JP2016174581A - Microbe detection apparatus, microbe detection program, and microbe detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検体中に微生物が含まれているかを検出するための微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法に関する。更に詳しくは、短時間で微生物コロニーを検出し、検出時に微生物を死滅させることがない微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法に関する。 The present invention relates to a microorganism detection apparatus, a microorganism detection program, and a microorganism detection method for detecting whether a microorganism is contained in a specimen. More specifically, the present invention relates to a microorganism detection apparatus, a microorganism detection program, and a microorganism detection method that detect microbial colonies in a short time and do not kill microorganisms at the time of detection.
加工食品等の製品を製造して出荷する際に、細菌等の微生物が含まれていないかを確認するための微生物検査が行われている。この微生物検査は、通常、検出対象となる食品を粉砕後、撹拌させた精製水である検体を寒天平板に付着又は混和させ、その後、微生物が目視可能となる幅約１００μｍ以上の微生物コロニーになるように一定期間培養し、次いで、微生物コロニーを目視によって探すことによって検査する寒天平板培養試験に準じた検査が行われている。
しかし、この検査方法は培養の期間として通常１日以上かかるため、より短時間で検査できる方法が望まれている。これに対していくつかの検査方法が提案されている（例えば特許文献１を参照。）。
When products such as processed foods are manufactured and shipped, microbial tests are performed to confirm whether or not microorganisms such as bacteria are included. In this microbiological test, a food sample to be detected is usually crushed, and a sample, which is agitated purified water, is attached to or mixed with an agar plate, and then becomes a microbial colony having a width of about 100 μm or more where the microbe can be observed Thus, an inspection according to an agar plate culture test in which a microorganism colony is inspected by visual inspection is performed.
However, since this inspection method usually takes one day or more as a culture period, a method capable of inspecting in a shorter time is desired. In contrast, several inspection methods have been proposed (see, for example, Patent Document 1).
特許文献１に記載される微生物検査方法は、検査対象の微生物が有する酵素に反応して蛍光物質を生ずる非蛍光物質を平板培地に拡散させ、平板培地の表面に光を照射して蛍光を発する箇所の個数から前記検体に含まれる検査対象の微生物コロニーの個数を測定している。また、個数の測定は、スキャナで行われている。 In the microorganism testing method described in Patent Document 1, a non-fluorescent substance that generates a fluorescent substance in response to an enzyme of a microorganism to be examined is diffused in a plate medium, and the surface of the plate medium is irradiated with light to emit fluorescence. The number of microbial colonies to be examined contained in the specimen is measured from the number of locations. The number is measured with a scanner.
特許文献１に記載されているような従来の微生物検査方法では、食材の端切れやゴミ等の夾雑物が付着していた場合に、これら夾雑物が蛍光物質と混同される自家蛍光を放ったり、染色によって蛍光を放ったりすることがあり、微生物コロニーとの区別が困難になるという問題があった。
また、培養時間が短いと微生物コロニーが小さく、微生物コロニーの大きさと夾雑物の大きさとの違いが少なくなって、両者を区別することが困難となるという問題があった。
ＡＴＰ等の細胞内の物質を検出することで、短時間で微生物を検出する方法も知られているが、細胞内の物質を検出するために細胞が破壊されてしまう。このような検査方法では、１つの検体について微生物を検査した後に別の試験を行うことが不可能になり、例えば寒天平板培養試験を引き続き行うことができない。このため、複数の検体を用意する必要が生じ、検査に手間を要した。
In the conventional microorganism testing method as described in Patent Document 1, when contaminants such as cut pieces of food or dust are attached, these contaminants emit autofluorescence that is confused with fluorescent substances, There is a problem in that fluorescence may be emitted by staining, making it difficult to distinguish from microbial colonies.
In addition, when the culture time is short, the microbial colonies are small, and there is a problem that the difference between the size of the microbial colonies and the size of the contaminants is small, making it difficult to distinguish the two.
A method of detecting microorganisms in a short time by detecting an intracellular substance such as ATP is also known, but the cell is destroyed in order to detect the intracellular substance. Such an inspection method makes it impossible to perform another test after inspecting microorganisms for one specimen, for example, an agar plate culture test cannot be continued. For this reason, it was necessary to prepare a plurality of specimens, and it took time and effort for the examination.
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、短時間で微生物コロニーを検出し、検出時に微生物を死滅させることがない微生物検出装置、微生物検出プログラム及び微生物検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above situation, and an object thereof is to provide a microorganism detection apparatus, a microorganism detection program, and a microorganism detection method that detect microbial colonies in a short time and do not kill microorganisms at the time of detection. And
１．微生物のコロニーを検出する微生物検出装置であって、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、を備えることを特徴とする微生物検出装置。
２．前記判定手段は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１．記載の微生物検出装置。
３．前記判定手段は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１．又は２．に記載の微生物検出装置。
４．前記輝度補正手段は、前記基板画像上の前記各区画の輝度の値から前記背景の輝度の値を減算することにより前記補正輝度を算出する前記１．乃至３．のいずれかに記載の微生物検出装置。
５．前記撮像部は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている前記１．乃至４．のいずれかに記載の微生物検出装置。
６．微生物のコロニーを検出する微生物検出プログラムであって、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得させる撮像機能と、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像機能により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正機能と、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定機能と、を備えることを特徴とする微生物検出プログラム。
７．前記判定機能は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記６．記載の微生物検出プログラム。
８．前記判定機能は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記６．又は７．に記載の微生物検出プログラム。
９．前記輝度補正機能は、前記基板画像上の前記各区画の輝度の値から前記背景の輝度の値を減算することにより前記補正輝度を算出する前記６．乃至８．のいずれかに記載の微生物検出プログラム。
１０．微生物のコロニーを検出する微生物検出方法であって、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像工程と、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像工程により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正工程と、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定工程と、を備えることを特徴とする微生物検出方法。
１１．前記判定工程は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１０．記載の微生物検出方法。
１２．前記判定工程は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する前記１０．又は１１．に記載の微生物検出方法。
１３．前記輝度補正工程は、前記基板画像上の前記各区画の輝度の値から前記背景の輝度の値を減算することにより前記補正輝度を算出する前記１０．乃至１２．のいずれかに記載の微生物検出方法。
１４．前記撮像工程は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている前記１０．乃至１３．のいずれかに記載の微生物検出方法。
1. A microorganism detection apparatus for detecting a colony of microorganisms, irradiating excitation light onto a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, imaging the substrate, and acquiring a substrate image; The imaging unit acquires the substrate image at a predetermined cycle after staining the specimen, obtains luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined cycle, and the background of the substrate image Luminance correction means for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance, and with the passage of time, the corrected luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value And a determination unit that determines that a microbial colony is present in the section in which at least one of the occurrences occurs.
2. The determination means determines that a microbial colony exists in the section where the corrected luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value. The microorganism detection apparatus as described.
3. The determination means determines that a microbial colony is present in the section when the change rate of the corrected luminance becomes a positive value and then becomes a negative value. Or 2. The microorganism detecting apparatus according to 1.
4). The luminance correction means calculates the corrected luminance by subtracting the background luminance value from the luminance value of each section on the substrate image. To 3. The microorganisms detection apparatus in any one of.
5. The imaging unit acquires the substrate image in a state where the substrate is housed in a lidded container, the lid of the lidded container has translucency, and a dew condensation prevention unit is formed on an inner surface thereof, or 1. The dew condensation prevention device is provided outside. To 4. The microorganisms detection apparatus in any one of.
6). A microorganism detection program for detecting a colony of microorganisms, irradiating excitation light onto a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, imaging the substrate, and acquiring a substrate image; and The substrate image is acquired by the imaging function at a predetermined period after the specimen is stained, the luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined period is obtained, and the background of the substrate image A luminance correction function for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance, and with the passage of time, the corrected luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value And a determination function for determining that a microbial colony is present in the section in which at least one of the above has occurred.
7). The determination function determines that a microbial colony is present in the section where the corrected luminance exceeds a predetermined value and a change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value. The microorganism detection program described.
8). The determination function determines that a microbial colony exists in the section when the rate of change of the corrected luminance becomes a positive value and then becomes a negative value. Or 7. The microorganism detection program described in 1.
9. The brightness correction function calculates the corrected brightness by subtracting the background brightness value from the brightness value of each section on the board image. To 8. The microorganism detection program according to any one of the above.
10. A microorganism detection method for detecting a colony of microorganisms, irradiating excitation light onto a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, imaging the substrate, and acquiring a substrate image; The substrate image is acquired by the imaging step at a predetermined cycle after staining of the specimen, the luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined cycle is obtained, and the background of the substrate image A luminance correction step for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance, and with the passage of time, the corrected luminance has exceeded a predetermined value and the change rate of the corrected luminance has exceeded a predetermined value And a determination step of determining that a microbial colony is present in the section where at least one of them has occurred.
11. The determination step is that the determination is that the microbial colony is present in the section where the corrected luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value. The microorganism detection method as described.
12 The determining step determines that a microbial colony is present in the section when the rate of change of the corrected luminance becomes a positive value and then becomes a negative value. Or 11. The method for detecting a microorganism according to 1.
13. The luminance correction step calculates the corrected luminance by subtracting the background luminance value from the luminance value of each section on the substrate image. To 12. The microorganism detection method according to any one of the above.
14 The imaging step acquires the substrate image in a state where the substrate is accommodated in a lidded container, the lid of the lidded container has translucency, and a dew condensation prevention portion is formed on an inner surface thereof, or 10. The dew condensation prevention tool is provided outside. Thru 13. The microorganism detection method according to any one of the above.
本発明の微生物検出装置によれば、微生物のコロニーを検出する微生物検出装置であって、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、を備えるため、微生物コロニーの蛍光輝度と夾雑物及び基板背景の蛍光輝度とが同程度の輝度であったり、微生物コロニーと夾雑物の面積の大きさに差がなかったりする短時間の培養条件であっても、誤検出することなく微生物コロニーの検出を行うことができる。
また、本微生物検出装置による検出は、蛍光の撮像によるものであり、蛍光染色剤による染色の際に微生物を破壊するものではないため、本装置による検出後も寒天平板培養試験のための培養を続行することができる。これにより、１つの検体について本微生物検出装置により検査を行った後、同じ検体を用いて寒天平板培養試験等を行うことができるため、検出結果の検証も容易にすることができる。
According to the microorganism detection apparatus of the present invention, the microorganism detection apparatus detects a colony of microorganisms, irradiates excitation light onto a substrate on which a specimen stained with a fluorescent staining agent is attached, and images the substrate. An imaging unit for acquiring a substrate image, and causing the imaging unit to acquire the substrate image at a predetermined cycle after staining the specimen, and for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined cycle. Luminance correction means for obtaining a luminance and calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each of the sections with reference to the luminance of the background of the substrate image; the corrected luminance exceeding a predetermined value as time passes; and the correction Determination means for determining that a microbial colony is present in the section where at least one of the luminance change rates exceeds a predetermined value, and the fluorescence luminance of the microbial colony, the contaminants, and the substrate Detecting microbial colonies without false detections even under short-term culture conditions where the fluorescence intensity of the scene is comparable, or there is no difference in the size of the area between microbial colonies and contaminants It can be carried out.
In addition, since the detection by this microorganism detection apparatus is based on fluorescence imaging and does not destroy microorganisms when stained with a fluorescent stain, culture for agar plate culture test is also performed after detection by this apparatus. You can continue. Thereby, after a test is performed on one sample using the present microorganism detection apparatus, an agar plate culture test or the like can be performed using the same sample, so that verification of the detection result can be facilitated.
前記判定手段は、前記補正輝度が所定値を超え且つ前記補正輝度の変化率が所定値を超えた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する場合は、補正輝度の大きさとその時間的変化とから微生物コロニーと夾雑物とを判別することにより、微生物コロニーをより高精度で検出することができる。
前記判定手段は、前記補正輝度の変化率が正の値となり、その後負の値となった場合は、前記区画に微生物コロニーが存在すると判定すれば、輝度が上昇した後、蛍光染色剤の消費等により輝度が減少する微生物コロニーを、確実に検出することができる。
前記輝度補正手段は、前記基板画像上の前記各区画の輝度の値から前記背景の輝度の値を減算することにより前記補正輝度を算出する場合は、容易に補正輝度を求め、微生物コロニーと夾雑物とを判別可能にすることができる。
前記撮像手段は、前記基板が蓋付き容器に収容された状態で前記基板画像を取得し、前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている場合は、蓋付き容器の蓋が基板より低温となり結露しやすい状態になっても結露防止部により結露を防止することができる。
When the determination means determines that a microbial colony is present in the section where the corrected luminance exceeds a predetermined value and the rate of change of the corrected luminance exceeds a predetermined value, from the magnitude of the corrected luminance and its temporal change By distinguishing between microbial colonies and contaminants, microbial colonies can be detected with higher accuracy.
If the rate of change of the corrected luminance becomes a positive value and then becomes a negative value, the determining means determines that a microbial colony is present in the section, and then increases the luminance, and then consumes the fluorescent stain. It is possible to reliably detect microbial colonies whose luminance decreases due to, for example.
When the luminance correction means calculates the correction luminance by subtracting the background luminance value from the luminance value of each section on the substrate image, the correction luminance is easily obtained and contaminated with microbial colonies. The object can be distinguished.
The imaging means acquires the substrate image in a state where the substrate is accommodated in a lidded container, the lid of the lidded container has translucency, and a dew condensation prevention portion is formed on an inner surface thereof. In the case where an anti-condensation device is provided outside, the dew condensation prevention unit can prevent dew condensation even when the lid of the lidded container becomes colder than the substrate and tends to form dew.
微生物のコロニーを検出する微生物検出プログラムによれば、前記微生物検出装置に好適な機能をコンピュータ上に実現することができる。
微生物のコロニーを検出するための微生物検出方法によれば、微生物コロニーの蛍光輝度と夾雑物及び基板背景の蛍光輝度とが同程度の輝度であったり、微生物コロニーと夾雑物の面積に大きさに差がなかったりする短時間の培養条件であっても、誤検出することなく微生物コロニーの検出を行うことができる。
According to the microorganism detection program for detecting a colony of microorganisms, a function suitable for the microorganism detection apparatus can be realized on a computer.
According to the microorganism detection method for detecting a colony of microorganisms, the fluorescence intensity of the microorganism colony and the fluorescence intensity of the contaminants and the substrate background are approximately the same, or the size of the area of the microorganism colonies and contaminants is increased. Even under short-time culture conditions where there is no difference, microbial colonies can be detected without erroneous detection.
本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明するが、同様の参照符号は図面のいくつかの図を通して同様の部品を示す。
ここで示される事項は例示的なもの及び本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。この点で、本発明の根本的な理解のために必要である程度以上に本発明の構造的な詳細を示すことを意図してはおらず、図面と合わせた説明によって本発明の幾つかの形態が実際にどのように具現化されるかを当業者に明らかにするものである。 The items shown here are for illustrative purposes and exemplary embodiments of the present invention, and are the most effective and easy-to-understand explanations of the principles and conceptual features of the present invention. It is stated for the purpose of providing what seems to be. In this respect, it is not intended to illustrate the structural details of the present invention beyond what is necessary for a fundamental understanding of the present invention. It will be clear to those skilled in the art how it is actually implemented.
１．微生物検出装置
本実施形態に係る微生物検出装置（１）は、蛍光染色剤により染色されて励起光により蛍光を発するようになった検体を付着させた基板（６）の画像から微生物のコロニーを検出する検出装置であり、撮像部（２）と、輝度補正手段（４１）と、判定手段（４６）とを備える（図１を参照。）。また、計数手段（４７）を備えることができる。輝度補正手段（４１）、判定手段（４６）及び計数手段（４７）は、情報処理部（４）上に備えることができる。
1. Microorganism detection apparatus The microorganism detection apparatus (1) according to the present embodiment detects a colony of microorganisms from an image of a substrate (6) on which a specimen stained with a fluorescent stain and fluoresced by excitation light is attached. The detection device includes an imaging unit (2), a luminance correction unit (41), and a determination unit (46) (see FIG. 1). Moreover, a counting means (47) can be provided. The brightness correction means (41), the determination means (46), and the counting means (47) can be provided on the information processing section (4).
前記検体は、微生物のコロニーの有無や数を検出する対象物であり、例えば、食品、飲料水、化粧品、原水、排水、工業用水、環境試料等を精製水に溶解させて調製した液状物を挙げることができる。微生物検出装置（１）により検出する微生物は特に問わず、例えば、大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、リステリア、クロストリジウム、バチルス等の、グラム陽性、グラム陰性、好気性、嫌気性を問わずコロニーを形成する細菌等を挙げることができる。
前記蛍光染色剤は、検出対象となる微生物コロニーを選択的に染色できるものであればよく、検出する微生物によって適宜選択される。微生物の活性を利用する蛍光染色剤として、例えば、微生物のエステラーゼ活性により染色されるフルオレセインジアセテート等のＦＤＡ系染色剤、呼吸活性により染色されるＣＴＣ等のテトラゾリウム塩系染色剤等を挙げることができる。また、微生物の核や細胞壁に非特異的に結合する染色剤として、プロピジウムイオダイド、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ、メチレンブルー、サフラニン、フクシン、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレット等を挙げることができる。また、検出対象となる微生物の染色を行うことなく、検出対象となる微生物が生産する酵素等により、酵素の誘導体から蛍光物質を代謝されてもよい。そのような酵素の例として、大腸菌が生成するβグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ等を挙げることができる。
The specimen is an object for detecting the presence or number of microbial colonies, for example, a liquid substance prepared by dissolving food, drinking water, cosmetics, raw water, waste water, industrial water, environmental samples, etc. in purified water. Can be mentioned. The microorganisms to be detected by the microorganism detection apparatus (1) are not particularly limited, and for example, colonies such as Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella, Listeria, Clostridium, and Bacillus are formed regardless of whether they are gram positive, gram negative, aerobic, or anaerobic. Examples include bacteria.
The fluorescent stain is not particularly limited as long as it can selectively stain microbial colonies to be detected, and is appropriately selected depending on the microorganism to be detected. Examples of fluorescent stains that utilize the activity of microorganisms include, for example, FDA stains such as fluorescein diacetate that are stained by the esterase activity of microorganisms, tetrazolium salt stains such as CTC that are stained by respiratory activity, and the like. it can. Examples of stains that bind nonspecifically to the nuclei and cell walls of microorganisms include propidium iodide, ethidium bromide, DAPI, methylene blue, safranin, fuchsin, crystal violet, gentian violet, and the like. Further, the fluorescent substance may be metabolized from the derivative of the enzyme by an enzyme or the like produced by the microorganism to be detected without staining the microorganism to be detected. Examples of such enzymes include β-glucuronidase, β-galactosidase, β-glucosidase, etc. produced by E. coli.
前記基板（６）は、検体を付着させることができるものであればよく、検体中の微生物を培養するための培地や、メンブレンフィルタ等の濾過材等を例示することができる。
微生物検出装置（１）によって微生物コロニーが検出可能となるのに必要な時間は、検出対象となる微生物の種類はいうまでもなく、撮像部（２）の撮像解像度等によっても変化する。例えば、大腸菌を検出対象とする場合、通常、培養開始時点より３〜６時間で１つの大腸菌の数が１００〜１００００、径が約２０μｍ以上の微生物コロニーとなり、一般的な撮像素子を用いた撮像部（２）を用いて判別が可能となる。
The substrate (6) may be any substrate as long as it can attach a specimen, and examples thereof include a medium for culturing microorganisms in the specimen, a filtering material such as a membrane filter, and the like.
The time required for the microorganism colony to be detected by the microorganism detection apparatus (1) varies depending on the imaging resolution of the imaging unit (2), not to mention the type of microorganism to be detected. For example, when Escherichia coli is a detection target, usually, the number of one E. coli is 100 to 10,000 and a microbial colony having a diameter of about 20 μm or more in 3 to 6 hours from the start of culture, and imaging using a general imaging device It becomes possible to discriminate using the part (2).
以下、図１を参照しつつ微生物検出装置１を詳細に説明する。微生物検出装置１は、撮像部２と、情報処理部４とから構成することができる。情報処理部４には、輝度補正手段４１、判定手段４６等が備えられる。
（撮像部）
撮像部２は、少なくとも光源２３及び撮像素子２８を備え、光源２３から発せられる励起光が照射されている基板６を、撮像素子２８により撮像することにより基板画像を取得する。
撮像部２の具体的な構成は任意に選択することができ、例えば、基板６の載置台２２、励起光を発する光源２３、載置台２２に励起光を照射する落射照明部２４、基板６の撮像を行う撮像素子２８等から構成することができる。尚、撮像部２には、染色剤の反応条件を維持するための加熱手段等の温度維持手段を備えることができる。
載置台２２は、基板６を載置又は固定するための台であり、その載置方法及び固定方法は特に問わない。
光源２３は、検出対象となる微生物コロニーの蛍光の励起光を発するための光源であり、波長やエネルギーにより過度に光殺菌性を示さないのであればその種類を特に問わない。例えば、光源２３として、ＬＥＤランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、レーザ発振器等を挙げることができる。
落射照明部２４は、基板に照射する光源の光路と、基板を撮像する撮像素子の光路の光軸と、を同一にするためのものであり、ダイクロイックミラーやプリズム等を組み合わせて構成することができる。
Hereinafter, the microorganism detection apparatus 1 will be described in detail with reference to FIG. The microorganism detection apparatus 1 can be composed of an imaging unit 2 and an information processing unit 4. The information processing unit 4 includes a luminance correction unit 41, a determination unit 46, and the like.
(Imaging part)
The imaging unit 2 includes at least a light source 23 and an imaging element 28, and obtains a substrate image by imaging the substrate 6 irradiated with excitation light emitted from the light source 23 with the imaging element 28.
The specific configuration of the imaging unit 2 can be arbitrarily selected. For example, the mounting table 22 of the substrate 6, the light source 23 that emits excitation light, the epi-illumination unit 24 that irradiates the mounting table 22 with excitation light, and the substrate 6. The image pickup device 28 or the like that performs image pickup can be used. The imaging unit 2 can be provided with a temperature maintaining means such as a heating means for maintaining the reaction conditions of the stain.
The mounting table 22 is a table for mounting or fixing the substrate 6, and the mounting method and the fixing method are not particularly limited.
The light source 23 is a light source for emitting fluorescence excitation light of a microbial colony to be detected, and the type thereof is not particularly limited as long as it does not exhibit photobactericidal property excessively due to wavelength or energy. For example, examples of the light source 23 include an LED lamp, a mercury lamp, a halogen lamp, and a laser oscillator.
The epi-illumination unit 24 is for making the optical path of the light source that irradiates the substrate the same as the optical axis of the optical path of the image sensor that images the substrate, and may be configured by combining a dichroic mirror, a prism, or the like. it can.
撮像素子２８は、微生物コロニーから発する蛍光の波長により基板６を撮像して、その画像（基板画像）を得ることができる手段であればよく、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ、ＳＩＴイメージセンサ等を例示することができる。また、撮像素子は、エリアイメージセンサによって面状に撮像してもよいし、リニアイメージセンサによる走査を行って画像を得ても良い。
また、ダイクロイックミラーや光学フィルタ等を任意に組み合わせて、撮像素子２８に到達する蛍光の波長を限定することができる。
The image pickup device 28 may be any means that can pick up an image of the substrate 6 with the wavelength of the fluorescence emitted from the microbial colony and obtain an image (substrate image), such as a CCD image sensor, a CMOS image sensor, or a SIT image sensor. It can be illustrated. Further, the imaging element may capture an image in a planar shape with an area image sensor, or may obtain an image by scanning with a linear image sensor.
Further, the wavelength of fluorescence reaching the image sensor 28 can be limited by arbitrarily combining a dichroic mirror, an optical filter, or the like.
撮像部２によって撮影される基板６の画像は、複数枚の静止画として撮像してもよいし、動画として撮像してもよい。
また、撮像する基板６をそのまま載置台２２に載置して撮像してもよいし、基板６を容器７に入れて保護された状態で撮像してもよい。基板６を容器７に収容した状態で撮像部２により撮像を行う場合、図３、５に例示するように、通常透光性を備える蓋７２によって蓋がされた状態とし、上方から励起光を照射して撮像するようにすることができる。この場合、蓋７２の内面に結露防止部７５が形成されていることが好ましい。培養温度は室温より高いことが多く、検体が付着する基板６を入れた容器の蓋７２が外気によって冷やされ、蓋７２の内面に接する容器内の水蒸気が結露することにより蓋７２が曇り、撮像が困難になることがあるからである。
結露防止部７５は、蓋７２の透光性を維持しつつ、何らかの手段により蓋７２の内面が結露しないようにするための手段を備えていればよい。例えば、親水性の薬剤や界面活性剤等を蓋の内面に塗布等をすることを挙げることができる。また、透光性樹脂の蓋７２の内面表面に親水性官能基を付与したり、表面形状を変えたりすることによって表面を親水性とする親水性プラスチック加工等を行ってもよい。
また、結露防止部７５の代わりに蓋７２の外部に結露防止具が設けられてもよい。結露防止具は、蓋７２を覆うように設けられる透光性を備えるガラスヒータや、撮像時に各光路の外へ移動可能なヒータ等を挙げることができ、蓋７２の加温を行うことで蓋７２の内面の結露を防止することができる。
更に、蓋７２の結露を防止する方法として、基板６を容器本体７１に固定し、蓋７２が下方に向くように倒立させた状態で、下面に位置する蓋７２から撮像素子２８を用いて撮影する方法を挙げることができる。
The image of the substrate 6 captured by the imaging unit 2 may be captured as a plurality of still images or as a moving image.
Alternatively, the substrate 6 to be imaged may be placed on the mounting table 22 as it is, and the substrate 6 may be placed in the container 7 and protected. When imaging is performed by the imaging unit 2 in a state where the substrate 6 is accommodated in the container 7, as illustrated in FIGS. 3 and 5, the lid 72 is normally covered with a lid 72 having translucency, and excitation light is emitted from above. Imaging can be performed by irradiation. In this case, it is preferable that a dew condensation preventing portion 75 is formed on the inner surface of the lid 72. The culture temperature is often higher than room temperature, the lid 72 of the container containing the substrate 6 to which the specimen is attached is cooled by the outside air, and the water vapor in the container in contact with the inner surface of the lid 72 is condensed, so that the lid 72 becomes cloudy and imaging is performed. This may be difficult.
The dew condensation prevention unit 75 only needs to include means for preventing the inner surface of the lid 72 from condensing by some means while maintaining the translucency of the lid 72. For example, a hydrophilic drug, a surfactant or the like can be applied to the inner surface of the lid. Moreover, hydrophilic plastic processing etc. which make a surface hydrophilic may be performed by giving a hydrophilic functional group to the inner surface of the lid 72 of translucent resin or changing the surface shape.
Further, instead of the dew condensation prevention unit 75, a dew condensation prevention tool may be provided outside the lid 72. Examples of the anti-condensation tool include a translucent glass heater provided so as to cover the lid 72, a heater that can move out of each optical path during imaging, and the like by heating the lid 72. Condensation on the inner surface of 72 can be prevented.
Further, as a method for preventing the condensation of the lid 72, the substrate 6 is fixed to the container body 71, and the image is taken using the imaging element 28 from the lid 72 located on the lower surface with the lid 72 turned upside down. The method of doing can be mentioned.
（輝度補正手段）
輝度補正手段４１は、検体の染色後、所定の周期で撮像部２に基板画像を取得させ、所定周期毎の基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、基板画像の背景の輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する手段である。
また、検査をするために要する時間は微生物の種類の他、撮像部の解像度等の条件にもよるが、例えば、大腸菌を対象とする場合、通常、検体の染色後１〜５０分間程度となる。上記検査時間において、輝度補正手段４１は、所定の周期で撮像部２に基板画像を取得させ、各時点の基板画像について所定の処理を行うように構成される。上記所定の周期は、時間の経過に伴う微生物コロニーからの蛍光の輝度変化を検出可能な間隔であればよく、例えば３０秒〜１０分程度とすることができる。また、周期は必ずしも一定である必要はなく、検体の染色後の経過時間によって変更されてもよい。
(Brightness correction means)
The luminance correction unit 41 causes the imaging unit 2 to acquire a substrate image at a predetermined cycle after the specimen is stained, obtains luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image at a predetermined cycle, and This is means for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance of the background.
The time required for the examination depends on conditions such as the resolution of the imaging unit in addition to the type of microorganism, but for example, when targeting E. coli, it is usually about 1 to 50 minutes after staining the specimen. . In the inspection time, the luminance correction unit 41 is configured to cause the imaging unit 2 to acquire a substrate image at a predetermined cycle and to perform a predetermined process on the substrate image at each time point. The predetermined cycle may be an interval that can detect a change in luminance of fluorescence from a microbial colony over time, and may be, for example, about 30 seconds to 10 minutes. Further, the period is not necessarily constant, and may be changed depending on the elapsed time after staining the specimen.
前記区画とは、基板画像において微生物コロニーを検出するための単位となるブロックであり、そのブロックの大きさは適宜選択されればよい。すなわち、１つの区画は、１つの画素であってもよいし、複数の画素（例えば、２×２、３×３等）からなる領域であってもよい。１つの区画の大きさは、検出しようとする微生物コロニーの大きさより小さいことが好ましい。区画の大きさが検出すべき微生物コロニーの大きさよりも大きいと、区画内に微生物コロニー周辺の背景が含まれて、正確に検出できなくなるからである。
輝度補正手段４１は、基板画像を上記区画毎に分割して、各区画の輝度を取得するようにすることができる。１つの区画が複数の画素からなる場合には、各画素で検出された輝度の平均値等を当該区画の輝度とすることができる。
The section is a block serving as a unit for detecting a microbial colony in the substrate image, and the size of the block may be selected as appropriate. That is, one section may be a single pixel or a region composed of a plurality of pixels (for example, 2 × 2, 3 × 3, etc.). The size of one section is preferably smaller than the size of the microbial colony to be detected. This is because if the size of the compartment is larger than the size of the microbial colony to be detected, the background around the microbial colony is included in the compartment and it cannot be accurately detected.
The brightness correction means 41 can divide the board image into the sections and acquire the brightness of each section. When one section is composed of a plurality of pixels, the average value of the brightness detected at each pixel can be used as the brightness of the section.
輝度補正手段４１は、基板画像の背景の輝度（以下、背景輝度という。）を基準として、各区画の輝度を補正した補正輝度を算出するように構成されている。上記背景輝度は、基板画像において、微生物や、食材の端切れ・ゴミ等の夾雑物が存在しない領域の輝度である。輝度補正手段４１は、基板画像の全体から種々の方法で背景輝度を算出することが可能である。
背景輝度の具体的な算出方法は特に限定されない。通常、微生物や夾雑物等が存する区画数は、基板画像の全体の区画数に比べて僅かである。このため、例えば、同程度の輝度値となる区画数が最も多い区画の輝度を背景輝度とすることができる。具体的には、基板画像の輝度別の画素数を示すヒストグラムを生成し、そのヒストグラム中で最も大きな山となる箇所を背景輝度とすることができる。また、基板画像全体の輝度の平均値を背景輝度とすることもできる。その他、適宜選択した区画の輝度又は複数の区画の輝度の平均値等を背景輝度としてもよい。
The luminance correction unit 41 is configured to calculate a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance of the background of the board image (hereinafter referred to as background luminance). The background luminance is the luminance of a region where no microorganisms, impurities such as cut off foods or dust are present in the substrate image. The brightness correction unit 41 can calculate the background brightness from the entire board image by various methods.
A specific method for calculating the background luminance is not particularly limited. Usually, the number of sections in which microorganisms, contaminants, and the like are present is small compared to the total number of sections in the substrate image. For this reason, for example, the luminance of a partition having the largest number of partitions having the same luminance value can be set as the background luminance. Specifically, it is possible to generate a histogram indicating the number of pixels for each luminance of the substrate image, and use the largest peak in the histogram as the background luminance. Further, the average value of the luminance of the entire board image can be used as the background luminance. In addition, the luminance of the section selected as appropriate or the average value of the luminance of a plurality of sections may be used as the background luminance.
輝度補正手段４１は、上記のように算出した背景輝度を基準として、基板画像全体の区画毎の輝度を補正した補正輝度を算出するように構成される。具体的な補正の方法は特に限定されず、例えば、各区画の輝度から上記背景輝度を差し引いた値を補正輝度とすることができる（図２（ａ）、（ｂ）を参照。）。また、背景輝度に対する各区画の輝度の比率を、補正輝度としてもよい。 The luminance correction unit 41 is configured to calculate a corrected luminance obtained by correcting the luminance for each section of the entire board image with reference to the background luminance calculated as described above. The specific correction method is not particularly limited. For example, a value obtained by subtracting the background luminance from the luminance of each section can be used as the corrected luminance (see FIGS. 2A and 2B). The ratio of the luminance of each section to the background luminance may be corrected luminance.
輝度補正手段４１は、所定の周期で基板画像を取得する毎に、背景輝度及び補正輝度を算出するように構成することができる。取得した基板画像のデータ、背景輝度、及び区画毎の補正輝度は、情報処理部４内に備えられた記憶装置に格納しておくことができる。
また、輝度補正手段４１は、所定の周期で取得した基板画像のデータを記憶装置に格納しておき、検査中の適宜のタイミング又は検査終了後に、蓄積された基板画像のデータに基づいて各時点における背景輝度及び区画毎の補正輝度を算出するように構成することもできる。
The luminance correction means 41 can be configured to calculate the background luminance and the corrected luminance every time a substrate image is acquired at a predetermined period. The acquired board image data, background luminance, and corrected luminance for each section can be stored in a storage device provided in the information processing unit 4.
Further, the brightness correction unit 41 stores the substrate image data acquired at a predetermined cycle in a storage device, and at each time point based on the accumulated substrate image data at an appropriate timing during the inspection or after the inspection is completed. The background brightness and the corrected brightness for each section can be calculated.
（判定手段）
判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超えたこと及び補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた区画に微生物コロニーが存在すると判定する手段である。この判定をするためには、微生物コロニーと夾雑物とを識別する必要がある。
(Judgment means)
The determination unit 46 determines that there is a microbial colony in a section where at least one of the correction luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the correction luminance exceeds a predetermined value as the imaging time elapses. Means. In order to make this determination, it is necessary to distinguish between microbial colonies and contaminants.
基板上の検体には、検出対象となる微生物の他に夾雑物が含まれている場合がある。例えば、図２（ａ）は、基板上に微生物（１、２、３）及び夾雑物が存在した場合の、染色後の経過時間に対する基板画像上の蛍光輝度の変化を表している。本例においては、微生物（１、２、３）が存する区画の蛍光輝度はいずれも、時間経過に伴い一旦増加し、その後減少している。これに対して、夾雑物が存する区画の蛍光輝度は、時間経過に伴い単調増加している。また、背景輝度は、時間経過に伴いより低いレベルで単調増加している。 The sample on the substrate may contain impurities in addition to the microorganisms to be detected. For example, FIG. 2A shows a change in the fluorescence luminance on the substrate image with respect to the elapsed time after staining when microorganisms (1, 2, 3) and impurities are present on the substrate. In this example, the fluorescence brightness of the sections where the microorganisms (1, 2, 3) are present increases with time and then decreases. On the other hand, the fluorescence brightness of the section where the contaminants exist monotonously increases with time. Further, the background luminance monotonously increases at a lower level with the passage of time.
図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した各区画の蛍光輝度から背景輝度を差し引いた補正輝度の変化を示している。微生物（１、２、３）が存する区画の補正輝度はいずれも、時間経過に伴い一旦増加し、その後減少している。これに対して、夾雑物が存する区画の補正輝度は、微生物が存する区画の補正輝度よりも小さく、且つ時間経過によらずほぼ一定の値である。
図２（ｃ）は、図２（ｂ）に示した各区画の補正輝度について、１周期（５分）前の値からの変化率を表している。１又は複数の周期を単位とする補正輝度の変化率を、補正輝度の変化率とする。そうすると、微生物（１、２、３）が存する区画の補正輝度の変化率は相対的に大きな値であり、時間経過に伴い正の値となり、その後負の値となる。これに対して、夾雑物が存する区画の補正輝度の変化率は、微生物が存する区画の補正輝度の変化率よりもはるかに小さく、ほぼゼロとなる。
FIG. 2B shows a change in correction luminance obtained by subtracting the background luminance from the fluorescence luminance in each section shown in FIG. All of the corrected luminances of the sections where the microorganisms (1, 2, 3) exist temporarily increase with time and then decrease. On the other hand, the corrected brightness of the section where the contaminants exist is smaller than the corrected brightness of the section where the microorganisms exist, and is a substantially constant value regardless of the passage of time.
FIG. 2C shows the rate of change from the value before one cycle (5 minutes) with respect to the corrected luminance of each section shown in FIG. The change rate of the corrected luminance in units of one or a plurality of periods is set as the change rate of the corrected luminance. If it does so, the change rate of the correction | amendment brightness | luminance of the area | region where microorganisms (1, 2, 3) exist is a comparatively big value, and becomes a positive value with time progress, and becomes a negative value after that. On the other hand, the change rate of the corrected luminance in the section where the contaminants exist is much smaller than the change rate of the corrected brightness in the section where the microorganisms exist, and is almost zero.
以上のような微生物（１、２、３）の蛍光輝度、夾雑物の蛍光輝度、及び背景輝度の変化から、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度の変化量が所定値（図２（ｂ）に示すＳ０）を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
また、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度の変化率が所定値（図２（ｃ）に示すＳ１）を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
更に、判定手段４６は、撮像時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超え、且つ補正輝度の変化率が所定値を超えた場合には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。
また、判定手段４６は、補正輝度の変化率が正の値となり、その後、負の値となった場合は、その区画に微生物コロニーが存在すると判定するようにすることもできる。
From the change in the fluorescence brightness of the microorganisms (1, 2, 3), the fluorescence brightness of the contaminants, and the background brightness as described above, the determination unit 46 determines that the change amount of the correction brightness is a predetermined value (see FIG. When S 0 ) shown in 2 (b) is exceeded, it can be determined that a microbial colony is present in the section.
In addition, when the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value (S 1 shown in FIG. 2C) with the passage of the imaging time, the determination unit 46 determines that a microbial colony exists in the section. Can do.
Furthermore, when the correction luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the correction luminance exceeds a predetermined value as the imaging time elapses, the determination unit 46 can determine that a microbial colony exists in the section. .
Moreover, the determination means 46 can also determine that a microbial colony exists in the division, when the change rate of correction | amendment luminance becomes a positive value and becomes a negative value after that.
微生物の種類や染色条件によっては、蛍光輝度の変化が図２に示したような変化とは異なる場合もあるが（後述）、上記の判定方法を適宜選択することによって、微生物コロニーを検出することが可能となる。
なお、図２に示したように、微生物コロニーの蛍光輝度が一旦増加した後に減少するのは、蛍光染色剤の微生物による消費等が生じるためである。このように、微生物コロニーの蛍光の輝度がある時間まで増加した後に減少し、夾雑物及び背景の輝度に近い輝度となる場合も、微生物コロニーと夾雑物及び基板とを明確に区別することが可能である。
Depending on the type of microorganism and the staining conditions, the change in fluorescence brightness may differ from the change shown in FIG. 2 (described later), but by selecting the above determination method as appropriate, a microbial colony can be detected. Is possible.
As shown in FIG. 2, the fluorescence intensity of the microbial colony once increases and then decreases because the fluorescent stain is consumed by the microorganism. In this way, even when the brightness of the fluorescence of the microbial colony increases after a certain period of time and decreases to a brightness close to the brightness of the contaminants and the background, it is possible to clearly distinguish the microbial colonies from the contaminants and the substrate. It is.
（計数手段）
微生物検出装置１には、微生物コロニーの計数手段４７を備えることができる。上記のとおり、輝度補正手段４１及び判定手段４６により、基板画像から微生物コロニーの存在する区画を検出することができる。計数手段４７は、その微生物コロニーの数や大きさを算出する手段である。
１つの微生物コロニーを判断する具体的な方法は特に問わず、微生物コロニーであると判定された区画が隣接して存在する場合には、合わせて１つの微生物コロニーと判断することができる。例えば、微生物コロニーであると判定された複数の区画が隣接しており、それぞれの補正輝度の大きさや変化率の値が一定の範囲である場合には、それらの区画をまとめて１つの微生物コロニーと判断することができる。そして、計数手段４７は、基板画像上の微生物コロニーの数を算定することができる。また、計数手段４７は、１つの微生物コロニーを構成する区画数又は画素数から、その微生物コロニーの大きさ（面積）を算定することができる。
(Counting means)
The microorganism detection apparatus 1 can include a microorganism colony counting means 47. As described above, the brightness correction unit 41 and the determination unit 46 can detect a section where microbial colonies exist from the substrate image. The counting means 47 is a means for calculating the number and size of the microbial colonies.
The specific method for determining one microbial colony is not particularly limited, and when there are adjacent sections determined to be microbial colonies, they can be determined as one microbial colony. For example, when a plurality of sections determined to be microbial colonies are adjacent to each other and the values of the corrected luminance and the rate of change are within a certain range, the sections are grouped into one microbial colony. It can be judged. Then, the counting means 47 can calculate the number of microbial colonies on the substrate image. The counting means 47 can calculate the size (area) of the microbial colony from the number of sections or the number of pixels constituting one microbial colony.
以上の輝度補正手段４１、判定手段４６、計数手段４７は、ハードウェア、ソフトウェアのいずれによって実現されてもよい。通常は、撮像部２とのインターフェースを備えたコンピュータ上で動作するプログラムによって実現することができる。 The brightness correction means 41, the determination means 46, and the counting means 47 described above may be realized by any of hardware and software. Usually, it can be realized by a program operating on a computer having an interface with the imaging unit 2.
２．微生物検出プログラム
微生物のコロニーを検出する微生物検出プログラムは、前記撮像部２を用いて基板画像を取得する撮像機能と、前記輝度補正手段４１をコンピュータ上に実現させる輝度補正機能と、前記判定手段４６をコンピュータ上に実現させる判定機能と、を備える。また、前記計数手段４７をコンピュータ上に実現させる計数機能を備えることができる。
図６に示すように、撮像機能は、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得させる（Ｓ１１）。
輝度補正機能は、前記検体の染色後所定の周期で前記撮像機能により前記基板画像を取得させ、所定周期毎の基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、基板画像の背景の輝度を算出し（Ｓ１２）、その背景の輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する（Ｓ１３）。
判定機能は、時間経過に伴い、補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた区画に微生物コロニーが存在すると判定する（Ｓ１４）。
計数機能は、検出した微生物コロニーの数や大きさを算出する（Ｓ１５）。
2. Microorganism detection program A microorganism detection program for detecting a colony of microorganisms includes an imaging function for acquiring a substrate image using the imaging unit 2, a luminance correction function for realizing the luminance correction unit 41 on a computer, and the determination unit 46. And a determination function for realizing the above on a computer. Further, it is possible to provide a counting function for realizing the counting means 47 on a computer.
As shown in FIG. 6, the imaging function irradiates excitation light onto a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, images the substrate, and acquires a substrate image (S11).
The luminance correction function acquires the substrate image by the imaging function at a predetermined period after staining the specimen, obtains luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image at a predetermined period, The luminance of the background is calculated (S12), and the corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with the luminance of the background as a reference is calculated (S13).
The determination function determines that a microbial colony exists in a section in which at least one of the corrected luminance exceeds a predetermined value and the change rate of the corrected luminance exceeds a predetermined value as time passes ( S14).
The counting function calculates the number and size of the detected microbial colonies (S15).
また、前記図２に示したような蛍光輝度が一旦増加した後に減少する輝度変化を生じる検体について適用することができる、微生物検出プログラムの処理の流れを図７に例示する。
撮像ステップＳ２１、背景輝度算出ステップＳ２２、補正輝度算出ステップＳ２３、計数ステップＳ２７は、それぞれ図６に示したステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１５と同じであるため、説明を省略する。
FIG. 7 illustrates a processing flow of the microorganism detection program that can be applied to a specimen that causes a luminance change that decreases after the fluorescence luminance once increases as shown in FIG.
The imaging step S21, background luminance calculation step S22, corrected luminance calculation step S23, and counting step S27 are the same as steps S11, S12, S13, and S15 shown in FIG.
[a]第１判定ステップ
第１判定ステップＳ２４として、各区画の補正輝度と、その１周期前の基板画像の同じ区画の補正輝度の差を算出し、その差が所定値以上大きい場合は、微生物コロニーが存在する可能性がある推定区画Ａとして検出する。
[b]第２判定ステップ
第２判定ステップＳ２５では、各区画の補正輝度から、その１周期前の基板画像の同じ区画の補正輝度を差し引き、その差が負であって絶対値が所定値を超える場合は、微生物コロニーが存在する可能性がある推定区画Ｂとして検出する。
[c]第３判定ステップ
第３判定ステップＳ２６では、推定区画Ａとして検出され、その後に推定区画Ｂとして検出された区画を、微生物コロニーが存在する区画Ｃと判定する。即ち、基板画像上の同じ位置であって、過去に推定区画Ａとして検出され、その後に推定区画Ｂとして検出されたが区画を、微生物コロニーがある区画Ｃと判定する。
[a] First Determination Step As a first determination step S24, a difference between the corrected luminance of each section and the corrected luminance of the same section of the board image one cycle before is calculated, and when the difference is larger than a predetermined value, It is detected as an estimated section A in which a microbial colony may be present.
[b] Second Determination Step In the second determination step S25, the correction brightness of the same section of the board image one cycle before is subtracted from the correction brightness of each section, the difference is negative, and the absolute value is a predetermined value. When it exceeds, it is detected as an estimated section B in which a microbial colony may be present.
[c] Third Determination Step In the third determination step S26, the section detected as the estimated section A and then detected as the estimated section B is determined as the section C in which the microbial colony exists. That is, it is the same position on the board image, and is detected as the estimated section A in the past and then detected as the estimated section B, but the section is determined to be the section C having the microbial colony.
３．微生物検出方法
以下、実施例に基づいて微生物検出方法を具体的に説明する。
本微生物検出方法は、図１に示したような前記微生物検出装置１を用いて微生物のコロニーを検出する。
撮像部２は、筐体２１内に設けられており、基板６の載置台２２と、載置台２２の上方に配置される落射照明部２４と、落射照明部２４の上方に配置される撮像素子２８と、落射照明部２４の側方に配置される光源２３を備える。筐体２１内は加熱手段等によって、一定の温度に保たれている。
落射照明部２４は光学フィルタ２６、及びダイクロイックミラー２５により、側方から入射する光源２３からの励起光を下方の載置台２２側に反射させる。また、載置台２２から発せされる蛍光を、光学フィルタ２７を介して上方の撮像素子２８に透過させる。更に、側方からの入射光は光学フィルタ２６、及びダイクロイックミラー２５により励起光として必要な波長に制限され、下方からの入射光は、ダイクロイックミラー２５及び光学フィルタ２７により蛍光付近の波長に制限される。撮像素子２８は、ＣＣＤイメージセンサを用いたカメラを用いる。
情報処理部４は、パーソナルコンピュータ等のコンピュータ装置であり、前記微生物検出プログラムを実行することができる。
基板６は、蓋付き容器７内に収容された状態で載置台２２に載置される。蓋付き容器７は樹脂製であり、図３〜５に示すように、容器本体７１と、容器本体７１に被せる蓋部７２とを備える。また、蓋部７２の天面は励起光及び蛍光に対して透光性を備え、内面側（容器本体７１と対向する面）には、界面活性剤の塗布や親水性プラスチック加工等により形成された結露防止部７５を備える。
3. Microorganism detection method Hereinafter, a microorganism detection method will be described in detail based on examples.
In this microorganism detection method, a microorganism colony is detected using the microorganism detection apparatus 1 as shown in FIG.
The imaging unit 2 is provided in the housing 21, and includes a mounting table 22 for the substrate 6, an epi-illumination unit 24 disposed above the mounting unit 22, and an imaging element disposed above the epi-illumination unit 24. 28 and a light source 23 disposed on the side of the epi-illumination unit 24. The inside of the housing 21 is kept at a constant temperature by a heating means or the like.
The epi-illumination unit 24 reflects the excitation light from the light source 23 incident from the side to the lower mounting table 22 side by the optical filter 26 and the dichroic mirror 25. Further, the fluorescence emitted from the mounting table 22 is transmitted through the optical filter 27 to the upper image sensor 28. Further, incident light from the side is limited to a wavelength required as excitation light by the optical filter 26 and the dichroic mirror 25, and incident light from below is limited to a wavelength near the fluorescence by the dichroic mirror 25 and the optical filter 27. The As the image sensor 28, a camera using a CCD image sensor is used.
The information processing unit 4 is a computer device such as a personal computer, and can execute the microorganism detection program.
The substrate 6 is placed on the placement table 22 while being accommodated in the lidded container 7. The container 7 with a lid is made of resin, and includes a container body 71 and a lid portion 72 that covers the container body 71 as shown in FIGS. In addition, the top surface of the lid 72 is translucent to excitation light and fluorescence, and is formed on the inner surface side (surface facing the container body 71) by application of a surfactant, hydrophilic plastic processing, or the like. The dew condensation prevention part 75 is provided.
先ず、検出対象を溶解させた精製水である検体を、基板６であるメンブレンフィルタによって濾過する。濾過によって検体に微生物が含まれていれば基板６に付着する。次いで、この基板６をプレート上の寒天平板培地に載置し、３７℃に保った恒温槽内で培養を行う。この培養時間は、大腸菌であれば３〜６時間である。
培養時間を経過したとき、基板上に大腸菌が付着していれば、図１１に示すように大腸菌の数が１つの状態から１００〜１００００、幅１０〜２０μｍのコロニーになる。
上記培養時間が経過した基板６を、蛍光染色剤の溶液を入れた容器本体７１内に収納し、浸漬させることで染色させる。その後、蓋部７２により蓋をして、載置台２２に載置する。
First, a specimen that is purified water in which a detection target is dissolved is filtered by a membrane filter that is a substrate 6. If microorganisms are contained in the specimen by filtration, they adhere to the substrate 6. Next, the substrate 6 is placed on an agar plate medium on a plate and cultured in a thermostatic chamber maintained at 37 ° C. This culture time is 3 to 6 hours for Escherichia coli.
If E. coli adheres to the substrate after the culturing time has elapsed, the number of E. coli becomes 100 to 10,000 and a colony having a width of 10 to 20 μm from one state as shown in FIG.
The substrate 6 on which the culture time has elapsed is housed in a container body 71 containing a fluorescent dye solution, and dyed by being immersed. Thereafter, the lid 72 is put on the lid and placed on the mounting table 22.
上記のように、検体を染色した後、以下の撮像工程、輝度補正工程、判定工程、計数工程を実施する。
（撮像工程）
撮像工程では、蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板６に対して、励起光を照射し、基板６を撮像素子２８によって撮影して基板画像を取得する。励起光の波長は撮像素子２８に入射する蛍光の波長より短く、一般的に３７０〜６５０μｍであり、光源２３の光を落射照明部２４を介して蓋付き容器７の上方から照射する。
As described above, after the specimen is stained, the following imaging process, luminance correction process, determination process, and counting process are performed.
(Imaging process)
In the imaging step, excitation light is applied to the substrate 6 on which the specimen stained with the fluorescent stain is attached, and the substrate 6 is imaged by the imaging element 28 to obtain a substrate image. The wavelength of the excitation light is shorter than the wavelength of the fluorescence incident on the image sensor 28 and is generally 370 to 650 μm. The light from the light source 23 is irradiated from above the lidded container 7 through the epi-illumination unit 24.
（輝度補正工程）
輝度補正工程は、前記撮像工程により基板画像を取得させる（画像取得ステップ）。画像取得ステップによる基板画像の取得は、前記検体の染色後５分周期で３０分間にわたり繰り返して行い、複数の基板画像を得る。撮影された基板画像の一例を、図１２に示す。
なお、一連の撮像が完了した後は、蓋付き容器７から基板６を取り出して、再度プレートに載置して培養器に戻し、培養の継続を行うことができる。
輝度補正工程では、５分毎に取得される前記基板画像において、１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求める。例えば、基板画像を格子状に分割し、各格子で囲まれた正方形のブロックを１つの区画とし、その区画に含まれる複数画素の平均輝度を、その区画の輝度とする。そして、各基板画像の背景輝度を算出する（背景輝度算出ステップ）。次に、算出された背景輝度を基準として各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する（補正輝度算出ステップ）。
(Brightness correction process)
In the luminance correction step, a substrate image is acquired by the imaging step (image acquisition step). The acquisition of the substrate image by the image acquisition step is repeated for 30 minutes at a cycle of 5 minutes after the staining of the specimen to obtain a plurality of substrate images. An example of the photographed board image is shown in FIG.
In addition, after a series of imaging is completed, the board | substrate 6 can be taken out from the container 7 with a lid | cover, can be mounted on a plate again, can be returned to an incubator, and culture | cultivation can be continued.
In the luminance correction step, the luminance for each section composed of one or a plurality of pixels is obtained in the substrate image acquired every five minutes. For example, the substrate image is divided into a grid, and a square block surrounded by each grid is defined as one section, and the average luminance of a plurality of pixels included in the section is defined as the brightness of the section. Then, the background luminance of each board image is calculated (background luminance calculation step). Next, a corrected luminance is calculated by correcting the luminance of each section with the calculated background luminance as a reference (corrected luminance calculating step).
上記背景輝度算出ステップでは、撮像された基板画像の輝度別の画素（区画）数を示すヒストグラムを生成し、そのヒストグラム中で最も大きな山となる箇所を背景輝度として算出する。また、各基板画像について背景輝度を算出する。
次に、上記補正輝度算出ステップでは、各基板画像の区画毎の輝度を背景輝度により補正した補正輝度を求める。各区画の補正輝度は、それぞれの区画の輝度から背景輝度を差し引いた値とする。
In the background luminance calculation step, a histogram indicating the number of pixels (divisions) by luminance of the picked-up board image is generated, and a portion having the largest peak in the histogram is calculated as the background luminance. Further, the background luminance is calculated for each board image.
Next, in the corrected luminance calculation step, a corrected luminance obtained by correcting the luminance for each section of each board image with the background luminance is obtained. The corrected brightness of each section is a value obtained by subtracting the background brightness from the brightness of each section.
（判定工程）
次いで、判定工程として、各基板画像の各区画に微生物コロニーが存在するか否かの判定を行う。前記のとおり、補正輝度が所定値を超えた場合、補正輝度の変化率が所定値を超えた場合、補正輝度の変化率が正の値から負の値に変化した場合等には、その区画に微生物コロニーが存在すると判定することができる。検出対象の微生物の種類等に応じてこれらの判定条件を選択し又は組み合わせて、微生物コロニーが存在するか否かを判定するようにすることができる。また、微生物コロニーが存在すると判定された複数の区画が隣接している場合は、１つの微生物コロニーとして取り扱うことができる。
以上により、微生物コロニーの大きさが、夾雑物の大きさと差がない場合であっても明確に区別することができる。また、微生物コロニーの区画の蛍光輝度が、夾雑物や基板の背景の蛍光輝度と大きく差がない場合であっても、微生物コロニーを明確に区別することができる。
(Judgment process)
Next, as a determination step, it is determined whether there is a microbial colony in each section of each substrate image. As described above, when the correction luminance exceeds a predetermined value, when the change rate of the correction luminance exceeds a predetermined value, or when the change rate of the correction luminance changes from a positive value to a negative value, the section It can be determined that there is a microbial colony. These determination conditions can be selected or combined according to the type of microorganism to be detected, etc., to determine whether a microbial colony exists. Moreover, when the some division determined that the microbial colony exists is adjacent, it can handle as one microbial colony.
As described above, even when the size of the microbial colony is not different from the size of the contaminant, it can be clearly distinguished. Further, even when the fluorescence intensity of the microbial colony section is not significantly different from the fluorescence intensity of the contaminants or the background of the substrate, the microbial colony can be clearly distinguished.
（計数工程）
その後、各基板画像上の微生物コロニーの数を計数する計数工程を行うことができる。微生物コロニーの数は、各基板画像において微生物コロニーが検出された区画の数とすることができる。微生物コロニーが存在すると判定された複数の区画が隣接している場合は、１つの微生物コロニーとして取り扱うことができる。また、１つの微生物コロニーを構成する区画数から、その微生物コロニーの大きさ（面積）を求めることができる。
(Counting process)
Thereafter, a counting step of counting the number of microbial colonies on each substrate image can be performed. The number of microbial colonies may be the number of sections in which microbial colonies are detected in each substrate image. When a plurality of sections determined to have microbial colonies are adjacent to each other, they can be handled as one microbial colony. Further, the size (area) of the microbial colony can be obtained from the number of sections constituting one microbial colony.
本微生物検出方法によれば、蛍光染色剤の添加及び励起光の照射だけで微生物コロニーを検出するため、基板６上の微生物が死滅し難く、本微生物検出方法の実施後に基板６の培養を継続することができる。培養を継続することによって、図１３に示すように目視可能な大きさまで微生物コロニーを成長させることができ、目視により微生物コロニーを計数することもできる。このため、微生物の検出をするために、培地を複数用意する必要がない。 According to the present microorganism detection method, microorganism colonies are detected only by adding a fluorescent stain and irradiation with excitation light. Therefore, microorganisms on the substrate 6 are hard to be killed, and the culture of the substrate 6 is continued after the execution of the present microorganism detection method. can do. By continuing the culture, microbial colonies can be grown to a size that can be visually observed as shown in FIG. 13, and the microbial colonies can be counted visually. For this reason, it is not necessary to prepare a plurality of culture media in order to detect microorganisms.
本微生物検出方法により基板画像上の輝度の変化を計測した例を、図２及び図８〜９に示す。ただし、各グラフに示す微生物、夾雑物、背景輝度を求めた各区画の位置は、本微生物検出方法による全ての撮像が終わった時点の基板を、図１１に示すように蛍光顕微鏡によって観察して確認した区画（図１２の輝点を参照）に従った。
図２及び図８〜９において、(a)は、撮像素子２８で得られた基板画像の各区画の蛍光輝度の変化を示している。また、(b)は、背景輝度により各区画の輝度を補正した補正輝度の変化を示している。更に、(c)は、補正輝度の変化率を示している。
The example which measured the change of the brightness | luminance on a board | substrate image with this microbe detection method is shown in FIG.2 and FIGS.8-9. However, the position of each section for which the microorganisms, contaminants, and background luminance shown in each graph were obtained was determined by observing the substrate at the time when all the imaging by the microorganism detection method was completed with a fluorescence microscope as shown in FIG. The confirmed section (see the bright spot in FIG. 12) was followed.
2 and 8 to 9, (a) shows a change in fluorescence luminance of each section of the substrate image obtained by the image sensor 28. Further, (b) shows a change in the corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section by the background luminance. Further, (c) shows the change rate of the corrected luminance.
図８（及び前記の図２）は、４時間培養後、蛍光染色剤としてＦＤＡ（フルオレセインジアセテート）を用いて染色させた基板６の輝度の変化を示すグラフである。ここで、各微生物（４、５）は、図１１及び１２に示したように、本微生物検出方法による計測完了後、蛍光顕微鏡で観察して位置を特定した微生物コロニーである。また、各夾雑物１、２は、大きさが約１００μｍのキャベツ片を検体中に含め、基板６による濾過を行うことで基板６に付着させた。 FIG. 8 (and FIG. 2 described above) is a graph showing changes in luminance of the substrate 6 stained with FDA (fluorescein diacetate) as a fluorescent stain after culturing for 4 hours. Here, as shown in FIGS. 11 and 12, each microorganism (4, 5) is a microorganism colony whose position is specified by observation with a fluorescence microscope after completion of measurement by this microorganism detection method. Moreover, each contaminant 1 and 2 was made to adhere to the board | substrate 6 by including the cabbage piece about 100 micrometers in size in a test substance, and filtering with the board | substrate 6. FIG.
図８において、（ａ）を見れば、補正前の輝度の大きさからは、検体中の微生物４、５と、各夾雑物と、基板の背景とを区別することが困難である。しかし、同図（ｂ）に示される補正輝度の変化を見ると、微生物４、５は、計測開始から約５分間において、夾雑物１、２に比べて、補正輝度が大きく上昇し、補正輝度の変化率も大きい。これに対して、夾雑物１、２の補正輝度は大きく変化していない。また、同図（ｃ）を見ても、計測開始から約５分間において、微生物４、５の補正輝度変化率は、夾雑物１、２と比較して際立っている。
したがって、図８に示すような検体については、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
In FIG. 8, it is difficult to distinguish between the microorganisms 4 and 5 in the specimen, each contaminant, and the background of the substrate from the magnitude of the luminance before correction. However, when the change in the corrected luminance shown in FIG. 5B is observed, the corrected luminance of the microorganisms 4 and 5 increases significantly compared to the contaminants 1 and 2 in about 5 minutes from the start of measurement. The rate of change is large. On the other hand, the correction brightness of the contaminants 1 and 2 does not change greatly. In addition, as can be seen from FIG. 5C, the corrected luminance change rate of the microorganisms 4 and 5 is conspicuous compared to the contaminants 1 and 2 in about 5 minutes from the start of measurement.
Therefore, for the specimen as shown in FIG. 8, microbial colonies can be detected from the change in the corrected luminance calculated based on the substrate image in a short time after staining.
図９及び１０は、基板６としてメンブレンフィルタではなく寒天平板を用いて、５時間培養後、蛍光染色剤としてテトラゾリウム塩類であるＣＴＣを用いて寒天平板上に生育した微生物コロニーを直接染色した際の基板画像の輝度の変化を示すグラフである。基板には、夾雑物として、大きさが約２０μｍのキャベツ片が付着している。
図９（ａ）を見れば、補正前の輝度の大きさからは、検体中の微生物６〜８と、夾雑物と、基板の背景とを区別することが困難である。しかし、同図（ｂ）に示される補正輝度の変化を見ると、微生物６〜８は、計測開始から約１０分間において、夾雑物に比べて、補正輝度が大きく上昇している。これに対して、夾雑物の補正輝度は大きく変化していない。また、同図（ｃ）を見ても、計測開始から約１０分間において、微生物６〜８の補正輝度変化率は、夾雑物と比較して際立っている。
したがって、図９に示すような検体についても、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
FIGS. 9 and 10 show a case where microbial colonies grown on an agar plate were directly stained using CTC which is a tetrazolium salt as a fluorescent staining agent after 5 hours of culture using an agar plate instead of a membrane filter as the substrate 6. It is a graph which shows the change of the brightness | luminance of a board | substrate image. A cabbage piece having a size of about 20 μm is adhered to the substrate as a contaminant.
Referring to FIG. 9A, it is difficult to distinguish the microorganisms 6 to 8 in the specimen, the contaminants, and the background of the substrate from the brightness before correction. However, looking at the change in the corrected luminance shown in FIG. 5B, the corrected luminance of the microorganisms 6 to 8 is greatly increased compared to the impurities in about 10 minutes from the start of measurement. On the other hand, the correction brightness of the contaminants does not change greatly. Moreover, even if it sees the same figure (c), in about 10 minutes from the measurement start, the correction | amendment luminance change rate of the microorganisms 6-8 is conspicuous compared with a foreign material.
Therefore, even for a specimen as shown in FIG. 9, it is possible to detect a microbial colony from a change in corrected luminance calculated based on a substrate image in a short time after staining.
また、図１０に示す例においても、微生物９〜１１は、計測開始から５分程度の間に補正輝度が大きく増加している（同図（ｂ）、（ｃ））。これに対して、夾雑物の補正輝度は大きく変化していない。
したがって、図１０に示すような検体についても、染色後の短時間における基板画像に基づいて算出される補正輝度の変化から、微生物コロニーの検出が可能である。
Also in the example shown in FIG. 10, the corrected luminance of the microorganisms 9 to 11 greatly increases within about 5 minutes from the start of measurement ((b) and (c) in the figure). On the other hand, the correction brightness of the contaminants does not change greatly.
Therefore, even for a specimen as shown in FIG. 10, it is possible to detect a microbial colony from a change in corrected luminance calculated based on a substrate image in a short time after staining.
本発明は以上で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。 The present invention is not limited to the embodiments described in detail above, and various modifications or changes can be made within the scope of the claims of the present invention.
１；微生物検出装置、
２；撮像部、２１；筐体、２２；載置台、２３；光源、２４；落射照明部、２５；ダイクロイックミラー、２６、２７；光学フィルタ、２８；撮像素子、
４；情報処理部、４１；輝度補正手段、４６；判定手段、４７；計数手段、
６；基板（メンブレンフィルタ）、
７；蓋付き容器、７１；容器本体、７２；蓋部、７５；結露防止部。
1; microorganism detection device,
2; Imaging unit, 21; Housing, 22; Mounting table, 23; Light source, 24; Epi-illumination unit, 25; Dichroic mirror, 26, 27; Optical filter, 28;
4; Information processing unit, 41; Luminance correction means, 46; Determination means, 47; Counting means,
6; substrate (membrane filter),
7; Container with lid, 71; Container body, 72; Lid, 75; Condensation prevention unit.
Claims (14)
蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像部と、
前記検体の染色後所定の周期で前記撮像部に前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正手段と、
時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定手段と、
を備えることを特徴とする微生物検出装置。 A microorganism detecting device for detecting a colony of microorganisms,
An imaging unit that irradiates excitation light to a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, images the substrate, and acquires a substrate image;
The imaging unit acquires the substrate image at a predetermined cycle after staining the specimen, obtains luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined cycle, and the background of the substrate image Brightness correction means for calculating a corrected brightness obtained by correcting the brightness of each section with reference to the brightness;
Determining means for determining that a microbial colony is present in the section where at least one of the correction luminance exceeds a predetermined value and the rate of change of the correction luminance exceeds a predetermined value as time passes; ,
A microorganism detection apparatus comprising:
前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物検出装置。 The imaging unit acquires the substrate image in a state where the substrate is accommodated in a lidded container,
The microorganism detection apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the lid of the container with lid has translucency, and has a dew condensation prevention part formed on its inner surface or a dew condensation prevention tool provided on the outside. .
蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得させる撮像機能と、
前記検体の染色後所定の周期で前記撮像機能により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正機能と、
時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定機能と、
を備えることを特徴とする微生物検出プログラム。 A microorganism detection program for detecting a colony of microorganisms,
An imaging function that irradiates excitation light to a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, images the substrate, and acquires a substrate image;
The substrate image is acquired by the imaging function at a predetermined period after the specimen is stained, the luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined period is obtained, and the background of the substrate image A luminance correction function for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance;
A determination function for determining that a microbial colony is present in the section where at least one of the correction luminance exceeds a predetermined value and the rate of change of the correction luminance exceeds a predetermined value as time passes. ,
A microorganism detection program comprising:
蛍光染色剤により染色された検体を付着させた基板に対して励起光を照射し、前記基板を撮像して基板画像を取得する撮像工程と、
前記検体の染色後所定の周期で前記撮像工程により前記基板画像を取得させ、前記所定周期毎の前記基板画像上の１又は複数の画素からなる区画毎の輝度を求め、前記基板画像の背景の輝度を基準として前記各区画の輝度を補正した補正輝度を算出する輝度補正工程と、
時間経過に伴い、前記補正輝度が所定値を超えたこと及び前記補正輝度の変化率が所定値を超えたことのうちの少なくとも１つが生じた前記区画に微生物コロニーが存在すると判定する判定工程と、
を備えることを特徴とする微生物検出方法。 A microorganism detection method for detecting a colony of microorganisms,
An imaging step of irradiating excitation light to a substrate on which a specimen stained with a fluorescent stain is attached, imaging the substrate, and acquiring a substrate image;
The substrate image is acquired by the imaging step at a predetermined cycle after staining of the specimen, the luminance for each section composed of one or a plurality of pixels on the substrate image for each predetermined cycle is obtained, and the background of the substrate image A luminance correction step for calculating a corrected luminance obtained by correcting the luminance of each section with reference to the luminance;
A determination step of determining that a microbial colony is present in the section where at least one of the correction luminance exceeds a predetermined value and the rate of change of the correction luminance exceeds a predetermined value as time passes; ,
A microorganism detection method comprising:
前記蓋付き容器の蓋は透光性を備え、且つその内面に結露防止部が形成されている又は外部に結露防止具が設けられている請求項１０乃至１３のいずれかに記載の微生物検出方法。 The imaging step acquires the substrate image in a state where the substrate is accommodated in a lidded container,
The microorganism detecting method according to any one of claims 10 to 13, wherein the lid of the container with lid is translucent and has a condensation prevention part formed on the inner surface thereof or a condensation prevention tool provided outside. .
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