JP2016501020A - リアソータントインフルエンザａウイルス - Google Patents

Abstract

リアソータントインフルエンザＡウイルスを生成するための新たなインフルエンザドナー株が提供される。一局面において、２種以上のドナー株由来のバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが提供され、ここでＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡウイルスに由来する。別の局面において、バックボーンセグメントＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳおよびＭを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが提供され、ここで前記バックボーンセグメントは、２種以上のドナー株に由来し、前記インフルエンザＡウイルスは、ＨＡおよびＮＡセグメントをさらに含み、前記ＨＡおよび前記ＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来する。

Description

本発明は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＢＡＲＤＡ）によって付与された助成金第ＨＨＳＯ１００２０１０００６１Ｃ号の下、政府の支援を受けて一部なされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

（技術分野）
本発明は、インフルエンザＡウイルス再集合の分野にある。さらに、本発明は、インフルエンザＡウイルスに対して防御するためのワクチンを製造することに関する。

インフルエンザ感染に対する最も効率的な防御は、循環している株に対してワクチン接種することであり、可能な限り迅速にワクチン生成のためのインフルエンザウイルスを生成することが重要である。

野生型インフルエンザウイルスは、しばしば、卵および細胞培養物において低力価までは増殖する。ワクチン生成のためにより良好に増殖するウイルス株を得るために、循環しているインフルエンザ株を、より迅速に増殖する高収量ドナー株と再集合させる（ｒｅａｓｓｏｒｔ）ことは、現在一般的な実施である。これは、培養宿主に、上記循環しているインフルエンザ株（ワクチン株）および高収量ドナー株を共感染させ（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔ）、上記ワクチン株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント、ならびに上記ドナー株に由来する他のウイルスセグメント（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２をコードするもの）を含むリアソータントウイルスを選択することによって達成され得る。別のアプローチは、上記インフルエンザウイルスを逆遺伝学によって再集合することである（例えば、参考文献１および２を参照のこと）。

参考文献３は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７由来のＰＢ１遺伝子セグメント、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９由来のＨＡおよびＮＡセグメント、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来の改変ＰＡセグメントおよびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来の残りのウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが細胞中で増大した増殖を示すことを報告する。

現在、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを再集合するために、制限された数のドナー株のみがあり、最も一般的に使用される株は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）株である。しかし、Ａ／ＰＲ／８／３４バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、効率的なワクチン製造を確実にするために常に十分良好に増殖する訳ではない。従って、インフルエンザウイルス再集合のためのさらに改善されたドナー株を提供することは、当該分野で必要なことである。

国際公開第２００７／００２００８号 国際公開第２００７／１２４３２７号 国際公開第２０１０／０７００９８号

（好ましい実施形態の要旨）
本発明者らは、ここで驚くべきことに、２種以上のインフルエンザドナー株由来のバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、同じドナー株由来の全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスと比較して、培養宿主において（特に、細胞培養物中で）より迅速に増殖し得ることを発見した。特に、本発明者らは、２種の異なる高収量ドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、上記２種の元のドナー株のみのいずれかで作製されるリアソータントより、標的ワクチン関連ＨＡ／ＮＡ遺伝子でより高収量のリアソータントを生成し得ることを見出した。

２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡウイルスは、異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得る。これらリアソータントインフルエンザウイルスにおいて、上記ＰＢ１セグメントは、好ましくは、上記ワクチン株と同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有するドナーウイルスに由来する。例えば、上記ＰＢ１セグメントおよび上記ＨＡセグメントは、両方ともがＨ１サブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来し得る。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスはまた、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得、ここで上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／またはここで上記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。例えば、上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ１ウイルスに由来し得、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来し得る。

本発明はまた、ＰＢ１セグメントがＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡウイルスを提供する。このセグメントは、配列番号２２の配列と少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、Ｈ１ ＨＡサブタイプを有し得る。本発明のこの局面に従うリアソータントインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含まないことが理解される。

上記リアソータントインフルエンザＡウイルスが、２種もしくは３種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、各ドナー株は、リアソータントインフルエンザＡウイルスのバックボーンセグメントのうちの１つより多くを提供し得るが、上記ドナー株のうちの１種もしくは２種はまた、ただ１つのバックボーンセグメントを提供し得る。

上記リアソータントインフルエンザＡウイルスが、２種、３種、４種もしくは５種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記ドナー株のうちの１種もしくは２種は、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスのバックボーンセグメントのうちの１種より多くを提供し得る。一般に、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、６種より多くのバックボーンセグメントを含むことはできない。よって、例えば、上記ドナー株のうちの１種が、ウイルスセグメントのうちの５種を提供する場合、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、合計２種の異なるドナー株由来のバックボーンセグメントしか含むことができない。

リアソータントインフルエンザＡウイルスが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７由来のＰＢ１セグメントを含む場合、それは、好ましくは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭセグメントを含まない。リアソータントインフルエンザＡウイルスが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭセグメントを含む場合、それは、好ましくは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含まない。いくつかの実施形態において、本発明は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメント、ならびにＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰおよびＭセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡウイルスを含まない。上記Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントは、配列番号２７の配列を有し得、上記Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭセグメントは、それぞれ、配列番号２８、２９もしくは３０の配列を有し得る。

本発明のインフルエンザＡウイルス株は、同じインフルエンザドナー株に由来する全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザ株と比較して、同じ時間でおよび同じ増殖条件下で、ＭＤＣＫ細胞および／もしくは卵の中でより高収量ウイルス力価まで増殖し得る。

本発明はまた、ドナー株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスを提供し、ここで上記ドナー株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株である。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、ＰＡセグメントである場合、それは、配列番号１５の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、ＰＢ１セグメントである場合、それは、配列番号１６の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、ＰＢ２セグメントである場合、それは、配列番号１７の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、ＮＰセグメントである場合、それは、配列番号１８の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、Ｍセグメントである場合、それは、配列番号１９の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、ＮＳセグメントである場合、それは、配列番号２０の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。

少なくとも１種のバックボーンセグメントは、前段落で考察されるように、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来し得る。好ましいリアソータントインフルエンザＡウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来するＰＢ１セグメントを含む。本発明者らは、このバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが培養宿主において十分に増殖することを示した。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ではないインフルエンザウイルスに由来する全ての他のバックボーンセグメントを含み得る。

上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメントおよびインフルエンザ株ＰＲ８−Ｘに由来する全ての他のバックボーンセグメントを含み得る。ＰＲ８−Ｘのセグメントは、配列番号１（ＰＡ）、配列番号２（ＰＢ１）、配列番号３（ＰＢ２）、配列番号４（ＮＰ）、配列番号５（Ｍ）、配列番号６（ＮＳ）、配列番号７（ＨＡ）もしくは配列番号８（ＮＡ）の配列を有する。従って、本発明のインフルエンザウイルスは、以下から選択される１種以上のゲノムセグメントを含み得る：配列番号１の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号３の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号５の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＭセグメント、配列番号４の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＮＰセグメント、および／もしくは配列番号６の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＮＳセグメント。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスはまた、配列番号１、および／もしくは３〜６の配列を有する１種以上のセグメントを含み得る。好ましい実施形態において、上記リアソータントインフルエンザ株は、この段落で言及されるゲノムセグメントの全てを含む。この実施形態は、このようなリアソータントインフルエンザＡウイルスが、細胞培養物および孵化鶏卵において特によく増殖することを本発明者らが見出したので、好ましい。

一般に、リアソータントインフルエンザウイルスは、各バックボーンセグメントのうちの１種のみを含む。例えば、上記インフルエンザウイルスが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来のＰＢ１セグメントを含む場合、それは、別のインフルエンザＡドナー株に由来するＰＢ１セグメントを同時には含まない。

上記バックボーンウイルスセグメントは、特定の培養宿主における培養のために最適化され得る。例えば、上記リアソータントインフルエンザウイルスが哺乳動物細胞において培養される場合、上記培養宿主における最適な増殖のために、上記ウイルスセグメントのうちの少なくとも１種を適合させることは、有利である。例えば、発現宿主がイヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞株）である場合、上記ウイルスセグメントは、上記細胞におけるウイルス増殖を最適化する配列を有し得る。従って、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３に整列させた場合、配列番号３のアミノ酸３８９に対応する位置においてリジンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３に整列させた場合、配列番号３のアミノ酸５５９に対応する位置においてアスパラギンを有するＰＢ２ゲノムセグメントを含み得る。また、上記ＰＡゲノムセグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸３２７に対応する位置においてリジンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸４４４に対応する位置においてアスパラギン酸を、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸６７５に対応する位置においてアスパラギン酸を有する、本発明に従うリアソータントインフルエンザウイルスが提供される。本発明のリアソータントインフルエンザ株はまた、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４に整列させた場合、配列番号４のアミノ酸２７に対応する位置においてスレオニンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４に整列させた場合、配列番号４のアミノ酸３７５に対応する位置においてアスパラギンを有するＮＰゲノムセグメントを有し得る。改変体インフルエンザ株はまた、これら変異のうちの２つ以上を含み得る。上記改変体インフルエンザウイルスが、上記で同定されるアミノ酸変化のうちの両方を有する改変体ＰＢ２セグメント、および／もしくは上記で同定されるアミノ酸変化のうちの３つ全てを含むＰＡ、および／もしくは上記で同定されるアミノ酸変化のうちの両方を含むＮＰセグメントを含むことは、好ましい。上記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１株であり得る。

代わりに、もしくはさらに、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸２００に対応する位置においてイソロイシンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸３３８に対応する位置においてアスパラギンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸５２９に対応する位置においてイソロイシンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸５９１に対応する位置においてイソロイシンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する位置においてヒスチジンを、および／もしくはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸７５４に対応する位置においてリジンを有するＰＢ１セグメントを含み得る。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用して、ギャップオープニングペナルティー＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５とともに）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［４］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ［５］におけるニードルツールで便利に実施される。

本発明は、本発明のリアソータントインフルエンザＡウイルスを調製するための方法を提供する。これら方法は、（ｉ）培養宿主に、インフルエンザＡウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで上記バックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来する、工程；および（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたウイルスを精製する工程を包含する。これら方法において、上記ＨＡおよび上記ＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来し得るか、または上記ＨＡおよびＰＢ１セグメントは、異なるＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来し得るが、ただし、上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。上記ＰＢ１バックボーンウイルスセグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来し得る。上記１種以上の発現構築物は、ＰＲ８−Ｘに由来する上記ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、もしくはＮＳセグメントのうちの１種以上、または配列番号９および／もしくは１１〜１４と少なくとも９０％もしくは１００％の同一性を有するセグメントをさらにコードし得る。上記発現構築物は、上記ＰＢ１セグメントが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来する場合、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントをコードしなくてもよい。

上記少なくとも１種の発現構築物は、配列番号２２の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の発現構築物は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来するＰＢ１セグメントをコードしない。

上記方法は、（ｉｖ）培養宿主を、上記工程（ｉｉ）もしくは工程（ｉｉｉ）で得られたウイルスに感染させる工程；（ｖ）工程（ｉｖ）の培養宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｖｉ）工程（ｖ）で得られたウイルスを精製する工程をさらに包含し得る。

本発明はまた、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主を本発明のリアソータントウイルスに感染させる工程；（ｂ）上記工程（ａ）からの宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

本発明はまた、ワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｄ）上記実施形態のうちのいずれか１つの方法によって、ウイルスを調製する工程、および（ｅ）上記ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する。

本発明は、インフルエンザＡウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現系を提供し、ここで上記発現構築物は、同じインフルエンザＨＡサブタイプを有する２種の異なるインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＰＢ１セグメントをコードするか、または異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する２種の異なるインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＰＢ１セグメントをコードし、ここで上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。

本発明はまた、インフルエンザＡウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現系を提供し、ここで上記発現構築物は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９のＰＢ１セグメントをコードする。上記発現構築物は、ＰＲ８−Ｘに由来するＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、Ｍおよび／もしくはＰＡセグメントのうちの１種以上をコードするｖＲＮＡをさらに含み得る。従って、上記発現構築物は、配列番号９および／もしくは１１〜１４の配列と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有する１種以上のヌクレオチド配列を含み得る。上記発現構築物が、ＰＲ８−Ｘに由来するＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、ＭおよびＰＡセグメントの全てをコードすることは、好ましい。

本発明はまた、本発明の発現系を含む宿主細胞を提供する。これら宿主細胞は、上記発現系において発現構築物からインフルエンザＡウイルスを発現し得る。

本発明の発現系において使用され得る発現構築物もまた、提供される。例えば、本発明は、同じ構築物上で本発明に従うリアソータントインフルエンザ株のバックボーンセグメントをコードする発現構築物を提供する。

（ドナー株）
インフルエンザドナー株は、たとえそれらが、ときおりウイルスのＮＡセグメントを提供し得るとしても、リアソータントインフルエンザウイルスにおいてバックボーンセグメントを代表的には提供する株である。しかし、通常は、リアソータントインフルエンザウイルスにおけるＨＡおよびＮＡセグメントの両方は、上記ＨＡセグメントを提供するインフルエンザ株であるワクチン株に由来する。

本発明者らは、驚くべきことに、同じＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが、異なるＨＡサブタイプを有するウイルスに由来するＨＡおよびＰＢ１セグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、培養宿主において遙かに迅速に増殖し得ることを発見した。これらリアソータントインフルエンザウイルスは、好ましくは、少なくとも２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを有する。

同じＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスのＰＢ１セグメントは、通常、異なるＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスのＰＢ１セグメントより高い同一性レベルを有する。例えば、Ｈ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９のＰＢ１セグメントを使用するＢｌａｓｔ検索は、Ｈ１ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザ株のみが、ＰＢ１セグメントにおいて高い同一性を有することを示した。同様に、Ｈ３株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５のＰＢ１セグメントを使用するＢｌａｓｔ検索は、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスのみが、このウイルスのＰＢ１セグメントに対して高レベルの同一性を有することを示した。

本発明者らは、少なくとも２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを有し、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが、培養宿主において特によく増殖することをさらに発見した。これらリアソータントインフルエンザウイルスは、好ましくは、少なくとも２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントを有する。上記リアソータントインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメントおよびＨ１サブタイプを有するインフルエンザウイルスのＨＡセグメントを含み得る。

Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株のセグメントのうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種もしくは７種を含むインフルエンザ株はまた、ドナー株として使用され得る。

本発明は、配列番号９〜１４もしくは２１〜２６の配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するウイルスセグメントを有するドナー株で実施され得る。例えば、遺伝コードの縮重に起因して、異なる配列を有するいくつかの核酸によってコードされる同じポリペプチドを有することが考えられる。従って、本発明は、配列番号１〜８もしくは１５〜２０の配列と同じポリペプチドをコードするウイルスセグメントで実施され得る。例えば、配列番号３１および３２の核酸配列は、たとえそれらが同じウイルスタンパク質をコードするとしても、７３％の同一性を有するに過ぎない。

本発明はまた、配列番号９〜２２によってコードされるポリペプチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするウイルスセグメントで実施され得る。

ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列におけるバリエーションはまた、ウイルスの継代の間に起こり得る自発的変異から生じ得る。このような改変体インフルエンザ株はまた、本発明において使用され得る。

（リアソータントウイルス）
本発明は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。これらリアソータントインフルエンザウイルスは、異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得るが、ただし、上記ＨＡおよび上記ＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来する。それらはまた、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得るが、ただし上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。

Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメントを含む２種以上の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルスが、さらに提供される。

上記ＰＢ１およびＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来し得る。

インフルエンザウイルスは、セグメント化したマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡおよびＢウイルスは、８種のセグメント（ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１、ＨＡおよびＮＡ）を有するのに対して、インフルエンザＣウイルスは、７種を有する。本発明のリアソータントウイルスは、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメント、もしくはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来する少なくとも１種（すなわち、１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種）のバックボーンウイルスセグメントを含む。上記バックボーンウイルスセグメントは、ＨＡもＮＡもコードしないものである。従って、バックボーンセグメントは、代表的には、上記インフルエンザウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２ポリペプチドをコードする。上記ウイルスはまた、例えば、参考文献６に記載されるように、機能的ＮＳタンパク質をコードしないＮＳセグメントを含み得る。たとえ、本発明のドナー株に由来するＨＡもしくはＮＡのいずれかを含むがそれらの両方を含まないリアソータントウイルスもまた想定されても、上記リアソータントウイルスは、代表的には、ドナー株に由来するＨＡおよびＮＡをコードするセグメントを含まない。

上記リアソータントウイルスが、単一のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、ドナー株およびワクチン株に由来するセグメントを、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２もしくは７：１の比で含む。ドナー株に由来するセグメントの大部分を有する（特に、６：２の比）ことは、代表的である。上記リアソータントウイルスが２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、第１のドナー株、第２のドナー株およびワクチン株に由来するセグメントを、１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：２、３：２：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１もしくは６：１：１の比で含む。

好ましくは、上記リアソータントウイルスは、上記ドナー株のＨＡセグメントを含まない。なぜならこれは、上記インフルエンザウイルスの主要ワクチン抗原をコードし、したがってワクチン株に由来するはずだからである。本発明のリアソータントウイルスは、従って、好ましくは、上記ワクチン株に由来する、少なくともＨＡセグメントを、および代表的には、ＨＡおよびＮＡセグメントを有する。

本発明はまた、１種より多くのワクチン株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントを包含するが、ただし、上記リアソータントは、本発明に従うバックボーンを含む。例えば、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、１種のドナー株に由来するＨＡセグメントおよび異なるドナー株に由来するＮＡセグメントを含み得る。

本発明のリアソータントウイルスは、上記リアソータントウイルスのウイルスセグメントのうちのいくつかが、同じ時間（例えば、１２時間、２４時間、４８時間もしくは７２時間）でおよび同じ増殖条件下で得られる野生型ワクチン株より高いウイルス力価になるまで増殖し得る。上記ウイルス力価は、当業者に公知の標準的方法によって決定され得る。本発明のリアソータントウイルスは、同じ時間枠でおよび同じ条件下で、野生型ワクチン株のウイルス力価より少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高い、少なくとも５００％高い、もしくは少なくとも１０００％高いウイルス力価を達成し得る。

本発明は、汎流行性ならびに汎流行性間期の（流行期（ｓｅａｓｏｎａｌ））インフルエンザワクチン株を再集合させるのに適している。上記リアソータントインフルエンザ株は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６を含み得る。上記ワクチン株は、インフルエンザＡ型ウイルス ＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９を含み得る。本発明のリアソータントインフルエンザウイルスで使用されるワクチン株が、流行期インフルエンザ株である場合、上記ワクチン株は、Ｈ１もしくはＨ３サブタイプを有し得る。本発明の一局面において、上記ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１株もしくはＨ３Ｎ２株である。上記リアソータントインフルエンザ株はまた、インフルエンザＢ型株のＨＡセグメントを含み得る。

本発明において使用するための上記ワクチン株はまた、汎流行性の株もしくは潜在的に汎流行性の株であり得る。汎流行性のアウトブレイクを引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）現在循環しているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含む（すなわち、１０年を超えてヒト集団において顕性でなかったもの（例えば、Ｈ２）、または上記ヒト集団において以前に全く認められなかったもの（例えば、一般に、トリ集団においてのみ見いだされてきたＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）。その結果、上記ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）上記ヒト集団において水平伝播し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。Ｈ５ヘマグルチニンタイプを有するワクチン株は、好ましい。ここで上記リアソータントウイルスは、汎流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対して免疫化するためのワクチンにおいて使用される。他の考えられる株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の潜在的に出現する汎流行性株が挙げられる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと拡がり得るかもしくは拡がってしまった潜在的汎流行性株（例えば、ブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株）に対して防御するためのワクチンにおける使用のために、リアソータントウイルスを生成するのに特に適している。

本発明のリアソータントインフルエンザ株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９株に由来するＨＡセグメントおよび／もしくはＮＡセグメントを含み得る。

ワクチン株として使用され得る株は、抗ウイルス治療に耐性（例えば、オセルタミビル［７］および／もしくはザナミビルに耐性）である株（耐性汎流行性株［８］を含む）を含む。

機能的ＮＳタンパク質をコードしないＮＳセグメントを含むリアソータントウイルスはまた、本発明の範囲内にある。ＮＳ１ノックアウト変異体は、参考文献６に記載される。これらＮＳ１変異体ウイルス株は、弱毒化生インフルエンザワクチンを調製するために特に適している。

本発明の方法において使用される「第２のインフルエンザ株」は、使用されるドナー株とは異なる。

（逆遺伝学）
本発明は、逆遺伝学技術によって本発明のリアソータントインフルエンザウイルス株を生成するために特に適している。これら技術において、上記ウイルスは、発現系を使用して培養宿主において生成される。

一局面において、上記発現系は、同じＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＰＢ１セグメントをコードし得る。それはまた、異なるＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＰＢ１セグメントをコードし得るが、ただし、上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。上記発現系は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＰＢ１セグメントをコードし得る。これら実施形態において、上記系は、別のインフルエンザドナー株、例えば、ＰＲ８−Ｘに由来するセグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、および／もしくはＰＢ２のうちの少なくとも１種をコードし得る。

インフルエンザＡおよびＢウイルスに関する逆遺伝学は、複製および転写を開始するために必要な４種のタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびヌクレオタンパク質）、および全８つのウイルスゲノムセグメントを発現するために１２のプラスミドで実施され得る。しかし、構築物の数を減らすために、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のために）が、単一のプラスミドに含まれ得（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、もしくは全８種のインフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、そしてＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域が別のプラスミド上に含まれ得る（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種もしくは８種のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）［９］。１種以上のインフルエンザｖＲＮＡセグメントをｐｏｌ Ｉプロモーターの制御下に、および１種以上のインフルエンザタンパク質コード領域を同じプラスミド上の別のプロモーター（特に、ｐｏｌ ＩＩプロモーター）の制御下に含めることもまた、考えられる。これは、好ましくは、２方向性プラスミドを使用することによって行われる。

参考文献９の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一の発現構築物上にＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一の発現構築物上に全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１種の発現構築物にノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）セグメントを、ならびに別の発現構築物上に６種の他のウイルスセグメントを含めることは、新たに出現するインフルエンザウイルス株が通常はＮＡおよび／もしくはＨＡセグメントの中に変異を有するので、特に好ましい。従って、別個の発現構築物にＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを有するという利点は、ＨＡおよびＮＡ配列を含むベクターのみが、置換される必要があるということである。従って、本発明の一局面において、上記ワクチン株のＮＡおよび／もしくはＨＡセグメントは、１種の発現構築物に含まれ得、本発明のドナー株に由来するセグメントをコードするｖＲＮＡは、上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを除いて、異なる発現構築物に含まれる。本発明は、従って、本発明のドナー株のバックボーンウイルスセグメントをコードする１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種のｖＲＮＡを含む発現構築物を提供する。上記発現構築物は、機能的ＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を生成するＨＡおよび／もしくはＮＡウイルスセグメントを含まなくてもよい。

公知の逆遺伝学システムは、ｐｏｌ Ｉプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどに由来する所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子を発現する工程を含む。インフルエンザウイルスは、生活環を開始するためにはウイルスポリメラーゼの存在を要するので、システムはまた、これらタンパク質を提供し得る。例えば、上記システムは、ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含み得、その結果、両方のタイプのＤＮＡの発現が、完全な感染性ウイルスのアセンブリをもたらす。上記ウイルスポリメラーゼをタンパク質として供給することもまた、可能である。

逆遺伝学が、インフルエンザｖＲＮＡの発現のために使用される場合、配列エレメントについての互いに関して正確なスペーシングが、ポリメラーゼが複製を開始するために重要であることは、当業者にとって明らかである。従って、上記ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子が、ｐｏｌ Ｉプロモーターと終結配列との間で正確に位置づけられるが、この位置づけが、逆遺伝学システムを扱うものの能力の十分範囲内であることは、重要である。

組換えウイルスを生成するために、細胞は、ビリオンをアセンブリするために必要なウイルスゲノムの全てのセグメントを発現しなければならない。本発明の発現構築物にクローニングされるＤＮＡは、好ましくは、上記ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全てを提供するが、ヘルパーウイルスを使用して、上記ＲＮＡおよびタンパク質のうちのいくつかを提供することもまた可能である。しかし、ヘルパーウイルスを使用しない系が好ましい。上記インフルエンザウイルスは、セグメント化ウイルスであるので、そのウイルスゲノムは、通常、本発明の方法において１種より多くの発現構築物を使用して発現される。しかし、ウイルスゲノムのうちの１種以上のセグメントもしくはさらに全セグメントを単一の発現構築物上で組み合わせることもまた、想定される。

いくつかの実施形態において、発現構築物もまた含まれ、この発現構築物は、宿主細胞におけるアクセサリータンパク質の発現をもたらす。例えば、逆遺伝学システムの一部として非ウイルスセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を発現することは、有利であり得る。

（発現構築物）
本発明の発現系において使用される発現構築物は、１方向性もしくは２方向性の発現構築物であり得る。１種を超える導入遺伝子が上記方法において使用される場合（同じ発現構築物上であろうと異なる発現構築物上であろうと）、１方向性および／もしくは２方向性の発現を使用することは可能である。

インフルエンザウイルスは、感染力のためにタンパク質を必要とするので、２方向性発現構築物を使用することは、一般に好ましい。なぜならこれは、宿主細胞が必要とする発現構築物の総数を減らすからである。従って、本発明の方法は、遺伝子もしくはｃＤＮＡが、上流のｐｏｌ ＩＩプロモーターと下流の非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターとの間に位置する、少なくとも１種の２方向性発現構築物を利用し得る。上記遺伝子もしくはｃＤＮＡを上記ｐｏｌ ＩＩプロモーターから転写すると、タンパク質へと翻訳され得る、キャップのあるプラス−センスウイルスｍＲＮＡが生じる一方で、上記非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターから転写すると、マイナス−センスｖＲＮＡが生じる。上記２方向性発現構築物は、２方向性発現ベクターであり得る。

２方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち、５’→３’および３’→５’の両方）で発現を駆動する少なくとも２種のプロモーターを含む。上記２種のプロモーターは、同じ２本鎖ＤＮＡの異なる鎖に作動可能に連結され得る。好ましくは、上記プロモーターのうちの一方は、ｐｏｌ Ｉプロモーターであり、他方のプロモーターのうちの少なくとも１種は、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。これは、上記ｐｏｌ Ｉプロモーターが、キャップされていないｖＲＮＡを発現するために使用され得る一方で、上記ｐｏｌ ＩＩプロモーターが、後にタンパク質へと翻訳され得るｍＲＮＡを転写するために使用され得、従って、同じ構築物からのＲＮＡおよびタンパク質の同時発現を可能にするので、有用である。１種より多くの発現構築物が、発現系内で使用される場合、上記プロモーターは、内因性および非内因性のプロモーターの混合物を含み得る。

上記発現構築物において使用されるｐｏｌ Ｉおよびｐｏｌ ＩＩプロモーターは、宿主細胞が由来する同じ分類学上の目に由来する生物にとって内因性であり得る。あるいは、上記プロモーターは、宿主細胞とは異なる分類学上の目における生物に由来し得る。用語「目」とは、従来の分類学上の順位付けをいい、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目などである。ヒトおよびチンパンジーは、同じ分類学上の目（霊長目）の中にいるが、ヒトおよびイヌは、異なる目の中にいる（霊長目 対 食肉目）。例えば、ヒトｐｏｌ Ｉプロモーターは、イヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）においてウイルスセグメントを発現するために使用され得る［１０］。

上記発現構築物は、代表的には、ＲＮＡ転写終結配列を含む。上記終結配列は、内因性終結配列であってもよいし、上記宿主細胞にとって内因性でない終結配列であってもよい。適切な終結配列は、当業者に明らかであり、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記発現構築物は、ｍＲＮＡのために、特に、発現がｐｏｌ ＩＩプロモーターによって制御される遺伝子の末端に、１以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。

発現系は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種もしくは少なくとも１２種の発現構築物を含み得る。

発現構築物は、ベクター（例えば、プラスミドもしくは他のエピソーム構築物）であり得る。このようなベクターは、代表的には、少なくとも１種の細菌性および／もしくは真核生物性の複製起点を含む。さらに、上記ベクターは、原核生物および／もしくは真核生物の細胞における選択を可能にする選択マーカーを含み得る。このような選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、アンピシリンもしくはカナマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子である。上記ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを促進するために１以上のマルチクローニング部位をさらに含み得る。

代替として、発現構築物は、直線状の発現構築物であってもよい。このような直線状の発現構築物は、代表的には、いかなる増幅および／もしくは選択配列をも含まない。しかし、このような増幅および／もしくは選択配列を含む直線状の構築物もまた、本発明の範囲内にある。参考文献１１は、直線状の発現構築物を記載し、これは、各ウイルスセグメントに関して個々の直線状の発現構築物を記載している。同じ直線状の発現構築物に１種より多い、例えば、２種、３種、４種、５種もしくは６種のウイルスセグメントを含めることもまた、可能である。このような系は、例えば、参考文献１２に記載されている。

発現構築物は、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。このような方法は、例えば、参考文献１３に記載された。上記発現構築物が直線状の発現構築物である場合、発現構築物を直線状にして、その後、単一の制限酵素部位を使用して、上記宿主細胞に導入することは、可能である。あるいは、上記発現構築物を、少なくとも２種の制限酵素部位を使用してベクターから切り出すことは可能である。さらに、直線状の発現構築物を、核酸増幅技術を使用して（例えば、ＰＣＲによって）それを増幅することによって得ることもまた、可能である。

本発明の系において使用される発現構築物は、非細菌性発現構築物であり得る。このことは、上記構築物が、その中にコードされるウイルスＲＮＡセグメントの真核生物細胞における発現を駆動し得るが、細菌中での上記構築物の増殖に必要とされる成分を含まないことを意味する。従って、上記構築物は、細菌性複製起点（ｏｒｉ）を含まず、通常は、細菌性選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含まない。このような発現構築物は、参考文献１４（参考として援用される）に記載される。

上記発現構築物は、化学合成によって調製され得る。上記発現構築物は、化学合成によって、全体的にもしくは部分的にのいずれかで調製され得る。化学合成によって発現構築物を調製するための適切な方法は、例えば、参考文献１４（参考として援用される）に記載される。

本発明の発現構築物は、当業者に公知の任意の技術を使用して、宿主細胞へと導入され得る。例えば、本発明の発現構築物は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、もしくは微粒子銃を使用することによって、宿主細胞に導入され得る。

（細胞）
本発明における使用のための培養宿主は、目的のウイルスを生成し得る任意の真核生物細胞であり得る。本発明は、代表的には、細胞株を使用するが、例えば、初代細胞が代替として使用され得る。上記細胞は、代表的には、哺乳動物もしくはトリのものである。適切な哺乳動物細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞タイプが使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサルの細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎臓細胞［１５〜１７］である。適切なイヌの細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞である。

さらに適切な細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ ５；ＰＥＲ．Ｃ６［１８］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８など。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ） Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［１９］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２０］から、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、上記ＡＴＣＣは、種々の異なるＶｅｒｏ細胞をカタログ番号ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞をカタログ番号ＣＣＬ ３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。

本発明における使用に好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２１〜２３］である。元のＭＤＣＫ細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ ３４として入手可能である。ＭＤＣＫ細胞の派生物が使用されることは、好ましい。このような派生物は、例えば、参考文献２１において記載されており、この参考文献は、懸濁培養における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ ３３０１６」もしくはＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「３３０１６−ＰＦ」；参考文献２１もまた参照のこと）を開示している。さらに、参考文献２４は、無血清培養において懸濁物中で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示している。いくつかの実施形態において、使用されるＭＤＣＫ細胞株は、腫瘍形成性であり得る。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することもまた、想定される。例えば、参考文献２５は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献２６は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）を含む、非常に感染しやすいＭＤＣＫ細胞を開示している。

１種より多くの細胞タイプの混合物を使用して、本発明の方法を実施することは、可能である。しかし、本発明の方法が、単一の細胞タイプで、例えば、モノクローナル細胞で実施されることは、好ましい。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、単一の細胞株に由来する。さらに、同じ細胞株が、ウイルスを再集合させるために、およびウイルスの任意のその後の増殖のために使用され得る。

好ましくは、上記細胞は、一般的な汚染物質源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞培養のための種々の無血清培地が、当業者に公知である（例えば、イスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地が使用され得る（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さもなければ、複製のための細胞はまた、特注の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％のウシ胎仔血清を有する、ＭＥＭもしくはＤＭＥＭ培地）中で培養され得る。

上記細胞は、接着培養物もしくは懸濁物中にあり得る。

（従来の再集合）
伝統的には、インフルエンザウイルスは、培養宿主（通常は、卵）にドナー株およびワクチン株を共感染させることによって再集合される。リアソータントウイルスは、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を含むリアソータントウイルスを選択するために、上記ドナー株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質に対して特異性を有する抗体を添加することによって選択される。この処理を数継代行う間に、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含むリアソータントウイルスの迅速な増殖を選択し得る。

本発明は、これら方法における使用に適している。上記ドナー株と比較して、異なるＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するワクチン株を使用することは、より容易であり得る。なぜならこれは、リアソータントウイルスの選択を促進するからである。しかし、上記ドナー株と同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するワクチン株を使用することもまた、可能であり、本発明のいくつかの局面において、これは好ましい。この場合、上記ドナー株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質に対して優先的な特異性を有する抗体が利用可能であるはずである。

（ウイルス調製）
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主に本発明のリアソータントウイルスを感染させる工程；（ｂ）上記工程（ａ）の宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）で生成したウイルスを精製する工程を包含する。

培養宿主は、細胞または孵化鶏卵であり得る。細胞が、本発明のこの局面において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が、使用される上記細胞株および上記ウイルスに依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。

上述したように、細胞は、好ましくは、無血清培地もしくは無タンパク質培地中で培養される。

上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システム（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍ）で、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分（もしくは栄養分の一部）の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のｐＨ値を、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値に、および特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０℃〜４０℃の間の温度で行われる。感染細胞を培養する場合（工程ｂ）、上記細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間の温度もしくは３２℃〜３４℃の間の温度、または３３℃で培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである［２７］。

酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値において、および特には、３５％〜６０％の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約８〜２５×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約５〜２０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で行われる。上記細胞は、１０^−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値（「感染多重度」；感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応する）で感染させられ得る。

ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。したがって、一部の実施形態において、上記細胞は、懸濁物中での増殖に適合され得る。

本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離も含む。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活性化されることも本発明にしたがって好ましい。ウイルス不活性化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。

上記培養宿主は、卵であり得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在の標準的方法は、ＳＰＦ孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。ウイルスを卵によって継代し、その後、上記ウイルスを、細胞培養物中で増殖させることもまた可能であり、その逆もまた同様である。

（ワクチン）
本発明は、上記方法に従って生成されるウイルスを利用して、ワクチンを生成する。

ワクチン（特に、インフルエンザワクチン）は、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。

不活性化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原（インフルエンザについては、ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む）を含み得る。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、ＵＶ光もしくはγ線照射）。

ビリオンは、ウイルス含有流体（例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清）から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。

スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート ８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を生成する（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む）ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である（例えば、参考文献２８〜３３などを参照のこと）。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ ｅｓｔｅｒ）などである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る（例えば、スクロース密度勾配溶液において）。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するために）、上記採取したビリオンの濃縮（例えば、吸着法（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着）を使用して）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する）ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ^ＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸ^ＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥ^ＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ^ＴＭ製品である。

精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記ＦＬＵＶＩＲＩＮ^ＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬ^ＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣ^ＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。

別の形態の不活性化抗原は、ビロソーム［３４］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。

本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む）で安定化され得る。インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である（例えば、参考文献３５の第１７章および第１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンとしては、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ^ＴＭ製品（三価生ウイルスワクチン）が挙げられる。

上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）され得る。これら３つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。

ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照することによって標準化されている（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量が、使用され得る（例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合）。分割量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた（例えば、３×もしくは９×用量［３６、３７］）。従って、ワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量としては、１株あたり、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。

生ワクチンに関して、投与は、ＨＡ含有量よりむしろ、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、１株あたり１０^６〜１０^８の間の（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５の間の）ＴＣＩＤ_５０が、代表的である。

本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のＨＡ、もしくは改変ＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの非常に塩基性の領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。

汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。

抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である（例えば、オセルタミビル［３８］および／もしくはザナミビルに抵抗性である）株である（耐性汎流行性株を含む［３９］）。

本発明の組成物は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれより多い）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡ型ウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢ型ウイルスを含む）に由来する抗原を含み得るが、ただし、少なくとも１つのインフルエンザ株が、本発明のリアソータントインフルエンザ株であることを条件とする。抗原のうち少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全てが本発明のリアソータントインフルエンザ株に由来する組成物もまた想定される。ワクチンが１より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、１より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。四価ワクチンもまた有用である［４０］（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。

（薬学的組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献４１で入手される。

ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。

ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）ことが好ましい（例えば、チオメルサールを含まない［３２、４２］）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る［３２］。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。

張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない質量オスモル濃度が以前に報告されている［４３］が、この範囲において質量オスモル濃度を維持することは好ましい。

ワクチン組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。

ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのｐＨを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。

上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは、＜０．１ ＥＵ／用量を含む）。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。

本発明のワクチン組成物は、洗剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために））を含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々について１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

ワクチン組成物は、１回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。

インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与体積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。

組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。

（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実施である。

従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。

あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。

夾雑するＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑物を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）使用する）を含む参考文献４４および４５において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも使用され得る［４６］。

（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。

前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α―トコフェロール（下記参照）である。

油の混合物を使用することができる。

界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。

上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［４７］。

好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。

本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、引用文献５１の第１０章および引用文献５２の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［４８〜５０］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。

・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、体積で２〜１０％ スクアレン、２〜１０％ トコフェロールおよび０．３〜３％ ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、＜１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。それゆえ、これら３種の成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１種のこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、例えば、上記で検討した比で０．５〜１０ｍｇ スクアレン、０．５〜１１ｍｇ トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ ポリソルベート８０を含み得る［５３］。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。

・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［５４］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［５５］（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（体積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［５６］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［５７］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［５８］。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％ スクアレン、４％ ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％ Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献５９に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。

・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０もしくはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献６０に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［６１］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６２］。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６２］。

いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント添加形態（ｌｉｑｕｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｆｏｒｍ）においてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。

（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。

組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。

バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。

成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ ２３ゲージ、１インチ ２５ゲージおよび５／８インチ ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」^ＴＭの下で市販されるものである。

容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。

ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。

キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。

（処置方法、および上記ワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタまたはトリ）への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。

これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［６３］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。

本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［６４〜６６］、経口［６７］、皮内［６８、６９］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［７０］などが挙げられる。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。

好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。

処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的に経験したことがない患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。

本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（ｅｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵ^ＴＭ）としても公知）である。

（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。

上記方法の種々の工程は、同時もしくは種々の時点で、同じもしくは異なる地理上の位置（例えば、国）で、そして同じもしくは異なる人々もしくは実体によって行われ得る。

動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。

化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。

２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７１の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献７２に教示される。

２つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、塩基のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７１の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーター（これは、以下のとおりである：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１）を使用する、ＧＣＧ Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１）である。

図１は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、（Ａ）汎流行性様Ｈ１株（株１）もしくは（Ｂ）第２の汎流行性様株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物の感染後６０時間で回収したスクロース勾配精製ウイルスのＨＡ含有量（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される）を比較する。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、白い棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。 図２は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、（Ａ）プレパンデミック（ｐｒｅ−ｐａｎｄｅｍｉｃ）Ｈ１株（株１）および（Ｂ）第２のプレパンデミックＨ１株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物から、感染後６０時間で回収した未精製ウイルスのＨＡ含有量（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される）を比較する。図２Ａおよび図２Ｂにおいて、白い棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。 図３は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、Ｈ３株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物から、感染後６０時間で回収したスクロース精製ウイルスのＨＡ収量（ＨＰＬＣによって決定される）を比較する。白い棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。 図４は、参照ワクチン株、またはＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかならびに汎流行性様Ｈ１株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスへの感染後６０時間で孵化鶏卵から回収したウイルスのウイルス力価（病巣形成アッセイ（ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＦＦＡ）によって決定される；図４Ａ）ならびにＨＡ力価（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される；図４Ｂ）を比較する。図４Ａにおいて、個々の点は、１個の卵のデータを示す。線は、個々のデータ点の平均を表す。ｙ軸は、感染単位／ｍｌを示す。図４Ｂにおいて、白い棒は、参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、プールした卵サンプルのＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。 図５は、参照ワクチン株、または＃２１もしくは＃２１Ｃバックボーンのいずれかならびに汎流行性様Ｈ１株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスに感染させたＭＤＣＫ細胞から、感染後６０時間で回収したウイルスのウイルス力価（ＦＦＡによって決定される；図５Ａ）およびＨＡ力価（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される；図５Ｂ）を比較する。両方の図において、白い棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、＃２１バックボーンで作製したリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、バックボーンを含むＰＲ８−Ｘ ＰＢ２セグメントの中に２個のイヌ適合変異（Ｒ３８９Ｋ、Ｔ５５９Ｎ）を含む改変＃２１バックボーン（＃２１Ｃ）で作製したリアソータントウイルスを表す。図５Ａおよび図５Ｂ中のｙ軸は、それぞれ、感染単位／ｍｌおよびＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。 図６は、ＰＲ８−Ｘ、＃２１もしくは＃２１Ｃのバックボーンのいずれかならびに異なる汎流行性様Ｈ１株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスに感染させたＭＤＣＫ細胞から感染後６０時間で回収したウイルスのウイルス力価（ＦＦＡによって決定される）を比較する。白い棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを表し、点付きの棒は、＃２１バックボーンを表し、チェック模様の棒は、バックボーンを含むＰＲ８−Ｘ ＰＢ２セグメントの中に２個のイヌ適合変異（Ｒ３８９Ｋ、Ｔ５５９Ｎ）を含む＃２１Ｃバックボーンを表す。ｙ軸は、感染単位／ｍｌを示す。 図７は、参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）、またはＰＲ８−Ｘもしくは＃２１Ｃバックボーンのいずれかならびに汎流行性様Ｈ１株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスに感染させた孵化鶏卵から、感染後６０時間で回収したウイルスのＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって決定される）を比較する。個々の点は、１個の卵のデータを表す。線は、個々のデータ点の平均を表す。ｙ軸は、ＨＡ単位を示す。 図８は、ＰＲ８−Ｘバックボーンもしくはイヌ適合ポリメラーゼ変異を含む改変ＰＲ８−Ｘバックボーンのいずれかならびに汎流行性様Ｈ１株（株１）由来のＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞の感染後の種々の時点で回収したウイルスの感染力価（ＦＦＡによって決定される）を比較する。図８Ａにおいて、三角マーカー付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを示し、四角マーカー付きの実線は、ＰＲ８−Ｘ ＰＡセグメントの中に３個のイヌ適合変異（Ｅ３２７Ｋ、Ｎ４４４Ｄ、およびＮ６７５Ｄ）を含む改変ＰＲ８−Ｘバックボーン「ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）」を示す。図８Ｂにおいて、三角マーカー付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを示し、白丸マーカー付きの実線は、ＰＲ８−Ｘ ＮＰセグメントの中に２個のイヌ適合変異（Ａ２７Ｔ、Ｅ３７５Ｎ）を含む改変ＰＲ８−Ｘバックボーン「ＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）」を示す。両方の図において、ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、感染単位／ｍｌを示す。 図９は、参照ワクチン株、またはＰＲ８−Ｘもしくはイヌ適合変異を含む改変ＰＲ８−ＸバックボーンのいずれかならびにＨ３株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスに感染させたＭＤＣＫ細胞から、感染後の種々の時間で回収したウイルスの感染力価（ＦＦＡによって決定される；図９Ａ）およびＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって決定される；図９Ｂ）を比較する。図９Ａにおいて、×マーカー付きの破線は、参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を示し、三角マーカ付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを示し、四角マーカー付きの実線は、ＰＲ８−Ｘ ＰＡセグメントの中に３個のイヌ適合変異（Ｅ３２７Ｋ、Ｎ４４４Ｄ、およびＮ６７５Ｄ）を含む改変ＰＲ８−Ｘバックボーン「ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）」を示し、白丸マーカー付きの実線は、ＰＲ８−Ｘ ＮＰセグメントの中に２個のイヌ適合変異を含む改変ＰＲ８−Ｘバックボーン「ＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）」を示す。ｙ軸は、感染単位／ｍｌを表し、ｘ軸は、感染後の時間を表す。図９Ｂにおいて、白い棒は、参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を示し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを示し、チェック模様の棒は、ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）バックボーンを示し、斜交線付きの棒は、ＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）バックボーンを示す。ｙ軸は、感染後６０時間の時点のＨＡ単位を表す。 図１０は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、（Ａ）Ｈ３株（株２）もしくは（Ｂ）第２のＨ３株（株３）もしくは（Ｃ）第３のＨ３株（株４）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物から、感染後６０時間で回収したスクロース勾配精製ウイルスのＨＡ含有量（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される）を比較する。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、白い棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、点付きの棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、チェック模様の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。

（発明を実施する態様）
（新たなドナー株の開発）
高増殖ドナー株を提供するために、本発明者らは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９のＰＢ１セグメントおよびＰＲ８−Ｘに由来する他の全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、ＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、改善された増殖特徴を示すことを見出した。このインフルエンザバックボーンは、＃２１といわれる。

（病巣形成アッセイ（ＦＦＡ））
ＦＦＡのために、未感染ＭＤＣＫ細胞を、９６ウェルプレートにおいて１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ １００μｌ中、１．８×１０^４ 細胞／ウェルの密度でプレートする。翌日、培地を吸引し、細胞を、容積５０μｌ中のウイルス（ＤＭＥＭ＋１％ ＦＣＳ中で希釈したウイルス）に感染させる。上記細胞を、翌日まで３７℃でインキュベートする。

感染後のいくつかの時点で、上記培地を吸引し、上記細胞をＰＢＳで１回洗浄する。５０μｌの氷冷５０％／５０％ アセトン−メタノールを各ウェルに添加し、続いて、−２０℃で３０分間インキュベートする。上記アセトンミックスを吸引し、上記細胞を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で１回洗浄する。５０μｌの、ＰＢＳ中の２％ ＢＳＡを各ウェルに添加し、続いて、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートする。抗ＮＰの１：６０００希釈物５０μｌを、ブロッキング緩衝液中に添加し、続いて、ＲＴで１時間インキュベートする。上記抗体溶液を吸引し、上記細胞を、ＰＢＳＴで３回洗浄する。二次抗体（ヤギ抗マウス）を５０μｌ ブロッキング緩衝液中で１：２０００希釈で添加し、上記プレートを、ＲＴで１時間インキュベートする。上記抗体溶液を吸引し、上記細胞をＰＢＳＴで３回洗浄する。５０μｌのＫＰＬ Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、１０分間インキュベートする。上記Ｔｒｕｅ−Ｂｌｕｅを吸引し、ｄＨ_２Ｏで１回洗浄することによって、上記反応を停止させる。水を吸引し、上記細胞を静置して乾燥させる。

（ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
ウイルス再集合のためのドナー株として＃２１株が適切であることを試験するために、リアソータントインフルエンザウイルスを、逆遺伝学によって生成する（このウイルスは、種々のインフルエンザ株（人畜共通感染株、流行期株、および汎流行性様株を含む）に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびにＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかに由来する他のウイルスセグメントを含む）。これらリアソータントウイルスのＨＡ含有量、ＨＡ収量およびウイルス力価を決定する。コントロールとして、ＰＲ８−ＸもしくはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するあらゆるバックボーンセグメントを含まない参照ワクチン株を使用する。これらウイルスを、孵化鶏卵もしくはＭＤＣＫ細胞のいずれかにおいて培養する。

その結果は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスが、卵および細胞培養物の両方においてコントロールウイルスおよびＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むウイルスと比較して、より高いウイルス力価およびＨＡ収量を一貫して与えることを示す。この差異は、＃２１リアソータントとＰＲ８−Ｘリアソータントとの間の差異のみであるので、ＰＢ１セグメントに起因する（図１〜４を参照のこと）。

（ＰＲ８−Ｘもしくはイヌ適合ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
ＰＲ８−Ｘの増殖特徴に対するイヌ適合変異の効果を試験するために、本発明者らは、ＰＲ８−ＸのＰＡセグメント（Ｅ３２７Ｋ、Ｎ４４４Ｄ、およびＮ６７５Ｄ）、またはＮＰセグメント（Ａ２７Ｔ、Ｅ３７５Ｎ）に変異を導入する。これらバックボーンは、それぞれ、ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）およびＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）といわれる。ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）およびＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）バックボーン、ならびに汎流行性様Ｈ１インフルエンザ株（株１）またはＨ３インフルエンザ株（株２）のＨＡおよびＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを生成する。コントロールとして、ＰＲ８−Ｘに由来するあらゆるバックボーンセグメントも含まない参照ワクチン株を使用する。上記リアソータントインフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ細胞で培養する。

その結果は、イヌ適合バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、未改変ＰＲ８−Ｘバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、より高いウイルス力価まで一貫して増殖することを示す（図８および図９を参照のこと）。

（ＰＲ８−Ｘ、＃２１もしくは＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
バックボーンセグメントにおけるイヌ適合変異が、＃２１バックボーンの増殖特徴を改善するか否かを試験するために、本発明者らは、ＰＲ８−Ｘ ＰＢ２セグメントの中に変異（Ｒ３８９Ｋ、Ｔ５５９Ｎ）を導入することによって、＃２１バックボーンを改変する。このバックボーンは、＃２１Ｃといわれる。２種の異なる汎流行性様Ｈ１株（株１および株２）に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびにＰＲ８−Ｘ、＃２１バックボーンもしくは＃２１Ｃバックボーンのいずれかに由来する他のウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを、逆遺伝学によって生成する。コントロールとして、ＰＲ８−ＸもしくはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するあらゆるバックボーンセグメントも含まない参照ワクチン株を使用する。これらウイルスを、ＭＤＣＫ細胞で培養する。これらリアソータントウイルスのウイルス収量を決定する。汎流行性様Ｈ１株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントならびにＰＲ８−Ｘもしくは＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスに関しては、ＨＡ力価もまた、決定する。

その結果は、＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、ＰＲ８−Ｘバックボーンセグメントもしくは＃２１バックボーンのみを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、より高いウイルス力価まで一貫して増殖することを示す（図５、図６および図７を参照のこと）。＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスはまた、ＰＲ８−Ｘリアソータントと比較してより高いＨＡ力価を示す。

本発明が、例示によってのみ記載されており、改変が、本発明の範囲および趣旨内に留まりつつ行われ得ることが理解される。

Claims (56)

1. ２種以上のドナー株由来のバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスであって、ここでＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡウイルスに由来する、リアソータントインフルエンザＡウイルス。
2. バックボーンセグメントＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳおよびＭを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスであって、ここで前記バックボーンセグメントは、２種以上のドナー株に由来し、前記インフルエンザＡウイルスは、ＨＡおよびＮＡセグメントをさらに含み、前記ＨＡおよび前記ＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来する、リアソータントインフルエンザＡウイルス。
3. 前記ＨＡセグメントおよび前記ＰＢ１セグメントは、Ｈ１インフルエンザ株に由来する、請求項１または請求項２に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
4. ２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスであって、ここでＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントは、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来し、前記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または前記ＨＡセグメントは、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない、リアソータントインフルエンザＡウイルス。
5. 前記ＰＢ１セグメントは、Ｈ１ウイルスに由来するか、そして／または前記ＨＡセグメントは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来する、請求項４に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
6. ２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスであって、ここで少なくとも１つのバックボーンセグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する、リアソータントインフルエンザＡウイルス。
7. バックボーンセグメントＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳおよびＭを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスであって、ここで前記バックボーンセグメントは、２種以上のドナー株に由来し、そして少なくとも１種のバックボーンセグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する、リアソータントインフルエンザＡウイルス。
8. 前記少なくとも１種のバックボーンセグメントは、ＰＢ１セグメントである、請求項６または請求項７に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
9. 前記ＰＢ１セグメントは、配列番号１６の配列と少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する、請求項８に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
10. 前記ＰＢ１セグメントは、配列番号１６の配列を有する、請求項９に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
11. 前記ＨＡセグメントは、Ｈ１インフルエンザ株に由来する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
12. 前記ＰＢ１セグメントおよび前記ＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
13. 以下：
    ａ）配列番号１の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＰＡセグメント、
    ｂ）配列番号３の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＰＢ２セグメント、
    ｃ）配列番号５の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＭセグメント、
    ｄ）配列番号４の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＮＰセグメント、および／または
    ｅ）配列番号６の配列と少なくとも９５％もしくは９９％の同一性を有するＮＳセグメント、
    からなる群より選択される１種以上のゲノムセグメントをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
14. 前記ウイルスは、配列番号１の配列と９５％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号３の配列と９５％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号５の配列と９５％の同一性を有するＭセグメント、配列番号４の配列と９５％の同一性を有するＮＰセグメント、および配列番号６の配列と９５％の同一性を有するＮＳセグメントを含む、請求項１３に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
15. 前記ウイルスは、配列番号１の配列を有するＰＡセグメント、配列番号３の配列を有するＰＢ２セグメント、配列番号５の配列を有するＭセグメント、配列番号４の配列を有するＮＰセグメントおよび配列番号６の配列を有するＮＳセグメントを含む、請求項１４に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
16. ２種、３種もしくは４種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み、ここで各ドナー株は、１種より多くのバックボーンセグメントを提供する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
17. ２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み、ここで前記ＰＢ１セグメントは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来しない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
18. ２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み、ここで少なくとも前記ＰＡ、ＮＰ、もしくはＭセグメントは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来しない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
19. 前記ゲノムセグメントのうちの少なくとも１種は、以下：
    ａ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３と整列させた場合に、配列番号３のアミノ酸３８９に対応する位置にリジンを有するＰＢ２ゲノムセグメント；および／または
    ｂ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３と整列させた場合に、配列番号３のアミノ酸５５９に対応する位置にアスパラギンを有するＰＢ２ゲノムセグメント；および／または
    ｃ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に、配列番号１のアミノ酸３２７に対応する位置にリジンを有するＰＡゲノムセグメント；および／または
    ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に、配列番号１のアミノ酸４４４に対応する位置にアスパラギン酸を有するＰＡゲノムセグメント；および／または
    ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に、配列番号１のアミノ酸６７５に対応する位置にアスパラギン酸を有するＰＡゲノムセグメント；および／または
    ｆ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４と整列させた場合に、配列番号４のアミノ酸２７に対応する位置にスレオニンを有するＮＰゲノムセグメント；および／または
    ｇ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４と整列させた場合に、配列番号４のアミノ酸３７５に対応する位置にアスパラギンを有するＮＰゲノムセグメント
    からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡウイルス。
20. ＰＢ２セグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号３と整列させた場合に、配列番号３のアミノ酸３８９に対応する位置にリジンを、および配列番号３のアミノ酸５５９に対応する位置にアスパラギンを有する、請求項１９に記載のリアソータントインフルエンザＡ株。
21. 前記ＰＡゲノムセグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１と整列させた場合に、アミノ酸３２７に対応する位置にリジンを；配列番号１のアミノ酸４４４に対応する位置にアスパラギン酸を、およびアミノ酸６７５に対応する位置にアスパラギン酸を有する、請求項１９に記載のリアソータントインフルエンザＡ株。
22. 前記ＮＰゲノムセグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号４と整列させた場合に、配列番号４のアミノ酸２７に対応する位置にスレオニンを、およびアミノ酸３７５に対応する位置にアスパラギンを有する、請求項１９に記載のリアソータントインフルエンザＡ株。
23. 前記株は、請求項２０のＰＢ２ゲノムセグメント、請求項２１のＰＡゲノムセグメントおよび請求項２２のＮＰゲノムセグメントを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡ株。
24. 前記インフルエンザＡ株は、Ｈ１株である、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のインフルエンザＡ株。
25. リアソータントインフルエンザＡウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
    （ｉ）培養宿主に、インフルエンザＡウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物に導入する工程であって、ここで前記発現構築物は、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントをコードし、ＨＡおよびＰＢ１ゲノムセグメントは、同じインフルエンザＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来する、工程；ならびに
    （ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、前記培養宿主を培養する工程
    を包含する、方法。
26. 前記発現構築物は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来するＰＢ１セグメントをコードしない、請求項２５に記載の方法。
27. リアソータントインフルエンザＡウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
    （ｉ）培養宿主に、インフルエンザＡウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで前記発現構築物は、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントをコードし、ＰＢ１バックボーンウイルスセグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来する、工程；ならびに
    （ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、前記培養宿主を培養する工程、
    を包含する、方法。
28. 前記少なくとも１種の発現構築物は、配列番号２２の配列と少なくとも９０％もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記発現構築物は、配列番号９、および／もしくは１１〜１４の配列と少なくとも９０％の同一性もしくは１００％の同一性を有する配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記発現構築物は、配列番号９および１１〜１４の配列と少なくとも９０％の同一性もしくは１００％の同一性を有する配列のうちの全てを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ＨＡセグメントは、Ｈ１インフルエンザウイルスに由来する、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られるリアソータントウイルスを精製する工程をさらに包含する、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. インフルエンザウイルスを生成するための方法であって、前記方法は：
    （ａ）培養宿主を請求項１〜２４に記載のリアソータントインフルエンザウイルスに感染させる工程；
    （ｂ）工程（ａ）の宿主を培養して、前記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、
    （ｃ）工程（ｂ）で生成したウイルスを精製する工程
    を包含する、方法。
34. ワクチンを調製する方法であって、前記方法は：
    （ａ）請求項３３に記載の方法によってウイルスを調製する工程、および
    （ｂ）前記ウイルスからワクチンを調製する工程、
    を包含する、方法。
35. 前記培養宿主は、孵化鶏卵である、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記培養宿主は、哺乳動物細胞である、請求項３３または３４に記載の方法。
37. 前記細胞は、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記細胞は、接着して増殖する、請求項３７に記載の方法。
39. 前記細胞は、懸濁物中で増殖する、請求項３７に記載の方法。
40. 前記ＭＤＣＫ細胞は、細胞株ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、請求項３９に記載の方法。
41. 工程（ｂ）は、前記ウイルスを不活性化する工程を包含する、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記ワクチンは、全ビリオンワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記ワクチンは、スプリットビリオンワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記ワクチンは、表面抗原ワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記ワクチンは、ビロソームワクチンである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記ワクチンは、１用量あたり、１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記インフルエンザ株のうちの少なくとも１種は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７もしくはＨ９サブタイプである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
48. インフルエンザＡウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現系であって、ここで前記発現構築物は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンウイルスセグメントをコードし、ＨＡおよびＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザＨＡサブタイプを有する２種の異なるインフルエンザ株に由来する、発現構築物。
49. インフルエンザＡウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現系であって、ここで前記発現構築物は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンウイルスセグメントをコードし、ＨＡおよびＰＢ１セグメントは、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する２種の異なるインフルエンザ株に由来し、前記発現構築物は、Ｈ３ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来するＰＢ１セグメントをコードせず、そして／または前記発現構築物は、Ｈ１ ＨＡサブタイプもしくはＨ５ ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来するＨＡセグメントをコードしない、発現系。 インフルエンザＡウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現系であって、ここで前記発現構築物は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンウイルスセグメントをコードし、ＰＢ１セグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来する、発現系。
50. 前記発現構築物は、ＰＲ８−Ｘ由来のＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、ＭおよびＰＡセグメントをコードするｖＲＮＡをさらに含み得る、請求項４８または４９に記載の発現系。
51. 前記少なくとも１種の発現構築物は、配列番号２２の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の発現系。
52. 前記発現構築物は、配列番号９および／もしくは１１〜１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のうちの１以上をさらに含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記発現構築物は、配列番号９および１１〜１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のうちの全てを含む、請求項５２に記載の方法。
54. 請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の発現系を含む、宿主細胞。
55. 前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項５４に記載の宿主細胞。
56. 前記宿主細胞は、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。

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