JP2016212121A - 受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法、並びにクロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法 - Google Patents
受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法、並びにクロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法、並びにクロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関する【解決手段】本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法に関し、より詳細には、動物の産仔数生産能力に応じて異なって発現される精子のマーカーを見出し、前記マーカーに特異的に結合する抗体を含む産仔数予測用マーカー組成物、およびそれを用いて動物の産仔数を予測する方法に関する。また、本発明は、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関し、より詳細には、精子の運動性、運動学または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）状態を測定して動物の産仔数を予測する方法に関する。【選択図】図５
Description
本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法に関し、より詳細には、動物の産仔数生産能力に応じて異なって発現される精子のマーカーを見出し、前記マーカーに特異的に結合する抗体を含む産仔数予測用マーカー組成物、およびそれを用いて動物の産仔数を予測する方法に関する。また、本発明は、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関し、より詳細には、精子の運動性、運動学または受精能獲得状態を測定して動物の産仔数を予測する方法に関する。
動物を対象とする雄動物の受胎能の予測および診断は、当業者の主な関心事である。人の受胎能に関連する問題の約５０％は、男性因子（ｍａｌｅ ｆａｃｔｏｒ）に由来する。また、５０％に該当する種雄（Ｓｉｒｅ、例えば、父獣、種馬、種豚など）を用いた繁殖システムの失敗は、動物産業に大きい経済的損失を与え得る（非特許文献１）。したがって、雄動物の受胎能を正確に予測および診断するために、新しい方法が開発されるべきである。
全世界的に、人工授精（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ、ＡＩ）が動物産業で幅広く行われている。最近のデータによれば、ここ３０年間、ヨーロッパや米国で雌ブタの９０％がＡＩにより繁殖された（非特許文献２）。また、豚産業で、遺伝的なアップ‐グラデーション（ｕｐ‐ｇｒａｄａｔｉｏｎ）のためにＡＩが広範囲に行われている（非特許文献３）。
全世界的に、人工授精（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ、ＡＩ）が動物産業で幅広く行われている。最近のデータによれば、ここ３０年間、ヨーロッパや米国で雌ブタの９０％がＡＩにより繁殖された（非特許文献２）。また、豚産業で、遺伝的なアップ‐グラデーション（ｕｐ‐ｇｒａｄａｔｉｏｎ）のためにＡＩが広範囲に行われている（非特許文献３）。
一方、高品質の精液を選択するために用いられる方法は、精子の形態、運動性、および卵母細胞の浸透力アッセイなどの既存の分析方式に依存している（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。このような検査は、可妊／不妊（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ／ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）の雄因子を測定する際に多く用いられているが、臨床的な価値は正確に立証されていない（非特許文献７；非特許文献８）。
したがって、従来の精液検査の欠点を補完するために、ヒトと経済的重要性を有する動物の種を対象として精子の機能および受胎能を測定できる新しい方法が開発されなければならない。これとともに、増大された産仔数生産効率を有する優れた種雄（ｓｉｒｅ）を選択する方法が提供された時に、シード（ｓｅｅｄ）の生産を最適化するための方法も開発されるべきである。
最近報告されたいくつかの研究によれば、効果的なツールとしてプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）を用いると、精子の分子生物学的現象を理解するにおいて役に立つと報告されており、実際に、精子のプロテオミクスについての蓄積された知識は、新たな分子マーカーを見出すことを可能とした。（非特許文献９；非特許文献１０）。このような点で、包括的なプロテオミクスツールを用いて優れた種雄（ｓｉｒｅ）来由タンパク質バイオマーカーを見出すことは、動物の生殖に関連する分野の新しい地平を開くであろう。
哺乳動物の射精された精子は、女性生殖管（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ）に長時間存在しながら、受精能獲得などの必要な生理学的な変形過程を経る（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４，非特許文献１５；非特許文献１６）。精子は、卵子と受精するために受精能獲得過程を経なければならないため、精子の受胎能力を考慮すると、受精能獲得過程前、後の変化は非常に重要である。しかしながら、現在までは、産仔数にかかわらず受精能獲得前、後のタンパク質発現挙動の差のみを比較した研究が多かった。
そこで、本発明者らは、新しい産仔数予測方法を開発するために鋭意検討した結果、精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）前後のタンパク質マーカーの発現変化による産仔数の予測方法と、クロルテトラサイクリン染色法を用いた受精能獲得状態による動物の精液品質および産仔数の予測方法を用いると、個体の産仔数生産能力が効果的に予測できることを確認し、本発明をなすに至った。
そこで、本発明者らは、新しい産仔数予測方法を開発するために鋭意検討した結果、精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）前後のタンパク質マーカーの発現変化による産仔数の予測方法と、クロルテトラサイクリン染色法を用いた受精能獲得状態による動物の精液品質および産仔数の予測方法を用いると、個体の産仔数生産能力が効果的に予測できることを確認し、本発明をなすに至った。
Ｓｈａｒｌｉｐ ＩＤ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｓｔｅｒｉｌ，７７（５）：８７３−８８２，２００２
Ｇｅｒｒｉｔｓ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，６３（２）：２８３‐２９９，２００５
Ｇａｄｅａ Ｊ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，６３（２）：４３1‐４４４，２００５
Ｂｏｎｄｅ ＪＰ，Ｌａｎｃｅｔ，３５２（９１３５）：１１７２‐１１７７，１９９８
Ｂｕｄｗｏｒｔｈ ＰＲ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，９（１）：４１‐５４，１９９８
Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，１２１（１‐２）：１３１‐１３８，２０１０
Ｌｅｗｉｓ ＳＥ，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１３４（１）：３１‐４０，２００７
Ｂｒａｕｎｄｍｅｉｅｒ ＡＧ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８４：１９１５‐１９２５，２００１
Ｃｏｒｎｅｒ ＪＳ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｐｅｒｍ Ｃｅｌｌ，ｐｐ４９‐７１，２００６
ｄｅ Ｍａｔｅｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，７（２３）：４２６４‐４２７７，２００７
Ｚａｎｅｖｅｌｄ ＬＪ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，６：１２６５‐１２７４，１９９１
Ｆｒａｓｅｒ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，９６：３６３‐３７７，２００１
Ｋｉｒｉｃｈｏｋ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：７３７‐７４０，２００６
Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ＰＥ，ＰＮＡＳ，１０６：６６７‐６６８，２００９
Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３
Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：e５４１９２，２０１３
本発明の目的は、動物の産仔数予測用バイオマーカー、産仔数予測用マーカー組成物、および前記マーカーを用いて動物の産仔数を予測する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）有無に応じて動物の精液品質を予測する方法および動物の産仔数を予測する方法を提供することにある。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される動物の精液で発現が増加することを特徴とする、動物の産仔数予測用マーカー。
（項目２）
前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする、上記項目に記載の動物の産仔数予測用マーカー。
（項目３）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、動物の産仔数予測用組成物。
（項目４）
前記抗体は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用組成物。
（項目５）
上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、動物の産仔数予測用キット。
（項目６）
基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
前記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
洗浄液と、
酵素反応停止液と、をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目７）
前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目８）
前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目９）
（ａ）抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、
（ｃ）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む、動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１０）
前記固定体は、ニトロセルローズ膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスで構成される群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１１）
前記抗原‐抗体結合反応が、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原‐抗体凝集法からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１２）
前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１３）
前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１４）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む、動物の産仔数予測用組成物。
（項目１５）
前記プローブは、前記遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡと厳しい条件下でハイブリダイズすることができるプローブであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用組成物。
（項目１６）
上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、動物の産仔数予測用キット。
（項目１７）
前記キットは、ＰＣＲキット、ＲＴ‐ＰＣＲキット、またはＤＮＡチップであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目１８）
（ａ）対象試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する段階と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む、動物の産仔数予測方法。
（項目１９）
前記（ａ）段階のタンパク質レベルを測定する段階は、抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ
１Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２０）
前記試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、およびＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２１）
抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、または抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体を用いた時に、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、またはＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測することを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２２）
前記試料で、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２３）
抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、または抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体を用いた時に、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測することを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２４）
次の段階を含む動物の精液品質予測方法：
（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の変化を測定する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の測定値を対照群精子の測定値と比較して精液の品質を評価する段階。
（項目２５）
前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２６）
前記精子の運動性を測定する方法として、ＣＡＳＡ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２７）
前記受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２８）
前記対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２９）
次の段階を含む動物の産仔数予測方法：
（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応の変化を測定する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応における精子の精子膜パターンを、ＡＲ‐、Ｂ‐、またはＦ‐パターンに分類した後、それぞれのパターンの割合を対照群精子の精子膜パターンの割合と比較して、受精能が得られた精子のＡＲ‐パターンの割合が１７．５％より大きいか等しく、受精能獲得前後のＡＲ‐パターンの割合の差が１８．９７％より大きいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測し、受精能獲得前後のＢ‐パターンの割合の差が０．６８％より小さいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測することを特徴とする動物の産仔数を予測する段階。
（項目３０）
前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目３１）
前記（ｂ）段階の受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目３２）
前記（ｃ）段階の対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
摘要
本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法、並びにクロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関する。
本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法に関し、より詳細には、動物の産仔数生産能力に応じて異なって発現される精子のマーカーを見出し、前記マーカーに特異的に結合する抗体を含む産仔数予測用マーカー組成物、およびそれを用いて動物の産仔数を予測する方法に関する。また、本発明は、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関し、より詳細には、精子の運動性、運動学または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）状態を測定して動物の産仔数を予測する方法に関する。本発明によれば、動物の精子来由タンパク質マーカーを用いて、産仔数生産能力に応じて異なって発現されるタンパク質を分析することで、個体の産仔数生産能力を予測することができる。また、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数の予測方法により、精子の受精能力および個体の産仔数生産能力を予測することができる。したがって、本発明は、上記方法で提供される情報に基づいて、高い精子の受精能力および高い産仔数生産能力を有する優れた種を選別して、動物の安定的な生産を図るにおいて非常に有用に用いることができる。
（項目１）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される動物の精液で発現が増加することを特徴とする、動物の産仔数予測用マーカー。
（項目２）
前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする、上記項目に記載の動物の産仔数予測用マーカー。
（項目３）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーに特異的に結合する抗体を含む、動物の産仔数予測用組成物。
（項目４）
前記抗体は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用組成物。
（項目５）
上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、動物の産仔数予測用キット。
（項目６）
基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
前記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
洗浄液と、
酵素反応停止液と、をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目７）
前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目８）
前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目９）
（ａ）抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、
（ｃ）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む、動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１０）
前記固定体は、ニトロセルローズ膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスで構成される群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１１）
前記抗原‐抗体結合反応が、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原‐抗体凝集法からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１２）
前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１３）
前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用マーカー検出方法。
（項目１４）
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む、動物の産仔数予測用組成物。
（項目１５）
前記プローブは、前記遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡと厳しい条件下でハイブリダイズすることができるプローブであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用組成物。
（項目１６）
上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、動物の産仔数予測用キット。
（項目１７）
前記キットは、ＰＣＲキット、ＲＴ‐ＰＣＲキット、またはＤＮＡチップであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測用キット。
（項目１８）
（ａ）対象試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する段階と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む、動物の産仔数予測方法。
（項目１９）
前記（ａ）段階のタンパク質レベルを測定する段階は、抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ
１Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２０）
前記試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、およびＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２１）
抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、または抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体を用いた時に、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、またはＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測することを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２２）
前記試料で、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２３）
抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、または抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体を用いた時に、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測することを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目２４）
次の段階を含む動物の精液品質予測方法：
（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の変化を測定する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の測定値を対照群精子の測定値と比較して精液の品質を評価する段階。
（項目２５）
前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２６）
前記精子の運動性を測定する方法として、ＣＡＳＡ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２７）
前記受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２８）
前記対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の精液品質予測方法。
（項目２９）
次の段階を含む動物の産仔数予測方法：
（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応の変化を測定する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応における精子の精子膜パターンを、ＡＲ‐、Ｂ‐、またはＦ‐パターンに分類した後、それぞれのパターンの割合を対照群精子の精子膜パターンの割合と比較して、受精能が得られた精子のＡＲ‐パターンの割合が１７．５％より大きいか等しく、受精能獲得前後のＡＲ‐パターンの割合の差が１８．９７％より大きいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測し、受精能獲得前後のＢ‐パターンの割合の差が０．６８％より小さいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測することを特徴とする動物の産仔数を予測する段階。
（項目３０）
前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目３１）
前記（ｂ）段階の受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
（項目３２）
前記（ｃ）段階の対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の動物の産仔数予測方法。
摘要
本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法、並びにクロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関する。
本発明は、受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法に関し、より詳細には、動物の産仔数生産能力に応じて異なって発現される精子のマーカーを見出し、前記マーカーに特異的に結合する抗体を含む産仔数予測用マーカー組成物、およびそれを用いて動物の産仔数を予測する方法に関する。また、本発明は、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数予測方法に関し、より詳細には、精子の運動性、運動学または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）状態を測定して動物の産仔数を予測する方法に関する。本発明によれば、動物の精子来由タンパク質マーカーを用いて、産仔数生産能力に応じて異なって発現されるタンパク質を分析することで、個体の産仔数生産能力を予測することができる。また、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数の予測方法により、精子の受精能力および個体の産仔数生産能力を予測することができる。したがって、本発明は、上記方法で提供される情報に基づいて、高い精子の受精能力および高い産仔数生産能力を有する優れた種を選別して、動物の安定的な生産を図るにおいて非常に有用に用いることができる。
本発明は、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される動物の精液で発現が増加することを特徴とする動物の産仔数予測用マーカーを提供する。
また、本発明は、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーに特異的に結合する抗体を含む動物の産仔数予測用組成物、および前記組成物を含む動物の産仔数予測用キットを提供する。
また、本発明は、（ａ）抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、（ｃ）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む動物の産仔数予測用マーカー検出方法を提供する。
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、（ｃ）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む動物の産仔数予測用マーカー検出方法を提供する。
また、本発明は、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む動物の産仔数予測用組成物、および前記産仔数予測用組成物を含む動物の産仔数予測用キットを提供する。
また、本発明は、（ａ）対象試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する段階と、（ｂ）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む動物の産仔数予測方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の変化を測定する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の測定値を対照群精子の測定値と比較して、精液の品質を評価する段階と、を含む動物の精液品質を予測する方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応の変化を測定する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応における精子の精子膜パターンを、ＡＲ‐、Ｂ‐、またはＦ‐パターンに分類した後、それぞれのパターンの割合を対照群精子の精子膜パターンの割合と比較して、受精能が得られた精子のＡＲ‐パターンの割合が１７．５％より大きいか等しく、受精能獲得前後のＡＲ‐パターンの割合の差が１８．９７％より大きいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測し、受精能獲得前後のＢ‐パターンの割合の差が０．６８％より小さいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測することを特徴とする動物の産仔数を予測する段階と、を含む、動物の産仔数予測方法を提供する。
本発明によれば、動物の精子来由タンパク質マーカーを用いて、産仔数生産能力に応じて異なって発現されるタンパク質を分析することで、個体の産仔数生産能力を予測することができる。また、クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数の予測方法により、精子の受精能力および個体の産仔数生産能力を予測することができる。したがって、本発明は、上記方法で提供される情報に基づいて、高い精子の受精能力および高い産仔数生産能力を有する優れた種を選別して、動物の安定的な生産を図るにおいて非常に有用に用いることができる。
本発明の一実施例で、雄ブタを産仔数の高いグループ（高産仔数）と低いグループ（低産仔数）とに分け、それぞれのグループから精子を採取して２‐ＤＥを行った後、ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳを用いて高産仔数および低産仔数を比較することで、産仔数生産能力に応じたタンパク質の発現挙動を分析した。その結果、高産仔数と低産仔数との間にタンパク質の発現量において差があることを確認した（図１および図２）。発現量の差がある前記タンパク質は、表２に示したように、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）であることが確認された。特に、ＥＱＴＮ、ＡＷＮ、ＴＰＩ、ＲＡＢ２Ａ、ＡＱＮ‐３またはＮＤＵＦＳ２は、高産仔数精子に比べ低産仔数精子で有意に過量発現され（＞３倍；Ｐ＜０．０５；図２Ａ）、ＬＡＡＯ、ＭＤＨ２、ＮＴ５Ｃ１Ｂ、ＬＹＺＬ４またはＣＡＬＭは、低産仔数精子に比べ高産仔数精子で有意に過量発現されることが確認された（＞３倍；Ｐ＜０．０５；図２Ａ）。
したがって、本発明は、一観点で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される動物の精液で発現が増加することを特徴とする動物の産仔数予測用マーカーに関する。
Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される動物の精液で発現が増加することを特徴とする動物の産仔数予測用マーカーに関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
前記マーカーおよび本発明で用いられたマーカーのＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．は下記のとおりである（表２参照）。
ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：１６４５４１
ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：２６５４１７９
ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．： ８０９７１５１０
ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２５３７９
ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：５４５８２２３０
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：５４５８３２１７
細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３３５２８５８４
リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２６８７１
ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２４５６７
スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：２４８３０４
スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：１１４０８３
ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：２６５４１７９
ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．： ８０９７１５１０
ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２５３７９
ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：５４５８２２３０
Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：５４５８３２１７
細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３３５２８５８４
リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２６８７１
ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：３１１２４５６７
スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：２４８３０４
スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）のＮＣＢＩ ｇｉ Ｎｏ．：１１４０８３
ＥＱＴＮ（３８‐４８ ＫＤａ）タンパク質は、動物種の赤道部分（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ）および先体に位置して保存している途中、ＡＲ（ａｃｒｏｓｏｍｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）時に露出されて精子‐卵子相互作用および受精プロセスに関与すると知られている（Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，５９（１）：２２‐９，１９９８；Ｙｏｓｈｉｎａｇａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１２２（４）：６４９‐５５，２００１；Ｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，４４４（４）：５３７‐５４２，２０１４；Ｍａｎａｎｄｈａｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，６５（５）：１４２５‐１４３６，２０１１）。最近の研究結果によれば、Ｅｑｔｎ ＫＯマウス（Ｅｑｔｎ‐／‐）の精子は、ＡＲおよび受精の欠乏があるが、正常な運動性および形態を示すと報告されている（Ｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，４４４（４）：５３７‐５４２，２０１４）。
ｒｅａｃｔｉｏｎ）時に露出されて精子‐卵子相互作用および受精プロセスに関与すると知られている（Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，５９（１）：２２‐９，１９９８；Ｙｏｓｈｉｎａｇａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１２２（４）：６４９‐５５，２００１；Ｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，４４４（４）：５３７‐５４２，２０１４；Ｍａｎａｎｄｈａｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，６５（５）：１４２５‐１４３６，２０１１）。最近の研究結果によれば、Ｅｑｔｎ ＫＯマウス（Ｅｑｔｎ‐／‐）の精子は、ＡＲおよび受精の欠乏があるが、正常な運動性および形態を示すと報告されている（Ｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，４４４（４）：５３７‐５４２，２０１４）。
ＲＡＢ２Ａタンパク質は、ＲＡＢ族のサブグループであって、小胞輸送（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）および膜融合を調節すると報告されており、精子の先体膜に位置すると知られていて、先体の構造的変形を起こすのに関与し、精子の受精能獲得後にＡＲを誘導することができると報告されている（Ｒａｈｍａｎ ＭＳ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，３６０９８６，２０１３；Ｗｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ，９（２）：４６８‐４７５，２０１４）。
ＡＱＮ‐３およびＡＷＮタンパク質は、低分子量でブタの精子で確認されており（Ｓａｎｚ Ｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２９１（１）：３３‐３６，１９９１；Ｓａｎｚ Ｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，３００（３）：２１３‐２１８，１９９２）、ＺＰ‐結合タンパク質として１０９‐１３３アミノ酸および２つのジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ）を有する構造を有し（Ｃａｌｖｅｔｅ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１８（２）：７１９‐７２５，１９９３）、射精時に多量のＡＱＮ‐３およびＡＷＮが精子の表面にコーティングされていて受精能獲得状態になると放出されると知られている。また、ＡＱＮ‐３とＡＷＮは、受精能獲得および生殖細胞（ｇａｍｅｔｅｓ）の認識において重要な役割をすると報告されている（Ｄｏｓｔａｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１２００（１）：４８‐５４，１９９４）。
ＮＤＵＦＳ２タンパク質は、ＮＡＤＨ‐ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ４０ＫＤａのサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）であると知られており（Ｆｅａｒｎｌｅｙ ＩＭ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２７８（Ｐｔ ３）：８２１‐８２９，１９９１；Ｐｒｏｃａｃｃｉｏ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ，９（６）：４８２‐４８４，１９９８）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、ミトコンドリア電子伝達系（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ）のコントリビューティドサイト１（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ ｓｉｔｅ １）である。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、精子でチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）リン酸化および精子の運動性に関与すると報告されている（Ｒｕｉｚ−Ｐｅｓｉｎｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，４４（８ Ｐｔ １）：１６１６‐１６２０，１９９８；Ａｒｃｅｌａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，５２（５‐６）：４６３‐４７２，２００８；Ｌｏｚａ―Ｈｕｅｒｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８３０（１１）：５３０５‐５３１５，２０１３）。
ＴＰＩタンパク質は、精子の受精能獲得およびＡＲに必要なブドウ糖代謝に関与する必須酵素であるが（Ｆｒａｓｅｒ ＬＲ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，６１（１）：２５‐３５，１９８１）、多量発現する場合には、精子の運動性を弱化させ（ａｓｔｈｅｎｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）、精子の冷凍保存性が低下すると報告されている（Ｓｉｖａ ＡＢ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ，１６（７）：４５２‐４６２，２０１０；Ｖｉｌａｇｒａｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，８０（５）：４４３‐４５０，２０１３）。
ＬＡＡＯタンパク質は、ウシの場合は精子の尾に位置すると知られており、精子の老化または死滅時に活性化すると知られている（Ｓｈａｎｎｏｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，６４（２）：４６９‐４７３，１９８２；Ｓｈａｎｎｏｎ Ｐ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，６４（２）：４６３‐４６７，１９８２）。
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，６４（２）：４６３‐４６７，１９８２）。
ＭＤＨタンパク質は、細胞呼吸において重要な役割をすると知られており、哺乳類（雄ヒツジ、雄ブタ、および雄ウシ）の精子の中間部分（ｍｉｄ‐ｐｉｅｃｅ）に位置し、受精能獲得およびＡＲに寄与すると報告されている（Ｋｏｈｓａｋａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，９５（１）：２０１‐２０９，１９９２；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ，３７（１）：４０‐４６，２００５）。
Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ，９５（１）：２０１‐２０９，１９９２；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ，３７（１）：４０‐４６，２００５）。
ＬＹＺＬ４タンパク質は、精子の先体に位置し、運動性およびＡＲを調節して受精において重要な機能をすると報告されている（Ｓｕｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），４３（５）：３４６‐５３，２０１１；Ｎａｒｍａｄｈａ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６（１１）：ｅ２７６５９，２０１１）。
ＣＡＬＭタンパク質は、精子の先体および鞭毛に位置し、運動性およびＡＲにおいて重要な役割をすると報告されている（Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３９０（１）：１‐８，２００１；Ｃｏｌａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，７１（５）：７８９‐８００，２００９；Ｌａｓｋｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，１３２（３‐４）：１６９‐１７７，２０１２）。
本発明において、「産仔数予測用マーカー」とは、動物の産仔数生産能力に応じて異なって発現される有機生体分子を意味し、前記有機生体分子としては、これに限定されないが、例えば、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖タンパク質、糖（例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などが挙げられる。
本発明は、他の観点で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択されるマーカーに特異的に結合する抗体を含む動物の産仔数予測用組成物に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
本発明において、前記抗体は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする。
本発明において、「抗体」とは、抗原性部位に対して向けられて特異的に結合するタンパク質分子を意味する。抗体は、当業界で通常的に実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１‐５１９，１９７６）、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）、またはファージ抗体ライブラリ方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４‐６２８，１９９１）などにより製造されることができる。本発明に用いられる抗体は、モノクローン抗体またはポリクローン抗体、免疫学的に活性である断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、ヒト化抗体、抗体軽鎖、遺伝子操作された単一鎖Ｆν分子、キメラ抗体などであることができる。
本発明において、前記産仔数予測用マーカーまたは産仔数予測用組成物は、男性避妊薬に適用可能な用途を有することができる。
本発明は、さらに他の観点で、前記産仔数予測用組成物を含む動物の産仔数予測用キットに関する。
本発明において、前記動物の産仔数予測用キットは、基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、前記標識体と発色反応する発色基質溶液と、洗浄液と、酵素反応停止液と、をさらに含むことを特徴とし、前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とし、前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする。
また、本発明は、さらに他の観点で、（ａ）抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、（ｃ）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む動物の産仔数予測用マーカー検出方法に関する。
４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む動物の産仔数予測用マーカー検出方法に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
本発明において、前記固定体は、ニトロセルローズ膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスで構成される群から選択されることを特徴とし、前記抗原‐抗体結合反応は、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原‐抗体凝集法からなる群から選択されることを特徴とする。
本発明において、前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とし、前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする。
また、本発明は、さらに他の観点で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む動物の産仔数予測用組成物に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
本発明において、前記プローブは、前記遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡと厳しい条件下でハイブリダイズできるプローブであることを特徴とする。
本発明において「プライマー」とは、短い自由水酸基を有する核酸配列であって相補的な鋳型と塩基対を形成することができ、鋳型鎖の複写のための開始地点として機能する、短い核酸配列を意味する。「非特異的増幅」とは、標的配列以外の核酸配列にプライマーがハイブリッドされ、プライマー伸長の基質として作用することで起こる、標的配列以外の核酸増幅のことである。
本発明において「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合を成すことができる、短くは数塩基、長くは数百塩基に相当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識付けされているため、特定ｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ
ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態に製作されることができる。
ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態に製作されることができる。
また、本発明は、さらに他の観点で、前記産仔数予測用組成物を含む動物の産仔数予測用キットに関する。
本発明において、前記キットは、ＰＣＲキット、ＲＴ‐ＰＣＲキット、またはＤＮＡチップであることを特徴とする。
また、本発明は、さらに他の観点で、（ａ）対象試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する段階と、（ｂ）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む動物の産仔数予測方法に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
本発明において、前記（ａ）段階のタンパク質レベルを測定する段階は、抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される一つ以上を用いることを特徴とする。
本発明は、前記試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、およびＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする。
本発明は、前記抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、または抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体を用いた時に、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、またはＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測することができることを特徴とする。
本発明は、前記試料で、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする。
本発明は、前記抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、または抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体を用いた時に、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測することができることを特徴とする。
本発明において、前記ｍＲＮＡの発現量を測定するための分析方法としては、当業界に公知の方法を用いることができ、例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、競合逆転写重合酵素連鎖反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ‐ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＲＴ‐ＰＣＲ）、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロット法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどが挙げられるが、これに限定されない。
本発明において、前記タンパク質の発現量を測定するための分析方法としては、当業界に公知の方法を用いることができ、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組職免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体結合分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、蛍光標示式細胞分取（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）などが挙げられるが、これに限定されない。
本発明は、一実施例で、精子の受精能獲得前後の状態および前記受精能獲得前後の変化による精子の運動性、運動学および受精能獲得状態と産仔数との相関度を検討した結果、表５に示したように、運動性および運動学は、受精能獲得前後および受精能獲得状態下の変化は産仔数と著しい相関度を示さなかった。また、受精能獲得前の受精能獲得状態は、産仔数と著しい相関関係を示さなかった。しかし、表６に示したように、受精能獲得後のＡＲは、産仔数と陽性の相関関係を示した（ｒ＝０．３７５；Ｐ＜０．０５）。また、受精能獲得前後のＡＲおよびＢパターンの差（△）は著しい相関関係を示した。表６に示したように、受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）は、産仔数と陽性の相関関係を示し（ｒ＝０．３３３；Ｐ＜０．０５）、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）は、産仔数と陰性の相関関係を示した（ｒ＝−１９６０．４７７；Ｐ＜０．０５）。
したがって、本発明は、さらに他の観点で、（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の変化を測定する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の精子の運動性または受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）の測定値を対照群精子の測定値と比較して、精液の品質を評価する段階と、を含む動物の精液品質予測方法に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とする。
本発明において、前記精子の運動性を測定する方法として、ＣＡＳＡ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ
ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いることを特徴とする。
ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いることを特徴とする。
本発明において、前記受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とする。
本発明において、前記対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする。
また、本発明は、さらに他の観点で、（ａ）動物から採取した精子を準備する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で準備した精子の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応の変化を測定する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の受精能獲得（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）または先体反応における精子の精子膜パターンを、ＡＲ‐、Ｂ‐、またはＦ‐パターンに分類した後、それぞれのパターンの割合を対照群精子の精子膜パターンの割合と比較して、受精能が得られた精子のＡＲ‐パターンの割合が１７．５％より大きいか等しく、受精能獲得前後のＡＲ‐パターンの割合の差が１８．９７％より大きいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測し、受精能獲得前後のＢ‐パターンの割合の差が０．６８％より小さいか等しいと、１２匹以上の産仔数を有する受胎能を予測することを特徴とする動物の産仔数を予測する段階と、を含む、動物の産仔数予測方法に関する。
本発明において、前記動物は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、エルク（ｅｌｋ）、およびバイソン（ｂｉｓｏｎ）からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする。
本発明において、前記（ａ）段階の精子は、受精能獲得前の精子またはヘパリン処理して受精能獲得が誘導された精子であることを特徴とし、前記（ｂ）段階の受精能獲得の変化を測定する方法として、ＣＴＣ（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法を用いることを特徴とし、前記（ｃ）段階の対照群精子は、高産仔数または低産仔数を有する動物来由のものであることを特徴とする。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明なことである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるべきである。
Ｉ．受胎能力に関連するタンパク質マーカーを用いた動物の産仔数予測方法
実施例Ｉ‐１：材料準備
ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）種ブタの精液サンプルは、ＳＵＮＪＩＮ社（Ｄａｎｙａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）から提供されたものを使用した。各雄の受胎能フィールドデータは農場から入手した（総仔ブタ数／総繁殖数）。パリティ後の受胎能偏差を取り除くために、受胎能におけるペロティ１は除き、ペロティ２‐８受胎能データのみが含まれた。９匹の高産仔数精液（１２．３±０．０７）および９匹の低産仔数精液（１０．２±０．０９）サンプルを収集した。繰り返し実験（ｎ＝３）のために、精液サンプルをそれぞれ無作為に３グループの高産仔数および低産仔数に分けた。個別的な差を排除するために、各グループを混合した。混合されたサンプルを、５００ｘｇで２０分間、不連続的なＰｅｒｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ（７０％［ｖ／ｖ］および３５％［ｖ／ｖ］）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で洗浄して、精液血漿および死んだ精子を除去した。ＥＬＩＳＡの受胎能フィールドデータに基づいた無作為に選択された２０個の雄ブタサンプルも、上記の方法で洗浄した。全ての動物は、実験動物の使用、処置および管理に対する指針による、中央大学動物実験倫理委員会により承認されたプロトコル下で飼育された。
実施例Ｉ‐１：材料準備
ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）種ブタの精液サンプルは、ＳＵＮＪＩＮ社（Ｄａｎｙａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）から提供されたものを使用した。各雄の受胎能フィールドデータは農場から入手した（総仔ブタ数／総繁殖数）。パリティ後の受胎能偏差を取り除くために、受胎能におけるペロティ１は除き、ペロティ２‐８受胎能データのみが含まれた。９匹の高産仔数精液（１２．３±０．０７）および９匹の低産仔数精液（１０．２±０．０９）サンプルを収集した。繰り返し実験（ｎ＝３）のために、精液サンプルをそれぞれ無作為に３グループの高産仔数および低産仔数に分けた。個別的な差を排除するために、各グループを混合した。混合されたサンプルを、５００ｘｇで２０分間、不連続的なＰｅｒｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ（７０％［ｖ／ｖ］および３５％［ｖ／ｖ］）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で洗浄して、精液血漿および死んだ精子を除去した。ＥＬＩＳＡの受胎能フィールドデータに基づいた無作為に選択された２０個の雄ブタサンプルも、上記の方法で洗浄した。全ての動物は、実験動物の使用、処置および管理に対する指針による、中央大学動物実験倫理委員会により承認されたプロトコル下で飼育された。
実施例Ｉ‐２：ＣＡＳＡ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）
精子の運動性（％）および運動学（ｍｏｔｉｏｎ ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ）は、精子分析器（ＣＡＳＡ ｓｙｓｔｅｍ；ｃｏｍｐｕｔｅｒ―ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＡＩＳ ｐｌｕｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。具体的には、前記実施例１で準備した各処理群の精子１０μＬをＭａｋｌｅｒチャンバー（Ｍａｋｌｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）に入れ、満たされたチャンバーを３７℃加熱段階に置いた。位相差モードで１０Ｘ対物レンズを用いて、画像をＳＡＩＳでリレーし、デジタル化して分析した。各試料に対して、少なくとも２５０個の精子細胞の動きをランダムフィールドから記録した（＞５）。
運動性設定パラメーターにおいて、対象のＶＣＬ（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）が１０μｍ／ｓ以上である場合に、運動性があることとした。運動性（％）および４つの運動学パラメーター（すなわち、ＶＣＬ、ＶＳＬ（ｓｔｒａｉｇｈｔ―ｌｉｎｅ
ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＶＡＰ（ａｖｅｒａｇｅ ｐａｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、平均ＡＬＨ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｈｅａｄ ｌａｔｅｒａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を分析した。
精子の運動性（％）および運動学（ｍｏｔｉｏｎ ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ）は、精子分析器（ＣＡＳＡ ｓｙｓｔｅｍ；ｃｏｍｐｕｔｅｒ―ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＡＩＳ ｐｌｕｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。具体的には、前記実施例１で準備した各処理群の精子１０μＬをＭａｋｌｅｒチャンバー（Ｍａｋｌｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）に入れ、満たされたチャンバーを３７℃加熱段階に置いた。位相差モードで１０Ｘ対物レンズを用いて、画像をＳＡＩＳでリレーし、デジタル化して分析した。各試料に対して、少なくとも２５０個の精子細胞の動きをランダムフィールドから記録した（＞５）。
運動性設定パラメーターにおいて、対象のＶＣＬ（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）が１０μｍ／ｓ以上である場合に、運動性があることとした。運動性（％）および４つの運動学パラメーター（すなわち、ＶＣＬ、ＶＳＬ（ｓｔｒａｉｇｈｔ―ｌｉｎｅ
ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＶＡＰ（ａｖｅｒａｇｅ ｐａｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、平均ＡＬＨ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｈｅａｄ ｌａｔｅｒａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を分析した。
実施例Ｉ‐３：受精能獲得状態のＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８／クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）蛍光性の評価
受精能獲得状態を確認するために、二重染色法を用いた（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５４１９２，２０１３，Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｌ‐ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，７５（６）：１１６１‐１１６９，２０１１）。すなわち、１３５μＬの処理された精子にＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液１５μＬ（１０μｇ Ｈ３３２５８／ｍＬ ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ））を添加して、常温で２分間処理した。前記混合物を、ＤＰＢＳで２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）２５０μＬ上に積み重ね、超過染色液を除去した。５００ｘｇで５分間遠心分離して上層液を除去し、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）をＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）１００μＬおよびクロルテトラサイクリン溶液（５μＬ緩衝液中、ＣＴＣ７５０ｍＭ：Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１３０ｍＭ、およびシステイン５ｍＭ、ｐＨ７．４）に再浮遊させた。Ｈ３３２５８およびＣＴＣによる受精能獲得状態を、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明下でそれぞれＵＶ ＢＰ ３４０‐３８０／ＬＰ ４２５およびＢＰ ４５０‐４９０／ＬＰ ５１５励起／放射フィルター（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いて、Ｎｉｋｏｎ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ‐ＦＸＡ顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。精子を、生きている非‐受精能獲得（ｌｉｖｅ ｎｏｎ‐ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｆパターン、赤道部分に強い蛍光線があるかない、精子の頭部全体に一律に分散された明るい緑色蛍光）、生きている受精能獲得（ｌｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｂパターン、先体領域および暗い先体後部に緑色蛍光）、および生きている先体反応（ｌｉｖｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｒｅａｃｔｅｄ；ＡＲパターン、先体領域で緑色蛍光、先体後部領域でのみ緑色蛍光、または頭部に蛍光なし）に分類した（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３，Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｌ‐ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，７５（６）：１１６１‐１１６９，２０１１）。各スライドに少なくとも４００個の精子を有する２つのスライドでサンプルを評価した。
受精能獲得状態を確認するために、二重染色法を用いた（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５４１９２，２０１３，Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｌ‐ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，７５（６）：１１６１‐１１６９，２０１１）。すなわち、１３５μＬの処理された精子にＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液１５μＬ（１０μｇ Ｈ３３２５８／ｍＬ ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ））を添加して、常温で２分間処理した。前記混合物を、ＤＰＢＳで２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）２５０μＬ上に積み重ね、超過染色液を除去した。５００ｘｇで５分間遠心分離して上層液を除去し、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）をＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）１００μＬおよびクロルテトラサイクリン溶液（５μＬ緩衝液中、ＣＴＣ７５０ｍＭ：Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１３０ｍＭ、およびシステイン５ｍＭ、ｐＨ７．４）に再浮遊させた。Ｈ３３２５８およびＣＴＣによる受精能獲得状態を、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明下でそれぞれＵＶ ＢＰ ３４０‐３８０／ＬＰ ４２５およびＢＰ ４５０‐４９０／ＬＰ ５１５励起／放射フィルター（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いて、Ｎｉｋｏｎ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ‐ＦＸＡ顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。精子を、生きている非‐受精能獲得（ｌｉｖｅ ｎｏｎ‐ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｆパターン、赤道部分に強い蛍光線があるかない、精子の頭部全体に一律に分散された明るい緑色蛍光）、生きている受精能獲得（ｌｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｂパターン、先体領域および暗い先体後部に緑色蛍光）、および生きている先体反応（ｌｉｖｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｒｅａｃｔｅｄ；ＡＲパターン、先体領域で緑色蛍光、先体後部領域でのみ緑色蛍光、または頭部に蛍光なし）に分類した（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３，Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｌ‐ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，７５（６）：１１６１‐１１６９，２０１１）。各スライドに少なくとも４００個の精子を有する２つのスライドでサンプルを評価した。
実施例１‐２および実施例１‐３の方法で、 精子の運動性及び受精能獲得の状態を高
産仔数対低産仔数で比較するために、ＣＡＳＡおよびＨ３３２５８／ＣＴＣ染色を行った。その結果、精子の運動性、運動学および受精能獲得状態は、（１）低産仔数の場合、Ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＭＯＴ）＝８８．９４±１．３０％、ＶＣＬ＝１５２．９２±１０．４０μｍ／ｓ、ＶＳＬ＝７６．６４±７．６１μｍ／ｓ、ＶＡＰ＝８８．７１±６．１１μｍ／ｓ、ＡＬＨ＝６．９３±０．４０μｍ、ＡＲ＝１．１２±０．４１％、Ｆ＝９１．５５±３．９２％、およびＢ＝７．３３±３．７２％と示され、（２）高産仔数の場合、ＭＯＴ＝９１．４３±２．５５％、ＶＣＬ＝１５９．１０±９．８９μｍ／ｓ、ＶＳＬ＝７４．８０±５．８０μｍ／ｓ、ＶＡＰ＝８７．５３±１０．４７μｍ／ｓ、ＡＬＨ＝７．１１±０．４３μｍ、ＡＲ＝２．１０±１．１３％、Ｆ＝８７．１４±０．６３％、およびＢ＝１０．７５±０．９７％（表１）と示された。すなわち、精子の運動性および受精能獲得状態の程度は、産仔数の大きさとは関係ないということが分かった。
産仔数対低産仔数で比較するために、ＣＡＳＡおよびＨ３３２５８／ＣＴＣ染色を行った。その結果、精子の運動性、運動学および受精能獲得状態は、（１）低産仔数の場合、Ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＭＯＴ）＝８８．９４±１．３０％、ＶＣＬ＝１５２．９２±１０．４０μｍ／ｓ、ＶＳＬ＝７６．６４±７．６１μｍ／ｓ、ＶＡＰ＝８８．７１±６．１１μｍ／ｓ、ＡＬＨ＝６．９３±０．４０μｍ、ＡＲ＝１．１２±０．４１％、Ｆ＝９１．５５±３．９２％、およびＢ＝７．３３±３．７２％と示され、（２）高産仔数の場合、ＭＯＴ＝９１．４３±２．５５％、ＶＣＬ＝１５９．１０±９．８９μｍ／ｓ、ＶＳＬ＝７４．８０±５．８０μｍ／ｓ、ＶＡＰ＝８７．５３±１０．４７μｍ／ｓ、ＡＬＨ＝７．１１±０．４３μｍ、ＡＲ＝２．１０±１．１３％、Ｆ＝８７．１４±０．６３％、およびＢ＝１０．７５±０．９７％（表１）と示された。すなわち、精子の運動性および受精能獲得状態の程度は、産仔数の大きさとは関係ないということが分かった。
下記表１は、低産仔数および高産仔数を有する精子の運動性、運動学および受精能獲得状態を示したものである。
実施例Ｉ‐４：２‐ＤＥおよびゲルイメージの分析
精子中のタンパク質を抽出するために、精子サンプル５０ｘ１０６／ｍＬを尿素（ｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）７Ｍ、チオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）２Ｍ、ＣＨＡＰＳ４％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ）０．０５％（ｖ／ｖ）、オクチルβ‐ジ‐グルコピロサイド（ｏｃｔｙｌ β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒｏｓｉｄｅ）１％（ｗ／ｖ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）２４μＭ、ＤＴＴ１％（ｗ／ｖ）、ＩＰＧ緩衝液０．５％（ｖ／ｖ）、およびＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）０．００２％（ｗ／ｖ）を含む再水和緩衝液に、１時間４℃で可溶されるようにした。
精子中のタンパク質を抽出するために、精子サンプル５０ｘ１０６／ｍＬを尿素（ｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）７Ｍ、チオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）２Ｍ、ＣＨＡＰＳ４％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ）０．０５％（ｖ／ｖ）、オクチルβ‐ジ‐グルコピロサイド（ｏｃｔｙｌ β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒｏｓｉｄｅ）１％（ｗ／ｖ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）２４μＭ、ＤＴＴ１％（ｗ／ｖ）、ＩＰＧ緩衝液０．５％（ｖ／ｖ）、およびＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）０．００２％（ｗ／ｖ）を含む再水和緩衝液に、１時間４℃で可溶されるようにした。
次に、精子来由タンパク質の部分標本２５０μｇを、長さ２４ｃｍのＮＬ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（ｐＨ３‐１１；Ａｍｅｒｓｈａｍ）再水和トレー内の再水和緩衝液４５０μＬに、４℃で１２時間放置した。
１次元電気泳動を行うにあたり、ＩＰＧｐｈｏｒ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓを用いて、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）を１００Ｖ（１時間）、２００Ｖ（１時間）、５００Ｖ（１時間）、１０００Ｖ（１時間）、５０００Ｖ（１．５時間）、８０００Ｖ（１．５時間）、および８０００‐９００００Ｖｈｒに焦点化（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）した。焦点化終了後、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）を、１５分間常温で、尿素（ｕｒｅａ）６Ｍ、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．８）７５ｍＭ、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）３０％（ｖ／ｖ）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）２％（ｗ／ｖ）、ＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）０．００２％（ｗ／ｖ）、およびＤＴＴ２％（ｗ／ｖ）が含まれた平衡緩衝液Ａで平衡状態となるようにした。次に、ストリップを、常温で１５分間、平衡緩衝液Ｂ（ＤＤＴがなく、ヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ）２．５％（ｗ／ｖ）を含む平衡緩衝液Ａ）で、２回目の平衡状態となるようにした。
２次元電気泳動を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル１２．５％（ｗ／ｖ）を用いて、ＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）がゲルの低い端側に移動し始めるまで１００Ｖ １ｈおよび５００Ｖで行った。イメージ分析のために、ゲルをシルバー染色した。次に、前記ゲルをＧＳ‐８００（Ｂｉｏ‐ｒａｄ）の高い解像度でスキャンした。それぞれのゲルのタンパク質スポット（ｓｐｏｔ）をＰＤＱｕｅｓｔ ８．０ソフトウェア（Ｂｉｏ‐ｒａｄ）を用いてマッチングさせながら、高産仔数および低産仔数を有する精子ゲルを比較分析した。低産仔数を有する精子ゲルを対照群として用いた。最後に、高産仔数ゲル／低産仔数ゲルの割合でスポットの密度を計算した。
実施例Ｉ‐５：タンパク質同定
４‐１：タンパク質をゲル内トリプシン消化（ｉｎ‐ｇｅｌ ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。切除されたゲルスポットを５分間シェーキングしながら１００μＬの脱染溶液（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；フェリシアン化カリウム３０ｍＭおよびチオ硫酸塩１００ｍＭ）で脱染させた。前記脱染溶液を除去した後、ゲルスポットを炭化水素アンモニウム２００ｍＭで２０分間処理した。ゲル片を１００μＬのアセトニトリルで脱水させ、真空遠心分離器内で乾燥させた。前記過程を３回繰り返した。乾燥されたゲル片を、変形されたトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．２μgを含む５０ｍＭの炭化水素アンモニウム２０μＬで氷上で４５分間再水和させた。前記溶液を除去した後、５０ｍＭの炭化水素アンモニウム３０μＬを添加した。消化は３７℃で一晩行われた。前記ペプチド溶液をＣ１８ナノカラム（ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて脱染させた。
４‐１：タンパク質をゲル内トリプシン消化（ｉｎ‐ｇｅｌ ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。切除されたゲルスポットを５分間シェーキングしながら１００μＬの脱染溶液（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；フェリシアン化カリウム３０ｍＭおよびチオ硫酸塩１００ｍＭ）で脱染させた。前記脱染溶液を除去した後、ゲルスポットを炭化水素アンモニウム２００ｍＭで２０分間処理した。ゲル片を１００μＬのアセトニトリルで脱水させ、真空遠心分離器内で乾燥させた。前記過程を３回繰り返した。乾燥されたゲル片を、変形されたトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．２μgを含む５０ｍＭの炭化水素アンモニウム２０μＬで氷上で４５分間再水和させた。前記溶液を除去した後、５０ｍＭの炭化水素アンモニウム３０μＬを添加した。消化は３７℃で一晩行われた。前記ペプチド溶液をＣ１８ナノカラム（ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて脱染させた。
４‐２：注文製作したクロマトグラフィーカラムを、質量分析前にペプチド混合液を脱染して濃縮させるために用いた。１００‐３００ｎＬのＰｏｒｏｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ Ｒ２ ｍａｔｅｒｉａｌで構成されたカラム（ビーズ径２０‐３０μｍ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を構築されたＧＥＬｏａｄｅｒ ｔｉｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内に満たした。弱い気圧で液体をカラムに通過させるために、１０ｍＬのシリンジを用いた。３０μＬの消化上澄液来由のペプチド混合液を５％のギ酸３０μＬで希釈させ、カラムに載せた後、５％のギ酸３０μＬで洗浄した。ＭＳ／ＭＳ分析のために、ペプチドをプレコートされたホウケイ酸塩ナノ‐電気噴霧針（ｐｒｅ‐ｃｏａｔｅｄ ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｎａｎｏ‐ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｎｅｅｄｌｅ；ＥｃｏｎｏＴｉｐＴＭ）に直接１．５μＬの５０％メタノール／４９％水／１％ギ酸で溶出した。
４‐３：ＥＩＳ‐ＭＳ／ＭＳ分析
ゲル内消化により生成されたペプチドのＭＳ／ＭＳを、Ｑ‐ＴＯＦ２質量分析計におけるナノ‐ＥＳＩを用いて行った（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。ソース温度は室温であった。イオンソース内のプレコートされたホウケイ酸塩ナノ‐電気噴霧針に安定的な１０‐３０ｎＬ／ｍｉｎの流速を作るために、０‐５ｐｓｉ窒素背圧とともに、１ｋＶポテンシャルを適用した。コーン電圧（ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）は４０Ｖであった。ヘクサポール衝突細胞内分裂に対する前駆体イオンを選択するために、四重極分析器を用いた。衝突ガスは６‐７ｘ１０‐５ｍｂａｒ圧力のアルゴンであり、衝突エネルギーは２５‐４０Ｖであった。生成物イオンは、マイクロ‐チャンネルプレート検出器である反射装置に適した直交ＴＯＰ分析器および時間ディジタル変換器（ｔｉｍｅ‐ｔｏ‐ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）を用いて分析した。ペプチド配列システムを用いてデータを処理した。
ゲル内消化により生成されたペプチドのＭＳ／ＭＳを、Ｑ‐ＴＯＦ２質量分析計におけるナノ‐ＥＳＩを用いて行った（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。ソース温度は室温であった。イオンソース内のプレコートされたホウケイ酸塩ナノ‐電気噴霧針に安定的な１０‐３０ｎＬ／ｍｉｎの流速を作るために、０‐５ｐｓｉ窒素背圧とともに、１ｋＶポテンシャルを適用した。コーン電圧（ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）は４０Ｖであった。ヘクサポール衝突細胞内分裂に対する前駆体イオンを選択するために、四重極分析器を用いた。衝突ガスは６‐７ｘ１０‐５ｍｂａｒ圧力のアルゴンであり、衝突エネルギーは２５‐４０Ｖであった。生成物イオンは、マイクロ‐チャンネルプレート検出器である反射装置に適した直交ＴＯＰ分析器および時間ディジタル変換器（ｔｉｍｅ‐ｔｏ‐ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）を用いて分析した。ペプチド配列システムを用いてデータを処理した。
４‐４：データベース検索
ＭＡＳＣＯＴソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）内のイオン検索オプションとしてＭＳ／ＭＳイオン検索を指定した。ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳによるＥＳＩ‐ＭＳ内のペプチドピークからペプチド断片ファイルを得た。潜在的に損失された分節部位を有する酵素としてトリプシンを選択した。ツールタイプとしてＥＳＩ‐ＱＴＩＦを選択した。ペプチド断片ファイルを、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いたデータベースに基づいて検索し、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ分類によって限定した。酸化されたメチオニンを可変的変形とし、カルバミドメチル化システイン（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を固定的変形とした。質量許容差（ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）は、ペプチドは±１Ｄａ、断片は±０．６Ｄａとした。高数値ペプチドは、ＭＡＳＣＯＴ内のデフォルト有効臨界レベル（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）以上のものと一致した（ｐ＜０．０５、ペプチド数値＞３５）。
ＭＡＳＣＯＴソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）内のイオン検索オプションとしてＭＳ／ＭＳイオン検索を指定した。ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳによるＥＳＩ‐ＭＳ内のペプチドピークからペプチド断片ファイルを得た。潜在的に損失された分節部位を有する酵素としてトリプシンを選択した。ツールタイプとしてＥＳＩ‐ＱＴＩＦを選択した。ペプチド断片ファイルを、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いたデータベースに基づいて検索し、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ分類によって限定した。酸化されたメチオニンを可変的変形とし、カルバミドメチル化システイン（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を固定的変形とした。質量許容差（ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）は、ペプチドは±１Ｄａ、断片は±０．６Ｄａとした。高数値ペプチドは、ＭＡＳＣＯＴ内のデフォルト有効臨界レベル（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）以上のものと一致した（ｐ＜０．０５、ペプチド数値＞３５）。
受胎能に関連するタンパク質を探すために、高産仔数および低算数を有するブタ来由の精子のタンパク質を２‐ＤＥおよびシルバー染色した後、イメージ分析した結果、図１および図２に示したように、高／低産仔数による差が３倍以上（Ｐ＜０．０５）大きく示された１１個のスポットが確認された。前記確認されたスポットのタンパク質をＭＡＳＣＯＴ ＳＷを用いてＭＳ／ＭＳイオン検索した結果、表２に示したように、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）であることが確認された。特に、ＥＱＴＮ、ＡＷＮ、ＴＰＩ、ＲＡＢ２Ａ、ＡＱＮ‐３、またはＮＤＵＦＳ２は、高産仔数精子に比べ低産仔数精子で有意に過量発現され（＞３倍；Ｐ＜０．０５；図２Ａ）、ＬＡＡＯ、ＭＤＨ２、ＮＴ５Ｃ１Ｂ、ＬＹＺＬ４、またはＣＡＬＭは、低産仔数精子に比べ高産仔数精子で有意に過量発現されることが確認された（＞３倍；Ｐ＜０．０５；図２Ａ）。
下記表２は、特異的に発現（３倍以上発現差）されるタンパク質をＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳで確認した結果を示したものである。
実施例Ｉ‐６：ウェスタンブロッティング
２‐ＤＥ結果を確認するために、抗‐ＲＡＢ２Ａ、抗‐ＴＰＩ、抗‐ＮＤＵＦＳ２、抗‐ＣＡＬＭ、および抗‐ＭＤＨ２抗体で視覚化したウェスタンブロッティングバンドを、高産仔数と低産仔数の３つの個別的な雄ブタ精子から数量化した。ウェスタンブロッティング法は、既存の方法を僅かに変形して行った（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５４１９２，２０１３）。前記精子サンプルをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回濯いだ後、１０，０００ｘｇで５分間遠心分離した。その後、ペレットを再浮遊させ、５％の２‐メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液で室温で１０分間処理した。次に、不溶性断片を１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離して分離した。前記処理されたサンプルを、１２％のミニ‐ゲルシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移動させた。前記膜を３％のブロッキング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で室温で１時間ブロッキングした。高産仔数および低産仔数精子来由のＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、またはＭＤＨ２を室温で２時間ブロッキング溶液で希釈（１：１，０００）した抗‐ＲＡＢ２Ａマウスモノクロナール（モノクローン）抗体、抗‐ＴＰＩウサギポリクローナル（ポリクローン）抗体、抗‐ＮＤＵＦＳ２ヤギポリクローナル抗体、抗‐ＣＡＬＭマウスモノクロナール抗体、および抗‐ＭＤＨ２ウサギポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて免疫検出した。次に、ブロッキング溶液で希釈された（１：３，０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）に接合された抗‐マウスＩｇＧ、抗‐ウサギＩｇＧ、および抗‐ヤギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）で前記膜を室温で２時間処理した。α‐ｔｕｂｕｌｉｎは、室温で２時間ブロッキング溶液で希釈された（１：１０，０００）モノクロナール抗α‐ｔｕｂｕｌｉｎマウス抗体（Ａｂｃａｍ）で処理して検出した。また、室温で１時間ブロッキング溶液で希釈された（１：１０，０００）ＨＲＰに接合されたヤギ抗‐マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）で膜を処理した。前記膜をＰＢＳＴで３回洗浄した。前記膜に付着されたタンパク質を、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬を用いてＥＣＬテクニックで検出した。全てのバンドは、ＧＳ‐８００ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）でスキャンしてＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）で分析した。最後に、ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２／α‐ｔｕｂｕｌｉｎバンドの信号強度の割合を計算した。
２‐ＤＥ結果を確認するために、抗‐ＲＡＢ２Ａ、抗‐ＴＰＩ、抗‐ＮＤＵＦＳ２、抗‐ＣＡＬＭ、および抗‐ＭＤＨ２抗体で視覚化したウェスタンブロッティングバンドを、高産仔数と低産仔数の３つの個別的な雄ブタ精子から数量化した。ウェスタンブロッティング法は、既存の方法を僅かに変形して行った（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５４１９２，２０１３）。前記精子サンプルをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回濯いだ後、１０，０００ｘｇで５分間遠心分離した。その後、ペレットを再浮遊させ、５％の２‐メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液で室温で１０分間処理した。次に、不溶性断片を１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離して分離した。前記処理されたサンプルを、１２％のミニ‐ゲルシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移動させた。前記膜を３％のブロッキング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で室温で１時間ブロッキングした。高産仔数および低産仔数精子来由のＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、またはＭＤＨ２を室温で２時間ブロッキング溶液で希釈（１：１，０００）した抗‐ＲＡＢ２Ａマウスモノクロナール（モノクローン）抗体、抗‐ＴＰＩウサギポリクローナル（ポリクローン）抗体、抗‐ＮＤＵＦＳ２ヤギポリクローナル抗体、抗‐ＣＡＬＭマウスモノクロナール抗体、および抗‐ＭＤＨ２ウサギポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて免疫検出した。次に、ブロッキング溶液で希釈された（１：３，０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）に接合された抗‐マウスＩｇＧ、抗‐ウサギＩｇＧ、および抗‐ヤギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）で前記膜を室温で２時間処理した。α‐ｔｕｂｕｌｉｎは、室温で２時間ブロッキング溶液で希釈された（１：１０，０００）モノクロナール抗α‐ｔｕｂｕｌｉｎマウス抗体（Ａｂｃａｍ）で処理して検出した。また、室温で１時間ブロッキング溶液で希釈された（１：１０，０００）ＨＲＰに接合されたヤギ抗‐マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）で膜を処理した。前記膜をＰＢＳＴで３回洗浄した。前記膜に付着されたタンパク質を、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬を用いてＥＣＬテクニックで検出した。全てのバンドは、ＧＳ‐８００ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）でスキャンしてＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）で分析した。最後に、ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２／α‐ｔｕｂｕｌｉｎバンドの信号強度の割合を計算した。
高／低産仔数精子来由のタンパク質の正体を検証するために、ウェスタンブロットおよび抗体を用いて実験を行った結果、ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２は、それぞれ２４、２７、４９、１７、および３３ｋＤａ位置で確認され、これは図３の結果と類似する。特に、ＴＰＩ、ＲＡＢ２ＡまたはＮＤＵＦＳ２は、高産仔数精子に比べ低産仔数精子で有意に過量発現され（Ｐ＜０．０５）、ＭＤＨ２またはＣＡＬＭは、低産仔数精子に比べ高産仔数精子で有意に過量発現されることが確認された（Ｐ＜０．０５）。
実施例Ｉ‐７：ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ―ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ）
雄ブタのＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２と産仔数との相関関係を確認するために、２０匹の雄ブタ来由の精子に対してＥＬＩＳＡを行った。精子からタンパク質を抽出するために、精子サンプル５０ｘ１０６／ｍＬを、尿素（ｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）７Ｍ、チオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）２Ｍ、ＣＨＡＰＳ４％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ）０．０５％（ｖ／ｖ）、オクチルβ‐ジ‐グルコピロサイド（ｏｃｔｙｌ β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒｏｓｉｄｅ）１％（ｗ／ｖ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）２４μＭ、ＤＴＴ１％（ｗ／ｖ）、ＩＰＧ緩衝溶液０．５％（ｖ／ｖ）、ＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）０．００２％（ｗ／ｖ）を含む再水和緩衝液に、１時間４℃で可溶されるようにした。
ａｓｓａｙ）
雄ブタのＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２と産仔数との相関関係を確認するために、２０匹の雄ブタ来由の精子に対してＥＬＩＳＡを行った。精子からタンパク質を抽出するために、精子サンプル５０ｘ１０６／ｍＬを、尿素（ｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）７Ｍ、チオ尿素（ｔｈｉｏｕｒｅａ）（Ｓｉｇｍａ）２Ｍ、ＣＨＡＰＳ４％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ）０．０５％（ｖ／ｖ）、オクチルβ‐ジ‐グルコピロサイド（ｏｃｔｙｌ β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｏｐｙｒｏｓｉｄｅ）１％（ｗ／ｖ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）２４μＭ、ＤＴＴ１％（ｗ／ｖ）、ＩＰＧ緩衝溶液０．５％（ｖ／ｖ）、ＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）０．００２％（ｗ／ｖ）を含む再水和緩衝液に、１時間４℃で可溶されるようにした。
精製されたタンパク質（５０μｇ／ウェル）をｉｍｍｕｎｏ９６‐ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩処理した。次に、前記プレートを、ブロッキング溶液（５％［ｗ／ｖ］ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（０．５％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含むＤＰＢＳ））で３７℃で９０分間ブロッキングした。ブロッキング後、３７℃で９０分間ブロッキング溶液で希釈（１：５，０００）した抗‐ＲＡＢ２Ａマウスモノクロナール抗体、抗‐ＴＰＩウサギポリクローナル抗体、抗‐ＮＤＵＦＳ２ヤギポリクローナル抗体、抗‐ＣＡＬＭマウスモノクロナール抗体、および抗‐ＭＤＨ２ウサギポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてプレートを処理した。次に、３７℃で９０分間ブロッキング溶液で希釈した（１：５，０００）ＨＲＰに接合された抗‐マウス、抗‐ウサギ、または抗‐ヤギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）で膜を処理した。前記ＨＲＰを活性化するために、プレートをＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）で室温で１５分間処理し、反応を終了させるために１Ｎ硫酸を処理した。最後に、マイクロプレート分析器（Ｇｅｍｉｎｉ Ｅｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて４５０ｎｍで信号を測定した。
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて４５０ｎｍで信号を測定した。
ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２と産仔数との相関関係を確認するために、２０匹の雄ブタの精子からタンパク質を抽出し、発現レベルをピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算して確認した。その結果、表３に示したように、ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、およびＮＤＵＦＳ２は、産仔数の大きさと陰性の相関関係を有し（ｒ＝−０．６２４、−０．７９７、および−０．６５５；Ｐ＜０．０１）、ＣＡＬＭおよびＭＤＨ２は、産仔数の大きさと陽性の相関関係を有することが確認された（ｒ＝０．６６５および０．６３８；Ｐ＜０．０１）。
下記表３は、雄ブタの精子のＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）の発現レベルと産仔数との相関関係を示したものである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
実施例Ｉ‐８：パラメーターの品質評価（Ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｅｍｅｎｔ）
４つの主要パラメーターである敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、陽性予測値（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）、および陰性予測値（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）を用いてスクリーニングテストを行った（Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ．，１２１（１‐２）：１３１‐１３８，２０１０；Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，３３（４）：６０４‐６１２，２０１０；Ｐａｒｋ ＹＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，５８（４）：４６１‐４６６，２０１２）。敏感度は、テストにより産仔数が正確に確認された雄の割合（パーセント）を決定するものである。特異度は、テストにより実際に陰性と確認された雄の割合を決定するものである。陽性予測値は、実際は産仔数が１１匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陽性と確認された雄の割合を決定するものである。陰性予測値は、実際は産仔数が１１匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陰性と確認された雄の割合を決定するものである。
４つの主要パラメーターである敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、陽性予測値（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）、および陰性予測値（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）を用いてスクリーニングテストを行った（Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ．，１２１（１‐２）：１３１‐１３８，２０１０；Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，３３（４）：６０４‐６１２，２０１０；Ｐａｒｋ ＹＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，５８（４）：４６１‐４６６，２０１２）。敏感度は、テストにより産仔数が正確に確認された雄の割合（パーセント）を決定するものである。特異度は、テストにより実際に陰性と確認された雄の割合を決定するものである。陽性予測値は、実際は産仔数が１１匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陽性と確認された雄の割合を決定するものである。陰性予測値は、実際は産仔数が１１匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陰性と確認された雄の割合を決定するものである。
パラメーターの品質評価を行った結果は、次のとおりである。まず、産仔数の大きさのｃｕｔ‐ｏｆｆ数値を決定するために、ＲＯＣ曲線を用いた。前記曲線によれば、ＲＡＢ２Ａ（０．１１８）、ＴＰＩ（１．１１５）、ＮＤＵＦＳ２（０．９３）、ＣＡＬＭ（０．２７５）、およびＭＤＨ２（０．９２５）のｃｕｔ‐ｏｆｆ数値は、最大化された敏感度および特異度と対応する。したがって、表４に示したように、前記数値を低い制限値（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ）と決定した。前記タンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値をそれぞれみれば、
（１）ＲＡＢ２Ａタンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ９０．９、４４．４、８０、および６６．７％である。１１匹の産仔数を有する予測の総合精度は７０％であった（表４）。図４Ａに示したように、０．１１８以上のＲＡＢ２Ａ発現レベルを有する場合、低産仔数は１０．５４匹であるが、０．１１８またはそれ以下のＲＡＢ２Ａ発現レベルを有する場合、平均産仔数は１１．３１匹であった。
（２）ＴＰＩタンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ７２．７、４４．４、５７．１、および６１．５％である。１１匹またはそれ以上の産仔数を有する予測の総合精度は６０％であった（表４）。図４Ｂに示したように、１．１１５以上のＴＰＩ発現レベルを有する場合、平均産仔数は１０．７匹であるが、１．１１５またはそれ以下のＴＰＩ発現レベルを有する場合、平均産仔数は１１．４匹であった（Ｐ＜０．０５）。
（３）ＮＤＵＦＳ２タンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ９０．９、４４．４、８０、および６６．７％である。１１匹またはそれ以上の産仔数を有する予測の総合精度は７０％であった（表４）。図４Ｃに示したように、０．９３以上のＮＤＵＦＳ２発現レベルを有する場合、平均産仔数は１０．５４匹であるが、０．９３またはそれ以下のＮＤＵＦＳ２発現レベルを有する場合、平均産仔数は１１．３１匹であった（Ｐ＜０．０５）。
（４）ＣＡＬＭタンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ８１．８、８８．９、８０、および９０％である。１１匹またはそれ以上の産仔数を有する予測の総合精度は８５％であった（表４）。図４Ｄに示したように、０．２７５以下のＣＡＬＭ発現レベルを有する場合、平均産仔数は１０．８匹であるが、０．２７５またはそれ以上のＣＡＬＭ発現レベルを有する場合、平均産仔数は１１．５匹であった（Ｐ＜０．０５）。
（５）ＭＤＨ２タンパク質の敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ９０．９、６６．７、８５．７、および７６．９％である。１１匹またはそれ以上の産仔数を有する予測の総合精度は８０％であった（表４）。図４Ｅに示したように、０．９２５以下のＭＤＨ２発現レベルを有する場合、平均産仔数は１０．６４匹であるが、０．９２５またはそれ以上のＭＤＨ２発現レベルを有する場合、平均産仔数は１１．３７匹であった。（Ｐ＜０．０５）。
下記表４は、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）の発現レベルと産仔数との相関関係を示したものである。
実施例Ｉ‐９：シグナル経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）
産仔数に応じて異なって発現されるタンパク質の生物学的機能およびシグナル経路を視覚化するために、Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ｖ９．０、Ａｒｉｄａｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いた。
産仔数に応じて異なって発現されるタンパク質の生物学的機能およびシグナル経路を視覚化するために、Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ｖ９．０、Ａｒｉｄａｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いた。
Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｔｕｄｉｏで分析した結果、確認された精子のマーカータンパク質であるＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）は、図５に示したように、マーカータンパク質間に相互作用をし、特定細胞プロセス、タンパク質キナーゼ、リガンド、コンプレックス、機能的クラス、および小分子に関連することが確認された。
実施例Ｉ‐１０：統計学的分析
統計分析は、統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ（バージョン１８．０）（ＵＳＡ）を用いて行った。ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２と産仔数との相関関係を決定するためにピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
統計分析は、統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ（バージョン１８．０）（ＵＳＡ）を用いて行った。ＲＡＢ２Ａ、ＴＰＩ、ＮＤＵＦＳ２、ＣＡＬＭ、およびＭＤＨ２と産仔数との相関関係を決定するためにピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
ＲＯＣｓ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ‐ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅｓ）を用いて、平均産仔数を基準として産仔数が１１匹より大きいか等しいか、または１１匹より小さいかを確認するために、それぞれ分析されたパラメーターの能力を評価した。ＲＯＣｓでｃｕｔ‐ｏｆｆ数値を計算した。前記ｃｕｔ‐ｏｆｆ数値は、最大化された特異度と敏感度をなす地点に関連して決定された（Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ．，１２１（１‐２）：１３１‐１３８，２０１０；Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，３３（４）：６０４‐６１２，２０１０；Ｐａｒｋ ＹＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，５８（４）：４６１‐４６６，２０１２）。
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｗｏ‐ｔａｉｌｅｄ ｔ‐ｔｅｓｔを用いて、タンパク質発現レベルと予測された産仔数をＲＯＣｓで比較した。Ｐ値が０．０５以下である場合、有効な差であるとみなした。全てのデータは、平均（Ｍｅａｎ）±測定標準誤差（ＳＥＭ）で示した。
ＩＩ．クロルテトラサイクリン染色法を用いた動物の精液品質および産仔数の予測方法
実施例ＩＩ‐１：精液ソースおよび人工受精
雄ランドレース種から精液サンプルを任意に収集した（ＳＵＮＪＩＮ社のＧＧＰ農場、Ｄａｎｙａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）。受胎データ（総仔ブタ数／総繁殖数）は農場から入手した。前記データに基づいて、平均産仔数が１１．４７±１．１９である２７匹の雄ブタから１７サンプルを採取した。前記採取された精液は、人工受精のために３０×１０６精子／ｍＬの濃度でエキステンダー（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ ｔｈａｗｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００ｍＬに希釈した後、１７℃に保存した。
雄ランドレース種から精液サンプルを任意に収集した（ＳＵＮＪＩＮ社のＧＧＰ農場、Ｄａｎｙａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）。受胎データ（総仔ブタ数／総繁殖数）は農場から入手した。前記データに基づいて、平均産仔数が１１．４７±１．１９である２７匹の雄ブタから１７サンプルを採取した。前記採取された精液は、人工受精のために３０×１０６精子／ｍＬの濃度でエキステンダー（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ ｔｈａｗｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００ｍＬに希釈した後、１７℃に保存した。
前記保存された精液は、射精後３日以内のものを用いて、雌ブタの発情２４時間以内に１回目の人工受精をし、２回目の人工受精は、１回目の人工受精後２４時間経過時に再度人工受精して終了した。上記の方法により人工受精された２７匹の雄ブタの受胎能力に関連するデータを収集した。
精液分析のために、２時間以内に収集されたエキステンダーに保存中の精液を用いた。前記精液は、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で１，５００ｘｇで１０分間洗浄した後、受精能獲得前と後の用途に使用できるように２つに分けた。受精能獲得実験のために、上記の２つのうち１つをＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ｖ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）０．９１ｍＭ、Ｄ‐グルコース（Ｄ‐ｇｌｕｃｏｓｅ）３．０５ｍＭ、乳酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｌａｃｔａｔｅ）２．９２ｍＭ、およびヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）１０μｇ／ｍＬを含むｍＴＣＭ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）１９９培地で、空気中で５％ＣＯ２存在下で、３７℃で培養した（Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２１：１３１‐１３８，２０１０）。
全ての動物は、実験動物の使用、処置、および管理に対する指針による、中央大学動物実験倫理委員会により承認されたプロトコル下で飼育された。
実施例ＩＩ‐２：ＣＡＳＡ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ‐ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）
精子の運動性（％）および運動学（ｍｏｔｉｏｎ ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ）は、精子分析器（ＣＡＳＡ ｓｙｓｔｅｍ；ｃｏｍｐｕｔｅｒ‐ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＡＩＳ ｐｌｕｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。具体的には、前記実施例１で準備した各処理群の精子１０μＬを、加熱段階のＭａｋｌｅｒチャンバー（Ｍａｋｌｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）に置いた。位相差モードで１０Ｘ対物レンズを用いて、画像をＳＡＩＳでリレーし、デジタル化して分析した。各試料に対して、少なくとも２５０個の精子細胞の動きを少なくとも５ランダムフィールドから記録した。ユーザー定義設定プログラムは次のとおりである：フレーム獲得、２０；フレーム割合、３０Ｈｚ；最小差（ｃｏｎｔｒａｓｔ）、７；最小サイズ、５；低い／高いサイズｇａｔｅｓ、０．４‐１．５；低い／高い彩度ｇａｔｅｓ、０．４‐１．５；非自動性頭部大きさ、１６；非自動性明るさ、１４。運動性設定パラメーターにおいて、対象のＶＣＬ（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）が１０μｍ／ｓ以上である場合に、運動性があることとした。運動性（％）および５つの運動学パラメーター（すなわち、ＶＣＬ、ＶＳＬ（ｓｔｒａｉｇｈｔ‐ｌｉｎｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＶＡＰ（ａｖｅｒａｇｅ ｐａｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＬＩＮ（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）、および平均ＡＬＨ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｈｅａｄ ｌａｔｅｒａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を分析した。
精子の運動性（％）および運動学（ｍｏｔｉｏｎ ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ）は、精子分析器（ＣＡＳＡ ｓｙｓｔｅｍ；ｃｏｍｐｕｔｅｒ‐ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｐｅｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＡＩＳ ｐｌｕｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。具体的には、前記実施例１で準備した各処理群の精子１０μＬを、加熱段階のＭａｋｌｅｒチャンバー（Ｍａｋｌｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）に置いた。位相差モードで１０Ｘ対物レンズを用いて、画像をＳＡＩＳでリレーし、デジタル化して分析した。各試料に対して、少なくとも２５０個の精子細胞の動きを少なくとも５ランダムフィールドから記録した。ユーザー定義設定プログラムは次のとおりである：フレーム獲得、２０；フレーム割合、３０Ｈｚ；最小差（ｃｏｎｔｒａｓｔ）、７；最小サイズ、５；低い／高いサイズｇａｔｅｓ、０．４‐１．５；低い／高い彩度ｇａｔｅｓ、０．４‐１．５；非自動性頭部大きさ、１６；非自動性明るさ、１４。運動性設定パラメーターにおいて、対象のＶＣＬ（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）が１０μｍ／ｓ以上である場合に、運動性があることとした。運動性（％）および５つの運動学パラメーター（すなわち、ＶＣＬ、ＶＳＬ（ｓｔｒａｉｇｈｔ‐ｌｉｎｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＶＡＰ（ａｖｅｒａｇｅ ｐａｔｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、ＬＩＮ（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）、および平均ＡＬＨ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｈｅａｄ ｌａｔｅｒａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を分析した。
実験結果、精子の受精能獲得前後の状態および前記受精能獲得前後の変化による精子の運動性および運動学と産仔数との相関関係を検討した結果、表５に示したように、運動性および運動学は、受精能獲得前後および受精能獲得状態下の変化に関連して産仔数と著しい相関関係を示さなかった。ここで、表５は、雄ブタ精子の受精能獲得前後による精子の運動性、運動学、およびその差（△）と産仔数との相関関係を示したものである。
実施例ＩＩ‐３：受精能獲得状態のＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８／クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）蛍光性の評価
受精能獲得状態を確認するために、既存の二重（Ｄｕａｌ）染色法を僅かに変形して用いた（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３）。すなわち、１３５μＬの非‐受精能獲得精子または受精能獲得精子に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液（１５０μＭのＨ３３２５８を含むＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ））１５μＬを添加し、常温で１０分間処理した。前記混合物を、ＤＰＢＳで２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）２５０μＬ上に積み重ね、超過染色液を除去した。４００ｘｇで１０分間遠心分離して上層液を除去し、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）をＤＰＢＳ５００μＬおよびクロルテトラサイクリン溶液（５μＬの緩衝液中、ＣＴＣ７５０ｍＭ：Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１３０ｍＭ、およびシステイン５ｍＭ、ｐＨ７．４）に再浮遊させた。Ｈ３３２５８およびＣＴＣによる受精能獲得状態を、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明下でそれぞれＵＶ ＢＰ ３４０‐３８０／ＬＰ ４２５およびＢＰ ４５０‐４９０／ＬＰ ５１５励起／放射フィルター（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いて、Ｎｉｋｏｎ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ‐ＦＸＡ顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。精子を、生きている非‐受精能獲得（ｌｉｖｅ ｎｏｎ‐ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｆパターン、赤道部分に強い蛍光線があるかない、精子の頭部全体に一律に分散された明るい緑色蛍光）、生きている受精能獲得（ｌｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｂパターン、先体領域および暗い先体後部に緑色蛍光）、および生きている先体反応（ｌｉｖｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｒｅａｃｔｅｄ；ＡＲパターン、先体領域で緑色蛍光、先体後部領域でのみ緑色蛍光、または頭部に蛍光なし）に分類した（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３）。各スライドに少なくとも４００個の精子を有する２つのスライドでサンプルを評価した。
受精能獲得状態を確認するために、既存の二重（Ｄｕａｌ）染色法を僅かに変形して用いた（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３）。すなわち、１３５μＬの非‐受精能獲得精子または受精能獲得精子に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液（１５０μＭのＨ３３２５８を含むＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ））１５μＬを添加し、常温で１０分間処理した。前記混合物を、ＤＰＢＳで２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）２５０μＬ上に積み重ね、超過染色液を除去した。４００ｘｇで１０分間遠心分離して上層液を除去し、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）をＤＰＢＳ５００μＬおよびクロルテトラサイクリン溶液（５μＬの緩衝液中、ＣＴＣ７５０ｍＭ：Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１３０ｍＭ、およびシステイン５ｍＭ、ｐＨ７．４）に再浮遊させた。Ｈ３３２５８およびＣＴＣによる受精能獲得状態を、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明下でそれぞれＵＶ ＢＰ ３４０‐３８０／ＬＰ ４２５およびＢＰ ４５０‐４９０／ＬＰ ５１５励起／放射フィルター（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いて、Ｎｉｋｏｎ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ‐ＦＸＡ顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。精子を、生きている非‐受精能獲得（ｌｉｖｅ ｎｏｎ‐ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｆパターン、赤道部分に強い蛍光線があるかない、精子の頭部全体に一律に分散された明るい緑色蛍光）、生きている受精能獲得（ｌｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔａｔｅｄ；Ｂパターン、先体領域および暗い先体後部に緑色蛍光）、および生きている先体反応（ｌｉｖｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｒｅａｃｔｅｄ；ＡＲパターン、先体領域で緑色蛍光、先体後部領域でのみ緑色蛍光、または頭部に蛍光なし）に分類した（Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ，９９：３５４‐６１，２０１３；Ｋｗｏｎ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｅ５４１９２，２０１３）。各スライドに少なくとも４００個の精子を有する２つのスライドでサンプルを評価した。
実験結果、精子の受精能獲得前後の状態および前記受精能獲得前後の変化による精子の受精能獲得状態と産仔数との相関関係を検討した結果、表６に示したように、受精能獲得後のＡＲは産仔数と陽性の相関関係を示した（ｒ＝０．３７５；Ｐ＜０．０５）。また、受精能獲得前後のＡＲおよびＢパターンの差（△）は、著しい相関関係を示した。表６に示したように、受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）は、産仔数と陽性の相関関係を示し（ｒ＝０．３３３；Ｐ＜０．０５）、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）は、産仔数と陰性の相関関係を示した（ｒ＝−１９６０．４７７；Ｐ＜０．０５）。ここで、表６は、雄ブタの精子の受精能獲得前後による受精能獲得およびその差（△）と産仔数との相関関係を示したものである。
実施例ＩＩ‐４：パラメーターの品質評価（Ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｅｍｅｎｔ）４つの主要パラメーターである敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、陽性予測値（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）、および陰性予測値（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）を用いてスクリーニングテストを行った（Ｅｖａｎｓ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，４５：６５７‐６６０，２００２）。敏感度は、テストにより産仔数が正確に確認された雄の割合（パーセント）を決定するものである。特異度は、テストにより実際に陰性と確認された雄の割合を決定するものである。陽性予測値は、実際は産仔数が１２匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陽性と確認された雄の割合を決定するものである。陰性予測値は、実際は産仔数が１２匹であるかそれより大きい場合または小さい場合でも、テストにより陰性と確認された雄の割合を決定するものである。
受精能獲得状態を確認するために、実施例ＩＩ‐３の方法で、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８／クロルテトラサイクリンで精子を染色し、受精能獲得有無に応じて精子状態を分類した後、実施例ＩＩ‐４のように受精能獲得状態のパラメーター品質を評価した。１２匹の産仔数に対するｃｕｔ‐ｏｆｆ数値を決定するために、受精能獲得後のＡＲパターン（１７．５％）とともに、受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△＝１８．９７％）およびＢパターンの差（△＝０．６８％）を、低い制限値（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ）と決定した（表７、８および９）。
ここで、表７は、雄ブタの精子の受精能獲得後のＡＲパターンの割合（％）と産仔数との相関関係を示したものであり、表８は、雄ブタの精子の受精能獲得前後によるＡＲパターンの差（△）の割合（％）と産仔数との相関関係を示したものであり、表９は、雄ブタの精子の受精能獲得前後によるＢパターンの差（△）の割合（％）と産仔数との相関関係を示したものである。
受精能獲得後のＡＲパターンにおいて、６雄ブタは≧１７．５％のＡＲパターンを示し、≧１２匹の仔ブタを生産したが、６雄ブタは１２匹以下の仔ブタを生産した。一方、２雄ブタは、１７．５％以下のＡＲパターンを示し、≧１２匹の仔ブタを生産し、残り１３雄ブタは、１２匹以下の仔ブタを生産した。敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ７５、６８．４、８６．７、および５０％であった。表７に示したように、１２匹の産仔数を有する予測の総合精度は７０％であった。図６Ａに示したように、雄ブタの受精能獲得後のＡＲパターンが１７．５％以下である場合、平均産仔数は１１．１匹であったが、雄ブタの受精能獲得後のＡＲパターンが≧１７．５％である場合、平均産仔数は１１．９８匹であった（Ｐ＜０．０５）。
受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）が≧１８．９７％である５雄ブタは、≧１２匹を有する一方、残りの６雄ブタは１２匹以下の仔ブタを生産した。受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）が１８．９７％以下である３雄ブタは、≧１２匹の仔ブタを生産した（１３雄ブタは１２匹以下の仔ブタを生産）。敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ６２．５、６８．４、８１．３、および４５．５％であった。表８に示したように、≧１２匹の産仔数を有する予測の総合精度は７０％であった。図６Ｂに示したように、受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）が１８．９７％以下である場合には１１．１８匹の仔ブタを有するが、受精能獲得前後のＡＲパターンの差（△）が≧１８．９７％である場合には平均産仔数が１１．８８匹であった（Ｐ＜０．０５）。
６雄ブタは、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）が≦０．６８％である場合、１２匹以上の仔ブタを生産したが、４雄ブタは１２匹以下の仔ブタを生産した。一方、２雄ブタは、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）が０．６８％以上である場合、≧１２匹の仔ブタを生産し、１５雄ブタは１２匹以下の仔ブタを生産した。敏感度、特異度、陰性予測値、および陽性予測値は、それぞれ７５、７９、８８．２、および６０％であった。表９に示したように、≧１２匹の産仔数を有する予測の総合精度は７０％であった。図６Ｃに示したように、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）が０．６８％以上である場合には１１．１９匹の仔ブタを有するが、受精能獲得前後のＢパターンの差（△）が≦０．６８％である場合には≧１１．９４匹の仔ブタを生産した（Ｐ＜０．０５）。
実施例ＩＩ‐５：統計学的分析
統計分析は、統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ（バージョン１８．０）（ＵＳＡ）を用いて行った。受精能獲得／非‐受精能獲得精子または受精能獲得状態の変化による精子の運動性、運動学、受精能獲得状態と産仔数との相関関係を決定するために、ピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
統計分析は、統計ソフトウェアプログラムＳＰＳＳ（バージョン１８．０）（ＵＳＡ）を用いて行った。受精能獲得／非‐受精能獲得精子または受精能獲得状態の変化による精子の運動性、運動学、受精能獲得状態と産仔数との相関関係を決定するために、ピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
ＲＯＣｓ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ‐ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅｓ）を用いて、平均産仔数を基準として産仔数が１２匹より大きいか等しいか、または１２匹より小さかを確認するために個別分析されたパラメーターの能力を評価した。ＲＯＣｓでｃｕｔ‐ｏｆｆ数値を計算した。前記ｃｕｔ‐ｏｆｆ数値は、最大化された特異度と敏感度をなす地点に関連して決定された（Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ．，１２１（１‐２）：１３１‐１３８，２０１０；Ｏｈ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，３３（４）：６０４‐６１２，２０１０；Ｐａｒｋ ＹＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，５８（４）：４６１‐４６６，２０１２）。
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｗｏ‐ｔａｉｌｅｄ ｔ‐ｔｅｓｔを用いて、予測された産仔数をＲＯＣｓで比較した。Ｐ値が０．０５以下である場合、有効な差であるとみなした。全てのデータは平均（Ｍｅａｎ）±測定標準誤差（ＳＥＭ）で示した。
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的説明が好ましい実施様態にすぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないということが理解できる。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されるべきである。
Claims (27)
- 精液で発現が増加することを特徴とするＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー。
- ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）マーカーに特異的に結合する抗体を含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーに特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項２に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- 前記抗体は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- 請求項２に記載の組成物を含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。
- 基質との反応により発色する標識体が接合された２次抗体接合体と、
前記標識体と発色反応する発色基質溶液と、
洗浄液と、
酵素反応停止液と、をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。 - 前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。
- 前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。
- （ａ）抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体でコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、
（ｃ）前記検出されたＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）タンパク質のレベルを対照群と比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。 - （ａ’）抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上の抗体でさらにコーティングした固定体に対象試料を加えて、抗原‐抗体反応させる段階と、
（ｂ’）前記（ａ’）段階により生成された抗原‐抗体反応物を、標識体が接合された２次抗体接合体および発色基質溶液を用いて検出する段階と、
（ｃ’）前記検出されたＬ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）タンパク質のレベルを対照群とさらに比較して、産仔数予測のための情報を提供する段階と、を含む、請求項９に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。 - 前記固定体は、ニトロセルローズ膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート、およびガラスからなるスライドガラスで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。
- 前記抗原‐抗体結合反応が、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原‐抗体凝集法からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。
- 前記標識体は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、および色素（ｄｙｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。
- 前記発色基質は、ＴＭＢ（３，３´，５，５´‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２´‐ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ‐６‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、およびＯＰＤ（ｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用マーカー検出方法。
- ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）マーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上のマーカーを暗号化する遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたはプローブをさらに含む、請求項１５に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- 前記プローブは、前記遺伝子または前記遺伝子のｍＲＮＡと厳しい条件下でハイブリダイズすることができるプローブであることを特徴とする、請求項１５に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用組成物。
- 請求項１５に記載の組成物を含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。
- 前記キットは、ＰＣＲキット、ＲＴ‐ＰＣＲキット、またはＤＮＡチップであることを特徴とする、請求項１８に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測用キット。
- （ａ）対象試料で、ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する段階と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。 - 前記（ａ）段階のタンパク質レベルを測定する段階は、抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体を用いることを特徴とする、請求項２０に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
- （ａ’）対象試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルをさらに測定する段階と、
（ｂ’）前記ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の増加または減少を分析する段階と、を含む、請求項２０または２１に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。 - 前記（ａ’）段階のタンパク質レベルを測定する段階は、抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、および抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体からなる群から選択される１つ以上を用いることを特徴とする、請求項２２に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
- 前記試料で、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、およびＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
- 抗‐Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、抗‐ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、抗‐細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、抗‐リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、または抗‐ＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）抗体を用いた時に、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ‐ａｍｉｎｏ‐ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ、ＬＡＡＯ）、ＭＤＨ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＮＡＤ）、細胞質５´‐ヌクレオチダーゼ１Ｂ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ５´‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ １Ｂ、ＮＴ５Ｃ１Ｂ）、リゾチーム様タンパク質４（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ‐ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＬＹＺＬ４）、またはＣＡＬＭ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が高いと予測することを特徴とする、請求項２４に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
- 前記試料で、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、およびＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）からなる群から選択される１つ以上の動物の産仔数予測用マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項２２または２３に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
- 抗‐ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、抗‐スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、抗‐ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、抗‐ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、抗‐スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、または抗‐ＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）抗体を用いた時に、ＥＱＴＮ（Ｅｑｕａｔｏｒｉｎ）、スペルマドヘシンＡＷＮ（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＷＮ）、ＴＰＩ（Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＲＡＢ２Ａ（Ｒａｓ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ‐２Ａ）、スペルマドヘシンＡＱＮ‐３（Ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ ＡＱＮ‐３）、またはＮＤＵＦＳ２（ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ］ ｉｒｏｎ‐ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）のタンパク質の発現量が増加すると、動物の産仔数が低いと予測することを特徴とする、請求項２６に記載のブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の産仔数予測方法。
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