JP2016000713A - 線維芽細胞増殖因子４に対するハイブリドーマクローンおよびモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】癌等の様々な疾患のための診断及び治療ツールとして役立つ線維芽細胞増殖因子受容体ＦＧＦＲ４を特異的に標的とする、及び／又はＦＧＦＲ４が媒介するシグナル伝達に干渉する物質及びそれらの使用方法の提供。
【解決手段】野生型非還元ＦＧＦＲ４ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体、及び前記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株。前記抗体が、ＩｇＧ１、カッパ鎖アイソタイプであり、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、及び放射性同位体標識から選択される１種またはそれより多くの標識で標識されている、モノクローナル抗体。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１３年３月１２日付けで出願された米国出願番号６１／７７７，７２０に対して利益を主張する２０１４年３月１２日付けで出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２５０９７に関し、それに対して優先権を主張し、これらの全内容および開示は、参照により本明細書に組み入れられる。

電子出願された材料の参照による組み込み
[0002]同時に提出された、２０１４年３月１２日に作製された「ＦＧＦＲ４Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５」と名付けられた１つの１０，２５６キロバイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルであるコンピューターで読取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストを、参照により本明細書にその全体を組み入れる。

発明の分野
[0003]本発明は、ハイブリドーマクローンおよびモノクローナル抗体に関し、より特定には、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）に対するハイブリドーマクローンおよびモノクローナル抗体、ならびに使用方法に関する。

[0004]線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは、４種の受容体チロシンキナーゼ（線維芽細胞増殖因子受容体１〜４）および１種のキナーゼ欠損受容体（線維芽細胞増殖因子受容体５）に結合する構造的に関連するポリペプチドで構成される（Eswarakumarら（2005）Cytokine Growth Factor Rev 16：139；Ornitzら（2001）Genome Biol 2：3005.1；Sleemanら（2001）Gene 271：171）。ＦＧＦ受容体は、これまでに２３種の固有なメンバーがみつかっているＦＧＦファミリーによって活性化される可能性がある（Eswarakumarら（2005）Cytokine Growth Factor Rev 16：139；Yamashita，T.（2005）Therapeutic Apheresis and Dialysis、9：313）。２つのスプライス変異体しかわかっていない線維芽細胞増殖因子受容体４に対して、例えば線維芽細胞増殖因子受容体１〜３などの他のファミリーは、複数のスプライスの多様性により様々なＦＧＦに対するそれらの親和性において異なっている可能性がある（van Heumenら（1999）IUBMB Life 48：73）。

[0005]線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、細胞生存、運動性、発達、および血管新生などの必須のプロセスを調節するために、これらの受容体は癌生物学において極めて興味深い。ヒトにおいて、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４を包含するファミリー全体で高度に保存されたアミノ酸配列を有する。これらの細胞表面受容体は、細胞外免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを包含する。ＦＧＦとＦＧＦＲ１〜４との相互作用は、受容体のホモ二量体化と自己リン酸化、例えばＦＲＳ２などの細胞質アダプターの補充、および複数のシグナル伝達経路の開始を引き起こす（Powersら（2000）Endocr Relat Cancer 7：165；Schlessinger、J.（2004）Science 306：1506）。

[0006]ＦＧＦＲ４は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ９によって活性化されるが、それぞれ効率は低い（Ornitzら（1996）J．Biol.Chem.271：15292）。これらのＦＧＦはそれぞれさらに他のＦＧＦＲファミリーも活性化するが、ＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４に特異的である（Xieら（1999）Cytokine JID-900535311：729）。ＦＧＦによるＦＧＦＲ４の活性化は、ヘパリンへのリガンドの結合を必要とするが、ＦＧＦＲ４は、ヘパリン単独によっても活性化される可能性がある（GaoおよびGoldfarb（1995）EMBO J．14：2183）。多くのＦＧＦは広範なマイトジェンであるが、そのうちいくつかは細胞の運動性を誘導するか、または細胞分化の状態を変更する（McKeehanら（1998）Prog Nucleic Acid Res Mol.Biol 59：135）。インビボにおいて、いくつかのＦＧＦは有力な血管新生特性を有し、他のものは創傷治癒を含む組織再構築に関与している（Wernerら、（1994）Science 266：819）。

[0007]ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインにリガンドが結合すると、この受容体は二量体化し、ＴＫドメインにおいて残基のリン酸化を引き起こす。このリン酸化は、細胞内ドメインへのシグナル伝達分子の補充を誘導し、それによって１種またはそれより多くのシグナル伝達経路を活性化する（Vainikkaら（1992)EMBO J 11：4273；Vainikkaら（1994）J. Biol. Chem.269：18320）。例えば、ＦＧＦＲ４がＰＬＣ−γ１と結合すると、ＦＧＦ刺激によるＭＡＰキナーゼの活性化とＤＮＡ合成の増加が観察されている。他のヒトＦＧＦＲファミリーとのさらなる相互作用は、ＦＧＦＲ４のシグナル伝達能力を拡張する可能性があり、シグナルの多様化だけでなくシグナルの増幅も達成できる（McKeehanおよびKan（1994）Mol Reprod Dev 39：69）。８５ｋＤａのセリンキナーゼはＦＧＦＲ４のチロシンリン酸化を負に調節することが見出されているが、その正確な機能は解明されていない（Vainikkaら（1996）J Biol Chem 271：1270）。ＦＧＦＲ４とＮＣＡＭとの結合は、腫瘍転移に決定的な役割を果たすインテグリン依存性接着を媒介することが実証されている（Cavallaroら（2001）Nat Cell Biol 3：650）。

[0008]ＦＧＦおよびＦＧＦＲは、細胞増殖、移動、走化性、分化、形態形成、および血管新生を調節することにより発達と組織修復において重要な役割を果たす（Ornitzら（2001）Genome Biol 2：3005.1；Augusteら（2003）Cell Tissue Res 314：157；Steilingら（2003）Curr Opin Biotechnol 14：533）。数種のＦＧＦおよびＦＧＦＲが、乳癌、前立腺癌、頸部癌、胃癌、および結腸癌の病因に関連している（Jeffersら（2002）Expert Opin Ther Targets 6：469；Mattilaら（2001）Oncogene 20：2791〜2；Ruoholaら（2001）Cancer Res 61：4229；Marshら（1999）Oncogene 18：1053；Shimokawaら（2003）Cancer Res 63：6116；Jang（2001）Cancer Res 61：3541；Cappellen（1999）Nat Genet 23：18；Gowardhan（2005）Br J Cancer 92：320）。

[0009]加えて、ＦＧＦＲ４発現は広く分布しており、発達中の骨格筋、肝臓、肺、膵臓、副腎、腎臓、および脳などの組織で報告されている（Kanら（1999）J Biol Chem 274：15947；Nicholesら（2002）Am J Pathol 160：2295；Ozawaら（1996）Brain Res Mol Brain Res 41：279；Starkら（1991）Development 113：641）。乳腺腺癌および卵巣腺癌で、ＦＧＦＲ４の増幅が報告されている（Jaakkolaら（1993）Int J Cancer 54：378）。その上、ＦＧＦＲ４の突然変異および欠損は、悪性腫瘍と相関しており、いくつかのケースでは、前立腺および肺腺癌、頭頸部扁平上皮癌、軟部組織肉腫、星状細胞腫、および下垂体腺腫の予後に相間している（Jaakkolaら（1993）Int J Cancer 54：378；Morimoto （2003）Cancer 98：2245；Qian（2004）J Clin Endocrinol Metab 89：1904；Spinolaら（2005）J Clin Oncol 23：7307；Streitら（2004）Int J Cancer 111：213；Wang（1994）Mol Cell Biol 14：181；Yamada（2002）Neurol Res 24：244）。加えて、ＦＧＦＲ４のポリペプチド配列のアミノ酸３８８における多形は、黒色腫（Streitら、2006）、乳房の癌腫（Bangeら、2002）、前立腺の癌腫（Wangら（2004）Clin Cancer Res.10：6169）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）（Streitら（2004）Int J Cancer 111：213）、肺腺癌（Spinolaら（2005）J Clin Oncol 23：7307）、および軟部組織肉腫（Morimotoら（2003）Cancer 98：2245）におけるより侵襲性の高い疾患状態と関連する。

[0010]興味深いことに、マウスにおける筋特異的プロモーターの制御下におけるＦＧＦＲ４特異的リガンドであるＦＧＦ１９のトランスジェニック発現は、肝細胞癌を引き起こすことが見出された（Nicholesら（2002）Am J Pathol 160：2295）。

Eswarakumarら（2005）Cytokine Growth Factor Rev 16：139 Ornitzら（2001）Genome Biol 2：3005.1 Sleemanら（2001）Gene 271：171 Yamashita，T.（2005）Therapeutic Apheresis and Dialysis、9：313 van Heumenら（1999）IUBMB Life 48：73 Powersら（2000）Endocr Relat Cancer 7：165；Schlessinger、J.（2004）Science 306：1506 Ornitzら（1996）J．Biol.Chem.271：15292 Xieら（1999）Cytokine JID-900535311：729 GaoおよびGoldfarb（1995）EMBO J．14：2183 McKeehanら（1998）Prog Nucleic Acid Res Mol.Biol 59：135 Wernerら、（1994）Science 266：819 Vainikkaら（1992)EMBO J 11：4273 Vainikkaら（1994）J. Biol. Chem.269：18320 McKeehanおよびKan（1994）Mol Reprod Dev 39：69 Vainikkaら（1996）J Biol Chem 271：1270 Cavallaroら（2001）Nat Cell Biol 3：650 Ornitzら（2001）Genome Biol 2：3005.1 Augusteら（2003）Cell Tissue Res 314：157 Steilingら（2003）Curr Opin Biotechnol 14：533 Jeffersら（2002）Expert Opin Ther Targets 6：469 Mattilaら（2001）Oncogene 20：2791〜2 Ruoholaら（2001）Cancer Res 61：4229 Marshら（1999）Oncogene 18：1053 Shimokawaら（2003）Cancer Res 63：6116 Jang（2001）Cancer Res 61：3541 Cappellen（1999）Nat Genet 23：18 Gowardhan（2005）Br J Cancer 92：320 Kanら（1999）J Biol Chem 274：15947 Nicholesら（2002）Am J Pathol 160：2295 Ozawaら（1996）Brain Res Mol Brain Res 41：279 Starkら（1991）Development 113：641 Jaakkolaら（1993）Int J Cancer 54：378 Morimoto （2003）Cancer 98：2245 Qian（2004）J Clin Endocrinol Metab 89：1904 Spinolaら（2005）J Clin Oncol 23：7307 Streitら（2004）Int J Cancer 111：213 Wang（1994）Mol Cell Biol 14：181 Yamada（2002）Neurol Res 24：244 Streitら、2006 Bangeら、2002 Wangら（2004）Clin Cancer Res.10：6169 Streitら（2004）Int J Cancer 111：213 Spinolaら（2005）J Clin Oncol 23：7307 Morimotoら（2003）Cancer 98：2245 Nicholesら（2002）Am J Pathol 160：2295

[0011]したがって、ＦＧＦＲ４を特異的に標的とする、および／またはＦＧＦＲ４が媒介するシグナル伝達に干渉する物質が求められている。固有な結合と機能的な特徴を含む固有な遺伝子構造およびアミノ酸構造を有する抗ＦＧＦＲ４抗体が特に有用である。このような抗体は、癌などの様々な疾患のための診断および治療ツールとして役立つ可能性がある。

[0012]本発明のいくつかの実施態様は、ＦＧＦＲ４に結合する抗体およびそれらのフラグメントを包含する。本発明はまた、ＦＧＦＲ４に特異的に結合する１種またはそれより多くの抗体を生産する１種またはそれより多くのハイブリドーマ細胞株、および本抗体の使用方法も対象とする。いくつかの実施態様において、本抗体は、モノクローナル抗体である。その上、いくつかの実施態様において、本モノクローナル抗体は、野生型非還元ＦＧＦＲ４ポリペプチドを認識する。

[0013]本発明のいくつかの実施態様は、野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合する抗体およびそれらのフラグメントを包含する。例えば、本抗体のうち少なくともいくつかは、配列番号１のＦＧＦＲ４ポリペプチドに特異的に結合する。他の形態において、本抗体のうち少なくともいくつかは、配列番号２を含むＦＧＦＲ４ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合する。

[0014]本発明の抗体は、好ましくは、ヒトＦＧＦＲ４タンパク質に対する、より好ましくはその野生型の非還元形態のヒトＦＧＦＲ４に対する特異的結合特性を有する単離されたモノクローナル抗体である。本抗体は、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、および放射性同位体標識からなる群より選択される１種またはそれより多くの標識で標識されていてもよい。

[0015]本発明のいくつかの実施態様は、１種またはそれより多くのハイブリドーマ細胞株によって生産されるモノクローナル抗体を包含する。例えば、本発明は、ＡＴＣＣに、ＰＴＡ−１２１０１９というＡＴＣＣ受入番号で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３によって生産されたモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性を含むモノクローナル抗体を包含する。

[0016]本発明のいくつかの実施態様は、ハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３を提供することを包含する、モノクローナル抗体の作製方法を包含する。このハイブリドーマ細胞株は、ヒトＦＧＦＲ４に特異的なモノクローナル抗体を生産できる。いくつかの形態において、本方法は、モノクローナル抗体の生産が可能な条件下でハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３を培養することを包含する。

[0017]追加の目的、利点、および新規の特徴は、以下の説明に記載されるか、または以下の図面の試験と詳細な説明を参照すれば当業者には明らかになると予想される。

[0018]図面に本発明の例示的および代表的な実施態様を示す。

図１は、本明細書において開示されたハイブリドーマを生産するのに用いられる工程を例示する。 図２は、本明細書で説明される方法を使用して生成した複数のハイブリドーマクローンのＦＧＦＲ４結合性能のＥＬＩＳＡによるスクリーニングからの光学密度（ＯＤ）の結果を包含する棒グラフを表する。 図３は、フローサイトメトリーの重ね合わせ図を表し、ここで、ｍＡｂ ＢＴ５３と異なる蛍光色素を有する２種の異なる二次抗体とを使用して、２種の横紋筋肉腫細胞株でのＦＧＦＲ４タンパク質の認識が例示される。特に左の２つの重ね合わせ図では、二次抗体は、近赤外蛍光色素のＤｙ６４９を使用した。右の２つの重ね合わせ図は、より低い波長で読み取られるＲ−フィコエリトリンを使用した。これらの重ね合わせ図において、ｘ軸でゼロの近くに配された実線のプロットは、陰性対照の抗マウスＩｇＧ抗体で染色された細胞群を示す。実線ではないプロットは、ＢＴ５３ｍＡｂで染色された細胞群を示す。

[0022]本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）を認識する抗体を対象とする。本発明はまた、本抗体を生産するハイブリドーマ細胞株、および本抗体の使用方法も対象とする。より具体的には、本発明者らは、ＢＴ５３と名付けられたヒトＦＧＦＲ４タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマクローンを生産した。抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体は、ヒトＦＧＦＲ４をその野生型の形態で認識する。本発明のいくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体は、野生型ＣＤ９ヒトＦＧＦＲ４をその野生型の非還元形態で認識する。

[0023]用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、一般的には、対象となる特定の抗原標的に免疫特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を指す。したがって用語「抗体」は、これらに限定されないが、野生型抗体およびそれらの変異体、野生型抗体およびそれらの変異体のフラグメント、ペプチボディ（peptibodies）およびそれらの変異体、ならびに抗体またはそれらの特定のフラグメントもしくは部分、例えばそれらの単鎖抗体およびフラグメントなどの構造および／または機能を模倣する抗体模倣剤を包含する。したがって用語「抗体」は、全長の抗体および／またはそれらの変異体、加えてそれらのフラグメントを包含する。抗体の標的への結合は、例えば、これらに限定されないが、インビトロ、インサイチュ、および／またはインビボで、少なくとも１種の標的となる活性もしくは結合、または受容体の活性もしくは結合を、このような結合により調節する、減少させる、増加させる、拮抗する、刺激する、軽減する、緩和する、ブロックする、阻害する、阻止する、および／または干渉するといった様々な作用を引き起こす可能性がある。したがって本発明は、生体分子（例えば抗原もしくは受容体）またはそれらの一部に結合が可能な抗体フラグメントを包含し、このようなものとしては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント（例えばCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（Colliganら編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、1994〜2001）を参照）；二重特異性抗体；線状抗体（Zapataら（1995）Protein Eng．8（10）：1057）；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性を有する抗体などが挙げられる。

[0024]したがって、抗体は最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一の抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体なども包含する）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＦＧＦＲ４抗体組成物、単鎖の抗ＦＧＦＲ４抗体、および抗ＦＧＦＲ４抗体のフラグメントを包含する。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、この実質的に均一な抗体の集団とはすなわち、天然に存在し得る突然変異がわずかな量で存在する可能性があることを除けば、集団を構成する個々の抗体が同一であることを言う。モノクローナル抗体は、「ｍＡｂ」と略記される場合もある。

[0025]「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識部位および抗原−結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが強い非共有結合で結合した二量体からなる。この立体構造で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原−結合部位が定められる。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原−結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも親和性は低いが抗原を認識してそれと結合する能力を有する。

[0026]またＦａｂフラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１つまたはそれより多くのシステインなどの、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基が付加されている点でＦａｂ’フラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントはもともと、間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして生産された。他の抗体フラグメントの化学的カップリングも公知である。

[0027]あらゆる脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる明確に異なる２つのタイプのどちらかに分類できる。

[0028]免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて様々なクラスに分類できる。５つの主要な免疫グロブリンのクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられる。

[0029]「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでおり、それによりｓＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの総論に関しては、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編、シュプリンガー−フェアラーク（Springer-Verlag）、ニューヨーク、269〜315頁（1994）を参照されたい。

[0030]用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原−結合部位を有する小さい抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）中で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖中で２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させて、２つの抗原−結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollingerら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：6444でより詳細に説明されている。

[0031]「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の汚染成分は、抗体にとって診断または治療用途の妨げになると予想される、例えば酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク性溶質などの材料である。好ましい実施態様において、抗体は、ローリー法によって決定した場合、（１）抗体の９５重量％より高度に、最も好ましくは９９重量％より高度に精製されるか、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基が得られる程度に精製されるか、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき均質になるように精製されると予想される。抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないのであれば、単離された抗体は、組換え細胞内の自然の位置で存在する抗体も包含する。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程で調製されると予想される。

[0032]「野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチド」または「野生型配列のＦＧＦＲ４タンパク質」は、それに相当する自然から誘導されたＦＧＦＲ４ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチドは自然から単離してもよいし、または組換えまたは合成方法によって生産してもよい。用語「野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチド」は、具体的には、特定のＦＧＦＲ４ポリペプチドの天然に存在する切断された形態、分泌された形態、および／または膜に結合した形態、このようなポリペプチドの天然に存在する変異体の形態（例えばオルタナティブスプライシングされた形態）ならびに天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。本発明の様々な実施態様において、本明細書において開示された野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチドは、本明細書で列挙された全長アミノ酸配列を含む、成熟した、または全長の野生型配列のポリペプチドである。いくつかの実施態様において、この「野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントを含む。さらに、いくつかの実施態様において、この「野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチド」は、全長ポリペプチドまたはタンパク質のフラグメント、例えば配列番号２のアミノ酸などを含む。

[0033]本明細書では同義的に使用される用語「個体」、「対象」、および「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物（例えば非霊長類および霊長類など）を指し、その例としては、これらに限定されないが、マウス、サル、ヒト、哺乳類の家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジ）、哺乳類の競技用動物（例えばウマ）、および哺乳類のペット（例えばイヌおよびネコ）が挙げられ；好ましくは、この用語はヒトを指す。

[0034]用語「処置」、「処置すること」などは、本明細書で使用される場合、望ましい薬理学的および／または生理学的な作用を得ることを指す。この作用は、疾患の部分的または完全な治療の観点から治療効果を有する場合もあるし、および／または疾患に起因する有害作用の場合もある。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患または状態を処置するための本発明の化合物の投与を包含し、さらに：（ａ）疾患を抑制すること、すなわちその発達を止めること；（ｂ）緩和ケアを提供すること、すなわち患者の苦痛を少なくしてそれを防ぐこと；および（ｃ）疾患を和らげること、すなわち疾患もしくは障害を縮小させること、またはそれらの症状もしくは合併症を緩和することを包含する。最適な望ましい応答が達成されるように、投薬レジメンを調節してもよい。

[0035]用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、抗原性分子の一部であって、それに対応するように生産された抗体が結合する部分を指す。「ＦＧＦＲ４エピトープ」は、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体が特異的に結合するＦＧＦＲ４タンパク質の部分を含む。エピトープは、直鎖状のアミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が、一つずつ直鎖状に連続して配置されている）、非直鎖状のアミノ酸残基、または直鎖状のアミノ酸残基と非直鎖状のアミノ酸残基の両方を含んでいてもよい。典型的には、エピトープは、一般的に短いアミノ酸配列（例えば約５アミノ酸の長さ）である。

モノクローナル抗体
[0036]あるいは、抗ＦＧＦＲ４抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。例えばKohlerおよびMilstein（1975）Nature 256：495によって説明されている方法などのハイブリドーマ法を使用して、モノクローナル抗体を調製してもよい。ハイブリドーマ法において、典型的には、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫化して、免疫剤に特異的に結合すると予想される抗体を生産させるか、またはそのような抗体を生産可能なリンパ球を発生させる。あるいは、このようなリンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。

[0037]典型的には、免疫剤は、ＦＧＦＲ４ポリペプチド、それらの一部、それらの融合タンパク質、および／またはＦＧＦＲ４を発現する細胞の全細胞（すなわち、固定した、または生きた細胞）もしくはフラグメントを包含する。例えば、ヒト血小板はＦＧＦＲ４を発現することが知られており、そのため固定したヒト血小板は免疫剤として使用できる。一般的に、ヒト由来細胞が望ましい場合は末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望ましい場合は脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いでリンパ球と不死化細胞株とを例えばポリエチレングリコールなどの好適な融合化剤を使用して融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding（1986）Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、Academic Press、59〜103頁）。不死化細胞株は、形質転換した哺乳動物細胞であってもよく、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト由来の骨髄腫細胞であってもよい。ラットまたはマウス骨髄腫細胞株を採用してもよい。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種またはそれより多くの物質を含有する好適な培地で培養してもよい。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を有さない場合、ハイブリドーマ用培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を包含すると予想され、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐものである。

[0038]好ましい不死化細胞株は、効率的に融合して、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を促進し、例えばＨＡＴ培地などの培地に感受性を有する細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫細胞系であり、これは、例えば、カリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所細胞流通センター（Salk Institute Cell Distribution Center）、およびバージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から得ることができる。またヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、ヒトモノクローナル抗体生産についても説明されている（Kozbor（1984）J．Immunol.133：3001；Brodeurら（1987）Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、マルセル・デッカー社（Marcel Dekker，Inc.）、ニューヨーク、51〜631頁）。

[0039]次いでハイブリドーマ細胞を培養する培地を、ＦＧＦＲ４またはそれらのフラグメントに対するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイしてもよい。ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定してもよいし、または例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロの結合アッセイによって決定してもよい。このような技術およびアッセイは当業界公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonおよびPollard（1980）Anal．Biochem．107：220のスキャッチャード分析によって決定してもよい。

[0040]望ましいハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングして、標準的な方法によって増殖させてもよい（Goding、上記）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水のようなインビボの環境で増殖させてもよい。

[0041]サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地または腹水から単離または精製できる。

[0042]またモノクローナル抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明されている方法などの組換えＤＮＡ法によって作製してもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用した手法）を使用して容易に単離し配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい源として役立つ。ＤＮＡが単離されたら、それを発現ベクターに入れて、次いでこれを例えば他の状況では免疫グロブリンタンパク質を生産しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成してもよい。また、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、それと相同なマウスの配列と置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら、上記）、または免疫グロブリンのコード配列と、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部とを共有結合で合体させることにより、ＤＮＡを改変してもよい。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換されてもよいし、またはキメラ２価抗体が形成されるように本発明の抗体のいずれかの抗原結合部位の可変ドメインと置換されてもよい。

[0043]抗体は、１価抗体であってもよい。１価抗体の調製方法は当業界周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と改変された重鎖との組換え発現に関する方法である。一般的に、重鎖は、重鎖の架橋形成を防ぐためにＦｃ領域中のあらゆるポイントで切断されていてもよい。あるいは、架橋形成が起こらないように、関連するシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているか、または欠失している。

[0044]またインビトロの方法も、１価抗体を調製するのに好適である。それらのフラグメントを生産するための抗体の消化は、当業界公知の慣例的な技術を使用して達成できる。

[0045]本発明の抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体は、ＦＧＦＲ４ポリペプチド、好ましくは野生型配列のＦＧＦＲ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体の全体または抗原結合フラグメントであってもよい。さらに、好ましい実施態様において、モノクローナル抗体は、ＦＧＦＲ４タンパク質を認識するラボ番号ｍＡｂ ＢＴ５３のモノクローナル抗体である。

[0046]非限定的な実施態様の１つにおいて、モノクローナル抗体は、抗体またはそれらの機能的なフラグメントがＦＧＦＲ４タンパク質またはそれらのフラグメントに結合するようにハイブリドーマ細胞株によって生産される。一実施態様において、モノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ１、カッパ鎖アイソタイプに由来するものである。

[0047]より具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含み、ここで前記ＨＣＶＲは：ａ）ＣＤＲＨ１におけるペプチド、ｂ）ＣＤＲＨ２におけるペプチド、ｃ）ＣＤＲＨ３におけるペプチドを含み、前記ＬＣＶＲは：ａ）ＣＤＲＬ１におけるペプチド、ｂ）ＣＤＲＬ２におけるペプチド、およびｃ）ＣＤＲＬ３におけるペプチドを含む。

ヒト抗体およびヒト化抗体
[0048]ヒトで使用するために、本発明のマウスモノクローナル抗体をヒト化して、免疫原性を低下させてもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化された形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２など、または抗体の他の抗原−結合部分配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、例えば望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、それに相当する非ヒト残基で置き換えられている。またヒト化抗体は、レシピエント抗体中、または移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むと予想され、そのうちＣＤＲ領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域に相当する。最適には、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むと予想される（Jonesら（1986）Nature 321：522；Riechmannら（1988）Nature 332：323；およびPresta（1992）Curr．Op．Struct．Biol．2：593）。

[0049]非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界周知である。アプローチの一例は、マウスモノクローナル抗体の元の可変領域をヒト免疫グロブリンの定常領域に合体させたマウス−ヒトキメラ抗体を作製することである。キメラ抗体およびそれらの生産方法は当業界公知である。例えば、Cabillyら、欧州特許ＥＰ０１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Taniguchiら、欧州特許ＥＰ０１７１４９６（１９８６年２月１９日公開）；Morrisonら、欧州特許出願ＥＰ０１７３４９４（１９８６年１月１８日公開）；Neubergerら、国際公報番号ＷＯ／１９８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Kudoら、欧州特許出願ＥＰ０１８４１８７（１９８６年６月１１日公開）；Robinsonら、国際公報番号ＷＯ／１９８７／００２６７１（１９８７年５月７日公開）；Liuら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：3439〜3443；Sunら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：214〜218；Betterら（1988）Science 240：1041〜1043を参照されたい。これらの参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。一般的には、マウスｍＡｂのＨ鎖およびＬ鎖の抗原−結合領域をコードするＤＮＡセグメントをｍＡｂ生産ハイブリドーマ細胞からクローニングして、次いでこれをそれぞれヒト免疫グロブリンのＣ_Ｈ領域とＣ_Ｌ領域とをコードするＤＮＡセグメントに合体させて、マウス−ヒトキメラ免疫グロブリンをコードする遺伝子を生産してもよい。

[0050]一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称されることが多く、これらは、典型的には「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、実質的には、Winterおよび共同研究者（Jonesら（1986）Nature、321：522〜525；Riechmannら（1988）Nature、332：323〜327；Verhoeyenら（1988）Science、239：1534〜1536）に記載の、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でそれに相当するヒト抗体の配列を置換することによる方法に従って行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、この場合、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に短い配列が、それに相当する非ヒト種からの配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類の抗体中の類似する部位からの残基で置換されているヒト抗体である。

抗体の医薬組成物
[0051]他の実施態様において、上記で説明したような抗体またはフラグメントを医薬的に許容されるキャリアー、希釈剤または添加剤と共に包含する医薬組成物が提供される。

[0052]当業者には明白と予想されるが、本明細書の教示で説明した抗体を含む医薬組成物の調製において、様々な媒体、および添加剤、ならびに投与経路を使用できる。代表的な製剤技術は、特に、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第19版、マック・パブリッシング社（Mack Publishing Co．）、ペンシルバニア州イーストン（1995）、およびHandbook of Pharmaceutical Excipients、第3版、Kibbe，A．H．編、ワシントンD．C．、米国薬剤師会（American Pharmaceutical Association）（2000）で教示されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

[0053]医薬組成物は、一般的に、薬学的に許容されるキャリアーと、薬理学的に有効な量の抗体または抗体混合物とを含むと予想される。

[0054]医薬組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、エアロゾル、固体、丸剤、錠剤、カプセル、ゲル、局所用クリーム、坐剤、経皮パッチ、および当業界公知の他の製剤として製剤化してもよい。

[0055]本明細書で説明される目的に関して、抗体の医薬的に許容される塩は、有機ならびに無機の酸および／または塩基を包含する当分野において承認されているあらゆる医薬的に許容される塩を包含することが意図される。塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、さらには第一、第二、および第三アミン、例えばメチル、エチル、およびプロピルなどの低級炭化水素のエステルが挙げられる。他の塩としては、例えば酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸などの有機酸が挙げられる。

[0056]「薬学的に許容されるキャリアー」は、本明細書で使用される場合、医薬組成物を製剤化する分野における当業者に公知のあらゆる標準的な薬学的に容認されたキャリアーを含む。したがって、抗体またはペプチドそれ自身、例えば医薬的に許容される塩として、または結合体として存在するものは、薬学的に許容される希釈剤中の調合物として調製してもよく、その場合、このような希釈剤としては；例えば、塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水性エタノール、またはグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば植物油、動物油、合成油など）、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート８０の溶液が挙げられ、あるいは適切な添加剤中の固体調合物として調製してもよい。

[0057]医薬組成物は、１種またはそれより多くの緩衝液（例えば中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えばグルコース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくは例えばグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなど）、静菌薬、例えばＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、調合物をレシピエントの血液と等張、低張または弱く高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、および／または保存剤をさらに含むことが多いと予想される。あるいは本発明の組成物は、凍結乾燥製剤（lyophilizate）として製剤化してもよい。

[0058]本発明の組成物に当業者公知のあらゆる好適なキャリアーを用いることができるが、キャリアーのタイプは、典型的には投与様式に応じて決められると予想される。抗体組成物は、例えば経口、経鼻、経粘膜、静脈内、腹膜内、皮内、皮下、および筋肉内投与などのあらゆる適切な投与方式に応じて製剤化できる。

[0059]非経口投与の場合、本組成物は、生理学的に許容できる希釈剤中の、例えばパイロジェンフリーの滅菌水、油、塩類溶液、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはエタノールなどの滅菌された液体などの製剤用キャリアーを共に含む物質の溶液または懸濁液の注射可能な投与量として投与できる。加えて、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助剤が組成物中に存在していてもよい。

[0060]医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成由来の成分であり、例えば、落花生油、ダイズ油、トウモロコシ油、綿実油、オレイン酸エチル、およびミリスチン酸イソプロピルの非水性溶液である。抗体は、活性成分が持続放出されるような方式で製剤化できるデポー注射の形態または埋め込み型製剤で投与できる。典型的な組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調節された５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌからなる水性緩衝液中に配合される場合、抗体を５ｍｇ／ｍｌで含む。

[0061]典型的には、本組成物は、注射可能物質として、液状の溶液または懸濁液；注射前に、これらに限定されないが、例えばパイロジェンフリーの滅菌水、塩類溶液、緩衝液、デキストロース溶液などの好適な媒体で再溶解させるのに好適な固体または粉末形態のいずれかとして調製される。また調製物は、乳化されていてもいし、あるいはリポソーム、または例えばポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマーなどのマイクロ粒子中に封入されていてもよい。

[0062]本明細書で説明される医薬組成物は、例えば密封したアンプルまたはバイアルなどの単位用量または複数回投与用の容器で提供されてもよい。このような容器は、典型的には、使用まで調合物の滅菌状態および安定性が保持されるように密封される。一般的に、調合物は、上記で提示したように油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存されてもよい。

[0063]あるいは、医薬組成物は、使用直前に滅菌液体キャリアーを添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存されてもよい。

[0064]本発明はまた、本発明の抗体を少なくとも１種のさらなる抗新生物剤と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。前記組み合わせは、例えば異常な細胞増殖の阻害において効果的である。

[0065]現在のところ多くの抗新生物剤が当業界公知である。一実施態様において、抗新生物剤は、これらに限定されないが、例えば抗体または免疫調節タンパク質などの治療用タンパク質からなる群より選択される。他の実施態様において、抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤、キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗代謝産物、挿入性抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、抗生物剤（anti-survival agent）、生体応答調整物質、抗ホルモン、例えば抗アンドロゲン剤、および抗血管新生剤からなる低分子阻害剤または化学療法剤からなる群より選択される。

[0066]さらにその他の実施態様において、医薬組成物は、抗体と、ＥＧＦＲファミリーのメンバーの阻害剤とを含み、このような阻害剤としては、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４阻害剤、特にＨＥＲ２阻害剤、例えばアンタゴニスト抗体または低分子阻害剤が挙げられる。

[0067]本発明の医薬組成物はヒト用医薬で使用でき、また獣医学的な目的にも使用できる。

抗ＦＧＦＲ４抗体に関する使用
[0068]本発明の抗ＦＧＦＲ４抗体は、様々な有用性を有する。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ４抗体は、様々な癌細胞またはエキソゾームの表面上でのＦＧＦＲ４発現に関する診断または予後アッセイで使用でき、例えば、特異的な細胞、組織、または血清中でのその発現を検出することにおいて使用できる。例えば不均一または均一相のいずれかで行われる競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの、当業界公知の様々な診断および予後アッセイ技術を使用できる（Zola、Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques、ＣＲＣプレス社（CRC Press, Inc．）（1987）、147〜1581頁）。

[0069]これらのアッセイで使用される抗体は、検出可能な部分で標識してもよい。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで生産することが可能であると予想される。抗体を検出可能な部分にコンジュゲートする当業界公知のあらゆる方法を採用でき、このような方法としては、Hunterら（1962）Nature、144：945；Davidら（1974）Biochemistry、13：1014；Painら（1981）J．Immunol．Meth．、40：219；ならびにNygren，J．Histochem. and Cytochem.、30：407（1982）によって説明された方法が挙げられる。

[0070]「検出すること」は、サンプル中の分析物の存在、非存在、または量を決定することを指し、さらに、サンプル中の、またはサンプル中のセルあたりの分析物の量を定量することを包含する場合もある。

[0071]「診断」は、病的状態の存在または性質を同定することを指す。診断方法は、それらの特異性および感受性の点で異なっている。特定の診断方法では確定的な状態の診断が得られない可能性があるが、その方法が診断に役立つ陽性の指標を提供するのであれば、それで十分有用である。

[0072]「イムノアッセイ」は、サンプルと分析物に特異的に結合する抗体とを接触させること、および抗体と分析物との結合を検出することを含む、サンプル中の分析物を検出する方法を指す。

[0073]「免疫組織化学剤（Immunohistochemical）」（ＩＨＣと略記される）は、例えばポリクローナルおよびモノクローナル抗体などの特異的な結合剤を指し、これらは、対象の抗原を認識して、しばしば物質が対象の抗原に結合したことを示す化学物質によって標識する。ＩＨＣ剤の例は、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体である。

[0074]本発明は、正常および異常なレベルの決定を包含する、細胞中、細胞膜上、ならびに組織および体液中で検出可能なＦＧＦＲ４ポリペプチドのレベルを検出するための定量的な診断アッセイと定性的な診断アッセイの両方に関する。宿主から誘導されたサンプル中の例えばＦＧＦＲ４などのポリペプチドのレベルを決定するのに使用できるアッセイ技術は当業者周知である。このようなアッセイ方法としては、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。これらのなかでも、生体液中に発現された遺伝子のタンパク質を検出するためにはＥＬＩＳＡがよく使用される。ＥＬＩＳＡアッセイでは、まず、ＦＧＦＲ４に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製が行われる。加えて、一般的には、ＦＧＦＲ４に特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、例えば放射性、蛍光性または酵素試薬などの検出可能な試薬、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼに取り付けられる。

[0075]上記の試験は、患者の体液（例えば唾液、髄液、精液、間質液、羊水など）および組織抽出物（ホモジネートまたは溶解した組織）から誘導されたサンプル、例えば組織生検および病理解剖で得られた材料から誘導されたサンプルで実行できる。ポリペプチドの測定または転写レベルによって癌に罹患している疑いのある患者からの細胞および組織中で決定されたＦＧＦＲ４のレベルを、正常または対照の細胞もしくは組織中のＦＧＦＲ４のレベルと比較する。正常で健康な個体（すなわち、対照サンプル）から得られた同じ細胞、組織、または体液中のレベルと比較した、患者で測定されたＦＧＦＲ４のレベルの変更は、癌の指標となる。「レベルの変更」とは、そのアッセイにおいて、患者で測定されたＦＧＦＲ４レベルが、同じ正常細胞または組織中のＦＧＦＲ４レベルと比較した場合に変化（すなわち、増加または減少）していることが検出されることを意味する。ＦＧＦＲ４レベルの変更の検出は、これらに限定されないが、例えば乳癌、消化器癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膀胱癌、神経膠腫、黒色腫、肝細胞癌、胃癌、および肺癌などの様々な癌の診断において有用である。

[0076]さらに、癌と診断されている患者におけるＦＧＦＲ４レベルのモニターは、まだ転移していない癌の転移の開始を決定すること、および癌のステージを決定することにおいて有用である。例えば、まだ転移していない患者において、転移の開始に関して癌をモニターする方法において、ＦＧＦＲ４の検出を使用できる。この方法では、転移がすでに起こっていることがわかっていない癌（例えば乳癌）患者が同定される。次いで患者からのサンプル中のＦＧＦＲ４レベルを測定する。次いでこのようにして測定されたＦＧＦＲ４レベルを、正常な対照サンプルからのＦＧＦＲ４のレベルと比較する。正常な対照と比較して、患者で測定されたＦＧＦＲ４レベルの変化は、転移した癌と関連する。

[0077]また、例えば乳癌に罹った患者における癌のステージも決定できる。この方法では、癌に罹った患者が同定される。患者からの組織サンプル中のＦＧＦＲ４レベルを測定して、前記患者の基準ＦＧＦＲ４レベルを確立する。次いで、その後の時期に、例えば患者の医師による計画的な検査時に同じ組織サンプル中のＦＧＦＲ４レベルを決定する。次いで測定されたＦＧＦＲ４レベルを患者の基準ＦＧＦＲ４レベルと比較する。この方法において、患者の基準ＦＧＦＲ４レベルに対する、患者で測定されたＦＧＦＲ４レベルの増加は、癌の進行と関連し、基準ＦＧＦＲ４レベルに対する、測定されたＦＧＦＲ４レベルの減少は、癌が縮小しているか、または緩和状態であることと関連する。また、患者ごとに確立された基準ＦＧＦＲ４レベルに対する、測定されたＦＧＦＲ４レベルの増加も、転移の指標になる可能性がある。

[0078]一実施態様において、ＦＧＦＲ４の免疫組織化学は、ＦＧＦＲ４発現の存在に基づくリスクを設定するための「指標診断（index diagnostic）」として機能する。それゆえに、このパラメーターおよび他のパラメーター（例えば病変の大きさ）に基づいて、異なる治療様式（すなわち、化学療法、放射線療法、外科手術）が使用されるべきかどうかを決定できる。関連する形態において、前癌状態から悪性の表現型への進行をモニターする方法が開示される。例えば、組織を連続的にサンプリング（すなわち生検）して、病変におけるＦＧＦＲ４の発現状態を観察することによって、治療的介入が推奨されるかどうか、または治療的介入が成功するかどうかの指標を示すような方式で、前癌状態が進行しているかどうかを決定できる。

[0079]本発明の一形態は、一群の細胞が癌になる可能性、例えばこれらの細胞または腺が前癌状態になるかまたは癌性の病変に進行する可能性を決定する方法、または原発腫瘍が転移する可能性を決定する方法である。本発明は、例えばＦＧＦＲ４タンパク質に特異的に結合する抗体などの物質を利用して、組織および細胞中のＦＧＦＲ４のレベルを評価する。細胞および組織中のＦＧＦＲ４発現はさらに、例えば選択的な増幅、またはハイブリダイゼーション法などの核酸分析を使用して評価することもできる。正常または対照レベルよりも高いＦＧＦＲ４のレベルは、前癌状態の疾患が存在する可能性、すなわち細胞または組織が前癌状態である可能性、および／または原発腫瘍が転移する可能性が高いことの指標となる。

[0080]他の実施態様において、抗ＦＧＦＲ４抗体は、例えば癌などの疾患を処置する方法において有用である。本発明の方法は、好ましくは、上記で説明したように、前記処置を必要とする対象に、抗体またはそれらのＦＧＦＲ４抗原結合フラグメントを提供する工程を包含する。

[0081]抗体または抗体フラグメントを使用して癌細胞を免疫標的化する方法は当業界周知である。例えば米国特許第６，３０６，３９３号は、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法における抗ＣＤ２２抗体の使用を説明しており、米国特許第６，３２９，５０３号は、ヘビ状膜貫通抗原（serpentine transmembrane antigen）を発現する細胞の免疫標的化を説明している。抗体が癌細胞に結合して、細胞および腫瘍の破壊を媒介するか、および／または細胞または腫瘍の増殖を阻害するように、本明細書で説明される抗体（場合により細胞毒性物質または他の物質にコンジュゲートされた、ヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体またはフラグメント、またはそれらの他の改変体などを含む）を患者に導入してもよい。

[0082]本開示を限定する意図はないが、このような抗体が治療効果を発揮できるメカニズムは、補体が媒介する細胞崩壊、腫瘍抗原の生理学的な機能を調節する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞の分化を調節すること、腫瘍の血管新生因子プロファイルを変更すること、免疫刺激または腫瘍抑制サイトカインや増殖因子の分泌を調節すること、細胞接着を調節すること、および／またはアポトーシスを誘導することを包含する可能性がある。

[0083]また本発明の抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦＲ４が媒介するシグナル伝達の低減もしくはブロック、リガンド結合の低減もしくはブロック、細胞増殖の低減もしくはブロック、または細胞移動の低減もしくはブロックによっても作用する可能性がある。

[0084]抗体はまた、例えば放射性リガンド、色素、蛍光および／もしくは発光物質、または細胞質の毒素などの毒性物質または治療剤にコンジュゲートされていてもよいし、さらに、毒性物質または治療剤を腫瘍細胞に直接送達するために、治療的に使用されてもよい。さらに、本発明のいくつかの実施態様において、標識された抗体を使用してインビボまたはインビトロで細胞を標識して、ＦＧＦＲ４タンパク質の発現レベルを決定することもできる。この場合、各標識物質に適用可能な第二の方法により、標識された細胞を直接的または間接的に画像化できる。

[0085]「処置」は、本明細書において、疾患、障害または望ましくない状態の治療的、予防的、待機的、または抑制的な処置を意味する。処置は、疾患の症状が発症する前に、および／または臨床症状、または疾患の他の兆候が出た後に、適切な形態で対象に抗体を投与して、疾患の重症度を低減させる、疾患の進行を止める、または疾患を取り除くことを包含する。疾患の予防は、好ましくはその疾患に罹患する可能性が高い対象において、障害または疾患の症状が発症するまでの時間を長くすること、または発症を遅らせることを包含する。

[0086]治療用調製物は、未改変の抗体を使用してもよいし、または抗体の官能性に応じて例えば毒素または細胞毒性分子などの治療用化合物とコンジュゲートした抗体を使用してもよい。一般的に、未改変の抗体が使用される場合、これらは、典型的には機能的なＦｃ領域を有すると予想される。「機能的なＦｃ領域」は、本明細書において、例えばＦｃ受容体、特にＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）への結合などのＦｃの生物学的機能に影響を及ぼす最小限の配列を意味する。

[0087]理論にとらわれずにいえば、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体、免疫エフェクター細胞に結合し、細胞媒介性細胞毒性、エンドサイトーシス、食細胞活動、炎症性サイトカインの放出、補体媒介性細胞毒性、および抗原提示を調節することによって、抗腫瘍モノクローナル抗体の有効性に影響を与える可能性があると考えられる。これに関して、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の混合物は、様々なエピトープに結合することにより、単一のモノクローナル抗体が使用される場合と比較して、細胞表面上のＦｃがより高密度になることから、有利であると予想される。当然ながら、標的細胞を枯渇させることにおけるそれらの有効性を強化するために、または未改変の抗体が治療上有効ではない場合、毒素または細胞毒性薬にコンジュゲートした抗体を使用してもよい。

[0088]抗体組成物は単独で使用してもよいし、あるいは従来の処置の有効性を高めるために、または抗体によって標的化されていない異常細胞を標的化するために他の治療剤と組み合わせて使用してもよい。本発明の抗体および抗体組成物は、ＰＥＧ化抗体および／または抗体のプレターゲティングコンストラクトを包含する。化学療法的処置を受けていない患者においては、抗体療法による方法と、化学療法剤、放射線または外科処置レジメンとを組み合わせることが好ましい場合があるが、それに対して、１回またはそれより多くの化学療法を受けた患者には、抗体療法での処置が提示される可能性がある。加えて、抗体療法はまた、特に化学療法剤の毒性に対する耐性が極めて低い患者において、併用される化学療法で使用される投与量を少なくすることもできる。さらに、化学療法剤に対して耐性の腫瘍を有する癌患者を抗体で処置することにより、これらの組み合わせ薬剤に対する感受性と反応性が誘導される可能性がある。

[0089]一形態において、抗体は、治療的な細胞毒性薬と共に補助的に使用され、このような細胞毒性薬としては、例えば、これらに限定されないが、ブスルファン、チオグアニン、イダルビシン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびヒドロキシ尿素が挙げられる。抗体療法の補助剤として有用な他の物質は、病気の状態で見出される異常な細胞分子を特異的に標的とする化合物である。これらの物質は、疾患特異的であると予想される。

[0090]治療効果を得るのに必要な本組成物の量は、特定の目的ごとに従来の手法に従って経験的に決定されると予想される。一般的には、本組成物を治療目的でエクスビボまたはインビボで投与する場合、本組成物は、薬理学的に有効な用量で与えられる。「薬理学的に有効な量」または「薬理学的に有効な用量」は、特に、障害または疾患の状態を処置する、または後退させる、例えば障害または疾患の１種またはそれより多くの症状または兆候を低減させる、または除去するために、望ましい結果を達成できる望ましい生理学的効果または量をもたらすのに十分な量である。

[0091]実例として、乳癌に罹った患者への抗体の投与は、元々の疾患が根絶または改善される場合だけでなく、疾患に関連する症状の重症度または継続時間の減少が患者により報告される場合も治療的有用性を提供する。また治療的有用性は、改善が認識されるかどうかに関係なく、元々の疾患または障害の進行の中断または遅延も包含する。

[0092]対象に投与される量は、投与されるもの、例えば予防または療法などの投与目的、宿主の状態、投与方式、投与回数、投与間のインターバルなどに応じて変更されると予想される。これらは当業者により経験的に決定してもよく、治療応答の程度に応じて調節が可能である。適切な用量の決定の際に考慮する要素としては、これらに限定されないが、対象の大きさおよび体重、対象の年齢および性別、症状の重症度、疾患のステージ、物質の送達方法、物質の半減期、ならびに物質の有効性が挙げられる。考慮される疾患のステージは、疾患が急性かまたは慢性か、再発期かまたは寛解期か、および疾患の進行度を包含する。治療有効量の投薬および投与回数の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

[0093]本発明の開示のいずれの組成物についても、治療上有効な用量は当業界周知の方法により容易に決定される。例えば、初回有効量は、細胞培養から、または他のインビトロのアッセイから推測が可能である。例えば、Sliwkowsky，M Xら（1999）Semin．Oncol．26．suppl．12：60〜70は、インビトロでの抗体依存性細胞毒性の測定を説明している。次いで動物モデルに所定用量を処方して、血中濃度または組織濃度、例えば細胞培養アッセイによって決定されるＩＣ_５０の濃度などを得ることができる。

[0094]加えて、毒性および治療効果は、一般的には細胞培養アッセイおよび／または実験動物で、典型的にはＬＤ_５０（試験集団の５０％が死に至る用量）およびＥＤ_５０（試験集団の５０％において治療上の有効性が認められる量）を決定することによって決定される。毒性と治療有効性との用量比が、治療指数である。個々に、または組み合わせて高い治療指標を示す組成物が好ましい。有効量の決定は十分に当業者の能力の範囲内であり、具体的には本明細書で示された詳細な開示に記載されている。また、例えばFinglおよびWoodbury、General Principles In：The Pharmaceutical Basis of Therapeutics、1〜46頁（1975）、およびそこで引用された文献などの標準的な参考文献でも、指針を見出すことができる。

[0095]初期の寛容を誘導する用量を得るために、ヒトおよび非ヒト霊長類において抗体が免疫原性である可能性について考慮される。例えばキメラまたはヒト化抗体のケースのように、抗体が部分的に、または主としてヒト免疫グロブリン配列で構成されていたとしても、免疫反応は生物学的に有意であり、抗体の治療効果を損なう可能性がある。所定の実施形態では、ある程度の治療用抗体に対する免疫寛容が確立されるように、初期には高用量の抗体が投与される。

[0096]寛容を誘導する用量とは、用いられた前駆細胞特異的抗体の繰り返し投与に対する抗体反応の誘導を予防する、または減少させるのに十分な用量である。

[0097]寛容を誘導する用量の好ましい範囲は、１０ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。寛容を誘導する用量のより好ましい範囲は、２０〜４０ｍｇ／ｋｇである。寛容を誘導する用量のさらにより好ましい範囲は、２０〜２５ｍｇ／ｋｇである。

[0098]これらの治療レジメンの範囲内で、抗体の治療上有効な用量は、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。第二のより好ましい治療上有効な用量は、０．２〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。さらにより好ましい治療上有効な用量は、０．５〜２ｍｇ／ｋｇの範囲である。代替の実施態様では、それに続く治療的な単回用量または複数回の用量は、寛容を誘導する用量と同一の調合物に含まれていてもよいし、または異なる調合物に含まれていてもよく、および／または寛容を誘導する用量と同一の経路で投与されてもよいし、または異なる経路で投与されてもよい。

[0099]本発明の目的にとって、投与方法は、処置される状態、対象の抗体の形態、および医薬組成物に応じて選ばれる。

[00100]抗体組成物の投与は、これらに限定されないが、連続的、皮下、静脈内、経口、局所、経皮、腹膜内、筋肉内、および膀胱内などの様々な方式で行うことができる。例えば、経口、筋肉内、または皮下投与には、微粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセル化製剤が有用である。加えて、静脈内投与には、リポソームおよびナノ粒子が好適である。医薬組成物の投与は、単一の経路を介してなされてもよいし、または数種の経路によって共になされてもよい。例えば、腹膜内投与は、静脈注射を伴ってなされる可能性がある。好ましくは、治療的な用量は、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下に投与される。

[00101]本組成物は、１回で投与してもよいし、または複数回で投与してもよい。いくつかの実施態様において、本組成物は、なかでも処置される徴候と担当医師による判断に応じて、１日１回、１日２〜３回もしくは複数回、または１日あたりそれより多くの回数で投与してもよい。

[00102]また本組成物の投与は、当業者周知の持続放出または長期送達方法を介しても達成できる。「持続放出」または「長期放出」は、本明細書で使用される場合、１日より長い期間、好ましくは１週間より長い期間、および最も好ましくは少なくとも約３０日から６０日、またはそれより長い期間にわたり送達系が対象化合物の薬学的に治療効果のある量を付与することを意味する。長期放出系は、例えば上記で説明した生分解性ポリマーなどの、抗体を含有する埋め込み型の固体またはゲル；例えば蠕動ポンプおよびフルオロカーボン推進ポンプ（fluorocarbon propellant pump）などのポンプ；浸透圧ポンプおよび小型浸透圧ポンプ；などを含んでいてもよい。

[00103]本発明の方法は、単一のモノクローナル抗体、およびこれらの抗体によって認識される特定の抗原を認識するあらゆる抗体、加えて様々なモノクローナル抗体の組み合わせを投与することを想定している。２種またはそれより多くのモノクローナル抗体は、単一の抗体と比較して改良された作用をもたらす可能性がある。あるいは、抗体と、異なる抗原に結合する抗体との組み合わせは、単一の抗体と比較して改良された作用をもたらす可能性がある。加えて、新生細胞または病変の差次的な標識付けを改善するために、抗体と組み合わせて造影剤を投与してもよい。このようなモノクローナル抗体のカクテルは、異なるエフェクターメカニズムを利用するモノクローナル抗体を含有しているか、または細胞毒性モノクローナル抗体と免疫エフェクターの官能性に依存するモノクローナル抗体とを直接組み合わせていることから、このようなカクテルは所定の利点を有する可能性がある。このようなモノクローナル抗体の組み合わせは、相乗的な治療効果を示す可能性がある。

[00104]また本発明のいくつかの実施態様は、組織ならびに／または細胞の成分を単離する、収集する、および／もしくは別の方法で精製するのに使用できる。いくつかの実施態様は、細胞および／または副産物、成分、例えば細胞（例えばエキソゾーム）、および／または細胞の他の部分から放出された成分などを単離する方法を提供する。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ４抗体は、細胞および／または細胞の成分の単離に使用できる。

抗体キット
[00105]本発明のアッセイを実行するのに必要な試薬を含有する抗体キットが提供される。本キットは、１つまたはそれより多くの区画を包含していてもよく、これらの区画はそれぞれ、例えば：（ａ）上記で説明した本発明の構成要素のうち１つを含む第一の容器；および（ｂ）以下に示すもの、すなわち：洗浄試薬、検出または競合アッセイのための対照としての抗体またはペプチドおよび／または組換えＦＧＦＲ４タンパク質もしくはそれらのフラグメントの存在の検出が可能な試薬のうち１種またはそれより多くを含む１つまたはそれより多くの他の容器などの１つまたはそれより多くの容器を収容する。例えば、いくつかの実施態様において、本キットは、細胞単離キットとして設計されてもよい。

[00106]このような容器は、サンプルと試薬が二次汚染を起こさないように試薬を１つの区画から他の区画に効率的に移すことが可能であり、さらに、それぞれの容器の物質または溶液は、１つの区画から他の区画に定量的な様式で添加できる。

[00107]本キットは典型的には容器を含有し、このような容器は、例えばガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されていてもよく、さらに例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管などであってもよい。本キットには典型的にはラベルが添付されており、このようなラベルには、何らかの書込みまたは記録済みのデータが含まれており、このようなデータは、本キットの内容物を利用するための指示または他の情報を提供する、電子的にまたはコンピューターにより読取り可能な形態（例えばディスク、光ディスク、またはテープ）であってもよい。ラベルには、この調合物が選択された障害を診断または処置するために使用されることが表示される。

[00108]当業者であれば容易に理解できるものと予想されるが、開示された本発明の抗体は、当業界周知の確立されたキットの様式の１つに容易に取り入れることができる。

[00109]本明細書で引用された全ての特許および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

[00110]以下の実施例は単に例示的な目的で示されたにすぎず、発明の範囲を限定することはまったく意図していない。

[00111]ヒトＦＧＦＲ４タンパク質に結合するマウスモノクローナル抗体を分泌する複数のマウスハイブリドーマクローンを作製した。本明細書でより詳細に説明されているように、これらの抗体は、ヒトＦＧＦＲ４をその野生型の形態で、またはそれらのフラグメントを認識する（例えば、特異的に結合する）。

[00112]実施例で言及された市販の試薬は、特に他の指定がない限り製造元の説明書に従って使用された。以下の実施例は単に例示的な目的で示されたにすぎず、発明の範囲を限定することはまったく意図していない。

[00113]実施例１
[00114]一般的なハイブリドーマ生産およびスクリーニングプロトコール
[00115]実験室での一般的なハイブリドーマ生産のため、加えてハイブリドーマのスクリーニングおよびサブクローニングのために、以下のプロトコールを使用した。

一般的なハイブリドーマ融合プロトコール
[00116]融合調製物：
[00117]融合の３〜４日前
[00118]１）１０％のＣ−ＤＭＥＭ中に５×１０^５細胞／ｍｌ（５０ｍｌ）で骨髄腫細胞、Ｐ３×６５３（Ｐ３細胞）を含む２つのＴ−７５または１つのＴ−２２５フラスコをセットアップした。融合の前日に新鮮な培地を添加した。加えて、この期間中に、融合に望ましいリンパ球を生産させるために使用した動物の静脈内にブースター注射を行った。さらに、動物からの組織の回収で使用されるあらゆる器具をオートクレーブした。

[00119]融合の日
[00120]融合の日に、以下に示すような融合用培地を調製した：ＤＭＥＭ（ＬＴＩ）１２８ｍｌ、ＨＡＴ（５０×；シグマ（Sigma））４ｍｌ、ＯＰＩ（１００×；シグマ）２ｍｌ、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ；シグマ）２ｍｌ、グルタマックスＩ（Glutamax I）（１００×；ＬＴＩ）２ｍｌ、ＮＣＴＣ（シグマ）２０ｍｌ、ＦＢＳ（ＬＴＩ）４０ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＬＴＩ）２ｍｌ、ニュートリドーマ（Nutridoma）（ＢＭ）２．０ｍｌ。加えて、０．５ｍｌの１ＭのＨＥＰＥＳを含む５０ｍｌのＳＦ−ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ）を調製した。その後、コニカルチューブに９．５ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳと０．５ｍｌＤＭＳＯとを添加した（ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ／ＤＭＳＯ）。

[00121]上述の培地を調製した後、以下のもの：２００ｍｌの融合用培地（ＦＸ培地）、４０ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ、１０ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ／ＤＭＳＯ、および１ｍｌのポリエチレングリコール／ＤＭＳＯ混合物（ＰＥＧ／ＤＭＳＯ）のアリコートを３７℃の水浴中に入れた。加えて、８つの平底９６ウェルプレートに、融合番号、プレート番号、および日付を記入した（例えばＦＸ０３．５８／３１／０７）。さらに５０×ＨＡＴを１０ｍＬのＳＦ−ＤＭＥＭに懸濁し、１００×ＯＰＩを１０ｍＬの滅菌水中に懸濁した。

[00122]融合
[00123]図１は、融合過程で採用できる工程を例示する。まず、（以下でより詳細に説明される通りに）抗原で予め免疫化したマウスを処分し、脾臓を摘出した。１００ｍｍの細胞培養中で１０ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ中に各脾臓を入れた。加えて、Ｐ３細胞を回収し、５〜２０×１０^７個の細胞が融合に使用されるように計数した。

[00124]細胞培養皿に脾臓を入れたら、脾臓を薄く削いで脾細胞を取り出し、得られた脾細胞懸濁液を１５ｍｌのコニカルチューブに入れて、大きい死細胞片をそのまま２〜３分間沈降させた。この段階で、計数されたＰ３細胞を５０ｍｌのコニカルチューブに移した。さらに、１５ｍｌのコニカルチューブから大きい死細胞片を残して脾細胞懸濁液を取り出し、新しい１５ｍｌのコニカルチューブに移した。脾細胞懸濁液とＰ３細胞をそれぞれ遠心分離によりペレット化した。

[00125]その後、脾細胞（すなわち脾細胞）を１０ｍｌの温かいＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳで穏やかに混合しながら洗浄し、ペレット化した脾細胞を懸濁させるのに使用したピペットに血栓を付着させた。Ｐ３細胞も１０ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ中で洗浄した。Ｐ３細胞と脾細胞を再度ペレット化し、それぞれ５ｍｌの温かいＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに別々に懸濁し、１４ｍｌの丸底チューブ（ファルコン（Falcon）（登録商標）２０５９）中で一緒に混合した。混合した細胞懸濁液をペレット化し、得られた上清を吸引により除去した。得られた混合した細胞ペレットを穏やかに破壊し、３７℃で１〜２分インキュベートした。

[00126]脾細胞とＰ３細胞との融合を誘導するために、１ｍｌの５０％のＰＥＧ／ＤＭＳＯ（シグマ）を、一定して撹拌して軽く叩くことにより４５〜６０秒かけて添加した。次いで細胞懸濁液を３７℃で４５秒かき混ぜた。このインキュベートの後、ＰＥＧと同じ方式で（すなわち、３７℃で撹拌し、軽く叩き、かき混ぜることにより）２ｍｌの温かいＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ／５％のＤＭＳＯを２分かけて添加することによってＰＥＧを希釈した。この添加の後、８ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ／ＤＭＳＯを２分かけて添加することによってこの混合物をさらに希釈し、融合した細胞を３７℃で１５分インキュベートした。インキュベートの後、融合した細胞をペレット化し、新たにニュートリドーマを添加した融合用培地１６０ｍｌに懸濁した。得られた混合物を２００μｌ／ウェルで平板培養し、プラスチック容器中で３７℃でインキュベートした。

[00127]ハイブリドーマの限界希釈
[00128]インキュベート後、研究者は、スクリーニングされた細胞が確実に単一起源のクローンになるようにスクリーニング前に２回の限界希釈を行った。以下の手法を２回繰り返し、そのうち第一の限界希釈は２０−ＨＴ培地を使用し、第二の限界希釈は２０−ＨＹ培地を使用した。

[00129]まず、平底の９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに１００μｌの培地を添加した。その後、融合した細胞（すなわちハイブリドーマ）からの培養物１００μｌをＡ１ウェルに添加し、混合した。混合後、ウェルＡ１から１００μｌをウェルＢ１に移し、混合した。これと同じ手法を細胞培養プレートの第一のカラムでウェルＨ１まで繰り返した（すなわち、９６ウェルプレートの第一のカラムで一連の２倍希釈を行った）。この最初の希釈の後、第一のカラム（Ａ１〜Ｈ１）中で各ウェルに１００μｌの培地を添加し、確実に各ウェルに２００μｌの培地が含まれるようにした。その後、８チャンネルピペットを使用して、プレートの第一のカラム（ウェルＡ１〜Ｈ１）からの１００μｌの培地および細胞をプレートの第二のカラム（ウェルＡ２〜Ｈ２）に移した。これと同じ手法をプレートの１２番目のカラム（ウェルＡ１２〜Ｈ１２）まで連続的に繰り返して、かなりの希釈液を得た。次いで、スクリーニングの前にプレートを３７℃で７〜１０インキュベートした。

[00130]融合した細胞のスクリーニング
[00131]まず、コーティング緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ９．５）中のおよそ０．５μｇ／ｍｌの対象のタンパク質（例えば、配列番号２の配列を含む野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチド）を１ウェルあたり２５μｌで、２つの３８４ウェルプレートをコーティングした。これらの２つの３８４ウェルプレートを４℃で一晩インキュベートした。

[00132]スクリーニングの日に、対象のタンパク質を含むコーティングを除去し、１ウェルあたり５０μｌのブロッキング緩衝液（１％のＢＳＡ）を添加し、プレートを３７℃で３０分インキュベートした。その後、融合プレートの各ウェルからの２５μｌを添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次いでウェルを５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−トゥイーン（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。洗浄工程後、ＰＢＳ−Ｔ中の１μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＧＡＭ（ヤギ由来抗マウス抗体）Ｆｃ（２５μｌ）を各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで各ウェルを５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。洗浄工程後、０．１％の過酸化水素を含むＯＰＤ基質（ピアース（Pierce））２５μｌを各ウェルに添加し、ＲＴで１５分間インキュベートした。インキュベート後、２５μｌのＳＴＯＰ緩衝液（２Ｍ硫酸）を各ウェルに添加し、各ウェルの吸光度を４９５ｎｍで読み取った。その後、３８４ウェルのスプレッドシートを使用して得られたデータを分析し、どのハイブリドーマが対象のタンパク質に結合する抗体を生産したかを決定した。

[00133]実施例２
[00134]実験方法
[00135]ＦＧＦＲ４に対するモノクローナル抗体の生産
[00136]モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以下の改変を施した以外はこれまでに述べられたようにして生成した（Azorsaら（1999）J Immunol Methods 229：35〜48）；雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）に、ＰＢＳ中の３〜５００万個の洗浄したＦＧＦＲ４を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１）を、２週間のインターバルで３回腹膜内注射し、それに続いて、マウスを処分する前にＰＢＳ中の３〜５００万個の洗浄したＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１を連続３日注射した。予め、ＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１を野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチド（配列番号１）を発現するコンストラクトでトランスフェクトした。脾細胞を単離して、上記で説明したようにＰＥＧ：ＤＭＳＯ（５０：５、％ｖ、シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich））を使用して骨髄腫細胞株Ｐ３×６５３に融合させた。２０％のＦＢＳ（インビトロジェン（Invitrogen））、２ｍＭのグルタマックスＩ（インビトロジェン）、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１×ＨＡＴ（シグマ−アルドリッチ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および０．５×ニュートリドーマ−ＣＳ（ロシュ（Roche）、ニュージャージー州ブランチバーグ）が補充されたＤＭＥＭ：ＮＣＴＣ−１０９（９０：１０、％ｖ、インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）培地中の９６ウェルプレートに、融合した細胞を植え付けた。ハイブリドーマコロニーをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、これを上記で説明したように限界希釈で２回サブクローニングした。最終的に、本発明者らは、融合実験から７６８種のハイブリドーマクローンとサブクローンをスクリーニングした。ＢＴ５３と名付けられた抗ＦＧＦＲ４ｍＡｂを含有するハイブリドーマクローンからの組織培養上清を収集し、０．０２％のアジ化ナトリウムを用いて４℃で保存した。

[00137]上記および下記で説明したヒトＦＧＦＲ４タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ株を、ブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・ティシュー・カルチャー・コレクション（American Type Tissue Culture Collection）（ATCC；10801 University Blvd、バージニア州マナサス20110-2209）特許寄託機関にオリジナルの寄託物として寄託し、これには以下のＡＴＣＣ受入番号が付与された：クローンＢＴ５３（ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１２１０１９、２０１４年２月２１日に寄託）。

[00138]ハイブリドーマのスクリーニングおよびＢＴ５３の親クローンの同定
[00139]まず、２つの３８４ウェルの平底ＥＬＩＳＡプレートを１ウェルあたり２５μｌのおよそ０．５μｇ／ｍｌの、コーティング緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ９．５）中のＲ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）から購入した組換えヒトＦＧＦＲ４／Ｆｃキメラタンパク質（カタログ番号６８５−ＦＲ）（配列番号２）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。次の日、コーティングのタンパク質を除去し、５０μｌのブロッキング緩衝液（１％のウシ血清アルブミン）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、各ハイブリドーマクローンからの上清２５μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。１時間後、プレートを１ウェルあたり５０μｌのＰＢＳ−トゥイーンで３回洗浄した。次に、２５μｌの１μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼヤギ抗マウスＦＣ抗体（二次抗体）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。１時間後、プレートを１ウェルあたり５０μｌのＰＢＳ−トゥイーンで３回洗浄した。次いで、ピアースからのＯＰＤ基質２５μｌを０．１％の過酸化水素と共に各ウェルに添加した。次いでプレートを室温で１５分間インキュベートした。インキュベート完了後、２５μｌのＳＴＯＰ緩衝液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）を各ウェルに添加し、各ウェルの光学密度を４９５ｎｍで読み取った。

[00140]試験された７６８種のハイブリドーマクローンおよびサブクローンのそれぞれについての測定したままの結果が得られたら、これらの値をそれぞれのプレートでの最大値に正規化した。加えて、試験された対照および様々なハイブリドーマ上清を示すグラフに光学密度をプロットした。

[00141]上記で説明した定量ＥＬＩＳＡを使用してハイブリドーマクローンを選択した後、第二の一連のＥＬＩＳＡを行った。具体的に言えば、これらの第二のＥＬＩＳＡは、配列番号２の野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドに対するハイブリドーマクローンによって生産されたモノクローナル抗体の結合をさらに評価して確認するための定性的な目的でのみ行われた。

[00142]免疫蛍光染色
[00143]免疫蛍光顕微鏡法を使用して、上記で説明したＥＬＩＳＡ実験の結果を定性的に確認した。特に、いずれも配列番号１（野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチド）を発現するＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１および３Ｔ３−ＦＧＦＲ４．ｃｌＳ５細胞を使用して、ハイブリドーマクローンによって生産されたモノクローナル抗体の特異的結合を試験した。両方の細胞株からの細胞をチャンバースライド上で平板培養し、そのまま５０％の密集度になるまで成長させ、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、複数のハイブリドーマクローンからの抗ＦＧＦＲ４抗体（１：１０希釈）を含有するハイブリドーマ上清で免疫染色し、それに続いてＣｙ３コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（１：２００、ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch）、ペンシルベニア州ウェストグローブ）で免疫染色した。細胞を蛍光顕微鏡を使用して可視化し、結合を定性的に評価した。

[00144]フローサイトメトリー
[00145]ＦＧＦＲ４は、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）組織で高度に発現される（Taylorら（2009）J Clin Invest 119：3395）。２種のＲＭＳ細胞株、ＲＭＳ−ＲＤおよびＲＭＳＲｈ３０をフローサイトメトリーによって分析した。特に、両方の株からの細胞を固定し、マウスＩｇＧを認識する陰性対照マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）またはＢＴ５３モノクローナル抗体のいずれかの一次抗体で染色し、どちらも１μｇ／ｍｌで添加された。一次抗体の添加と室温で１時間のインキュベートの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２つのグループに分けた。洗浄後、両タイプの細胞の第一のグループを、第一の二次抗体（Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧａＭ）抗体）と共にインキュベートした。両タイプの細胞の第二のグループを、第二の二次抗体（近赤外蛍光色素（ＤＹ−６４９）にコンジュゲートしたＧＡＭ抗体）と共にインキュベートした。これらは全てフローサイトメーターを使用して分析された。

[00146]実施例３
[00147]モノクローナル抗ＦＧＦＲ４抗体のスクリーニング
[00148]まず、上述した融合の結果生成したハイブリドーマ株の特異性を評価する実験を行った。具体的に言えば、限界希釈により得られた合計７６８種のハイブリドーマクローン（すなわち、８つの９６ウェルプレートの合計）からの上清を使用してＥＬＩＳＡを行った。これらの実験で、それぞれのＥＬＩＳＡプレートのウェルを配列番号２の野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドでコーティングし、図２で例示したようにして各ハイブリドーマクローンを対照モノクローナル抗体と比較して試験した。具体的に言えば、光学密度（ＯＤ）によって測定した場合、試験された多数のハイブリドーマクローンで様々な結合活性を記録した。しかしながら、プレート７、ウェルＣ５で見出されたハイブリドーマクローンからの抗体は最大のＯＤ値を示し、これを試験された全ウェルの最大結合活性と解釈した。このウェル７Ｃ５からのハイブリドーマクローンを限界希釈によりさらにクローニングして、モノクローナル集団を得て、これをハイブリドーマＢＴ５３と名付けた。図２で示されるように、ウェル７Ｃ５中でハイブリドーマクローンによって生産されたモノクローナル抗体（すなわち、ハイブリドーマＢＴ５３のクローン）は、配列番号２に対して、対照ｍＡｂと比較しても最大の結合活性を示した。さらに、これらの定量的なＯＤ値のいくつかを表１のＥＬＩＳＡ１の列にも記載する。それによれば、ハイブリドーマＢＴ５３は、野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドにうまく結合するｍＡｂを生産しただけでなく、対照抗体と比較してより高い結合活性での結合を達成した。

[00149]次に、定性実験を行い、７Ｃ５ハイブリドーマクローン（すなわち、ＢＴ５３ハイブリドーマのクローン）と、上記で詳述した融合実験の結果として生成した他のハイブリドーマクローンとを比較した。まず、定性的な免疫蛍光実験を行い、他のクローンと比較した７Ｃ５ハイブリドーマクローンの結合活性の相対強度を評価した。まず、ＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１細胞を多数のハイブリドーマクローンからの上清に晒し、結合を定性的に評価した。表１からわかるように、いくつかのクローンは、ある程度の細胞への結合を示したが；７Ｃ５ハイブリドーマ細胞は、最大のＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１細胞への結合を示した。

[00150]追加の実験を行い、この定性的な免疫蛍光法データをさらに確認した。上述したように、表１に記載されたクローンはいずれも、少なくともＨｅＬａ−ＦＧＦＲ４．ｃｌ２１細胞への結合活性のバックグラウンドレベルよりも高いレベルを示し、ＢＴ５３ハイブリドーマクローン（７Ｃ５）が最大の結合を示した。しかしながら、ＨｅＬａ細胞はヒト起源であるため、ワクチン接種過程中のこれらの細胞の投与は、一般的にヒトペプチドを認識する抗体生産を引き起こす可能性がある。上記で説明したデータをさらに検証して、ハイブリドーマクローンによって生産されたｍＡｂが野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドと結合することを確認するために、３Ｔ３−ＦＧＦＲ４．ｃｌＳ５細胞を使用して免疫蛍光実験を繰り返した。これらの３Ｔ３細胞はマウス起源であり、同様に野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチド（配列番号１）の全体を発現する。それによれば、マウス起源のハイブリドーマクローンは、配列番号１の野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドを除いて３Ｔ３細胞上のどの抗原にも結合しないと予想される。表１で例示したように、ＢＴ５３ハイブリドーマクローンによって生産された抗体は、トランスフェクトされた３Ｔ３細胞に対して識別可能な結合活性を生じる抗体だけであり、さらに、ＢＴ５３ハイブリドーマによって生産されたｍＡｂは、野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドにだけ強く結合することも示された。

[00151]表１に列挙したハイブリドーマクローンを中心に第二の定性ＥＬＩＳＡを繰り返し行った。特に、ＢＴ５３ハイブリドーマクローン（７Ｃ５）が、配列番号２のＦＧＦＲ４ポリペプチドへの相対的な定性的に評価した結合を示す唯一のクローンであった。その上、７Ｃ５クローンをさらにサブクローニングし、追加の定性実験を行い、クローン集団が、野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドに結合する単一種の抗体を生産したことを確認した。これらのサブクローニングした集団からの定性ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光データは、全ての７Ｃ５サブクローンによる強い結合を示しており（データ示さず）、これはさらに、ＢＴ５３ハイブリドーマクローンによって生産されたｍＡｂの強い特異的な結合活性を示す。

[00152]次に、フローサイトメトリーを使用してＢＴ５３モノクローナル抗体の結合特異性のデータをさらに確認した。具体的に言えば、フローサイトメトリーによって、ＢＴ５３ハイブリドーマクローンからのｍＡｂを使用して、抗マウスＩｇＧ抗体（すなわち、陰性対照）と比較することにより、２種の横紋筋肉腫（ＲＭＳ）細胞株、ＲＭＳ−ＲＤおよびＲＭＳＲｈ３０を分析した。さらにこれらの実験では、異なる蛍光色素を有するマウス抗体を認識する２種の異なる二次抗体を使用した。加えて、これらの実験を行った後、所定の細胞型と二次抗体に関して得られたフローサイトメトリープロットを重ね合わせて、ＢＴ５３ｍＡｂと陰性対照抗体とを比較した。

[00153]図３を参照すると、ＢＴ５３ハイブリドーマ株によって生産されたｍＡｂは、ＲＭＳ−ＲＤおよびＲＭＳ−Ｒｈ３０細胞の両方に対して結合活性を示した。第一に、左側の重ね合わせたプロットは、Ｄｙ６４９二次抗体で染色された両方の細胞株を示す。特に、実線のヒストグラム（両方のプロットにおいてｘ軸の左側）は、結合をほとんど示さなかった陰性対照抗体を示す。逆に、白抜きのヒストグラム（両方のプロットにおいてｘ軸の中央から右側）は、ＢＴ５３ハイブリドーマ株によって生産されたｍＡｂによる結合を示す。同様に、右側の重ね合わせたプロットは、異なる二次抗体（Ｒ−ＰＥ）を使用した同じ結果を示す。総合すると、これらの重ね合わせたプロットは、ＢＴ５３ハイブリドーマクローンによって生産されたｍＡｂは、野生型ＦＧＦＲ４ポリペプチドに強く特異的に結合することを示した。

[00154]本明細書に記載された本発明の様々な実施態様に好適な改変を施すことができることが予想されるが、これらも本発明の範囲内に含まれるものとする。それゆえに本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ解釈されるものとする。

Claims (16)

1. ハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１０１９によって生産されたモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体。
2. 前記モノクローナル抗体が、配列番号１のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 前記抗体が、ＩｇＧ１、カッパ鎖アイソタイプである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
4. 前記抗体が標識されている、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
5. 前記抗体が、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、および放射性同位体標識からなる群より選択される１種またはそれより多くの標識で標識されている、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
6. 前記モノクローナル抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
7. ハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１０１９によって生産された単離されたモノクローナル抗体。
8. 前記モノクローナル抗体が、配列番号１のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
9. 前記抗体が、ＩｇＧ１、カッパ鎖アイソタイプである、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
10. 前記抗体が標識されている、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
11. 前記抗体が、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、および放射性同位体標識からなる群より選択される１種またはそれより多くの標識で標識されている、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
12. 前記モノクローナル抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
13. モノクローナル抗体の作製方法であって、該方法は、ヒト野生型ＣＤ９線維芽細胞増殖因子４に特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１２１０１９を提供すること、およびモノクローナル抗体の生産が可能な条件下でハイブリドーマ細胞株ＢＴ５３を培養することを含む、上記方法。
14. 前記モノクローナル抗体に標識をカップリングすることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記標識が、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、および放射性同位体標識からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記モノクローナル抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１３に記載の方法。

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