JP2016067291A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の回収率と通液性に優れた核酸の分離精製方法を提供する。【解決手段】表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経て、かつ遠心力による分離を行なわないことを特徴とする、核酸の分離精製方法。（Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合する工程。（Ｂ）前記混合液と中空糸とを接触させ、中空糸に核酸を吸着させる工程。（Ｃ）洗浄液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸以外の成分を洗浄する工程。（Ｄ）溶出液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸を脱着させる工程。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。

遺伝子検査はゲノム解析技術の進歩により大きな注目を浴びてきている。 特に、近年では個別化医療の普及や感染症領域におけるＰＯＣＴ(臨床現場即時検査)など遺伝子検査に関連する市場が飛躍的に伸長し、遺伝子検査をさらに普及させると期待されている。

遺伝子検査を行なうには、初めに核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製することが必要である。
従来、核酸を含む試料溶液から核酸を得る方法としてはフェノール・クロロホルム法という技術が知られていた。この方法はフェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの夾雑物を不溶化させ、核酸を分離精製する方法である。かかる従来技術は、大量の核酸を安価に分離精製できるが、操作が煩雑であり、核酸の回収率も低く、フェノール・クロロホルムが最終精製物にコンタミする という問題点があった。また、フェノール・クロロホルム自体も有毒であるため、作業環境に制限があるという問題点があった。

一方、かかる問題点を解消すべく所謂Ｂｏｏｍ法という発明がなされた（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。この方法は、カオトロピック物質を利用してタンパク質、脂質などの夾雑物を可溶化し、核酸を固相担体に吸着させて回収後、核酸を再び溶解することで、核酸を分離精製する方法である。前記Ｂｏｏｍ法で用いられる固相担体としては、シリカフィルター（例えば、特許文献２、３参照）、シリカ磁性ビーズ（例えば、特許文献４〜６参照）などの様々な態様が知られている。

シリカフィルターを用いることで、迅速・簡便に核酸を分離精製できるが、検体（特に、血液などの高粘性液体）によっては工程中に固相担体の詰まりが発生するという問題点があった。また、固相担体を通液させるために、１０，０００Ｇ以上の高い遠心力が必要となるため、自動化が困難であり、かつ得られる核酸が物理的な外力により断片化し易いという問題点もあった。

一方、シリカ磁性ビーズを用いることで、固相担体の詰まりの問題は解決でき、自動化も容易であるが、核酸の回収率が低下するという問題点があった。また、除去しきれないシリカ磁性粒子が最終精製物にコンタミするという問題点があった。

特開平２−２８９５９６ 特開２００５−２２４１６７ 特開２００６−２９６２２０ 特開２０００−１２５８６０ 特開２０００−３００２６２ 特開２００４−３１７９２

Ｒ． Ｂｏｏｍ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９９０， ｖｏｌ．２８， ｎｏ．３， ｐ．４９５−５０３．

本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、核酸の回収率と通液性に優れた核酸の分離精製方法を提供することにある。

本発明者らは、固相担体として中空糸を用いることで、核酸の回収率と通液性の両立が可能であることを見出し、本発明に至った。

１． 表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経て、かつ遠心力による分離を行なわないことを特徴とする、核酸の分離精製方法。
（Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合する工程。
（Ｂ）前記混合液と中空糸とを接触させ、中空糸に核酸を吸着させる工程。
（Ｃ）洗浄液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸以外の成分を洗浄する工程。
（Ｄ）溶出液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸を脱着させる工程。
２． 前記中空糸が、ポリエーテルスルホンとポリビニルピロリドンとの混合物、またはセルロース類からなる、１．に記載の核酸の分離精製方法。
３． 前記工程（Ｂ）〜（Ｄ）の少なくともいずれか１以上の工程において、中空糸の一方の開口部に前記混合液、洗浄液、または溶出液を接触させ、前記混合液、洗浄液、または溶出液を中空糸内部へ吸引し吐出する、１．または２．に記載の核酸の分離精製方法。
４． ３．において、前記混合液、洗浄液、または溶出液を中空糸内部へ吸引し吐出するために、空気の圧力変化を発生させる装置を使用する、３．に記載の核酸の分離精製方法。
５． 工程（Ｃ）の後、工程（Ｄ）の前に、中空糸を５０℃〜９０℃で加熱処理することで中空糸に残留した洗浄液を除去する工程をさらに含む、１．から４．のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６． 工程（Ｄ）において、５０℃〜９０℃に加熱した溶出液を中空糸に接触させる、１．から５．のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７． １．から６．のいずれかに記載の核酸の分離精製方法に用いるための中空糸であって、表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸。
８． １．から６．のいずれかに記載の核酸の分離精製方法に用いるためのデバイスであって、７．に記載の中空糸を保持しているデバイス。
９． １．から６．のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、７．に記載の中空糸または８．に記載のデバイス、中空糸に核酸を吸着させるための結合液、中空糸から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、中空糸から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。

本発明により、核酸を分離精製する方法において、高い核酸の回収率と高い通液性を両立することができる。

本発明の核酸分離精製方法の適用例の一つ（シリンジの形態） 本発明の核酸分離精製方法の適用例の一つ（シリンジの形態） 比較例の核酸分離精製方法の一つ

以下、本発明を詳述する。
（分離精製の対象となる核酸）
本発明における分離精製の対象となる核酸の種類としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、１本鎖核酸または２本鎖核酸、直鎖状核酸または環状核酸を用いることができる。これらの中でも、核酸の回収率の観点からＲＮＡが好ましい。

（核酸の分離精製原理）
本発明における核酸の分離精製の原理は、ＢＯＯＭ法（非特許文献１）として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で、核酸の固相担体への特異的な結合、洗浄および溶出により核酸を分離精製する。
具体的には、
工程（Ａ）：混合工程において核酸を含む試料と結合液とを混合し、
工程（Ｂ）：結合工程において前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させ、
工程（Ｃ）：洗浄工程において洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分を洗浄し、
工程（Ｄ）：溶出工程において溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させることで、核酸を含む試料から核酸を分離精製することができる。

本発明は、遠心力を用いることなく核酸の分離精製を行う方法である。遠心分離を行なうには、遠心分離機が必要となり、迅速・簡便な核酸抽出が困難となる。また、物理的な外力によるダメージにより、核酸が分解する恐れもある。

遠心力を用いることなく核酸の分離精製を行うために、本発明では、固相担体に中空糸を用いる。一般的に固相担体として用いられるシリカフィルターを用いると、核酸の回収率には優れるものの、遠心が必要不可欠となる。また核酸を含む試料の種類によってはフィルターに詰まりが発生する恐れがある。

前記中空糸としては、核酸の吸着効率を向上させる観点から、表面が親水性であり、かつ表面積が大きいことが好ましい。

ここで、表面が親水性である中空糸とは、［１］中空糸自体が親水性高分子からなる中空糸、［２］中空糸自体が親水性高分子と疎水性高分子との混合物からなる中空糸、［３］中空糸自体が疎水性高分子からなり、表面を親水性高分子でコーティングした中空糸等が挙げられる。

前記親水性高分子としては、特に限定されるものではないが、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デンプン、セルロース類（例えば、セルロース、セルロース混合エステル、セルロースアセテート等）等が挙げられる。これらの中でも、前記［１］のように中空糸自体が親水性高分子からなる中空糸を用いる場合は、成形加工性や中空糸としての使用実績の観点から、セルロース類が好ましく、前記［２］や［３］のように疎水性高分子と混合して使用する場合や、コーティング目的で使用する場合は、疎水性高分子との相溶性や中空糸としての使用実績の観点から、ＰＶＰが好ましい。また、前記親水性高分子は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

前記［２］や［３］で用いる疎水性高分子としては、特に限定されるものではないが、例えばポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等、オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、が挙げられる。これらの中でも、成形加工性や中空糸としての使用実績の観点から、ＰＥＳ、ＰＶＤＦが好ましく、ＰＥＳがより好ましい。また、前記疎水性高分子は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

前記［２］や［３］において、親水性高分子と疎水性高分子との組み合わせは特に限定されない。例えば、前記で例示した親水性高分子と前記で例示した疎水性高分子との組み合わせであれば良い。中でも、成形加工性や中空糸としての使用実績の観点から、ポリエーテルスルホンとポリビニルピロリドンとの組み合わせが好ましい。

前記中空糸の形態としては、特に限定されるものではないが、表面に微細孔を有することが好ましい。表面に微細孔を有さない中空糸を用いると、核酸が吸着し得る表面積が少ないため、十分な量の核酸と結合することができない恐れがある。
なお、前記中空糸における微細孔は、中空糸膜を貫通していても良いし、貫通していなくても良い。

前記微細孔の孔径は、特に限定されないが、下限としては０．０１μｍが好ましく、０．０５μｍがより好ましい。一方、上限は１．０μｍが好ましく、０．５μｍがより好ましい。孔径が０．０１μｍより小さいと、十分な表面積向上効果が見られない恐れがある。一方、孔径が１．０μｍより大きいと、中空糸内に液体を吸引し吐出するのが困難になる恐れがある。
前記細孔径は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により測定することができる。

前記中空糸の内径は、特に限定されないが、１５０μｍ以上であることが好ましく、２５０μｍ以上がより好ましい。一方、上限は１５００μｍであることが好ましい。内径が１５０μｍより小さいと、中空糸内に液体を吸引し吐出するのが困難になる恐れがある。一方、内径が１５００μｍより大きいと、十分な表面積向上効果が見られない恐れがある。
前記中空糸の外径は特に限定されないが、内径／外径の比率の下限が７／６であることが好ましく、６／５であることがより好ましい。一方、上限は３／２が好ましく、４／３がさらに好ましい。

前記中空糸の長さは、特に限定されないが、下限としては２ｍｍが好ましい。一方、上限は１０ｍｍが好ましく、５ｍｍがより好ましい。長さが２ｍｍより短いと、核酸の回収率が低下する恐れがある。一方、長さが１０ｍｍより長いと洗浄が困難となり、核酸の純度が低下する恐れがある。

前記中空糸を用いて核酸の分離精製を行うためには、混合液、洗浄液、または溶出液などの各種溶液を中空糸内部に吸引し吐出する機構が必要である。前記機構としては、各種溶液の吸引および吐出ができれば特に限定されないが、空気の圧力変化を発生させる機構が好ましく、例えば、ピペットやシリンジが挙げられる。

前記中空糸を用いて核酸の分離精製を行う際は、中空糸単独を用いても良いが、操作性の観点から、中空糸を各種溶液と接触し、吸引吐出する側（通液部側）および吸引吐出機構側（通気部側）の二方向に開口面をもつ容器に固定することが好ましい。
中空糸を固定する容器は、ピペットチップ、またはそれに類似する形状の容器が適している。ピペットチップの形状は、特に限定されないが、一般的に利用されている円錐形で先が切断されており筒状のチップが好ましい。当然ながら、ピペットチップに限らず、吸引吐出機構とのかん合部に密着できる形状であれば良く、所望の形状が選択できる。

以下、各工程について詳述する。

（Ａ：混合工程）
本発明の工程（Ａ）：混合工程は、核酸を含む試料と結合液とを混合する工程である。

本発明の混合工程で用いる核酸を含む試料としては、特に限定されず、例えば血液、血清、血球、髄液、喀痰、尿、胃液、鼻汁、糞便、精液、唾液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液などの生体試料が挙げられる。また、培養した組織、細胞、細菌、ウイルスなども挙げられる。さらには、別な方法で精製した核酸についても該当する。

本発明の混合工程で用いる結合液としては、カオトロピック物質を含む水溶液であることが好ましい。ここでカオトロピック物質とは、水溶液中でカオトロピックイオンを生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用（カオトロピック効果）を有している物質のことである。
前記カオトロピック物質としては、核酸の中空糸への吸着に寄与するものであれば特に限定されないが、例えばグアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン硫酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素が挙げられる。これらの中でも、カオトロピック効果の強さからグアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩が好ましい。また、前記カオトロピック物質は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記カオトロピック物質濃度は、十分なカオトロピック効果が得られれば特に限定されないが、グアニジンチオシアン酸塩の場合は１．０〜６．０Ｍ、グアニジン塩酸塩の場合は１．０〜８．０Ｍであることが好ましい。グアニジンチオシアン酸塩の濃度が１．０Ｍより少ないと、十分なカオトロピック効果が得られない恐れがある。一方、グアニジンチオシアン酸塩の濃度が６．０Ｍより多いと保存中にグアニジンチオシアン酸塩が析出する恐れがある。同様にグアニジン塩酸塩の濃度が１．０Ｍより少ないと、十分なカオトロピック効果が得られない恐れがある。一方、グアニジン塩酸塩の濃度８．０Ｍより多いと保存中にグアニジン塩酸塩が析出する恐れがある。

前記結合液には、核酸と中空糸との結合を補助するために、アルコール類を含有させるのが好ましい。前記アルコール類としては、前記効果が得られれば、いかなる種類のアルコールを用いてもよいが、エタノール、イソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。また、前記アルコールは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記アルコール濃度は、特に限定されないが、１０〜７０％が好ましく、１０〜５０％がより好ましい。アルコール濃度が１０％より少ないと、十分な結合補助効果が得られない恐れがある。一方、アルコール濃度が７０％より多くすると、核酸と中空糸との結合性はかえって減少する。

前記結合液には、ｐＨ調整や核酸の吸着効果向上のために緩衝剤を含有させるのが好ましい。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）などが挙げられる。これらの中でも、ｐＨ５．０〜９．０（好ましくはｐＨ６．０〜８．０）において充分な緩衝能力を有するなどの理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましい。また、前記緩衝剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、１０〜１００ｍＭ程度が好ましい。

前記結合液には、細胞膜の破壊または細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。前記界面活性剤としては、前記効果が得られれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよく、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記界面活性剤濃度は、特に限定されないが、０．１〜２０％であることが好ましい。界面活性剤濃度が０．１％より少ないと、十分な細胞膜の破壊またはタンパク質の変性効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度が２０％より多くしても、効果の向上は見られない。

また、前記結合液には、核酸を含む試料中に含まれるタンパク質、特にヌクレアーゼを変性させる目的で、還元剤を含有させてもよい。前記還元剤としては、前記効果が得られれば、いかなる種類の還元剤を用いてもよく、例えば水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛などの電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物などが挙げられる。これらの中でも、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが好ましい。
前記還元剤濃度は、特に限定されないが、１．０ 〜 １００ｍ Ｍであることが好ましい。還元剤濃度が１．０ｍＭより少ないと、十分なタンパク質の変性効果が得られない恐れがある。一方、還元剤濃度が１００ｍＭより多くしても、効果の向上は見られない。

前記核酸を含む試料と結合液とを混合する方法は、特に限定されず、例えばボルテックスミキサーによる混和、転倒混和、ピペッティングなどが挙げられる。

（Ｂ：結合工程）
本発明の工程（Ｂ）：結合工程は、前記混合液と中空糸とを接触させ、中空糸に核酸を吸着させる工程である。

前記混合液と中空糸とを接触させ、中空糸に核酸を吸着させる方法は、特に限定されず、例えば、先端に中空糸を固定したシリンジを用い、混合液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、中空糸に核酸を吸着させる方法などが挙げられる。

（Ｃ：洗浄工程）
本発明の工程（Ｃ）：洗浄工程は、洗浄液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸以外の成分（例えば、タンパク質、脂質 など）を洗浄する工程である。なお、洗浄工程は、１回の洗浄で済ませてもよいし、複数回洗浄を繰り返してもよい。

本発明の洗浄工程で用いる洗浄液としては、中空糸に吸着している核酸を脱離させず、かつ核酸以外の成分を脱離させるものであれば、特に限定されないが、アルコール類を含む水溶液であることが好ましい。
前記アルコール類としては、前記効果が得られれば、いかなる種類のアルコールを用いてもよいが、エタノール、イソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。また、前記アルコールは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記アルコール濃度は、特に限定されないが、２０〜１００％が好ましく、３０〜９０％がより好ましい。アルコール濃度が２０％より少ないと、核酸が脱離する恐れがある。

前記洗浄液には、ｐＨ調整や核酸の吸着効果向上のために緩衝剤を含有させるのが好ましい。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）などが挙げられる。これらの中でも、ｐＨ５．０〜９．０（好ましくはｐＨ６．０〜８．０）において充分な緩衝能力を有するなどの理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましい。また、前記緩衝剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記緩衝剤濃度は、特に限定されないが、１０〜１００ｍＭ程度が好ましい。さらに、最終精製物へのコンタミを低減する目的から、洗浄液中の緩衝剤濃度は結合液中の緩衝剤濃度よりも低いことがより好ましい。

前記洗浄液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸以外の成分を洗浄する方法は、特に限定されず、例えば、先端に中空糸を固定したシリンジを用い、洗浄液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、中空糸から核酸以外の成分を洗浄する方法などが挙げられる。

前記洗浄工程後に、必要に応じて、中空糸に残留した洗浄液を、加熱により除去することができる。加熱温度は５０〜９０℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。加熱温度が５０℃より低いと、十分な洗浄液の除去効果が得られない。一方、加熱温度が９０℃より高いと、核酸が分解・変性する恐れがある。

（Ｄ：溶出工程）
本発明の工程（Ｄ）：溶出工程は、溶出液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸を脱着させる工程である。

本発明の溶出工程で用いる溶出液としては、中空糸に吸着している核酸を脱離させ、かつ核酸抽出後の反応、例えば逆転写、ＰＣＲに代表される核酸増幅反応を阻害しない溶液組成であれば、特に限定されないが、水、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液［１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］が好ましい。

前記溶出液は、溶出効率を上げるために必要に応じて、加熱することができる。加熱温度は５０〜９０℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。加熱温度が５０℃より低いと、十分な溶出率向上効果が得られない。一方、加熱温度が９０℃より高いと、核酸が分解・変性する恐れがある。

前記溶出液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸を脱着させる方法は、特に限定されず、例えば、先端に中空糸を固定したシリンジを用い、溶出液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、中空糸から核酸を脱着させる方法などが挙げられる。

本発明はまた、前記の核酸分離精製方法に用いるための中空糸であって、表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸である。

本発明はまた、前記の核酸分離精製方法に用いるためのデバイスであって、前記の中空糸を保持しているデバイスである。前記デバイスの形態は特に限定されないが、シリンジが好ましい。その具体的な形態は後述の実施例などで例示される。

本発明はまた、前記の核酸分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、前記の中空糸または前記のデバイス、中空糸に核酸を吸着させるための結合液、中空糸から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、中空糸から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キットである。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。
［各種評価法］

＜１．中空糸の孔径、内径、外径＞
各粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し、中空糸の孔径、内径、外径を測定した。

＜２．核酸の濃度：１０ｎｇ／μＬ以上＞
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が１０ｎｇ／μＬ以上の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
装置名 ： Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（登録商標）２０００
測定モード ： 核酸−ＲＮＡ
試料液量 ： ２μＬ
Ｂｌａｎｋ ： 水

＜７．核酸の濃度：１０ｎｇ／μＬ以下＞
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が１０ｎｇ／μＬ以下の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
装置名 ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０
測定キット ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ｑｕｂｉｔ（登録商標）
ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ
容器 ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ｑｕｂｉｔ（登録商標）
ａｓｓａｙ ｔｕｂｅｓ
測定モード ： ＲＮＡ−ＲＮＡ
試料液量 ： １０μＬ
Ｂｌａｎｋ ： 水

［実施例１］
ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）／ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）製の中空糸 ＵＦＷ−Ｓ２（東洋紡社製）を３０ｍｍの長さに切断し、前記中空糸を３０ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ２．０×４．０ｍｍ（アラム社製）の中に１本挿入した。その後、テルモシリンジ ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端と、内部に前記中空糸を挿入した前記ＰＰチューブとを、５ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ３．０×４．０ｍｍ（アラム社製）により連結し、シリンジ１（図１参照）を作成した。得られたシリンジ１の詳細を表１に示す。

［実施例２〜４］
ＰＥＳ／ＰＶＰ製の中空糸 ＵＦＷ−Ｓ２（東洋紡社製）の長さが２０、４０、５０ｍｍで、アラメック（登録商標）ＰＰチューブ２．０×４．０ｍｍ（アラム社製）の長さが２０、４０、５０ｍｍである以外は、実施例１と同様にして、シリンジ２〜４を作成した。得られたシリンジ２〜４の詳細を表１に示す。

［実施例５］
ＰＥＳ／ＰＶＰ製の中空糸 ＭＦ０２０（東洋紡社製）を３０ｍｍの長さに切断し、前記中空糸を３０ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ２．０×４．０ｍｍ（アラム社製）の中に３本挿入した。その後、テルモシリンジ ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端と、内部に前記中空糸を挿入した前記ＰＰチューブとを、５ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ３．０×４．０ｍｍ（アラム社製）により連結し、シリンジ５（図２参照）を作成した。得られたシリンジ５の詳細を表１に示す。

［実施例６］
セルローストリアセテート（ＣＴＡ）製の中空糸 ＡＫＨ（東洋紡社製）を３０ｍｍの長さに切断し、前記中空糸を３０ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ２．０×４．０ｍｍ（アラム社製）の中に４５本挿入した。その後、テルモシリンジ ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端と、内部に前記中空糸を挿入した前記ＰＰチューブとを、５ｍｍの長さに切断したアラメック（登録商標）ＰＰチューブ３．０×４．０ｍｍ（アラム社製）により連結し、シリンジ６（図なし）を作成した。得られたシリンジ６の詳細を表１に示す。

［比較例１］
ＰＥＳ／ＰＶＰ製の中空糸 ＵＦＷ−Ｓ２（東洋紡社製）の長さが１０ｍｍで、アラメック（登録商標）ＰＰチューブ２．０×４．０ｍｍ（アラム社製）の長さが１０ｍｍである以外は、実施例１と同様にして、シリンジ７を作成した。得られたシリンジ７の詳細を表１に示す。

［比較例２］
ＰＥＳ／ＰＶＰ製のメンブレンフィルター ＨＰＷＰ（ミリポア社製）をベルトポンチＴＰＯ−４０（トラスコ社製）にて４ｍｍφの大きさに打ち抜いた。その後、テルモシリンジ ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端に、前記ＰＥＳ／ＰＶＰ製のメンブレンフィルターを１枚介してメスルアーフィッティング ＶＰＲＦ２０６（アイシス社製）を接続し、シリンジ８（図３参照）を作成した。得られたシリンジ８の詳細を表１に示す。

［比較例３］
ＰＥＳ／ＰＶＰ製のシリンジフィルター ＳＹ４ＰＬ−Ｓ（ｍｄｉ社製）をテルモシリンジ ＳＳ−０２ＳＺ（テルモ社製）の先端に勘合させ、シリンジ９を作成した。得られたシリンジ９の詳細を表１に示す。

＜ｔｏｔａｌ ＲＮＡの回収率＞
前記シリンジ１〜９を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率の評価を行なった。
試料溶液として、ＨｅＬａ Ｓ３細胞よりセパゾール（登録商標）ＲＮＡＩ ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を用いてプロトコール通りに分離精製した１０００ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液 １０μＬと、結合液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ３５μＬとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ ２５μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄するという操作を２回繰り返した。最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製） ４０μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率を表２に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率は下式（１）より算出した。

（式（１））
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率（％）＝｛精製ｔｏｔａｌ ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）×溶出液量 ４０（μＬ）｝÷｛投入ｔｏｔａｌ ＲＮＡ濃度 １０００（ｎｇ／μＬ）×投入ｔｏｔａｌ ＲＮＡ液量 １０（μＬ）｝×１００

次いで、洗浄後加熱の検討を行なった。
試料溶液として、ＨｅＬａ Ｓ３細胞よりセパゾール（登録商標）ＲＮＡＩ ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を用いてプロトコール通りに分離精製した１０００ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液 １０μＬと、結合液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ３５μＬとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ ２５μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄するという操作を２回繰り返した。次いで、４０℃〜９０℃で１０分加熱した後、最後に、溶出液としてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製） ４０μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率を表２に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率は上式（１）より算出した。

次いで、溶出液加熱の検討を行なった。
試料溶液として、ＨｅＬａ Ｓ３細胞よりセパゾール（登録商標）ＲＮＡＩ ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を用いてプロトコール通りに分離精製した１０００ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液 １０μＬと、結合液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ３５μＬとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールＳＰ ２５μＬ（ナカライテスク社製）を混合した後、シリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン社製）のＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返した後、ろ液を廃棄するという操作を２回繰り返した。最後に、溶出液として４０℃〜９０℃のＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）４０μＬをシリンジ１〜９にて吸引吐出を１０回繰り返し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ水溶液を得た。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率を表２に示す。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収率は上式（１）より算出した。

本発明により、高い核酸の回収率と高い通液性を両立することができ、より迅速・簡便な核酸抽出可能となり、また核酸の分離精製工程の自動化も非常に容易であることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。

Claims (9)

1. 表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸を用い、少なくとも下記工程（Ａ）から（Ｄ）をこの順に経て、かつ遠心力による分離を行なわないことを特徴とする、核酸の分離精製方法。
   （Ａ）核酸を含む試料溶液と結合液とを混合する工程。
   （Ｂ）前記混合液と中空糸とを接触させ、中空糸に核酸を吸着させる工程。
   （Ｃ）洗浄液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸以外の成分を洗浄する工程。
   （Ｄ）溶出液と中空糸とを接触させ、中空糸から核酸を脱着させる工程。
2. 前記中空糸が、ポリエーテルスルホンとポリビニルピロリドンとの混合物、またはセルロース類からなる、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
3. 前記工程（Ｂ）〜（Ｄ）の少なくともいずれか１以上の工程において、中空糸の一方の開口部に前記混合液、洗浄液、または溶出液を接触させ、前記混合液、洗浄液、または溶出液を中空糸内部へ吸引し吐出する、請求項１または２に記載の核酸の分離精製方法。
4. 請求項３において、前記混合液、洗浄液、または溶出液を中空糸内部へ吸引し吐出するために、空気の圧力変化を発生させる装置を使用する、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
5. 工程（Ｃ）の後、工程（Ｄ）の前に、中空糸を５０℃〜９０℃で加熱処理することで中空糸に残留した洗浄液を除去する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
6. 工程（Ｄ）において、５０℃〜９０℃に加熱した溶出液を中空糸に接触させる、請求項１から５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
7. 請求項１から６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法に用いるための中空糸であって、表面に微細孔を有し、かつ表面が親水性の中空糸。
8. 請求項１から６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法に用いるためのデバイスであって、請求項７に記載の中空糸を保持しているデバイス。
9. 請求項１から６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための核酸の分離精製キットであって、請求項７に記載の中空糸または請求項８に記載のデバイス、中空糸に核酸を吸着させるための結合液、中空糸から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、中空糸から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。