JP2016141665A - アフラトキシン鋳型、分子インプリントポリマー、ならびにその作製法および使用法 - Google Patents

Abstract

【課題】アフラトキシン鋳型および分子インプリントポリマー（MIP）、特に、再使用可能で、環境に優しいMIP、その産生法、およびその利用法。
【解決手段】式（I）で表されるアフラトキシン及び該鋳型を含むMIP。

（R1はH、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル又はハロ置換C1-6アルキル；R2はハロ、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、ハロ置換C1-6アルキル、CH2C(O)OR'又はCH(C(O)OR')2；R'はH、C1-6アルキル又は置換C1-6アルキル；R3はH、C1-6アルコキシ又は置換C1-6アルキル）
【選択図】なし

Description

本開示は概してアフラトキシン鋳型および分子インプリントポリマー（MIP）に関する。特に本開示は、再使用可能で、環境に優しいMIP、その産生法、およびその利用法（例えば、アフラトキシンを捕捉および/または吸着するため）に関する。本開示の組成物および方法は、食事、治療、予防、食料・飲料の加工および製造、ならびに研究および品質管理適用を含む、様々な適用において使用される。

マイコトキシンは様々な真菌によって分泌される二次代謝物で、収穫前、収穫中および収穫後の穀物ならびに飼料においてしばしば産生される。飼料および穀物は自然に真菌胞子と接触する。植物の真菌汚染および毒素の生合成は、収穫前の植物の健康状態、気象条件、収穫技術、遅延ならびに保存および飼料加工のための安定化前の水熱条件に依存する。各真菌に応じて、真菌の成長は自由水の量（a_w）、温度、酸素の存在、基質の性質、およびpH条件を含むいくつかの物理化学的パラメーターによって制御される。マイコトキシンは収穫前ならびに貯蔵中の収穫後に増殖する。

いくつかの真菌は水分、水の利用可能性、温度または酸素の特定のレベルでのみ毒素を産生する。マイコトキシンの作用はその深刻さが大きく異なる。致死的なマイコトキシンもあれば、確認可能な疾患または健康問題を引き起こすものもあり、そのマイコトキシンに特異的な症状を生じることなく免疫系を弱めるものもあり、アレルゲンまたは刺激原として作用するものもあり、動物またはヒトに対して公知の作用はないものもある。最近の国連食糧農業機構（FAO）の報告によれば、世界の穀物供給のおよそ25％はマイコトキシンで汚染されている。マイコトキシン汚染は食料および飼料生産者、特に穀物および動物生産者に対して経済的悪影響を有する。

マイコトキシンは植物製品（例えば、飼料、穀物、植物タンパク質、加工穀物副産物、粗飼料および糖蜜製品）の真菌感染の結果として食物連鎖中に出現し得、ヒトによって直接摂食されるか、または汚染穀物、家畜もしくは他の動物の飼料材料によって導入されるかのいずれかでありうる。マイコトキシンは消化中の分解に対して抵抗性が高く、したがって食用製品（例えば、肉、魚、卵および乳製品）における食物連鎖中、または摂食した親毒素の代謝物の形で残存する。料理および凍結などの温度処理は、マイコトキシンの出現率を低下させる十分な方法ではない。したがって、飼料および/または食物連鎖における有害作用を低減し、および/またはマイコトキシンの発生を排除するための組成物および/または方法が必要とされている。

アフラトキシンはマイコトキシンファミリーのメンバーである。これらの毒素は、様々な飼料および食品材料を汚染し、最終的に乳、卵または場合によっては肉などの動物の副産物中にその天然の形で転移しうるか、または代謝物を有する、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）またはA.パラジチカス（A. parasiticus）などのアスペルギルス（Aspergillus）属菌のカビによって産生される。アフラトキシンはその高い毒性および発癌性ゆえに重大な健康リスクを示し、規制レベルにより動物飼料およびヒト食料におけるその許容される濃度が厳密に守られている。

診断および緩和の両方の目的のために、材料からのアフラトキシンおよび代謝物の単離が必要とされている。本明細書に記載の分子インプリントポリマー（MIP）は、アフラトキシンの分子認識を示す材料である。MIPはアフラトキシン鋳型（例えば、アフラトキシンの模倣物）存在下で合成されるが、この鋳型はインプリントを作製するために使用され、次いで重合工程の完了後にポリマーから除去されて、ポリマー中に鋳型と同じ立体化学、官能性、および形態の空洞を残す。MIPがアフラトキシンと遭遇すると、アフラトキシンは空洞に結合する。

本開示は概して、アフラトキシン鋳型および分子インプリントポリマー（MIP）に関する。特に本開示は、再使用可能で、環境に優しいMIP、その産生法、その利用法（例えば、アフラトキシンを捕捉および/または吸着するため）、および異なる様式での使用の適用法（例えば、トレーサビリティのためにアフラトキシンの存在を検出するため、および汚染源からアフラトキシンを除去するため）に関する。本開示の組成物および方法は、食事、治療、予防、食料・飲料の加工および製造、液体ろ過ならびに研究および品質管理適用を含む、様々な適用において使用される。

ある態様において、アフラトキシン鋳型、モノマー、架橋剤、および/またはMIPは、低毒性または無毒性、および高い吸水、ならびにアフラトキシンの保持などの、望ましい安全性および/または環境特性を有する。好ましい態様において、MIPは再使用可能で、経済的に実現可能/生産可能でありうる。

本開示の1つの局面において、アフラトキシン鋳型を提供する。特定の態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式（I）を有する：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。ある態様において、R'はハロ、ヒドロキシおよびアルコキシからなる群より選択される置換基をさらに含む。具体的態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式を有する単離化合物である：

。さらなる態様は、下記：

およびその組み合わせからなる群より選択される単離化合物である、アフラトキシン鋳型を含む。

本開示の別の局面は、以下の方法を含む：
式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
3,5-ジメトキシフェノールを4-クロロアセト酢酸エチルと酸中で反応させて4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを生成する段階。

他の態様において、アフラトキシン鋳型の合成法は、
式：

の一塩基酸をポリリン酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階；
反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：

のアフラトキシン鋳型を得る段階を含む。

他の態様において、一塩基酸は、式：

の二塩基酸を溶媒に懸濁する段階、および少なくとも100〜140℃に加熱する段階により提供される。

別の態様において、アフラトキシン鋳型化合物の合成法は、
ジエチル中間体2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸エステルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階；および
二塩基酸類縁体を沈澱させて式：

のアフラトキシン鋳型を単離する段階を含む。

他の態様において、2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルは、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンをマロン酸ジエチル、ヨウ化カリウム、およびクラウンエーテルと極性溶媒中で合わせて混合物を生成する段階；およびカリウムブトキシドを混合物に加えて2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを生成する段階を含む方法によって調製する。

他の態様において、式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法は、
2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階、および式：

の二塩基酸類縁体を沈澱させる段階；
二塩基酸類縁体を溶媒に懸濁する段階、少なくとも100〜140℃に加熱する段階、および式：

の一塩基酸を沈澱させる段階；
一塩基酸を酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階、反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：

の化合物を得る段階を含む。

本開示の別の局面は、モノマーから作製された架橋ポリマーと以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型との複合体を含む、分子インプリントポリマー中間体を提供する：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。特定の態様において、分子インプリントポリマー中間体は約100：1〜1：100のアフラトキシン鋳型とモノマーとの比を有する。他の態様において、分子インプリントポリマー中間体は約1：4.1〜1：10のモノマーと架橋剤との比を有する。さらに他の態様において、分子インプリントポリマー中間体は、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、式（I）のアフラトキシン鋳型を含む。

本開示の別の局面は、モノマーから作製された架橋ポリマーを含む分子インプリントポリマーを含み、ここでポリマーは複数の空洞を有し、ここで空洞の少なくとも1つは以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製された：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。特定の態様において、分子インプリントポリマーは、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンであるアフラトキシン鋳型を含む。ある態様において、分子インプリントポリマーは、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリンであるアフラトキシン鋳型化合物を含む。ある態様において、分子インプリントポリマーは、メタクリル酸、2-ビニルピリジン、メタクリル酸2-ヒドロキシエチルおよびその組み合わせからなる群より選択されるモノマーを有する。ある態様において、分子インプリントポリマーは、ジメタクリル酸エチレングリコールである架橋剤を有する。さらに他の態様において、分子インプリントポリマーは約100：1〜1：100のアフラトキシン鋳型とモノマーとの比を有する。さらに他の態様において、分子インプリントポリマーは約1：4.1〜1：10のモノマーと架橋剤との比を有する。

本開示の別の局面は、以下の方法を含む：
分子インプリントポリマーの作製法であって、以下の段階を含む、方法：
以下の式（I）：

を有するアフラトキシン鋳型を提供する段階であって、式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；アフラトキシン鋳型を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階；モノマーおよび1つまたは複数の架橋剤を重合させて分子インプリントポリマー中間体を生成する段階；および分子インプリントポリマー中間体からアフラトキシン鋳型を除去して分子インプリントポリマーを生成する段階。特定の態様において、アフラトキシン鋳型は5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、またはその組み合わせを含む。ある態様において、MIPは本明細書に記載の方法によって調製する。

ある態様において、アフラトキシン鋳型化合物を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階は、モノマーおよび架橋剤を1つまたは複数の有機溶媒の溶液中で混合することを含む。特定の態様において、1つまたは複数の溶媒はアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液、およびアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液のうち2つ以上の混合物からなる群より選択される。

他の態様において、方法は開始剤を加える段階をさらに含む。特定の態様において、開始剤はアゾ(ビス)-イソブチロニトリル（AIBN）であり、ここでAIBNの熱分解によってフリーラジカルが生成し、開始剤として作用する。さらに他の態様において、有機溶媒中、55〜110℃の温度でフリーラジカルを生成することにより、重合を開始する。

ある態様において、分子インプリントポリマー中間体からのアフラトキシン鋳型の除去は、分子インプリントポリマー中間体を溶媒で洗浄する段階を含む。特定の態様において、有機溶媒はエチルアルコール、メチルアルコール、アセトニトリル、トルエン、およびその混合物の群より選択される。

ある態様において、分子インプリントポリマーを前記1回または複数回の洗浄後に乾燥する。

本開示の別の局面は、以下の方法を含む：
アフラトキシンを捕捉する方法であって、以下の段階を含む、方法：
空洞の少なくとも1つが以下の式（I）：

を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって、式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；任意でアフラトキシンを含む材料を提供する段階；および分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階。

ある態様において、材料は液体、固体、または気体である。特定の態様において、材料は土壌、香辛料、飲料、食糧、動物飼料、薬学的組成物、栄養学的組成物、および美容組成物からなる群より選択される。具体的態様において、材料は乳である。

ある態様において、分子インプリントポリマーを材料と、少なくとも1秒間接触させる。

ある態様において、方法は、分子インプリント材料を材料から分離する段階をさらに含む。特定の態様において、分子インプリントポリマーの分離は、ろ過または遠心分離によって分離する段階を含む。

ある態様において、方法は、分子インプリントポリマーと複合したアフラトキシンの量を検出する段階、分子インプリントポリマーと接触した後の材料中のアフラトキシンの量を検出する段階、またはその両方をさらに含む。

他の態様において、アフラトキシンを捕捉する方法は、以下の段階を含む：
少なくとも1つの空洞が以下の式（I）：

を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって、式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；(b）アフラトキシンを含む材料を提供する段階；および(c）分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階であって、分子インプリントポリマーは材料の単位あたり少なくとも40重量パーセントのアフラトキシンを捕捉する、段階。ある態様において、材料は液体であり、かつ分子インプリントポリマーは材料の体積あたりアフラトキシンの重量の少なくとも40パーセントを捕捉する。

より具体的には、本発明は以下を提供する：
[１]
以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型：

式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される；
[２]
R'がハロ、ヒドロキシおよびアルコキシからなる群より選択される置換基をさらに含む、[1]に記載のアフラトキシン鋳型；
[３]
以下の式：

を有する単離化合物である、[1]に記載のアフラトキシン鋳型；
[４]
下記：

およびその組み合わせからなる群より選択される単離化合物である、[1]に記載のアフラトキシン鋳型；
[５]
式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
3,5-ジメトキシフェノールを4-クロロアセト酢酸エチルと酸中で反応させて4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを生成する段階；
[６]
アフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
式：

の一塩基酸をポリリン酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階；
反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：

のアフラトキシン鋳型を得る段階；
[７]
一塩基酸が、式：

の二塩基酸を溶媒に懸濁する段階、および少なくとも100〜140℃に加熱する段階により提供される、[6]に記載の方法；
[８]
アフラトキシン鋳型化合物の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
ジエチル中間体2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸エステルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階；および
二塩基酸類縁体を沈澱させて式：

のアフラトキシン鋳型を単離する段階；
[９]
2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを、以下の段階を含む方法によって調製する、[8]に記載の合成法：
4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンをマロン酸ジエチル、ヨウ化カリウム、およびクラウンエーテルと極性溶媒中で合わせて混合物を生成する段階；および
カリウムブトキシドを混合物に加えて2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを生成する段階；
[１０]
式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階、および式：

の二塩基酸類縁体を沈澱させる段階；
二塩基酸類縁体を溶媒に懸濁する段階、少なくとも100〜140℃に加熱する段階、および式：

の一塩基酸を沈澱させる段階；
一塩基酸を酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階、反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：

の化合物を得る段階；
[１１]
モノマーから作製された架橋ポリマーと以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型との複合体を含む、分子インプリントポリマー中間体：

式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
式中
R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される；
[１２]
アフラトキシン鋳型とモノマーとの比が約100：1〜1：100である、[11]に記載の分子インプリントポリマー中間体；
[１３]
モノマーと架橋剤との比が約1：4.1〜1：10である、[11]に記載の分子インプリントポリマー中間体；
[１４]
式（I）のアフラトキシン鋳型が4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、[11]に記載の分子インプリントポリマー中間体；
[１５]
モノマーから作製された架橋ポリマーを含む分子インプリントポリマーであって、複数の空洞を有し、ここで空洞の少なくとも1つが以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、分子インプリントポリマー：

式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
式中
R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される；
[１６]
アフラトキシン鋳型が4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンである、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[１７]
アフラトキシン鋳型化合物が5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリンである、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[１８]
モノマーがメタクリル酸、2-ビニルピリジン、メタクリル酸2-ヒドロキシエチルおよびその組み合わせである、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[１９]
架橋剤がジメタクリル酸エチレングリコールである、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[２０]
アフラトキシン鋳型とモノマーとの比が約100：1〜1：100である、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[２１]
モノマーと架橋剤との比が約1：4.1〜1：10である、[15]に記載の分子インプリントポリマー；
[２２]
分子インプリントポリマーの作製法であって、以下の段階を含む、方法：
以下の式（I）：

を有するアフラトキシン鋳型を提供する段階であって、
式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
式中
R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
アフラトキシン鋳型を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階；
モノマーおよび1つまたは複数の架橋剤を重合させて分子インプリントポリマー中間体を生成する段階；および
分子インプリントポリマー中間体からアフラトキシン鋳型を除去して分子インプリントポリマーを生成する段階；
[２３]
アフラトキシン鋳型化合物を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階が、モノマーおよび架橋剤を1つまたは複数の有機溶媒の溶液中で混合することを含む、[22]に記載の方法；
[２４]
1つまたは複数の溶媒がアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液、およびアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液のうち2つ以上の混合物からなる群より選択される、[23]に記載の方法；
[２５]
開始剤を加える段階をさらに含む、[22]に記載の方法；
[２６]
開始剤がアゾ(ビス)-イソブチロニトリル（AIBN）であり、ここでAIBNの熱分解によってフリーラジカルが生成し、開始剤として作用する、[25]に記載の方法；
[２７]
前記重合を、有機溶媒中、55〜110℃の温度でフリーラジカルを生成することにより開始する、[26]に記載の方法；
[２８]
アフラトキシン鋳型が5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、またはその組み合わせを含む、[22]に記載の方法；
[２９]
分子インプリントポリマー中間体からのアフラトキシン鋳型の除去が、分子インプリントポリマー中間体を溶媒で洗浄する段階を含む、[22]に記載の方法；
[３０]
前記有機溶媒がエチルアルコール、メチルアルコール、アセトニトリル、トルエン、およびその混合物の群より選択される、[34]に記載の方法；
[３１]
前記分子インプリントポリマーを前記1回または複数回の洗浄後に乾燥する、[22]に記載の方法；
[３２]
[22]に記載の方法によって調製した分子インプリントポリマー；
[３３]
アフラトキシンを捕捉する方法であって、以下の段階を含む、方法：
空洞の少なくとも1つが以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって：

式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
式中
R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
任意でアフラトキシンを含む材料を提供する段階；および
分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階；
[３４]
材料が液体、固体、または気体である、[33]に記載の方法；
[３５]
材料が土壌、香辛料、飲料、食糧、動物飼料、薬学的組成物、栄養学的組成物、および美容組成物からなる群より選択される、[34]に記載の方法；
[３６]
材料が乳である、[35]に記載の方法；
[３７]
分子インプリントポリマーを材料と、少なくとも1秒間接触させる、[33]に記載の方法；
[３８]
分子インプリント材料を材料から分離する段階をさらに含む、[33]に記載の方法；
[３９]
分子インプリントポリマーの分離が、ろ過または遠心分離によって分離する段階を含む、[33]に記載の方法；
[４０]
分子インプリントポリマーと複合したアフラトキシンの量を検出する段階、分子インプリントポリマーと接触した後の材料中のアフラトキシンの量を検出する段階、またはその両方をさらに含む、[33]に記載の方法；
[４１]
アフラトキシンを捕捉する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a）少なくとも1つの空洞が以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって：

式中
R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
式中
R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
R₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
(b）アフラトキシンを含む材料を提供する段階；および
(c）分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階であって、分子インプリントポリマーは材料の単位あたり少なくとも40重量パーセントのアフラトキシンを捕捉する、段階；ならびに
[４２]
材料が液体であり、かつ分子インプリントポリマーが材料の体積あたりアフラトキシンの重量の少なくとも40パーセントを捕捉する、[41]に記載の方法。

（図１）即時捕集固相抽出（SPE）カラム装置において、pH6.0の酢酸アンモニウム緩衝液：

中のアフラトキシンM1（AFM1）の100ng/L溶液1mLを用いての、各MIP 1mg量によって吸着されたAFM1の量を示す。同様に、吸着段階後に行った後続メタノール：

およびトルエン：（■）洗浄中に存在するAFM1の量も示す。吸着されたAFM1の量および材料から遊離されたAFM1の量を定量することができる。
（図２）表示のMIPおよび対応する非インプリントポリマー（NIP）（0.001％〜0.1％で変動）について、90ng/L AFM1溶液10mLにより、5〜500分の6つの期間で、自由流動MIP/NIPを用いて、複数の時点を平均した平均AFM1吸着を示す。吸着効力を、上清中に残存するマイコトキシン：

およびメタノール洗浄後にMIP/NIPから溶出するマイコトキシン：

の定量によって測定し、吸着効力および選択性を規定した。即時吸着があるという事実により、各生成物について各時点（15、30、60、90分および18時間）のAFM1吸着量を平均した。次いで、すべての試験チューブを3,000rpmで10分間遠心分離し、分析のためにUPLCバイアルに移した。次いで、粉末（MIPまたはNIP）を2mLエッペンドルフチューブに移し、1mLのメタノールを加え、約3秒間ボルテックスにかけた。
（図３）225ng/L濃度でAFM1を加えた生乳10mL中のMIP-003（0.001％〜0.1％で変動）について平均した平均AFM1吸着を示す。
（図４）アフラトキシン鋳型の合成の概略図である。
（図５）SPEカラム装置において、室温で、様々な包含率（0.001％〜0.1％で変動）でのMIP-005によるAFM1の即時捕集の結果を示す。

定義
本明細書において用いられる「約」なる用語は、特定の列挙された数値に関して用いられる場合、その値は列挙された値から1％以下で変動しうることを意味する。例えば、本明細書において用いられる「約100」なる表現は、99および101ならびにその間のすべての値（例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など）を含む。

本明細書において用いられる「分子インプリントポリマー」または「MIP」なる用語は、1つまたは複数のアフラトキシンに選択的に結合する合成ポリマーを意味する。ある態様において、MIPは高いエナンチオ選択性および低い基質選択性を示し、ここでMIPは鋳型アフラトキシンラセミ体ならびに天然アフラトキシンなどのその対応する類縁体と相互作用する。ある態様において、MIPは、アフラトキシンの結合について、対応する非インプリントポリマーよりも高いエナンチオ選択性を有する。ある態様において、MIPはアフラトキシンに選択的に結合し、他のマイコトキシンには結合しない。ある態様において、MIPはアフラトキシンB1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、およびQ1の1つまたは複数に結合する。ある態様において、MIPはアフラトキシンB1およびアフラトキシンM1に選択的に結合する。

ある態様において、空洞を生成するためにポリマーを架橋し、空洞の少なくとも1つは式（I）のアフラトキシン鋳型を用いて作製する。いくつかの態様において、少なくとも1つの空洞は式（I）のアフラトキシン鋳型および/またはアフラトキシンとの可逆的結合のための相互作用部位を提供する。概して、MIPは：(i）1つまたは複数の標的化合物（例えば、アフラトキシン）の構造、サイズ、形状および/または他の化学的特長を模倣する鋳型（例えば、アフラトキシン鋳型）ならびに(ii）モノマーおよび/または架橋試薬などの他の成分を用いて構築する。例えば、1つまたは複数のアフラトキシン鋳型を、モノマーおよび架橋剤を含む重合前混合物に組み入れる。次いで、混合物を重合して、架橋ポリマーおよびアフラトキシン鋳型を含む「分子インプリントポリマー中間体」または「MIP中間体」を生成する。ポリマーが生成した後にアフラトキシン鋳型を除去すると、1つもしくは複数のアフラトキシンまたはアフラトキシンに類似の他の化合物と複合体を形成するための化学的および/または物理的能力を有する相補的空洞が残る。そのような領域（例えば、空洞または他の領域）を、1つまたは複数のアフラトキシンを結合するために調整して、そのようなアフラトキシン含有化合物に対する高い親和性および選択性を生じる。アフラトキシン鋳型化合物を用いて分子インプリントポリマーを生成するが、いくつかの態様において、MIPは1つまたは複数のアフラトキシンとは異なるが、類似の化合物群に対して高い親和性を有することもある。例えば、MIPは、1つまたは複数のアフラトキシンと形状、サイズ、電荷密度、幾何学または他の物理的もしくは化学的性質が類似の分子を含むいくつかの化合物に結合しうる。

本明細書において用いられる「非インプリントポリマー」または「NIP」なる用語は、鋳型化合物（例えば、アフラトキシン鋳型）なしで生成した合成ポリマーを意味する。そのようなポリマーは、エナンチオ選択性も基質選択性も有しておらず、NIPの成分と水素結合、イオン相互作用、静電相互作用などを生成しやすい任意の分子と相互作用しうるであろう。NIPは、特定の化合物（例えば、AFB1、AFM1）を標的とするMIPネットワークにおけるインプリント法から特定の空洞が利用できる場合よりも、安定性が低い非特異的な非共有結合の表面相互作用に関与する。ある態様において、「対応する」NIPは、MIPと同じモノマーおよび架橋剤によるが、鋳型（例えば、アフラトキシン鋳型）を用いずに合成した、合成ポリマーを意味する。

本明細書において用いられる「ポリマー」なる用語は、典型的には共有化学結合によって連結されてネットワークを形成する、反復構造単位（例えば、モノマー）からなる分子（高分子）を意味する。ある態様において、ポリマーをモノマーの架橋により生成して、ネットワークへと集合する一次鎖または構造単位を形成する。

本明細書において用いられる「アフラトキシン鋳型」なる用語は、1つまたは複数の天然アフラトキシンの構造、サイズ、形状および/または他の化学的特徴を模倣する、1つまたは複数の合成的に構築された分子を意味する。本開示は、合成または天然のいずれかでありうる、用いたアフラトキシン鋳型のタイプによって限定されることはない。事実、アフラトキシンB1、B2、G1、G2、M1、P1、Q1、および本明細書に記載の他のアフラトキシンを含むが、それらに限定されるわけではない、アフラトキシン鋳型化合物を用いて生成したMIPに、様々なアフラトキシンが結合しうる。

本明細書において用いられる「モノマー」なる用語は、他のモノマーに化学的に結合してポリマーを生成しうる分子を意味する。

本明細書において用いられる「架橋」および「架橋剤」なる用語は、2つ以上のモノマーに結合してポリマーネットワークを形成することが可能な、2、3または4つの二重結合を含む分子を意味する。

本明細書において用いられる「構造単位」なる用語は、ポリマー鎖の構築ブロックを意味し、反復単位に関連する。

本明細書において用いられる「アニオンの」または「アニオン」なる用語は、負電荷を有するイオンを意味する。

本明細書において用いられる「カチオンの」または「カチオン」なる用語は、正電荷を有するイオンを意味する。この用語は、正電荷を含む、分子インプリントポリマーなどのポリマー化合物を意味することができる。

本明細書において用いられるとおり、本明細書において用いられる「酸」なる用語は、プロトンを供与および/または電子を受容することができる任意の化学化合物を意味する。本明細書において用いられる「塩基」なる用語は、プロトンを受容および/または電子もしくは水酸化物イオンを供与することができる任意の化学化合物を意味する。本明細書において用いられる「塩」なる用語は、無機または有機酸および塩基から誘導されうる化合物を意味する。

本明細書において用いられる「ブリーディング」なる用語は、MIPの数回の洗浄段階後にまだMIPと関連しており、MIPから解離してその吸着活性を妨害し続ける、鋳型の残存画分を意味する。

本明細書において用いられる「ポロゲンの/ポロゲン」なる用語は、ポリマー中の空洞（例えば、MIPの空洞）のサイズを変えるために用いる物質、分子、緩衝液、溶媒（例えば、トルエン、キシレン、エチルベンゼン）を意味する。ある態様において、ポリマーとポロゲンとの比は最終構造の空隙の量と直接相関し、形成されるポリマー凝集体のサイズを規定する。

本明細書において用いられる「包含率」なる用語は、例えば、材料（例えば、乳）の体積の単位に対するポリマーの重量の単位で、または材料の重量の単位に対するポリマーの重量の単位で、材料の単位あたりで提供されるMIPの量を意味する。

本明細書において用いられる「空洞」なる用語は、MIP内部にあり、アフラトキシンがその中で結合するのを可能にするようにサイズおよび/または形状が調整された、空間、細孔、または他の開口を意味する。ある態様において、空洞は、ポリマーをアフラトキシン鋳型存在下で重合し、アフラトキシン鋳型を除去して架橋ポリマー中で空洞を形成することにより、架橋ポリマー中で形成し、このポリマーはMIPとなる。

本明細書において用いられる「重合」なる用語は、化学反応においてモノマー分子を共に反応させて、三次元ネットワークまたはポリマー鎖および凝集ポリマー鎖を生成する工程を意味する。

本明細書において用いられる「沈澱」なる用語は、化学反応中の溶液における固体の生成を意味する。反応が起こると、生成した固体は沈澱と呼び、固体の上に残っている液体は上清と呼ぶ。

本明細書において用いられる「遠心分離」なる用語は、軸に対し垂直の力をかけて、回転中の目的物を固定軸のまわりに押す、回転ローターによって生じる遠心力を用いて、サイズまたは密度により分子を分離する工程を意味する。遠心機は沈降原理を用いてはたらき、ここで求心加速度を用いて密度が大きい物質および小さい物質を密度の異なる層に均等に分布させる。

本明細書において用いられる「濃度」なる用語は、既定の空間あたりの物質の量を意味する。濃度は通常は体積の単位あたりの質量で表す。溶液を希釈するために、より多くの溶媒を加えるか、または溶質の量を低減（例えば、選択的分離、蒸発、噴霧乾燥、凍結乾燥により）しなければならない。反対に、溶液を濃縮するためには、溶媒の量を低減しなければならない。

本明細書において用いられる「層」なる用語は、材料の階層に組織化されて、材料の密度特性に関連して、遠心分離または沈降による分離後に得られる重なり部分または区分を形成する、通常は水平の沈着物を意味する。

本明細書において用いられる「精製した」または「精製する」なる用語は、試料からの外来成分の除去を意味する。化学的文脈にいて用いられる場合、「精製した」または「精製する」とは、望まれない物質からの興味対象の化学物質の物理的分離を意味する。有機分子の精製のために一般に用いられる方法には、下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない：アフィニティ精製、機械的ろ過、遠心分離、蒸発、不純物の抽出、他の成分が不溶性の溶媒への溶解、結晶化、吸着、蒸留、分別、昇華、精錬、精製、電気分解および透析。

本明細書において用いられる「乾燥」なる用語は、物質中の液体の量を低減または除去する任意の種類の工程を意味する。

本明細書において用いられる「洗浄」なる用語は、調製物の不純物または可溶性の不要成分の除去（例えば、任意のタイプの溶質（例えば、蒸留水、緩衝液、もしくは溶媒、または混合物）を用いて）を意味する（例えば、MIPは試料からアフラトキシン鋳型成分を除去するために洗浄してもよい）。

本明細書において用いられる「分析物」なる用語は、原子、分子、物質、または化学成分を意味する。一般に、分析物はそれ自体で測定せず、むしろ分析物の局面または性質（物理的、化学的、生物学的など）を、超高性能液体クロマトグラフィ（UPLCと略記）などの分析手順を用いて判定する。例えば、一般に、「椅子」（分析物-成分）をそれ自体としては測定しないが、椅子の高さ、幅などを測定する。同様に、一般に、アフラトキシン自体は測定しないが、むしろアフラトキシンの1つまたは複数の性質（例えば、アフラトキシンの、例えば、その安定性に関連する、蛍光もしくは分子量、濃度、または生物活性）を測定する。

本明細書において用いられる「試料」なる用語は、任意の原料からの標本を含む広い意味で使用される（例えば、合成、生体および環境試料）。合成試料には、人工的に生成された任意の材料（例えば、MIP）が含まれる。生体試料は動物（ヒトを含む）から得てもよく、液体、固体、組織、および気体を含む。生体試料には、血漿、血清などの血液製剤が含まれる。環境試料には、表面物質、土壌、水、結晶および工業試料などの環境材料が含まれる。

本明細書において用いられる「超高性能液体クロマトグラフィ」または「UPLC」なる用語は、化合物を分離するための液体クロマトグラフィの一形態を意味する。化合物を溶液に溶解する。試料混合物を、溶媒または溶媒混合物が特定の圧で流動しているカラムに注入し、混合物の成分をカラムから溶出することにより、化合物を分離する。UPLC装置は1つまたは複数の移動相貯留槽、ポンプ、インジェクター、分離カラム、および検出器を含む。カラム溶出液中の分析物の存在を、屈折率、設定した波長のUV-VIS吸光度、適切な波長による励起後の蛍光、電気化学的応答、または荷電状態での分析物の分子量に基づく質量と電荷との比における変化を定量的に検出することにより記録する。

本明細書において用いられる「シグナル」なる用語は、一般に、反応が起こったこと（例えば、抗体の抗原への結合）を示す任意の検出可能な工程に関して使用される。シグナルは定性的ならびに定量的に評価することができる。「シグナル」のタイプの例には、放射性シグナル、蛍光シグナル、比色製品/試薬シグナル、質量と電荷との比測定が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる「吸収する」および「吸収」なる用語は、材料が別の物質を「取り込む」または「吸い上げる」工程を意味する。例えば、「吸収」は、拡散または浸透により、物質を細胞中に、または組織および器官を通過して、取り込む、または同化する工程（例えば、消化系による栄養素の吸収または薬物の血流中への吸収）を意味しうる。

本明細書において用いられる「吸着する」および「吸着」なる用語は、材料が組成物（吸着剤）によって（例えば、その表面上に）捕獲、捕捉、結合、捕集、および/もしくは蓄積される場合に起こる工程、または組成物（例えば、MIP）が試料中の標的分子（例えば、1つまたは複数のアフラトキシン）に（例えば、試料から標的分子を除去するために）結合する工程を意味する。

本明細書において用いられる「収着する」および「収着」なる用語は、吸着および吸収の両方を意味する。

本明細書において用いられる「捕捉する」、「捕獲する」、「捕集する」、「吸着する」、または「結合する」なる用語は、互いに接触することになる（例えば、それにより複合体を形成する）複数の実体の物理的結合（例えば、結合（例えば、水素結合、イオン結合、共有結合または他のタイプの結合）を介して）を意味する。結合の例示的な形には、水素結合、配位、およびイオン対形成が含まれるが、それらに限定されるわけではない。捕捉相互作用は、それぞれの実体の立体化学および幾何学に依存して（例えば、捕捉の特異性をさらに規定する）、様々な数の化学的相互作用（例えば、化学結合）を含みうる。複数の実体が相互作用する場合、それらは化学的結合または物理的結合によって捕捉されうるが、電荷、双極子、または他のタイプの相互作用を介して結合してもよい。

本明細書において用いられる「捕捉剤」、「捕獲剤」、「捕集剤」、「吸着剤」および/または「結合剤」なる用語は、第二の実体と複合体を形成することが可能な実体を意味する。

本明細書において用いられる「複合体」なる用語は、複数の別々の実体の間の結合（例えば、実体が同じまたは異なる（例えば、同じまたは異なる化学種）複数の実体の間の結合）によって形成される実体を意味する。結合は共有結合または非共有結合を介して（例えば、ファンデルワールス、静電、電荷相互作用、疎水性相互作用、双極子相互作用、および/または水素結合力（例えば、ウレタン結合、アミド結合、エステル結合、およびその組み合わせ）を介して）であってもよい。

本明細書において用いられる「結合する」なる用語は、複数の別々の実体の間の密接な結合（例えば、実体が同じまたは異なる（例えば、同じまたは異なる化学種）複数の実体の間の結合）を意味する。結合は共有結合または非共有結合を介して（例えば、ファンデルワールス、静電、電荷相互作用、疎水性相互作用、双極子相互作用、および/または水素結合力（例えば、ウレタン結合、アミド結合、エステル結合、およびその組み合わせ）を介して）であってもよい。本明細書において用いられる「密接な」なる用語は、接触すること、またはほぼ接触することを意味する。

本明細書において用いられる「有効量」なる用語は、有益または望ましい結果を達成するのに十分な組成物（例えば、MIP）の量を意味する。有効量を、1回または複数回の投与、適用または用量で投与する、および/または別の材料と合わせることができ、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。

本明細書において用いられる「動物」なる用語は、動物界の任意の1種または複数の種を意味する。これには、家畜、他の農場動物、家庭内動物、ペット動物、海洋および淡水動物、ならびに野生動物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる「飼料材料」なる用語は、対象にエネルギーおよび/または栄養素を与える、ヒトまたは動物によって消費される材料を意味する。飼料材料の例には、乳製品、ジュース、蒸留酒用穀物を含むが、それらに限定されるわけではない穀物、果物、野菜、肉、完全混合飼料（TMR）、まぐさ、ペレット、前記項目のいずれかの濃縮物、前記製品のいずれかのプレミックスまたは共製品、糖蜜、繊維、飼い葉、牧草、干し草、穀粒、葉、前記製品のいずれかから作られた食物、前記製品のいずれかを含む可溶性物および栄養補助食品が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる「マイコトキシン」なる用語は、様々な真菌の菌種によって産生される毒性および/または発癌性化合物を意味する。ある態様において、マイコトキシンはアフラトキシンである。

本明細書において用いられる「マイコトキシン中毒症」なる用語は、マイコトキシンがヒトまたは動物の体の抵抗障壁を通過した状態を意味する。マイコトキシン中毒症は感染症または疾患のいずれかと考えることができ、罹患した者に有害な影響を有しうる。

本明細書において用いられる「有毒な」なる用語は、動物またはヒトの細胞または組織を含むが、それらに限定されるわけではない、動物またはヒトに対する任意の不利益な、有毒の、有害な、またはそれ以外の負の影響を意味する。本明細書において用いられる、「影響」に関する「不利益な」、「有毒の」、「有害な」、または「それ以外の負の」なる用語は、動物またはヒトの同じ細胞または組織を毒素または毒物の接触または投与前とそのような接触後とで比較し、そのような比較をしたときのそのような細胞または組織における望ましくない変化を検出することにより判定することができる。

本明細書において用いられる「トレーサビリティ」なる用語は、測定結果または標準値の性質を意味する。途切れのない比較の連鎖により、規定の参照、通常は国内標準または国際標準に関連づけることができ、全ての比較は不確かさを有する。それは、一般的な計量概念を化学的測定に実用的に適用するものであり、分析化学測定も確実に比較可能にするための技術用語、概念および戦略を提供する。それは、証明可能なやり方で、一意的に同定可能な実体を測定する。トレーサビリティの測定は、とりわけ、文書に記録された同定法によって項目の年代、位置、および/または適用を相互に関連づけるために用いられる。

本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に記載がないかぎり、完全飽和で、明記された数の炭素原子（例えば、C1-C6は1〜6個の炭素を意味する）を有する、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはその組み合わせを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、シクロヘキシル、例えば、n-ペンチルの同族体および異性体、n-ヘキシルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる「ヘテロアルキル」なる用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に記載がないかぎり、完全飽和で、明記された数の炭素原子（例えば、C1-C6は1〜6個の炭素を意味する）を有し、その中で炭素原子の1個がヘテロ原子で置き換えられている、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはその組み合わせを意味する。ある態様において、ヘテロ原子は酸素である。

本明細書において用いられる「置換アルキル」なる用語は、特に記載がないかぎり、完全飽和で、明記された数の炭素原子（例えば、C1-C6は1〜6個の炭素を意味する）を有し、かつH原子の少なくとも1つの置換を有する、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはその組み合わせを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、シクロヘキシル、例えば、n-ペンチルの同族体および異性体、n-ヘキシルなどが含まれる。置換アルキルにおいて用いることができる置換基の例には、ハロゲン、カルボキシ、およびヒドロキシル基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる「ハロ置換アルキル」なる用語は、ハロ原子を用いてH原子の少なくとも1つが置き換えられている、置換アルキルを意味する。

本明細書において用いられる「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」なる用語は、それら自体で、または他の用語との組み合わせで、特に記載がないかぎり、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式版を意味する。加えて、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は複素環が分子の残部に結合している位置を占有することができる。

「ハロ」または「ハロゲン」なる用語は、それら自体で、または他の用語との組み合わせで、特に記載がないかぎり、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、1〜(2m+1)（mはアルキル基における炭素原子の総数）の範囲の数の、同じまたは異なりうるハロゲン原子による、1つまたは複数の置換アルキル基を含むことが意図される。したがって、「ハロアルキル」なる用語は、モノハロアルキル（1個のハロゲン原子で置換されたアルキル）およびポリハロアルキル（2〜(2m+1)の範囲の数のハロゲン原子で置換されたアルキル）を含む。

「アルコキシ」なる用語は、酸素原子を介して分子の残部に結合している1つまたは複数のアルキル基を意味する。

詳細な説明
本開示は、アフラトキシン鋳型、1つまたは複数のそのようなアフラトキシン鋳型を含む化合物、およびそのような化合物を用いて作製された分子インプリントポリマー、ならびにそのような鋳型および化合物の作製法および使用法を記載する。

アフラトキシン鋳型および中間体
ある態様において、本明細書に記載のアフラトキシン鋳型はアフラトキシン分子の構造類縁体である。他の態様において、アフラトキシン鋳型は1つまたは複数のアフラトキシンと形状、サイズ、電荷密度、幾何学および/または他の物理的もしくは化学的性質が類似している。具体的態様において、アフラトキシン鋳型はクマリン部分、少なくとも1つのアルコキシ部分、およびカルボニル部分を含む。アフラトキシン分子はアフラトキシンB1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、およびQ1の1つまたは複数のタイプを含む。

ある態様において、アフラトキシンB1（AFB1）を、本明細書に記載の合成を用いて構造類縁体を作製するためのモデルとして用いた。アフラトキシン類縁体は、大量の毒性アフラトキシンを取り扱う必要性、およびアフラトキシンのポリマーからのブリーディングを防止する必要性を低減または除去するので有利である。ある態様において、少なくとも2つの異なるアフラトキシン鋳型を調製する。ある態様において、アフラトキシン鋳型は天然アフラトキシンに比べて毒性が低いか、またはない。

アフラトキシン鋳型は以下の式を有するか、または含む：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；R'はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。関連する態様において、R'はハロ、オキソ、ヒドロキシおよびアルコキシからなる群より選択される1つまたは複数の置換基である。

ある態様において、R₁、R₂、R₃、およびR'は独立にアルキル基であってもよい。アルキルは、完全飽和で、明記された数の炭素原子（例えば、C1-C6は1〜6個の炭素を意味する）を有する、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはその組み合わせを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、シクロヘキシル、例えば、n-ペンチルの同族体および異性体、n-ヘキシルなどが含まれる。

ある態様において、R₁、R₂、R₃、およびR'は独立に置換アルキル基であってもよい。置換アルキルは、完全飽和で、明記された数の炭素原子（例えば、C1-C6は1〜6個の炭素を意味する）を有し、かつH原子の少なくとも1つの置換を有する、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、あるいはその組み合わせを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、シクロヘキシル、例えば、n-ペンチルの同族体および異性体、n-ヘキシルなどが含まれる。置換の例には、ハロゲン、カルボキシ、およびヒドロキシル基が含まれる。

ある態様において、R₁、R₂、R₃、およびR'は独立にハロゲンであってもよい。ハロ基またはハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、ハロアルキルは、1〜(2m+1)（mはアルキル基における炭素原子の総数）の範囲の数の、それぞれ同じまたは異なりうる、1つまたは複数のハロゲン原子で置換されたアルキルを含む。例にはモノハロアルキル（1個のハロゲン原子で置換されたアルキル）およびポリハロアルキル（2〜(2m+1)の範囲の数のハロゲン原子で置換されたアルキル）が含まれる。ある態様において、ハロゲンは塩素またはフッ素である。

ある態様において、R₃は独立にアルコキシであってもよい。アルコキシは、酸素原子を介して分子の残部に結合しているアルキル基を意味する。例にはメトキシ、エトキシなどが含まれる。

いくつかの例示的態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式を有するか、または含む：

。具体的態様において、アフラトキシン鋳型は4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンである。

他の関連する態様において、アフラトキシン鋳型は下記：

およびその組み合わせからなる群より選択される単離分子を含む。

ある態様において、アフラトキシン鋳型は2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4イル)メチル)マロン酸、3-(5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4イル)プロパン酸、2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4イル)メチル)マロン酸ジエチルおよびその組み合わせからなる群より選択される単離分子を含む。

別の態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式（I）を有するか、または含む：

式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。

ある態様において、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは、それぞれアルキルおよびヘテロアルキルの環式版を意味する。加えて、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は複素環が分子の残部に結合している位置を占有することができる。

他の関連する態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式を有するか、または含む：

。具体的態様において、アフラトキシン鋳型は5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリンである。

アフラトキシン鋳型合成
本明細書に記載のアフラトキシン鋳型およびそのようなアフラトキシン鋳型を含む化合物を、様々な方法によって調製することができる。本明細書に記載の例示的方法は、経済的である（例えば、経済的に達成可能な様式での実現可能な大規模生産を可能にする）だけでなく、以前にマイコトキシン鋳型を作製するために使用された試薬よりも一般に容易に入手可能でありうる試薬も使用する、1つまたは複数のアフラトキシン鋳型を含む化合物の大規模生産を可能にする方法（例えば、合成法）および材料を提供する。

ある態様において、式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法は、3,5-ジメトキシフェノールを4-クロロアセト酢酸エチルと酸中で反応させて4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを生成する段階を含む。他の態様において、化合物4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを単離し、MIPを生成するために用いる。

ある態様において、アフラトキシン鋳型の合成法は、
式：

の一塩基酸をポリリン酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階；
反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：

のアフラトキシン鋳型を得る段階を含む。このアフラトキシン鋳型を単離し、MIPを生成するために用いる。

ある態様において、一塩基酸を提供する方法は、式：

の二塩基酸を溶媒に懸濁する段階、および少なくとも100℃、または約100〜140℃に加熱する段階を含む。

ある態様において、アフラトキシン鋳型化合物の合成法は、
式：

のジエステル類縁体（すなわち、2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸エステル）を、溶媒（例えば、エタノール）中で塩基（例えば、NaOH）を用いて脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階、および少なくとも60℃に加熱して二塩基酸類縁体を生成する段階；および
二塩基酸類縁体を沈澱させて式：

のアフラトキシン鋳型を単離する段階を含む。

ある態様において、ジエステル中間体（すなわち、2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチル）の合成法は、
式：

の4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンをマロン酸ジエチル、ヨウ化カリウム、およびクラウンエーテルと合わせてジエステル類縁体を生成する段階；および
ジエステル類縁体を沈澱させて式：

のアフラトキシン鋳型中間体を単離する段階を含む。

ある態様において、式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法は、
2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階、および式：

の二塩基酸類縁体を沈澱させる段階；
二塩基酸類縁体を溶媒に懸濁する段階、および100℃または100〜140℃に加熱する段階、および式：

の一塩基酸を沈澱させる段階；
一塩基酸を酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階、反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて：

を得る段階を含む。

次いで図4を参照して、ここでアフラトキシン鋳型類縁体および中間体化合物を、トルエン中H₂SO₄存在下で3,5-ジメトキシフェノールを4-クロロアセト酢酸エチルと縮合させて塩素化類縁体、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを生成することにより生成する。この例では、アセトニトリル中で4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンをマロン酸ジエチル、ヨウ化カリウム、およびクラウンエーテルと合わせて混合物を生成する。混合物が生成すれば、カリウムt-ブトキシドを混合物に加えて式2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルのジエステルを生成する。

2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルの生成後、本態様において、2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルをアルコール中、塩基を用いて脱保護することにより、二塩基酸を生成する。式：

を有する二塩基酸を溶媒中、少なくとも135℃に加熱する。本態様において、次いで二塩基酸をキシレン中、還流温度での部分脱カルボキシル化により、その一塩基酸に変換する。少なくとも本態様において、一塩基酸を、ポリリン酸を用いた環化にかけて、式：

の最終AFT-1アフラトキシン鋳型（AFT-1）を得た。

用いる化学式は、アフラトキシン鋳型をMIPに可逆的に結合させるために、以下にさらに詳細に記載する、分子インプリントポリマー中間体を考慮しなければならないことが理解されるべきである。加えて、アフラトキシン鋳型に含まれるアフラトキシン鋳型は、分子インプリントポリマー中間体に、アフラトキシンB1などの1つまたは複数のアフラトキシンに対する高レベルの親和性を保持する空洞を提供しなければならない。

ある態様において、アフラトキシン鋳型および担体を含む組成物を提供する。ある態様において、組成物は所望の特徴を有するMIPを生成するためのアフラトキシン鋳型の有効量（例えば、典型的にはモノマーの量に対する量、比として表される）を含む。組成物は適切な担体、賦形剤、ならびにアフラトキシン鋳型の適切な転移、送達、安定性、および官能性を提供する他の作用物質と共に製剤する。

分子インプリントポリマー
ある態様において、分子インプリントポリマーは、モノマーを含むかまたはモノマーから作製された架橋ポリマーを含み、ここで架橋ポリマーは複数の空洞を有し、空洞の少なくとも1つは以下の式（I）のアフラトキシン鋳型により作製される：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'はH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される；あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。

ある態様において、少なくとも1つの空洞は式（I）のアフラトキシン鋳型の結合を提供する。ある態様において、MIPは1つまたは複数のアフラトキシン鋳型を選択的に結合する。ある態様において、MIPはアフラトキシンの1つまたは複数のタイプ、例えば、アフラトキシンB1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、およびQ1を選択的に結合する。ある態様において、MIPのアフラトキシンに対する親和性および/または選択性を対応するNIPと比較する。

いくつかの場合に、アフラトキシン鋳型またはアフラトキシンの結合のすべて、または一部は、特定の条件下で可逆的である。MIP中間体を生成した後、アフラトキシン鋳型を、溶媒を用いて除去する。ある態様において、アフラトキシン鋳型のポリマーとの相互作用を崩壊させることができ、アフラトキシン鋳型と類似の極性および/または溶解性を有する溶媒を選択する。ある態様において、溶媒は極性溶媒である。

または、ある態様において、MIPは材料のアフラトキシンに結合し、材料から分離された後、MIPを再使用するために結合したアフラトキシンを除去することができる。ある態様において、結合したアフラトキシンおよび/またはアフラトキシン鋳型の少なくとも一部は、極性溶媒などの溶媒を用いてMIPから除去可能である。ある態様において、アフラトキシンのポリマーとの相互作用を崩壊させることができ、アフラトキシンと類似の極性および/または溶解性を有する溶媒を選択する。ある態様において、溶媒はエチルアルコール、メチルアルコール、アセトニトリル、トルエン、およびその混合物の群から選択される。いくつかの態様において、溶媒存在下で、体積あたりの重量に基づき、MIPに結合したアフラトキシンの約25％以下が遊離される。ある態様において、MIPは、例えば、極性溶媒中で、材料から捕捉された1つまたは複数のアフラトキシンの25重量％、20重量％、15重量％、10重量％、5重量％、または1重量％以下を遊離する。これに対して、同じ溶媒存在下、対応するNIPからは、約90％以上のアフラトキシンが遊離される。

ある態様において、MIPはアフラトキシン鋳型に化学的および/または物理的相互作用によって結合する。他の態様において、空洞を形成しているポリマーネットワークはアフラトキシン鋳型に共有または非共有結合によって結合する。ある態様において、MIPは約20オングストローム以下のミクロ孔、および約20から2000オングストロームの間のメソおよびマクロ孔を含む。ある態様において、アフラトキシン鋳型は少なくとも300立方オングストロームのモル体積を有する。他の態様において、MIPは少なくとも300立方オングストロームのモル体積を有する1つまたは複数の空洞または孔を有する。

ある態様において、アフラトキシン鋳型は本明細書に記載の式（I）の式を有する。具体的態様において、式（I）のアフラトキシン鋳型は4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、およびその組み合わせからなる群より選択される。ある態様において、分子インプリントポリマーを複数の式（I）のアフラトキシン鋳型を用いて合成する。

ある態様において、ポリマーをモノマーから生成する。モノマーは、どのモノマーまたはモノマーの組み合わせが鋳型との相互作用（例えば、共有、非共有、イオン、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用）を最も起こしやすいかを評価するために、アフラトキシン鋳型の構造特性を考慮して選択する。インビボ（例えば、治療薬もしくは診断薬として、または動物飼料もしくはヒト食糧の消費可能な捕捉成分として）で用いるポリマーまたはオリゴマー化合物の場合、非毒性で、適切なインビボでの安定性および溶解性を示すモノマーを選択することが重要である。アフラトキシンMIPの好ましい例には、アクリルアミドおよびメタクリラートが含まれるが、それらに限定されるわけではない。または、例えば、適切な有機または無機試薬との反応により、鋳型の溶解性を増強するために、ポリマーを重合後に処理してもよい。

モノマーのクラスおよび具体的モノマー（例えば、本開示のMIP合成法において用いられる）には、以下のクラスおよびその誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない：アクリル酸および誘導体（例えば、2-ブロモアクリル酸、塩化アクリロイル、N-アクリロイルチロシン、N-アクリロイルピロリジノン、トランス-2-(3-ピリジル)-アクリル酸)、アクリル酸エステル（例えば、アクリル酸アルキル、アクリル酸アリル、アクリル酸ヒドロキシプロピル）、メタクリル酸および誘導体（例えば、イタコン酸、2-(トリフルオロメチル)プロペン酸）、メタクリル酸エステル（例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸2-ヒドロキシエチル、メタクリル酸3-スルホプロピルナトリウム塩、モノメタクリル酸エチレングリコール）、スチレン（例えば、(2,3および4)-アミノスチレン、スチレン-4-スルホン酸、3-ニトロスチレン、4-エチルスチレン）、ビニル（例えば、クロロギ酸ビニル、4-ビニル安息香酸、4-ビニルベンズアルデヒド、ビニルイミダゾール、4-ビニルフェノール、4-ビニルアミン、アクロレイン）、ビニルピリジン（例えば、(2,3,および/または4)-ビニルピリジン、3-ブテン1,2-ジオール）、ボロン酸（例えば、4-ビニルボロン酸）、スルホン酸（例えば、4-ビニルスルホン酸、アクリルアミド-2-メチル-1-プロパン-スルホン酸）、金属キレート剤（例えば、スチレンイミノ二酢酸）、アクリルアミドおよび誘導体（例えば、N-メチルアクリルアミド）、メタクリルアミドおよび誘導体（例えば、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-(3-アミノプロピル)メタクリルアミド）、アルケン（例えば、4-ペンテン酸、3-クロロ-1-フェニル-1-プロペン）無水（メタ）アクリル酸および誘導体（例えば、無水メタクリル酸）、ケイ素含有モノマー（例えば、(3-メタクリルオキシプロピル)トリメトキシシラン、テトラメチルジシロキサン）、ポリエン（例えば、イソプレン、3-ヒドロキシ-3,7,11-トリメチル-1,6,10-ドデカトリエン）、アジド（例えば、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸）、チオール（例えば、アリルメルカプタン）。末端がアクリル酸エステルまたはそれ以外の不飽和ウレタン、炭酸エステルおよびエポキシドも、ケイ素系モノマーを用いうるのと同様、本発明の態様において用いることができる。

使用する場合には、1つまたは複数の架橋剤は好ましくは1つもしくはいくつかのポリマーもしくはオリゴマー化合物、または特定の条件下で切断を提供する化合物である。本発明のポリマー化合物に剛性を付与する架橋剤は、当業者には公知で、ジ-、トリ-、テトラ-およびペンタ-官能性アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、ビニル、アリル、およびスチレンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。架橋剤の具体例には、p-ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリラート（EGDMAと略記）、テトラメチレンジメタクリラート（TDMAと略記）、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（MDAA）、N,N'-1,3-フェニレンビス(2-メチル-2-プロペンアミド)（PDBMP）、2,6-ビスアクリロイルアミドピリジン、1,4-ジアクリロイルピペラジン（DAPと略記）、1,4-フェニレンジアクリルアミド、およびN,O-ビスアクリロイル-L-フェニルアラニノールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。可逆的で、切断可能な架橋剤の例には、N,N'-ビス-(アクリロイル)シスタミン、N,N-ジアリル酒石酸ジアミド、N,N-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド、N1-((E)-1-(4-ビニルフェニル)メチリデン)-4-ビニルアニレン、アリルジスルフィド、およびビス(2-メタクリロイルオキシエチル))ジスルフィドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様において、エチレングリコールジメタクリラートを架橋剤として用いる。好ましい架橋モノマーはエチレングリコールジメタクリラートであるが、本発明の態様はこの試薬に限定されず、ジビニルベンゼンおよびトリメチロールプロパントリメタクリラート（TRIMと略記）などの他の架橋モノマーを用いてもよい。

例えば最終適用の状況で（例えば、食品または飼料製品中、水産養殖での使用を意図した水中、インビボなどで）使用しうる、適切な完全性を有するMIP構造を提供する単純モノマーと架橋剤との任意の比を用いることができる。当業者であれば、所望の構造的完全性を提供するためのモノマーの適切な比を選択することができ、これは標的分子の性質および構造、ならびに用いる鋳型の性質および構造に密接に関連している。

ある態様において、MIPは約100：1〜1：100（w/w）のアフラトキシン鋳型とモノマーとのモル比を有する。例えば、約1：2〜1：7のアフラトキシン鋳型とモノマーとの比を用いる。他の態様において、MIPは約1：4〜1：10のモノマーと架橋剤とのモル比を有する。

ある態様において、MIPは、溶媒と接触すると体積が変化する。ある態様において、水性溶媒と接触したMIPはその重量の最大10倍の水を吸着することができる。他の態様において、MIPは、溶媒に入れた場合に、その体積が乾燥状態のMIPの体積の約75％、50％、40％、30％、20％、10％、5％またはそれ未満増大するように選択する。MIP合成の媒質として用いる溶媒または溶媒混合物は、MIPの膨潤特性にも影響を有し、また空洞および孔のサイズや三次元MIPネットワーク内の分布ならびにミクロ、メソ、マクロスフェアおよび凝集体の形成にも影響を有する。ある態様において、MIPの空洞サイズまたは膨潤性を変えるために、MIPの合成において1つまたは複数のポロゲンを用いてもよい。特定の態様において、MIP膨潤の増大およびMIP空洞サイズの増大が望まれる場合、アセトニトリルなどの極性溶媒をMIP重合のための溶媒または共溶媒として用いる。または、MIP膨潤およびMIP空洞サイズの増大が望まれない場合（例えば、MIPがクロマトグラフィカラムとしての使用を意図される場合で、そのような場合、膨潤は流速を妨害し、分析物の溶出およびHPLC装置の動作能力を妨げる）、そのような溶媒を回避する。ある態様において、MIPの膨潤性を対応するNIPと比較する。

ある態様において、MIPの特徴を対応するNIPと比較する。対応するNIPはMIPと同じ架橋ポリマーを含むが、アフラトキシン鋳型非存在下で生成される。

ある態様において、組成物はMIPおよび担体を含む。ある態様において、組成物は材料からアフラトキシンを捕捉するためのMIPの有効量を含む。ある態様において、有効量は、材料の単位あたりの重量に基づき、材料中のアフラトキシンの少なくとも40％の捕捉を提供する量、および/または材料中のアフラトキシンを0.5ppb未満に低減する量である。組成物は適切な担体、賦形剤、ならびにMIPの適切な転移、送達、安定性、および官能性を提供する他の作用物質と共に製剤する。

MIPの合成法
ある態様において、MIPの合成法を記載する。フリーラジカル、カチオン、およびアニオン重合を含む、異なる重合法を用いてもよい。それに対する相補的ポリマー化合物を生成する化合物の活性立体配座に悪影響を及ぼさない重合条件を、本明細書において選択し、提供する。特に好ましい態様において、フリーラジカル沈澱重合法を用いる。

MIPの作製法は、概して、以下の段階を含む：
以下の式（I）：

で示すものなどの、アフラトキシン鋳型を提供する段階であって、式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；R'はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される；あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；ならびにアフラトキシン鋳型を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階。モノマーおよび架橋剤を合わせた後、モノマーおよび架橋剤を重合して分子インプリントポリマー中間体を生成する。

特定のMIPに対応する非インプリントポリマー（NIP）は、MIPと同じ方法、同じモノマー、および同じ架橋剤を用いて生成されるが、アフラトキシン鋳型が存在しない。

本開示は、担体中の本明細書に記載のMIPを含む組成物も提供する。ある態様において、担体は生理的に許容される担体である。他の態様において、担体は溶媒である。

分子インプリントポリマー中間体
MIP前駆体ポリマーと合わせたアフラトキシン鋳型は分子インプリントポリマー中間体を生成する。この分子インプリントポリマー中間体は、モノマーを用いて作製した架橋MIP前駆体ポリマーとアフラトキシン鋳型との複合体である。少なくとも1つの態様において、アフラトキシン鋳型は以下の式（I）の化合物を有するか、または含む：

式中、R₁はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；R₂はハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；R'はH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは式中、R₁はR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつR₃はH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。特に、アフラトキシン鋳型類縁体は4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンおよび5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリンからなる群より選択される。

いくつかの態様において、アフラトキシン鋳型と少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤とを1つまたは複数の有機溶媒中で合わせる。ある態様において、1つまたは複数の溶媒はアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液、およびアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液のうち2つ以上の混合物からなる群より選択される。具体的態様において、アセトニトリルおよびトルエンの混合物を溶媒として用いる。特に、アセトニトリルおよびトルエンの溶液は少なくとも約20％のアセトニトリルを含む。

他の関連する態様において、開始剤を用いて熱分解により生じるフリーラジカルを生成する。開始剤にはアゾ-ビスイソブチロニトリル（AIBNと略記）、アゾ-ビスジメチルバレロニトリル（ABDVと略記）、ベンジルのジメチルアセタール、ベンゾイルペルオキシド（BPOと略記）、および4,4'-アゾ(4-シアノ吉草酸)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。具体的態様において、アゾ(ビス)-イソブチロニトリルが開始剤である。ある態様において、55〜110℃の温度の有機溶媒中でフリーラジカルを生成することにより、重合を開始する。

ある態様において、合成法は、MIPの空洞のサイズおよび膨潤性を変えるためのポロゲンを加える段階をさらに含む。ポロゲンの例にはトルエン、キシレン、およびエチルベンゼンが含まれる。

分子インプリントポリマー中間体は、約100：1〜1：100のアフラトキシン鋳型化合物とモノマーとの比を用いて作製することができる。他の態様において、アフラトキシン鋳型化合物とモノマーとの比は約1：2〜1：7である。

分子インプリントポリマー中間体は架橋剤を用いて作製することもでき、モノマーと架橋剤との比は約1：4.1〜1：10でありうる。

表1は、分子インプリントポリマー（MIP）中間体および非インプリントポリマー（NIP）中間体の一連の例ならびにいくつかのアフラトキシン鋳型とモノマーとの比およびモノマーと架橋剤との比を提供し、これらは本明細書に記載の分子インプリントポリマー中間体の範囲内である。

分子インプリントポリマー中間体が生成すれば、これを沈澱させ、アフラトキシン鋳型を分子インプリントポリマー中間体から除去して、分子インプリントポリマーを生成する。この工程は、分子インプリントポリマー中間体を溶媒で洗浄することによって達成することができる。ある態様において、アフラトキシンと類似の極性および/または溶解性を有する溶媒を選択する。ある態様において、有機溶媒はエチルアルコール、メチルアルコール、アセトニトリル、トルエン、およびその混合物の群から選択される。アフラトキシン鋳型の除去は、LC-MSなどの公知の方法によって判定することができる。アフラトキシン鋳型の除去後、分子インプリントポリマーが生成し、アフラトキシン分子を捕捉するために利用可能である。ある態様において、MIPを乾燥する。

ある態様において、MIPの収率は、鋳型とモノマーとの比を高める、および/またはモノマーと架橋剤との比を高めることにより、増強することができる。ある態様において、鋳型とモノマーとの比は少なくとも1：2および/またはモノマーと架橋剤との比は少なくとも1：6である。

使用法
本開示は、1つまたは複数のアフラトキシンを捕捉する方法であって、空洞の少なくともいくつかは前述のアフラトキシンの少なくとも1つとの可逆的結合を提供する、複数の空洞を有する架橋ポリマーを含む分子インプリントポリマーを接触させる段階を含む方法を提供する。MIPが生成すれば、アフラトキシンを含むことが疑われる、任意でアフラトキシンを含む、またはアフラトキシンを含むことが公知の材料内または材料上にこれを配置することができる。アフラトキシンを含む材料は気体、半気体、液体、半液体、または固体でありうることが理解されるべきである。例示的態様において、アフラトキシンを含む材料は、土壌、香辛料、飲料、食糧、動物飼料、薬学的組成物、栄養学的組成物、および美容組成物からなる群より選択される。1つの態様において、アフラトキシンを含む材料は乳である。

MIPの選択量（例えば、有効量、または包含率）を、アフラトキシンを含む、またはアフラトキシンを含むことが疑われる材料に曝露する。ある態様において、材料の単位あたりのMIPの量は少なくとも0.01％である。例えば、少なくとも1：6.8のアフラトキシン鋳型化合物とモノマーとのモル比、少なくとも1：5.8のモノマーと架橋剤とのモル比で合成し、少なくとも0.1％の包含率を有するMIPは、緩衝液中100ng/LのAFM1溶液からアフラトキシンM1（AFM1）の少なくとも76.5％を吸着する。別の例において、少なくとも1.0％の包含率はAFM1の100％吸着を示した。他の態様において、MIP/材料比は少なくとも0.01％〜100％である。ある態様において、液体の体積あたりのMIPの量は材料1リットルあたり約100mg〜1キログラムである。

ある態様において、MIPを、アフラトキシンを含む、またはアフラトキシンを含むことが疑われる材料と少なくとも1秒間接触させる。他の態様において、MIPを、アフラトキシンを含む、またはアフラトキシンを含むことが疑われる材料と約1、2、3、4、5分間またはそれ以上接触させる。他の態様において、MIPを材料と約1秒間〜500分間接触させる。

ある態様において、材料およびMIPをpH1〜13の溶液中で接触させる。他の態様において、pHは約pH6.0、pH7.0、pH7.5、またはそれ未満である。

ある態様において、MIPを材料と撹拌しながら、または撹拌せずにバッチ中で接触させる。他の態様において、MIPを、固相抽出カラムなどのクロマトグラフィカラム中に配置する。

MIPを材料とあらかじめ決められた期間接触させると、MIPは捕捉したアフラトキシンを含み、これを材料から分離する。1つのそのような分離法はろ過である。別の分離法は遠心分離である。

MIPによるアフラトキシンの吸着は、材料の単位あたりのアフラトキシンの重量の少なくとも10％、20％、30、もしくは40％またはそれ以上の範囲である。材料から得る吸着は、pH、温度、毒素の濃度、MIPの性質、撹拌、および材料の流量に関して用いる条件に特異的である。MIPのマイコトキシンへの曝露の時間が増えれば、および/または包含率が増大すれば、100％の吸着が観察される。吸着は曝露の時間、アフラトキシンの濃度、MIPの包含レベル、および環境によって影響される。材料をMIPに、少なくとも0.1％の包含率で、少なくとも5分間曝露すると、MIPは材料中のアフラトキシンの少なくとも40重量％を捕捉することができる。関連する態様において、MIPは、材料中のアフラトキシンの量を0.5ppb未満または0.05ppb未満に低減するのに十分な量のアフラトキシンを材料から捕捉することになる。

いくつかの態様において、材料をMIPと、アフラトキシンレベルが低減するまで、複数回曝露して接触させることもできる。例えば、材料のMIPへの最初の曝露は、アフラトキシンの約10％以上を除去することができる。次いで、アフラトキシンが結合したMIPを除去し、洗浄して再使用するか、または次いで、アフラトキシンがほとんど、もしくはまったく結合していないMIPを材料と再度接触させる。アフラトキシンの量が、例えば、0.5ppb未満に低減するまで、複数回の曝露を続けることができる。

任意で、アフラトキシンが結合したMIPの分離後、アフラトキシンのMIPとの化学結合を崩壊しうる溶媒で処理することにより、アフラトキシンをMIPから除去することができる。しかし、アフラトキシンの結合に対するMIPの親和性と除去しうる結合したアフラトキシンの量との間には平衡がある。ある態様において、アフラトキシンに対して高い親和性を有するMIPについて、例えば、対応するNIPと比べて、MIPは、溶媒存在下、材料から捕捉したアフラトキシンの約25％、20％、15％、10％、5％、1％またはそれ未満を遊離する。特定の態様において、前に捕捉されたアフラトキシンが適切かつ十分な量の有機溶媒洗浄により事前に除去されており、したがって通常のLC-UVもしくはLC-蛍光、またはLC-MS定量法を用いて、MIP材料から浸出する検出可能な量のアフラトキシンは見られない、MIPを再使用することが望ましい。

アフラトキシンの捕捉のためにMIPを用いる方法の別の任意の段階は、MIPによる処理の前に、材料中のアフラトキシンの量（すなわち、十億分率（ppb））を検出することである。加えて、材料を、MIPによる処理中および/または処理後に再度試験して、アフラトキシンの捕捉率を判定してもよい。さらに、用いる特定のMIPに依存して、あらかじめ決められた濃度のアフラトキシンを捕捉するのに必要なMIPの量を解明してもよい。さらに、アフラトキシンと複合体形成したMIPを、いったん材料から分離した後、捕捉したアフラトキシン濃度について試験してもよい。

定量的吸着効果を、UPLC-Xevo-TQD MS/MS（Waters Corp.）を用いて判定することができる。例えば、水/0.1％ギ酸（v/v）およびメタノール/0.1％メタノール（v/v）の勾配を用い、分析物をAcquity UPLC(登録商標) BEH C18 1.7 μm 2.1×50mmカラム（Waters. Corp.）上で分離することができる。緩衝液およびミルク中のAFM1/AFB1/アフラトキシン鋳型の分析のために、C13-AFB1同位体の希釈および正規化技術を用いて、方法を最適化する。

アフラトキシンM1鋳型分子の合成
実施例1 4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-鋳型-1）の調製：
酢酸（12.5ml）中の4-クロロアセト酢酸エチル（26.6g）、および濃硫酸（6.25ml）の冷溶液を、酢酸（50.0ml）中の3,5-ジメトキシフェノール（25.0g）の溶液に、窒素雰囲気下、8〜10℃で15分間かけて滴加した。反応混合物を20〜25℃で1時間連続的に撹拌し、60℃までゆっくり加熱し、55〜60℃で12時間撹拌した。反応混合物を40℃まで冷却し、熱水（150.0ml）を40〜45℃で30分かけて滴加した。混合物を室温まで冷却し、1時間撹拌して、生成物を沈澱させた。生成物をろ過し、水（2×25ml）で洗浄し、30分間吸引乾燥した。冷メタノール（50.0ml）を粗生成物に加え、スラリーを8〜10℃で30分間撹拌した。生成物をろ過し、冷メタノール（2×25ml）で洗浄し、減圧下で乾燥して、最終生成物、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-鋳型-1）を得、これは白色飛散性粉末（39g）の外観を有していた。得られた生成物を持ち越し、そのまま次の段階で用いた。

実施例2 4-(2,2-ジカルボエトキシ-エチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-中間体-1）の調製：
ジエチルマロン酸エステル（32.75g）を、アセトニトリル（400ml）中の4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-鋳型-1、40.0g）、18-クラウン-6（4.96g）、およびヨウ化カリウム（3.12g）の混合物に、窒素雰囲気下、室温で加えた。カリウム-t-ブトキシド（t-BuOK、22.8g）を室温で反応混合物に一度に加えた（わずかに発熱）。反応混合物（懸濁液）の温度をゆっくり40℃まで上昇させ、次いで窒素雰囲気下、35〜40℃で24時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、35〜40℃、減圧下で蒸発乾固し、黄色半固体残渣を得た。残渣を水（200ml）および酢酸エチル（400ml）の混合物に撹拌しながら溶解した。混合物のpHを希塩酸で5に調節した。有機層を水層から分離し、水層を酢酸エチル（2×200ml）でさらに抽出した。無水硫酸ナトリウム（100g）で乾燥した有機層を合わせ、ろ過した。ろ液を35〜40℃、減圧下で濃縮乾固して、4-(2,2-ジカルボエトキシ-エチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-中間体-1）を得、これは黄色固体（58g）の外観を有していた。得られた生成物を持ち越し、そのまま次の段階で用いた。

実施例3 二塩基酸（AFM-中間体-2）の調製：
水酸化ナトリウムのペレット（15.6g）をエチルアルコール（290ml）中の4-(2,2-ジカルボエトキシ-エチル)-5,7-ジメトキシクマリン（AFM-中間体-1、58.0g）の懸濁液に室温で加えた。反応混合物（懸濁液）の温度を60℃までゆっくり上昇させ、次いで60〜65℃で3時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで混合物のpHを濃塩酸で2に調節して、生成物を沈澱させた。スラリーを10℃の温度まで冷却し、8〜10℃で1時間撹拌して、生成物の沈澱を完了した。生成物をろ過し（収穫-1）、次いで減圧下、20〜25℃で蒸留することにより、母液からエタノールを留去し、次いで濃縮部分を10℃に冷却して、生成物を沈澱させ、これをろ過した（収穫-2）。合わせた生成物をメタノールおよび水の1：1（v/v）混合物（2×200ml）で洗浄し、次いで減圧下でさらに乾燥して、二塩基酸（AFM-中間体-2）を得、これは黄色固体（45g）の外観を有していた。得られた生成物を持ち越し、そのまま次の段階で用いた。

実施例4 一塩基酸（AFM-中間体-3）の調製：
二塩基酸（AFM-中間体-2、30g）をm-キシレン（300ml）に室温で懸濁した。反応混合物（懸濁液）の温度を135℃までゆっくり上昇させ、次いで135〜140℃で12時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで生成した沈澱をろ過した。沈澱をn-ヘキサン（2×100ml）で洗浄し、減圧下で乾燥して、一塩基酸（AFM-中間体-3）を得、これは半白色固体（25g）の外観を呈した。得られた生成物を持ち越し、そのまま次の段階で用いた。

実施例5 5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン（AFM-鋳型-2）の調製：
一塩基酸（AFM-中間体-3、4.75g）をポリリン酸（9.50g）に窒素雰囲気下、室温で懸濁した。反応混合物（懸濁液）の温度を75℃までゆっくり上昇させ、次いで70〜75℃で12時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで水（50ml）をゆっくり加えて、過剰のポリリン酸を分解し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。ジクロロメタン（50ml）を反応混合物に加えて15分間撹拌し、有機層を分離した。生成物をジクロロメタン（2×25ml）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム（25g）で乾燥し、減圧下での蒸留により濃縮乾固した。残渣をメタノールに懸濁し、室温で30分間撹拌した。生成物をろ過し、メタノール（2×10ml）で洗浄し、次いで減圧下で乾燥して、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン（AFM-鋳型-2）を得、これは半白色固体（2.5g）の外観を呈した。

実施例6 生成したMIP組成物および特徴：
流動性粉末型のMIPポリマーをそのAFM1（Biopure、Romer Labs(登録商標) Inc, Union、MO）マイコトキシンへの吸着特性およびAFM1マイコトキシンの液体または半液体媒質からの化学的相互作用を介しての除去について試験するために、本開示の態様の開発中に実験を行った。AFM1マイコトキシンの捕捉の親和性における差を示し、かつ材料の特異性を評価するために、本明細書において生成したMIPを用いた。

6つの独立のMIPを、アセトニトリルおよびトルエン（1：3、v/v）の混合物中のAFT-1（1.0mmol、鋳型）、メタクリル酸（2.0mmol、MAA、モノマー）、およびエチレングリコールジメタクリラート（5.0mmol、EGDMA、架橋剤）を窒素雰囲気下、室温で用い、AFT-1とMAAおよびモノマーと架橋剤との異なるモル比（表1）を用いて調製した。溶液を不活性雰囲気下、室温で1時間撹拌した。次いで、アゾ(ビス)-イソブチロニトリル（0.01mmol、AIBN、開始剤）を加え、ゆっくり加熱し、60〜65℃で30分間維持して、MIPミクロスフェアを沈澱させた。2つの独立の非インプリントポリマー（NIP）も、同じ手順によるが、AFT-1非存在下で調製した。鋳型（AFT-1）をMIPから、溶出液のLC-UV、LC-蛍光での分析により判定して、洗液中の鋳型が完全に消失するまでトルエンで持続的に洗浄することにより除去した。

得られたMIPおよびNIPポリマー材料はブロックポリマーとして合成し、これを乳鉢と乳棒で粉砕して粉末とした。NIPポリマー材料は白色で、粉砕して粉末にすると高度に静電性であった。MIPポリマー材料は、赤色のMIP-005（このMIPについては、赤色の異なる合成バッチの鋳型を用いた）以外は、褐色の鋳型の存在により、褐色であった。MIP生成物のトルエン洗浄中に、ごくわずかな色の変化を経験した。しかし、メタノールで洗浄した場合、ポリマー構造から着色鋳型が洗浄されるため、粉末の色は極度に弱まり、薄くなった。粉末型のMIPポリマー材料もいくらか静電性であったが、NIP生成物ほどではなかった。

MIP/NIPの粉末型の膨潤特性を調べた（表2）。発明者らは、MIPの膨潤特性はNIPよりもかなり高いと結論づけた。MIP-001は、緩衝液中でその元のサイズの240％まで膨潤して、最大の体積増大を示した。MIP-002もその元のサイズの200％までの顕著なサイズ増大を示した。MIP-005およびNIP-005だけは、緩衝液に長期間曝露した場合に、サイズ増大を示さないポリマー材料であったが、NIP-004は最小限の11％の体積増大を示した。残りのMIP生成物はすべて、膨潤により、その元のサイズの150〜167％までの中等度のサイズ増大を示した。

（表１）6つのMIPおよびNIP調製のための鋳型対モノマー対架橋剤の比

（表２）各MIP/NIP粉末を、NMRチューブ中、pH6.0の酢酸アンモニウム緩衝溶液に90時間曝露した後の体積膨張の割合

実施例7 生成したMIPを緩衝液中でAFM1に適用した場合の、マイコトキシンに対する捕捉能力
定量的吸着効果を、UPLC-Xevo-TQD MS/MS（UPLC-MS/MSとしても公知）（Waters Corp.）を用いて実施した。水/0.1％ギ酸（v/v）およびメタノール/0.1％メタノール（v/v）の勾配を用い、分析物をAcquity UPLC(登録商標) BEH C18 1.7 μm 2.1×50mmカラム（Waters. Corp.）上で分離した。緩衝液およびミルク中のAFM1/AFB1/AFT-1の分析のために、C13-AFB1同位体の希釈および正規化技術を用いて、方法を最適化した。

即時捕集特性
調査するMIP/NIPの包含率について試験するために、その包含のレベルをpH6.0の環境で材料の0.001〜1.0％（w/v）の勾配をつけることにより、本開示の態様の開発中に実験を行った。AFM1を吸着するためにMIP生成物を用いることの実行可能性を確認するために、いくつかの即時捕集試験を行った。この試験を実施するために、最も低い包含率について、0.01mg、0.1mg、1.0mg、および10.0mgのMIP-005をポリテトラフルオロエチレン（PTFE）フリットの抽出カートリッジに、緩衝液中のスラリー技術を用いてロードした。簡単に言うと、MIPを、緩衝液を用いて懸濁液とし、カートリッジにロードし、秤量して、MIPの正確な量をもとめた。この実験で用いたMIPの量は、0.001％、0.01％、0.1％、および1.0％（w/v）の包含率に相当する。この実験は室温で行った。

ポリマー材料を加え、続いて1倍量（1mL）の水、1倍量のメタノール、および2倍量の緩衝液で連続して溶出することにより、ポリマー材料を「準備」した。次いで、100ng/LのAFM1を加えた緩衝液の溶液1mLを各カートリッジに加え、1分後にAFM1を含まない緩衝液1mLを加えた。これらの最後の2つの溶出液を、AFM1含有量の分析のために、同じシラン処理したUPLCバイアルに回収した。捕集したAFM1を溶出するために、1mL量のメタノールをカートリッジに加え、溶離液を回収した後、1mLのトルエン溶離液を加え、これも同様に分析のため別に回収した。メタノールおよびトルエン溶離液試料を、窒素ガスを用いて乾燥し、分析前に1mLの緩衝液中で再構成した。UPLC-MS/MSを用いての結果の有効な定量を可能にするために、緩衝液中AFM1の公知の濃度の標準品を1、5、10、50、および100ng/Lで作製した。

結果から、1mg/Lの流動性ポリマーは、可能性のあるアフラトキシン標的として選択した100ng/LのAFM1の76.5％を吸着するのに十分であることが判明した（図1）。この包含率を残りのMIP評価のための基準として用いた。固相抽出（SPE）カートリッジに充填し、100％メタノール溶液で溶出した、MIPおよびNIPによる100ng/LのAFM1の即時収着を調べた。発明者らは、吸着は75.2から94.4ng/Lの吸着AFM1の間で変動することを見出した。

メタノールおよびトルエン抽出洗液中に存在するAFM1の量は、AFM1がMIP/NIPによって保持される度合の指標として役立つ。発明者らは、2つの例外を除き、試験した各生成物は、100％メタノールで洗浄すると、31.1から44.4ng/LのAFM1を遊離することを示している。MIP-001は64.3ng/LのAFM1を遊離し、MIP-005は低濃度である22.6ng/LのAFM1を遊離した。しかし、これら2つの生成物を例外として、MIPおよびNIPはそれぞれ類似のAFM1との相互作用強度を示した。各MIP/NIP生成物について、トルエン洗液中にAFM1はほとんど、またはまったく見られなかった。このことは、AFM1の多くはメタノール抽出中に遊離されたという事実、およびトルエンの非極性の性質は極性AFM1の脱離にほとんど影響しないという事実によると考えられる。図1参照。

吸着の動力学
反応の時間および吸着に対するその影響を、90ng/LのAFM1溶液10mLと、pH6.0で、225rpmのオービタルシェーカーでの撹拌下、5〜500分の6つの期間反応させた流動性MIP/NIPを用いて、本開示の態様の開発中に実験を行った。吸着効果を、上清中に残存するマイコトキシンおよびメタノール洗浄後にMIP/NIPから溶出するマイコトキシンを定量することにより測定し、これは吸着効果および選択性を規定するものであった。即時吸着があるという事実により、各生成物について各時点（15、30、60、90分および18時間）のAFM1吸着量を平均した。次いで、すべての試験チューブを3,000rpmで10分間遠心分離し、分析のためにUPLCバイアルに移した。次いで、粉末（MIPまたはNIP）を2mLエッペンドルフチューブに移し、ここに1mLのメタノールを加え、約3秒間ボルテックスにかけた。次いで、各チューブを10,000rpmで5分間遠心分離し、500μLの液体を取り出し、UPLCバイアルに加えた。次いで、試料を、窒素を用いて乾燥し、UPLC-MS/MSシステムによる分析前に500μLの緩衝液中で再構成した。

すべてのポリマーはどの時点でも45〜55％のAFM1を吸着することができ、MIPとNIPとの間で有意でない差が観察された。図2参照。しかし、選択性はMIPとNIPとの間で大きく異なっていた。MIPはそれらの製剤に依存してAFM1を部分的に遊離するにすぎなかった。前の実験でメタノール洗浄後に標的分子の遊離に関して観察された差は、標的分子とMIPとの間の反応時間を長くすると捕捉の安定性が増すが、NIPでは相互作用の安定性が低く、メタノール洗液中により多くの標的化合物を遊離することを明らかに示した。この実験は、MIPのアフラトキシンM1に対する相互作用の明らかな特異性および吸着特性を確立した。さらなる調査により、45〜450ng/mLまで変動する異なる濃度のAFM1を試験したところ、環境中に存在する吸着AFM1と非吸着AFM1との間の化学的平衡により、MIP/NIPはおよそ50％の類似の吸着能力を示すことが判明した。

実施例8 生成したMIPを乳中でAFM1に適用した場合の、マイコトキシンに対する捕捉能力
生乳中225ng/LのAFM1との相互作用におけるMIP（MIP-003）の能力を試験するために、本発明の態様の開発中に実験を行った。LC-MS等級の水中のMIP-003のスラリーを用いて、0.1mg、1.0mg、および10.0mgの粉末をそれぞれのシラン処理した試験チューブに加えた（各試験チューブ中にスラリーから1mLの水）。1mLの水を、粉末を含まないさらに2本の試験チューブに加え、添加およびブランク生乳の両方の形の対照として供した。次いで、AFM1を250ng/Lに添加した生乳9mLを各試験チューブに加えたが、ブランク乳対照は例外とし、これには無添加の乳9mLを加えた。次いで、すべての試験チューブを200rpmに設定したオービタルシェーカー上に室温で1時間置き、その後試験チューブを4,000rpmで10分間遠心分離した。14の100mg C18 SPEカートリッジ（各添加乳試料については三つ組、ブランク乳については二つ組）を、減圧を用いてメタノール1mLおよび水1mLを連続で溶出することにより活性化した。遠心分離後、液体1mLをそれぞれのSPEカートリッジに加え、ブランク乳を除く各試料にアセトニトリル中100ppbのAFB1試料10μLを添加して、内部標準とした。次いで、減圧を用いて液体を溶出し、続いて水1mLを、各カートリッジを通して溶出した。この後、メタノール1mLを各カートリッジに加え、陽圧を用いてシラン処理したUPLCバイアル中に溶出した。溶出後、2つのブランク乳試料の1つにAFM1を225ng/Lに添加し、100ppbのAFB1内部標準溶液10μLを添加した。結果を定量するために、アセトニトリル中1、5、10、25、50、100、250、および500ng/Lの濃度のAFM1の標準を作製した。各試料1mLを窒素気流により乾燥し、緩衝液1mL中で再構成した。次いで、各標準の500μL量に100ppbのAFB1溶液5μLを添加して、検量線を作製した。

0.1％（w/v）の包含率で、MIPは毒素の45.3％を除去することができた。図3に見られるとおり、発明者らは0.1mg（包含率0.001％）および1.0mg（0.01％）の流動性粉末でさえも、それぞれ乳から除去されたAFM1の6.7％および15.4％の範囲の吸着を示すことを確立した。この実験は、0.001％という低い包含率でも、複雑な生乳マトリックス中で特異的にAFM1を標的とする際のMIPの適用可能性を明らかに規定した。

実施例9
最初の試験はAFM1を捕捉するのに必要なMIPの包含のレベルを評価した。MIP-005材料を緩衝液条件で試験した。図5に示すとおり、粉末1mg（0.1％、w/vの包含率に相当）は緩衝液中100ng/LのAFM1溶液からAFM1の76.5％を吸着しうることが判明した。一方、0.001％および0.01％（w/v）の包含率では、AFM1吸着は無視できる結果となった。他方で、1.0％（w/v）の包含率はAFM1の100％の吸着を示した。図5参照。

本明細書において記載するすべての出版物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。

当業者であれば、本開示の新規教示および利点から実質的に逸脱することなく、多くの改変が可能であることを容易に理解するであろう。したがって、すべてのそのような改変は、添付の特許請求の範囲において規定される、本開示の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (42)

1. 以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型：
   

   

   式中
   R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
   R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
   R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。
2. R'がハロ、ヒドロキシおよびアルコキシからなる群より選択される置換基をさらに含む、請求項1記載のアフラトキシン鋳型。
3. 以下の式：
   

   

   を有する単離化合物である、請求項1記載のアフラトキシン鋳型。
4. 下記：
   

   

   およびその組み合わせからなる群より選択される単離化合物である、請求項1記載のアフラトキシン鋳型。
5. 式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
   3,5-ジメトキシフェノールを4-クロロアセト酢酸エチルと酸中で反応させて4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンを生成する段階。
6. アフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
   式：
   

   

   の一塩基酸をポリリン酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階；
   反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：
   

   

   のアフラトキシン鋳型を得る段階。
7. 一塩基酸が、式：
   

   

   の二塩基酸を溶媒に懸濁する段階、および少なくとも100〜140℃に加熱する段階により提供される、請求項6記載の方法。
8. アフラトキシン鋳型化合物の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
   ジエチル中間体2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸エステルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階；および
   二塩基酸類縁体を沈澱させて式：
   

   

   のアフラトキシン鋳型を単離する段階。
9. 2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを、以下の段階を含む方法によって調製する、請求項8記載の合成法：
   4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンをマロン酸ジエチル、ヨウ化カリウム、およびクラウンエーテルと極性溶媒中で合わせて混合物を生成する段階；および
   カリウムブトキシドを混合物に加えて2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを生成する段階。
10. 式（I）のアフラトキシン鋳型の合成法であって、以下の段階を含む、方法：
    2-((5,7-ジメトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)メチル)マロン酸ジエチルを脱保護して二塩基酸類縁体を生成する段階、および式：
    

    

    の二塩基酸類縁体を沈澱させる段階；
    二塩基酸類縁体を溶媒に懸濁する段階、少なくとも100〜140℃に加熱する段階、および式：
    

    

    の一塩基酸を沈澱させる段階；
    一塩基酸を酸に懸濁する段階、および少なくとも50℃に加熱する段階、反応混合物を50℃未満に冷却する段階、および水溶液を加えて式：
    

    

    の化合物を得る段階。
11. モノマーから作製された架橋ポリマーと以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型との複合体を含む、分子インプリントポリマー中間体：
    

    

    式中
    R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
    R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
    式中
    R₁がR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。
12. アフラトキシン鋳型とモノマーとの比が約100：1〜1：100である、請求項11記載の分子インプリントポリマー中間体。
13. モノマーと架橋剤との比が約1：4.1〜1：10である、請求項11記載の分子インプリントポリマー中間体。
14. 式（I）のアフラトキシン鋳型が4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項11記載の分子インプリントポリマー中間体。
15. モノマーから作製された架橋ポリマーを含む分子インプリントポリマーであって、複数の空洞を有し、ここで空洞の少なくとも1つが以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、分子インプリントポリマー：
    

    

    式中
    R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
    R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
    式中
    R₁がR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される。
16. アフラトキシン鋳型が4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリンである、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
17. アフラトキシン鋳型化合物が5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリンである、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
18. モノマーがメタクリル酸、2-ビニルピリジン、メタクリル酸2-ヒドロキシエチルおよびその組み合わせである、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
19. 架橋剤がジメタクリル酸エチレングリコールである、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
20. アフラトキシン鋳型とモノマーとの比が約100：1〜1：100である、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
21. モノマーと架橋剤との比が約1：4.1〜1：10である、請求項15記載の分子インプリントポリマー。
22. 分子インプリントポリマーの作製法であって、以下の段階を含む、方法：
    以下の式（I）：
    

    

    を有するアフラトキシン鋳型を提供する段階であって、
    式中
    R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
    R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
    式中
    R₁がR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
    アフラトキシン鋳型を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階；
    モノマーおよび1つまたは複数の架橋剤を重合させて分子インプリントポリマー中間体を生成する段階；および
    分子インプリントポリマー中間体からアフラトキシン鋳型を除去して分子インプリントポリマーを生成する段階。
23. アフラトキシン鋳型化合物を少なくとも1つのモノマーおよび1つまたは複数の架橋剤と合わせる段階が、モノマーおよび架橋剤を1つまたは複数の有機溶媒の溶液中で混合することを含む、請求項22記載の方法。
24. 1つまたは複数の溶媒がアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液、およびアセトニトリル、トルエン、シクロヘキサン、ポリビニルアルコール水溶液のうち2つ以上の混合物からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
25. 開始剤を加える段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
26. 開始剤がアゾ(ビス)-イソブチロニトリル（AIBN）であり、ここでAIBNの熱分解によってフリーラジカルが生成し、開始剤として作用する、請求項25記載の方法。
27. 前記重合を、有機溶媒中、55〜110℃の温度でフリーラジカルを生成することにより開始する、請求項26記載の方法。
28. アフラトキシン鋳型が5,7-ジメトキシシクロペンテノン[2,3-c]クマリン、4-(2-クロロエチル)-5,7-ジメトキシクマリン、またはその組み合わせを含む、請求項22記載の方法。
29. 分子インプリントポリマー中間体からのアフラトキシン鋳型の除去が、分子インプリントポリマー中間体を溶媒で洗浄する段階を含む、請求項22記載の方法。
30. 前記有機溶媒がエチルアルコール、メチルアルコール、アセトニトリル、トルエン、およびその混合物の群より選択される、請求項34記載の方法。
31. 前記分子インプリントポリマーを前記1回または複数回の洗浄後に乾燥する、請求項22記載の方法。
32. 請求項22記載の方法によって調製した分子インプリントポリマー。
33. アフラトキシンを捕捉する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    空洞の少なくとも1つが以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって：
    

    

    式中
    R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
    R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
    式中
    R₁がR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
    任意でアフラトキシンを含む材料を提供する段階；および
    分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階。
34. 材料が液体、固体、または気体である、請求項33記載の方法。
35. 材料が土壌、香辛料、飲料、食糧、動物飼料、薬学的組成物、栄養学的組成物、および美容組成物からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
36. 材料が乳である、請求項35記載の方法。
37. 分子インプリントポリマーを材料と、少なくとも1秒間接触させる、請求項33記載の方法。
38. 分子インプリント材料を材料から分離する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
39. 分子インプリントポリマーの分離が、ろ過または遠心分離によって分離する段階を含む、請求項33記載の方法。
40. 分子インプリントポリマーと複合したアフラトキシンの量を検出する段階、分子インプリントポリマーと接触した後の材料中のアフラトキシンの量を検出する段階、またはその両方をさらに含む、請求項33記載の方法。
41. アフラトキシンを捕捉する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    (a）少なくとも1つの空洞が以下の式（I）を有するアフラトキシン鋳型を用いて作製される、複数の空洞を有する分子インプリントポリマーを提供する段階であって：
    

    

    式中
    R₁がH、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、およびハロ置換C_1-6アルキルから選択され；
    R₂がハロ、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、ハロ置換C_1-6アルキル、CH₂C(O)OR'、およびCH(C(O)OR')₂から選択され；ここでR'がH、C_1-6アルキル、および置換C_1-6アルキルから選択され；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、あるいは
    式中
    R₁がR₂と一緒にC_4-7シクロアルキル環、ハロ置換C_4-7シクロアルキル環、オキソ置換C_4-7シクロアルキル環、C_4-7シクロアルコキシ環、ヒドロキシ置換C_4-7シクロアルキル環およびカルボキシル基置換C_4-7シクロアルキルを形成し；かつ
    R₃がH、C_1-6アルコキシ、および置換C_1-6アルキルから選択される、段階；
    (b）アフラトキシンを含む材料を提供する段階；および
    (c）分子インプリントポリマーを材料と接触させる段階であって、分子インプリントポリマーが材料の単位あたり少なくとも40重量パーセントのアフラトキシンを捕捉する、段階。
42. 材料が液体であり、かつ分子インプリントポリマーが材料の体積あたりアフラトキシンの重量の少なくとも40パーセントを捕捉する、請求項41記載の方法。

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