前処置（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を行うことによって対処されてきた。研究者らは、これを達成するために化学療法（特にシクロホスファミド）を広く使用するが、一部の研究者は、Ｃａｍｐａｔｈを含む抗体を使用する。前処置は、リンパ系の「空間」を作り出すことならびに増殖因子および生存因子について競合する調節性の免疫細胞を枯渇させることによって、Ｔ細胞治療を大いに促進するとみられる。しかしながら、それは、患者にとって非常に有毒であり、正常な免疫細胞（例えば、病原体特異的）を完全に除去するので、いくつかのタイプの癌または高齢患者に対して容易に使用できない。さらに、リンパ球枯渇レジメンの使用は、Ｔ細胞治療を独立型の治療ではなく「一連の手順」に押し進め得る。
各患者は、その患者に対して製造されたユニークな細胞生成物を有する必要があるので、Ｔ細胞治療は、ブティック療法（ｂｏｕｔｉｑｕｅ ｔｈｅｒａｐｙ）であると広く考えられてきた。従来のＴ細胞治療（反復性の抗原刺激または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離によってもたらされる）は、それらの特異性または機能に関して再現できず、極端に変動する結果をもたらし、場合によっては、処置用の生成物を生成できないことがある。天然のＴ細胞レセプターまたはキメラＴ細胞レセプターの遺伝子移入は、この問題を解決し始めている（ここで、高度に腫瘍特異的なＴ細胞は、２週間未満で産生され得る）が、遺伝子が改変されたＴ細胞が、天然に存在するＴ細胞と異なって機能し得ることは明らかである。さらに、高度に特異的なＣＡＲ Ｔ細胞または最適化されたＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖を発現しているＴ細胞は、オフターゲット毒性を引き起こし得ることから、自殺遺伝子を含めることが必要である。
図１は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の最も基本的な構成要素を図示している。腫瘍特異的モノクローナル抗体に対する可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖が、Ｔ細胞レセプター複合体由来のＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、通常、グリシン−セリン可動性リンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに付着されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。
形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、細胞傷害および細胞活性化を誘導するＣＤ３ゼータ鎖を介してシグナル伝達する。
図２は、様々なキメラ抗原レセプターの開発を図示している。研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺傷を誘導するのに十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ゼータ鎖のみを発現しているＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。これらの構築物は、第１世代ＣＡＲと呼ばれる。
Ｂ７軸を介した共刺激は、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に加えた。この領域は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ゼータバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ゼータだけを有するＣＡＲまたはゼータとＣＤ２８の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、ＣＤ２８が、活性化後のＩＬ−２産生の増加に部分的に起因して、インビボにおいて拡大を促進することが実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。
ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４−１ＢＢまたはＯＸ４０を使用することにより、Ｔ細胞の生存および有効性がさらに改善された。４−１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ ＸＳら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ；１８（２）：４１３−２０）およびＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、最も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３−１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−５３３）。これらの細胞は、インビボにおいて１０００倍超拡大して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべてにおいて持続的な緩解をもたらした。
しかしながら、ＣＡＲは、抗腫瘍効果を改善したので、それらは、より危険にもなった。第２および第３世代のＣＡＲを使用した２つの目立った死亡例があり、ほんの少数の患者しか処置されていないことを考慮すれば、これは、甚だしい。これらの死亡は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する敗血症が原因で生じた（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８４３−８５１）。
自殺遺伝子は、養子導入されたＴ細胞による望まれない副作用からの十分な保護を提供するが；しかしながら、遺伝子改変されたＴ細胞を毒性の後に排除すると、その処置の治療効果も除去され得る。
Ｔ細胞レセプターシグナル伝達は、二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）に結合する多量体化領域を含むキメラレセプターと組み合わせてＣＩＤを使用して誘導され得る。Ｔ細胞を、１、２または３つのＦＫＢＰフラグメントと連結されたＣＤ３ゼータ鎖を発現するように操作した。それらの細胞は、キメラレセプターを発現し、ＣＩＤ依存性のＴ細胞活性化を示した（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４）。本願は、ＣＩＤによってコントロールされる誘導可能なキメラシグナル伝達分子（ＣＳＭ）を部分的に提供する。誘導可能なＣＳＭを発現するＴ細胞をＣＩＤと接触させることにより、細胞の活性化および免疫応答の誘導がもたらされる。
図３では、本願の治療法を、自殺遺伝子を使用するＣＡＲ処置の方法と比較している。本願は、抗腫瘍効果が徐々に増大するようにインビボにおけるＴ細胞の増殖および機能を増幅する遺伝子操作アプローチを部分的に提供する。二量体化化学誘導物質は、Ｔ細胞の機能および頻度を高めるために、インビボにおいてＴ細胞を活性化するためのコントロール可能な系において使用される。
図４および５に示されているように、いくつかの実施形態において、ＣＳＭは、ＣＤ３ゼータ鎖を伴っておよび伴わずに、１つ以上の共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）とタンデムで、Ｆｖドメインなどの多量体化領域を使用することにより、ＣＩＤ依存性の増殖および共刺激が可能になる。共刺激を提供するためおよびＴ細胞免疫応答を増加させるために、ＣＳＭは、単独で使用され得る。この方法を使用して、Ｔ細胞の集団、例えば、非特異的な標的を含む集団が、ＣＳＭをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ得るかまたは形質転換され得、次いで、被験体に投与されることにより、全身的免疫応答が高められ得る。
このＣＳＭは、例えばｓｃＦｖポリペプチドおよびＣＤ３ゼータ鎖を含み得るＣＡＲとともに、細胞において発現され得る。この方法では、誘導可能なＣＳＭ分子は、ＣＡＲと組み合わせて使用され、それにより、ＣＡＲシグナル伝達が２つの別個の機能に分離される。ＣＡＲによって提供されるこの第２の機能は、操作されたＴ細胞に対して抗原特異的細胞傷害をもたらす。図４において、この例は、ＰＳＭＡに対して特異性を有するＣＡＲを示しており；これらの操作されたＴ細胞は、例えば、被験体に投与されることにより、特異的な免疫応答、例えば、前立腺癌腫瘍に対する免疫応答をもたらし得る（図６）。
図２２に示されるように、いくつかの実施形態において、誘導可能な共刺激ポリペプチド、例えば、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドまたは切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、キメラ抗原レセプター自体の活性化をコントロールするために使用される。この改変された誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞、例えば、Ｔ細胞を形質導入するために使用され得る。これらの細胞は、本明細書中で論じられるようなキメラシグナル伝達分子をさらに発現し得、ある特定の実施形態において、キメラシグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ抗原レセプターは、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドとＭｙＤ８８ポリペプチドの両方を含む。
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「２つ以上の」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含み得る。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷されたまたは不活性化されたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリジウム、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの核酸配列全体の使用に限定されない。本発明が、２つ以上の遺伝子またはゲノムの部分的な核酸配列の使用を含むがこれに限定されないこと、およびこれらの核酸配列が、所望の免疫応答を誘発するように様々な組み合わせで配置されることは、容易に固有のことである。
本明細書中で使用される用語「癌」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉、舌、神経芽細胞腫、頭部、頚部、乳、膵、前立腺、癌、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頸、胃腸、リンパ腫、脳、結腸、肉腫または膀胱が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または不注意の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、癌）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「機能的等価物」は、それが共刺激ポリペプチド、細胞質領域またはシグナル伝達領域に関するとき、核酸のフラグメント、バリアントもしくはアナログのことを指すとき、免疫応答を刺激して腫瘍または過剰増殖性疾患を消失させる共刺激をコードする核酸のことを指す。「機能的等価物」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、Ｔ細胞において発現されたとき、Ｔ細胞によって媒介される腫瘍殺傷応答を増幅することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、および癌細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強することおよび／または活性化することができる。なおもさらに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、Ｔ細胞を活性化しないだろう。
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
用語用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む））を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインの産生および／または他の細胞応答を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。その用語は、例えば、癌性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき、固形腫瘍または癌に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指す。いくつかの例において、被験体は、癌を予防するために処置され得、ここで、その癌は、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関して使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すなわち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被験体が感染した後の処置のことを指す。
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその構成要素（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（これはＣＤ３＋細胞を意味することを含む）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性拡大）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
あるパーセントの細胞が殺傷される場合におけるような「殺傷する（ｋｉｌｌ）」または「殺傷する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞剥離のことも指し得る。
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体配座および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
「保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って測定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性は、多分化能（ｍｕｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。
誘導可能な多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導可能な多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞のような、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導可能な多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは高分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、標的化された様式（ｍａｎｏｒ）で、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を殺傷する、様々なレセプターを有するＴ細胞のことを指す。本願の方法を使用してＴＩＬの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能にし得る。
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
発現構築物の操作
発現構築物は、共刺激ポリペプチドおよびリガンド結合ドメインをコードし、これらはすべて、作動可能に連結されている。一般に、用語「作動可能に連結された」は、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結されていることを示すと意味され、ここで、そのプロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始し、媒介する。より詳細には、２つ以上のリガンド結合ドメインが、発現構築物において使用される。なおもさらに、発現構築物は、膜標的化配列を含む。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合エレメントのいずれかの側に共刺激ポリペプチドエレメントを含み得る。発現構築物は、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドに挿入され得る。提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して行われ得、これらの方法としては、本明細書中に提示される抗原提示細胞に核酸を形質導入する方法、形質転換する方法または別途提供する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
発現構築物は、マーカーポリペプチドをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、マーカーポリペプチドは、共刺激ポリペプチドに連結される。例えば、マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列、例えば、切断可能な２Ａ様配列を介して共刺激ポリペプチドに連結され得る。マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であり得るか、または例えば誘導可能なＣＳＭの活性に影響しないように選択される異種タンパク質であり得る。
２Ａ様配列または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ配列の場合、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合が省略される。これにより、２〜３個のポリペプチド、この場合、共刺激ポリペプチドの細胞質領域およびマーカーポリペプチドが残される。この配列が使用されるとき、２Ａ配列の５’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および２Ａ配列内の任意の上流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列内の任意の下流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
共刺激ポリペプチド
共刺激ポリペプチド分子は、細胞の生存および増殖に関与するシグナル伝達経路の活性化によって細胞媒介性の免疫応答を増幅することができる。企図される共刺激タンパク質としては、例えば、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）およびＣＤ２８ファミリーのメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激タンパク質には、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータ鎖、または例えばそれらの細胞質領域が含まれ得る。２つ以上の共刺激ポリペプチドまたは共刺激ポリペプチドの細胞質領域が、本明細書中で論じられる誘導可能なキメラシグナル伝達分子において使用され得る。例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ２８細胞質ポリペプチドおよび４−１ＢＢ細胞質ポリペプチドを含み得る。または、例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ２８細胞質ポリペプチドおよびＯＸ４０細胞質ポリペプチドを含み得る。または、例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ３ゼータドメインポリペプチドをさらに含み得る。
共刺激ポリペプチドには、ＮＦ−カッパーＢ経路、Ａｋｔ経路および／またはｐ３８経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。細胞活性化システムは、１つ以上のリガンド結合ドメイン（すなわち、小分子結合ドメイン）に融合された組換えシグナル伝達分子の利用に基づき、ここで、共刺激ポリペプチドは、オリゴマー化をもたらすリガンド（すなわち、脂質透過性の有機二量体化薬物）によって活性化されるおよび／または制御される。共刺激ポリペプチドの架橋またはオリゴマー化のために使用され得る他のシステムは、抗体、天然のリガンドおよび／または人工の交差反応リガンドもしくは合成リガンドを含む。なおもさらに、企図される別の二量体化のシステムは、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムを含む。
使用され得る共刺激ポリペプチドは、ＮＦ−カッパーＢおよび他の可変性のシグナル伝達カスケード、例えば、ｐ３８経路および／またはＡｋｔ経路を活性化するポリペプチドを含む。そのような共刺激ポリペプチドとしては、ＣＤ２８ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）、ＴＮＦレセプター（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本方法は、誘導可能な形態の共刺激ポリペプチド（例えば、ｉＣＤ２８、ｉ４−１ＢＢ、ｉＣＤ３−ゼータ）をコードする発現構築物を生成するような遺伝物質の操作を含む。そのような方法は、例えば、それぞれの細胞質ドメインをコードする異種核酸配列を含む、発現構築物の作製、およびその発現のための手段を含む。ベクターは、適切なヘルパー細胞において複製され得、ウイルス粒子が、それらから産生され得、細胞が、その組換えウイルス粒子に感染され得る。
したがって、本明細書中に提示される共刺激分子は、例えば、細胞外ドメインを欠くことがある。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、切断されているか、または除去されている。機能的な細胞外ドメインを有しない共刺激分子を生成するように、標準的な突然変異誘発、挿入、欠失または置換を用いて細胞外ドメインが変異され得ることもまた企図される。
いくつかの実施形態において、キメラシグナル伝達分子は、例えば、図２１に示されるように、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドおよび切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む。ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドおよび切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含むポリペプチドは、２００９年９月２１日に出願された、ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮ ＩＭＭＵＮＥ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＢＹ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＣＤ４０ ＡＮＤ ＰＡＴＴＥＲＮ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＡＤＡＰＴＥＲＳという表題の米国特許出願番号１２／５６３，９９１において論じられている（その全体が本明細書中で参照により援用される）。
遺伝子治療の文脈において、遺伝子は、ベクターの骨格を提供するウイルスゲノム以外の起源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、原核生物または真核生物の起源（例えば、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物または動物）に由来する。また、異種ＤＮＡは、２つ以上の起源に由来し、すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質である。また、異種ＤＮＡは、１つの起源に由来する制御配列および異なる起源に由来する遺伝子を含み得る。
共刺激ポリペプチドは、本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含み得るが、これらに限定されず、欠失または切断をはじめとした機能的な保存的変異を含み得、本明細書中に提供されるアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
リガンド結合領域
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインは、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメインは、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３−３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行するための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために突然変異誘発に供され得る。突然変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと突然変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム突然変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドンを公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、突然変異誘発に供され得る。
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されないであろう細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の突然変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
レセプターを多量体化する場合、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：３０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰおよびミリストイル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル伝達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラシグナル伝達分子は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）であり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、
Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む。
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０
分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０である。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆらぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９６を参照のこと。
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３−６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓのＮ末端部分またはＧタンパク質アルファサブユニット（例えば、最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそのようなタンパク質由来のそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸または約１５〜約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ ｐ値を有し、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ ｐ値を有する。Ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ ｐ値を有すると特徴付けられる。Ｌｏｇ ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏｇ ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅ ５９９、エントリー４４９３は、４．２というｌｏｇ ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしくは５個またはそれ以上のアシル部分が、膜会合領域に連結される。
本明細書中のキメラタンパク質は、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列も含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦベータ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見られる。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止める膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つ以上のらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げられる。
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、ＡＡＩ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る。１本分は、１０ｍＬのガラスバイアルにおける８ｍＬである（バイアル１本あたり合計約４０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
使用するために、ＡＰ１９０３は、投与前に、室温に温め、希釈される。５０ｋｇを超える被験体の場合、ＡＰ１９０３は、１００ｍＬの生理食塩水に希釈された４０ｍｇの用量で、１時間あたり５０ｍＬの速度で２時間にわたって、ＤＥＨＰフリー食塩水バッグおよび溶液セットを使用して、ｉ．ｖ．注入によって投与される。５０ｋｇ未満の被験体は、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を投与される。
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
ＡＰ１９０３を投与する必要性、ならびに治療用Ｔ細胞、例えば、キメラ抗原レセプターおよび誘導可能なキメラシグナル伝達分子を発現しているＴ細胞を活性化する必要性を判定する際、患者には、例えば、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％上下しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水における１００ｍＬに希釈される。
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという投与レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
使用されるＡＰ１９０３ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、約１０〜１００ｎＭ（ＭＷ：１４１２Ｄａ）である。これは、１４〜１４０μｇ／Ｌまたは約０．０１４〜０．１４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜１４０μｇ／ｋｇ）に等しい。投与量は、用途に応じて変動することがあり、ある特定の例では、０．１〜１０ｎＭの範囲内、または５０〜１５０ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、７５〜１２５ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜６００ｎＭ、１００〜７００ｎＭ、１００〜８００ｎＭもしくは１００〜９００ｎＭの範囲内であり得る。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上に記載されたＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において耐容性がよかった。
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含む免疫学的表面マーカーもまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９は、例えば、免疫磁気選択において、移入するための細胞の選択のために使用される。
調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
有用であり得る別の誘導可能なシステムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろにクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ最初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
他の例では、発生的に制御され、特定の分化細胞において活性であるプロモーターが選択され得る。したがって、例えば、あるプロモーターは、多能性幹細胞では活性でないことがあるが、例えば、その多能性幹細胞が、より成熟した細胞に分化した場合、そのプロモーターは、活性化されることがある。
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９７５−７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２−３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその構成要素エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が含まれる。
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６−８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましいだろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２または他の多量体化領域ポリペプチド、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域およびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３−９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８に提示されているような）。
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれ以上の鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」を包含する。
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含有量、核酸の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体配座および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って測定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄ）は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−．ベータ．−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。
核酸調製物
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイまたは治療薬において、コントロールまたは標準物質として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスフィットもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解する工程を含む。
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、Ｔ細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ ＰＥＩを使用した送達などの方法が挙げられる。
１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。例えば、動物由来の樹状細胞が、発現ベクターでその細胞をトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞をその動物に投与して戻す。
２．注射
ある特定の実施形態において、抗原提示細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内（ｉｎｔｒｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば（ｆｏｅ ｅｘａｍｐｌｅ）、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトカッパー免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。腫瘍抗原をコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされる腫瘍抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現しているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
８．レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立された。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチドは、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプターに特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
９．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺傷せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金を含む粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ないことがあることが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）によって境界されている。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能に欠けたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる突然変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
パッケージングシグナルの突然変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点突然変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていると仮定すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統が達成され得る。
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、Ｔ細胞などの標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができるだろう。
２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ある特定のウイルス配列の位置のウイルスゲノム内に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養液中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２−２４８）。
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用する。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
ＡＡＶベクターの末端反復は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを判定することもできる。
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１３，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
４．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して相同の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、または前駆細胞、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞が、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）に送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用され得、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加されるかまたは減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞が患者に提供される場合、場合によっては、オフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されないだろう。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞を活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超または８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１０％未満の治療用細胞が活性化されるような、誘導可能なＣＳＭ発現Ｔ細胞を活性化するこの選択された結果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。有効量は、所望の治療的応答（例えば、リガンド誘導物質が投与される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、またはＣＤ１９発現白血病細胞のレベルの低下）を達成する量でもあり得る。
任意の特定の用途に対する有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などのような因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬が、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質が、細胞を殺傷するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質より先に行われ得る、他の作用物質と同時であり得る、および／または他の作用物質の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれ以上の様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれ以上まで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
最適化されたおよび個別化された治療的処置
リガンド誘導物質の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベルを測定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している可能性がある腫瘍細胞またはＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルが、測定され得る。
例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後に固形腫瘍を有するという判定は、多量体リガンドを投与することによって、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞活性化することによってそれらの細胞を活性化する必要があり得るという指示を臨床医に提供する。別の例では、多量体リガンドで処置した後に、患者が、低下したレベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという判定は、追加の用量の多量体リガンドが必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、多量体リガンドで処置した後、患者が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという判定は、少なくとも１つのさらなる用量の多量体リガンドを投与する必要があり得ると臨床医に指示し得る。用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミング）の両方を含むと意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与される多量体リガンドの量のことを指す。したがって、投与量レベルの上昇は、被験体の体重に対して投与されるリガンドの量の増加を意味し得る。さらに、投与される用量（例えば、多量体リガンドが持続注入ポンプを使用して投与されるとき）の濃度の上昇は、１分あたりまたは１秒あたりに投与される濃度（ひいては、投与される量）が上昇することを意味し得る。
したがって、例えば、ある特定の実施形態において、上記方法は、多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合、さらなる用量の多量体リガンドを被験体に投与する工程を含む。上記方法は、例えば、多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、および被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合、さらなる用量の多量体リガンドを被験体に投与する工程も含む。これらの実施形態では、例えば、患者は最初に、本明細書中に提供される方法に従って治療用細胞およびリガンドで処置される。最初の処置の後、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数は、最初の処置の前の時点と比べて減少し得る。この最初の処置の後のある特定の時点において、患者は、再度試験されるか、または患者は、疾患症状について継続的にモニターされ得る。例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数が、最初の処置の直後の時点と比べて増加していると判定される場合、リガンドは、さらなる用量のために投与され得る。誘導可能なＣＳＭを発現する治療用細胞が、さらなるリガンドの非存在下においては比較的不活性な状態であるが患者の中に残っているので、このモニタリングおよび処置スケジュールは、継続され得る。
その後の薬物の用量、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を特定し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、その後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示書を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、保健サービス提供者は、コンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするために生物学的マーカーをモニターする工程が存在し得る。
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３は、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。例えば、水溶液における非経口投与の場合、その溶液は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースと等張性にされ得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、細胞が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらなる細胞および誘導物質が２週間間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０週間にわたって投与される投薬スケジュールを含み得る。
他の投薬スケジュールには、例えば、１用量の細胞および１用量の誘導物質が投与されるスケジュールが含まれる。別の例では、そのスケジュールは、細胞を投与する工程を含み得、誘導物質が、０週目に投与された後、さらなる細胞および誘導物質の投与が、４週間間隔で、例えば、合計４、８、１２、１６、２０、２４、２８または３２週間にわたって行われる。
ある用量の細胞の投与は、１セッションでまたは２以上のセッションで行われ得るが、用量という用語は、リガンドを投与する前に投与される細胞の総量のことを指し得る。
必要であれば、上記方法は、処置において使用されるより多くの細胞を得るためのさらなる白血球アフェレーシスをさらに含み得る。
疾患を処置するための方法
本方法は、病原微生物によって引き起こされる疾患および／または過剰増殖性疾患の処置または予防の方法も包含する。
処置され得るかまたは予防され得る疾患としては、ウイルス、細菌、酵母、寄生生物、原生動物、癌細胞などによって引き起こされる疾患が挙げられる。薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）は、一般化された免疫賦活物（Ｔ細胞を活性化する組成物またはシステム）として使用され得、それ自体、疾患を処置する際の有用性を有する。処置され得るおよび／または予防され得る例示的な疾患としては、ウイルス病因の感染症（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）、パピローマウイルスなど）；または細菌病因の感染症（例えば、肺炎、結核、梅毒など）；または寄生生物病因の感染症（例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など）が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含む癌としては、原発性または転移性メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌腫、腺扁平上皮癌腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頸癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提示されるＴ細胞活性化システムを使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変（例えば、腺腫様過形成および前立腺上皮内新形成）、上皮内癌、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
処置方法において、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞）の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提供されるとき、任意の症状よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症状の発生時または発生後に提供される。したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす物質もしくは疾患状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。
例えば、脈管構造においてＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨塊（ｂｏｎｅｙ ｍａｓｓ）およびリンパ系に存在する固形腫瘍を含む、任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得る。処置され得る他の固形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり得、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるために必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の用途に対する有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などのような因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。
Ａ．遺伝子に基づく治療
ある特定の実施形態において、共刺激ポリペプチド（例えば、本明細書中で論じられるもの）を提供することができる発現構築物が、細胞に、および例えばＴ細胞において提供される。発現ベクターおよびその中に使用される遺伝的エレメントに関する長い考察が、参照によりこの項に援用される。ある特定の例では、発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルス）であり得る。別の例では、ベクターは、リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。
遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベクターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびインビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。インビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０５、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０７、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０８、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０９、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１１または１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１２個の感染性粒子が患者に送達され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３は、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。
Ｂ．細胞に基づく治療
企図される別の治療は、形質導入されたＴ細胞の投与である。それらのＴ細胞は、インビトロにおいて形質導入され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。
細胞に基づく治療では、形質導入されるＴ細胞は、例えば、標的抗原核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか；細胞溶解産物、タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか；または細胞と電気的に融合され得る。それらの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞、または他の病原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。
Ｃ．併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合がある。
ある特定の実施形態において、抗癌剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗癌」剤は、例えば、１つ以上の癌細胞を殺傷すること、１つ以上の癌細胞においてアポトーシスを誘導すること、１つ以上の癌細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍もしくは１つ以上の癌細胞への血液の供給を減少させること、１つ以上の癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を予防するかもしくは阻害すること、または癌を有する被験体の寿命を延長することによって、被験体における癌に悪影響を与えることができる。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線治療剤（放射線治療）、外科手技（手術）、免疫治療剤（免疫療法）、遺伝的治療剤（遺伝子治療）、ホルモン治療、他の生物学的薬剤（生物療法）および／代替療法が挙げられる。
さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび／または予防するために、抗生物質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシン、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アンチモン類（ａｎｔｉｍｏｎｉａｌｓ）、アトバコン、スチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類（ｄｅｆｉｎｓｉｎｓ）、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類（例えば、シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
より一般的には、そのような薬剤は、癌細胞および／もしくは微生物を殺傷するためまたは癌細胞および／もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとともに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞を薬剤および薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもたらされる。これは、薬学的組成物と１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または２つ以上の別々の組成物もしくは製剤（ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は１つ以上の薬剤を含む）と細胞を接触させることによって達成され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬が標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質が、細胞を殺傷するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質より先に行われ得る、他の作用物質と同時であり得る、および／または他の作用物質の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれ以上の様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれ以上まで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、タキソテール（ドセタキセル）または別のタキサン、例えば、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）であり得る。化学療法剤は、治療用細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば、化学療法剤は、第１の用量のＴ細胞を投与する約１年前、１１、１０、９、８、７、６、５もしくは４ヶ月前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２，１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間前もしくは１週間前に、投与され得る。または、例えば、化学療法剤は、第１の用量のＴ細胞または誘導物質を投与した約１週間後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月後、または１年後に投与され得る。
化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチンは、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルに加えて投与され得る。
下記に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するものであって、本技術を限定しない。
以下の項では、治療用細胞、例えば、Ｔ細胞において、誘導可能なキメラシグナル伝達分子を発現する方法、および形質転換された細胞を使用する方法の例が、提供される。誘導可能なポリペプチドを発現する方法、形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞の使用、およびアッセイは、例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９−１０２４（１９９３）；２００８年７月２９日に発行された“Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”という表題の米国特許第７，４０４，９５０号；２０１１年４月１４日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ”という表題の米国特許出願番号１３／０８７，３２９；および２０１１年５月２０日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓという表題の米国特許出願番号１３／１１２，７３９（これらの全体が参照により本明細書中に援用される）に論じられている。
実施例１：誘導可能なキメラシグナル伝達分子発現ベクターの構築および評価
ベクターの構築および発現の確認
ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６に融合されたシグナル伝達分子を含む、治療薬としての使用に適した発現ベクターを構築する。これらの方法は、１つ以上の共刺激ポリペプチドを発現するためにも使用され得る。誘導可能なＣＳＭは、小分子医薬を使用して二量体化（または多量体化）され得る。誘導可能なＣＳＭをコードする核酸を、リガンド結合ドメインをコードする核酸に融合し、蛍光マーカーであるＧＦＰの発現も可能にする、ＳＦＧレトロウイルスベクターまたはｐＬｅｎｔｉ７．３レンチウイルスベクターに挿入する。
誘導可能なＣＳＭポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーとともにＣＳＭ配列に連結された、２つ、３つまたはそれ以上、ある特定の実施形態では、２つまたは３つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ−例えば、Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアントまたはＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８））を含む。レトロウイルスにおいて発現されたときの相同組換えを防ぐために、ＦＫＢＰ（Ｆｖ２）の１つ以上のアミノ酸配列をコドンゆらぎにする（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、元々コードされていたアミノ酸を維持したサイレント変異によって変更する）。すべての構築物を、ＳＦＧまたはｐＬｅｎｔｉ７．３にクローニングする。
２９３Ｔ細胞を、これらの各構築物でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後に、マーカー遺伝子ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって解析する。ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現レベルに加えて、発現された遺伝子産物をウエスタンブロットによって解析することにより、誘導可能なキメラシグナル伝達分子の発現も確かめる。例えば、共刺激ポリペプチドに結合する抗体が、そのウエスタンブロットのために使用され得る。
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、アプロチニン、ロイペプチンおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む溶解緩衝液（５０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１２％水、４％ブロモフェノールブルー０．５％）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。３０分間の遠心分離の後、上清を収集し、１：２でＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合し、煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングする。膜を、ウサギ抗共刺激ポリペプチド免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；１：５００希釈）およびマウス抗ＧＦＰ ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；１：２５，０００希釈）でプロービングする。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝露し、タンパク質の発現を、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で検出する。次いで、その膜をストリッピングし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）でリプロービングすることにより、ローディングの質を調べる。
誘導可能なＣＳＭ発現構築物の評価
細胞株
癌細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＡ５４９、ならびにヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ−２９３Ｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手する。細胞を、３７℃における５％二酸化炭素（ＣＯ２）を含む加湿雰囲気において、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む完全ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持する。形質導入されたＴ細胞およびＰＨＡ芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）培地中で維持する。
Ｔ細胞の活性化
拡大および形質導入のためのＴ細胞の活性化は、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して行われる。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。
レトロウイルス構築物およびレンチウイルス構築物
ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１およびＨｅｒ２／Ｎｅｕを標的化するコドン最適化された一本鎖可変フラグメントを含む誘導可能なＣＳＭ（ｉＣＳＭ）およびＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ構築物は、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によって合成される。ｉＣＳＭ構築物は、Ｔ細胞レセプターのＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ鎖を含む共刺激内部ドメインにインフレームで連結されたＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインからなる。ＣＡＲ構築物は、ヒトＩｇＧ１−Ｃｈ２Ｃｈ３ドメインおよびＣＤ３−ゼータ鎖をインフレームで含むｓｃＦｖフラグメントをクローニングすることによって作製される。ｉＣＳＭ構築物とＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ構築物の両方を、エメラルドＧＦＰを共発現する、ＳＦＧレトロウイルス骨格またはｐＬｅｎｔｉ７．３レンチウイルス骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。ｉＣＳＭの刺激作用および共刺激作用、ならびにＣＡＲ−ＣＤ３ゼータの細胞傷害性の評価を、これらの導入遺伝子をコードするレトロウイルスまたはレンチウイルスでＴ細胞を個別にまたは同時に形質導入することによって行う。
レトロウイルス形質導入
レトロウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、ｉＣＳＭ構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで約８０℃で保存する。レンチウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用して、プラスミドｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）およびｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶＧ ｅｎｖ）とともに、ｉＣＡＲ構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで約８０℃で保存する。大規模なレトロウイルスの生成のために、一過性ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を作製する。導入遺伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを拡大し、リンパ球形質導入のためのウイルスを作製するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価を、８週間超にわたる連続培養中、維持する。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレートを、３７℃において１時間または４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃において３０分間、プレートを１．５ｍｌの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、Ｔ細胞芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたウイルス上清において１ウェルあたり５×１０５細胞でプレーティングする。６０時間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。
ｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性
形質導入された各Ｔ細胞株の細胞傷害活性を、以前に提示されたような、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価する。ｉＣＳＭ、ＰＳＭＡ ＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ、またはｉＣＳＭウイルスとＣＡＲウイルスの両方で形質導入されたＴ細胞を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激された自家リンパ球（ＰＨＡ芽球）、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３またはＤＵ１４５およびＡ５４９癌細胞株、ならびにヒトＰＳＭＡを発現するトランスジェニックＡ５４９（Ａ５４９−ＰＳＭＡ）を含む、Ｃｒ５１で標識された標的細胞に対して比較する。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の５１Ｃｒ放出を測定するために使用する。３つ組ウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出）として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、Ａ５４９およびＡ５４９−ＰＳＭＡを、蛍光性ｍＯｒａｎｇｅを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。ｍＯｒａｎｇｅを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下において、形質導入されていないＴ細胞またはＣＡＲによって改変されたＴ細胞とともに、腫瘍細胞とＴ細胞とが１：１０という比で共培養する。２４時間後、ｉＣＡＲを有するＴ細胞を１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。７２時間後、細胞を捕集し、カウントし、Ｔ細胞を検出するためにＣＤ３で標識し、ｍＯｒａｎｇｅ腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ）によって解析する。
ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の表現型分析および活性化状態
ｉＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ。ｉＣＳＭ刺激剤として１０〜１００ｎＭ ＡＰ１９０３を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いて細胞を解析する。抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して、ＣＡＲの発現を評価した。
ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞のサイトカイン産生の解析
１００ｎＭ ＡＰ１９０３による刺激の前および後（２４時間）のＴ細胞培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリビーズアレイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して計測する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示書に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検証する。
ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の増殖
ｉＣＳＭを介したＡＰ１９０３誘導性シグナル伝達の増殖効果を、ＡＰ１９０３に曝露した後の、形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞の細胞成長を計測することによって評価する。Ｔ細胞を、３７℃において１０分間、１０μＭカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。その後、１×１０６個のＣＦＳＥで標識されたｉＣＳＭ改変Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地のみにおいて培養するか、または１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。５日後、細胞を収集し、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５およびＣＤ１９−ＰＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。
可溶性免疫グロブリンがＣＡＲ＋Ｔリンパ球の増殖および拡大に影響するかを評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られたヒト血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の段階希釈物とともに細胞を１×１０５細胞／ウェルで培養する。７２時間後、それらの細胞を、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）メチル−３［Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でパルスし、さらに１５時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集し、乾燥させ、毎分のカウント数を、β−シンチレーションカウンター（ＴｒｉＣａｒｂ ２５００ ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）において計測する。これらの実験は、３つ組で行う。他の実験では、コントロールおよびＣＡＲ＋Ｔリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリンの段階希釈物を１日おきに加える培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を用いて細胞を２日おきにカウントする。
インビボ実験
６〜８週齢の非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを照射し（２５０ｒａｄ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁された１０×１０６〜１５×１０６個のＬＮＣａＰ腫瘍細胞を、そのマウスの右側腹部の皮下に注射する。２週間後、直径がおよそ０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスの尾静脈に、形質導入されていないＴ細胞またはｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞（合計１５×１０６個）を注射した。それらのマウスを、ランダムに２群に分ける：Ｔ細胞を拡大するために、１群には、ＣＩＤ（５０〜１２５μｇ ＡＰ１９０３、腹腔内、１週間に２回）を投与し、もう１群には、キャリアのみ（１６．７％プロパンジオール、２２．５％ＰＥＧ４００および１．２５％Ｔｗｅｅｎ８０、腹腔内、１週間に２回）を投与する。２１日間にわたるノギス計測によって、腫瘍の成長についてマウスを評価する。末梢血サンプルを、７、１４および２１日目に後眼窩出血によって採取することにより、ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ１９発現Ｔ細胞に対するフローサイトメトリー解析を用いて、ｉＣＳＭまたはコントロールＴ細胞の残留および拡大を計測する。
ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の特色のインビボにおける評価
誘導可能なＣＳＭの発現が、Ｔ細胞の特色を変化させないことを確実にするために、形質導入されていないまたは非機能性の誘導可能なＣＡＲ（ＰＳＭＡ ＣＡＲ−ＣＤ３ゼータのみ）の表現型、抗原特異性、増殖能および機能を、ｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞と比較する。形質導入された細胞および形質導入されていない細胞におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋およびＴＣＲα／β＋細胞の数を比較し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−２を含むサイトカインの産生産生も同様に比較する。指数関数的に増えるＣＴＬの成長の特色、ならびに増殖に対する抗原およびＩＬ−２への依存性を評価し、抗原刺激の際のタイプＴＨ１およびＴＨ２サイトカインの表現型データおよび分泌データも同様に評価する。
実施例２：治療のためのヒト細胞における誘導可能なＣＳＭの使用
発現構築物、およびヒト細胞においてその発現構築物を使用する方法が、この実施例に提示される。
材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から作製される。簡潔には、健常ドナーまたは癌患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、拡大および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。
プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なＣＳＭからなる。その誘導可能なＣＳＭは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトＣＳＭに接続された、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８）からなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９５％の切断を媒介して、ｉＣＳＭのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生するＰＧ１３ベースの安定したクローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミドプロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、拡大し、ベクター作製のために使用する。
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および拡大のための培養液は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって拡大し、凍結保存する。
遺伝子改変され、同種異系枯渇された（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。高細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコーティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０６細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、レトロウイルスベクター含有新鮮培地と１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養液とが３：１の中に１×１０６細胞／ｍｌで播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養液中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×１０５細胞／ｍｌの播種密度で拡大する。
ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、１つの例において、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間拡大し、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブゲートを設定するために使用する。ＣＡＲ発現を、抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して評価する。
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を判定する。すべてのデータを平均値±１標準偏差として表す。
実施例３：ＡＰ１９０３依存性Ｔ細胞活性化の計測
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験では、二量体化に応答したサイトカインの産生を、マルチプレックスサイトカインビーズアレイを使用して計測した。
方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニング：
１．２つのＳＦＧベースのレトロウイルスベクターを、Ｇｉｂｓｏｎクローニングによって構築した（ここで、ＰＣＲ産物を、ｐＡｄ１１２７−０２−ｉＭＣから増幅し、ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ ＤＮＡフラグメントの代わりにｐＢＰ０３２０−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ．２Ａ．ΔＣＤ１９構築物に挿入した）。
ａ．第１のベクターにおいて、増幅されるＰＣＲ産物は、Ｆｖ’Ｆｖであるか、またはＦＫＢＰｖ３６フラグメントだけをレトロウイルス骨格に挿入した場合、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位においてＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌを置き換えた。このベクターは、ｐＢＰ０１７１−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９と呼ばれ、いかなるＴ細胞シグナル伝達分子も有しないコントロールベクターである。
ｂ．第２のベクターにおいて、増幅されるＰＣＲ産物は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’．Ｆｖ（またはｉＭＣｎｏＥ）だった。これを、ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ ＤＮＡ配列の代わりに、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限酵素認識部位においてｐＢＰ０３２０プラスミドに挿入した。このベクターは、ｐＢＰ０１７２−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ｉＭＣｎｏＥ．２Ａ．ΔＣＤ１９と呼ばれる。「ｎｏＥ」という接尾辞は、このｉＭＣ ＤＮＡが、エピトープタグをコードしないことを示す。
レトロウイルスの産生：
２．一過性のトランスフェクション法によってレトロウイルスを作製し、ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を以下のプラスミドでトランスフェクトした：
ａ．ＳＦＧレトロウイルスプラスミド（ｐＢＰ０１７１またはｐＢＰ０１７２；それぞれＲＶ−１７１またはＲＶ−１７２）
ｂ．レトロウイルスエンベローププラスミド（ＲＤ１１４）
ｃ．Ｇａｇ／ｐｏｌプラスミド（ｐＥＱ−ＰＡＭ−Ｅ） 。
３．４８および７２時間後に、複製欠損レトロウイルスを含むトランスフェクトされた細胞からの上清を捕集し、ドライアイス／エタノールにおいて急速凍結し、Ｔ細胞の形質導入まで−８０℃で保存した。
４．初代Ｔ細胞を形質導入するために、健常ドナー由来のＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたＴ細胞増殖培地中において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化した。３日後、Ｔ細胞を活性化し、収集し、レトロウイルス形質導入の準備を整えた。それらのＴ細胞を形質導入するために、まず、組織培養用に処理されていないプレートを４℃において一晩、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングした。次いで、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎを除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。次いで、レトロウイルス上清を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎプレートをコーティングするために使用した。次いで、活性化Ｔ細胞をウェルに加え、プレートを遠心分離することにより、ウイルス粒子の結合および形質導入を促進した。４８時間後、それらのＴ細胞を収集し、ＣＤ３とＣＤ１９との同時発現についてフローサイトメトリーによって解析することにより、ウイルスの形質導入効率を測定した。
ＡＰ１９０３によって誘導されたＴ細胞活性化の、サイトカイン産生による解析：
５．Ｔ細胞のＡＰ１９０３依存性Ｔ細胞活性化を評価するために、１×１０５個の形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞またはコントロールレトロウイルス（ＲＶ−１７１）もしくはｉＭＣを含むレトロウイルス（ＲＶ−１７２）で形質導入されたＴ細胞を、９６ウェルプレートに３つ組でプレーティングし、培地のみまたは１０ｎＭ ＡＰ１９０３を含む培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２において培養した。
６．２４時間後、それらの細胞を静かに混合し、プレートを遠心分離した。次いで、上清を捕集し、以下のサイトカインおよびケモカインを計測するＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ２７−ｐｌｅｘプレートにプレーティングした：
ａ．塩基性ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ＲＡ、エオタキシン、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−アルファおよびＶＥＧＦ。
ｂ．続いて、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＭＡＧＰＩＸ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｅｒを使用して、上清中のサイトカインおよびケモカインを計測し、そのプレートにおける標準物質と比較した。
結果：
形質導入効率：
１．２人の健常ドナー由来のＴ細胞を、レトロウイルスで形質導入し、４８時間後、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋同時発現についてフローサイトメトリーによって測定された効率は、以下のとおりだった：
ａ．ドナー０６３
ｉ．ＮＴ＝６．５４％
ｉｉ．ＲＶ−１７１＝７３．９％
ｉｉｉ．ＲＶ−１７２＝５４．６％
ｂ．ドナー７０７
ｉ．ＮＴ＝２．１６％
ｉｉ．ＲＶ−１７１＝８５．２％
ｉｉｉ．ＲＶ−１７２＝７３．６％ 。
２．形質導入は、ベクターとドナーの両方についてかなり高かったことから、それらがＨＥＫ２９３Ｔ細胞にとって有毒でないことおよびウイルス力価が良好であることが示唆された。
サイトカイン／ケモカインの産生
３．サイトカインおよびケモカインの分泌の解析から、ＡＰ１９０３二量体化に対する顕著な依存性が示された。Ｔ細胞によって産生された以下のサイトカインおよびケモカインは、２４時間にわたって誘導を示したが、コントロールベクターで形質導入されたＴ細胞または形質導入されていないＴ細胞からは誘導されなかった：
ａ．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＰ１０、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−アルファ 。
４．さらに、他のサイトカインおよびケモカインは、ｉＭＣのＡＰ１９０３活性化によって誘導されないとみられた。これらには、以下が含まれる：
ａ．塩基性ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ＲＡ、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＶＥＧＦ。
ある特定の結果は、図７〜１５にも示される。ＮＴ＝形質導入されていない活性化Ｔ細胞
ＲＶ０１７１＝ＳＦＧ−Ｍｙｒ．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９；ＲＶ０１７２＝ＳＦＧ＝Ｍｙｒ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９。
Ｔ細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３で２４時間刺激し、次いで、上清をサイトカインレベルについてアッセイした。
実施例４：ＡＰ１９０３依存性のＴ細胞の細胞傷害性の計測：
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験では、ＡＰ１９０３活性化の２つの態様を調べた。第１に、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の近位に存在する場合、それらの活性化によって腫瘍細胞の殺傷が誘導されるのか？第２に、Ｔ細胞が、ＡＰ１９０３を介して活性化される場合、それらは増殖するのか？
方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニングならびにレトロウイルスの産生
１．方法は、上記の実施例４において論じられた方法と本質的に同じである。同じ細胞をこのアッセイのために使用した。
ＧＦＰによってマークされたＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞株の作製：
２．ＣＡＰＡＮ−１をＡＴＣＣから購入した。続いて、ＥＧＦＰ／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質に対する遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞が、Ｇ４１８抗生物質とともに培養することによって長い時間にわたって選択されるのを可能にするネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＰ０１６８−ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰｌｕｃプラスミドによるトランスフェクションによって、その細胞株を遺伝子改変した。培養後、高いＧＦＰ発現を有するクローンを選択し、＞９５％ＧＦＰを有する細胞株が得られるまで継代培養した。
ｉＭＣ対応（ｅｎａｂｌｅｄ）Ｔ細胞とＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞との共培養：
３．形質導入されていないＴ細胞またはＲＶ−１７１（コントロールベクター）もしくはＲＶ−１７２（ｉＭＣベクター）で形質導入された細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中においてＴ細胞と腫瘍細胞とが５：１の比で培養した。次いで、共培養物を３７℃および５％ＣＯ２において７２時間インキュベートした。続いて、蛍光顕微鏡法によって、および０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養物を収集し、培養物中のＧＦＰ＋ＣＤ３−腫瘍細胞の頻度をフローサイトメトリーによって計測することによって、ＧＦＰ＋腫瘍細胞の存在について培養物を解析した。
結果：
４．共培養物のウェルを調べたところ、両方のドナーにおいて、ＡＰ１９０３で刺激されたＲＶ−１７２（ｉＭＣ含有ベクター）で形質導入されたＴ細胞は、大きなＴ細胞芽球コロニーによって明らかであるように、増殖していることが明らかだった。さらに、蛍光顕微鏡法によって、ＡＰ１９０３を投与されたＲＶ−１７２を形質導入されたＴ細胞を含む共培養物は、非常に少ない生存可能なＧＦＰ＋腫瘍細胞しか示さなかった。これらの最初の観察の後、Ｔ細胞および腫瘍細胞を収集し、フローサイトメトリーによって解析することにより、残存しているＣＡＰＡＮ−１ ＧＦＰ＋腫瘍細胞の頻度を測定した。
５．顕微鏡法によって観察されたように、フローサイトメトリーは、ＡＰ１９０３によって処理されたｉＭＣを形質導入された（ＲＶ−１７２）Ｔ細胞を含む共培養物におけるＡＰ１９０３の明白な効果を示した。ＧＦＰ＋腫瘍細胞の減少は、この条件だけで生じ、コントロールベクターで形質導入されたＴ細胞では生じず、二量体化剤を投与されなかったＲＶ−１７２で形質導入されたＴ細胞ではより低い程度でしか生じなかった。
６．まとめると、これらのデータから、Ｔ細胞におけるｉＭＣの活性化が、Ｔ細胞の殺傷を誘導することができ、ＡＰ１９０３によって処理されたＴ細胞の増殖を誘導することが示唆される。集合的には、サイトカイン／ケモカイン産生に関する本発明者らの知見とともに、これらのデータは、ｉＭＣが、Ｔ細胞において活性化され得ること、およびｉＭＣ二量体化の際にＴ細胞がそのエフェクター機能を保持し、高めることを示唆する。
ある特定の結果は、図１６〜１９にも示される。
実施例５：エキソビボにおけるＴ細胞の活性化およびヒト被験体への投与
ヒトを治療するために、改変されたＴ細胞を使用する方法が、この実施例に提示される。この実施例では、共刺激ポリペプチドの細胞質領域は、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８に由来する。これらの方法は、他の細胞、例えば、ＮＫおよびＮＫＴ細胞、ならびに腫瘍浸潤リンパ球に対して適合され得、本明細書中で論じられるような他の共刺激ポリペプチド細胞質領域を含む誘導可能なＣＳＭに対しても適合され得る。
材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から作製される。簡潔には、健常ドナーまたは癌患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、拡大および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。
プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なＣＳＭからなる。その誘導可能なＣＳＭは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトＣＳＭに接続された、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８）からなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、誘導可能なＣＳＭのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミド（ｐｌａｍｉｄ）プロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、拡大し、ベクター作製のために使用する。
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および拡大のための培養液は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって拡大し、凍結保存する。
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。高細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコーティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０６細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、レトロウイルスベクター含有新鮮培地と１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養液とが３：１の中に１×１０６細胞／ｍｌで播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養液中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×１０５細胞／ｍｌの播種密度で拡大する。
ＣＤ１９免疫磁気選択
必要であれば、ＣＤ１９に対する免疫磁気選択を、形質導入の４日後に行う。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間拡大し、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。
実施例６：白血病患者の処置
本願の方法を使用して、進行した治療抵抗性白血病を有する白血病患者を処置する本実施例は、他の状態または疾患、例えば、他の過剰増殖性疾患または固形腫瘍にも適用され得る。これらの方法は、標的抗原に応じて一本鎖可変フラグメントが変化し得るという理解の下で、本質的には論じられるように使用され得る。
Ｔ細胞を、誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入する。それらのＴ細胞を、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でも形質導入する。誘導可能なＣＳＭの例としては、ＣＤ２８ポリペプチド細胞質刺激領域および４−１ＢＢポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、図４に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ３ゼータポリペプチドも含み得る。キメラ抗原レセプターは、ＣＤ１９を認識する一本鎖可変フラグメントを含む。
患者は、リンパ球枯渇の前処置を受けた後、形質導入されたＣＤ１９標的化Ｔ細胞を投与される。それらのＴ細胞は、自家、同種異系または非同種異系であり得る。それらのＴ細胞を投与した後、キメラシグナル伝達分子を誘導することによってＣＤ１９標的化Ｔ細胞を拡大するために、リガンド誘導物質をその患者に投与する。その用量は、例えば、毎日、１週間に２回、または毎週、提供され得る。腫瘍細胞のレベルをモニターし、リガンド誘導物質、例えば、ＡＰ１９０３の投薬スケジュールを腫瘍細胞の負荷に基づいて調整する。制御されない速すぎる速度のＴ細胞の拡大、活性化および腫瘍細胞殺傷は、不必要に患者を害するより重度のサイトカインストーム（ｃｙｔｏｋｉｎｇ ｓｔｏｒｍ）をもたらし得るという懸念を理由に、投薬スケジュールは、毒性を限定し、患者に対して多大な害を引き起こさず、例えば、患者を病院の集中治療室の外で維持する速度で完全な回復を達成するようにデザインされる。いったん患者が完全な回復を達成し、決定されるある特定の長さの時間、例えば、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間にわたって疾患の無いままになると、ＡＰ１９０３の投与は、停止される。処置の後、リガンド誘導物質の非存在下において、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞の数は、減少する。少数の静止状態のＣＤ１９標的化Ｔ細胞の生存を可能にする低レベルの基底のシグナル伝達が、存在し得る。リガンド誘導物質なしでは、これらの細胞は、不活性のままであり、正常なＢ細胞を取り戻させる。将来の任意の時点において、患者が、白血病の再発を起こした場合、リガンド誘導物質であるＡＰ１９０３の投与を再開することにより、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞が再活性化し、その患者において完全奏効が再誘導される。複数の再発の場合には、この追加の投与は、２回以上繰り返されてもよい。
実施例７：ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞におけるｉＭＣ活性の計測：
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験は、切断型ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む誘導可能な共刺激分子が、ＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞上に高度に発現される前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を認識するＣＡＲで形質導入されたＴ細胞によるＧＦＰ改変ＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞の殺傷を改善するかを調べるためにデザインされる。
方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニング：
１．Ｔ細胞の形質導入は、ＲＶ−１７２（ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ．Ｆｖ’．２Ａ．ΔＣＤ１９）およびＲＶ−８９（ＳＦＧ．ＰＳＣＡｓｃＦｖ．ＣＨ２ＣＨ３．ＣＤ２８．ゼータ）を用いて行う。そのｓｃＦｖは、ヒト化モノクローナル抗体１Ｇ８（ＵＳ２０１２０７７９６２Ａ１におけるヒト化抗ＰＳＣＡから得られる）由来のｓｃＦｖを使用してＰＳＣＡを標的化する。これは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ＣＨ３領域に連結され、それは続いて、その分子の膜貫通部分と細胞質部分の両方を含むＣＤ２８に連結される。ＣＤ２８は、ＣＤ３ゼータの細胞質部分に連結される。
レトロウイルスの産生：
２．本質的には、前の実施例と同じである。
ＧＦＰによってマークされたＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞株の作製：
３．ＣＡＰＡＮ−１をＡＴＣＣから購入する。続いて、ＥＧＦＰ／ホタルルルシフェリン融合タンパク質に対する遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞が、Ｇ４１８抗生物質とともに培養することによって長い時間にわたって選択されるのを可能にするネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＰ０１６８−ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰｌｕｃによるトランスフェクションによって、その細胞株を遺伝子改変する。培養後、高いＧＦＰ発現を有するクローンを選択し、＞９５％ＧＦＰを有する細胞株が得られるまで継代培養する。
ｉＭＣ対応Ｔ細胞とＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞との共培養：
４．形質導入されていないＴ細胞またはＲＶ−８９（ＰＳＣＡ ＣＡＲ）およびＲＶ−１７２（ｉＭＣベクター）で同時形質導入された細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中においてＴ細胞と腫瘍細胞とが５：１の比で培養する。次いで、共培養物を３７℃および５％ＣＯ２において７２時間インキュベートする。続いて、蛍光顕微鏡法によって、および０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養物を回収し、培養物中のＧＦＰ＋ＣＤ３−腫瘍細胞の頻度をフローサイトメトリーによって計測することによって、ＧＦＰ＋腫瘍細胞の存在について培養物を解析する。
結果：
１．培養物を蛍光顕微鏡法によって調べることにより、誘導可能な共刺激分子およびキメラ抗原レセプターを形質導入されたＴ細胞を含むウェルおよびＡＰ１９０３を投与されたウェルにおける腫瘍細胞殺傷の改善を評価する。
２．フローサイトメトリーを使用して、トリプシン処理後の培養物中のＧＦＰ＋細胞を解析することにより、ＡＰ１９０３がこの短い培養期間（７２時間）において腫瘍細胞数の減少に寄与するかを判定する。培養の時間は、およそ５日間まで延長され得る。フローサイトメトリーのプロットは、５：１の比において、両方のウイルスで形質導入され、ＡＰ１９０３を投与されたウェル内のＧＦＰ＋細胞の減少を示し得る。
３．残存している生存可能なＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ細胞を、ＡＰ１９０３なしのＮＴ Ｔ細胞の条件に正規化することにより、腫瘍細胞殺傷に対するｉＭＣ活性化の効果が示される。
実施例８：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例
以下の配列は、誘導可能なキメラシグナル伝達分子（ＣＳＭ）配列のために使用されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の例を順番に提供する。
配列番号１、ミリストイル化（Ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｉｏｎ）ｎｔ
ＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣ
配列番号２、ミリストイル化 ａａ
ＭＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲ
配列番号３、リンカー配列（ＭｙｒとＦｖ１との間）ｎｔ
ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧ
配列番号４、リンカー配列（ＭｙｒとＦｖ１との間）ａａ
ＬＥＳＧＧＧＳＧ
配列番号５、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）ｎｔ
ＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
配列番号６、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）ａａ
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号７、リンカー配列（Ｆｖ１とＦｖ２との間）ｎｔ
ＧＴＣＧＡＧ
配列番号８、リンカー配列（Ｆｖ１とＦｖ２との間）ａａ
ＶＥ
配列番号９、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）ｎｔ
ＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＧＧＴＣＡＧＡＣＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴＣＡＣＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＡＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＡＣＧＣＴＣＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧ
配列番号１０、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）ａａ
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号１１、リンカー配列（Ｆｖ２とＣＤ２８との間）ｎｔ
ＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＧ
配列番号１２、リンカー配列（ＭｙｒとＣＤ２８との間）ａａ
ＳＧＧＧＳＧＶＥ
配列番号１３、ＣＤ２８ ｎｔ
ＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＣＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣＣ
配列番号１４、ＣＤ２８ ａａ
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
配列番号１５、リンカー配列（ＣＤ２８と４−１ＢＢとの間）ｎｔ
ＧＧＡＴＣＣ
配列番号１６、リンカー配列（ＣＤ２８と４−１ＢＢとの間）ａａ
ＧＳ
配列番号１７、４−１ＢＢ ｎｔ
ＡＧＴＧＴＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧ
配列番号１８、４−１ＢＢ ａａ
ＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
配列番号１９、リンカー配列（４−１ＢＢとＣＤ３ゼータとの間）ｎｔ
ＡＣＧＣＧＴ
配列番号２０、リンカー配列（４−１ＢＢとＣＤ３ゼータとの間）ａａ
ＴＲ
配列番号２１、ＣＤ３ゼータ ｎｔ
ＣＧＧＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＡＧＡＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＡＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣ
配列番号２２、ＣＤ３ゼータ ａａ
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号２３、リンカー配列（ＣＤ３ゼータとフューリンとの間）ｎｔ
ＧＴＣＧＡＣ
配列番号２４、リンカー配列（ＣＤ３ゼータとフューリンとの間）ａａ
ＶＤ
配列番号２５、フューリン ｎｔ
ＣＧＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴ
配列番号２６、フューリン ａａ
ＲＡＫＲ
配列番号２７、Ｖ５エピトープタグ ｎｔ
ＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣＴＣＡＡＣＡ
配列番号２８、Ｖ５エピトープタグ ａａ
ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ
配列番号２９、リンカー配列（Ｖ５とＰ２Ａとの間）ｎｔ
ＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣ
配列番号３０、リンカー配列（Ｖ５とＰ２Ａとの間）ａａ
ＧＳＧＳ
配列番号３１、ブタテッショウウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ｎｔ
ＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴ
配列番号３２、ブタテッショウウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ａａ
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号３３、リンカー配列（Ｐ２ＡとΔＣＤ１９との間）ｎｔ
ＡＣＧＣＧＴ
配列番号３４、リンカー配列（Ｐ２ＡとΔＣＤ１９との間）ａａ
ＴＲ
配列番号３５、ΔＣＤ１９ ｎｔ
ＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＡＴＴＣＴＧＡ
配列番号３６、ΔＣＤ１９ ａａ
ＭＰＰＰＲＬＬＦＦＬＬＦＬＴＰＭＥＶＲＰＥＥＰＬＶＶＫＶＥＥＧＤＮＡＶＬＱＣＬＫＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲＥＳＰＬＫＰＦＬＫＬＳＬＧＬＰＧＬＧＩＨＭＲＰＬＡＩＷＬＦＩＦＮＶＳＱＱＭＧＧＦＹＬＣＱＰＧＰＰＳＥＫＡＷＱＰＧＷＴＶＮＶＥＧＳＧＥＬＦＲＷＮＶＳＤＬＧＧＬＧＣＧＬＫＮＲＳＳＥＧＰＳＳＰＳＧＫＬＭＳＰＫＬＹＶＷＡＫＤＲＰＥＩＷＥＧＥＰＰＣＬＰＰＲＤＳＬＮＱＳＬＳＱＤＬＴＭＡＰＧＳＴＬＷＬＳＣＧＶＰＰＤＳＶＳＲＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫＧＰＫＳＬＬＳＬＥＬＫＤＤＲＰＡＲＤＭＷＶＭＥＴＧＬＬＬＰＲＡＴＡＱＤＡＧＫＹＹＣＨＲＧＮＬＴＭＳＦＨＬＥＩＴＡＲＰＶＬＷＨＷＬＬＲＴＧＧＷＫＶＳＡＶＴＬＡＹＬＩＦＣＬＣＳＬＶＧＩＬＨＬＱＲＡＬＶＬＲＲＫＲＫＲＭＴＤＰＴＲＲＦ
以下は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）配列のためのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の例である（順番に、ｓｃＦｖフラグメントなしで）
配列番号３７、シグナルペプチド ｎｔ
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＧＣ
配列番号３８、シグナルペプチド ａａ
ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＲ
配列番号３９、可動性リンカー配列 ｎｔ
ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣ
配列番号４０、可動性リンカー配列 ａａ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号４１、リンカー配列（ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３との間）ｎｔ
ＧＧＡＴＣＣ
配列番号４２、リンカー配列（ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３との間）ａａ
ＧＳ
配列番号４３、ＩｇＧ１ Ｃｈ２Ｃｈ３ ｎｔ
ＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＧＴＧＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＣＧＡＧＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＣ
配列番号４４、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３ ａａ
ＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰ
配列番号４５、リンカー配列（ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３との間）ｎｔ
ＣＴＣＧＡＧ
配列番号４６、リンカー配列（ｓｃＦｖとＣＨ２ＣＨ３との間）ａａ
ＬＥ
配列番号４７、ＣＤ３ゼータ膜貫通 ｎｔ
ＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＣＧＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＧＣＴＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＴＡＡＣＣＴＣＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＣＣＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＡＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＴＡＡ
配列番号４８、ＣＤ３ゼータ膜貫通 ａａ
ＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
さらなるキメラシグナル伝達分子の配列
配列番号４９、ＯＸ４０ ｎｔ
ＧＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣ
配列番号５０、ＯＸ４０ ａａ
ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
配列番号５１、５‘ＬＴＲ配列の配列番号２２ヌクレオチド配列
ＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＡＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
さらなる配列
配列番号５２ キャプシドタンパク質前駆体ヌクレオチド配列からのＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス−２Ａ
ＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣ
配列番号５３、キャプシドタンパク質前駆体アミノ酸配列からのＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス−２Ａ
ＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号５４、３’ＬＴＲヌクレオチド配列
ＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
配列番号５５、（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ部位を有するリンカー−Ｆｖ１−Ｆｖ２−リンカーのヌクレオチド配列（Ｆｖ２の中の小文字はゆらいだコドン））
ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧａＧＴｇＣＡｇＧＴｇＧＡｇＡＣｇＡＴｔＡＧｔＣＣｔＧＧｇＧＡｔＧＧｇＡＧａＡＣｃＴＴｔＣＣａＡＡｇＣＧｃＧＧｔＣＡｇＡＣｃＴＧｔＧＴｔＧＴｃＣＡｃＴＡｃＡＣｃＧＧｔＡＴＧＣＴｇＧＡｇＧＡｃＧＧｇＡＡｇＡＡｇＧＴｇＧＡｃｔｃＴｔｃａｃＧｃＧＡｔＣＧｃＡＡｔＡＡｇＣＣｔＴＴｃＡＡｇＴＴｃＡＴＧｃＴｃＧＧｃＡＡｇＣＡｇＧＡｇＧＴｇＡＴｃｃＧＧＧＧｇＴＧＧＧＡｇＧＡｇＧＧｃＧＴｇＧＣｔＣＡｇＡＴＧＴＣｇＧＴｃＧＧｇＣＡａＣＧａＧＣｇＡＡｇＣＴｔＡＣｃＡＴｃＴＣａＣＣｃＧＡｃＴＡｃＧＣｇＴＡｔＧＧｇＧＣａＡＣｇＧＧｇＣＡｔＣＣｇＧＧａＡＴｔＡＴｃＣＣｔＣＣｃＣＡｃＧＣｔＡＣｇＣＴｃＧＴａＴＴｃＧＡｔＧＴｇＧＡｇｃＴｃｔｔｇＡＡｇＣＴｔＧａｇＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣ
配列番号５６、（ＦＶ’ＦＶＬＳアミノ酸配列）
ＬＥＳＧＧＧＳＧＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＶＥＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳＧＧＧＳＧＶＤ
配列番号５７、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）ヌクレオチド配列
ＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
配列番号５８、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）アミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号５９、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）ヌクレオチド配列
ＧＧａＧＴｇＣＡｇＧＴｇＧＡｇＡＣｇＡＴｔＡＧｔＣＣｔＧＧｇＧＡｔＧＧｇＡＧａＡＣｃＴＴｔＣＣａＡＡｇＣＧｃＧＧｔＣＡｇＡＣｃＴＧｔＧＴｔＧＴｃＣＡｃＴＡｃＡＣｃＧＧｔＡＴＧＣＴｇＧＡｇＧＡｃＧＧｇＡＡｇＡＡｇＧＴｇＧＡｃｔｃＴｔｃａｃＧｃＧＡｔＣＧｃＡＡｔＡＡｇＣＣｔＴＴｃＡＡｇＴＴｃＡＴＧｃＴｃＧＧｃＡＡｇＣＡｇＧＡｇＧＴｇＡＴｃｃＧＧＧＧｇＴＧＧＧＡｇＧＡｇＧＧｃＧＴｇＧＣｔＣＡｇＡＴＧＴＣｇＧＴｃＧＧｇＣＡａＣＧａＧＣｇＡＡｇＣＴｔＡＣｃＡＴｃＴＣａＣＣｃＧＡｃＴＡｃＧＣｇＴＡｔＧＧｇＧＣａＡＣｇＧＧｇＣＡｔＣＣｇＧＧａＡＴｔＡＴｃＣＣｔＣＣｃＣＡｃＧＣｔＡＣｇＣＴｃＧＴａＴＴｃＧＡｔＧＴｇＧＡｇｃＴｃｔｔｇＡＡｇＣＴｔＧａｇ
配列番号６０、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）アミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラポリペプチドに対するさらなる配列
配列番号８１、ミリストイル化ポリペプチドのヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣ
配列番号８２、ミリストイル化ポリペプチドのアミノ酸配列
ＭＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲ
配列番号８３、リンカーヌクレオチド配列（リンカー１）
ＣＴＣＧＡＧ
配列番号８４、リンカーアミノ酸配列（リンカー１）
ＬＥ
配列番号８５、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドのヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＣＧＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＡＣＣＧＣＣＣＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＡＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＣＧＡＣＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡ
配列番号８６、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドのアミノ酸配列
ＭＡＡＧＧＰＧＡＧＳＡＡＰＶＳＳＴＳＳＬＰＬＡＡＬＮＭＲＶＲＲＲＬＳＬＦＬＮＶＲＴＱＶＡＡＤＷＴＡＬＡＥＥＭＤＦＥＹＬＥＩＲＱＬＥＴＱＡＤＰＴＧＲＬＬＤＡＷＱＧＲＰＧＡＳＶＧＲＬＬＤＬＬＴＫＬＧＲＤＤＶＬＬＥＬＧＰＳＩＥＥＤＣＱＫＹＩＬＫＱＱＱＥＥＡＥＫＰＬＱＶＡＡＶＤＳＳＶＰＲＴＡＥＬＡＧＩＴＴＬＤＤＰＬＧＨＭＰＥＲＦＤＡＦＩＣＹＣＰＳＤＩ
配列番号８７、ΔＣＤ４０ポリペプチドのヌクレオチド配列
ＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＣＧＧＡＴＴＡＧＣＧＴＡＣＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡ
配列番号８８、ΔＣＤ４０ポリペプチドのアミノ酸配列
ＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ
配列番号８９、リンカーヌクレオチド配列（リンカー２）
ＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡ
配列番号９０、リンカーアミノ酸配列（リンカー２）
ＶＥＳＧＧＧＳＧ
配列番号９１、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）ヌクレオチド配列
ＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
配列番号９２、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）アミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号９３、リンカーヌクレオチド配列（リンカー３）
ＧＴＣＧＡＧ
配列番号９４、リンカーアミノ酸配列（リンカー３）
ＶＥ
配列番号９５、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）ヌクレオチド配列
ＧＧａＧＴｇＣＡｇＧＴｇＧＡｇＡＣｇＡＴｔＡＧｔＣＣｔＧＧｇＧＡｔＧＧｇＡＧａＡＣｃＴＴｔＣＣａＡＡｇＣＧｃＧＧｔＣＡｇＡＣｃＴＧｔＧＴｔＧＴｃＣＡｃＴＡｃＡＣｃＧＧｔＡＴＧＣＴｇＧＡｇＧＡｃＧＧｇＡＡｇＡＡｇＧＴｇＧＡｃｔｃＴｔｃａｃＧｃＧＡｔＣＧｃＡＡｔＡＡｇＣＣｔＴＴｃＡＡｇＴＴｃＡＴＧｃＴｃＧＧｃＡＡｇＣＡｇＧＡｇＧＴｇＡＴｃｃＧＧＧＧｇＴＧＧＧＡｇＧＡｇＧＧｃＧＴｇＧＣｔＣＡｇＡＴＧＴＣｇＧＴｃＧＧｇＣＡａＣＧａＧＣｇＡＡｇＣＴｔＡＣｃＡＴｃＴＣａＣＣｃＧＡｃＴＡｃＧＣｇＴＡｔＧＧｇＧＣａＡＣｇＧＧｇＣＡｔＣＣｇＧＧａＡＴｔＡＴｃＣＣｔＣＣｃＣＡｃＧＣｔＡＣｇＣＴｃＧＴａＴＴｃＧＡｔＧＴｇＧＡｇｃＴｃｔｔｇＡＡｇＣＴｔＧａｇ
配列番号９５、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）アミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号９６、リンカーヌクレオチド配列（リンカー４）
ＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣ
配列番号９７、リンカーアミノ酸配列（リンカー４）
ＳＧＧＧＳＧＶＤ
配列番号９８、フューリンプロテアーゼコンセンサス切断部位のヌクレオチド配列
ＣＧＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴ
配列番号９９、フューリンプロテアーゼコンセンサス切断部位のアミノ酸配列
ＲＡＫＲ
配列番号１００、Ｖ５エピトープヌクレオチド配列
ＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣＴＣＡＡＣＡ
配列番号１０１、Ｖ５エピトープヌクレオチド配列
ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ
配列番号１０２、リンカーヌクレオチド配列（リンカー５）
ＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣ
配列番号１０３、リンカーアミノ酸配列（リンカー５）
ＧＳＧＳ
配列番号１０４、Ｐ２Ａヌクレオチド配列
ＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴ
配列番号１０５、Ｐ２Ａアミノ酸配列
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号１０６、リンカーヌクレオチド配列（リンカー６）
ＡＣＧＣＧＴ
配列番号１０７、リンカーアミノ酸配列（リンカー６）
ＴＲ
配列番号１０８、ΔＣＤ１９ヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＡＴＴＣＴＧＡ
配列番号１０９、ΔＣＤ１９アミノ酸配列
ＭＰＰＰＲＬＬＦＦＬＬＦＬＴＰＭＥＶＲＰＥＥＰＬＶＶＫＶＥＥＧＤＮＡＶＬＱＣＬＫＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲＥＳＰＬＫＰＦＬＫＬＳＬＧＬＰＧＬＧＩＨＭＲＰＬＡＩＷＬＦＩＦＮＶＳＱＱＭＧＧＦＹＬＣＱＰＧＰＰＳＥＫＡＷＱＰＧＷＴＶＮＶＥＧＳＧＥＬＦＲＷＮＶＳＤＬＧＧＬＧＣＧＬＫＮＲＳＳＥＧＰＳＳＰＳＧＫＬＭＳＰＫＬＹＶＷＡＫＤＲＰＥＩＷＥＧＥＰＰＣＬＰＰＲＤＳＬＮＱＳＬＳＱＤＬＴＭＡＰＧＳＴＬＷＬＳＣＧＶＰＰＤＳＶＳＲＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫＧＰＫＳＬＬＳＬＥＬＫＤＤＲＰＡＲＤＭＷＶＭＥＴＧＬＬＬＰＲＡＴＡＱＤＡＧＫＹＹＣＨＲＧＮＬＴＭＳＦＨＬＥＩＴＡＲＰＶＬＷＨＷＬＬＲＴＧＧＷＫＶＳＡＶＴＬＡＹＬＩＦＣＬＣＳＬＶＧＩＬＨＬＱＲＡＬＶＬＲＲＫＲＫＲＭＴＤＰＴＲＲＦ＊ 。
実施例９：代表的な実施形態
本技術のある特定の実施形態の例を、この後に提供する。
Ａ１．キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＯＸ４０からなる群より選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、組成物。
Ａ２．前記キメラタンパク質が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＯＸ４０からなる群より選択される第２の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をさらに含む、実施形態Ａ１に記載の組成物。
Ａ３．前記共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域および４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域を含む、実施形態Ａ２に記載の組成物。
Ａ４．前記共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドおよび４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドを含む、実施形態Ａ２に記載の組成物。
Ａ５．前記キメラタンパク質が、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれかに記載の組成物。
Ａ６．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれかに記載の組成物。
Ａ７．前記リガンド結合領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の組成物。
Ａ８ 前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰｖ３６アミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の組成物。
Ａ９．前記リガンド結合領域が、Ｆｖ１およびＦｖ２ｗアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ８に記載の組成物。
Ａ１０．前記核酸が、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれかに記載の組成物。
Ａ１０．１．前記プロモーターが、発生的に制御され、前記キメラポリペプチドが、発生的に分化した細胞において発現される、実施形態Ａ１０に記載の組成物。
Ａ１０．２．前記プロモーターが、組織特異的であり、前記キメラポリペプチドが、その特異的な組織において発現される、実施形態Ａ１０またはＡ１０．１に記載の組成物
Ａ１０．３．前記プロモーターが、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態Ａ１０に記載の組成物。
Ａ１０．４．前記プロモーターが、５’ＬＴＲ配列を含む、実施形態Ａ１０〜Ａ１０．３のいずれかに記載の組成物。
Ａ１１．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれかに記載の組成物。
Ａ１２．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ａ１１に記載の組成物。
Ａ１３．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれかに記載の組成物。
Ａ１４．実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の組成物で形質転換されたまたはトランスフェクトされた、細胞。
Ａ１５．前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｉｔｅ）、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ａ１４に記載の細胞。
Ａ１６．前記細胞が、シグナルペプチド、一本鎖可変フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されているかまたは形質導入されている、実施形態Ａ１５に記載の細胞。
Ａ１７．前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１６に記載の細胞。
Ａ１８．前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１６に記載の細胞。
Ａ１９．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αメソテリン、αＧＤ２およびαＨｅｒ２Ｎｅｕからなる群より選択される、実施形態Ａ１７またはＡ１８のいずれかに記載の細胞。
Ａ２０．前記多量体化領域が、二量体のリガンドに結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の組成物または実施形態Ａ１４〜Ａ１７のいずれかに記載の細胞。
Ａ２１．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ａ２０に記載の組成物または細胞。
Ａ２２．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ２１に記載の組成物または細胞。
Ａ２３．免疫応答を誘導するための方法であって、その方法は、インビトロまたはエキソビボにおいて、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の組成物でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含む、方法。
Ａ２４．多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドと前記細胞を接触させる工程をさらに含む、実施形態Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
Ａ２６．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ａ２４に記載の方法。
Ａ２７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
Ａ２８．トランスフェクトされたまたは形質転換されたＴ細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ａ２３〜Ａ２７のいずれかに記載の方法。
Ａ２９．前記細胞が、皮内投与または皮下投与によって前記被験体に投与される、実施形態Ａ２８に記載の方法。
Ａ３０．インビボにおいて免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
Ａ３１．多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドを含む組成物を前記被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３２．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ａ３１に記載の方法。
Ａ３３．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ａ３１に記載の方法。
Ａ３４．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ３１に記載の方法。
Ａ３５．前記被験体が、過剰増殖性疾患と診断されている、実施形態Ａ２８〜Ａ３４のいずれかに記載の方法。
Ａ３６．前記被験体が、腫瘍と診断されている、実施形態Ａ２８〜Ａ３４のいずれかに記載の方法。
Ｂ１．誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物で形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞であって、ここで、その誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、およびＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む、細胞。
Ｂ１．１．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｂ１に記載の細胞。
Ｂ１．２．誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物で形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞であって、ここで、その誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、および細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドを含む、細胞。
Ｂ２．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１またはＢ１．２のいずれかに記載の細胞。
Ｂ２．１．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１．１またはＢ１．２のいずれかに記載の細胞。
Ｂ３．前記膜標的化領域が、ミリストイル化標的化配列である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２．１のいずれかに記載の細胞。
Ｂ４〜Ｂ６．保留。
Ｂ７．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ８．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ９．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１０．前記ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１１．前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１２．前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１４．前記多量体化領域が、配列番号５８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１５．前記多量体化領域が、配列番号５７の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ１６．前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１４に記載の細胞。
Ｂ１７．前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１５に記載の細胞。
Ｂ１８．前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１４またはＢ１６に記載の細胞。
Ｂ１９．前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１５またはＢ１７に記載の細胞。
Ｂ２０．前記多量体化領域が、配列番号５８もしくは配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１４、Ｂ１６またはＢ１８のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２１．前記多量体化領域が、配列番号５７もしくは配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｂ１５、Ｂ１７またはＢ１９のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２２．前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ２４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の細胞。
Ｂ２５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｂ２４に記載の細胞。
Ｂ２６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｂ２４に記載の細胞。
Ｂ２７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の細胞。
Ｂ２８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の細胞。
Ｂ２９．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３０．保留。
Ｂ３１．前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ３０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３２．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｂ３１に記載の細胞。
Ｂ３３．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３４．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３５．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３６．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３７．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｂ３１〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３８．前記細胞が、シグナルペプチド、一本鎖可変フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含む誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でさらに形質転換されるかまたは形質導入される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３７のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ３８．１．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドを含まない、実施形態Ｂ３８に記載の細胞。
Ｂ３８．２．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドを含む、実施形態Ｂ３８またはＢ３８．１に記載の細胞。
Ｂ３９．前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ３８〜Ｂ３８．２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ４０．前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ３８〜Ｂ３８．２のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ４１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αメソテリン、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される、実施形態Ｂ３８〜Ｂ４０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｂ４２．前記一本鎖可変フラグメントが、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ３８〜Ｂ４０のいずれかに記載の細胞。
Ｂ４２．１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＣＡ一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ３８〜Ｂ４０のいずれかに記載の細胞。
Ｂ４３．免疫応答を誘導するための方法であって、前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドと実施形態Ｂ１〜Ｂ４２．１に記載の細胞を接触させる工程を含む、方法。
Ｂ４４．前記細胞が、インビボにおいて前記リガンドと接触される、実施形態Ｂ４３に記載の方法。
Ｂ４５．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ｂ４３またはＢ４４に記載の方法。
Ｂ４６．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ｂ４５に記載の方法。
Ｂ４７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｂ４５に記載の方法。
Ｂ４８．トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４９．前記細胞が、静脈内投与によって前記被験体に投与される、実施形態Ｂ４８に記載の方法。
Ｂ５０〜Ｂ５６．保留。
Ｂ５６．前記被験体が、腫瘍と診断されている、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５７．前記被験体が、癌を有する、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５８ 前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５９．前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｂ５８に記載の方法。
Ｂ６０．前記細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｂ５８またはＢ５９に記載の方法。
Ｂ６１．前記癌が、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｂ５７に記載の方法。
Ｂ６２．前記被験体が、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６３．前記被験体が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６４．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６５．前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６６．前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６７．被験体における白血病を処置するための方法であって、実施形態Ｂ１〜Ｂ４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する工程およびその被験体に多量体リガンドを投与する工程を含む、方法。
Ｂ６８．前記一本鎖可変フラグメントが、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｂ６７に記載の方法。
Ｂ６９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｂ６７またはＢ６８に記載の方法。
Ｂ７０．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｂ６７〜Ｂ６９のいずれかに記載の方法。
Ｂ７１．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｂ４３〜Ｂ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７２．さらなる用量の前記多量体リガンドが、前記被験体に投与されるべきであるか否かを決定する工程をさらに含む、実施形態Ｂ４３〜Ｂ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７３．前記被験体にさらなる用量の前記多量体リガンドを投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症状は、症状が減少した後に残っているかまたは検出される、実施形態Ｂ４３〜Ｂ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７４．前記被験体が、実施形態１〜４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する前に、疾患または状態と診断されており、前記多量体リガンドを投与した後に、その疾患または状態が検出され、さらなる用量の多量体リガンドが、被験体に投与される、実施形態Ｂ７３に記載の方法。
Ｂ７５．被験体における状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージを特定する工程、および
前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示、またはその被験体において特定された状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージに基づいてその患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｂ４３〜Ｂ７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７６．前記状態が、癌である、実施形態Ｂ７２〜Ｂ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７７．前記状態が、白血病である、実施形態Ｂ７２〜Ｂ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７８．前記状態が、固形腫瘍である、実施形態Ｂ７２〜Ｂ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７９．前記多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合に、その被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程
を含む、実施形態Ｂ７８に記載の方法。
Ｂ８０．前記多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べたときの、前記被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
その被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合に、その被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程
を含む、実施形態Ｂ７７に記載の方法。
Ｂ８１．前記腫瘍サイズおよび／または前記腫瘍細胞数が、前記多量体リガンドの投与前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、多量体リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｂ７９に記載の方法。
Ｂ８２．ＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルが、前記多量体リガンドの投与前のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、前記多量体リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｂ８０に記載の方法。
Ｂ８３．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｂ４３〜Ｂ７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１．誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物であって、ここで、その誘導可能なキメラ抗原レセプターは、多量体化領域、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドおよび一本鎖可変フラグメントを含む、組成物。
Ｃ１．１．前記誘導可能なキメラ抗原レセプターが、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ１．２．誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物であって、ここで、その誘導可能なキメラ抗原レセプターは、多量体化領域、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドおよび一本鎖可変フラグメントを含む、組成物。
Ｃ２．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１またはＣ１．２のいずれかに記載の組成物
Ｃ２．１．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１．１またはＣ１．２のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３〜Ｃ６．保留。
Ｃ７．前記誘導可能なキメラ抗原レセプターが、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２．１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ８．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ９．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１０．前記多量体化領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｃ１〜Ｃ９のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１１．前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１２．前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｃ１〜Ｃ１２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１４．前記多量体化領域が、配列番号５８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１５．前記多量体化領域が、配列番号５７の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１６．前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１４に記載の組成物。
Ｃ１７．前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１５に記載の組成物。
Ｃ１８．前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１４またはＣ１６に記載の組成物。
Ｃ１９．前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１５またはＣ１７に記載の組成物。
Ｃ２０．前記多量体化領域が、配列番号５８もしくは配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２１．前記多量体化領域が、配列番号５７もしくは配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ１５、Ｃ１７またはＣ１９のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２２．前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｃ１〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｃ２３に記載の組成物。
Ｃ２５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｃ２４に記載の組成物。
Ｃ２６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｃ２４に記載の組成物。
Ｃ２７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｃ２３に記載の組成物。
Ｃ２８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｃ２３に記載の組成物。
Ｃ２９．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｃ１〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３０．実施形態Ｃ１〜Ｃ２９のいずれか１つに記載の組成物で形質導入されたまたは形質転換された細胞。
Ｃ３１．前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｃ３０に記載の細胞。
Ｃ３２．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｃ３１に記載の細胞。
Ｃ３３．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ３４．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ３５．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ３６．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ３７．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｃ３１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ３８．保留。
Ｃ３９．前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ４０．前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ４１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αメソテリン、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれか１つに記載の細胞。
Ｃ４２．前記一本鎖可変フラグメントが、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれかに記載の細胞。
Ｃ４２．１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＣＡ一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれかに記載の細胞。
Ｃ４３．免疫応答を誘導するための方法であって、前記誘導可能なキメラ抗原レセプターの多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドと実施形態Ｃ１〜Ｃ４２．１に記載の細胞を接触させる工程を含む、方法。
Ｃ４４．前記細胞が、インビボにおいて前記リガンドと接触される、実施形態Ｃ４３に記載の方法。
Ｃ４５．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ｃ４３またはＣ４４に記載の方法。
Ｃ４６．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ｃ４５に記載の方法。
Ｃ４７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｃ４５に記載の方法。
Ｃ４８．トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４９．前記細胞が、静脈内投与によって被験体に投与される、実施形態Ｃ４８に記載の方法。
Ｃ５０〜Ｃ５６．保留。
Ｃ５６．前記被験体が、腫瘍と診断されている、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５７．前記被験体が、癌を有する、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５８ 前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５９．前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６０．前記細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｃ５８またはＣ５９に記載の方法。
Ｃ６１．前記癌が、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｃ５７に記載の方法。
Ｃ６２．前記被験体が、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６３．前記被験体が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６４．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６５．前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６６．前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｃ４３〜Ｃ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６７．被験体における白血病を処置するための方法であって、その方法は、実施形態Ｃ１〜Ｃ４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する工程およびその被験体に多量体リガンドを投与する工程を含む、方法。
Ｃ６８．前記一本鎖可変フラグメントが、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｃ６７に記載の方法。
Ｃ６９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３または
ＡＰ２０１８７である、実施形態Ｃ６７またはＣ６８に記載の方法。
Ｃ７０．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｃ６７〜Ｃ６９のいずれかに記載の方法。
Ｃ７１．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｃ４３〜Ｃ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７２．さらなる用量の前記多量体リガンドが、前記被験体に投与されるべきであるか否かを決定する工程をさらに含む、実施形態Ｃ４３〜Ｃ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７３．前記被験体にさらなる用量の前記多量体リガンドを投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症状は、症状が減少した後に残っているかまたは検出される、実施形態Ｃ４３〜Ｃ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７４．前記被験体が、実施形態１〜４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する前に、疾患または状態と診断されており、前記多量体リガンドを投与した後に、その疾患または状態が検出され、さらなる用量の多量体リガンドが、その被験体に投与される、実施形態Ｃ７３に記載の方法。
Ｃ７５．被験体における状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージを特定する工程、および
前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示、またはその被験体において特定された状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージに基づいてその患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｃ４３〜Ｃ７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７６．前記状態が、癌である、実施形態Ｃ７２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７７．前記状態が、白血病である、実施形態Ｃ７２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７８．前記状態が、固形腫瘍である、実施形態Ｃ７２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７９．前記多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合に、その被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程
を含む、実施形態Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８０．前記多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べたときの、前記被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
その被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合に、その被験体にさらなる用量の多量体リガンドを投与する工程
を含む、実施形態Ｃ７７に記載の方法。
Ｃ８１．前記腫瘍サイズおよび／または前記腫瘍細胞数が、前記多量体リガンドの投与前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、多量体リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｃ７９に記載の方法。
Ｃ８２．ＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルが、前記多量体リガンドの投与前のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、前記多量体リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｃ８０に記載の方法。
Ｃ８３．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｃ４３〜Ｃ７４のいずれか１つに記載の方法。
本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物または文書の内容または日付に関する自認するものである性質でもない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識するだろう。
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメントの非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
本技術のある特定の実施形態が、以下の請求項に示される。

Claims (83)

  1. 誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物であって、ここで、前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＣＤ３ゼータ鎖およびＯＸ４０からなる群より選択される共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、組成物。
  2. 前記膜標的化領域が、レセプター由来の、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸ Ｂｏｘ）、タンパク質間相互作用モチーフおよび膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記膜標的化領域が、ミリストイル化標的化配列である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＣＤ３ゼータ鎖およびＯＸ４０からなる群より選択される第２の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域および４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域が、ＯＸ４０細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドおよび４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域ポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記多量体化領域が、配列番号５８のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記多量体化領域が、配列番号５７の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  17. 前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記多量体化領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１４または１６に記載の組成物。
  19. 前記多量体化領域が、配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１５または１７に記載の組成物。
  20. 前記多量体化領域が、配列番号５８もしくは配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１４、１６または１８のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記多量体化領域が、配列番号５７もしくは配列番号５９の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項１５、１７または１９のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記マウス白血病ウイルスベクターが、ＭｏＭＬＶベクターである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２３に記載の組成物。
  29. 前記核酸が、プラスミド内に含まれている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物で形質転換されたまたはトランスフェクトされた、細胞。
  31. 前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞である、請求項３０に記載の細胞。
  32. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項３０に記載の細胞。
  33. 前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、請求項３０に記載の細胞。
  34. 前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、請求項３０に記載の細胞。
  35. 前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、請求項３０に記載の細胞。
  36. 前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、請求項３０に記載の細胞。
  37. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の細胞。
  38. 前記細胞が、シグナルペプチド、一本鎖可変フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でさらに形質転換されるかまたは形質導入される、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の細胞。
  39. 前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、請求項３８に記載の細胞。
  40. 前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、請求項３９に記載の細胞。
  41. 前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αメソテリン、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の細胞。
  42. 前記一本鎖可変フラグメントが、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである、請求項３８〜４０のいずれかに記載の細胞。
  43. 免疫応答を誘導するための方法であって、インビトロまたはエキソビボにおいて、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物で細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含む、方法。
  44. 誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドと前記細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記リガンドが、二量体である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項４４に記載の方法。
  48. トランスフェクトされたまたは形質転換された前記細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記細胞が、静脈内投与によって前記被験体に投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. インビボにおいて免疫応答を誘導するための方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
  51. 誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす多量体化領域に結合するリガンドを含む組成物を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記リガンドが、二量体である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記被験体が、過剰増殖性疾患と診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記被験体が、腫瘍と診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記被験体が、癌を有する、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記被験体が、固形腫瘍を有する、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細胞が、腫瘍床に送達される、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 前記癌が、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、請求項５７に記載の方法。
  62. 前記被験体が、血液または骨髄の疾患を有する、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記被験体が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記被験体が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記被験体が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される状態と診断されている、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  67. 被験体における白血病を処置するための方法であって、前記被験体に請求項３８に記載の組成物を投与する工程および多量体リガンドを投与する工程を含む、方法。
  68. 一本鎖可変フラグメントが、ＣＤ１９に結合する、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項６７〜６９のいずれかに記載の方法。
  71. 前記被験体が、ヒトである、請求項４３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. さらなる用量の前記多量体リガンドが、前記被験体に投与されるべきであるか否かを決定する工程をさらに含む、請求項４３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記被験体にさらなる用量の前記多量体リガンドを投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症状が、症状が減少した後に残っているかまたは検出される、請求項４３〜７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記被験体が、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の組成物または細胞を投与する前に、疾患または状態と診断されており、前記多量体リガンドを投与した後に、前記疾患または状態が検出され、さらなる用量の前記多量体リガンドが、前記被験体に投与される、請求項７３に記載の方法。
  75. 被験体における状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージを特定する工程、および
    前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、前記多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示、または前記被験体において特定された前記状態もしくは疾患の存在、不在もしくはステージに基づいて前記患者に投与される前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
    をさらに含む、請求項４３〜７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記状態が、癌である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記状態が、白血病である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記状態が、固形腫瘍である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
    腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合に、前記被験体にさらなる用量の前記多量体リガンドを投与する工程
    を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べたときの、前記被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
    前記被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合に、前記被験体にさらなる用量の前記多量体リガンドを投与する工程
    を含む、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記腫瘍サイズおよび／または前記腫瘍細胞数が、前記多量体リガンドの投与前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、前記多量体リガンドの投与後に減少する、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルが、前記多量体リガンドの投与前のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて減少している、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、請求項４８〜７４のいずれか１項に記載の方法。
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