JP2015531390A - 免疫原性組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物を提供する。

Description

本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖とキャリアタンパク質のコンジュゲートを含む免疫原性組成物の分野にある。この組成物は、免疫化に有用である。

細菌の莢膜糖は、長年にわたり莢膜形成菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンに使用されている。糖はＴ非依存性抗原であるが、その免疫原性は低い。キャリアにコンジュゲートさせることにより、Ｔ非依存性抗原をＴ依存性抗原に転換し、それにより、記憶応答を増強し、防御免疫の発生を可能にすることができる。したがって、最も有効な糖ワクチンは複合糖質に基づき、コンジュゲートワクチンの原型はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものである［例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００４年）Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編。ＩＳＢＮ ０−７２１６−９６８８−０の第１４章を参照されたい］。

コンジュゲートワクチンが記載されている別の細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは「Ｂ群連鎖球菌」または単に「ＧＢＳ」としても公知である。この研究の大半は、Ｄｅｎｎｉｓ Ｋａｓｐｅｒおよび共同研究者によって実施され、参考文献１〜９などの文書に記載されている。ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶのそれぞれに対するコンジュゲートワクチンは、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが示されている［１０＆１１］。しかし、さらに改善されたＧＢＳコンジュゲートワクチンが依然として必要である。

国際公開第２０１２／０３５５１９号

Ｐａｏｌｅｔｔｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９０）２６５：１８２７８〜８３ Ｗｅｓｓｅｌｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９９０）８６：１４２８〜３３

本発明は、ｉ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖と、ｉｉ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖と、ｉｉｉ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖と、ｉｖ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖と、ｖ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖とを含む免疫原性組成物を提供する。

典型的には、免疫原性組成物は、具体的に記載されているもの以外のコンジュゲート、特に、具体的に記載されているもの以外のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートはいかなるものも含まない。しかし、一部の実施形態では、組成物は、他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートを含めた他のコンジュゲートを含んでよい。例えば、組成物は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含んでよい。別の可能性では、組成物は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含んでよい。

上記の免疫原性組成物は、単位用量当たり任意の適切な量の莢膜糖（複数可）を含んでよい。莢膜糖（複数可）の適量は、単位用量当たり０．１〜５０μｇであり得る。典型的には、各ＧＢＳ莢膜糖は、１〜３０μｇ、例えば、２〜２５μｇ、特に、５〜２０μｇの量で存在する。莢膜糖（複数可）の適量としては、単位用量当たり５μｇ、１０μｇおよび２０μｇを挙げることができる。

単位用量当たりの莢膜糖（複数可）の量をさらに最小限にすることが可能であり得る。特に、莢膜糖（複数可）の適量は単位用量当たり０．１〜５μｇであり得る。したがって、典型的には、各ＧＢＳ莢膜糖は、単位用量当たり０．１〜５μｇ、例えば、０．５μｇ、２．５μｇまたは５μｇの量で存在してよい。例えば、各ＧＢＳ莢膜糖は、単位用量当たり０．５〜５μｇ、１〜４μｇ、２〜３μｇ、または約２．５μｇの量で存在してよい。

免疫原性組成物が１より多いコンジュゲートを含む上記の実施形態では、所与の莢膜糖の質量と他の莢膜糖（複数可）の質量の比率は変動してよい。しかし、典型的には、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶの莢膜糖の質量比は１：１：１：１：１である。

本発明の免疫原性組成物を投与する方法を以下に考察する。簡単に述べると、本発明の免疫原性組成物は、単回用量または複数回用量で投与することができる。本発明の免疫原性組成物を単回用量で投与することが有効である。したがって、単回用量で投与することは、本発明において、特に、これらの実施形態に好ましい。

あるいは、１つの単位用量の後に第２の単位用量を続けることが有効であり得る。典型的には、第２（または第３、第４、第５など）の単位用量は第１の単位用量と同一である。第２の単位用量は、第１の単位用量の後の任意の適切な時間、特に、１カ月後、２カ月後または３カ月後に投与することができる。例えば、第１の単位用量の３カ月後に第２の単位用量を投与することができる。別の例では、第１の単位用量の１カ月後に第２の単位用量を投与することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、例えば、下記の通り、大腿または上腕への筋肉内投与により、筋肉内に投与される。

下記の通り、本発明の免疫原性組成物は、１または複数のアジュバントを含んでよい。しかし、アジュバント化されていない（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）組成物を使用することも有効である。潜在的な毒性を低下させるために、アジュバントを除くことが有利であり得る。したがって、本発明において使用するため、特に、これらの実施形態には、いかなるアジュバントも含有しない（特に、いかなるアルミニウム塩アジュバントも含有しない）免疫原性組成物が好ましい。

莢膜糖
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖に基づく。莢膜糖は、ＧＢＳのペプチドグリカン骨格と共有結合で連結し、また、ペプチドグリカン骨格に結合した別の糖であるＢ群抗原とは異なる。

ＧＢＳ莢膜糖は化学的に関連するが、抗原性の見地から全く異なる。すべてのＧＢＳ莢膜多糖が以下の三糖コアを共有する：
β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ（１→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃｐ
種々のＧＢＳ血清型は、このコアの修飾のされ方が異なる。血清型ＩａとＩＩＩの差異は、例えば、このコアにおいて、連続した三糖コアを連結するためにＧｌｃＮＡｃ（Ｉａ）またはＧａｌ（ＩＩＩ）のいずれかが使用されることから生じる。血清型ＩａおよびＩｂはどちらも、コア内のＧｌｃＮＡｃに連結した［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］二糖を有するが、連結は１→４（Ｉａ）または１→３（Ｉｂ）のいずれかである。

ＧＢＳ関連疾患は、主に血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから生じ、その８５％超が５種の血清型：Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶによって引き起こされる。本発明は、好ましくは、これらの４種の血清型のうちの１または複数由来の糖、特に、血清型：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩのうちの１または複数由来の糖を用いる。これらの４種の血清型のそれぞれの莢膜糖は、（ａ）すべての場合においてガラクトース残基に２→３で連結している末端のＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基（一般にシアル酸と呼ばれる）と、（ｂ）三糖コア内部のＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）とを含む。

４種の糖のすべてが三糖コア内部のガラクトース残基を含むが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩは、各繰り返し単位内に追加的なガラクトース残基も含有する。

糖は、天然に見出される莢膜糖と比較して化学的に修飾することができる。例えば、糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（Ｎ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的にまたは完全に）などをされてよい。脱アセチル化は、コンジュゲートする前、その間、またはその後に起こり得るが、コンジュゲートする前に起こることが好ましい。特定の糖に応じて、脱アセチル化は免疫原性に影響を及ぼす場合と影響を及ぼさない場合がある。種々の血清型のＧＢＳ糖に対するＯ−アセチル化の関連性は参考文献１２において考察されており、いくつかの実施形態では、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化が、コンジュゲートする前、その間およびその後で、例えば、保護／脱保護によって、再アセチル化によってなどで保持される。しかし、典型的には、本発明において使用されるＧＢＳ糖は、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さない。特に、ＧＢＳ糖が、下記の通り塩基抽出によって精製された場合には、Ｏ−アセチル化は一般には失われる（参考文献１２）。脱アセチル化の作用などは、常套的なアッセイによって評価することができる。血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献１３および１４に記載の通り修飾することができる。例えば、参考文献１３および１４に記載の通り実質的に脱シアル化された血清型Ｖの莢膜糖が有用であり得る。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献１３に記載の通り、精製されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖を弱酸性条件下で（例えば、０．１Ｍの硫酸、８０℃で６０分間）処理することによって、またはノイラミニダーゼで処理することによって調製することができる。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖を調製するための好ましい方法は、精製された糖を１Ｍの酢酸を用いて、８１℃±３℃で２時間処理することによる。

特に、ＧＢＳ血清型Ｖの莢膜多糖のシアル酸の酸化の程度は、４０％未満、２５％未満、２０％未満、１７％未満、１５％未満、１０％未満、例えば、約１２％、約９％、約８％、約７％である。特に、ＧＢＳ血清型Ｖの莢膜多糖のＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃまたはシアル酸）含有量は、ＮｅｕＮＡｃ含有量が約１００％であるとみなされる天然のＧＢＳ血清型Ｖの多糖と比較して５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超である。特に、ＧＢＳ血清型Ｖの多糖は完全にシアル化されているまたは「天然の多糖」である。例えば、天然のＧＢＳ血清型Ｖの多糖と比較して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、約９０％（またはこれらの値の間の任意の範囲）のシアル酸含有量。特に、Ｖ型多糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、２−アセトアミド−２−デオキシ−グルコースおよびシアル酸を３：２：１：１のモル比で含有する。

本発明に従って使用される糖は、天然に見出されるような実質的に全長の莢膜多糖であってよく、または、天然の長さよりも短くてよい。全長の多糖は、本発明で用いるために、例えば、弱酸中での加水分解によって、加熱によって、サイズ選別クロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などによって解重合させて、より短い断片を得ることができる。鎖長は、ウサギにおいてＧＢＳ糖の免疫原性に影響を及ぼすことが報告されている［４］。特に、本発明において使用される血清型ＩＩおよび／またはＩＩＩの莢膜糖は、参考文献１５および１６に記載の通り解重合させることができる。これらの文書には、ＩＩ型およびＩＩＩ型の莢膜糖を、穏やかな脱アミノ切断により部分的に解重合させて、還元末端の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基を有する抗原断片にすることが記載されている。簡単に述べると、莢膜糖を０．５ＮのＮａＯＨに溶解させ、７０℃で約１〜４時間加熱する。このインキュベーションの長さによって解重合の程度を制御し、これは、標準の方法によって（例えば、参考文献１５に記載のＨＰＬＣによって）決定することができる。試料を氷水浴内で冷却した後、氷酢酸を加えてｐＨ４にする。次いで、部分的にＮ−脱アシル化された生成物を、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮＯ_２を４℃で２時間にわたって撹拌しながら加えることによって脱アミノ化する。新たに形成された２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基の遊離のアルデヒドは、以下に記載の通り、キャリアタンパク質とコンジュゲートするために用いることができる。

破傷風トキソイドキャリアとのコンジュゲートを形成するために、解重合した材料を用いることを含めた、エンド−β−ガラクトシダーゼによる血清型ＩＩＩの莢膜糖の解重合が報告されている［参考文献１＆４〜６］。ＧＢＳ血清型ＩＩＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖のオゾン分解も解重合のために用いられている［１７］。ＭＷ＞３０ｋＤａの糖を用いることが好ましく、実質的に全長の莢膜多糖を用いることができる。血清型Ｉａについては、ＭＷが１５０〜３００ｋＤａ、特に、１７５〜２７５ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約２００ｋＤａまたは約２６０ｋＤａである血清型Ｉａの糖を用いる。血清型Ｉｂについては、ＭＷが１５０〜３００ｋＤａ、特に、１７５〜２５０ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約２００ｋＤａまたは約２３０ｋＤａである血清型Ｉｂの糖を用いる。血清型ＩＩＩについては、ＭＷが５０〜２００ｋＤａ、特に、８０〜１５０ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約１００ｋＤａまたは約１４０ｋＤａである血清型ＩＩＩ糖を用いる。血清型Ｖについては、ＭＷが約５０ｋＤａまでの多糖を用いることも好ましい。典型的には、ＭＷが約１００ｋＤａである血清型Ｖの糖を用いる。これらの分子質量は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なものなどのデキストラン標準物質と比較してゲル濾過によって測定することができる［１８］。

莢膜糖は、本明細書の参考文献、例えば、参考文献２および１９などに記載の公知の技法によって精製することができる。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびさらなる限外濾過を伴う。ＧＢＳ細胞を、細菌の細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素であるムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）で処理することも有用である。

代替として、参考文献２０に記載の精製プロセスを用いることができる。このプロセスは、塩基抽出、エタノール／ＣａＣｌ_２処理、ＣＴＡＢ沈殿、および再可溶化を伴う。別の代替のプロセスが参考文献２１に記載されている。

しかし、本発明は、天然の供給源から精製された糖に限定されず、糖は、完全な合成または部分的な合成などの他の方法によって得ることができる。

コンジュゲーション
本発明は、それぞれキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ由来の莢膜糖であるコンジュゲートに関する。一般に、糖とキャリアの共有結合性コンジュゲーションにより、Ｔ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換されるので、糖の免疫原性が増強され、したがって免疫記憶が刺激される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり［例えば、参考文献２２］、これは周知の技法である［例えば、参考文献２３〜３１に概説されている］。したがって、本発明のプロセスは、精製された糖をキャリア分子とコンジュゲートするさらなるステップを含み得る。

ＧＢＳ糖のコンジュゲーションは、広く報告されている。例えば、参考文献１を参照されたい。多糖は免疫原性であるが、多糖をキャリアタンパク質にコンジュゲートすることにより、免疫原性を改善または増強することができる。したがって、本明細書で使用される場合、「キャリア」という用語は、抗原（例えば、多糖など）にコンジュゲートさせ、動物に投与すると、その動物における免疫応答、特に防御免疫応答を誘導または増強し、抗原、例えば、上記の多糖に特異的に結合する抗体の産生を惹起する免疫原性物質を指す。ＧＢＳ糖をコンジュゲートするための典型的な先行技術のプロセスは、典型的には、精製された糖の、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＣＲＭ１９７などのキャリアタンパク質との還元アミノ化を伴う［２］。還元アミノ化には、キャリアのアミノ酸の側鎖上のアミン基および糖のアルデヒド基が関与する。ＧＢＳ莢膜糖はそれらの天然の形態ではアルデヒド基を含まないので、典型的には、これを生じさせた後に、糖のシアル酸残基の一部（例えば、５％から４０％間、特に、１０％から３０％間、好ましくは約２０％）を酸化することに（例えば、過ヨウ素酸酸化）よってコンジュゲートする［２、３２］。ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶのそれぞれについて、このように調製されたコンジュゲートワクチンはヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが示されている［１０］。典型的には、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのすべてがこのように調製されたものである。しかし、本発明において脱シアル化された血清型Ｖの莢膜糖を用いる場合には、この糖にアルデヒド基を生じさせた後に、糖のガラクトース残基の一部（例えば、５％から４０％間、特に、１０％から３０％間、好ましくは約２０％）を酸化すること（例えば、過ヨウ素酸酸化）によってコンジュゲートすることができる［１４］。代替のコンジュゲーションプロセスは、参考文献３３に記載の通り、糖の−ＮＨ_２基（脱Ｎ−アセチル化によるものか、またはアミンの導入後のもの）を、二官能性リンカーと併せて用いることを伴う。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのうちの１または複数はこのように調製されたものである。別の代替のプロセスが参考文献１５および１６に記載されている。このプロセスでは、穏やかな脱アミノ切断によるＩＩ型またはＩＩＩ型の莢膜糖の解重合に由来する、末端の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基の遊離のアルデヒド基を還元アミノ化によるコンジュゲーションのために用いる。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのうちの１または複数はこのように調製されたものである。

本発明は、代表的にはタンパク質である、キャリアタンパク質の使用を含む。有用なキャリアタンパク質としては、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの、細菌の毒素または類毒素が挙げられる。毒素または類毒素の断片、例えば、破傷風トキソイドの断片Ｃも用いることができる［３４］。

ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体［３５〜３７］は、本発明での使用のための特に有用なキャリアである。交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）は、遺伝的に解毒されたジフテリア毒素の調製物である。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素（ＤＴ）とは単一のアミノ酸のみが異なり、したがって、ＤＴと高度に交差反応性である（ＣＲＭ＝交差反応性材料）。ジフテリア毒素のこの変異体にはホルムアルデヒドを用いた解毒が必要なく、また、精製された抗原の均一な調製物を、例えば、カザミノ酸および酵母抽出物の培地で成長させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ Ｃ７株（ベータ１９７）の培養物から容易に得ることができる。あるいは、ＣＲＭ１９７は、ＵＳ５，６１４，３８２に従って、組換えによって調製することができる。ＣＲＭ１９７は、いくつかの莢膜多糖抗原に対するキャリアタンパク質としてのヒトへの使用に関して認可されており、ホルムアルデヒド処理によって調製された従来のジフテリアトキソイドに対する潜在的な代替である。

他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［３８］、合成ペプチド［３９、４０］、熱ショックタンパク質［４１、４２］、百日咳タンパク質［４３、４４］、サイトカイン［４５］、リンフォカイン［４５］、ホルモン［４５］、増殖因子［４５］、ヒト血清アルブミン（組換え型であることが好ましい）、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４６］例えば、Ｎ１９［４７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［４８、４９］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［５０］、ニューモリシン［５１］、鉄取り込みタンパク質（ｉｒｏｎ−ｕｐｔａｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）［５２］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［５３］、組換え型のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの細胞外タンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ｒＥＰＡ）［５４］などが挙げられる。

キャリアへの結合は、例えば、キャリアタンパク質のリジン残基の側鎖の−ＮＨ_２基、またはアルギニン残基の側鎖の−ＮＨ_２基、またはＮ末端の−ＮＨ_２基を介することが好ましい。結合は、例えば、システイン残基の側鎖の−ＳＨ基を介してもよい。

例えば、キャリアが抑制される危険性を低下させるために、１より多いキャリアタンパク質を用いることが可能である。したがって、異なるＧＢＳ血清型に対して異なるキャリアタンパク質を用いることができ、例えば、血清型Ｉａの糖をＣＲＭ１９７とコンジュゲートすることができ、その一方で血清型Ｉｂの糖を破傷風トキソイドとコンジュゲートすることができる。詳細には、血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの糖をＣＲＭ１９７などの第１のキャリアにコンジュゲートさせることができ、血清型ＩＩおよびＶの糖を破傷風トキソイド（−ＴＴ）などの第２の（異なる）キャリアにコンジュゲートさせることができる。さらに詳細には、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶの糖をＣＲＭ１９７などの第１のキャリアにコンジュゲートさせることができ、血清型ＩＩの糖を−ＴＴなどの第２の（異なる）キャリアにコンジュゲートさせることができる。

本発明の例示的な免疫原性組成物は、（ａ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む。本発明の別の例示的な免疫原性組成物は、（ａ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）破傷風トキソイドにコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）破傷風トキソイドにコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む。本発明のさらに別の例示的な免疫原性組成物は、（ａ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）破傷風トキソイドにコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む。本発明のさらに別の例示的な免疫原性組成物は、（ａ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）破傷風トキソイドにコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む。特定の糖抗原に対して１より多いキャリアタンパク質を用いることも可能であり、例えば、血清型ＩＩＩの糖を２群にし、その一部をＣＲＭ１９７とコンジュゲートし、その他を破傷風トキソイドとコンジュゲートすることができる。しかし、一般的に、すべての糖に対して同じキャリアタンパク質を用いることが好ましい。

単一のキャリアタンパク質は、１より多い糖抗原を保有してよい［５５、５６］。例えば、単一のキャリアタンパク質を、血清型ＩａおよびＩｂ由来の糖とコンジュゲートすることができる。この目標を実現するために、コンジュゲーション反応の前に異なる糖を混合することができる。しかし、典型的には、各血清群に対してコンジュゲートを別々にし、コンジュゲートした後に異なる糖を混合することが好ましい。別々のコンジュゲートは、同じキャリアに基づいてよい。

典型的には、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわちタンパク質過剰）から５：１（すなわち糖過剰）の間、特に、１：５から２：１の間の比率であるコンジュゲートを用いる。キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートについては、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は、典型的には、約１：１から１：２の間、特に、約１：１．３である。キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートについては、比率は、典型的には、約１：１から１：２の間、特に、約１：１．３である。キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートについては、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は、典型的には、約３：１から１：１の間、特に、約２：１である。しかし、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が約１：１〜１：５、特に、約１：３．３である、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩも用いることができる。キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートについては、比率は、典型的には、約２：１から１：１の間、特に、約１．１：１である。したがって、特に、長い糖鎖では、糖の重量過剰が典型的である。

脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの多糖を使用する場合、詳細には、種々のレベルの多糖とタンパク質の架橋が使用される。架橋のレベルは、例えば、タンパク質−多糖比を変動させることによって調節することができる。詳細には、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１：１．５未満、１：１未満、１：０．５未満または約１：０．５である。

組成物は、少量の遊離のキャリアを含んでよい［５７］。所与のキャリアタンパク質が本発明の組成物中に遊離の形態およびコンジュゲートさせた形態の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形態は、典型的には、全体として、組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であり、例えば、２重量％未満で存在する。

コンジュゲートした後、遊離の糖およびコンジュゲートさせた糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含めた多くの適切な方法がある［参考文献５８＆５９なども参照されたい］。好ましい方法は参考文献６０に記載されている。

本発明の組成物が解重合したオリゴ糖を含む場合、解重合がコンジュゲーションに先行することが好ましい。

薬学的方法および使用
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容されるキャリアをさらに含んでよい。典型的な「薬学的に許容されるキャリア」としては、それ自体は、組成物を受け取る個体に対して有害な、抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的には、大きな、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸共重合体、スクロース［６１］、トレハロース［６２］、ラクトース、および脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）である。そのようなキャリアは当業者に周知である。ワクチンは、例えば、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有してよい。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在してよい。滅菌の、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水が典型的なキャリアである。薬学的に許容される賦形剤の詳細な論述は、参考文献６３において入手可能である。

本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液または懸濁物）または乾燥した形態（例えば、凍結乾燥したもの）であってよい。乾燥ワクチンを用いる場合には、注射する前に液体媒体中に再構成する。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）製品が凍結乾燥した形態で提示される。本発明の免疫原性組成物が１より多いＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートを含む場合、コンジュゲートを別々に調製し、混合し、次いで凍結乾燥することが典型的である。このように、本明細書に記載のコンジュゲートを２種、３種または４種などを含む凍結乾燥した組成物を調製することができる。凍結乾燥の間、コンジュゲートを安定化するために、糖アルコール（例えば、マンニトール）および／または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を、例えば、１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約２５ｍｇ／ｍｌ）で組成物に含めることが好ましい場合がある。スクロースの使用は、ＧＢＳコンジュゲートワクチンの安定剤として推奨されている（参考文献６４）。しかし、本発明の安定剤はマンニトールであることが典型的である。乾燥ワクチンを、注射する前に液体媒体中に再構成する場合、残留するマンニトールの濃度は、典型的には、約２〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、３．７５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌまたは１５ｍｇ／ｍｌになる。マンニトールの使用は、マンニトールがＧＢＳ莢膜糖の単糖サブユニットとは化学的に別個であるので有利である。これは、例えば品質管理分析のための莢膜糖の検出を、マンニトールに干渉されずに、上記糖のサブユニットの存在に基づいて行うことができることを意味する。対照的に、スクロースのような安定剤はグルコースを含有し、これは上記糖におけるグルコースサブユニットの検出に干渉し得る。

組成物はバイアルで提示されてもよく、または組成物は充填済み注射器で提示されてもよい。注射器は、針を伴って、または伴わずに供給することができる。注射器は、組成物の単回用量を含み、一方バイアルは、単回用量または複数回用量を含むことができる。

本発明の水性組成物は、他のワクチンを凍結乾燥した形態から再構成するためにも適している。本発明の組成物がそのような即時の再構成のために用いるものである場合、本発明は、バイアル２つを含み得るキット、または、充填済み注射器１つとバイアル１つを含み、注射する前に注射器の内容物を用いてバイアルの内容物を再活性化することができるキットを提供する。

本発明の組成物は、単位用量形態または複数回用量形態に包装することができる。複数回用量形態には充填済み注射器よりもバイアルの方が好ましい。有効な投与体積は常套的に確立することができるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射するためには、体積０．５ｍｌである。

組成物のｐＨは、６から８の間であることが好ましく、約７であることが好ましい。安定なｐＨは、バッファを用いることによって維持することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物はリン酸二水素カリウムバッファを含む。リン酸二水素カリウムバッファは、約１〜１０ｍＭ、例えば、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭまたは５．０ｍＭのリン酸二水素カリウムを含んでよい。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジンバッファを用いることが好ましい［６５］。組成物は、滅菌で有り得、かつ／または発熱物質を含まない可能性がある。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。

本発明の組成物は免疫原性であり、ワクチン組成物であることがより好ましい。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するためのもの）または治療的（すなわち、感染を処置するためのもの）のいずれかであり得るが、典型的には、予防的である。本発明の組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明にしたがうワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防する）であり得るか、または治療的（すなわち、感染を処置する）であり得るが、代表的には予防的である。予防的なワクチンでは、患者が抗体を生じたとしても免疫系が感染を撃退することができるまでに遅れまたは遅延があり得るので、疾患に対する完全な防御は保証されない。したがって、また、疑いを回避するために、予防的なワクチンという用語は、将来の感染の影響を、例えば、そのような感染の重症度または持続時間を軽減することによって緩和するワクチンを指す場合もある。「感染に対する防御」および／または「防御免疫をもたらす」という用語は、被験体の免疫系が、免疫応答を誘発し、感染に抵抗するための初回刺激を受けている（例えばワクチン接種によって）ことを意味する。特に、誘発される免疫応答により、細菌の種々の株などのいくつもの病原体に対する感染症に抵抗することができる。したがって、ワクチン接種された被験体は、感染するが、その感染に対して対照の被験体よりも良好に抵抗することができる。

ワクチンとして用いる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）、ならびに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、その量を個体に単回用量または一連のものの一部として投与することが、処置または予防に有効であることを意味する。一般に、所望の結果は、病原体に対して被験体を防御することができる、またはそれに寄与する抗原（例えば、病原体）特異的な免疫応答が生じることである。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、処置される個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置にあたる医師による医学的な状況に関する評価、および他の関連因子に応じて変動する。常套的な試行によって決定することができる量は比較的広範囲に入ることが予想される。

各用量の中で、個々の糖抗原の量は、一般に、０．１μｇから５０μｇの間（糖の質量として測定する）、詳細には、１μｇから５０μｇの間または０．５μｇから２５μｇの間、より詳細には、２．５〜７．５μｇ、例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇまたは約２５μｇになる。各用量の中で、ＧＢＳ莢膜糖の総量は、一般に≦７０μｇ（糖の質量として測定する）、例えば、≦６０μｇである。特に、総量は、≦４０μｇ（例えば、≦３０μｇ）または≦２０μｇ（例えば、≦１５μｇ）であってよい。これらの総量が本発明で使用するために好ましい。潜在的な毒性を低下させるために、単位用量当たりの莢膜糖（複数可）の総量を最小限にすることが有利であり得る。したがって、総量は≦２０μｇ、例えば、≦１５μｇ、≦７．５μｇまたは≦１．５μｇであることが好ましい。

ＧＢＳは、身体の種々の領域に影響を与えるので、本発明の組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、注射剤として、液剤または懸濁物のいずれかとして調製することができる。組成物は、肺への投与のために、例えば、微細な粉末または噴霧剤を用いて吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）として調製することができる。組成物は、坐薬または膣坐薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳または眼に投与するために、例えば、噴霧剤、滴剤（ｄｒｏｐ）、ゲル剤または散剤として調製することができる［例えば、参考文献６６＆６７］。肺炎球菌の糖［６８、６９］、Ｈｉｂ糖［７０］、ＭｅｎＣ糖［７１］、およびＨｉｂ糖とＭｅｎＣ糖のコンジュゲートの混合物［７２］の鼻投与での成功が報告されている。

本発明の組成物は、ａＰ／ｗＰ、ＴＴ、ＤＴおよび／またはＩＰＶ抗原、すなわち無細胞の百日咳抗原、例えば、百日咳線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ、６９Ｋ−ＯＭＰ）、百日咳線毛（ＦＩＭ）、または細胞性の百日咳抗原、全細胞百日咳抗原、百日咳トキソイドまたは百日咳毒素（ＰＴ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよび／または不活化ポリオウイルス抗原と組み合わせることができる。例えば、これは、本発明の組成物を、ＡＮＡＴＥＴＡＬＬ（登録商標）、ＤＩＦＴＥＴＡＬＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）またはＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）を含めた、すでに市販されている処方物と組み合わせることによって行うことができる。

本発明の組成物は、特に、複数回用量形式で包装する場合には、抗菌薬を含んでよい。

本発明の組成物は、洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでよい。洗浄剤は、一般に、低レベルで、例えば、＜０．０１％で存在する。

本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでよい。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度が典型的である。いくつかの実施形態では、４〜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば、９．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、６．７５ｍｇ／ｍｌまたは４．５ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度を用いることができる。

本発明の組成物は、一般に、バッファを含む。リン酸バッファが典型的である。

本発明の組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。特に、組成物は、１または複数のアジュバントを含んでよい。そのようなアジュバントとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：
Ａ．無機質を含有する組成物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、無機質を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献７３に開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取る。これらの塩への吸着が好ましい。無機質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる［７４］。

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを用いることができる。これらの名称は慣習的であるが、どちらも、存在する実際の化合物についての正確な記載ではないので、利便性のためだけに使用される（例えば、参考文献７５の第９章を参照されたい）。本発明では、アジュバントとして一般に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「ホスフェート」アジュバントを用いることができる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含有する（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。

繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわち、アジュバント自体は生理的なｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムアジュバントは、一般に、０．３から１．２の間、好ましくは０．８から１．２の間、より好ましくは０．９５±０．１のＰＯ_４／Ａｌモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）を有する。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真で観察されるようなプレート状の形態）である。粒子の典型的な直径は、任意の抗原が吸着した後に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり０．７から１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファのようなバッファを加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、通常、４．０から７．０の間、より好ましくは５．０から６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するために用いるアルミニウム塩の懸濁物は、バッファ（例えば、リン酸バッファまたはヒスチジンバッファまたはトリスバッファ）を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁物は、滅菌であり、そして発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭから２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭの間、およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性ホスフェートイオンを含んでよい。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。

本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることができる。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化アルミニウムよりも多く、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在してよい。

患者に投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

典型的なアジュバントであるリン酸アルミニウムアジュバントは、０．８４から０．９２の間のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質のアルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。低用量のリン酸アルミニウム、例えば、用量あたりコンジュゲートあたり５０μｇから１００μｇの間のＡｌ^３＋を用いた吸着を用いることができる。

Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油エマルジョン組成物としては、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）などのスクアレン−水エマルジョンが挙げられる［参考文献７５の第１０章； 参考文献７６〜７８も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。

組成物において使用するために特に好ましいアジュバントはサブミクロンの水中油エマルジョンである。本明細書で使用するための好ましいサブミクロンの水中油エマルジョンは、必要に応じて様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン、例えば、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、および、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロンの水中油エマルジョンである。組成物において使用するためのサブミクロンの水中油エマルジョン、それを作製する方法、およびムラミルペプチドなどの免疫賦活剤は、参考文献７６＆７９〜８０に詳しく記載されている。

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。

Ｃ．サポニン処方物［参考文献７５の第２２章］
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見出されるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）から、商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製された処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の生成方法は参考文献８１に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい［８２］。

サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる［参考文献７５の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンも含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに用いることができる。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１または複数を含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは、参考文献８２〜８４にさらに記載されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加的な洗浄剤（複数可）を欠いてよい［８５］。

サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説は、参考文献８６＆８７に見出すことができる。

Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、必要に応じてリン脂質と組み合わされ、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができ、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献８８〜９３においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば、参考文献９４においてさらに論じられている。

Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を含む。

ＬＰＳの無毒性の誘導体として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの「小粒子」形態は、参考文献９５に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過するのに十分小さい［９５］。他の無毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（ｍｉｍｉｃ）、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［９６、９７］。

リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４などが挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献９８＆９９に記載されている。

本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。

ＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾を含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献１００、１０１および１０２には、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置き換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１０３〜１０８においてさらに論じられている。

ＣｐＧ配列、例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフは、ＴＬＲ９に向けられ得る［１０９］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどの、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよく、または、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１１０〜１１２において論じられている。ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために５’末端を利用できるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献１０９＆１１３〜１１５を参照されたい。

細菌性のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来することが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献１１６に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は参考文献１１７に記載されている。毒素または類毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく、Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２であることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献１１８〜１２５に見出すことができる。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる参考文献１２６に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。

Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１２７］など）［１２８］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。

Ｇ．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア［１２９］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体が挙げられる。キトサンおよびそれらの誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる［１３０］。

Ｈ．微小粒子
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて、生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、それを、負に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン洗浄剤を用いて）。

Ｉ．リポソーム（参考文献７５の第１３章＆第１４章）
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、参考文献１３１〜１３３に記載されている。

Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１３４］を含む。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１３５］ならびに少なくとも１つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１３６］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１３７および１３８に記載されている。

Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

Ｍ．イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物「レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）３Ｍ」）が挙げられ、参考文献１３９および１４０にさらに記載されている。

Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
すべてが本発明においてアジュバントとして用いるのに適したチオセミカルバゾン化合物、ならびに化合物を処方、製造、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１４１に記載のものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核細胞を、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン産生について刺激することにおいて特に有効である。

Ｏ．トリプタントリン化合物
すべてが本発明においてアジュバントとして用いるのに適したトリプタントリン化合物、ならびに化合物を処方、製造、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１４２に記載のものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、ヒト末梢血単核細胞を、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン産生について刺激することにおいて特に有効である。

本発明は、上で識別されたアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下の組み合わせを本発明においてアジュバント組成物として使用することができる：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン［１４３］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１４４］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［１４５］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ［１４６］；（６）サブミクロンのエマルジョンに微小流動化した、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせたかのいずれかの、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ。（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１または複数の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例えば、３ｄＭＰＬなど）。

免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、参考文献７５の第７章に開示されている。

アルミニウム塩アジュバントの使用が特に好ましく、一般に、抗原はそのような塩に吸着される。本発明の組成物では、いくつかの抗原は水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原はリン酸アルミニウムと会合させることが可能である。しかし、一般には、単一の塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩を用いるがその両方は用いないことが好ましい。すべてのコンジュゲートが吸着する必要はない、すなわち、一部またはすべてが溶液中で遊離していてよい。

処置方法
本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法であって、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含む方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体を伴うことが好ましい。この方法により、追加免疫応答を生じさせることができる。

哺乳動物はヒトであることが好ましい。ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは、小児（例えば、よちよち歩きの小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）またはティーンエイジャーであることが好ましく、ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、ヒトは、成人であることが好ましい。例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために小児のために意図されたワクチンを成人に投与することもできる。処置するために好ましいヒトのクラスは、妊娠可能な年齢の女性（例えば、ティーンエイジャー以上）である。別の好ましいクラスは妊婦である。高齢の患者（例えば、５０歳超、６０歳超、７０歳超、８０歳超または９０歳超など、特に、６５歳超の高齢の患者）、特に、ＧＢＳ感染の危険性が増す可能性があるナーシングホームで生活している高齢の患者（［１４７］）は、処置するために好ましい別のヒトのクラスである。一部の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。特に、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し、かつ、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し得る。その代わりに、またはそれに加えて、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し得る。その代わりに、またはそれに加えて、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し得る。その代わりに、またはそれに加えて、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し得る。莢膜糖（複数可）に対する抗体のレベル（複数可）は、当技術分野で公知の技法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。抗体のレベル（複数可）は、投与の１カ月前、特に、投与前の１カ月以内（例えば、投与の２週間以内、１週間以内または当日）の時点のレベルであってよい。これらの検出不可能なレベル（複数可）の莢膜糖（複数可）に対する抗体を有する女性の新生児のＧＢＳ感染率はより高い可能性がある。これは、母系のＧＢＳ莢膜糖に対する抗体のレベルが高いことが、新生児における疾患リスクの低下と相関するからである［参考文献１４８および１４９］。したがって、これらの女性への投与が本発明において具体的に想定される。

本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。

本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。

これらの使用および方法は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患（例えば、新生児敗血症または菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎、化膿性関節炎など）を予防および／または処置するためのものであることが好ましい。

疾患が予防される被験体は、本発明のコンジュゲートを受ける被験体と同じでなくてよい。例えば、子を保護するために、女性（妊娠前または妊娠中の）にコンジュゲートを投与することができる（いわゆる「母体免疫化」［１５０〜１５２］）。妊婦を免疫化することにより、抗体に媒介される免疫が受動母体免疫を通じて乳児にもたらされる。受動免疫は、母体の抗体が胎盤を通じて胎児に移行すると自然に起こる。乳児は、能動的に獲得した免疫は何も有さずに生まれてくるので、受動免疫が乳児にとって特に重要である。本発明の組成物を妊婦に投与することにより、その女性における免疫が増強され、また、抗体が胎盤を通じて新生児に渡され、それにより、受動母体免疫が乳児に付与される。しかし、乳児における受動免疫は単に一過性のものであり、生後の最初の数週間、または数カ月で減少し始める。受動免疫は単に一過性のものであるので、受動免疫が減少する前に、乳児における能動免疫を誘導するために乳児が本発明の組成物の投与を受けることが重要であり得る。生後の乳児に２回目の免疫原性組成物を投与することにより、乳児における能動免疫が誘導され、妊娠中の母親から渡された免疫が延長される。

本明細書で使用される場合、乳児は、１歳未満（例えば、生後１日未満、生後１週間、生後２週間、生後３週間、生後４週間、生後２カ月、生後３カ月、生後４カ月、生後５カ月、生後６カ月、生後７カ月、生後８カ月、生後９カ月、生後１０カ月、生後１１カ月、生後１２カ月未満）の個体である。

妊婦には、妊娠中のいかなる時点においても本発明の組成物を投与することができる。例えば、妊娠の第１三半期、第２三半期または第３三半期の女性に組成物を投与することができる。一部の実施形態では、妊娠の最後の６〜１２週間（例えば、妊娠２８週、妊娠２９週、妊娠３０週、妊娠３１週、妊娠３２週、妊娠３３週、妊娠３４週、妊娠３５週、妊娠３６週、妊娠３７週、妊娠３８週、妊娠３９週）の女性に組成物を投与する。特に、乳児を出産する少なくとも４週間前の妊婦に本発明の組成物を投与する。一部の実施形態では、妊娠３２週から３６週の間の妊婦に１用量レジメンを投与する。他の実施形態では、妊婦に２用量レジメンを投与し、その場合、第１の用量をおよそ妊娠３２週に投与し、第２の用量をおよそ妊娠３６週に投与する。

乳児には、生後１年間、および所望であればその後のいかなる時点においても組成物を投与することができる。一般に、組成物は、乳児に、生後１年間で１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与される。例えば、本発明の組成物は、乳児に、誕生時、生後２週間、生後４週間、生後６週間、生後２カ月、生後３カ月、生後４カ月、生後６カ月、生後９カ月、および生後１２カ月から選択される１つまたは複数のときに投与することができる。特に、本発明の組成物は、乳児に、母体の抗体が非防御的な力価まで低下する前の時点で投与される。その後の投与は、任意の所望のスケジュールで行うことができる。

一実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患から乳児を保護する方法であって、（ａ）前記乳児を有する妊娠中の女性に本発明の組成物を投与するステップと、（ｂ）必要に応じて、妊娠から生まれた乳児に本発明の組成物を投与するステップとを含む方法が提供される。詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、ＩＩおよびＶによって引き起こされる早発性疾患から乳児を保護する方法。詳細には、疾患は、生後０時間および１６８時間以内、より詳細には、生後０時間および７２時間以内、さらにより詳細には生後２４時間から７２時間の間、さらにより詳細には生後４８時間から７２時間の間に起こる敗血症である。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、ＩＩおよびＶによって引き起こされる遅発性疾患から乳児を保護する方法も提供される。詳細には、疾患は、生後７日〜９０日以内、またはそれよりも後に起こる。

治療的処置の効力を調査する１つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、ＧＢＳ感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を調査する１つの方式は、組成物を投与した後に、ＧＢＳ抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。

本発明の好ましい組成物は、各抗原性成分に対する抗体保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準よりも優れている患者における抗体価を、ヒト被験体の許容できる百分率で付与することができる。関連する抗体価が、宿主が抗原に対して抗体陽転すると考えられる抗体価を超える抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの組織により公開されている。被験体の統計的に有意な試料の８０％超、より好ましくは９０％超、さらに好ましくは９３％超、最も好ましくは９６〜１００％が抗体陽転することが好ましい。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接的な送達は、非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔へ）、または直腸投与、経口投与、膣への投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺への投与は他の粘膜投与によって達成することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介してよいが、その代わりに無針注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。妊婦および乳児への投与は、同じ経路または異なる経路を介するものであり得る。

本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってよい。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールで使用することができる。一次用量スケジュールの後に、追加免疫用量スケジュールを続けることができる。初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）用量の間（例えば、４〜１６週の間）、および初回刺激と追加免疫との間の適切なタイミングは、常套的に決定することができる。

一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから独占的になり、または、追加的な何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでよい。

「からなる」という用語は、「のみからなる」を意味する。「Ｘからなる」組成物は、他の構成要素はいかなるものも含んではならないかもしれない。「Ｘから本質的になる」組成物は、他の活性成分はいかなるものも含んではならないかもしれない。「から本質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が、追加的な成分、ステップおよび／または部分を含み得るが、それは追加的な成分、ステップおよび／または部分が特許請求された組成物、方法または構造の基本的な特性および新規の特性を実質的に変更しない場合のみであることを意味する。

「約」という用語は、数値ｘとの関連では、例えば、ｘ±１０％を意味する。

「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語を本発明の定義から除くことができる。

糖環（ｓｕｇｅｒ ｒｉｎｇ）は、開いた形態および閉じた形態で存在できること、ならびに、本明細書の構造式において閉じた形態が示されていても、開いた形態も本発明に包含されることが理解されよう。同様に、糖は、ピラノース型およびフラノース型で存在できること、ならびに、本明細書の構造式においてピラノース型が示されていても、フラノース型も包含されることが理解される。糖の異なるアノマー形態も包含される。

具体的に記述されていない限り、２つまたはそれより多くの成分を混合するステップを含むプロセスは、いかなる特定の混合の順序も必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合には、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組み合わせ物を、第３の成分と組み合わせることができるなどである。

抗体は、一般に、それらの標的に特異的である。したがって、抗体は、標的に対して、無関連の対照タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンに対する親和性よりも高い親和性を有する。

別段の指定のない限り、ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を使用して決定することが好ましい。

図１は、新生仔攻撃モデルにおけるマウスの生存（％防御）を示す。それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた（Ａ）ＧＢＳ Ｉａ、（Ｂ）ＧＢＳ Ｉｂ、（Ｃ）ＧＢＳ ＩＩＩ、（Ｄ）ＧＢＳ ＩＩおよび（Ｅ）ＧＢＳ Ｖを用いて母体免疫化を行った。対応する抗原を用いてマウスを攻撃した。 図２は、それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた（Ａ）ＧＢＳ Ｉａ、（Ｂ）ＧＢＳ Ｉｂ、（Ｃ）ＧＢＳ ＩＩＩ、（Ｄ）ＧＢＳ ＩＩおよび（Ｅ）ＧＢＳに対するＯＰＫ力価を示す。対応する抗原を用いてマウスを免疫化した。 図３は、ＧＢＳ Ｖに対するＩｇＧ力価（図３Ａ）およびＯＰＫ力価（図３Ｂ）を示す。（Ａ）ミョウバン、（Ｂ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ、（Ｃ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ＋三価ワクチン（ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、および（Ｄ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ＋ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ＋三価ワクチン（ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ）を用いてマウスを免疫化した。 図４は、ＧＢＳ ＩＩに対するＩｇＧ力価（図４Ａ）およびＯＰＫ力価（図４Ｂ）を示す。（Ａ）ミョウバン、（Ｂ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ、（Ｃ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ＋三価ワクチン（ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、および（Ｄ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ＋ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ＋三価ワクチン（ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）を用いてマウスを免疫化した。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶに対するＩｇＧ力価（５Ａ）および５１５ Ｉａ株、Ｈ３６Ｂ株、ＣＯＨ１株、５４０１株、ＣＪＢ１１１株に対するＯＰＫ力価（５Ｂ）を示す。（Ａ）三価ワクチン：ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩおよび（Ｂ）五価ワクチン：ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを用いてマウスを免疫化した。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶに対するＩｇＧ力価（５Ａ）および５１５ Ｉａ株、Ｈ３６Ｂ株、ＣＯＨ１株、５４０１株、ＣＪＢ１１１株に対するＯＰＫ力価（５Ｂ）を示す。（Ａ）三価ワクチン：ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩおよび（Ｂ）五価ワクチン：ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを用いてマウスを免疫化した。 図６は、ＧＢＳ Ｖに対するＩｇＧ力価を示す。（Ａ）ＰＢＳ／ミョウバン、（Ｂ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ、（Ｃ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、（Ｄ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよびＶ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＩａ、Ｉｂ、ＩＩＩ）、（Ｅ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ、（Ｆ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｖ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、（Ｇ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよびＶ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＩａ、Ｉｂ、ＩＩＩ）を用いてマウスを免疫化した。 図７は、ＧＢＳ ＩＩに対するＩｇＧ力価を示す。（Ａ）ＰＢＳ／ミョウバン、（Ｂ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ、（Ｃ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、（Ｄ）ＣＲＭにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよびＶ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＩａ、Ｉｂ、ＩＩＩ）、（Ｅ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ、（Ｆ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、（Ｇ）ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよびＶ＋三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＩａ、Ｉｂ、ＩＩＩ）を用いてマウスを免疫化した。 図８は、マウス当たりコンジュゲート１μｇを２つの用量で用いて免疫化することにより生じた、ＣＲＭ−Ｉａ由来のシアル酸含有量が異なる試料の有効性分析について示す。Ａ）ＯＰＫＡ力価、３つのプロトコールからの平均値が横棒で示されている。Ｂ）：３つのプロトコールからの、攻撃を受けた仔の累積パーセント生存％である。Ｃ）：投与したロットのＩＶＲＰの有効性の値である。 図８は、マウス当たりコンジュゲート１μｇを２つの用量で用いて免疫化することにより生じた、ＣＲＭ−Ｉａ由来のシアル酸含有量が異なる試料の有効性分析について示す。Ａ）ＯＰＫＡ力価、３つのプロトコールからの平均値が横棒で示されている。Ｂ）：３つのプロトコールからの、攻撃を受けた仔の累積パーセント生存％である。Ｃ）：投与したロットのＩＶＲＰの有効性の値である。 図９は、脱シアル化ＣＲＭ−Ｉｂ試料（マウス当たりコンジュゲート１μｇを用いて免疫化することにより生じた）の有効性分析について示す。パネルＡは、ミョウバンを用いて処方した脱シアル化Ｉａ−ＣＲＭ１９７試料を２つの用量で用いて免疫化したマウスにおけるＯＰＫＡ力価（プールした血清）を示す。調製物＃１からのデータが三角形で示されており、調製物＃２からのデータが丸で示されている。２つの調製物におけるパーセントＳＡがＸ軸に示されている。横棒は、ＥＬＩＳＡによるＧＭＴおよびＯＰＫＡ力価の平均を示す。Ｂ）：攻撃を受けた仔のパーセント生存（３つのプロトコールの平均）である。Ｃ）調製物のＩＶＲＰの有効性の値である。 図９は、脱シアル化ＣＲＭ−Ｉｂ試料（マウス当たりコンジュゲート１μｇを用いて免疫化することにより生じた）の有効性分析について示す。パネルＡは、ミョウバンを用いて処方した脱シアル化Ｉａ−ＣＲＭ１９７試料を２つの用量で用いて免疫化したマウスにおけるＯＰＫＡ力価（プールした血清）を示す。調製物＃１からのデータが三角形で示されており、調製物＃２からのデータが丸で示されている。２つの調製物におけるパーセントＳＡがＸ軸に示されている。横棒は、ＥＬＩＳＡによるＧＭＴおよびＯＰＫＡ力価の平均を示す。Ｂ）：攻撃を受けた仔のパーセント生存（３つのプロトコールの平均）である。Ｃ）調製物のＩＶＲＰの有効性の値である。 図１０は、脱シアル化ＣＲＭ−ＩＩＩ試料（マウス当たりコンジュゲート０．２μｇを用いて免疫化することにより生じた）の有効性分析について示す。パネルＡは、ミョウバン中に処方した調製物＃１由来のＩａ−ＣＲＭ１９７脱シアル化試料の２つの０．２μｇ用量を用いて免疫化したマウス由来の血清におけるＯＰＫＡ力価を示す。（Ａ）丸は単一のマウスそれぞれからのＩｇＧ力価を示し、横棒は、ＥＬＩＳＡによるＧＭＴの平均を示す。（ｂ）丸は、同じプロトコールからの、プールした血清のＯＰＫＡ力価を示す。パネルＢは、免疫化した雌マウス由来の攻撃を受けた仔のパーセント生存を示す。

ワクチン
試験１〜４において使用するＧＢＳ一価ワクチンは全て、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたものである。

全ての試験において使用するＧＢＳ三価ワクチンは、それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた血清型：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩに由来する莢膜多糖で構成される。

試験１
新生仔攻撃モデル（Ｍａｉｏｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年７月１日：３０９巻、５７３１号、１４８〜１５０頁）において、マウスの防御のレベルを調査した。３つの用量の、アルミニウム塩（４００μｇ）でアジュバント化されたＧＢＳ一価ワクチン（抗原１μｇ）を母親に与えた。試験したＧＢＳ一価ワクチンは、それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶであった。図１に結果が示されている。

ＯＰＫアッセイも行い、その結果が図２に示されている。ワクチンの効力を評価するための実行可能な手法は、防御の代わり、ＧＢＳの場合では血清抗体のオプソニン化活性を使用することである。オプソニン作用性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）死滅アッセイでは、補体の存在下でエフェクター細胞による死滅のためにＧＢＳをオプソニン化する血清抗体の能力を測定する。一般に、ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ Ａｂ力価とＯＰＫ力価の間には良好な相関が存在する。ＧＢＳ ＩＩおよびＧＢＳ Ｖによる防御およびＯＰＡレベルは、ＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩによる防御およびＯＰＡレベルと同等であることがわかる。

試験２
３つの用量の、アルミニウム塩（４００μｇ）でアジュバント化された一価ワクチンまたは多価ワクチン（各抗原１μｇ）を用いてマウスを免疫化した。試験したワクチンは、（１）ＧＢＳ Ｖ、（２）ＧＢＳ ＶおよびＧＢＳ三価ワクチンを含有する四価ワクチン、ならびに（３）ＧＢＳ ＩＩ、ＧＢＶおよびＧＢＳ三価を含有する五価ワクチンであった。陰性対照として、アルミニウム塩を単独で用いてマウスを免疫化した。ＥＬＩＳＡおよびＯＰＫアッセイ（Ｖ型ＣＪＢ１１１株を使用した）を行った（２回繰り返した）。

これらの実験の結果が図３に示されている。ＧＢＳ Ｖと他の抗原との間に有意な免疫干渉は観察されないことがわかる。

免疫化したマウスを、ＧＢＳ Ｖを用いて攻撃し、その結果が表１に提供される。

試験３
３つの用量の、アルミニウム塩（４００μｇ）でアジュバント化された一価ワクチンまたは多価ワクチン（各抗原１μｇ）を用いてマウスを免疫化した。試験したワクチンは、（１）ＧＢＳ ＩＩ、（２）ＧＢＳ ＩＩおよびＧＢＳ三価ワクチンを含有する四価ワクチン、ならびに（３）ＧＢＳ ＩＩ、ＧＢＶおよびＧＢＳ三価ワクチンを含有する五価ワクチンであった。陰性対照として、アルミニウム塩を単独で用いてマウスを免疫化した。ＥＬＩＳＡおよびＯＰＫアッセイ（ＩＩ型５４０１株を使用した）を行った（２回繰り返した）。

図４に結果が示されている。ＧＢＳ ＩＩと他の抗原との間に有意な干渉は観察されなかった。

免疫化したマウスを、ＧＢＳ ＩＩを用いて攻撃し、その結果が表２に提供される。

試験４
３つの用量の、アルミニウム塩（４００μｇ）でアジュバント化された三価ワクチンまたは五価ワクチン（各抗原１μｇ）を用いてマウスを免疫化した。試験したワクチンは、（１）ＧＢＳ ＩＩ、（２）ＧＢＳ三価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）、（３）ＧＢＳ四価ワクチン（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ＋ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩ）、ならびに（４）（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ＋ＴＴにコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよびＶ）を含有する五価ワクチンであった。陰性対照として、アルミニウム塩を単独で用いてマウスを免疫化した。ＥＬＩＳＡおよびＯＰＫアッセイ（ＩＩ型５４０１株を使用した）を行った（２回繰り返した）。

免疫化したマウスを、ＧＢＳ ＩＩを用いて攻撃し、その結果が表３に提供される。

試験５
３つの用量の、アルミニウム塩（４００μｇ）でアジュバント化された三価ワクチンまたは五価ワクチン（各抗原１μｇ）を用いてマウスを免疫化した。ＥＬＩＳＡおよびＯＰＫアッセイ（ＩＩ型５４０１株を使用した）を行った（２回繰り返した）。

結果が図５Ａおよび５Ｂに示されている。三価ワクチンと五価ワクチンとの間に有意な干渉は観察されなかった。

コンジュゲートＩａ、ＩｂおよびＩＩＩの免疫原性および防御は、ＰＳ−ＩＩおよびＶの添加によって影響を受けない。五価の処方物における各ＰＳに対する同等のＥＬＩＳＡおよびＯＰＫ力価。

試験６
種々のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ糖の免疫原性を調査した。

ＣＲＭ１９７（「ＣＲＭ」）または破傷風トキソイド（「ＴＴ」）にコンジュゲートさせたＧＢＳ ＩＩおよび／またはＧＢＳ Ｖを含有する組成物を用いてマウスを免疫化した。ＧＢＳ Ｖに対する抗体価を、ＥＬＩＳＡによって分析した。結果が図６および図７に示されている。陰性対照としてＰＢＳ／アルミニウム塩のみを用いてマウスを免疫化した。

ＣＲＭコンジュゲートとＴＴコンジュゲートのどちらによっても対応する抗原に対する有意な免疫応答がもたらされることがわかる。ＧＢＳ ＩＩについては、ＣＲＭにコンジュゲートさせたかＴＴにコンジュゲートさせたかに関係なく、ＧＢＳ ＩＩと多価ワクチン中の他の抗原との間に有意な免疫干渉は観察されない。同様に、ＧＢＳ Ｖについて、ＣＲＭにコンジュゲートさせたかＴＴにコンジュゲートさせたかに関係なく、ＧＢＳ Ｖと多価ワクチン中の他の抗原との間に有意な免疫干渉は観察されない。

試験７
シアル酸成分の寄与を調査するために、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜多糖抗原Ｉａ、ＩｂおよびＩＩを試験した。シアル酸含有量が異なるワクチンロットを調製し、それを使用してマウスを免疫化し、マウス母体免疫化／新生仔攻撃モデルにおけるＧＢＳに対するＩｇＧ力価、誘導された抗体の機能活性および惹起された防御を決定した。１００％から＜５％までの異なるシアル酸含有量を有する多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの一価ロットを、天然のコンジュゲートを弱酸性条件で（例えば、ｐＨ４．７５、８０℃で種々のインキュベーションの時間にわたって）処理することによって生成した。有効性をＩＶＲＰによって評価した。ワクチンの免疫原性および誘導された抗体の機能活性をそれぞれ試験するために、脱シアル化ロットを用いて免疫化したマウス由来の血清をＥＬＩＳＡおよびオプソニン作用性アッセイ（ＯＰＫＡ）によって分析した。ワクチンを受けた雌マウスから生まれた仔における防御を試験するために生存実験も行った。

簡単に述べると、ＧＢＳコンジュゲートを、重水素化酢酸ナトリウムを用いて処理することによって脱シアル化した。シアル酸含有量をＮＭＲ技術によってモニターした。全ての調製物について、コンジュゲート３ｍｇ（総糖含有量によって決定する）を真空下で乾燥し（Ｇｅｎｅｖａｃ ｍｏｄ．ＥＺ−２ Ｐｌｕｓ）、重水素化した（Ｄ２Ｏ−Ａｌｄｒｉｃｈ １５１８８２−１００Ｇ Ｌｏｔ＃ＳＴＢＣ０４４６２Ｖ）５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７５（Ｓｉｇｍａ Ｓ８０７５０−５００Ｇ Ｌｏｔ＃０５０Ｍ０２１３Ｖ）３ｍＬに溶解させ、混合物を異なる時間に８０℃でインキュベートし、得られた調製物のアリコートを以下の通り特徴付けた：（１）結合／遊離シアル酸含有量の比率を推定するための１Ｈ ＮＭＲ分析、（２）ガラクトース（Ｇａｌ）決定に基づく糖含有量の推定、（３）タンパク質含有量の決定、（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および（５）キャピラリー電気泳動（データは示していない）。

１００％（天然の処理していない材料）から０％までの異なるＳＡを有する多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの一価ロットをミョウバン中に処方し、１日目および２１日目に５週齢のＣＤ１雌マウスの群に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって投与した。２１日目の２回目の免疫化後、雌を交配し、同じ血清型のＬＤ９０用量のＧＢＳを用いて仔を攻撃した（血清型Ｉａに対してＧＢＳ０９０、血清型Ｉｂに対してＧＢＳ Ｈ３６ｂ、および血清型ＩＩＩに対してＧＢＳ Ｍ７８１）。攻撃後３日間、毎日死亡率を記録した。最後のワクチン注射の２週間後に採取した血清を血清型特異的抗原（Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩ）のそれぞれに対する抗体の存在について分析することにより、ワクチンの免疫原性を試験した。各多糖に対する特異的なＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡによって定量化した。同じワクチンを受けた動物由来の血清のプールに対してオプソニン作用性アッセイ（ＯＰＫＡ）を使用し、新生仔攻撃によって、機能性抗体活性を評価した。

多糖Ｉａ−ＣＲＭ１９７に関しては、１μｇのワクチン用量を用いて免疫化した動物におけるＩｇＧ力価は、天然の多糖と比較して約４分の１の統計的に有意な低下（Ｐ＝０．００６７、マン・ホイットニー検定）が生じた＜５％以外は全ての試料について同様であった。１９％および＜５％（ＯＰＫＡ死滅）ならびに＜５％シアル酸含有量（生存）で抗体の機能活性の低下を認めることができた。ＩＶＲＰの結果に関して、シアル酸含有量が３３％以下の試料の有効性の値は１０分の１未満に低下した（図８）。

多糖Ｉｂ−ＣＲＭ１９７に関しては、５％未満のＳＡを含有する試料ではシアル酸含有量がより高い試料と比較して低いＥＬＩＳＡ力価、ＯＰＫＡ力価および生存が誘導された（図９）。

多糖ＩＩＩ−ＣＲＭ１９７に関しては、６６％未満のＳＡを含有する試料を受けた動物において、ＳＡ含有量がより高い試料を用いて免疫化した動物と比較してＰＳ ＩＩＩに対するＩｇＧ ＧＭＴが有意に高かった（Ｐ＜０．０１ マン・ホイットニー検定）。機能性抗体のレベルは、１μｇ用量の天然の試料を受けた動物と１μｇ用量の脱シアル化された試料を受けた動物で同様であった。しかし、０．２μｇ用量のコンジュゲートを受けた動物ではかなりの差異があり、３９％ＳＡの試料を受けた動物ではＯＰＫＡ力価が著しく低下し、２４％より低いＳＡでは生存率が低かった（図１０）。

試験８
シアル酸成分の寄与を調査するために、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜多糖抗原Ｖを試験した。シアル酸含有量が異なるワクチンロットを調製し、それを使用してマウスを免疫化した。１００％から２５％までの異なるシアル酸含有量を有する多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの一価ロットを、天然のコンジュゲートを弱酸性条件で（例えば、ｐＨ４．７５、８０℃で種々のインキュベーションの時間にわたって）処理することによって生成した。

ＮｅｕＮＡｃの除去は、マウスにおけるワクチン接種後の防御に影響を及ぼすと思われる。これらの実験は、ＮｅｕＮＡｃの含有量が７５％超である多糖Ｖ型コンジュゲートが有用であることを示唆している。

多糖Ｖ−ＣＲＭ１９７脱シアル化多糖コンジュゲートの免疫原性は、その架橋レベルに反比例する。したがって、免疫原性組成物が多糖Ｖ型、特に、脱シアル化多糖を含む場合、タンパク質：多糖の架橋レベルがより低いコンジュゲートが有益であり得る。

本発明は単に例として記載されており、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに改変を行うことができることが理解されよう。

Claims (32)

1. ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｄ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｅ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物。
2. ＧＢＳ莢膜糖の総量が≦７０μｇである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量当たり１〜３０μｇの量で存在する、請求項１または請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. 各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量当たり５μｇ、１０μｇまたは２０μｇの量で存在する、請求項３に記載の免疫原性組成物。
5. 単位用量当たりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＶおよびＩＩＩの莢膜糖の量が、２０μｇ、２０μｇ、２０μｇ、２０μｇおよび２０μｇ；１０μｇ、１０μｇ、１０μｇ、１０μｇおよび１０μｇ；ならびに５μｇ、５μｇ、５μｇ、５μｇおよび５μｇからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
6. 単位用量当たりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＶおよびＩＩＩの莢膜糖の量が、５μｇ、５μｇ、５μｇ、５μｇおよび５μｇである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量当たり０．１〜５μｇの量で存在する、請求項１または請求項２に記載の免疫原性組成物。
8. 各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量当たり０．５μｇ、２．５μｇまたは５μｇの量で存在する、請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. 前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＶおよびＩＩＩの莢膜糖の質量比が１：１：１：１：１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. １つの単位用量を投与し、その後、第１の単位用量の３カ月後に第２の単位用量を投与するためのものである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
11. １つの単位用量を投与し、その後、第１の単位用量の１カ月後に第２の単位用量を投与するためのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
12. 単回用量で投与するためのものである、請求項１〜９および請求項１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. アルミニウム塩アジュバントを含有しない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
14. いかなるアジュバントも含有しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
15. ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）中の前記キャリアタンパク質が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）中の前記キャリアタンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
17. ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の前記莢膜糖が１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の前記莢膜糖が１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の前記莢膜糖が５０〜２００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の前記莢膜糖が１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、そしてＧＢＳ血清型Ｖ由来の前記莢膜糖が１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
18. キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖である前記コンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖である前記コンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖である前記コンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である前記コンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、そしてキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である前記コンジュゲートが、約３：１から１：１の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
19. 筋肉内に投与するためのものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
20. 注射可能な液剤または懸濁物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
21. 凍結乾燥されている、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
22. 前記コンジュゲート（複数可）を安定化するためにマンニトールを含む、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
23. リン酸二水素カリウムバッファを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
24. 塩化ナトリウムを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
25. ワクチンである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
26. ヒトに投与するためのものである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
27. 妊娠可能な年齢の女性、妊婦および高齢の患者から選択されるヒトに投与するためのものである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
28. 妊婦に投与するためのものである、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
29. 投与前に、前記ヒトが、検出不可能なレベルの、ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体、ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する抗体、および／または ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を有する、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
30. 医薬として使用するためのものである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
31. Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患を予防および／または処置するためのものである、請求項３０に記載の免疫原性組成物。
32. 前記疾患が新生児敗血症、菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎または化膿性関節炎である、請求項３１に記載の免疫原性組成物。