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JP2016016267A - Artificial skin and method for producing the same - Google Patents

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JP2016016267A
JP2016016267A JP2014142724A JP2014142724A JP2016016267A JP 2016016267 A JP2016016267 A JP 2016016267A JP 2014142724 A JP2014142724 A JP 2014142724A JP 2014142724 A JP2014142724 A JP 2014142724A JP 2016016267 A JP2016016267 A JP 2016016267A
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典弥 松▲崎▼
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誠治 小池
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謙一郎 日渡
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雄 山口
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an artificial skin having a hair follicle-like structure formed in a cutis layer and having a structure closer to a living organism constructed, and to provide a method for producing the same.SOLUTION: In one or more embodiments, the artificial skin comprises a cutis layer comprising fibroblasts and an extracellular matrix component, and an epidermal layer, where the cutis layer includes a hair follicle-like structure. In one or more embodiments, the method for producing the artificial skin comprises: forming a cell layer comprising a cell aggregate containing hair papilla cells and cells coated with a film containing three dimensionally arranged extracellular matrix component; and arranging epidermal keratinocytes on the cell layer and cultivating the same, where the cell aggregate comprises a cluster of cells including the hair papilla cells, and a layer covering the same, which contains the epidermal keratinocytes.SELECTED DRAWING: Figure 5

Description

本開示は、人工皮膚及びその製造方法に関する。   The present disclosure relates to artificial skin and a method for manufacturing the same.

化粧品、医薬品及び医薬部外品等といったヒトに直接適用される物質の研究開発において、薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった物質の評価試験は重要である。これらの試験は、従来、マウスやラット等の動物を用いて行われているが、近年、動物愛護の観点から動物実験の見直しが求められている。物実験に代わる実験方法の１つとして、人工皮膚モデルを用いたin vitro試験等があり、そのため様々な人工皮膚等の研究が行われている。   In the research and development of substances directly applied to humans such as cosmetics, pharmaceuticals and quasi drugs, substance evaluation tests such as drug efficacy tests, pharmacological tests and safety tests are important. These tests are conventionally performed using animals such as mice and rats, but in recent years, animal experiments have been requested to be reviewed from the viewpoint of animal welfare. One of the experimental methods that can replace the physical experiment is an in vitro test using an artificial skin model, and various artificial skins have been studied.

特許文献１は、毛乳頭細胞スフェロイド及びそれを含有する発毛誘導剤を開示する。同文献は、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを含む真皮層と表皮層とを有する人工皮膚組織に毛乳頭細胞スフェロイドを移植することを開示する。
特許文献２は、毛乳頭細胞とケラチノサイトとからなるスフェロイドをコラーゲンゲルに播種してさらにコラーゲンゲルを重層した後、ケラチノサイトを播種して培養した人工皮膚を開示する。
特許文献３は、真皮組織層と表皮層とを有する人工皮膚モデルであって、真皮組織層内に組織付属器官を含むことを開示する。
特許文献４は、ヒト又は動物から抜出して得た毛包又はその断片を真皮代用基質に移植することを含む皮膚代用物の製造方法を開示する。
特許文献５は、組織付属器官を構成する細胞をコラーゲンマトリックス層に配置して培養することによって組織付属器官様構造体を含む人工組織及びその製造方法を開示する。 Patent document 1 discloses a hair papilla cell spheroid and a hair growth inducer containing the same. This document discloses transplanting hair papilla cell spheroids into an artificial skin tissue having a dermis layer containing a collagen gel containing fibroblasts and an epidermis layer.
Patent Document 2 discloses an artificial skin in which a spheroid composed of dermal papilla cells and keratinocytes is seeded on a collagen gel, further overlaid with a collagen gel, and then seeded and cultured with keratinocytes.
Patent Document 3 discloses an artificial skin model having a dermis tissue layer and an epidermis layer, and including a tissue appendage organ in the dermis tissue layer.
Patent Document 4 discloses a method for producing a skin substitute comprising transplanting a hair follicle or a fragment thereof obtained by extraction from a human or animal onto a dermis substitute substrate.
Patent Document 5 discloses an artificial tissue including a tissue appendage-like structure by culturing cells constituting a tissue appendage in a collagen matrix layer and a method for producing the same.

特開平１１−１８０８７８号公報（特許４３２４９８８）Japanese Patent Laid-Open No. 11-180878 (Patent No. 4324898) 特開２００８−１２５５４０号公報（特許５０９７３８７）JP 2008-125540 A (Patent 5097387) 特開２０１２−２０５５１６号公報JP 2012-205516 A 特開平１−８９７４号公報（特許２７３３８３８）Japanese Patent Laid-Open No. 1-8974 (Patent 2733838) 特開２００５−３０５１７７号公報JP 2005-305177 A

本開示は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織を備える真皮層を有する人工皮膚及びその製造方法を提供する。   In one or a plurality of embodiments, the present disclosure provides an artificial skin having a dermis layer including a hair follicle-like tissue and a method for manufacturing the same.

本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える人工皮膚に関する。   In one or a plurality of embodiments, the present disclosure relates to an artificial skin having a dermis layer and an epidermis layer including fibroblasts and an extracellular matrix component, and the dermis layer further includes a hair follicle-like tissue.

本開示は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞を含む細胞集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する人工皮膚の製造方法に関する。   In one or a plurality of embodiments, the present disclosure forms a cell layer including a cell aggregate including hair papilla cells and a cell coated with a coating including a three-dimensionally arranged extracellular matrix component, And culturing epidermal keratinocytes on the cell layer, wherein the cell aggregate comprises an aggregate of cells containing hair papilla cells and a layer containing epidermal keratinocytes covering the cell aggregate. It relates to a manufacturing method.

本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む人工皮膚の製造方法に関する。 In one or a plurality of embodiments of the present disclosure, 4 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / cm 2 of hair papilla cells coated with a coating containing an extracellular matrix component are disposed to form a hair papilla cell layer. And an artificial skin production method comprising placing and culturing epidermal keratinocytes on the dermal papilla cell layer.

本開示によれば、一又は複数の実施形態において、真皮層内に毛包様組織を備える人工皮膚を提供できる。   According to the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, an artificial skin including a hair follicle-like tissue in the dermis layer can be provided.

図１Ａ及びＢは、実施例１において毛乳頭細胞の局在位置変化を蛍光顕微鏡で観察した結果の一例であって、図１Ａは三次元組織作製直後の組織上面の蛍光顕微鏡像であり、図１Ｂは一週間半気相暴露培養した三次元組織の上面の蛍光顕微鏡像である。FIGS. 1A and 1B are examples of the results of observing changes in localized positions of dermal papilla cells with a fluorescence microscope in Example 1, and FIG. 1A is a fluorescence microscope image of the upper surface of the tissue immediately after preparation of the three-dimensional tissue. 1B is a fluorescence microscopic image of the upper surface of a three-dimensional tissue cultured for half a week by gas phase exposure. 図２Ａ及びＢは、実施例１において組織の形態変化を半気相暴露培養した三次元組織のＨＥ組織切片像で観察した結果の一例であって、図２Ａは三次元組織を一週間培養した組織切片像（ＨＥ切片）であり、図２Ｂは二週間、半気相暴露培養した組織切片像（ＨＥ切片）である。2A and 2B are examples of the results of observation of the morphological change of the tissue in the HE tissue section image of the three-dimensional tissue cultured in the semi-vapor phase exposure in Example 1, and FIG. 2A is a one-dimensional culture of the three-dimensional tissue. FIG. 2B is a tissue section image (HE section) obtained by culturing by semi-gas phase exposure for 2 weeks. 図３は二重細胞集合体の作製過程を示す画像の一例であって、図３Ａは二重細胞集合体の位相差顕微鏡像であり、図３Ｂは二重細胞集合体の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。FIG. 3 is an example of an image showing a production process of a double cell aggregate, FIG. 3A is a phase contrast microscopic image of the double cell aggregate, and FIG. 3B is a tissue section (HE section of the double cell aggregate. ). 図４は人工皮膚の作製工程を示す概略図である。FIG. 4 is a schematic view showing a process for producing artificial skin. 図５Ａ及びＢは、実施例２において細胞集合体の形態変化観察を行った結果の一例であって、図５ＡはＫＣ播種直後の組織切片（ＨＥ染色）であり、図５ＢはＫＣ播種から一週間半気相暴露培養した組織切片（サイトケラチン（ＣＫ）染色）の顕微鏡像である。5A and 5B are examples of the results of morphological change observation of cell aggregates in Example 2. FIG. 5A is a tissue section (HE staining) immediately after KC seeding, and FIG. 5B is one from KC seeding. It is a microscope image of the tissue section | slice (cytokeratin (CK) dyeing | staining) culture | cultivated by the semi-gas phase exposure for a week. 図６は、参考例２で作製した三次元組織の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。6 is a microscopic image of a tissue section (HE section) of the three-dimensional tissue prepared in Reference Example 2. FIG. 図７は、実施例３で作製した人工皮膚の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。FIG. 7 is a microscopic image of a tissue section (HE section) of the artificial skin prepared in Example 3.

本開示において「人工皮膚」は、真皮層を構成する成分となる細胞外マトリックス成分（以下、「ＥＣＭ成分」ともいう）と線維芽細胞とを含む真皮層と表皮層とを有し、真皮層が毛包様組織を備える。   In the present disclosure, the “artificial skin” has a dermis layer and an epidermis layer containing an extracellular matrix component (hereinafter also referred to as “ECM component”) that is a component constituting the dermis layer and fibroblasts, and the dermis layer Comprises hair follicle-like tissue.

本開示において「毛包様組織」は、一又は複数の実施形態において、真皮層内に存在し、かつ毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とその凝集体を覆う表皮角化細胞（ケラチノサイト）とを有する。毛包様組織は、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞で覆われた毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体を真皮層内で培養したものを含む。また、毛包様組織は、一又は複数の実施形態において、真皮層内で培養することによって成長したものを含む。毛包様組織の形状は、一又は複数の実施形態において、楕円形及び球根形等が挙げられる。   In one or more embodiments of the present disclosure, the “hair follicle-like tissue” is an aggregate of cells that are present in the dermis layer and contain hair papilla cells, and epidermal keratinocytes (keratinocytes) that cover the aggregate. Have In one or a plurality of embodiments, the hair follicle-like tissue includes an aggregate of cells including hair papilla cells covered with epidermal keratinocytes cultured in the dermis layer. In addition, in one or more embodiments, the hair follicle-like tissue includes those grown by culturing in the dermis layer. Examples of the shape of the hair follicle-like tissue include an oval shape and a bulb shape in one or more embodiments.

本開示において「真皮層」は、線維芽細胞を含む細胞とＥＣＭ成分との集合体で構成され、その内部に少なくとも毛包様組織を備える。真皮層は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞以外の細胞を含んでいてもよい。線維芽細胞以外の細胞としては、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、樹状細胞、メラニン細胞、脂肪細胞等が挙げられる。真皮層に含まれる線維芽細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が好ましく、１×１０４〜５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３がさらに好ましく、１×１０６〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が最も好ましい。真皮層は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織以外の組織付属器官及び／又はそれを構成する細胞を含んでいてもよい。ＥＣＭ成分としては、後述の例又は特許４９４１９４６４号及び特開２０１２−１１５２５４号に開示のものが挙げられる。 In the present disclosure, the “dermis layer” is composed of an assembly of cells including fibroblasts and an ECM component, and includes at least a hair follicle-like tissue therein. The dermis layer may contain cells other than fibroblasts in one or more embodiments. Examples of cells other than fibroblasts include, in one or more embodiments, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, dendritic cells, melanocytes, adipocytes, and the like. The concentration of fibroblasts contained in the dermis layer is preferably 1 × 10 2 to 1 × 10 10 cells / cm 3 because artificial skin close to human skin is obtained in one or more embodiments. × 10 4 to 5 × 10 9 cells / cm 3 is more preferable, and 1 × 10 6 to 1 × 10 9 cells / cm 3 is most preferable. In one or a plurality of embodiments, the dermis layer may include tissue appendages other than hair follicle-like tissue and / or cells constituting the tissue appendage. Examples of the ECM component include those described later or those disclosed in Japanese Patent No. 49419464 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-115254.

本開示において「表皮層」とは、一又は複数の実施形態において、真皮層上に形成された表皮角化細胞を含む細胞層をいう。表皮層は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に表皮角化細胞を配置した後、半気相暴露培養して表皮角化細胞を分化誘導させることによって形成することができる。   In the present disclosure, the “epidermal layer” refers to a cell layer including epidermal keratinocytes formed on the dermis layer in one or a plurality of embodiments. In one or a plurality of embodiments, the epidermis layer can be formed by placing epidermal keratinocytes on the cell layer and then inducing differentiation of the epidermis keratinocytes by exposure to a semi-gas phase.

本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、発毛、育毛及び／又は除毛の評価を行うための皮膚モデルとして使用できる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、発毛等の評価のみならず、被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価に用いることができる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性当の評価に用いることができる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、脱毛症や火傷等による皮膚損傷の治療のための移植用皮膚として使用できる。   In one or a plurality of embodiments, the artificial skin of the present disclosure can be used as a skin model for evaluating hair growth, hair growth and / or hair removal. In one or a plurality of embodiments, the artificial skin of the present disclosure can be used not only for evaluation of hair growth and the like, but also for drug evaluation such as a medicinal effect test, a pharmacological test, a safety test, etc. on the skin of the test substance. In one or a plurality of embodiments, the artificial skin of the present disclosure can be used for evaluation of skin safety, skin corrosivity, skin irritation, and skin permeability. In one or a plurality of embodiments, the artificial skin of the present disclosure can be used as a skin for transplantation for the treatment of skin damage caused by alopecia, burns, and the like.

［人工皮膚］
本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、真皮層は毛包様組織を備える人工皮膚（以下、「本開示の人工皮膚」ともいう）に関する。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、真皮層内に毛包様組織を備え、より生体に近い人工皮膚であるという効果を奏する。本開示の人工皮膚は、後述する本開示の人工皮膚の製造方法により製造できる。 [Artificial skin]
In one or a plurality of embodiments of the present disclosure, the present disclosure has a dermis layer and an epidermis layer including fibroblasts and extracellular matrix components, and the dermis layer includes artificial follicle-like tissue (hereinafter referred to as “the present disclosure”). Also referred to as “artificial skin”. In one or a plurality of embodiments, the artificial skin of the present disclosure has an effect that the artificial skin is provided with a hair follicle-like tissue in the dermis layer and is closer to a living body. The artificial skin of this indication can be manufactured with the manufacturing method of the artificial skin of this indication mentioned below.

真皮層に含まれる線維芽細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が好ましく、１×１０４〜５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３がさらに好ましく、１×１０６〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が最も好ましい。 The concentration of fibroblasts contained in the dermis layer is preferably 1 × 10 2 to 1 × 10 10 cells / cm 3 because artificial skin close to human skin is obtained in one or more embodiments. × 10 4 to 5 × 10 9 cells / cm 3 is more preferable, and 1 × 10 6 to 1 × 10 9 cells / cm 3 is most preferable.

真皮層における毛包様組織の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。 The number of hair follicles like tissue in the dermis layer, in one or more embodiments, since the artificial skin is obtained close to the human skin, is preferably 1 to 500 pieces / cm 2, is 2 to 250 pieces / cm 2 More preferably, 3 to 150 / cm 2 is most preferable.

真皮層は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞（以下、「コート線維芽細胞」ともいう）を三次元に配置し培養することを含む製造方法により製造されたものである。   In one or a plurality of embodiments, the dermis layer is produced by arranging and culturing fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component (hereinafter also referred to as “coated fibroblasts”) in three dimensions. Produced by the method.

真皮層は、一又は複数の実施形態において、管状組織を備える。管状組織は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織と近接していることが好ましい。本開示において「毛包様組織と管状組織とが近接する」とは、毛包様組織と管状組織とが近くに位置していることをいう。「毛包様組織と管状組織とが近接する」としては、一又は複数の実施形態において、毛包様組織と管状組織とが接していること、毛包様組織と管状組織との間で物質等の移動が可能な位置にあること等を含む。管状組織は、一又は複数の実施形態において、１又は複数の分岐部を有する中空構造である。管状組織は、一又は複数の実施形態において、毛細血管網様組織ということができる。管状組織の壁面は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞を含み、実質的に血管内皮細胞によって構成されていることが好ましい。   The dermal layer comprises tubular tissue in one or more embodiments. The tubular tissue is preferably proximate to the hair follicle-like tissue in one or more embodiments. In the present disclosure, “the hair follicle-like tissue and the tubular tissue are close to each other” means that the hair follicle-like tissue and the tubular tissue are located close to each other. “The hair follicle-like tissue and the tubular tissue are close to each other” means that in one or more embodiments, the hair follicle-like tissue and the tubular tissue are in contact with each other, and the substance between the hair follicle-like tissue and the tubular tissue is used. It is in the position which can be moved. The tubular tissue is a hollow structure having one or more branches in one or more embodiments. Tubular tissue may be referred to as a capillary network-like tissue in one or more embodiments. In one or a plurality of embodiments, the wall surface of the tubular tissue preferably contains vascular endothelial cells and is substantially constituted by vascular endothelial cells.

したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、前記真皮層が管状組織に近接する毛包様組織を備える人工皮膚に関する。本形態の人工皮膚は管状組織に近接する毛包様組織を備えるため、一又は複数の実施形態において、in vitroにおいて生体に近い発毛剤・育毛剤の評価モデルを提供できる。すなわち、発毛剤・育毛剤は毛根部の血行を改善することで効果を発揮するもの（ミノキシジルなど）が多く、本形態の人工皮膚によれば、真皮層に管状組織（血管網）を備え、この管状組織が毛包様組織に近接していることから、血行改善により効果を示す発毛剤・育毛剤の評価を行うことが可能になりうるという効果を奏しうる。   Accordingly, the present disclosure, in one or more embodiments, comprises a hair follicle-like tissue having a dermis layer and an epidermis layer comprising fibroblasts and extracellular matrix components, wherein the dermis layer is proximate to tubular tissue. Related to artificial skin. Since the artificial skin of this embodiment includes a hair follicle-like tissue close to a tubular tissue, in one or a plurality of embodiments, an evaluation model for a hair growth agent / hair growth agent that is close to a living body in vitro can be provided. In other words, many hair growth agents and hair growth agents are effective by improving blood circulation at the root of the hair (such as minoxidil), and according to the artificial skin of this embodiment, the dermis layer has a tubular tissue (vascular network). Since this tubular tissue is close to the hair follicle-like tissue, it is possible to obtain an effect that it is possible to evaluate a hair growth agent / hair growth agent that shows an effect by improving blood circulation.

［人工皮膚の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、人工皮膚の製造方法に関する。
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、毛乳頭細胞を含む細胞の集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、前記毛乳頭細胞を含む細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する。 [Method for producing artificial skin]
In one or a plurality of embodiments, the present disclosure relates to a method for manufacturing artificial skin.
The method for producing artificial skin according to the first embodiment of the present disclosure includes a cell layer including an aggregate of cells including dermal papilla cells and cells coated with a coating including an extracellular matrix component arranged in three dimensions. Forming a keratinocyte on the cell layer and culturing, and the cell aggregate containing the dermal papilla cell comprises an aggregate of cells containing the dermal papilla cell and an epidermis angle covering it And a layer containing keratinocytes.

本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、真皮層内に毛包様組織を備える人工皮膚を効率よく製造できる。本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞を含む細胞集合体を、ＥＣＭ成分でコートされた細胞の細胞層内に配置し培養することから、より生体に近い真皮層を備える人工皮膚を製造できる。本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、発毛及び／又は育毛作用を奏しうる毛包様組織を備える人工皮膚を製造できるという効果を奏しうる。   According to the method for manufacturing artificial skin in the first embodiment of the present disclosure, artificial skin having a hair follicle-like tissue in the dermis layer can be efficiently manufactured. According to the method for producing artificial skin in the first embodiment of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, a cell aggregate including hair papilla cells is disposed in a cell layer of cells coated with an ECM component. By culturing, an artificial skin having a dermis layer closer to a living body can be produced. According to the method for manufacturing artificial skin according to the first embodiment of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, an effect that an artificial skin including a hair follicle-like tissue capable of producing hair growth and / or hair growth can be manufactured. Can play.

毛乳頭細胞を含む細胞集合体（以下、「毛乳頭細胞集合体」ともいう）は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と、それを覆う表皮角化細胞を含む層と有する。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、コアシェル構造（二重細胞集合体）であり、コア部は毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体で形成され、シェル部は表皮角化細胞を含む細胞層（膜）で形成される。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞以外の細胞を含んでいてもよい。毛乳頭細胞以外の細胞としては、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞、毛包上皮幹細胞、メラノサイト（色素細胞）、色素幹細胞、外毛根鞘細胞、内毛根鞘細胞、結合組織鞘細胞、毛母細胞、脂肪幹細胞、等が挙げられる。毛乳頭細胞集合体の大きさは、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、直径が、３０〜５００μｍであることが好ましく、５０〜２００μｍであることがさらに好ましい。毛乳頭細胞集合体の形状は、一又は複数の実施形態において、球状である。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、特開２００８−１２５５４０号公報に開示された方法及び実施例を参酌して調製できる。   A cell aggregate containing hair papilla cells (hereinafter also referred to as “hair papilla cell aggregate”) has an aggregate of cells containing hair papilla cells and a layer containing epidermal keratinocytes covering the aggregate. In one or a plurality of embodiments, the dermal papilla cell aggregate is a core-shell structure (double cell aggregate), the core part is formed of an aggregate of cells containing dermal papilla cells, and the shell part is an epidermal keratinocyte. It is formed by a cell layer (membrane) containing In one or a plurality of embodiments, the dermal papilla cell aggregate may contain cells other than dermal papilla cells. Cells other than hair papilla cells are not particularly limited, and in one or more embodiments, epidermal keratinocytes, hair follicle epithelial stem cells, melanocytes (pigment cells), pigment stem cells, outer hair root sheath cells, inner hair root sheath cells , Connective tissue sheath cells, hair matrix cells, adipose stem cells, and the like. In one or a plurality of embodiments, the size of the hair papilla cell aggregate is such that an artificial skin close to human skin is obtained, and thus the diameter is preferably 30 to 500 μm, and preferably 50 to 200 μm. Further preferred. The shape of the dermal papilla cell aggregate is spherical in one or more embodiments. In one or a plurality of embodiments, the hair papilla cell aggregate can be prepared in consideration of the methods and examples disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-125540.

細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞（以下、「コート細胞」ともいう）は、細胞と、ＥＣＭ成分を含む被膜（以下、「ＥＣＭ膜」ともいう）とを有する。
細胞としては、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞が挙げられ、その他には、上皮細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等が挙げられ、中でも線維芽細胞が好ましい。細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞、及び人工多能性幹細胞等の由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、培養細胞であってもよい。培養細胞としては、一又は複数の実施形態において、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
ＥＣＭ膜は、ＥＣＭ成分を含みかつ細胞をコートする膜である。ＥＣＭ膜は、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ成分を１種類又は２種類以上含む。ＥＣＭ膜は、一又は複数の実施形態において、物質Ａ、及び物質Ａと相互作用する物質Ｂを含んでいてもよく、好ましくは物質Ａを含む膜と物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含む。なお、ＥＣＭ成分としての物質Ａと物質Ｂについては、［ＥＣＭ成分］の項で、詳しく説明する。
ＥＣＭ膜の厚みは、適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜１×１０３ｎｍが好ましく、２〜１×１０２ｎｍがさらに好ましく、３〜１×１０２ｎｍが最も好ましい。コート細胞は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法を参酌して調製することができる。 A cell coated with a coating containing an extracellular matrix component (hereinafter also referred to as “coated cell”) has a cell and a coating containing an ECM component (hereinafter also referred to as “ECM membrane”).
Examples of the cell include fibroblasts in one or a plurality of embodiments, and other examples include epithelial cells, tissue stem cells, immune cells, and the like, among which fibroblasts are preferable. In one or a plurality of embodiments, the cell may be a human-derived cell or a non-human cell. In one or a plurality of embodiments, the cell may be a cell derived from an embryonic stem cell, an induced pluripotent stem cell, or the like. The cell may be a cultured cell in one or more embodiments. Examples of the cultured cells include primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells in one or more embodiments. One type of cell may be sufficient and two or more types may be sufficient as it.
An ECM membrane is a membrane that contains an ECM component and coats cells. In one or a plurality of embodiments, the ECM film includes one type or two or more types of ECM components. In one or more embodiments, the ECM film may include a substance A and a substance B that interacts with the substance A, and preferably a film that includes the substance A and a substance B that interacts with the substance A. Including. The substances A and B as ECM components will be described in detail in the section of [ECM component].
The thickness of the ECM film can be determined as appropriate. In one or a plurality of embodiments, an artificial skin close to human skin is obtained, and therefore 1 to 1 × 10 3 nm is preferable, and 2 to 1 × 10 2 nm is more preferable. Preferably, 3 to 1 × 10 2 nm is most preferable. In one or a plurality of embodiments, the coat cell can be prepared in consideration of the method disclosed in JP2012-115254A.

本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、毛乳頭細胞を含む細胞集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成することを含む。   The method for producing artificial skin according to the first embodiment of the present disclosure includes a cell layer including a cell aggregate including dermal papilla cells and a cell coated with a coating including an extracellular matrix component arranged in three dimensions. Forming.

細胞層における毛乳頭細胞集合体の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。 The number of hair papilla cell aggregates in the cell layer, in one or more embodiments, since the artificial skin is obtained close to the human skin, is preferably 1 to 500 pieces / cm 2, 2 to 250 pieces / cm 2 Is more preferable, and 3-150 pieces / cm 2 is most preferable.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成において、配置するコート細胞の数は、毛乳頭細胞集合体の大きさ及び形成する細胞層の厚みに応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。また、コート細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。 In the formation of the cell layer containing the dermal papilla cell aggregate, the number of coat cells to be arranged can be appropriately determined according to the size of the dermal papilla cell aggregate and the thickness of the cell layer to be formed, and in one or a plurality of embodiments From the viewpoint of obtaining artificial skin close to human skin, 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2 is preferable, 6 × 10 5 to 3 × 10 7 cells / cm 2 is more preferable, 1 5 × 10 6 to 1.5 × 10 7 cells / cm 2 is most preferable. In one or a plurality of embodiments, the coated cells are preferably arranged in 1 to 500 layers, more preferably 2 to 100 layers, because artificial skin close to human skin is obtained. It is most preferable to arrange so that 50 layers are laminated.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成において、コート細胞は、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞を含むことが好ましい。配置するＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞の数は、毛乳頭細胞集合体の大きさ及び形成する細胞層の厚みに応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
また、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。 In the formation of the cell layer containing the hair papilla cell aggregate, in one or a plurality of embodiments, the coat cell preferably includes a fibroblast coated with an ECM membrane. The number of fibroblasts coated with the ECM membrane to be arranged can be appropriately determined according to the size of the hair papilla cell aggregate and the thickness of the cell layer to be formed. In one or a plurality of embodiments, the number is close to human skin. Since artificial skin is obtained, 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2 is preferable, 6 × 10 5 to 3 × 10 7 cells / cm 2 is more preferable, and 1.5 × 10 6 to Most preferred is 1.5 × 10 7 cells / cm 2 .
Further, in one or a plurality of embodiments, the fibroblasts coated with the ECM film are preferably arranged in an amount of 1 to 500 layers, and in an arrangement of 2 to 100 layers because an artificial skin close to human skin is obtained. More preferably, it is most preferable to arrange 5 to 50 layers.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞集合体を覆うようにコート細胞を配置することにより形成できる。また、毛乳頭細胞集合体を含む細胞層は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を三次元に配置することによって形成された細胞層内に毛乳頭細胞集合体を導入することにより形成できる。配置する毛乳頭細胞集合体の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。 In one or a plurality of embodiments, the cell layer containing the dermal papilla cell aggregate can be formed by arranging coat cells so as to cover the dermal papilla cell aggregate. Further, in one or a plurality of embodiments, the cell layer containing the hair papilla cell aggregate can be formed by introducing the hair papilla cell aggregate into the cell layer formed by arranging the coat cells in three dimensions. . The number of hair papilla cell aggregates arranged in one or a plurality of embodiments, since the artificial skin is obtained close to the human skin, is preferably 1 to 500 pieces / cm 2, is 2 to 250 pieces / cm 2 More preferably, 3 to 150 / cm 2 is most preferable.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、さらに血管内皮細胞を配置することを含む。血管内皮細胞を配置した場合、毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞層上に配置することが好ましい。   Formation of the cell layer comprising the dermal papilla cell aggregate includes, in one or more embodiments, further placing vascular endothelial cells. When vascular endothelial cells are arranged, the dermal papilla cell aggregate is preferably arranged on the vascular endothelial cell layer in one or a plurality of embodiments.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を配置して細胞層（ベース層）を形成すること、細胞層上に毛乳頭細胞集合体を配置すること、及び細胞上に配置された細胞集合体を覆うようにコート細胞を三次元に配置することを含む。細胞層（ベース層）の形成の一又は複数の実施形態において、ベースコート細胞層は無くても良く、ベース層を作成する際はコート細胞が１層以上、又は２〜５０層積層されるように配置すればよい。配置するコート細胞は、一又は複数の実施形態において、ベース層を作成する場合は、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。 In one or a plurality of embodiments, the formation of the cell layer including the hair papilla cell aggregate is formed by arranging a coat cell to form a cell layer (base layer), and arranging the hair papilla cell aggregate on the cell layer. And arranging the coated cells in three dimensions so as to cover the cell aggregates arranged on the cells. In one or a plurality of embodiments of forming a cell layer (base layer), the base coat cell layer may be omitted, and when forming the base layer, one or more coat cells or 2 to 50 layers are laminated. What is necessary is just to arrange. In one or a plurality of embodiments, when the base layer is formed, the coated cells to be arranged are obtained as artificial skin close to human skin, and 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2. 6 × 10 5 to 3 × 10 7 cells / cm 2 are more preferable, and 1.5 × 10 6 to 1.5 × 10 7 cells / cm 2 are most preferable.

毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、基材上で行うことができる。基材は、一又は複数の実施形態において、多孔質膜を有する。基材としては、一又は複数の実施形態において、トランスウェル（登録商標）、及びセルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。   Formation of the cell layer containing the dermal papilla cell aggregate can be performed on a substrate in one or more embodiments. The substrate has a porous membrane in one or more embodiments. Examples of the substrate include Transwell (registered trademark), Cell Culture Insert (trade name), and the like in one or a plurality of embodiments.

本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、一又は複数の実施形態において、基材上にコート細胞を配置して細胞層（ベース層）を形成することを含んでもよい。   In one or a plurality of embodiments, in one or a plurality of embodiments, the method for manufacturing artificial skin according to the first embodiment of the present disclosure forms a cell layer (base layer) by arranging coated cells on a substrate. May include.

コート細胞の配置後、毛乳頭細胞集合体の配置に先立ち、所定の期間培養を行うことが好ましい。培地は、一又は複数の実施形態において、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培養温度は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、４〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３０〜３７℃が最も好ましい。培養時間は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、１〜２４時間、好ましくは６〜２４時間である。   After the arrangement of the coat cells, it is preferable to perform the culture for a predetermined period prior to the arrangement of the hair papilla cell aggregate. In one or a plurality of embodiments, the medium may include Eagle's MEM medium, Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RDMI, and GlutaMax medium. In one or more embodiments, the medium may be a medium supplemented with serum or a serum-free medium. In one or a plurality of embodiments, the culture temperature is preferably 4 to 60 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, and most preferably 30 to 37 ° C because good artificial skin can be obtained. In one or a plurality of embodiments, the culture time is 1 to 24 hours, preferably 6 to 24 hours, since a good artificial skin is obtained.

本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、細胞集合体を含む細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。表皮角化細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞集合体を含む細胞層の表面を覆うように配置する。表皮角化細胞は、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞の細胞層が１層形成されるように配置することが好ましい。培養は、一又は複数の実施形態において、半気相暴露培養が挙げられる。表面の表皮角化細胞が空気に曝された状態で培養することにより、表皮角化細胞を分化誘導させることによって表皮層を形成することができる。培養温度は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、４〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３０〜３７℃が最も好ましい。培養時間は、一又は複数の実施形態において、培養温度よっても異なるが、に３日以上が好ましく、３〜２８日がさらに好ましく、５〜１４日が最も好ましい。培地としては、上述のものが挙げられる。   The method for producing artificial skin according to the first embodiment of the present disclosure includes placing and culturing epidermal keratinocytes on a cell layer containing cell aggregates. In one or a plurality of embodiments, the epidermal keratinocytes are arranged so as to cover the surface of the cell layer containing the cell aggregate. In one or a plurality of embodiments, the epidermal keratinocytes are preferably arranged so that one cell layer of the epidermal keratinocytes is formed. In one or a plurality of embodiments, the culture includes a semi-gas phase exposure culture. By culturing the epidermal keratinocytes in a state exposed to air, an epidermal layer can be formed by inducing differentiation of the epidermal keratinocytes. In one or a plurality of embodiments, the culture temperature is preferably 4 to 60 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, and most preferably 30 to 37 ° C because good artificial skin can be obtained. In one or a plurality of embodiments, the culture time varies depending on the culture temperature, but is preferably 3 days or more, more preferably 3 to 28 days, and most preferably 5 to 14 days. Examples of the medium include those described above.

本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞の配置から好ましい培養条件を選択することにより３〜３０日、５〜１４日、さらには７日程度で毛包様組織を備える人工皮膚を製造できる。   According to the method for producing artificial skin in the first embodiment of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, 3 to 30 days, 5 to 14 days by selecting preferable culture conditions from the arrangement of epidermal keratinocytes. Furthermore, an artificial skin having a hair follicle-like tissue can be produced in about 7 days.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、ＥＣＭ成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞（以下、「コート毛乳頭細胞」ともいう）を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。コート毛乳頭細胞は、毛乳頭細胞とＥＣＭ膜とを含む。ＥＣＭ膜は上述の通りである。 In the method for producing artificial skin according to the second embodiment of the present disclosure, 4 × 10 5 to 3 × 10 6 hair papilla cells coated with a coating containing an ECM component (hereinafter also referred to as “coated hair papilla cells”). arranging cells / cm 2 to form a dermal papilla cell layer, and arranging and culturing epidermal keratinocytes on the dermal papilla cell layer. Coated dermal papilla cells include dermal papilla cells and an ECM membrane. The ECM film is as described above.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、上記所定の量のコート毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞層と表皮角化細胞とを積層することによって、コアシェル構造の毛乳頭細胞集合体を形成できる。本開示の人工皮膚の第２の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛包様組織の前駆体である毛乳頭細胞集合体が形成されるため、好ましくは毛乳頭細胞集合体の準備を別途行わない場合であっても毛包様組織を備える真皮層を有する人工皮膚を製造できる。   According to the method for manufacturing artificial skin in the second embodiment of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, the hair papilla cell layer containing the predetermined amount of coat hair papilla cells and the epidermal keratinocytes are stacked. Thus, a core-shell structure hair papilla cell aggregate can be formed. According to the second method for producing artificial skin of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, a hair papilla cell aggregate that is a precursor of a hair follicle-like tissue is formed. Even if this preparation is not performed separately, an artificial skin having a dermis layer having a hair follicle-like tissue can be produced.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、より生体に近い真皮層を形成する点から、一又は複数の実施形態において、コート細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含むことが好ましい。コート細胞は、上述の通りであって、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞が挙げられる。細胞層の形成は、少なくともＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞を含む細胞層を形成することが好ましく、コート線維芽細胞以外のコート細胞を配置することを含んでいてもよい。配置するコート線維芽細胞の数は、一又は複数の実施形態において、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
言い換えると、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞が、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚がえられることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積層されるように配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。 In the method for producing artificial skin according to the second embodiment of the present disclosure, from the point of forming a dermis layer closer to a living body, in one or a plurality of embodiments, the coated cells are arranged and cultured in three dimensions to form the cell layer. It preferably includes forming. The coat cell is as described above, and in one or more embodiments, a fibroblast coated with an ECM membrane can be mentioned. The formation of the cell layer preferably forms a cell layer including at least a fibroblast coated with an ECM membrane, and may include arranging a coat cell other than the coat fibroblast. In one or a plurality of embodiments, the number of coated fibroblasts to be arranged is preferably 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2 , and 6 × 10 5 to 3 × 10 7 cells / cm 2. More preferably, 1.5 × 10 6 to 1.5 × 10 7 cells / cm 2 are most preferable.
In other words, in one or a plurality of embodiments, it is preferable to arrange 1 to 500 layers of fibroblasts coated with an ECM membrane, so that 2 to 100 layers are laminated. It is more preferable to arrange them in a stack, and it is most preferable to arrange them so that 5 to 50 layers are laminated.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、コート毛乳頭細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上配置して毛乳頭細胞層を形成することを含む。コート毛乳頭細胞は、真皮層内に形成される毛包様組織の大きさをより大きくする点から、一又は複数の実施形態において、４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成することが好ましく、６×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましく、６×１０５〜２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、９×１０５〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
言い換えると、コート毛乳頭細胞は、一又は複数の実施形態において、少なくとも複数層積層されるように配置することが好ましく、より好ましくは２〜１０層、さらに好ましくは３〜５層である。 The method for producing artificial skin according to the second embodiment of the present disclosure includes disposing coated hair papilla cells at 4 × 10 5 cells / cm 2 or more to form a hair papilla cell layer. The coated hair papilla cells are arranged at 4 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / cm 2 in one or a plurality of embodiments from the viewpoint of increasing the size of the hair follicle-like tissue formed in the dermis layer. It is preferable to form a hair papilla cell layer, more preferably 6 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / cm 2 , further preferably 6 × 10 5 to 2.5 × 10 6 cells / cm 2 , and 9 × 10 5 to 1.5 × 10 6 cells / cm 2 is most preferable.
In other words, in one or a plurality of embodiments, the coated hair papilla cells are preferably arranged so that at least a plurality of layers are laminated, more preferably 2 to 10 layers, and still more preferably 3 to 5 layers.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を含む細胞層上にコート毛乳頭細胞を配置することを含む。配置するコート毛乳頭細胞の数は、上述の通りである。   In one or a plurality of embodiments, the method for producing artificial skin in the second embodiment of the present disclosure includes disposing coated hair papilla cells on a cell layer containing coated cells. The number of coated hair papilla cells to be arranged is as described above.

本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。表皮角化細胞の配置及び培養は、第１の実施形態と同様である。   In one or a plurality of embodiments, the method for producing artificial skin in the second embodiment of the present disclosure includes arranging and culturing epidermal keratinocytes on hair papilla cells. The arrangement and culture of epidermal keratinocytes are the same as in the first embodiment.

［二重細胞集合体の製造方法］
上述の通り、本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、上記所定の量のコート毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞層と表皮角化細胞とを積層することによって、コアシェル構造の毛乳頭細胞集合体を形成できる。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、コート毛乳頭細胞を１×１０２〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む二重細胞集合体の製造方法（以下、「本開示の二重細胞集合体の製造方法」ともいう）に関する。本開示の二重細胞集合体の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞とを含むコアシェル構造の二重細胞集合体を製造することができる。 [Method for producing double cell aggregate]
As described above, according to the method for manufacturing artificial skin according to the second embodiment of the present disclosure, the core shell is obtained by laminating the hair papilla cell layer including the predetermined amount of coated hair papilla cells and the epidermal keratinocytes. A structure of dermal papilla cells can be formed. Therefore, in one or a plurality of embodiments, the present disclosure provides that a dermal papilla cell layer is formed by arranging coated dermal papilla cells at 1 × 10 2 to 1 × 10 4 cells / cm 2 , and the dermal papilla cell layer The present invention relates to a method for producing a double cell aggregate comprising arranging and culturing epidermal keratinocytes (hereinafter also referred to as “the method for producing a double cell aggregate of the present disclosure”). According to the method for producing a double cell aggregate of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, a double cell aggregate having a core-shell structure including an aggregate of dermal papilla cells and epidermal keratinocytes covering the aggregate is produced. can do.

コート毛乳頭細胞は、真皮層内に形成される毛包様組織から毛軸の形成が促進される適切なサイズを作製する点から、一又は複数の実施形態において、５００〜５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することが好ましく、又は２，０００〜３，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することがさらに好ましい。 In one or more embodiments, the coated dermal papilla cells are made from a follicle-like tissue formed in the dermis layer to have an appropriate size that promotes the formation of the hair shaft, and in one or more embodiments, 500 to 5,000 cells / cm. It is preferable to arrange 2 or more preferably arrange 2,000 to 3,000 cells / cm 2 .

二重細胞集合体の製造は、一又は複数の実施形態において、細胞凝集塊の形成に適した基材上で行うことが好ましい。細胞凝集塊の形成に適した基材としては、一又は複数の実施形態において、細胞低吸着処理が行われたウェルプレート等が挙げられる。   In one or a plurality of embodiments, the production of the double cell aggregate is preferably performed on a substrate suitable for forming a cell aggregate. Examples of the substrate suitable for the formation of the cell aggregate include a well plate subjected to a low cell adsorption treatment in one or a plurality of embodiments.

［評価キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の人工皮膚と、本開示の人工皮膚が配置された容器とを含む評価用キット（以下、「本開示の評価用キット」ともいう）に関する。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛等のための被検物質の評価を行うことができる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、発毛等の評価のみならず、被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価に用いることができる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性等の評価に用いることができる。 [Evaluation kit]
In one or a plurality of embodiments, the present disclosure relates to an evaluation kit (hereinafter, also referred to as “evaluation kit of the present disclosure”) including the artificial skin of the present disclosure and a container in which the artificial skin of the present disclosure is disposed. . In one or a plurality of embodiments, the evaluation kit of the present disclosure can evaluate a test substance for hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair suppression, and the like. In one or a plurality of embodiments, the evaluation kit of the present disclosure can be used not only for evaluation of hair growth and the like, but also for drug evaluation such as a drug efficacy test, a pharmacological test, a safety test, and the like of the test substance. In one or a plurality of embodiments, the evaluation kit of the present disclosure can be used for evaluation of skin safety, skin corrosion, skin irritation, skin permeability, and the like.

容器としては、一又は複数の実施形態において、トランスウェル（登録商標）、及びセルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、容器を配置するマルチディッシュ等を含んでいてもよい。   Examples of the container include Transwell (registered trademark) and cell culture insert (trade name) in one or a plurality of embodiments. In one or a plurality of embodiments, the evaluation kit of the present disclosure may include a multi-dish or the like in which containers are arranged.

本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、所定の検査に用いる試薬、材料、及び用具、並びにその評価についての説明書（取扱説明書）の少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。   In one or a plurality of embodiments, the evaluation kit of the present disclosure may further include at least one of a reagent, a material, and a tool used for a predetermined test, and an instruction (instruction manual) for the evaluation. Good.

［評価方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の人工皮膚を用いた被検物質を評価する方法（以下、「本開示の評価方法」ともいう）に関する。本開示の評価方法は、被検物質を、本開示の人工皮膚に接触させること、及び、被検物質の接触による被検物質による人工皮膚への影響を観察することを含む。本開示の評価方法によれば、一又は複数の実施形態において、従来の方法と比較して生体の皮膚に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。評価としては、一又は複数の実施形態において、育毛、発毛、脱毛、除毛、抑毛、薬剤評価、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性等の評価が挙げられる。 [Evaluation method]
In one or a plurality of embodiments, the present disclosure relates to a method for evaluating a test substance using the artificial skin of the present disclosure (hereinafter, also referred to as “evaluation method of the present disclosure”). The evaluation method of the present disclosure includes bringing a test substance into contact with the artificial skin of the present disclosure and observing the influence of the test substance on the artificial skin due to the contact of the test substance. According to the evaluation method of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, the test substance can be evaluated in an environment close to the skin of a living body as compared with the conventional method. In one or a plurality of embodiments, the evaluation method of the present disclosure can be an extremely useful tool in the evaluation of the dynamics of drugs having various molecular weights in the creation (screening) of new drugs, and in the development of cosmetics and quasi drugs. Examples of the evaluation include evaluation of hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, hair suppression, drug evaluation, skin safety, skin corrosivity, skin irritation, skin permeability and the like in one or a plurality of embodiments.

［ＥＣＭ成分］
以下に、ＥＣＭ成分について例を挙げて説明する。 [ECM component]
Below, an example is given and demonstrated about an ECM component.

ＥＣＭ成分としての物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有する高分子とＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子（以下、「相互作用を有する高分子」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子との組み合わせが挙げられる。   As a combination of the substance A and the substance B as the ECM component, in one or a plurality of embodiments, a polymer having an RGD sequence and a polymer that interacts with a polymer having an RGD sequence (hereinafter referred to as “having an interaction”). Or a combination of a polymer having a positive charge and a polymer having a negative charge.

（ＲＧＤ配列を有する高分子）
ＲＧＤ配列を有する高分子とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列を有する高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、元来ＲＧＤ配列を有しないものにＲＧＤ配列を結合させたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する高分子は、生分解性であることが好ましい。ＲＧＤ配列を有する高分子としては、ＲＧＤ配列を有するタンパク質、ＲＧＤ配列を結合させた天然由来高分子、ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子が挙げられる。 (Polymer having RGD sequence)
A polymer having an RGD sequence refers to a polymer having an “Arg-Gly-Asp” (RGD) sequence, which is an amino acid sequence responsible for cell adhesion activity. In the present specification, “having an RGD sequence” may originally have an RGD sequence, or may have an RGD sequence bound to one that originally does not have an RGD sequence. The polymer having an RGD sequence is preferably biodegradable. Examples of the polymer having an RGD sequence include a protein having an RGD sequence, a naturally-derived polymer having an RGD sequence bound thereto, and a synthetic polymer having an RGD sequence bound thereto.

ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン等が挙げられる。   Examples of the protein having an RGD sequence include fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and collagen.

ＲＧＤ配列を結合させた天然由来高分子は、元来ＲＧＤ配列を有しない天然由来高分子に、ＲＧＤ配列を結合させた高分子である。元来ＲＧＤ配列を有しない天然由来高分子としては、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、抗体、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン、ε−ポリリジン、キチン、キトサン等が挙げられる。   The naturally-derived polymer to which the RGD sequence is bound is a polymer in which the RGD sequence is bound to a naturally-derived polymer that does not originally have an RGD sequence. Naturally derived polymers that originally have no RGD sequence include collagen, gelatin, albumin, globulin, proteoglycan, enzyme, antibody, water-soluble polypeptide, low molecular peptide, α-polylysine, ε-polylysine, chitin, chitosan and the like. Can be mentioned.

ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子は、合成高分子にＲＧＤ配列を結合させた高分子である。ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。合成高分子としては、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体；ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。   The synthetic polymer in which the RGD sequence is bonded is a polymer in which the RGD sequence is bonded to the synthetic polymer. The molecular shape of the synthetic polymer to which the RGD sequence is bonded may be any of a linear shape, a graft shape, a comb shape, a dendritic shape, a star shape, a mesh shape, and the like. Synthetic polymers include polyurethane, polycarbonate, polyamide, or a copolymer thereof; polyester, poly (N-isopropylacrylamide-co-polyacrylic acid), polyamideamine dendrimer, polyethylene oxide, polyε-caprolactam, polyacrylamide, Examples include poly (methyl methacrylate-γ-polyoxyethylene methacrylate).

ＲＧＤ配列を有する高分子は、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、ＲＧＤ配列を結合させたキチン、及びＲＧＤ配列を結合させたキトサンが好ましく、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、及びＲＧＤ配列を結合させたゼラチンがさらに好ましい。   Since a polymer having an RGD sequence can provide good artificial skin, among these, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, polylysine, elastin, collagen bound with an RGD sequence, gelatin bound with an RGD sequence, Chitin combined with an RGD sequence and chitosan combined with an RGD sequence are preferable, and fibronectin, vitronectin, laminin, polylysine, collagen combined with an RGD sequence, and gelatin combined with an RGD sequence are more preferable.

（相互作用する高分子）
相互作用する高分子とは、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子をいい、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する天然由来高分子と、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する合成高分子が挙げられる。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子とが結合、接着、吸着、又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する高分子は、生分解性であることが好ましい。 (Interacting polymer)
The interacting polymer refers to a polymer that interacts with a polymer having an RGD sequence, a naturally-derived polymer that interacts with a polymer having an RGD sequence, and a synthesis that interacts with a polymer having an RGD sequence. Examples include polymers. As used herein, “interact” means, in one or more embodiments, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, hydrogen bond, charge transfer interaction, covalent bond formation, specific interaction between proteins. , And / or close proximity to a polymer that interacts with a polymer having an RGD sequence chemically and / or physically by van der Waals force, etc., to the extent that it can be bonded, adhered, adsorbed, or exchanged with electrons. To do. The interacting polymer is preferably biodegradable.

ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が挙げられる。   In one or a plurality of embodiments, the naturally-derived polymer that interacts with a polymer having an RGD sequence includes collagen, gelatin, proteoglycan, integrin, enzyme, antibody, water-soluble polypeptide, low-molecular peptide, polyamino acid, and elastin. , Heparin, heparan sulfate, dextran sulfate, hyaluronic acid and the like. Examples of the polyamino acid include polylysine such as α-polylysine or ε-polylysine, polyglutamic acid, polyaspartic acid and the like in one or a plurality of embodiments.

相互作用する高分子としては、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、エラスチンが好ましく、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、コラーゲンがさらに好ましく、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸が最も好ましい。   As the interacting polymer, good artificial skin can be obtained, and among these, gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, globulin, albumin, polyglutamic acid, collagen, and elastin are preferable, gelatin, dextran sulfate, Heparin, hyaluronic acid and collagen are more preferred, and gelatin, dextran sulfate, heparin and hyaluronic acid are most preferred.

ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用を有する高分子との好ましい組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンとコラーゲン又はゼラチン、等が挙げられる。
中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、ラミニンとゼラチンが好ましく、フィブロネクチンとゼラチンがさらに好ましい。なお、ＲＧＤ配列を有する高分子及び相互作用を有する高分子は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。 In one or a plurality of embodiments, a preferred combination of a polymer having an RGD sequence and a polymer having an interaction includes fibronectin and gelatin, fibronectin and ε-polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and Examples include heparin, fibronectin and collagen, laminin and gelatin, laminin and collagen, polylysine and elastin, vitronectin and collagen, collagen combined with RGD sequence or gelatin combined with RGD sequence and collagen or gelatin.
Among them, fibronectin and gelatin, fibronectin and ε-polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, laminin and gelatin are preferable, and fibronectin and gelatin are more preferable. In addition, the polymer having the RGD sequence and the polymer having the interaction may be one kind each, or two or more kinds may be used in combination within the range showing the interaction.

（正の電荷を有する高分子）
正の電荷を有する高分子とは、正の電荷を有する、天然由来高分子又は合成高分子をいう。正の電荷を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、正の電荷を有する水溶性天然由来高分子が好ましい。正の電荷を有する水溶性天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン、正の電荷を有する水溶性ポリペプチド、正の電荷を有する低分子ペプチド、正の電荷を有するポリアミノ酸、キチン、キトサン等が挙げられる。正の電荷を有するポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン；ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が挙げられる。正の電荷を有する合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。正の電荷を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、正の電荷を有するポリウレタン、ポリアミド、正の電荷を有するポリカーボネート、又はこれらの共重合体；正の電荷を有するポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。 (Polymer with positive charge)
A polymer having a positive charge refers to a naturally-derived polymer or a synthetic polymer having a positive charge. The naturally derived polymer having a positive charge is preferably a water-soluble naturally derived polymer having a positive charge in one or a plurality of embodiments. In one or more embodiments, the water-soluble naturally-derived polymer having a positive charge includes basic collagen, basic gelatin, lysozyme, cytochrome c, peroxidase, myoglobin, water-soluble polypeptide having a positive charge, positive A low molecular weight peptide having a positive charge, a polyamino acid having a positive charge, chitin, chitosan and the like. Examples of the polyamino acid having a positive charge include polylysine such as poly (α-lysine) and poly (ε-lysine); polyarginine, polyhistidine and the like in one or a plurality of embodiments. The molecular shape of the synthetic polymer having a positive charge may be any of a linear shape, a graft shape, a comb shape, a dendritic shape, a star shape, a mesh shape, and the like. In one or a plurality of embodiments, the positively charged synthetic polymer may include a positively charged polyurethane, polyamide, a positively charged polycarbonate, or a copolymer thereof; a positively charged polyester, Examples include diallyldimethylammonium chloride (PDDA), polyallylamine hydrochloride, polyethyleneimine, polyvinylamine, and polyamidoamine dendrimer.

（負の電荷を有する高分子）
負の電荷を有する高分子とは、負の電荷を有する、天然由来高分子又は合成高分子をいう。負の電荷を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、負の電荷を有する水溶性天然由来高分子が好ましい。負の電荷を有する水溶性天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン、負の電荷を有する水溶性ポリペプチド、負の電荷を有する低分子ペプチド、デキストラン硫酸等が挙げられる。負の電荷を有する合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。負の電荷を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、負の電荷を有するポリウレタン、負の電荷を有するポリアミド、負の電荷を有するポリカーボネート、及びこれらの共重合体；負の電荷を有するポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール等が挙げられる。 (Polymer with negative charge)
A negatively charged polymer refers to a naturally derived polymer or a synthetic polymer having a negative charge. The naturally-derived polymer having a negative charge is preferably a water-soluble naturally-derived polymer having a negative charge in one or a plurality of embodiments. In one or more embodiments, the water-soluble naturally-derived polymer having a negative charge includes acidic collagen, acidic gelatin, albumin, globulin, catalase, β-lactoglobulin, thyroglobulin, α-lactalbumin, ovalbumin, Examples thereof include a water-soluble polypeptide having a negative charge, a low molecular weight peptide having a negative charge, and dextran sulfate. The molecular shape of the synthetic polymer having a negative charge may be any of linear, graft, comb, dendritic, star, and network. In one or a plurality of embodiments, the negatively charged synthetic polymer may be a negatively charged polyurethane, a negatively charged polyamide, a negatively charged polycarbonate, and a copolymer thereof; Polyester having poly (acrylic acid), polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide methylpropane sulfonic acid, terminal carboxylated polyethylene glycol and the like.

正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子との好ましい組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ε−ポリリジン塩とポリスチレンスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスチレンスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩が好ましい。ポリスチレンスルホン酸塩としては、一又は複数の実施形態において、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する高分子及び負の電荷を有する高分子は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。   As a preferable combination of a polymer having a positive charge and a polymer having a negative charge, in one or a plurality of embodiments, ε-polylysine salt and polystyrene sulfonate, ε-polylysine and polystyrene sulfonate, chitosan And dextran sulfate, polyallylamine hydrochloride and polystyrene sulfonate, polydiallyldimethylammonium chloride and polystyrene sulfonate, polydiallyldimethylammonium chloride and polyacrylate, etc. Among these, ε-polylysine salt and polysulfonate, polydiallyldimethylammonium chloride and polyacrylate are preferable. Examples of the polystyrene sulfonate include sodium polystyrene sulfonate (PSS) and the like in one or more embodiments. In addition, the polymer having a positive charge and the polymer having a negative charge may each be one kind, or two or more kinds may be used in combination within a range showing an interaction.

本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ａ１］ 線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と、
表皮層とを有し、
前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える、人工皮膚。
［Ａ２］ 前記真皮層は、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の線維芽細胞を含む、［Ａ１］記載の人工皮膚。
［Ａ３］ 前記真皮層は、さらに血管内皮細胞を含む管状組織を備え、
前記毛包様組織と前記管状組織とが近接する、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の人工皮膚。
［Ａ４］ 前記毛包様組織は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と表皮角化細胞とを含む、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ５］ 前記表皮角化細胞は、前記毛乳頭細胞で構成された細胞の凝集体を覆う、［Ａ４］記載の人工皮膚。
［Ａ６］ 前記真皮層は、前記毛包様組織を１〜５００個／ｃｍ２含む、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれか記載の人工皮膚。
［Ａ７］前記毛包様組織は、直径が３０〜５００μｍである、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ８］ 前記毛包様組織の形状は、楕円形である、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ９］ さらに脂肪層を含み、前記脂肪層上に前記真皮層が形成されている、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ１０］ 前記真皮層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養することを含む［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ｂ１］ 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされ、三次元に配置された細胞と、毛乳頭細胞を含む細胞集合体とを含む細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、
前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体ととそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する、人工皮膚の製造方法。
［Ｂ２］ 前記細胞集合体を含む細胞層の形成は、
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を配置して細胞層を形成すること、
前記細胞層上に、前記細胞集合体を配置すること、及び
前記細胞集合体を覆うように細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置することを含む、［Ｂ１］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ３］ 前記細胞集合体は、直径が３０〜５００μｍである、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ４］ 前記細胞層の形成は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ３］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ５］ 前記コートされた線維芽細胞を４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成することを含む、［Ｂ４］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ６］ 前記細胞層の形成は、さらに血管内皮細胞を配置することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ５］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ７］ 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び
前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養すること、を含む人工皮膚の製造方法。
［Ｂ８］ 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含み、
前記細胞層上に前記毛乳頭細胞を配置して前記毛乳頭細胞層を形成することを含む、［Ｂ７］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ９］ 前記表皮角化細胞の配置後の培養は、半気相暴露培養である、［Ｂ１］から［Ｂ８］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｃ１］ ［Ｂ１］から［Ｂ９］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法により製造された、人工皮膚。
［Ｄ１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛の少なくとも一つの評価を行う評価用キット。
［Ｄ２］ ［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性からなる群から選択される少なくとも一つの評価行うための評価用キット。
［Ｅ１］ 人工皮膚を用いた被検物質を評価する方法であって、
前記人工皮膚が、［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚であり、
被検物質を、前記人工皮膚に接触させること、及び、被検物質の接触による被検物質による人工皮膚への影響を観察することを含む評価方法。
［Ｆ１］ 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を５００〜５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む二重細胞集合体の製造方法。
［Ｆ２］ 前記コートされた毛乳頭細胞を、細胞低吸着処理が行われたウェルプレート配置することを含む。［Ｆ１］の二重細胞集合体の製造方法。 The present disclosure may relate to one or more of the following embodiments.
[A1] a dermis layer comprising fibroblasts and extracellular matrix components;
Having a skin layer,
Artificial skin, wherein the dermis layer further comprises hair follicle-like tissue.
[A2] The artificial skin according to [A1], wherein the dermis layer includes 1 × 10 2 to 1 × 10 10 cells / cm 3 fibroblasts.
[A3] The dermis layer further comprises a tubular tissue containing vascular endothelial cells,
The artificial skin according to [A1] or [A2], wherein the hair follicle-like tissue and the tubular tissue are close to each other.
[A4] The artificial skin according to any one of [A1] to [A3], wherein the hair follicle-like tissue includes an aggregate of cells including dermal papilla cells and epidermal keratinocytes.
[A5] The artificial skin according to [A4], wherein the epidermal keratinocytes cover an aggregate of cells composed of the dermal papilla cells.
[A6] The artificial skin according to any one of [A1] to [A5], wherein the dermis layer includes 1 to 500 hair follicle-like tissues / cm 2 .
[A7] The artificial skin according to any one of [A1] to [A6], wherein the hair follicle-like tissue has a diameter of 30 to 500 μm.
[A8] The artificial skin according to any one of [A1] to [A7], wherein the hair follicle-like tissue has an elliptical shape.
[A9] The artificial skin according to any one of [A1] to [A8], further including a fat layer, wherein the dermis layer is formed on the fat layer.
[A10] The artificial skin according to any one of [A1] to [A10], wherein the dermal layer includes three-dimensionally arranging and culturing fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component.
[B1] forming a cell layer coated with a coating containing an extracellular matrix component and three-dimensionally arranged, and a cell aggregate containing hair papilla cells; and keratinization on the cell layer Placing and culturing the cells,
The said cell aggregate is a manufacturing method of artificial skin which has an aggregate of the cell containing a hair papilla cell, and the layer containing the epidermis keratinocyte which covers it.
[B2] Formation of the cell layer containing the cell aggregate is
Placing a cell coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a cell layer;
[B1] description including disposing the cell aggregate on the cell layer, and disposing cells coated with a coating containing an extracellular matrix component so as to cover the cell aggregate in a three-dimensional manner. For producing artificial skin.
[B3] The method for producing artificial skin according to [B1] or [B2], wherein the cell aggregate has a diameter of 30 to 500 μm.
[B4] The formation of the cell layer includes arranging 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2 of fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component, from [B1] The method for producing artificial skin according to any one of [B3].
[B5] The method for producing artificial skin according to [B4], comprising disposing the coated fibroblasts at 4 × 10 5 to 1.5 × 10 8 cells / cm 2 to form a dermal papilla cell layer. .
[B6] The method for producing artificial skin according to any one of [B1] to [B5], wherein the formation of the cell layer further includes arranging vascular endothelial cells.
[B7] A dermal papilla cell layer is formed by arranging 4 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / cm 2 of dermal papilla cells coated with a coating containing an extracellular matrix component, and on the dermal papilla cell layer A method for producing artificial skin, comprising placing and culturing epidermal keratinocytes on the skin.
[B8] including three-dimensionally arranging and culturing fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a cell layer;
The method for producing artificial skin according to [B7], comprising disposing the dermal papilla cells on the cell layer to form the dermal papilla cell layer.
[B9] The method for producing artificial skin according to any one of [B1] to [B8], wherein the culture after the placement of the epidermal keratinocytes is a semi-gas phase exposure culture.
[C1] Artificial skin manufactured by the method for manufacturing artificial skin according to any one of [B1] to [B9].
[D1] The artificial skin according to any one of [A1] to [A10] and [C1],
An evaluation kit for evaluating at least one of hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, and hair suppression, including a container in which the artificial skin is disposed.
[D2] The artificial skin according to any one of [A1] to [A10] and [C1];
An evaluation kit for performing at least one evaluation selected from the group consisting of skin safety, skin corrosivity, skin irritation and skin permeability, comprising a container in which the artificial skin is disposed.
[E1] A method for evaluating a test substance using artificial skin,
The artificial skin is the artificial skin according to any one of [A1] to [A10] and [C1],
An evaluation method comprising: bringing a test substance into contact with the artificial skin; and observing the influence of the test substance on the artificial skin due to the contact of the test substance.
[F1] Arrangement of 500-5,000 cells / cm 2 of hair papilla cells coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a hair papilla cell layer, and epidermal keratinocytes on the papilla cell layer A method for producing a double cell aggregate comprising arranging and culturing.
[F2] The method includes arranging the coated dermal papilla cells in a well plate subjected to a low cell adsorption treatment. [F1] A method for producing a double cell aggregate.

以下に、実施例及び参考例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。   Hereinafter, the present disclosure will be further described using examples and reference examples. However, the present disclosure is not construed as being limited to the following examples.

［コート細胞の作製］
特開２０１２−１１５２５４号公報の記載に基づきコート細胞を調製した。
＜正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）＞
細胞はＮＨＤＦ（ＬＯＮＺＡ社製）、細胞外マトリックス成分はフィブロネクチン（ＦＮ）及びゼラチン（Ｇ）を使用した。細胞をＦＮ溶液及びＧ溶液に交互に計９回浸漬させることによって（ＦＮ浸漬操作：５回、Ｇ浸漬操作：４回）、ゼラチンとフィブロネクチンとを含む被膜でＮＨＤＦがコートされたコート細胞（コートＮＨＤＦ）を作製した（被膜の厚み：９ｎｍ）。なお、被膜の厚みは特開２０１２−１１５２５４号公報の実施例に記載の方法により測定した。
＜正常ヒト毛乳頭細胞（ＤＰＣ）＞
細胞として予め蛍光（ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｏｒａｎｇｅ）染色したＤＰＣを使用した以外は、同様にしてゼラチンとフィブロネクチンとを含む被膜でＤＰＣがコートされたコート細胞（コートＤＰＣ）を作製した（被膜の厚み：９ｎｍ）。 [Preparation of coated cells]
Coated cells were prepared based on the description in JP2012-115254A.
<Normal human skin fibroblasts (NHDF)>
NHDF (manufactured by LONZA) was used for the cells, and fibronectin (FN) and gelatin (G) were used for the extracellular matrix components. By immersing the cells alternately in the FN solution and the G solution a total of 9 times (FN immersion operation: 5 times, G immersion operation: 4 times), coated cells in which NHDF is coated with a coating containing gelatin and fibronectin (coated NHDF) was produced (film thickness: 9 nm). The thickness of the coating was measured by the method described in the examples of JP2012-115254A.
<Normal human dermal papilla cells (DPC)>
Coated cells (coated DPC) coated with DPC with a coating containing gelatin and fibronectin were prepared in the same manner except that DPC previously stained with cell tracker orange was used as the cells (coat thickness: 9 nm). .

［人工皮膚の作製（実施例１−１）］
特開２０１２−１１５２５４号公報の記載の方法に基づき、２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製、内直径：６．５ｍｍ、膜面積：０．３３ｃｍ２）に、コートＮＨＤＦを６×１０５ｃｅｌｌｓ播種して真皮組織（６層）を作製した。１日培養後、コートＤＰＣを真皮組織上に４×１０５ｃｅｌｌｓ播種してＤＰＣ層（４層）を作製した。さらに１日培養後、ＤＰＣ層上に正常ヒト表皮角化細胞（ＫＣ）を１．８×１０５ｃｅｌｌｓ播種してＫＣ層（１層）を形成し、所定期間、半気相暴露培養或いは液中培養することで人工皮膚を得た。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。 [Production of artificial skin (Example 1-1)]
Based on the method described in JP 2012-115254 A, a 24-well cell culture insert (made by Corning, inner diameter: 6.5 mm, membrane area: 0.33 cm 2 ) was seeded with 6 × 10 5 cells of coated NHDF. A dermal tissue (6 layers) was prepared. After culturing for 1 day, the coated DPC was seeded on the dermis tissue at 4 × 10 5 cells to prepare a DPC layer (4 layers). Furthermore, after culturing for one day, normal human epidermal keratinocytes (KC) are seeded on the DPC layer by 1.8 × 10 5 cells to form a KC layer (one layer). Artificial skin was obtained by medium culture. In addition, the medium used the medium for hair papillae cells (PromoCell) and HuMedia-KG2 (Kurabo) mixed 1: 1, and the medium was changed once a day.

[人工皮膚の作製（実施例１−２）]
真皮組織を作製しない（コートＮＨＤＦの播種を行わない）こと、及びＤＰＣを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種すること以外は、（実施例１−１）と同様の方法で人工皮膚を作製した。 [Production of artificial skin (Example 1-2)]
Artificial skin was prepared in the same manner as in Example 1-1 except that no dermal tissue was prepared (no seeding of coated NHDF) and 5 × 10 5 cells of DPC were seeded.

［人工皮膚の作製（参考例１）］
コートＤＰＣの播種細胞数を１×１０５ｃｅｌｌｓ（ＤＰＣ層：１層）とした以外は、（実施例１−１）と同じ操作で人工皮膚を作製した。 [Production of artificial skin (Reference Example 1)]
Artificial skin was prepared in the same manner as (Example 1-1) except that the number of seeded cells of the coated DPC was changed to 1 × 10 5 cells (DPC layer: 1 layer).

（局在位置変化の確認）
毛乳頭細胞の局在位置変化を蛍光顕微鏡で観察した。その結果の一例を図１に示す。図１は、実施例１の組織上面からの蛍光顕微鏡写真である。図１Ａは組織作製直後の写真、図１Ｂは一週間半気相暴露培養後の写真である。図１Ａに示すように、組織作製直後は赤く染色されたＤＰＣが培養基材全面に均一に分布していた。一方、一週間半気相暴露培養した図１Ｂでは、毛乳頭細胞同士が集まって直径１００μｍ程度の細胞塊（細胞集合体）、毛乳頭組織を形成していた。 (Confirmation of local position change)
Changes in the location of dermal papilla cells were observed with a fluorescence microscope. An example of the result is shown in FIG. FIG. 1 is a fluorescence micrograph from the upper surface of the tissue of Example 1. FIG. 1A is a photograph immediately after tissue preparation, and FIG. 1B is a photograph after one week and half vapor phase exposure culture. As shown in FIG. 1A, immediately after the tissue preparation, DPC dyed red was uniformly distributed over the entire culture substrate. On the other hand, in FIG. 1B, which was cultured for half a week by exposure to a gas phase, dermal papilla cells gathered to form a cell mass (cell aggregate) having a diameter of about 100 μm and a dermal papilla tissue.

（組織の形態変化観察）
組織の形態変化を半気相暴露培養した三次元組織のＨＥ組織切片像で観察した。その結果の一例を図２に示す。図２は、ＮＨＤＦ−ＤＰＣ−ＫＣ（６−４−１）構造の組織切片像である。図２Ａは一週間半気相暴露したＨＥ切片像であり、図２Ｂは二週間半気相暴露したＨＥ切片像である。図２Ａに示すように、一週間半気相暴露培養した組織断片には直径１００μｍ程度の毛乳頭細胞の集合体（矢印）が観察された。これにより、毛乳頭構造が三次元組織内に形成されていることが確認された。また二週間半気相暴露培養することによって、図２Ｂに示すように、培養一週間で観察されていた毛乳頭組織が表皮角化細胞で囲まれ、毛包様組織が形成されたことが確認された。すなわち毛器官構造を有する人工皮膚が得られたことが確認された。 (Organizational change observation)
The tissue morphological change was observed in a HE tissue section image of a three-dimensional tissue cultured by semi-gas phase exposure. An example of the result is shown in FIG. FIG. 2 is a tissue slice image of the NHDF-DPC-KC (6-4-1) structure. FIG. 2A is a HE slice image exposed for one week and a half vapor phase, and FIG. 2B is a HE slice image exposed for a half week gas phase. As shown in FIG. 2A, aggregates (arrows) of dermal papilla cells having a diameter of about 100 μm were observed in the tissue fragments cultured for half a week by gas phase exposure. Thereby, it was confirmed that the dermal papilla structure was formed in the three-dimensional tissue. In addition, as shown in FIG. 2B, it was confirmed that the hair papilla tissue observed in one week of culture was surrounded by epidermal keratinocytes, and a hair follicle-like tissue was formed by culturing for two weeks and a half gas phase. It was done. That is, it was confirmed that an artificial skin having a hair organ structure was obtained.

上記組織の形態観察結果をまとめたものを下記表１に示す。真皮体積密度は、ＮＨＤＦ播種数から真皮層体積（ＨＥ切片から求めた真皮層厚みと培養基材底面積から算出）を割った値とした。なお、真皮層の厚みは、ＨＥ切片を光学顕微鏡観察により３箇所測定し、その平均を算出することにより求めた。
Table 1 below summarizes the morphological observation results of the tissues. The dermal volume density was obtained by dividing the NHDF seeding number by the dermis layer volume (calculated from the dermis layer thickness obtained from the HE slice and the culture substrate bottom area). In addition, the thickness of the dermis layer was calculated | required by measuring three places of HE slices by optical microscope observation, and calculating the average.

表１に示すように、ＤＰＣが積層されるようにＤＰＣ層を形成し（ＤＰＣ平面密度：１．２×１０６〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、その上にＫＣを積層して培養を行うことによって、三次元組織内に毛包様組織が形成されることが確認できた。一方、参考例１（ＤＰＣ平面密度：３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）では、毛包様組織は形成されなかった。また、ＫＣ播種後の培養を半気相暴露培養とすることによって、形成される毛包様組織の径をより大きくすることができた。 As shown in Table 1, a DPC layer is formed so that DPCs are laminated (DPC plane density: 1.2 × 10 6 to 1.5 × 10 6 cells / cm 2 ), and KC is laminated thereon. It was confirmed that the hair follicle-like tissue was formed in the three-dimensional tissue by culturing in this manner. On the other hand, in Reference Example 1 (DPC planar density: 3.0 × 10 5 cells / cm 2 ), no hair follicle-like tissue was formed. Moreover, the diameter of the hair follicle-like tissue formed was able to be enlarged by making culture | cultivation after KC seed | inoculation into semi-gas phase exposure culture | cultivation.

［二重細胞集合体の作製］
低吸着表面処理されたＵ底の９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、ＤＰＣを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１２〜２４時間３７℃でインキュベートして直径１００μｍ程度のＤＰＣ細胞集合体を作製した。次にＤＰＣ細胞集合体が形成されたウェルにＫＣを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１２〜２４時間インキュベートして直径１５０〜２００μｍ程度のコアシェル構造の毛乳頭細胞集合体（二重細胞集合体、ＤＰＣ−ＫＣスフェロイド）を得た。得られた二重細胞集合体を図３Ａ及びＢに示す。図３Ａは位相差顕微鏡像であり、図３ＢはＨＥ切片の顕微鏡像である。 [Production of double cell aggregates]
DPC cells are seeded at 3 × 10 3 cells / well in a U-bottom 96-well plate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) treated with a low adsorption surface and incubated at 37 ° C. for 12-24 hours. Was made. Next, KC was seeded at 3 × 10 3 cells / well in wells in which DPC cell aggregates were formed, and incubated for 12 to 24 hours, and then a core-shell structure hair papilla cell aggregate (dual cell aggregate) having a diameter of about 150 to 200 μm. Body, DPC-KC spheroid). The resulting double cell aggregate is shown in FIGS. 3A and B. FIG. 3A is a phase contrast microscopic image, and FIG. 3B is a microscopic image of an HE section.

［人工皮膚の作製（実施例２）］
図４に示す手順で人工皮膚を作製した。まず、２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサートにコートＮＨＤＦを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。次に二重細胞集合体をセルカルチャーインサート１つ当り３０個（９０個／ｃｍ２）となるように播種し、１時間インキュベートした。細胞集合体の接着を確認後、ＮＨＤＦコート細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ播種して細胞集合体を完全にＮＨＤＦコートで覆い細胞集合体を含む細胞層を形成した。さらにこの細胞層上にＫＣを２×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、半気相暴露で一週間培養して三次元組織を作製した。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。 [Production of artificial skin (Example 2)]
Artificial skin was prepared according to the procedure shown in FIG. First, 5 × 10 5 cells of seed NHDF were seeded on a 24-well cell culture insert and cultured for 1 day. Next, double cell aggregates were seeded at 30 cells (90 cells / cm 2 ) per cell culture insert and incubated for 1 hour. After confirming the adhesion of the cell aggregate, 2 × 10 6 cells of NHDF-coated cells were seeded to completely cover the cell aggregate with the NHDF coat to form a cell layer containing the cell aggregate. Further, 2 × 10 5 cells of KC were seeded on this cell layer, and cultured for one week by semi-gas phase exposure to prepare a three-dimensional tissue. In addition, the culture medium used what mixed the medium for hair papilla cells (PromoCell) and HuMedia-KG2 (Kurabo) 1: 1, and culture medium exchange was performed once a day.

組織切片像を確認することによって細胞集合体の形態変化観察を行った。その結果の一例を図５に示す。図５ＡはＫＣ播種直後の組織切片（ＨＥ染色）の顕微鏡像であり、図５ＢはＫＣ播種から一週間半気相暴露培養した組織切片（サイトケラチン（ＣＫ）染色）の顕微鏡像である。図５Ｂに示すように、細胞集合体の外殻（シェル部）はケラチン陽性であり、内部（コア部）には毛乳頭細胞を含む組織があることから、三次元組織内に毛包様組織が導入出来ていることが確認できた。また、図５Ａと図５Ｂとを比較すると細胞集合体の形状が、円形（球形）から楕円形に変化しており、毛器官を有する人工皮膚が作製できた。なお、この人工皮膚における真皮体積密度は、２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であった。 The morphological change of the cell aggregate was observed by confirming the tissue section image. An example of the result is shown in FIG. FIG. 5A is a microscopic image of a tissue section (HE staining) immediately after KC seeding, and FIG. 5B is a microscopic image of a tissue section (cytokeratin (CK) staining) cultured for half a week after KC seeding. As shown in FIG. 5B, since the outer shell (shell part) of the cell assembly is keratin positive and the inside (core part) contains tissue containing hair papilla cells, the hair follicle-like tissue is present in the three-dimensional tissue. It was confirmed that was introduced. Further, comparing FIG. 5A and FIG. 5B, the shape of the cell aggregate was changed from a circular shape (spherical shape) to an elliptical shape, and an artificial skin having a hair organ could be produced. The dermis volume density in this artificial skin was 2.5 × 10 8 cells / cm 3 .

（参考例２）
二重細胞集合体に代えて、ＤＰＣにより構成されたＤＰＣ細胞集合体を用いた以外は実施例２と同様にして三次元組織を作製した。得られた組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像を図６に示す。図６に示すように、参考例２の三次元組織は一週間組織を培養すると、真皮層と細胞集合体の境界が不明瞭になった（細胞集合体：矢印）。また、細胞集合体の周りにもＫＣが存在せず、毛包様組織を形成していなかった。なお、この人工皮膚における真皮体積密度は、２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であった。 (Reference Example 2)
A three-dimensional tissue was prepared in the same manner as in Example 2 except that a DPC cell aggregate constituted by DPC was used instead of the double cell aggregate. A microscopic image of the obtained tissue section (HE section) is shown in FIG. As shown in FIG. 6, when the three-dimensional tissue of Reference Example 2 was cultured for one week, the boundary between the dermis layer and the cell aggregate became unclear (cell aggregate: arrow). Further, no KC was present around the cell aggregate, and no hair follicle-like tissue was formed. The dermis volume density in this artificial skin was 2.5 × 10 8 cells / cm 3 .

［人工皮膚の作製（実施例３）］
２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサートにコートＮＨＤＦを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。続いてヒト臍帯静脈血管内細胞（ＨＵＶＥＣ）を７×１０４ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。続いて実施例２の二重細胞集合体を、セルカルチャーインサート１つ当り３０個（９０個／ｃｍ２）となるように播種し、１時間インキュベートした。細胞集合体の接着を確認後、ＮＨＤＦコート細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ播種して細胞集合体を完全にＮＨＤＦコート細胞で覆い細胞集合体を含む細胞層を形成した。さらにこの細胞層上にＫＣを２×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、半気相暴露で一週間培養して三次元組織を作製した。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。 [Production of artificial skin (Example 3)]
A 24-well cell culture insert was seeded with 5 × 10 5 cells of coated NHDF and cultured for 1 day. Subsequently, human umbilical vein intravascular cells (HUVEC) were seeded at 7 × 10 4 cells and cultured for 1 day. Subsequently, the double cell aggregate of Example 2 was seeded at 30 cells (90 cells / cm 2 ) per cell culture insert and incubated for 1 hour. After confirming the adhesion of the cell aggregate, 2 × 10 6 cells of NHDF-coated cells were seeded to completely cover the cell aggregate with NHDF-coated cells to form a cell layer containing the cell aggregate. Further, 2 × 10 5 cells of KC were seeded on this cell layer, and cultured for one week by semi-gas phase exposure to prepare a three-dimensional tissue. In addition, the medium used the medium for hair papillae cells (PromoCell) and HuMedia-KG2 (Kurabo) mixed 1: 1, and the medium was changed once a day.

組織切片像を確認することによって細胞集合体の形態変化観察を行った。その結果の一例を図７に示す。図７は実施例３の組織切片像である。図７Ａは組織作製直後（培養１日目）の切片をＣＤ３１染色した像である。ＣＤ３１陽性のＨＵＶＥＣ細胞が管状組織（血管）を形成し、血管網が毛包様組織に近接している人工皮膚（真皮体積密度：２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３）を得た。図７Ｂは半気相暴露培養１週間後のＨＥ切片の顕微鏡像である。これをみると、細胞集合体から毛軸の形成が確認されていることが確認できた。以上から血管網が近接する毛器官を有する人工皮膚モデルを作製出来た。 The morphological change of the cell aggregate was observed by confirming the tissue section image. An example of the result is shown in FIG. FIG. 7 is a tissue section image of Example 3. FIG. 7A is an image obtained by CD31 staining of a section immediately after tissue preparation (culture day 1). Artificial skin (dermal volume density: 2.5 × 10 8 cells / cm 3 ) in which CD31-positive HUVEC cells formed tubular tissues (blood vessels) and the vascular network was close to the hair follicle-like tissues was obtained. FIG. 7B is a microscopic image of HE sections after one week of semi-gas phase exposure culture. When this was seen, it has confirmed that formation of the hair shaft was confirmed from the cell aggregate. From the above, an artificial skin model having hair organs close to the vascular network could be produced.

Claims (15)

線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と、
表皮層とを有し、
前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える、人工皮膚。 A dermis layer comprising fibroblasts and extracellular matrix components;
Having a skin layer,
Artificial skin, wherein the dermis layer further comprises hair follicle-like tissue. 前記真皮層は、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の線維芽細胞を含む、請求項１記載の人工皮膚。 The artificial skin according to claim 1, wherein the dermis layer comprises 1 × 10 2 to 1 × 10 10 cells / cm 3 fibroblasts. 前記真皮層は、さらに血管内皮細胞を含む管状組織を備え、
前記毛包様組織と前記管状組織とが近接する、請求項１又は２に記載の人工皮膚。 The dermis layer further comprises a tubular tissue containing vascular endothelial cells,
The artificial skin according to claim 1 or 2, wherein the hair follicle-like tissue and the tubular tissue are close to each other. 前記毛包様組織は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と、前記凝集体を覆う表皮角化細胞とを含む、請求項１から３のいずれかに記載の人工皮膚。   The artificial skin according to any one of claims 1 to 3, wherein the hair follicle-like tissue includes an aggregate of cells including dermal papilla cells and an epidermal keratinocyte covering the aggregate. 前記真皮層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養することを含む製造方法により製造されたものである、請求項１から４のいずれかに記載の人工皮膚。   The dermis layer is produced by a production method including three-dimensionally arranging and culturing fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component. Artificial skin. 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされ、三次元に配置された細胞と、毛乳頭細胞を含む細胞集合体とを含む細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、
前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する、人工皮膚の製造方法。 Forming a cell layer containing cells coated with a coating containing an extracellular matrix component and arranged three-dimensionally and a cell aggregate containing dermal papilla cells, and arranging epidermal keratinocytes on the cell layer And culturing,
The method for producing artificial skin, wherein the cell aggregate has an aggregate of cells containing dermal papilla cells and a layer containing epidermal keratinocytes covering the aggregate. 前記細胞集合体を含む細胞層の形成は、
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を配置して細胞層を形成すること、
前記細胞層上に、前記細胞集合体を配置すること、及び
前記細胞集合体を覆うように細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置することを含む、請求項６記載の人工皮膚の製造方法。 Formation of a cell layer containing the cell aggregate is
Placing a cell coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a cell layer;
The cell assembly is disposed on the cell layer, and the cells coated with a coating containing an extracellular matrix component so as to cover the cell assembly are disposed in three dimensions. For producing artificial skin. 前記細胞層の形成は、さらに血管内皮細胞を配置することを含む、請求項６又は７に記載の人工皮膚の製造方法。   The method for producing artificial skin according to claim 6 or 7, wherein the formation of the cell layer further includes arranging vascular endothelial cells. 前記コートされた細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を含む、請求項６から８のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。   The method for producing artificial skin according to claim 6, wherein the coated cells include fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component. 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び
前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養すること、を含む人工皮膚の製造方法。 4. 4 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / cm 2 of dermal papilla cells coated with a coating containing an extracellular matrix component are disposed to form a dermal papilla cell layer; and an epidermal angle on the dermal papilla cell layer A method for producing artificial skin, comprising arranging and cultivating cells. 細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含み、
前記細胞層上に前記毛乳頭細胞を配置して前記毛乳頭細胞層を形成することを含む、請求項１０記載の人工皮膚の製造方法。 Including three-dimensionally arranging and culturing fibroblasts coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a cell layer;
The method for producing artificial skin according to claim 10, comprising disposing the dermal papilla cell layer on the cell layer to form the dermal papilla cell layer. 前記表皮角化細胞の配置後の培養は、半気相暴露培養である、請求項６から１１のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。   The method for producing artificial skin according to any one of claims 6 to 11, wherein the culture after the placement of the epidermal keratinocytes is a semi-gas phase exposure culture. 請求項６から１２のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法により製造された、人工皮膚。   Artificial skin manufactured by the method for manufacturing artificial skin according to any one of claims 6 to 12. 請求項１から５及び１３のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛からなる群から選択される少なくとも一つの評価を行うための評価用キット。 Artificial skin according to any one of claims 1 to 5 and 13,
An evaluation kit for performing at least one evaluation selected from the group consisting of hair growth, hair growth, hair removal, hair removal, and hair suppression, including a container in which the artificial skin is disposed. 請求項１から５及び１３のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性からなる群から選択される少なくとも一つの評価行うための評価用キット。 Artificial skin according to any one of claims 1 to 5 and 13,
An evaluation kit for performing at least one evaluation selected from the group consisting of skin safety, skin corrosivity, skin irritation and skin permeability, comprising a container in which the artificial skin is disposed.
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