JP2016012114A - 照明装置、これを有する顕微鏡装置及び顕微鏡観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】褪色するまでに照射できる総エネルギーを増やし、且つ褪色を抑制することができる照明装置、これを有する顕微鏡装置及び顕微鏡観察方法を提供すること。
【解決手段】照明装置は、蛍光物質を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための照明装置であって、試料に含まれる蛍光物質を励起させる励起光を照射する励起光照射部を有し、励起光照射部は、少なくとも試料が存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明することを特徴とするものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、照明装置、これを有する顕微鏡装置及び顕微鏡観察方法に関するものである。

顕微鏡による観察として蛍光顕微鏡を用いる観察が知られている。蛍光観察とは、蛍光色素や蛍光タンパク質で標識された試料に励起光を照射し、試料から発せられた蛍光シグナルを観察する手法である。
励起光の照射により、励起光によって発生した活性酸素によって蛍光色素や蛍光タンパク質には化学変化が起きる。その結果、蛍光観察を継続していると、試料は徐々に蛍光を発しなくなってしまう。この現象を褪色という。

励起光の照射エネルギーに対する蛍光強度は、指数関数（ｙ＝Ａｅｘｐ（Ｂｘ）＋Ｃ）で近似できる（Ｌｏｌｉｎｇ Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ.， １９９５）。そして、褪色の進行しやすさは、減衰係数（褪色係数）Ｂによって決まる。

特開２００５−３１６０３６号公報

褪色は、蛍光観察においては、極力減少させることが望ましい。このため、例えば、従来、以下の構成（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）が提案されている。
（Ａ）生物細胞標本が褪色しないように、不必要な励起光を試料に照射させないような励起光を遮光制御する構成、
（Ｂ）ＮＤフィルタを用いて、励起光を減光制御する構成、
（Ｃ）励起光の照射時間を短くするため蛍光画像のオートフォーカスを行う構成。

上記のいずれの構成においても、励起光を照射する時間を短くすること、または励起光の放射照度を小さくすることで褪色を抑制している。しかしながら、褪色するまでに照射できる励起光の総エネルギーを大きくすることは達成されていない。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、褪色するまでに照射できる総エネルギーを増やし、且つ褪色を抑制することができる照明装置及びこれを有する顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、第１の側面において本発明に従う照明装置は、
蛍光物質を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための照明装置であって、
試料に含まれる蛍光物質を励起させる励起光を照射する励起光照射部を有し、
励起光照射部は、少なくとも試料が存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明することを特徴とする。

また、第２の側面において本発明に従う顕微鏡装置は、試料を保持するステージと、試料を照射する励起光を発する照明装置と、試料に対向して設置される対物レンズとの少なくとも一方を有し、照明装置は、上述に記載の照明装置であり、試料を蛍光観察することを特徴とする。
また、他の側面において本発明に従う顕微鏡観察方法は、蛍光物質を有する観察対象物を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための顕微鏡観察方法であって、試料に含まれる蛍光物質を励起させる励起光を照射する励起光照射工程と、少なくとも試料が存在する観察領域の酸素濃度を抑制する酸素濃度抑制工程と、を有することを特徴とする。

本発明によれば、褪色するまでに照射できる総エネルギーを増やし、且つ褪色を抑制することができる照明装置、これを有する顕微鏡装置及び顕微鏡観察方法を提供することができるという効果を奏する。

第１実施形態に係る照明装置と観察光学系との構成を示す図である。 第２実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第３実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第４実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第５実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第６実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第７実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第８実施形態の照明装置の構成を示す図である。 第９実施形態の照明装置の構成を示す図である。 褪色抑制照明領域の波長を変える透過型照明と落射型照明との組み合わせを示す図である。 褪色抑制照明領域の波長を変える落射型照明の構成を示す図である。 褪色抑制照明領域の波長を変える透過型照明の構成を示す図である。 褪色抑制照明領域について説明する図である。 観察領域と褪色抑制照明領域について説明する図である。 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、光学部材を光軸から見た構成を示している。 （ａ）、（ｂ）は、第１０実施形態の顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 （ａ）、（ｂ）は、酸素消費工程を示すフローチャートである。 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、第１１実施形態の顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 第１２実施形態の顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 第１０実施形態の顕微鏡観察方法を行う装置の構成を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は、試料の周辺の褪色抑制照明領域を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は、それぞれ試料の周辺の褪色抑制照明領域を示す図、第１１実施形態の顕微鏡観察方法を行う装置の試料近傍の構成を示す図である。 （ａ）は、試料を覆う物理的な壁を示す図、（ｂ）は、試料を覆うように油の層を形成する例を示す図である。 第１２実施形態の顕微鏡観察方法を行う装置の構成を示す図である。

実施形態の説明の前に、本願の発明者が鋭意研究して見出した蛍光を低減する原理について説明する。褪色の主要因の１つに、活性酸素による試料の化学変化が挙げられる。試料に対して励起光を照射していると、励起光照射部分の試料の酸素が活性酸素となり、その活性酸素が周辺物質を酸化させるので、蛍光物質の褪色が少しずつ進行する。そして、励起光照射部の酸素は減少するので、励起光が照射されていない励起光照射部分の外側から、酸素が励起光照射部分に拡散流入する。流入した酸素は、励起光の照射により活性酸素となって更に蛍光物質などと結びつき褪色を進行させる。これにより、褪色が促進されると考えられる。

そこで、観察している部分の外側周辺を覆うように、即ち囲むように比較的強い励起光を照射する。これにより、試料のある観察領域の外側近傍の酸素を活性させる。活性酸素は観察領域の外側で蛍光物質などと結びつく。そのため観察領域に流入してくる酸素を、観察部以外の領域において消費させることができる。この結果、観察している試料が存在する領域内への酸素流入を低減し、観察部内での活性酸素の発生を抑制できる。

図１３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）は、上述した考え方を説明する図面である。

図１３（ｆ）において、試料を観察する観察領域９には、試料Ｓａが存在している。褪色抑制照明領域１０は、観察領域９の外側周辺に存在する。例えば、観察領域９内に試料Ｓａが存在する。また、褪色抑制照明領域１０は、観察領域９に比較して、例えば、より強度の大きな励起光を照射する。この点は、実施形態において詳述する。

図１３（ａ）は、観察領域９（厚さ０．１１ｍｍ）のみの場合を示している。同様に、図１３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）は、それぞれ観察領域９の外側の周辺に、左側から順番に、輪帯状の褪色抑制照明領域の厚さを大きくした構成を示している。褪色抑制照明領域１０の厚さは、図１３（ｂ）〜（ｅ）の順に、厚さ＝０．０５５ｍｍ、０．１１ｍｍ、０．１６５ｍｍ、０．２２ｍｍである。

図１３（ｇ）のグラフにおいて、横軸は「励起光強度（Ｗ）×照射時間（秒）／照明範囲（ｃｍ^２）」を示し、縦軸は観察される観察領域９の「画像の明るさ（ただし、１で正規化している）」を示している。
図１３（ｇ）から明らかなように、例えば、励起光強度（Ｗ）照射と、時間（秒）とを一定にした場合でも、輪帯状の褪色抑制照明領域１０の面積が大きくなるに応じて、観察される観察領域９の画像も明るくなる。換言すると、輪帯状の褪色抑制照明領域１０の面積が大きくなるに応じて、観察領域９の褪色を低減できることがわかる。

（観察される視野範囲について）
後述する各実施形態に係る照明装置と、観察光学系とを組み合わせた顕微鏡装置の状態では、その構成に依存して、以下の２つのうちいずれかの状態となる。
図１４（ａ）、（ｂ）は、それぞれ観察領域９と、褪色抑制照明領域１０を示している。
図１４（ａ）は、顕微鏡装置の対物レンズの実視野ＦＯＶ内に観察領域９と褪色抑制照明領域１０とが同時に観察される様子を示す。
図１４（ｂ）は、対物レンズの視野内であり試料を観察する観察領域９’と、対物レンズの実視野ＦＯＶ外である観察領域９’の外側周辺の褪色抑制照明領域１０’を示している。

以下に、本発明に係る照明装置及びこれを有する顕微鏡装置の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態によりこの発明が限定されるものではない。

（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る照明装置１００と観察光学系３００との構成を示している。照明装置１００と、観察光学系３００とにより、顕微鏡装置を構成する。

まず、照明装置１００について説明する。励起光照射部である照明光源１は、試料Ｓａに含まれる光物質を励起させる励起光を含む光を照射する。レンズ２、レンズ３、レンズ４を透過した光は、励起フィルタ５に入射する。励起フィルタ５は、特定の波長帯域の光のみを選択的に透過させ、それ以外の光を遮断する。透過した光が励起光になる。

励起フィルタ５は、いわゆるバンドパスフィルタである。蛍光物質により励起波長は異なる。このため、蛍光観察においては、用いる蛍光物質の特性に適した励起フィルタ５を組み合わせる。

励起フィルタ５を透過した光は、ダイクロイック・ミラー６に入射する。ダイクロイック・ミラー６は、光軸ＡＸに対して４５度の角度で挿入配置されている。ダイクロイック・ミラーは、ロングパスの機能を有するミラーである。蛍光においては、励起光の波長に対して、蛍光波長は長くなる。このため、ダイクロイック・ミラー６の分光透過特性は、短い波長の励起光は反射、もしくは吸収し、長い波長の蛍光は透過するように設定されている。

ダイクロイック・ミラー６で反射した励起光は、レンズ７（対物レンズ）により平行光に変換され、標本Ｓｂを照明する。レンズ７は、対物レンズである。また、標本Ｓｂは、ステージ８に載置されている。標本Ｓｂ中の試料Ｓａが存在している観察領域９からは、試料Ｓａに標識した蛍光色素などの蛍光シグナルが蛍光として、レンズ７の方向へ反射する。

試料からの蛍光は、レンズ７とダイクロイック・ミラー６を透過して、吸収フィルタ１１に入射する。吸収フィルタ１１は、蛍光を透過し、その他の波長はカット（反射、もしくは吸収）する。

励起光照射部は、照明光源１からの光をもとに、試料Ｓａに含まれる蛍光物質を励起させる励起光を照射する。
照射光源１は、少なくとも試料Ｓａが存在する観察領域９及び観察領域９の周辺の褪色抑制照明領域１０を照明する。

このように、本実施形態では、励起光照射部は、照明光源１からの光をもとに、レンズ７を透過して試料Ｓａに励起光を照射する落射照明型である。
これにより、レンズ７（対物レンズ）は、観察用光学系と励起光照明用光学系との機能を兼用する。このため、コンデンサレンズが不要となる。

（観察光学系について）
次に、観察光学系３００について説明する。光軸に対して４５度傾いて配置されている反射ミラー１２を反射した光は、レンズ１３へ入射する。レンズ１３は、カメラなどの撮像装置へ蛍光を導く。コンピュータ１５は、撮像装置１４からの蛍光信号を画像処理する。そして、モニタ１６は、試料Ｓａの蛍光画像を表示する。

ここで、照明装置１００に関する説明を続ける。本実施形態において、例えば、核をＤＡＰＩで染色する場合は、Ｕ（ＵＶ）励起すること、微小管をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色する場合は、Ｂ（青）励起すること、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ
Ｒｅｄで染色する場合は、Ｇ（緑色）励起することが望ましい。

（第２実施形態）
図２は、第２実施形態の照明装置１１０の構成を示している。
照明光源１は、ステージ８に対してレンズ７とは反対側からステージ８に励起光を照射する透過照明型の励起光照射部である。

照明光源１からの光は、レンズ２、３、４を透過する。そして、励起フィルタ５を透過した光は、観察領域９と褪色抑制照明領域１０を照明する。

観察領域９の試料Ｓａからの蛍光は、レンズ７に入射する。そして、吸収フィルタ１１は、蛍光を透過し、その他の波長はカット（反射）する。その後、蛍光は観察光学系３００に導かれる。

これにより、落射照明に比較して、より大きな面積の照明範囲を容易に得ることができる。

（第３実施形態）
図３は、第３実施形態の照明装置１２０の構成を示している。
本実施形態では、照明光源としての励起光照射部は、レンズ７を通過して試料Ｓａに励起光を照射する落射照明型の照明光源１（第１励起光照射部）と、試料Ｓａに対してレンズ７とは反対側から試料Ｓａに励起光を照射する透過照明型の照明光源１７（第２励起光照射部）、とを有する。

本実施形態を具体的に説明する。照明光源１からの光は、レンズ２、３、４を透過する。そして、励起フィルタ５を透過した光は、ダイクロイック・ミラー６に入射する。ダイクロイック・ミラー６は、光軸ＡＸに対して４５度の角度で挿入配置されている。ダイクロイック・ミラー６で反射した励起光は、レンズ７により平行光に変換され、観察領域９に存在する試料Ｓａを照明する。

他方、照明光源１７（第２励起光照射部）からの光は、レンズ１８、１９、２０を透過し、観察領域９の周辺の褪色抑制照明領域１０を照明する。
試料Ｓａで発生した蛍光は、レンズ７、ダイクロイック・ミラー６を透過し、観察光学系３００へ導かれる。

本実施形態では、これにより、照明光源１（第１励起光照射部）からの第１の励起光と、照明光源１７（第２励起光照射部）からの第２の励起光に関して、それぞれの励起光強度を任意に設定できるという効果を奏する。

さらに、以下の条件式（１）、（２）の下限値を下回らないようにすることで、観察領域９の周辺から観察領域９へ侵入する酸素もしくは活性酸素が減少し、観察領域９での酸化による褪色を低減できる。従って、蛍光観察における観察領域９の励起強度を維持しながらも、標本Ｓｂ内の試料Ｓａの観察時間を長くすることに有利となる。

そして、以下の条件式（１）、（２）を満足することが望ましい。
１．３＜φexc／φobj （１）
０．００２ｍｍ＜φexc−φobj （２）
ただし、
φobjは、顕微鏡装置が有するレンズ７（対物レンズ）が観察する領域９の試料Ｓａ面
における最大直径、
φexcは、励起光照射部である照明光源１又は１７が照射する励起光の試料Ｓａ面にお
ける最大直径、
である。

これにより、励起光の照射領域を観察領域９に対して広くすることで、観察領域９の周辺で活性酸素を発生させることができる。この結果、観察領域９外にて蛍光物質などと活性酸素を結合させることが出来る。観察領域での褪色の抑制に有利となる。

さらに、条件式（１）、（２）に代えて、以下の条件式（１−１）、（２−１）を満足することが望ましい。
２．０＜φexc／φobj （１−１）
０．０４ｍｍ＜φexc−φobj （２−１）

さらに、条件式（１）、（２）に代えて、以下の条件式（１−２）、（２−２）を満足することが、より一層望ましい。
２．０＜φexc／φobj＜２０ （１−２）
０．０４ｍｍ＜φexc−φobj＜２ｍｍ （２−２）

条件式（１−２）、（２−２）の上限値を上回ると、褪色抑制効果が小さくなってしまう。

（第４実施形態）
図４は、第４実施形態の照明装置１３０の構成を示している。
本実施形態の照明装置１３０は、落射照明型である。照明光源１からの光は、レンズ２、３、４を透過する。透過した後、励起フィルタ５、ダイクロイック・ミラー６によりレンズ７ａ（対物レンズ）に導かれる、レンズ７ａの周辺には、レンズ７ａを取り囲むように、レンズ７ｂが設けられている。

レンズ７ａを透過した光は、観察領域９を照明する。レンズ７ｂを透過した光は、観察領域９の周辺の褪色抑制照明領域１０を照明する。

観察領域９の試料Ｓａからの蛍光は、再度、レンズ７ａを透過する。レンズ７ａを透過した光は、ダイクロイック・ミラー６、吸収フィルタ１１を透過する。透過した光は、観察光学系３００へ導かれる。

落射照明型の変形例としては、本実施形態のように、対物レンズ７ａの外側から他のレンズにより褪色抑制照明領域１０を照明する構成、対物レンズ７ａの外側に光ファイバを設けて、光ファイバに導光された光で褪色抑制照明領域１０を照明する構成、など様々な変形例が考えられる。

（第５実施形態）
図５は、第５実施形態の照明装置１４０の構成を示している。
本実施形態では、照明光源１を含む励起光照射部の照明範囲は、少なくとも試料Ｓａを観察する観察領域９と、観察領域９の外側周辺の褪色抑制照明領域１０と、であり、さらに、褪色抑制照明領域１０を照射する励起光の強度は、観察領域９を照射する励起光の強度と異なっている。

特に、褪色抑制照明領域１０を照射する励起光の強度は、観察領域９を照射する励起光の強度よりも大きくなるように構成されている。

これにより、観察領域９よりも外側にも高い強度の励起光を照明することで、観察領域９周辺でより活性酸素を発生させる。これにより、観察領域９外にて蛍光物質などと活性酸素を結合させることが出来るという効果を奏する。

本実施形態は、さらに、照明光学系を有し、励起光照射部からの励起光のうち、観察領域９を照射する励起光は、観察領域９である試料面において集光され、励起光照射部は、褪色抑制照明領域を照明する励起光を、光軸ＡＸ方向にそって試料面とは異なる位置に集光させる。

例えば、照明光源１からの光のうち、レンズ２、３を透過した光は、光学部材２２により、輪帯形状となる。そして、ステージ８は、光学部材２２と共役な位置関係にある。このため、レンズ７を透過した光は、観察領域９の周辺を、中空形状で且つ円錐状の光束として、褪色抑制照明領域１０を照明する。

本実施形態では、これにより、光軸ＡＸ方向から観察領域９付近へ拡散流入してきた酸素も活性酸素とすることで、観察領域９外にて蛍光物質などと活性酸素を結合させることが出来るという効果を奏する。

（第６実施形態）
図６は、第６実施形態の照明装置１５０の構成を説明する図である。励起光照射部は、第１励起光照射部である照明光源１と、第２励起光照射部である照明光源１７とを有している。
照明光源１は、レンズ７を通過して褪色抑制照明領域１０に励起光を照射する落射照明型の照射部である。

第２励起光照射部である照明光源１７は、レンズ７とは反対側から観察領域９の試料Ｓａに励起光を照射する透過照明型の照射部である。
ここで、褪色抑制照明領域１０に励起光を照射する照明光源１（第１励起光照射部）は、光路中の試料Ｓａと共役な視野絞りの位置に、スリット２２´が形成された光学部材２２を有する。

図１５（ａ）は、光学部材２２を光軸から見た構成を示している。光学部材２２に形成されたスリット２２´は、光軸に回転対称な輪帯形状である。

図６に戻って説明を続ける。スリット２２´を透過した光は、レンズ４、励起フィルタ５を透過し、ダイクロイック・ミラー６により、レンズ７の方向へ導かれる。そして、レンズ７は、褪色抑制照明領域１０を照明する。

もう一方の照明光源１７（第２励起光照射部）からの光は、レンズ１８、１９、２０を透過する。透過した光は、励起フィルタ２１を透過し、観察領域９の試料Ｓａを照明する。

試料Ｓａからの蛍光は、レンズ７を透過し、ダイクロイック・ミラー６、吸収フィルタ１１を透過する。透過した光は、観察光学系３００に導かれる。

（第７実施形態）
図７は、第７実施形態の照明装置１６０の構成を説明する図である。
本実施形態では、励起光照射部である照明光源１は、レンズ７を通過して試料Ｓａに励起光を照射する落射照明型の照射部である。

本実施形態では、観察領域９を照明する励起光、褪色抑制照明領域１０を照明する励起光を、それぞれ完全に独立で強度を設定できる。

光学部材は、前記スリットよりも光軸側にＮＤフィルタ２３を有している。そして、ＮＤフィルタ２３を通過する励起光は、観察領域９を照射し、スリット２２´を通過する励起光は、褪色抑制照明領域１０を照射する。

図１５（ｂ）は、光学部材２２を光軸方向から見た図である。光学部材２２の内側には輪帯状のスリット２２´が形成されている。さらに、光学部材２２の中心部には、所定の透過率を有するＮＤフィルタ２３が形成されている。

このように、観察用照明光学系と褪色抑制用照明光学系とが同一のもので構成可能である。

（第８実施形態）
図８は第８実施形態の照明装置１７０の構成を説明する図である。
本実施形態では、励起光照射部である照明光源１は、試料Ｓａに対してレンズ７とは反対側から試料Ｓａに励起光を照射する透過照明型の照射部である。

光路中の試料Ｓａと共役な視野絞りの位置に、光学部材２２が設けられている。光学部材２２は、スリット２２´よりも光軸側に配置されているＮＤフィルタ２３を有している。ＮＤフィルタ２３を通過する励起光は、観察領域９を照射する。また、スリット２２´を通過する励起光は、褪色抑制照明領域１０を照射する。

試料Ｓａからの蛍光は、レンズ７を透過し、吸収フィルタ１１を透過した後、観察光学系に導かれる。

本実施形態でも第７実施形態と同様に、観察領域９を照明する光の強度は、ＮＤフィルタ２３により周辺部（褪色抑制照明部）よりも低減されている。
一方、光学部材２２の観察領域９を照明する光の通過位置を中空とし、その周辺をＮＤフィルタとすることも可能である。観察領域９よりも外側にも低い強度の励起光を照明することで、観察領域９外の褪色は抑えつつ、観察領域９周辺で活性酸素を発生させ、観察領域９外にて蛍光物質などと活性酸素を結合させることが出来るという効果を奏する。

（第９実施形態）
図９は第９実施形態の照明装置１８０を示す図である。
励起光照射部である照明光源１、１７の照明範囲は、少なくとも試料Ｓａを観察する観察領域９と、観察領域９の外側周辺の褪色抑制照明領域１０とであり。
さらに、褪色抑制照明領域１０を照射する励起光の波長は、観察領域９を照射する励起光の波長と異なる。

照明光源１、１７（励起光照射部）からの励起光のうち、観察領域９を照射する励起光は、観察領域９である試料Ｓａ面において集光され、褪色抑制照明領域を照明する励起光を、光軸方向にそって試料Ｓａ面とは異なる位置に集光させる。

励起光照射部は、照明光源１（第１励起光照射部）と、照明光源１７（第２励起光照射部）とを有し、照明光源１は、レンズ７を通過して褪色抑制照明領域１０に励起光を照射する落射照明型の照射部であり、照明光源１７は、レンズ７とは反対側から観察領域９の試料Ｓａに励起光を照射する透過照明型の照射部である。

そして、褪色抑制照明領域１０に励起光を照射する照明光源１は、光路中の試料Ｓａと共役な視野絞りの位置に、スリットが形成された光学部材２２を有する。

光学部材２２に形成されたスリット２２´´は、光軸に回転対称な輪帯形状である。そして、図１５（ｃ）に示すように、スリット２２´´は、波長選択素子である。

これにより、観察領域９と異なる波長を観察領域９の外側に照射することで、観察領域９外の観察対象物の褪色を抑制することができる。

また、波長が異なる照明を行う構成は、強度が異なる照明を行う上記実施形態と同様に、例えば、図１０に示す透過型照明と落射型照明との組み合わせ、図１１に示す落射型照明、図１２に示す透過型照明と様々な構成例をとることができる。

（第１０実施形態）
次に、第１０実施形態に係る顕微鏡観察方法について説明する。以下に述べる顕微鏡観察方法は、全て、蛍光物質を有する観察対象物を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための顕微鏡観察方法である。
なお、本出願において、「試料」とは、少なくとも観察対象物を含む物をいう。「観察領域（範囲）」とは、試料に対して観察光が照射され、試料の蛍光観察を行う領域（範囲）をいう。「標本」とは、試料を含む容器、ガラス平板などの全体構成をいう。

図１６（ａ）は、本実施形態の手順を示すフローチャートである。
ステップＳ１０１の励起光照射工程において、試料Ｓａに含まれる蛍光物質を励起させる励起光を照射する。
ステップＳ１０２の酸素濃度抑制工程において、少なくとも試料Ｓａが存在する観察領域の酸素濃度を抑制する。

図１６（ｂ）に示すように、酸素濃度抑制工程は、ステップＳ１０３において観察範囲外で酸素を消費する酸素消費工程を有する。

具体的には、図１７（ａ）に示すように、酸素消費工程は、褪色抑制照明工程と、励起光強度制御工程と、を有する。
ステップＳ２０１において、少なくとも試料Ｓａが存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明する。ステップＳ２０２において、褪色抑制照明工程において照射する励起光の強度を制御する。

また、図１７（ｂ）に示すように、酸素消費工程は、褪色抑制照明工程と、励起光波長制御工程と、を有することでもできる。
ステップＳ２０１において、少なくとも試料Ｓａが存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明する。ステップＳ２０３において、照射する励起光の波長を制御する。

ここで、褪色抑制照明工程において、特定の波長よりも短い波長の励起光を照射することが望ましい。
例えば、試料Ｓａを励起する特定の波長を緑色（Ｇ）光の波長とする。この場合、褪色抑制のためには、紫外（ＵＶ)光、青色（Ｂ）光、緑色（Ｇ）の順に、波長が短い光のほうが望ましい。特に波長は４００ｎｍ以下であることが望ましい。

本実施形態に係る顕微鏡観察方法を実施するための装置構成について説明する。以下、上述した第１実施形態と同一の部分には、同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

図２０は、本実施形態を実施するレーザー顕微鏡の構成を例示した図である。図２０に例示されるレーザー顕微鏡３０１は、それぞれ独立に動作する観察用の走査手段３０５と刺激用の走査手段３２４とを含むことで、標本Ｓｂ上の任意の部位に光刺激を与えながら標本Ｓｂをイメージングしてその反応を観察することができる、いわゆるツインスキャンと呼ばれる構成を有している。

また、レーザー顕微鏡３０１は、刺激光路上に、走査手段３２４に加えて、刺激光を光軸と直交する方向に平行に移動させるシフト手段である平行平板３２３を含んでいる。これにより、レーザー顕微鏡３０１は、制御装置３２６が平行平板３２３及び走査手段３２４を制御することで、標本Ｓｂに対して刺激光を照射する照射位置と照射角度をそれぞれ独立して制御することができる。

図２０を参照しながら、レーザー顕微鏡３０１の構成について具体的に説明する。レーザー顕微鏡３０１は、観察用の励起手段を含む観察手段と、光刺激手段と、制御部３２６と、を含んでいる。

観察手段は、標本Ｓｂを励起する励起光（レーザー光）を射出するレーザー光源３０２と、シャッター３０３と、励起光を反射し蛍光を透過するダイクロイック・ミラー３０４と、励起光の集光位置を標本Ｓｂ上で移動させて標本Ｓｂを走査する走査手段３０５と、結像レンズ３０８と組み合わせて対物レンズ３１０の瞳を走査手段３０５に投影する瞳投影レンズ３０６と、励起光及び蛍光を透過し刺激光を反射するダイクロイック・ミラー３０７と、蛍光を集光させて中間像を形成する結像レンズ３０８と、ミラー３０９と、励起光を標本面上に集光させる対物レンズ３１０と、蛍光を共焦点絞り３１３上に集光させる共焦点レンズ３１２と、対物レンズ３１０の前側焦点位置（標本Ｓｂ）と光学的に共役な位置にピンホールが形成された共焦点絞り３１３と、励起光を遮断するバリアフィルタ３１４と、バリアフィルタ３１４を通過した蛍光を検出する光検出器３１５と、を含んでいる。

走査手段３０５は、標本面における励起光の集光位置を光軸と直交するＸ方向に移動させてＸ方向に標本Ｓｂを走査するガルバノミラー３０５ａと、標本面における励起光の集光位置を光軸及びＸ方向と直交するＹ方向に移動させてＹ方向に標本Ｓｂを走査するガルバノミラー３０５ｂと、を含み、ガルバノミラー３０５ａ及びガルバノミラー３０５ｂは、そのおよそ中間に対物レンズ３１０の瞳面３１０Ｐと光学的に共役な瞳共役面が形成されるように、配置されている。

光刺激手段は、標本Ｓｂを刺激する刺激光（レーザー光）を射出するレーザー光源３１６と、シャッター３１７と、ミラー３１８と、レンズ３１９及びレンズ３２０からなり刺激光のビーム径を変更するビーム径変更光学系と、対物レンズ３１０の前側焦点面（標本面）と光学的に共役な面に配置された開口径が可変な視野絞り３２１と、対物レンズ３１０の瞳面３１０Ｐと共役な瞳共役面に刺激光を集光させる集光レンズ３２２と、刺激光を光軸と直交する方向に平行に移動させる平行平板３２３と、刺激光を標本Ｓｂに照射する照射位置を移動させて標本Ｓｂを走査する走査手段３２４と、結像レンズ３０８と組み合わせて対物レンズ３１０の瞳を走査手段３０５に投影する瞳投影レンズ３２５と、ダイクロイック・ミラー３０７と、結像レンズ３０８と、ミラー３０９と、標本Ｓｂに刺激光を照射する対物レンズ３１０と、を含んでいる。なお、ダイクロイック・ミラー３０７、結像レンズ３０８、ミラー３０９、及び、対物レンズ３１０は、観察手段と共有されている。

走査手段３２４は、標本面における刺激光の照射位置を光軸と直交するＸ方向に移動させてＸ方向に標本Ｓｂを走査するガルバノミラー３２４ａと、標本面における刺激光の照射位置を光軸及びＸ方向と直交するＹ方向に移動させてＹ方向に標本Ｓｂを走査するガルバノミラー３２４ｂと、を含み、ガルバノミラー３２４ａ及びガルバノミラー３２４ｂは、そのおよそ中間に対物レンズ３１０の瞳面３１０Ｐと光学的に共役な瞳共役面が形成されるように、配置されている。ガルバノミラー３２４ａ、ガルバノミラー３２４ｂは、例えば、それぞれＹ軸周り、Ｘ軸周りに回転する。

シフト手段である平行平板３２３は、刺激光が透過する平行平板であって、刺激光が入射する入射面を光軸と直交するＸＹ平面に対して任意の角度に傾けることができる。即ち、平行平板３２３は、Ｘ軸周りにもＹ軸周りにも回転可能に構成されている。

制御部３２６は、レーザー光源３０２、走査手段３０５、光検出器３１５、レーザー光源３１６、平行平板３２３、及び、走査手段３２４に接続されていて、レーザー光源３０２やレーザー光源３１６の発光波長の制御及び/又発光強度の制御、走査手段３０５及び走査手段３２４への走査信号の送信、平行平板３２３の回転制御、光検出器３１５からの電気信号の受信などを行う。
図２０を参照しながら、レーザー顕微鏡３０１全体の動作について概説する。

レーザー光源３０２から平行光として射出された励起光は、シャッター３０３を通過して入射するダイクロイック・ミラー３０４で反射されて、走査手段３０５に入射する。制御部３２６からの走査信号により制御された走査手段３０５は、ガルバノミラー３０５ａ、ガルバノミラー３０５ｂでそれぞれ光軸と直交するＸ方向、Ｙ方向に励起光を偏向する。走査手段３０５から瞳投影レンズ３０６へ入射した励起光は、瞳投影レンズ３０６で収斂されて、収斂光または発散光としてダイクロイック・ミラー３０７を透過し、発散光として結像レンズ３０８に入射する。

励起光は、結像レンズ３０８で再び平行光に変換されて、ミラー３０９を介して入射する対物レンズ３１０により標本Ｓｂ上に集光される。励起光が集光した標本Ｓｂの集光位置では、標本Ｓｂに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光を発する。なお、標本面上における集光位置は、走査手段３０５でのＸ方向、Ｙ方向への偏向量を制御することで、Ｘ方向、Ｙ方向に任意に移動させることができる。

標本Ｓｂから生じた蛍光は、対物レンズ３１０により平行光に変換されて、励起光と同じ光路を反対向きに進行する。即ち、ミラー３０９、結像レンズ３０８、ダイクロイック・ミラー３０７、瞳投影レンズ３０６、及び、走査手段３０５を介してダイクロイック・ミラー３０４に入射する。

ダイクロイック・ミラー３０４に入射した蛍光は、ダイクロイック・ミラー３０４を透過し、共焦点レンズ３１２により標本面（対物レンズ３１０の前側焦点面）と共役な面に配置された共焦点絞り３１３に集光する。焦点位置から生じた蛍光は、共焦点絞り３１３に形成されたピンホールを通過し、さらにバリアフィルタ３１４を通過して、光検出器３１５で検出される。

光検出器３１５は、検出した蛍光を電気信号に変換して、制御部３２６へ送信する。制御部３２６は、光検出器３１５からの電気信号と走査手段３０５へ送信した走査信号とから、標本Ｓｂの画像を生成し、不図示の表示装置に表示する。

一方、レーザー光源３１６から平行光として射出された刺激光は、シャッター３１７を通過して入射するミラー３１８で反射され、レンズ３１９及びレンズ３２０からなるビーム径変更光学系に入射する。ビーム径変更光学系によりビーム径が調整された刺激光は、平行光として視野絞り３２１に入射する。

可変絞りである視野絞り３２１は標本面と光学的に共役な面に配置されている。このため、視野絞り３２１の開口径を調整し視野絞り３２１を通過する刺激光のビーム径を調整することで、標本面における刺激光のビーム径を規定して標本Ｓｂに照射する刺激光の照射範囲を制御することができる。

また、刺激光の強度はガウス分布を有しているが、視野絞り３２１でガウス分布の裾野部分（刺激光の光束の周辺部分）を遮断し、比較的均一な強度分布を有するガウス分布の中心部分（刺激光の光束の中心部分）を選択的に透過させる。これにより、標本Ｓｂに照射される刺激光の強度分布の不均一が抑制されて、標本Ｓｂを比較的均一な強度で照射することができる。

視野絞り３２１を通過した刺激光は、集光レンズ３２２により収斂光に変換されて、収斂光として入射した平行平板３２３を透過する。平行平板３２３を透過した刺激光は、平行平板３２３で、平行平板３２３の屈折率と平行平板３２３への入射角により定まる量だけ光軸と直交する方向に平行移動し、収斂光束として走査手段３２４に入射する。なお、平行平板３２３で刺激光が光軸に対して平行移動する量（以降、シフト量と記す。）は、平行平板３２３を駆動する制御部３２６により制御される。

制御部３２６からの走査信号により制御された走査手段３２４は、ガルバノミラー３２４ａ、ガルバノミラー３２４ｂでそれぞれ光軸と直交するＸ方向、Ｙ方向に刺激光を偏向する。走査手段３２４で偏向され、発散光として瞳投影レンズ３２５へ入射した刺激光は、瞳投影レンズ３２５で平行光に変換されて、ダイクロイック・ミラー３０７に照射される。ダイクロイック・ミラー３０７に入射した刺激光はダイクロイック・ミラー３０７で反射され、結像レンズ３０８によりミラー３０９を介して対物レンズ３１０の瞳面３１０Ｐに集光する。

瞳面３１０Ｐに集光した刺激光は、対物レンズ３１０により再び平行光に変換されて標本Ｓｂに照射される。なお、標本面上における刺激光の照射位置は、走査手段３２４でのＸ方向、Ｙ方向への偏向量を制御することで、Ｘ方向、Ｙ方向に任意に移動させることができる。

次に、刺激光を褪色抑制照明に用いることを説明する。図２１（ａ）は、試料Ｓａをｚ方向（刺激光が進行する方向）から見た図である。観察手段の走査手段３０５により照明光Ｌ１は、試料Ｓａを、光軸（ｚ軸）に垂直なｘｙ面内において、図中左から右へ実線で示すように水平に走査する。照明光Ｌ１は、図中右端の位置から、点線で示す軌跡を通り、図中左の位置へ戻る。点線で示す期間は、照明光Ｌ１はＯＦＦとなっている。照明光Ｌ１のＯＮ・ＯＦＦの切替えは、例えば、照明光Ｌ１の光路をシャッター３０３で遮光すること、レーザー光源３０２をＯＦＦすることで行うことができる。一方、照明光Ｌ１の走査中において、光刺激手段の走査手段３２４のガルバノミラー３２４ａ、ガルバノミラー３２４ｂの２つを連携させて回転駆動させることにより、レーザー光源３１６からの刺激光を観察領域９の周辺部に沿って矩形に移動させる。

これにより、図２１（ａ）において、試料Ｓａの周辺の褪色抑制照明領域１０を刺激光で照明できる。この時、試料Ｓａが刺激光で照明されても良い。この結果、レーザー光源３１６は、少なくとも試料Ｓａが存在する観察領域９の周辺の褪色抑制照明領域１０を照明する。従って、第１実施形態で上述したように、褪色を抑制できる。

本実施形態の他の態様として、化学的に、例えば、特定の波長の光を照射することで活性酸素を発生するような分子を試料Ｓａを載置するスライドガラス上に塗布、または試料Ｓａ中に入れておくこともできる。そして、観察範囲外において、特定の波長の光を照射する。これにより、分子に対して特定の波長の光を照射することで、活性酸素を発生させて、酸素を消費できる。これにより、褪色を抑制できる。ここで、照明光（刺激光）Ｌ１の波長は、より短いほうが好ましい。

図２１（ｂ）は、本実施形態の他の態様を示している。図２１（ｂ）は、レーザー走査顕微鏡の撮影において、試料Ｓａを観察手段のレーザー光源３０２からの照明光により走査している状態を示している。試料Ｓａにおいては、照明光Ｌ３を照射する。そして、褪色抑制照明領域１０ａ、１０ｂにおいて、照明光Ｌ３とは光学的に特性が異なる照明光Ｌ２を照射する。褪色抑制照明領域１０ａ、１０ｂは、本来はブランキング期間として、照明光を照射しない領域である。本実施形態では、あえてブランキング期間となる褪色抑制照明領域１０ａ、１０ｂにおいても、照明光Ｌ２を照射する。

ここで、照明光Ｌ２は、照明光Ｌ３に比較して、光強度を大きくすることが望ましい。照明光の光強度の制御は、ＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ‐Ｏｐｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：音響光学変調素子）を用いること、レーザー光源の出力を制御すること、光路中にＮＤフィルタ等の所定の透過率を有するフィルタを配置することで行うことができる。これにより、褪色抑制照明領域１０ａ、１０ｂにおいて、活性酸素を発生させ、酸素を消費できる。この結果、褪色を抑制できる。

また、照明光Ｌ２は、特定の波長の光、例えば照明光Ｌ３に比較して、波長を短くすることが望ましい。照明光の波長の制御は、ＡＯＭを用いること、光源として、異なる波長の光を出力する複数のＬＥＤを択一的に選択すること、連続波長の光を出力する光源において光路中に波長選択性のフィルタを配置することで行うことができる。

照明光Ｌ２は、上述したように、例えば、試料Ｓａを励起する特定の波長を緑色（Ｇ）光の波長とした場合、褪色抑制のためには、紫外（ＵＶ)光、青色（Ｂ）光、緑色（Ｇ）光の順に、波長が短い光のほうが望ましい。

また、褪色抑制照明は、試料Ｓａを覆う３次元空間に対して行うことができる。図２２（ａ）は、試料Ｓａに対して、褪色抑制照明を光Ｌ４と、光Ｌ４に垂直な方向に光Ｌ５とを照射する様子を示している。これにより、試料Ｓａの周辺空間を３次元的に覆うように、褪色抑制照明を行うことができる。
図２２（ａ）においては、光Ｌ４、光Ｌ５により、試料Ｓａを照明しても良い。

（第１１実施形態）
次に、第１１実施形態に係る顕微鏡観察方法について説明する。

本実施形態において、酸素濃度抑制工程は、観察範囲に酸素が流入することを抑制する酸素流入抑制工程を有することが望ましい。

例えば、図１８（ａ）に示すように、酸素流入抑制工程は、ステップＳ３０１において、観察範囲外において、試料Ｓａ周囲の環境よりも酸素透過率を低くする工程とすることが望ましい。
より具体的には、試料Ｓａの周囲に、試料Ｓａ近傍の酸素透過率に比較して、より酸素透過率が低い媒質を配置する。媒質としては、アルミニウム箔を用いることができる。アルミニウム箔の酸素透過率は、０．００６以下（単位：ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ）である。

さらに好ましくは、観察範囲を覆う領域の酸素透過率を低くすることが望ましい。これにより、さらに褪色抑制を効率良く行うことができる。

（第１１実施形態）
また、図１８（ｂ）に示すように、本実施形態は、酸素流入抑制工程は、ステップＳ３０２において、観察範囲外で、試料Ｓａ周囲の環境よりも粘性を高くすることが望ましい。

さらに好ましくは、図１８（ｃ）に示すように、酸素流入抑制工程は、ステップＳ３０３において、観察範囲を覆う領域で試料Ｓａ周囲の環境よりも粘性を高くすることがより好ましい。これにより、さらに、効率的に褪色を抑制できる。

図２２（ｂ）は、本実施形態の装置の試料近傍の構成を示す。試料Ｓａは、ガラスボトムディシュである標本Ｓｂ内において載置されている。試料Ｓａは、緩衝液４０８内に浸されている。ここで、高粘性媒質供給部４０４は、制御部４０３からの指示信号に従って、標本Ｓｂに高粘性媒質４０５を供給する。これにより、試料Ｓａ外から試料Ｓａへ流入する酸素の流入量、流入速度を抑えることができる。この結果、試料Ｓａの褪色を抑制できる。

好ましくは、酸素濃度抑制工程は、試料Ｓａ周辺の物質の粘性を、特定の粘性よりも高くする工程であることが望ましい。これにより、さらに褪色を抑制できる。

図２３（ａ）は、試料Ｓａを覆うように物理的な壁４０６を構成した状態を示している。物理的な壁４０６は、高粘性の媒質により構成できる。

図２３（ｂ）は、試料Ｓａを覆うようにひまし油の層４０７を形成する例を示す。この層は、２０μｍ以上が望ましい。なお、ディッシュ標本の緩衝液として一般的に使われているリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、略称:ＰＢＳ）を使用する場合の例である。

（第１２実施形態）
第１２実施形態は、図１９に示すように、ステップＳ３０４の酸素濃度検出工程において、試料Ｓａ中の酸素濃度を検出する。ステップＳ３０４の酸素濃度検出工程において検出された酸素濃度に基づいて試料Ｓａ中の酸素濃度を抑制する。酸素濃度の抑制は、上述の各実施形態で述べた内容を用いることができる。ステップＳ３０５において、試料Ｓａが所定の酸素濃度であるか否かが判断される。ステップＳ３０５の判断結果が真（Ｙｅｓ)のとき、処理を終了する。ステップＳ３０５の判断結果が偽（Ｎｏ）のとき、ステップＳ１０２へ戻り、酸素濃度を抑制する工程を行う。

図２４は、本実施形態を行うための装置構成を示している。図１と同一の構成には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。酸素濃度検出部４０１は、試料Ｓａにおける酸素濃度を検出する。
酸素濃度検出部４０１について説明する。酸素濃度の検出する機構として、例えば、以下の３つの構成のいずれかを用いることができる。
（１） 電極を利用した溶存酸素計を用いて、直接検出する。
（２） 蛍光を観察することで酸素濃度を検出する。
（３） 酸素濃度変化に依存して蛍光特性が変化する試薬を用いた蛍光観察を利用する。蛍光寿命や蛍光強度は、酸素濃度に依存する。このため、酸素濃度による蛍光寿命や蛍光強度の変化を検出することで酸素濃度を検出する。

ここでは、電極を利用した溶存酸素計について説明する。溶存酸素を測定する手段としては酸素電極を利用できる。電極内部には２種類の金属である作用電極と対極が配置され、電解液が満たされている。電極先端は、酸素を通過させ、イオンは通さないテフロン（登録商標）膜で覆われている（隔膜式電極）。

テフロン（登録商標）膜を通過した酸素によって，電極内部では金属の酸化還元反応が起こり、通過酸素量に相当する電流が流れる。テフロン（登録商標）膜を通過する酸素の量は、測定液中の溶存酸素濃度に比例する。このため、電流値を測定することで溶存酸素濃度を求めることができる。

隔膜式電極には、外部から一定電圧（０．５〜０．８Ｖ）を印加するポーラログラフ式と、外部からの電圧を加えないガルバニ電池式の２つの方式がある。隔膜式電極では、両電極の構造に大きな違いはないが、作用電極と対極に使用される金属の組合せや電解液が異なる。酸素濃度検出部４０１は、このような構成とすることができる。

制御部４０３は、酸素濃度検出部４０１により検出された酸素濃度に基づいて、例えば、冷却ユニット４０２を制御し、標本Ｓｂの温度を低下させる。動物系の標本では３７℃、植物系の標本では２７℃くらいで観察が行われることが多い。本装置では、観察標本を観察する時に、生命活動できる範囲で、これらの温度よりも低くなるようにする。温度を下げることで、酸素の拡散係数（単位：ｍ^２／ｓ）を低下させる。これにより、酸素の発生を抑制し、褪色を低減できる。

また、レーザー顕微鏡においては、タイムラプス撮影場面において、撮影時のみ酸素濃度が低下するようにすることもできる。

本実施形態は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々変形例をとることができる。

以上のように、本発明は、褪色するまでに照射できる総エネルギーを増やし、且つ褪色を抑制することができる照明装置、これを有する顕微鏡装置及び顕微鏡観察方法に有用である。

１ 照明光源
２、３、４ レンズ
５ 励起フィルタ
６ ダイクロイック・ミラー
７ レンズ
８ ステージ
９ 観察領域
１０ 褪色抑制照明領域
１１ 吸収フィルタ
１２ 反射ミラー
１３ レンズ
１４ カメラ（撮像装置）
１５ コンピュータ
１６ モニタ
１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０ 照明装置
３００ 観察光学系
３０１ レーザー顕微鏡
４００ 顕微鏡観察装置
４０２ 冷却ユニット
４０３ 制御部
４０４ 高粘性媒質供給部
４０５ 高粘性媒質
４０６ 物理的な壁
４０７ 油層
４０８ 緩衝液
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５ 照明光

Claims (33)

1. 蛍光物質を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための照明装置であって、
   前記試料に含まれる前記蛍光物質を励起させる励起光を照射する励起光照射部を有し、
   前記励起光照射部は、少なくとも前記試料が存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明することを特徴とする照明装置。
2. 前記励起光照射部が照明する範囲は、以下の条件式（１）、（２）を満足することを特徴とする請求項１に記載の照明装置。
   １．３＜φexc／φobj （１）
   ０．００２ｍｍ＜φexc−φobj （２）
   ただし、
   φobjは、前記顕微鏡装置が有する対物レンズが観察する領域の試料面における最大直
   径、
   φexcは、前記励起光照射部である照明光源が照射する励起光の前記試料面における最
   大直径、
   である。
3. 以下の条件式（１−１）、（２−１）を満足することを特徴とする請求項２に記載の照明装置。
   ２．０＜φexc／φobj （１−１）
   ０．０４ｍｍ＜φexc−φobj （２−１）
   ただし、
   φobjは、前記顕微鏡装置が有する対物レンズが観察する領域の試料面における最大直径、
   φexcは、前記励起光照射部である照明光源が照射する励起光の前記試料面における最大直径、
   である。
4. 以下の条件式（１−２）、（２−２）を満足することを特徴とする請求項３に記載の照明装置。
   ２．０＜φexc／φobj＜２０ （１−２）
   ０．０４ｍｍ＜φexc−φobj＜２ｍｍ （２−２）
   φobjは、前記顕微鏡装置が有する対物レンズが観察する領域の試料面における最大直径、
   φexcは、前記励起光照射部である照明光源が照射する励起光の前記試料面における最大直径、
   である。
5. 前記励起光照射部は、前記対物レンズを透過して前記試料に前記励起光を照射する落射照明型であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の照明装置。
6. 前記励起光照射部は、前記試料に対して前記対物レンズとは反対側から前記試料に前記励起光を照射する透過照明型であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の照明装置。
7. 前記励起光照射部は、
   前記対物レンズを通過して前記試料に前記励起光を照射する落射照明型の第１励起光照射部と、
   前記試料に対して前記対物レンズとは反対側から前記試料に前記励起光を照射する透過照明型の第２励起光照射部と、を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の照明装置。
8. 前記励起光照射部の照明範囲は、少なくとも前記試料を観察する観察領域と、前記観察領域の外側周辺の褪色抑制照明領域と、であり、
   さらに、前記褪色抑制照明領域を照射する励起光の強度は、前記観察領域を照射する励起光の強度と異なることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の照明装置。
9. 前記褪色抑制照明領域を照射する前記励起光の強度は、前記観察領域を照射する前記励起光の強度よりも大きいことを特徴とする請求項８に記載の照明装置。
10. さらに、照明光学系を有し、
    前記励起光照射部からの励起光のうち、
    前記観察領域を照射する励起光は、前記観察領域である試料面において集光され、
    前記励起光照射部は、前記褪色抑制照明領域を照明する励起光を、光軸方向にそって試料面とは異なる位置に集光させることを特徴とする請求項７または８に記載の照明装置。
11. 前記励起光照射部は、第１励起光照射部と、第２励起光照射部とを有し、
    前記第１励起光照射部は、前記対物レンズを通過して前記褪色抑制照明領域に前記励起光を照射する落射照明型の照射部であり、
    前記第２励起光照射部は、前記対物レンズとは反対側から前記観察領域の前記試料に前記励起光を照射する透過照明型の照射部とを有し、
    前記褪色抑制照明領域に前記励起光を照射する前記第１励起光照射部は、光路中の前記試料と共役な視野絞りの位置に、スリットが形成された光学部材を有することを特徴とする請求項８に記載の照明装置。
12. 前記光学部材に形成された前記スリットは、光軸に回転対称な輪帯形状であることを特徴とする請求項１１に記載の照明装置。
13. 前記励起光照射部は、前記対物レンズを通過して前記試料に前記励起光を照射する落射照明型の照射部であり、
    前記光学部材は、前記スリットよりも光軸側にＮＤフィルタを有し、
    前記ＮＤフィルタを通過する励起光は、前記観察領域を照射し、
    前記スリットを通過する励起光は、前記褪色抑制照明領域を照射することを特徴とする請求項１２に記載の照明装置。
14. 前記励起光照射部は、前記試料に対して前記対物レンズとは反対側から前記試料に前記励起光を照射する透過照明型の照射部であり、
    光路中の前記試料と共役な視野絞りの位置に、前記光学部材を有し、
    前記光学部材は、前記スリットよりも光軸側に配置されているＮＤフィルタを有し、
    前記ＮＤフィルタを通過する励起光は、前記観察領域を照射し、
    前記スリットを通過する励起光は、前記褪色抑制照明領域を照射し、
    光軸方向にそって試料面とは異なる位置に集光させることを特徴とする請求項８に記載の照明装置。
15. 前記励起光照射部の照明範囲は、少なくとも前記試料を観察する観察領域と、前記観察領域の外側周辺の褪色抑制照明領域と、であり、
    さらに、前記褪色抑制照明領域を照射する励起光の波長は、前記観察領域を照射する励起光の波長と異なることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の照明装置。
16. さらに、照明光学系を有し、
    前記励起光照射部からの励起光のうち、
    前記観察領域を照射する励起光は、前記観察領域である試料面において集光され、
    前記照明光学系は、前記褪色抑制照明領域を照明する励起光を、光軸方向にそって試料面とは異なる位置に集光させることを特徴とする請求項１５に記載の照明装置。
17. 前記励起光照射部は、第１励起光照射部と、第２励起光照射部とを有し、
    前記第１励起光照射部は、前記対物レンズを通過して前記褪色抑制照明領域に前記励起光を照射する落射照明型の照射部であり、
    前記第２励起光照射部は、前記対物レンズとは反対側から前記観察領域の前記試料に前記励起光を照射する透過照明型の照射部とを有し、
    前記褪色抑制照明領域に前記励起光を照射する前記第１励起光照射部は、光路中の前記試料と共役な視野絞りの位置に、スリットが形成された光学部材を有することを特徴とする請求項１５に記載の照明装置。
18. 前記光学部材に形成された前記スリットは、光軸に回転対称な輪帯形状であることを特徴とする請求項１７に記載の照明装置。
19. 前記励起光照射部は、前記対物レンズを通過して前記試料に前記励起光を照射する落射照明型の照射部であり、
    光路中の前記試料と共役な視野絞りの位置に、スリットが形成された光学部材を有し、
    前記光学部材は、前記スリットよりも光軸側に波長選択素子を有し、
    前記波長選択素子を通過する励起光は、前記観察領域を照射し、
    前記スリットを通過する励起光は、前記褪色抑制照明領域を照射することを特徴とする請求項１５に記載の照明装置。
20. 前記励起光照射部は、
    前記試料に対して前記対物レンズとは反対側から前記試料に前記励起光を照射する透過照明型の照射部であり、
    さらに、光路中の前記試料と共役な視野絞りの位置に、スリットが形成された光学部材を有し、
    前記光学部材は、前記スリットよりも光軸側に配置されている波長選択素子を有し、
    前記波長選択素子を通過する励起光は、前記観察領域を照射し、
    前記スリットを通過する励起光は、前記褪色抑制照明領域を照射することを特徴とする請求項１５に記載の照明装置。
21. 試料を保持するステージと、
    前記試料を照射する励起光を発する照明装置と、前記試料に対向して設置される対物レンズとの少なくとも一方を有し、
    前記照明装置は、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の照明装置であり、
    前記試料を蛍光観察することを特徴とする顕微鏡装置。
22. 蛍光物質を有する観察対象物を含む試料を顕微鏡装置により蛍光観察するための顕微鏡観察方法であって、
    前記試料に含まれる前記蛍光物質を励起させる励起光を照射する励起光照射工程と、 少なくとも前記試料が存在する観察領域の酸素濃度を抑制する酸素濃度抑制工程と、を有することを特徴とする顕微鏡観察方法。
23. 前記酸素濃度抑制工程は、観察範囲外で酸素を消費する酸素消費工程を有することを特徴とする請求項２２に記載の顕微鏡観察方法。
24. 前記酸素消費工程は、
    少なくとも前記試料が存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明する褪色抑制照明工程と、
    前記褪色抑制照明工程において照射する励起光の強度を制御する励起光強度制御工程と、
    を有することを特徴とする請求項２３に記載の顕微鏡観察方法。
25. 前記酸素消費工程は、
    少なくとも前記試料が存在する観察領域の周辺の褪色抑制照明領域を照明する褪色抑制照明工程と、
    前記褪色抑制照明工程において照射する励起光の波長を制御する励起光波長制御工程と、
    を有することを特徴とする請求項２３に記載の顕微鏡観察方法。
26. 前記褪色抑制照明工程において、特定の波長よりも短い波長の励起光を照射することを特徴とする請求項２５に記載の顕微鏡観察方法。
27. 前記酸素濃度抑制工程は、前記観察範囲に酸素が流入することを抑制する酸素流入抑制工程を有することを特徴とする請求項２２に記載の顕微鏡観察方法。
28. 前記酸素流入抑制工程は、前記観察範囲外において、前記試料周囲の環境よりも酸素透過率を低くする工程を有することを特徴とする請求項２７に記載の顕微鏡観察方法。
29. 前記酸素流入抑制工程は、前記観察範囲を覆う領域で前記試料周囲の環境よりも酸素透過率を低くする工程であることを特徴とする請求項２８に記載の顕微鏡観察方法。
30. 前記酸素流入抑制工程は、前記観察範囲外において、前記試料周囲の環境よりも粘性を高くする工程を有することを特徴とする請求項２７に記載の顕微鏡観察方法。
31. 前記酸素流入抑制工程は、前記観察範囲を覆う領域で前記試料周囲の環境よりも粘性を高くする工程であることを特徴とする請求項３０に記載の顕微鏡観察方法。
32. 前記酸素濃度抑制工程は、前記試料周辺の物質の粘性を、特定の粘性よりも高くする工程であること特徴とする請求項２２に記載の顕微鏡観察方法。
33. さらに、前記試料中の酸素濃度を検出する酸素濃度検出工程と、
    前記酸素濃度検出工程において検出された酸素濃度に基づいて前記試料中の酸素濃度を制御する酸素濃度抑制工程を有することを特徴とする請求項２３、２７または３３に記載の顕微鏡観察方法。

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