JP2016088884A - Tumor treatment composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物に関する。 The present invention relates to a composition for treating Ewing sarcoma family tumors.
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ ｏｆ ｆａｍｉｌｙ ｔｕｍｏｒｓ：ＥＳＦＴ）は、小児期に最も多く発症する腫瘍である。例えば、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の一種である骨ユーイング肉腫は、主として小児に発症する悪性骨軟部腫瘍である。ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対しては、化学・手術・放射線療法などの治療が行われているが、５年生存率が約５０％と予後不良な疾患である。 Ewing's sarcoma of family tumors (ESFT) is the most common tumor in childhood. For example, bone Ewing sarcoma, a member of the Ewing sarcoma family tumor, is a malignant bone and soft tissue tumor that mainly develops in children. Ewing sarcoma family tumors are treated with chemotherapy, surgery, radiotherapy, etc., but the 5-year survival rate is about 50%, which is a poor prognosis.
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者においては、特定の染色体（ヒトであれば、第２２染色体）の特徴的な転座が認められ、転座によって生じるＥＷＳキメラ遺伝子にコードされるタンパク質が疾病の発生原因と考えられている。例えば、ヒトであれば、第２２染色体と第１１染色体の転座ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）によって生じるＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の転写産物では、転写制御ドメインであるＦｌｉ−１タンパク質のＮ末端領域が失われ、このため細胞増殖シグナル伝達経路が活性化されることが疾病発生の原因であると考えられている（非特許文献１）。この他、ＥＷＳキメラ遺伝子としては、ＥＲＧ（ｔ（２１；２２））、ＥＴＶ１（ｔ（７；２２））、Ｅ１Ａ−Ｆ（ｔ（１７；２２））、またはＦＥＶ（ｔ（２；２２））と、ＥＷＳとのキメラ遺伝子が知られている（非特許文献２）。 In Ewing sarcoma family tumor patients, a characteristic translocation of a specific chromosome (chromosome 22 in humans) is recognized, and the protein encoded by the EWS chimeric gene generated by the translocation is considered to be the cause of the disease. It has been. For example, in the case of humans, the transcription product of the EWS / Fli-1 chimeric gene generated by the translocation t (11; 22) (q24; q12) of chromosome 22 and chromosome 11 is Fli-1, which is a transcriptional regulatory domain. It is considered that the N-terminal region of the protein is lost and, therefore, the cell proliferation signal transduction pathway is activated, which is the cause of disease development (Non-patent Document 1). Other EWS chimeric genes include ERG (t (21; 22)), ETV1 (t (7; 22)), E1A-F (t (17; 22)), or FEV (t (2; 22)). ) And EWS are known (Non-Patent Document 2).
近年、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療方法として、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする核酸医薬が検討され始めている。例えば、引用文献３では、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡを用いることにより、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を保有するユーイング肉腫細胞株において、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１タンパク質の発現が抑制され、細胞増殖能が低下することが記載されている。 In recent years, nucleic acid drugs targeting the EWS chimeric gene have been studied as a method for treating Ewing sarcoma family tumors. For example, in Cited Document 3, by using a double-stranded siRNA targeting an EWS / Fli-1 chimeric gene, EWS / Fli-1 protein of EWS / Fli-1 protein is used in an Ewing sarcoma cell line carrying the EWS / Fli-1 chimeric gene. It is described that expression is suppressed and cell proliferation ability is reduced.
ＥＷＳキメラ遺伝子は腫瘍細胞に特異的であるという点において、ＥＷＳキメラ遺伝子を特異的に認識する二本鎖ｓｉＲＮＡは薬理学上の利点がある。しかしながら、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ単独で処理した場合、処理後１日程度は生存細胞数が低下するものの、その後は細胞増殖が再び活発化する（例えば、非特許文献３のＦｉｇｕｒｅ ３）。それゆえ、細胞増殖抑制効果の持続性が十分ではないという問題があった。 Double-stranded siRNA that specifically recognizes the EWS chimeric gene has pharmacological advantages in that the EWS chimeric gene is specific for tumor cells. However, when treated with double-stranded siRNA alone targeting the EWS / Fli-1 chimeric gene, the number of viable cells decreases for about one day after the treatment, but thereafter cell proliferation is reactivated (for example, non- FIG. 3) of Patent Document 3. Therefore, there is a problem that the cell growth inhibitory effect is not sufficient.
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、細胞増殖抑制効果の持続性が高いユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a composition for treating Ewing sarcoma family tumors having a high cell growth inhibitory effect.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a composition for treating Ewing sarcoma family tumors, comprising a double-stranded siRNA targeting an EWS chimeric gene and miR-145. As a result, the inventors have found that the above-mentioned problems can be solved, and have completed the present invention.
本発明によれば、細胞増殖抑制効果の持続性が高いユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the composition for Ewing sarcoma family tumor treatment with the high persistence of the cell growth inhibitory effect is provided.
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。 Embodiments of the present invention will be described below. In addition, this invention is not limited only to the following embodiment.
また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％の条件で測定する。 In this specification, “X to Y” indicating a range means “X or more and Y or less”. Unless otherwise specified, measurement of operation and physical properties is performed under conditions of room temperature (20 to 25 ° C.) / Relative humidity 40 to 50%.
本発明に係るユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物（以下、「本発明に係るユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物」を、単に「本発明に係る組成物」とも称する。）は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含むことを特徴とする。 The Ewing sarcoma family tumor treatment composition according to the present invention (hereinafter, the “Ewing sarcoma family tumor treatment composition according to the present invention” is also simply referred to as “the composition according to the present invention”) is the EWS chimeric gene. It comprises a double-stranded siRNA to be targeted and miR-145.
本発明に係る組成物の作用メカニズムは、以下のものであると推測される。すなわち、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより、ＥＷＳキメラ遺伝子にコードされるタンパク質の発現が、一定程度抑制される。これにより増殖シグナルが弱まり、解糖系からＴＣＡ回路による糖代謝系に移行するため、酸化ストレスが増強されると考えらえる。一方、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株は、（１）Ｇ０／Ｇ１期で細胞周期が一旦停止すること、（２）オートファジーが誘導されること、（３）処理から７２〜９６時間後に再び活発に増殖を開始することを見出した。この結果から、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理した細胞が、増殖シグナルの低下により細胞周期がＧ０／Ｇ１期で一旦停止し、この間、酸化ストレスにより障害を受けたミトコンドリア等がオートファゴソーム中で修復を受けているものと推測した。酸化ストレスによる障害の修復が終わると、再び細胞周期が進行するため、処理から７２〜９６時間後に再び増殖が活発化するものと考えられる。一方、本発明者は、詳細な機構は不明ではあるが、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、細胞増殖抑制効果の持続性が増強されることを見出した。Ｊ．Ｂａｎら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ；３０， ２１７３−２１８０（２０１１））には、ユーイング肉腫細胞株をｍｉＲ−１４５処理することによりＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現が抑制されることが記載されているが、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５との併用により、ＥＷＳキメラ遺伝子の発現が相乗的に抑制されることを初めて見出した。ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用した場合、かような相乗的効果が一因となり、Ｓ期への移行がより強く抑制され、細胞増殖抑制効果の持続性が増強されるのではないかと推測される。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。 The action mechanism of the composition according to the present invention is presumed to be as follows. That is, the expression of the protein encoded by the EWS chimeric gene is suppressed to some extent by the double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene. This weakens the growth signal and shifts from the glycolytic system to the sugar metabolic system by the TCA circuit, and it is considered that oxidative stress is enhanced. On the other hand, the present inventor found that Ewing sarcoma cell lines treated with double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene had (1) that the cell cycle was temporarily stopped at G0 / G1 phase, and (2) autophagy was induced. (3) It was found that after 72 to 96 hours from the treatment, it actively started to grow again. From this result, the present inventor confirmed that cells treated with a double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene temporarily stopped at the G0 / G1 phase due to a decrease in proliferation signal, and during this time, the cells were damaged by oxidative stress. It was speculated that the received mitochondria etc. were repaired in the autophagosome. When repair of the damage due to oxidative stress is completed, the cell cycle proceeds again, and it is considered that proliferation is activated again 72 to 96 hours after the treatment. On the other hand, although the detailed mechanism is unknown, the present inventor enhances the persistence of the cell growth inhibitory effect by using miR-145 in combination with a double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene. I found. J. et al. Ban et al. (Oncogene; 30, 2173-2180 (2011)) describe that EWS / Fli-1 expression is suppressed by treating the Ewing sarcoma cell line with miR-145. The inventors found for the first time that the expression of the EWS chimeric gene is synergistically suppressed by the combined use of the double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145. When a double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145 are used in combination, such a synergistic effect contributes, and the transition to the S phase is more strongly suppressed, and the cell growth inhibitory effect is sustained. Is presumed to be enhanced. In addition, the said mechanism is estimation and does not restrict | limit the technical scope of this invention.
本明細書において、「ユーイング肉腫ファミリー腫瘍」は、特定の染色体（ヒトであれば第２２染色体）の転座を伴う疾患であり、例えば、骨ユーイング肉腫、骨外性ユーイング肉腫、未熟神経外胚葉腫瘍（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ Ｔｕｍｏｒ：ＰＮＥＴ）、およびアスキン（Ａｓｋｉｎ）腫瘍を含む。このうち、本発明に係る組成物は、骨ユーイング肉腫に特に有効に用いられる。 In the present specification, the “Ewing sarcoma family tumor” is a disease accompanied by translocation of a specific chromosome (chromosome 22 if human), for example, bone Ewing sarcoma, extraosseous Ewing sarcoma, immature neuroectodermal Tumor (Primitive Neurotumor Tumor: PNET) and Askin tumor. Among these, the composition according to the present invention is particularly effectively used for bone Ewing sarcoma.
本明細書における「ＥＷＳキメラ遺伝子」は、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者において典型的に観察される、上記の染色体の転座によって生じるキメラ遺伝子であり、例えば、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１、ＥＷＳ／ＥＲＧ、ＥＷＳ／ＥＴＶ１、ＥＷＳ／Ｅ１Ａ−Ｆ、およびＥＷＳ／ＦＥＶなどのキメラ遺伝子が挙げられる。 An “EWS chimeric gene” as used herein is a chimeric gene produced by the above-described chromosomal translocation typically observed in Ewing sarcoma family tumor patients, for example, EWS / Fli-1, EWS / ERG, EWS. Chimeric genes such as / ETV1, EWS / E1A-F, and EWS / FEV.
本発明に係る組成物において使用される「二本鎖ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）に関与し、配列特異的に標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを分解し、標的タンパク質の発現を特異的に抑制する活性を備える二本鎖のＲＮＡ分子である。生体内においてｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に組込まれ、パッセンジャー鎖が脱離する。その後、ガイド鎖が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を認識して結合し、ガイド鎖が結合したｍＲＮＡはＲＩＳＣによって分解される。本発明で用いられる二本鎖ｓｉＲＮＡは、単離されたものである。 The “double-stranded siRNA” used in the composition according to the present invention is involved in RNA interference (RNAi), degrades mRNA encoding the target protein in a sequence-specific manner, and specifically targets the expression of the target protein. It is a double-stranded RNA molecule with an activity to suppress it. In vivo, siRNA is incorporated into a protein complex called RISC, and the passenger strand is released. Thereafter, the guide strand recognizes and binds to the mRNA sequence encoding the target protein, and the mRNA to which the guide strand is bound is degraded by RISC. The double-stranded siRNA used in the present invention has been isolated.
なお、本明細書では、二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合する、当該ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（または当該アンチセンス鎖を含むＲＮＡ領域）を「ガイド鎖」と表現する。一方、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（または当該センス鎖を含むＲＮＡ領域）を「パッセンジャー鎖」と表現する。 In the present specification, in the double-stranded siRNA, an antisense strand (or an RNA region containing the antisense strand) against the mRNA that finally pairs with the mRNA of the target gene is referred to as a “guide strand”. Express. On the other hand, a sense strand (or an RNA region containing the sense strand) with respect to the antisense strand is expressed as a “passenger strand”.
二本鎖ｓｉＲＮＡは、通常は２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のガイド鎖と、ガイド鎖に相補的な２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のパッセンジャー鎖とからなる。ガイド鎖は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の連続する１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基に対して相補的な配列を含む（標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の、ガイド鎖と相補的な領域を「標的配列」とも称する。）。また、パッセンジャー鎖は、標的配列と相同な配列を含む。 The double-stranded siRNA usually comprises a guide strand having 21 to 30 bases, preferably 23 to 27 bases, and a passenger strand complementary to the guide strands having 21 to 30 bases, preferably 23 to 27 bases. The guide strand includes a sequence complementary to a continuous 16 to 27 bases, preferably 21 to 25 bases of the mRNA sequence encoding the target protein (a region complementary to the guide strand of the mRNA sequence encoding the target protein). Is also referred to as "target sequence"). The passenger strand also includes a sequence that is homologous to the target sequence.
二本鎖ｓｉＲＮＡの末端構造は、平滑末端でもよいが、オーバーハング（突出）を有していても良い。パッセンジャー鎖とガイド鎖との３’末端が塩基対を形成せず、２〜５塩基、好ましくは２塩基突出したオーバーハング（例えば、ＵＵ、またはｄＴｄＴ）を有することにより、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を抑制する活性が向上することがある。ガイド鎖の塩基配列において標的配列に相補的な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。また、パッセンジャー鎖の塩基配列において標的配列に相同な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。 The terminal structure of the double-stranded siRNA may be a blunt end, but may have an overhang (protrusion). MRNA that encodes the target protein by the 3 ′ end of the passenger strand and the guide strand not forming a base pair and having an overhang (for example, UU or dTdT) protruding from 2 to 5 bases, preferably 2 bases The activity to suppress the expression of may be improved. A region other than the sequence region complementary to the target sequence in the base sequence of the guide strand may be an overhang. In addition, a region other than the sequence region homologous to the target sequence in the base sequence of the passenger strand may be an overhang.
本発明における組成物の有効成分として含まれる、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（以下、「ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ」を、単に「本発明に係るｓｉＲＮＡ」とも称する。）としては、標的配列（１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基）に相補的な配列を含むガイド鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）と、ガイド鎖に相補的な配列を含むパッセンジャー鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）とがアニールした二本鎖ポリヌクレオチドが用いられても良い。 The double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene (hereinafter referred to as “double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene”), which is included as an active ingredient of the composition in the present invention, is simply referred to as “siRNA according to the present invention”. As a guide strand (21 to 30 bases, preferably 23 to 27 bases) containing a sequence complementary to the target sequence (16 to 27 bases, preferably 21 to 25 bases) and complementary to the guide strands. Alternatively, a double-stranded polynucleotide in which a passenger strand (21 to 30 bases, preferably 23 to 27 bases) containing an arbitrary sequence is annealed may be used.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から誘導されたものが含まれる。ｓｈＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるパッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とが３〜１１塩基程度のループ領域を介して連結された一本鎖のポリヌクレオチドである。生体内で発現されたｓｈＲＮＡは、パッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とがハイブリダイズしたヘアピン構造を取るが、ＲＮａｓｅの一種（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングを受け、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。ｓｈＲＮＡの塩基長は、例えば４５〜７０塩基であり、好ましくは４５〜６０塩基である。 The double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention includes those derived from short hairpin RNA (shRNA). shRNA is a single-stranded polynucleotide in which a passenger strand equivalent region and a guide strand equivalent region in a double-stranded siRNA are linked via a loop region of about 3 to 11 bases. ShRNA expressed in vivo takes a hairpin structure in which a region corresponding to a passenger strand and a region corresponding to a guide strand are hybridized, but is processed by a kind of RNase (Dicer) to form a double-stranded siRNA. The base length of shRNA is, for example, 45 to 70 bases, and preferably 45 to 60 bases.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、分子構造の安定化、酵素耐性の向上、細胞への取り込みやすさの向上等を目的として、当業者に知られた手段によって化学的に修飾されたものであっても良い。化学的修飾の例としては、ＬＮＡ（登録商標）などの架橋化した核酸、ホスホロチオエート化した核酸、２’−Ｏ−メチル化した核酸を用いても良い。また、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖の５’末端および／または３’末端が蛍光色素、コレステロール、ビオチン等で修飾されたものであっても良い。 The double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition of the present invention is chemically synthesized by means known to those skilled in the art for the purpose of stabilizing the molecular structure, improving enzyme resistance, improving ease of incorporation into cells, and the like. May be modified. As an example of chemical modification, a cross-linked nucleic acid such as LNA (registered trademark), a phosphorothioated nucleic acid, or a 2'-O-methylated nucleic acid may be used. Further, the passenger strand and / or the guide strand may be modified at the 5 'end and / or 3' end with a fluorescent dye, cholesterol, biotin or the like.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とするものである。図１に、例として、ＥＷＳ遺伝子とＦｌｉ−１との転座、および転座によって生じるキメラ遺伝子に対する、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの結合を模式的に表す。図１に示すように、本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、転座切断点を含む領域を標的配列とする。これにより、本発明に係るｓｉＲＮＡはＥＷＳキメラ遺伝子を特異的に認識することができる。 The double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention targets an EWS chimeric gene. FIG. 1 schematically shows, as an example, the translocation between the EWS gene and Fli-1, and the binding of double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene to the chimeric gene generated by the translocation. As shown in FIG. 1, the double-stranded siRNA included as an active ingredient of the composition in the present invention uses a region containing a translocation cleavage point as a target sequence. Thereby, the siRNA according to the present invention can specifically recognize the EWS chimeric gene.
標的配列の選定方法は、当業者に知られた手法により行うことができ、例えば、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドがＡまたはＵである、（ｉｉ）センス鎖の５’末端がＧまたはＣである、（ｉｉｉ）ＧＣ含量が３５〜５５％である、（ｉｖ）ＧおよびＣが４塩基以上連続しない、ことを基準として選定することができる（例えば、Ｋ．Ｕｉ−Ｔｅｉら，Ｎｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４， ９３６−９４８； Ｍ．ＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉとＨ．Ｐｒｙｄｚ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｓｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２００４， １０５０−１０５８； Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３， ７１７４−７１８１； Ａ．Ｋｈｖｏｒｏｖａら，Ｃｅｌｌ ２００３， ２０９−２１６も参照される。）。 The method for selecting a target sequence can be performed by a technique known to those skilled in the art. For example, (ii) the nucleotide at the 5 ′ end of the antisense strand is A or U, (ii) the 5 ′ end of the sense strand Is G or C, (iii) the GC content is 35 to 55%, (iv) G and C are not consecutive for 4 bases or more (for example, K. Ui-Tei). , Nucleci Acids Research 2004, 936-948; M. Amarzguouui and H. Prydz, Biochemical Biophysical Research Communications 2004, 1050-1058; ology 2003, 7174-7181; A.Khvorova et, Cell 2003, 209-216 also referred)..
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とするものであるが、例えば、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子、ＥＷＳ／ＥＲＧキメラ遺伝子、ＥＷＳ／ＥＴＶ１キメラ遺伝子、ＥＷＳ／Ｅ１Ａ−Ｆキメラ遺伝子、およびＥＷＳ／ＦＥＶキメラ遺伝子からなる群から選択されるキメラ遺伝子を標的とするものである。本発明における組成物においては、好ましくはＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが用いられる。ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子は、骨ユーイング肉腫やＰＮＥＴ等、多くのユーイング肉腫ファミリー腫瘍において検出されることが知られている。ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者において特に頻繁に観察されるＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子としては、タイプ１（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン６）およびタイプ２（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン５）が知られている。 The double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention targets an EWS chimeric gene. For example, an EWS / Fli-1 chimeric gene, an EWS / ERG chimeric gene, an EWS / ETV1 chimeric gene , EWS / E1A-F chimeric genes, and chimeric genes selected from the group consisting of EWS / FEV chimeric genes. In the composition of the present invention, a double-stranded siRNA targeting the EWS / Fli-1 chimeric gene is preferably used. It is known that the EWS / Fli-1 chimeric gene is detected in many Ewing sarcoma family tumors such as bone Ewing sarcoma and PNET. EWS / Fli-1 chimeric genes observed particularly frequently in patients with Ewing sarcoma family tumors include type 1 (EWS exon 7 / Fli-1 exon 6) and type 2 (EWS exon 7 / Fli-1). Exon 5) is known.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖の標的配列は、ＥＷＳキメラ遺伝子の転座切断点を含む。好ましくは、本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖は、ＥＷＳキメラ遺伝子の、転座切断点を含む連続した１６〜２７塩基、より好ましくは連続した１９〜２６塩基、更に好ましくは連続した２１〜２５塩基を標的配列とする。標的配列におけるＥＷＳ遺伝子に由来する塩基数と、ＥＷＳ遺伝子との転座を生じた相手方遺伝子（例えば、Ｆｌｉ−１遺伝子、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、Ｅ１Ａ−Ｆ遺伝子、またはＦＥＶ遺伝子）（以降、Ｆｌｉ−１遺伝子等の「ＥＷＳ遺伝子との転座を生じた相手方遺伝子」を、単に「相手方遺伝子」とも称する。）に由来する塩基数との割合は、本発明における目的が達成される限りにおいて特に制限されるものではない。例えば、標的配列は、ＥＷＳ遺伝子由来の連続する３〜２４塩基と、相手方遺伝子由来の連続する３〜２４塩基（ただし、ＥＷＳ遺伝子由来の塩基と相手方遺伝子由来の塩基との合計が、１６〜２７塩基である。）とからなる。好ましくは、標的配列は、ＥＷＳ遺伝子由来の連続する６〜１９塩基と、相手方遺伝子由来の連続する６〜１９塩基（ただし、ＥＷＳ遺伝子由来の塩基と相手方遺伝子由来の塩基との合計が、２１〜２５塩基である。）とからなる。 The target sequence of the guide strand of the double stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention contains a translocation breakpoint of the EWS chimeric gene. Preferably, the guide strand of the double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention is a continuous 16 to 27 bases, more preferably a continuous 19 to 26 bases including a translocation breakpoint of the EWS chimeric gene. More preferably, consecutive 21 to 25 bases are used as the target sequence. The number of bases derived from the EWS gene in the target sequence and the partner gene that caused a translocation with the EWS gene (for example, Fli-1 gene, ERG gene, ETV1 gene, E1A-F gene, or FEV gene) (hereinafter referred to as Fli gene) -1 gene or the like "the partner gene that caused a translocation with the EWS gene" is also simply referred to as "the partner gene"), and the ratio with the number of bases derived from the gene is particularly limited as long as the object of the present invention is achieved. It is not limited. For example, the target sequence has 3-24 bases derived from the EWS gene and 3-24 bases derived from the counterpart gene (provided that the total of the bases derived from the EWS gene and the counterpart gene is 16-27. A base). Preferably, the target sequence includes 6 to 19 bases derived from the EWS gene and 6 to 19 bases derived from the counterpart gene (provided that the total of the bases derived from the EWS gene and the counterpart gene is 21 to 21 25 bases).
より好ましくは、本発明に係るｓｉＲＮＡのガイド鎖は、ＥＷＳ遺伝子のエキソン７由来の連続する３〜２４塩基（好ましくは６〜１９塩基）と、Ｆｌｉ−１遺伝子のエキソン５由来またはエキソン６由来の連続する３〜２４塩基（好ましくは６〜１９塩基）とが連結したＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の、転座切断点を含む連続した１６〜２７塩基、より好ましくは連続した１９〜２６塩基、更に好ましくは連続した２１〜２５塩基を標的配列とする。すなわち、本発明に係るｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖が、ＥＷＳ遺伝子のエキソン７由来の連続する３〜２４塩基配列（好ましくは６〜１９塩基）と、Ｆｌｉ−１遺伝子のエキソン５由来またはエキソン６由来の連続する３〜２４塩基配列（好ましくは６〜１９塩基）とが連結したＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の、転座切断点を含む１６〜２７塩基配列、より好ましくは１９〜２６塩基、更に好ましくは２１〜２５塩基配列、およびオーバーハングからなる。 More preferably, the guide strand of the siRNA according to the present invention is derived from 3-24 bases (preferably 6-19 bases) derived from exon 7 of the EWS gene, and from exon 5 or exon 6 of the Fli-1 gene. An EWS / Fli-1 chimeric gene linked to consecutive 3 to 24 bases (preferably 6 to 19 bases), including continuous 16 to 27 bases including a translocation breakpoint, more preferably continuous 19 to 26 bases, More preferably, the target sequence is 21 to 25 consecutive bases. That is, the passenger strand of the siRNA according to the present invention is a continuous 3-24 base sequence (preferably 6-19 bases) derived from exon 7 of the EWS gene and a continuous sequence derived from exon 5 or exon 6 of the Fli-1 gene. The EWS / Fli-1 chimeric gene linked with 3 to 24 nucleotide sequences (preferably 6 to 19 nucleotides) linked to each other has a 16 to 27 nucleotide sequence including a translocation breakpoint, more preferably 19 to 26 nucleotides, still more preferably. It consists of 21-25 base sequences and overhangs.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列（配列：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣ−３’）を含み、パッセンジャー鎖が配列番号２で示される塩基配列（配列：５’−ＧＵＣＡＵＡＡＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＧＣ−３’）を含むことが好ましい。本発明の一実施形態では、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とし、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列を含む１９〜２６塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。 The double-stranded siRNA included as an active ingredient of the composition of the present invention includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a guide strand (sequence: 5′-GCAGACACCCUUCUAUGAC-3 ′), and a passenger strand represented by SEQ ID NO: 2. It is preferable that the base sequence (sequence: 5'-GUCAUAAGAAGGGGUUCUGC-3 ') is included. In one embodiment of the present invention, the Ewing sarcoma family, which comprises a 19-26 base double-stranded siRNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and miR-145, targeting an EWS chimeric gene Tumor treatment compositions are provided.
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列（配列：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣ−３’）および２〜５塩基のオーバーハングからなり、パッセンジャー鎖が配列番号２で示される塩基配列（配列：５’−ＧＵＣＡＵＡＡＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＧＣ−３’）および２〜５塩基のオーバーハングからなることがより好ましい。すなわち、本発明の一実施形態では、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とし、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列および２〜５塩基のオーバーハングからなる二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。当該オーバーハングは、例えば、ＵＵ、またはｄＴｄＴである（ｄＴ：デオキシチミジン）。 The double-stranded siRNA contained as an active ingredient of the composition in the present invention consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the guide strand (sequence: 5′-GCAGACACCCUUCUAUGAC-3 ′) and an overhang of 2 to 5 bases, More preferably, the passenger strand consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (sequence: 5′-GUCAUAAGAAGGUUCUGC-3 ′) and an overhang of 2 to 5 bases. That is, in one embodiment of the present invention, a double-stranded siRNA whose target is an EWS chimeric gene and whose guide strand consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an overhang of 2 to 5 bases, and miR-145, A composition for the treatment of Ewing sarcoma family tumors is provided. The overhang is, for example, UU or dTdT (dT: deoxythymidine).
本発明で用いられるｍｉＲ−１４５はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の一種である。マイクロＲＮＡはノンコーディングＲＮＡの一種であり、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と相補的な配列領域を有する。生体内においては、ヘアピン構造を有する一本鎖ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから、酵素（Ｄｒｏｓｈａ）によって部分配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が切り出される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが前駆体となり、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ型酵素の一種であるＤｉｃｅｒによって約２０〜２５残基の成熟マイクロＲＮＡが切り出される。一般的に、切り出された成熟マイクロＲＮＡのうち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの５’末端側から発現するものを「−５ｐ」と、３’末端側から発現するものを「−３ｐ」と称する。成熟マイクロＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と結合することにより、当該ｍＲＮＡからの翻訳を阻害し、標的タンパク質の発現を抑制する。一般に、一つのマイクロＲＮＡは、複数のｍＲＮＡを標的とする場合が多い。 MiR-145 used in the present invention is a kind of microRNA (miRNA). MicroRNA is a kind of non-coding RNA and has a sequence region complementary to the 3 'untranslated region of the target mRNA. In vivo, a partial sequence (pre-miRNA) is cut out from pri-miRNA, which is a single-stranded RNA having a hairpin structure, by an enzyme (Drosha). Pre-miRNA serves as a precursor, and mature microRNA of about 20 to 25 residues is excised by Dicer, which is a kind of RNase type III enzyme. Generally, among the excised mature microRNAs, those expressed from the 5 'end of pre-miRNA are referred to as "-5p", and those expressed from the 3' end are referred to as "-3p". The mature microRNA binds to the 3 'untranslated region of the target mRNA, thereby inhibiting translation from the mRNA and suppressing the expression of the target protein. In general, one microRNA often targets multiple mRNAs.
本発明で用いられるｍｉＲ−１４５は、単離されたものである。 MiR-145 used in the present invention is isolated.
ｍｉＲ−１４５は、ヒトの他、マウス、ゼブラフィッシュ、ラット、ブタ、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、ウシ、アフリカツメガエル等の多くの生物種においても見出されている。例として、ヒトｍｉＲ−１４５（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、配列番号３）のステムループ構造を以下に示す。太字部分は成熟ｍｉＲ−１４５部分（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−３ｐ（配列番号５））を示す。 In addition to humans, miR-145 has been found in many biological species such as mice, zebrafish, rats, pigs, rhesus monkeys, chimpanzees, gorillas, cows, and Xenopus laevis. As an example, the stem loop structure of human miR-145 (hsa-miR-145, SEQ ID NO: 3) is shown below. The bold part indicates the mature miR-145 part (hsa-miR-145-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-145-3p (SEQ ID NO: 5)).
本発明において用いられるｍｉＲ−１４５は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡのいずれであっても良いが、好ましくは成熟ｍｉＲＮＡである。また、マイクロＲＮＡは一般的に生物種間での保存性が極めて高いため、ｍｉＲ−１４５が由来する生物種も特に制限されないが、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞が由来する生物種と同一種であることが好ましい。より好ましくはヒト由来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に対して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５が用いられ、さらに好ましくは成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５が用いられる。 MiR-145 used in the present invention may be pri-miRNA, pre-miRNA, or mature miRNA, but is preferably mature miRNA. In addition, since microRNA generally has extremely high conservation between species, the species from which miR-145 is derived is not particularly limited, but it must be the same species as the species from which the Ewing sarcoma family tumor cells are derived. Is preferred. More preferably, hsa-miR-145 is used for human-derived Ewing sarcoma family tumor cells, and more preferably, mature hsa-miR-145 is used.
二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−１４５は従来公知の核酸合成方法（例えば、核酸合成装置）により合成することができる。 Double-stranded siRNA and miR-145 can be synthesized by a conventionally known nucleic acid synthesis method (for example, a nucleic acid synthesizer).
本発明における組成物の有効成分としては、本発明に係るｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲ−１４５（以下、「本発明に係るｓｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ−１４５」を区別せず、両者を含む用語として「本発明に係る核酸分子」とも称する。）の発現ベクターも好ましく用いられる。かような発現ベクターとしては、適切なプロモーターを有するプラスミドベクター、ウイルスベクター等を、ベクターが導入される宿主に合わせて適宜選択し、プロモーターの下流に本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡを従来公知の手法により組込んだものを用いればよい。プロモーターとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が例示できる。 As an active ingredient of the composition in the present invention, siRNA and / or miR-145 according to the present invention (hereinafter, “siRNA according to the present invention” and “miR-145” are not distinguished, and the term including both is “ The expression vector of “the nucleic acid molecule according to the invention” is also preferably used. As such an expression vector, a plasmid vector, a viral vector or the like having an appropriate promoter is appropriately selected according to the host into which the vector is introduced, and DNA encoding the nucleic acid molecule according to the present invention is conventionally downstream of the promoter. What is incorporated by a known method may be used. The promoter is not particularly limited, and examples thereof include U6 promoter, H1 RNA polymerase III promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＳＩＮｓｉシリーズ、ｐＢＡｓｉシリーズ、ｐＳＩＲＥＮシリーズ（以上、タカラバイオ株式会社製）等が例示できる。プラスミドには、通常、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれる。 Examples of plasmid vectors include pSINsi series, pBAsi series, and pSIREN series (above, manufactured by Takara Bio Inc.). The plasmid usually contains a gene resistant to antibiotics such as ampicillin and kanamycin.
ウイルスベクターとしては、例えば、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が例示できる。 Examples of virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, and the like.
本発明に係るｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、パッセンジャー鎖をコードするＤＮＡとガイド鎖をコードするＤＮＡとが別々にプロモーターの下流にそれぞれ組込まれたもの（タンデム型）でもよく、パッセンジャー鎖相当領域をコードするＤＮＡとガイド鎖相当領域をコードするＤＮＡとがループ領域をコードするＤＮＡを介して連結されてひとつのプロモーターの下流に組込まれた上述のｓｈＲＮＡのようなもの（ショートヘアピン型）でもよい。 The DNA encoding the siRNA according to the present invention may be one in which the DNA encoding the passenger strand and the DNA encoding the guide strand are separately incorporated downstream of the promoter (tandem type), and encodes the region corresponding to the passenger strand. Such a shRNA (short hairpin type) in which the DNA to be encoded and the DNA encoding the region corresponding to the guide strand are linked via the DNA encoding the loop region and incorporated downstream of one promoter may be used.
ｍｉＲ−１４５をコードするＤＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、および成熟ｍｉＲＮＡのいずれをコードするものであっても良い。 The DNA encoding miR-145 may encode any of pri-miRNA, pre-miRNA, and mature miRNA.
本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡの下流には、ターミネーターが含まれることが好ましい。 It is preferable that a terminator is included downstream of the DNA encoding the nucleic acid molecule according to the present invention.
本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡのベクターへの組換え方法は、当業者に知られた手段によって行うことができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， ９．４７−９．５８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ（１９８９）等が参酌される。 The method for recombination of a DNA encoding a nucleic acid molecule according to the present invention into a vector can be performed by means known to those skilled in the art, for example, Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press (1989) and the like are considered.
本発明に係る組成物に含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の組成比は、任意の割合で設定できるが、好ましくは１：１〜１：５０（モル比）の比率であり、より好ましくは１：１〜１：３０（モル比）の比率であり、更に好ましくは１：１〜１：１０（モル比）の比率であり、特に好ましくは１：２〜１：１０（モル比）の比率である。上記のような割合で本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを組成物が含むことにより、肉腫細胞の増殖が特に効果的に抑制される。 The composition ratio of the double-stranded siRNA and miR-145 contained in the composition according to the present invention can be set at an arbitrary ratio, but is preferably a ratio of 1: 1 to 1:50 (molar ratio), more preferably. Is a ratio of 1: 1 to 1:30 (molar ratio), more preferably 1: 1 to 1:10 (molar ratio), and particularly preferably 1: 2 to 1:10 (molar ratio). Is the ratio. When the composition contains the siRNA according to the present invention and miR-145 at the ratio as described above, the proliferation of sarcoma cells is particularly effectively suppressed.
ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを含むユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物については、細胞増殖抑制効果の持続性をインビトロで確認することもできる。細胞増殖抑制効果の持続性は、例えば、ＴＣ−１３５、Ａ６７３、またはＲＤ−ＥＳのようなＥＷＳキメラ遺伝子を有する細胞株を、本発明に係る二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５にて、例えば実施例に記載の方法により処理し、細胞数を経時で計測することにより確認することができる。上記の細胞株は、例えばＡＴＣＣ等から購入することもできる。 With regard to the Ewing sarcoma family tumor therapeutic composition containing double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145, the persistence of the cytostatic effect can also be confirmed in vitro. For example, the cell growth inhibitory effect can be maintained by using a cell line having an EWS chimeric gene such as TC-135, A673, or RD-ES, for example, with the double-stranded siRNA and miR-145 according to the present invention. It can confirm by processing by the method as described in an example, and measuring a cell number with time. The above cell lines can also be purchased from, for example, ATCC.
本発明に係る組成物は、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを有効成分として、すなわち、所望の効果を発揮するのに充分な量（有効量）で含む。「有効量」とは、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、所望の治療効果を生じるために有効な作用物質の量を意味する。例えば、本発明に係る組成物の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。組成物が含む二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の量は、例えば組成物全体に対して、それぞれ０．００１重量％以上、好ましくはそれぞれ０．０１重量％以上である。上限は特に制限されず、本発明に係るｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５のみから組成物が構成されても良い（すなわち、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５との合計量が、組成物全体に対して１００重量％）。 The composition according to the present invention contains siRNA according to the present invention and miR-145 as active ingredients, that is, in an amount sufficient to exhibit a desired effect (effective amount). “Effective amount” means the amount of an agent effective to produce a desired therapeutic effect at a reasonable benefit / risk ratio applicable to any medical treatment. For example, although the dose of the composition according to the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., the dose can be easily varied depending on conditions such as the body weight of the subject person. It can be selected appropriately. The amount of double-stranded siRNA and miR-145 contained in the composition is, for example, 0.001% by weight or more, preferably 0.01% by weight or more, respectively, with respect to the entire composition. The upper limit is not particularly limited, and the composition may be composed only of siRNA according to the present invention and miR-145 (that is, the total amount of siRNA according to the present invention and miR-145 is based on the whole composition). 100% by weight).
本発明に係る組成物は、固体または液体での投与形態に応じて製剤化することができる。経口投与としては、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、カプセル剤、粉末薬、顆粒剤、およびペースト等が例示される。非経口投与としては、例えば、皮下、腹腔内、筋内もしくは静脈内注射のための製剤、または、膣内もしくは直腸内へ投与するための剤形へと製剤化されうる。本発明に係る組成物の有効成分は核酸分子であるため、好ましくは注射剤の形態として製剤化され、なかでもリポソーム−核酸分子が複合体化した形態に製剤化されることがさらに好ましい。 The composition according to the present invention can be formulated according to a solid or liquid dosage form. Examples of oral administration include liquid medicine (aqueous solution or non-aqueous solution or suspension), tablet, pill, capsule, powder medicine, granule, and paste. For parenteral administration, for example, it can be formulated into a preparation for subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular or intravenous injection, or a dosage form for intravaginal or rectal administration. Since the active ingredient of the composition according to the present invention is a nucleic acid molecule, it is preferably formulated in the form of an injection, and more preferably in the form of complexed liposome-nucleic acid molecules.
リポソームを用いることで核酸分子の細胞への取り込みが促進され、核酸分子の血中半減期を長期化することもできる。リポソームを調製する方法としては公知のものを採用することができ、例えばＦ．Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；９， ４６７−５０８（１９８０）等が参酌される。 By using liposomes, uptake of nucleic acid molecules into cells is promoted, and the blood half-life of nucleic acid molecules can be prolonged. As a method for preparing the liposome, a known method can be employed. Szoka, Annual Review of Biophysics and Bioengineering; 9, 467-508 (1980) and the like are referred to.
本発明に係る組成物は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる担体や、他の添加剤などを含んでもよい。また、本発明に係る組成物は、賦形剤などの添加剤と混合して非経口投与、または経口投与に適した形態で使用することができる。 The composition according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier according to a desired product form, other additives, and the like. In addition, the composition according to the present invention can be mixed with additives such as excipients and used in a form suitable for parenteral administration or oral administration.
「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。 “Pharmaceutically acceptable” means that within the scope of good medical judgment, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio, and without problems and complications such as excessive toxicity, irritation, and allergic reactions, in humans and animals. Refers to a compound, material, composition, and / or dosage form suitable for use in contact with tissue.
「製薬上許容されうる担体」とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明に係る組成物を運搬または輸送することに関与する、液体または固体の製薬上許容されうる充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤、カプセル化材料、賦形剤、またはこれらの混合を意味する。製薬上許容されうる担体としては、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；トラガカント；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油脂；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液等が例示できる。 “Pharmaceutically acceptable carrier” means a liquid or solid pharmaceutical agent involved in transporting or transporting a composition according to the present invention from one organ or part of the body to another organ or part of the body. It means an acceptable filler, diluent, excipient, solvent, encapsulating material, excipient, or a mixture thereof. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, sugars such as lactose, glucose and sucrose; starches such as corn starch and potato starch; cellulose and derivatives thereof such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; tragacanth; gelatin Talc; excipients such as cocoa butter and suppository wax; oils such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol; glycerin, sorbitol, mannitol and Polyols such as polyethylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; like magnesium hydroxide and aluminum hydroxide Do buffers; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline; Ringer's solution; ethyl alcohol; phosphate buffer solution and the like.
その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた、組成物中に存在してもよい。 In addition, wetting agents such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, emulsifiers and lubricants, and colorants, release agents, coatings, sweeteners, flavors and fragrances, preservatives and antioxidants are also present in the composition. May be present.
製薬上許容されうる酸化防止剤の例には以下のものがある：アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤も必要に応じて含有させることができる。 Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include: water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium disulfite, sodium sulfite, etc .; ascorbyl palmitate, butylhydroxy Oil-soluble antioxidants such as anisole (BHA), butylhydroxytoluene (BHT), lecithin, propyl gallate, α-tocopherol and the like; and citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like Such a metal chelating agent can also be contained as needed.
非経口投与に好適な形態に製剤化された本発明に係る組成物は、本発明に係る核酸分子とともに、１つまたは複数の製薬上許容されうる溶媒、分散剤、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、等張化剤、および／または懸濁剤を含みうる。非経口投与用とする場合には、本発明に係る化合物を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理食塩水、リンガー溶液（リンゲル液）、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリンおよび界面活性剤等と適当に組み合わせた、水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマルジョンとして製剤化され得る。好ましくは注射用滅菌水溶液として製剤化され、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内等に投与される。この際、製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨであることが好ましい。また、ローション剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤、散剤、粉剤（粉状）、用事調製用の固形製剤、または貼付剤などの外用剤として、標的部位およびその周辺部位に経皮的に投与してもよい。さらに、坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。上述したうち、好ましい製剤や投与形態等は、担当の医師によって選択され得る。ローション剤、クリーム剤または軟膏などの半固形製剤は、本発明に係る核酸分子を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤および懸濁剤などからなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。 A composition according to the present invention formulated into a form suitable for parenteral administration, together with a nucleic acid molecule according to the present invention, one or more pharmaceutically acceptable solvents, dispersants, emulsifiers, antioxidants, buffers Agent, bacteriostatic agent, isotonic agent, and / or suspending agent. When used for parenteral administration, the compound according to the present invention is purified water, an appropriate buffer solution such as a phosphate buffer, physiological saline, Ringer solution (Ringer solution), physiological salt solution such as a lock solution, ethanol, etc. Can be formulated as an aqueous solution, non-aqueous solution, suspension, liposome or emulsion, suitably combined with glycerin and surfactants. Preferably, it is formulated as a sterile aqueous solution for injection and administered intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly and the like. At this time, the preparation preferably has a physiological pH, preferably a pH within the range of 6-8. In addition, liquid preparations such as lotions, suspensions and emulsions, semi-solid preparations such as gels, creams and ointments, powders, powders (powder), solid preparations for use in preparations, or external preparations such as patches As such, it may be administered percutaneously to the target site and its surrounding sites. Furthermore, it can be administered as a suppository using a suppository base. Among the above, preferred preparations, administration forms, and the like can be selected by the doctor in charge. Semi-solid preparations such as lotions, creams or ointments are used to convert nucleic acid molecules according to the present invention into fat, fatty oil, lanolin, petrolatum, paraffin, wax, plaster, resin, plastic, glycols, higher alcohols, glycerin, It is obtained by appropriately mixing with one or more selected from the group consisting of water, emulsifiers and suspending agents.
組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬や、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることもできる。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質を用いることにより、吸収持続性のある製剤になり得る。 The composition may contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents and dispersing agents and various antibacterial and antifungal agents such as, for example, parabens, chlorobutanol, phenol sorbate. Isotonic agents such as sugar and sodium chloride can also be included in the composition. Furthermore, by using agents that delay absorption, such as aluminum monostearate and gelatin, a formulation with sustained absorption can be obtained.
本発明に係る組成物が治療対象とするユーイング肉腫ファミリー腫瘍の生物種は特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ等であるが、好ましくはヒトである。 The biological species of the Ewing sarcoma family tumor to be treated by the composition according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include humans, mice, rats, hamsters, dogs, cats, etc., preferably humans.
本発明に係る核酸の投与量は、患者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定されうる。本発明においては、少なくとも細胞増殖抑制効果を得るために必要な１日あたりの有効成分の量を投与できるように、１日あたりの投与量を考慮し、組成物中の含有量を適宜設定することが好ましい。なお、本発明による組成物は、有効成分である二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを、成人（６０ｋｇ換算）一人に１日あたり、好ましくはそれぞれ１ｎｇ／６０ｋｇ〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ、より好ましくはそれぞれ１０ｎｇ／６０ｋｇ〜１００ｍｇ／６０ｋｇ、さらに好ましくはそれぞれ１００ｎｇ／６０ｋｇ〜１０ｍｇ／６０ｋｇの範囲で提供される量を含む。 The dosage of the nucleic acid according to the present invention can be determined depending on the age and weight of the patient, symptoms, administration time, dosage form, administration method, combination of drugs, and the like. In the present invention, the content in the composition is appropriately set in consideration of the dose per day so that at least the amount of the active ingredient per day necessary for obtaining the cell growth inhibitory effect can be administered. It is preferable. In the composition according to the present invention, the active ingredient double-stranded siRNA and miR-145 are used per day for an adult (60 kg equivalent), preferably 1 ng / 60 kg to 1000 mg / 60 kg, more preferably each. Each includes an amount provided in the range of 10 ng / 60 kg to 100 mg / 60 kg, more preferably 100 ng / 60 kg to 10 mg / 60 kg.
本発明の別の側面においては、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを使用する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療方法に関する発明が提供される。本発明の更に別の側面においては、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療用組成物の製造における、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−１４５の使用、が提供される。これらの実施形態においては、本発明に係る組成物に関する上述の説明が、適宜修正されて適用される。 In another aspect of the present invention, there is provided an invention relating to a method for treating Ewing sarcoma family tumors using a double-stranded siRNA targeting an EWS chimeric gene and miR-145. In yet another aspect of the invention, there is provided the use of a double stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145 in the manufacture of a composition for the treatment of Ewing sarcoma family tumors. In these embodiments, the above description regarding the composition according to the present invention is appropriately modified and applied.
有効成分であるＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の投与経路は特に制限されず、経口、皮下、腹腔内、筋内、静脈内、膣内または直腸内へ投与されうるが、注射剤の形態で患部へ投与されることが好ましい。本発明に係る治療方法は、外科的治療、化学療法、免疫療法および／または放射線治療と組み合わせて行われても良い。 There are no particular restrictions on the route of administration of the double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene, which is the active ingredient, and miR-145, and it can be administered orally, subcutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, intravenously, intravaginally or rectally. Is preferably administered to the affected area in the form of an injection. The treatment method according to the present invention may be performed in combination with surgical treatment, chemotherapy, immunotherapy and / or radiation treatment.
ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とは、同時に投与されても良く、または別々に投与され得る。患者の負担を考慮し、好ましくは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とが同時に投与される。ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とが別々に投与される場合、投与経路は互いに異なってもよく、または同一でもよい。 The double stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145 may be administered simultaneously or may be administered separately. Considering the burden on the patient, preferably, a double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145 are administered simultaneously. When the double-stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene and miR-145 are administered separately, the routes of administration may be different from each other or the same.
本発明の効果を、以下の実施例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。 The effect of this invention is demonstrated using a following example. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples.
＜試験１ 二本鎖ｓｉＲＮＡ単独処置の場合＞
（細胞培養）
細胞実験には、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン６）を保有するユーイング肉腫細胞株であるＴＣ−１３５（岐阜大学大学院連合創薬医療情報研究科創薬科学教室（岐阜市柳戸１番１）保有株）を用いた。ＴＣ−１３５は、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社より購入）中で、３７℃のインキュベーター（９５％空気／５％ＣＯ２）内で培養した。
<Test 1 Double-stranded siRNA treatment>
(Cell culture)
For cell experiments, TC-135, a Ewing sarcoma cell line carrying EWS / Fli-1 chimeric gene (EWS exon 7 / Fli-1 exon 6) A science class (owned by Yanoya 1-1, Gifu City) was used. TC-135 was cultured in RPMI 1640 medium (purchased from Invitrogen) in a 37 ° C. incubator (95% air / 5% CO 2 ).
（統計解析）
統計分析はグラフパッドプリズムソフトウェアシステム（グラフパッドソフトウェア社）を用い、両側スチューデントｔ検定により統計有意性を評価した。値は６〜１２ウェルの細胞を評価した平均±標準偏差として示した。
(Statistical analysis)
Statistical analysis was performed using a GraphPad Prism software system (GraphPad Software), and statistical significance was evaluated by a two-sided Student's t test. Values are given as the mean ± standard deviation from which 6-12 well cells were evaluated.
（トランスフェクション）
ＴＣ−１３５は、トランスフェクションの前日に任意の細胞数で６ウェルプレートに播種した。ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖の配列を、配列番号６に示す（ｓｉＥＦ、配列番号６：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣｄＴｄＴ−３’）。なお、ｓｉＥＦは、ダーマコン社より購入した。また、対照区としては製品名：ｍｉＲＩＤＩＡＮ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈａｉｒｐｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ １（ダーマコン社製）を用いた。
(Transfection)
TC-135 was seeded in a 6-well plate at an arbitrary number of cells the day before transfection. The sequence of the guide strand of the double-stranded siRNA targeting the EWS / Fli-1 chimeric gene is shown in SEQ ID NO: 6 (siEF, SEQ ID NO: 6: 5′-GCAGACACCCUUCUAUGACdTdT-3 ′). SiEF was purchased from Dermacon. As a control, product name: miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control 1 (manufactured by Dermacon) was used.
二本鎖ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにはカチオン性リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ、ライフテクノロジーズ社）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。 Cationic liposomes (Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX, Life Technologies) were used for transfection of double-stranded siRNA according to the manufacturer's protocol.
（細胞増殖）
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションした。ｓｉＥＦをトランスフェクションした時点を０時間目とし、その後、９６時間まで培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を経時で計測した。その結果を図２に示す（＊＊：ｐ＜０．０１ 対対照区）。
(Cell proliferation)
TC-135 was seeded in a 6-well plate so as to be 2-3 × 10 4 cells / ml, and siEF (final concentration 10 nM) was transfected the next day. The time point at which siEF was transfected was defined as 0 hour, and then cultured for 96 hours, and the number of viable cells was counted over time by trypan blue staining. The results are shown in FIG. 2 (**: p <0.01 vs. control group).
図２に示す通り、ｓｉＥＦ処理によって生存細胞数は低減した。しかしながら、導入（トランスフェクション）から９６時間後（ｓｉＥＦ処理から９６時間後）には、ｓｉＥＦ処理した試験区においても細胞の有意な増殖が認められた。 As shown in FIG. 2, the number of viable cells was reduced by siEF treatment. However, after 96 hours from the introduction (transfection) (96 hours after siEF treatment), significant proliferation of cells was observed in the test group treated with siEF.
（ウェスタンブロット）
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をセルスクレイパーで回収した。
(Western blot)
TC-135 was seeded in a 6-well plate so as to be 2 to 3 × 10 4 cells / ml, and siEF (final concentrations 10 nM, 25 nM, 50 nM) was transfected the next day. 48 hours after transfection, the cells were harvested with a cell scraper.
氷冷した溶解バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％（ｗ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ−アルドリッチ社）中で細胞をホモジナイズし、氷上で２０分間静置した。ホモジネートを１３，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離した後、上清を全細胞タンパク質試料として採取した。試料中のタンパク質含有量は、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて測定した。 Ice-cold lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% (w / v) NP-40, 0.1% (w / v) deoxycholic acid, 0.1% (w / v) SDS , 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1% (w / v) protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) and homogenized for 20 minutes on ice, homogenate at 13,000 rpm for 20 minutes (4 ° C. ) After centrifugation, the supernatant was collected as a whole cell protein sample, and the protein content in the sample was measured using a DC protein assay kit (manufactured by Bio-Rad).
試料（１０μｇのタンパク質量）を１０．０または１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（パーキンエルマーライフサイエンス社）に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳液（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で調製）中で１時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。その後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ−Ｔで適度に希釈した抗Ｆｌｉ−１抗体（サンタクルズ社）と共に、４℃で膜を一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ−結合抗ウサギ、またはマウスＩｇＧ抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）と共に室温でさらにインキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄した。免疫ブロットは、アマシャムＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。抗β−アクチン抗体（シグマ−アルドリッチ社）を用いて同じ膜を再インキュベートすることにより、β−アクチンを内部標準として用いた。 Samples (10 μg protein amount) were separated by SDS-PAGE using 10.0 or 12.5% (w / v) polyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane (Perkin Elmer Life Sciences). Non-specific binding was blocked by incubation for 1 hour in 5% (w / v) skim milk (prepared in PBS containing 0.1% (w / v) Tween® 20 (PBS-T)). . Then, at 4 ° C. with anti-Fli-1 antibody (Santa Cruz) moderately diluted in PBS-T containing 2% (w / v) bovine serum albumin and 0.01% (w / v) sodium azide The membrane was incubated overnight. The membrane was then washed 3 times with PBS-T and further incubated at room temperature with a secondary antibody (HRP-conjugated anti-rabbit or mouse IgG antibody, Cell Signaling). The membrane was then washed 3 times with PBS-T. Immunoblots were visualized using Amersham ECL plus Western blotting detection reagent (GE Healthcare). Β-actin was used as an internal standard by reincubating the same membrane with anti-β-actin antibody (Sigma-Aldrich).
ウェスタンブロットの結果を図３に示す。ｓｉＥＦ単独処理によってＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現量は一定程度抑制されるものの、依然として強い発現が認められた。 The result of the Western blot is shown in FIG. Although the expression level of EWS / Fli-1 was suppressed to a certain extent by siEF single treatment, strong expression was still observed.
（細胞周期の解析）
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５の細胞周期を、Ｔａｌｉ（登録商標）イメージサイトメーター（インビトロジェン社製）を用いて解析した。導入から４８時間後における、細胞周期の解析結果を図４に示す（＊： ｐ＜０．０５ 対対照区）。図４に示す通り、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、対照区に比べてＧ０／Ｇ１期の細胞が多く、Ｇ２／Ｍ期の細胞が少なかった。
(Analysis of cell cycle)
The cell cycle of TC-135 transfected with siEF (final concentration 10 nM) was analyzed using a Tali (registered trademark) image cytometer (Invitrogen). FIG. 4 shows the results of cell cycle analysis 48 hours after introduction (*: p <0.05 vs. control group). As shown in FIG. 4, the test group treated with siEF had more cells in the G0 / G1 phase and fewer cells in the G2 / M phase than the control group.
抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（サンタクルズ社）、抗サイクリンＤ１抗体、抗ＣＤＫ６抗体、および抗ｐ２７抗体（以上、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５中に発現している各タンパク質の、導入から４８時間後における発現を、上記方法によりウェスタンブロットにて解析した。その結果を図５に示す。図５において、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現が低下していること、また、ＣＤＫ６およびｐ２７の発現が上昇していることが分かる。従って、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、導入から４８時間後においてＧ０／Ｇ１期で細胞周期が停止し、細胞増殖が一旦停止していることが示された。 TC- transfected with siEF (final concentrations 10 nM, 25 nM, 50 nM) using anti-c-Myc antibody (Santa Cruz), anti-cyclin D1 antibody, anti-CDK6 antibody and anti-p27 antibody (hereinafter Cell Signaling). The expression of each protein expressed in 135 after 48 hours from the introduction was analyzed by Western blot according to the above method. The result is shown in FIG. In FIG. 5, it can be seen that in the test group treated with siEF, the expression of c-Myc and cyclin D1 is decreased, and the expression of CDK6 and p27 is increased. Therefore, in the test group treated with siEF, the cell cycle was stopped in the G0 / G1 phase 48 hours after the introduction, and it was shown that the cell growth was temporarily stopped.
（オートファジーおよびアポトーシスの解析）
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、導入から４８時間後に電子顕微鏡（製品名Ｈ−７６５０、日立ハイテクノロジーズ社製）にて観察した結果を図６に示す（Ａ：対照区２０００倍、 Ｂ：対照区４０００倍、 Ｃ：ｓｉＥＦ処理区２５００倍、 Ｄ：ｓｉＥＦ処理区４０００倍）。図６（Ａ）における四角で囲った領域を拡大した像が、図６（Ｂ）である。また、図６（Ｃ）における四角で囲った領域を拡大した像が、図６（Ｄ）である。図６に示す通り、ｓｉＥＦで処理した試験区では、オートファゴソームの存在が確認された。
(Analysis of autophagy and apoptosis)
FIG. 6 shows the results of TC-135 transfected with siEF (final concentration 10 nM) observed with an electron microscope (product name H-7650, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) 48 hours after introduction (A: control group). 2000 times, B: control group 4000 times, C: siEF treatment group 2500 times, D: siEF treatment group 4000 times). FIG. 6B shows an enlarged image of the area surrounded by the square in FIG. In addition, an image obtained by enlarging a region surrounded by a square in FIG. 6C is FIG. 6D. As shown in FIG. 6, the presence of autophagosomes was confirmed in the test group treated with siEF.
抗ＬＣ３Ｂ抗体、抗Ａｔｇ３抗体、抗Ａｔｇ５抗体、抗Ａｔｇ７抗体、および抗Ａｔｇ１２抗体（以上、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５中に発現しているオートファジー関連タンパク質の、導入から４８時間後における発現を、上記方法によりウェスタンブロットにて解析した。その結果を図７に示す。図７において、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、ＬＣ３−１に対してＬＣ３−２の割合が増加していること、また、Ａｔｇ３の発現量が低下していることが分かる。従って、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、導入から４８時間後においてオートファジーが誘導されていることが示された。 In TC-135 transfected with siEF (final concentrations 10 nM, 25 nM, 50 nM) using anti-LC3B antibody, anti-Atg3 antibody, anti-Atg5 antibody, anti-Atg7 antibody, and anti-Atg12 antibody (hereinafter, Cell Signaling). The expression of the expressed autophagy-related protein 48 hours after introduction was analyzed by Western blot according to the above method. The result is shown in FIG. In FIG. 7, it can be seen that in the test group treated with siEF, the ratio of LC3-2 to LC3-1 is increased, and the expression level of Atg3 is decreased. Therefore, it was shown that autophagy was induced 48 hours after introduction in the test group treated with siEF.
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、バフィロマイシンＡ１（シグマ−アルドリッチ社）存在下（終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ）で４８時間培養し、細胞数を測定した。バフィロマイシンＡ１はリソソームとオートファゴソームとの融合を阻害する作用がある。ｓｉＥＦ処理した細胞をバフィロマイシンＡ１存在下で培養した場合、細胞増殖が促進されたときは、オートファジーの誘導によって細胞死が引き起こされていると考えられる。一方、ｓｉＥＦ処理した細胞をバフィロマイシンＡ１存在下で培養した場合、細胞増殖の促進が認められないときは、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられる。 TC-135 transfected with siEF (final concentration 10 nM) was cultured for 48 hours in the presence of bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich) (final concentration 1 nM, 10 nM), and the number of cells was measured. Bafilomycin A1 has an action of inhibiting fusion between lysosomes and autophagosomes. When cells treated with siEF are cultured in the presence of bafilomycin A1, it is considered that cell death is caused by induction of autophagy when cell proliferation is promoted. On the other hand, when cells treated with siEF are cultured in the presence of bafilomycin A1, if no cell proliferation is promoted, it is considered that the cells have acquired resistance to siEF by induction of autophagy. .
解析の結果、バフィロマイシンＡ１存在下で培養した試験区において、細胞増殖の促進は認められなかった。従って、ｓｉＥＦ処理した細胞は、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられた。 As a result of the analysis, no promotion of cell proliferation was observed in the test group cultured in the presence of bafilomycin A1. Therefore, the cells treated with siEF were considered to have acquired resistance to siEF by induction of autophagy.
ｓｉＥＦ（終濃度２０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、３−メチルアデニン（３ＭＡ、シグマ−アルドリッチ社）の存在下（終濃度１ｍＭ）で４８時間培養し、細胞数を測定した。３ＭＡはオートファゴソーム形成の阻害剤である。対照区（ｓｉＥＦ処理なし、３ＭＡ処理なし）における生存細胞数を１００％として算出した結果を図８に示す。図８より、ｓｉＥＦ処理した細胞を３ＭＡの存在下で培養することにより、生存細胞数が減少することが示された。従って、ｓｉＥＦ処理した細胞においては、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられた。 TC-135 transfected with siEF (final concentration 20 nM) was cultured for 48 hours in the presence of 3-methyladenine (3MA, Sigma-Aldrich) (final concentration 1 mM), and the number of cells was measured. 3MA is an inhibitor of autophagosome formation. FIG. 8 shows the results of calculation assuming that the number of viable cells in the control group (no siEF treatment, no 3MA treatment) was 100%. FIG. 8 shows that the number of viable cells is decreased by culturing siEF-treated cells in the presence of 3MA. Therefore, in siEF-treated cells, it was considered that the cells had acquired resistance to siEF by induction of autophagy.
ｓｉＥＦ（終濃度２０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、３−メチルアデニンの存在下（終濃度１ｍＭ）で４８時間培養した場合における、アポトーシス関連タンパク質の発現をウェスタンブロットにて確認した。すなわち、抗ＬＣ３Ｂ抗体、抗Ａｔｇ３抗、抗Ａｔｇ５抗体、抗Ａｔｇ７抗体、および抗Ａｔｇ１２抗体（以上、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、上記方法によりウェスタンブロットを行った。その結果を図９に示す。図９より、ｓｉＥＦ処理した試験区において、活性型（切断型）カスパーゼ９や８の増加や、ＰＡＲＰの切断亢進は認められなかった。ｓｉＥＦ処理した試験区においては、カスパーゼ３の発現量が減少していた。 When TC-135 transfected with siEF (final concentration 20 nM) was cultured for 48 hours in the presence of 3-methyladenine (final concentration 1 mM), the expression of apoptosis-related protein was confirmed by Western blot. That is, Western blotting was performed by the above method using an anti-LC3B antibody, anti-Atg3 anti, anti-Atg5 antibody, anti-Atg7 antibody, and anti-Atg12 antibody (hereinafter, Cell Signaling). The result is shown in FIG. From FIG. 9, in the test group treated with siEF, an increase in active (cleaved) caspases 9 and 8 and an increase in the cleavage of PARP were not observed. In the test group treated with siEF, the expression level of caspase 3 was decreased.
以上より、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、オートファジーが誘導され、これによって導入から４８時間後においてＧ０／Ｇ１期で細胞周期が停止し、細胞増殖が一旦停止するものと推測された。また、ｓｉＥＦ処理ではアポトーシスは誘導されないため、オートファジーによる細胞器官の修復後、再び細胞が増殖を開始するものと考えられる。 Based on the above, it was speculated that autophagy was induced in the test group treated with siEF, which caused the cell cycle to stop in the G0 / G1 phase 48 hours after the introduction, and the cell growth to temporarily stop. In addition, since siEF treatment does not induce apoptosis, it is considered that cells start to proliferate again after repair of cell organs by autophagy.
＜試験２ ｍｉＲ−１４５単独処置の場合＞
（細胞増殖）
ｍｉＲ−１４５（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、配列番号４：５’−ＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵ−３’）のトランスフェクションは、試験１におけるｓｉＥＦと同様の方法により行った。なお、ｍｉＲ−１４５は、アプライドバイオシステムズ社より購入したものを用いた。
<Test 2 miR-145 treatment alone>
(Cell proliferation)
Transfection of miR-145 (hsa-miR-145-5p, SEQ ID NO: 5'-GUCCAGUUUCCCAGGAAUCCCU-3 ') was performed by the same method as siEF in Test 1. In addition, miR-145 used what was purchased from Applied Biosystems.
６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ〜１００ｎＭ）をトランスフェクションした。その後、４８時間培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を計測した。対照区における生存細胞数を１００％として算出した結果を、図１０に示す。図１０に示す通り、ｍｉＲ−１４５処理によって細胞増殖が一定程度抑制されるものの、効果は強くなかった。ｍｉＲ−１４５の濃度を高くした場合、４０ｎＭを上限として、生存細胞数は一定となった。 TC-135 was seeded in a 6-well plate, and miR-145 (final concentration: 10 nM to 100 nM) was transfected the next day. Thereafter, the cells were cultured for 48 hours, and the number of viable cells was counted by trypan blue staining. FIG. 10 shows the results of calculation assuming the number of viable cells in the control group as 100%. As shown in FIG. 10, the cell growth was suppressed to some extent by miR-145 treatment, but the effect was not strong. When the concentration of miR-145 was increased, the number of viable cells was constant up to 40 nM.
＜試験３ 二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５の併用効果＞
（細胞増殖）
二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５のトランスフェクションは、試験１および２と同様の方法により行った。
<Test 3 Combined effect of double-stranded siRNA and miR-145>
(Cell proliferation)
Transfection of double-stranded siRNA and miR-145 was performed by the same method as in Tests 1 and 2.
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ）および終濃度４０ｎＭ ｍｉＲ−１４５をトランスフェクションした。その後、導入から９６時間まで培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を経時で計測した。その結果を図１１〜１３に示す（＊：ｐ＜０．０５ 対ｓｉＥＦ／ｍｉＲ−１４５併用区）。図１１〜１３に示すように、驚くべきことに、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、導入から９６時間培養という長時間培養においても、生細胞数が優位に減少した。このことから、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、細胞増殖抑制効果の持続性が高くなることが示された。 TC-135 was seeded in a 6-well plate at 2-3 × 10 4 cells / ml, and siEF (final concentrations 2 nM, 5 nM, 10 nM) and final concentrations 40 nM miR-145 were transfected the next day. Thereafter, the cells were cultured for 96 hours after introduction, and the number of viable cells was counted over time by trypan blue staining. The results are shown in FIGS. 11 to 13 (*: p <0.05 vs. siEF / miR-145 combination group). As shown in FIGS. 11 to 13, surprisingly, by using siEF and miR-145 in combination, the number of viable cells was significantly reduced even in the long-term culture of 96 hours after introduction. This indicates that the combined use of siRNA according to the present invention and miR-145 increases the sustainability of the cell growth inhibitory effect.
（ウェスタンブロット）
ｓｉＥＦ（終濃度２ｎＭ）とｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ）とを併用した場合における、導入から１２０時間のＥＷＳ／Ｆｌｉ−１、ｃ−Ｍｙｃ、およびＬＣ３Ｂの発現に対する影響を、上記の方法によりウェスタンブロットにて確認した。その結果を図１４に示す。ｓｉＥＦ単独やｍｉＲ−１４５単独でもＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現は一定程度抑制された。しかしながら、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現抑制効果が、相乗的に増強された。また、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、細胞増殖シグナルであるｃ−Ｍｙｃの発現も顕著に抑制された。ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、ＬＣ３−１に対するＬＣ３−２の割合が増加した。
(Western blot)
When siEF (final concentration: 2 nM) and miR-145 (final concentrations: 10 nM, 20 nM, 40 nM) are used in combination, the influence on the expression of EWS / Fli-1, c-Myc, and LC3B at 120 hours after introduction is described above. This was confirmed by Western blotting according to the above method. The result is shown in FIG. The expression of EWS / Fli-1 was suppressed to some extent even with siEF alone or miR-145 alone. However, the combined use of siEF and miR-145 synergistically enhanced the EWS / Fli-1 expression inhibitory effect. Moreover, the combined use of siEF and miR-145 significantly suppressed the expression of c-Myc, which is a cell proliferation signal. The combined use of siEF and miR-145 increased the ratio of LC3-2 to LC3-1.
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）とｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ）とを併用した場合における、導入から７２時間後のアポトーシス関連タンパク質発現への影響を、上記の方法によりウェスタンブロットにて確認した。その結果を図１５に示す。ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した試験区においては、カスパーゼの活性化は認められなかった。また、図１５より、ｍｉＲ−１４５単独（特に、終濃度４０ｎＭ）においてはＰＡＲＰの切断が認められたが、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した試験区においては同様の傾向は認められなかった。従って、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した場合、ｍｉＲ−１４５単独処理の場合とは異なる作用機構により細胞増殖が抑制されている可能性が考えられる。 When siEF (final concentration 10 nM) and miR-145 (final concentrations 10 nM, 20 nM, 40 nM) were used in combination, the effect on apoptosis-related protein expression 72 hours after introduction was confirmed by Western blotting using the above method. did. The result is shown in FIG. In the test plot where siEF and miR-145 were used in combination, caspase activation was not observed. In addition, from FIG. 15, cleavage of PARP was observed with miR-145 alone (particularly, a final concentration of 40 nM), but the same tendency was not observed in the test section where siEF and miR-145 were used in combination. Therefore, when siEF and miR-145 are used in combination, cell growth may be suppressed by an action mechanism different from that in the case of miR-145 alone treatment.
〔配列番号：１〕
ｓｉＲＮＡ。
〔配列番号：２〕
ｓｉＲＮＡ。
〔配列番号：６〕
ｓｉＲＮＡ。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子の説明： １〜１９残基はＲＮＡ；２０〜２１残基はＤＮＡである。
[SEQ ID NO: 1]
siRNA.
[SEQ ID NO: 2]
siRNA.
[SEQ ID NO: 6]
siRNA.
Description of DNA / RNA binding molecules: 1-19 residues are RNA; 20-21 residues are DNA.
Claims (4)
ｍｉＲ−１４５と、
を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物。 A double stranded siRNA targeting the EWS chimeric gene;
miR-145,
A composition for treating Ewing sarcoma family tumors, comprising:
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