JP2015230280A - 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ - Google Patents

Abstract

【課題】より迅速に生体試料に含まれる分析対象物の測定可能とする。
【解決手段】分析対象物の検出は、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって形成された複合物と、第二物質とを反応させることで発生する検出可能なシグナルを測定し、測定した上記シグナルを予め測定したシグナル基準値と比較することで上記分析対象物の濃度を判断する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップに関する。特に、細胞外顆粒を分析対象物として、試料中の細胞外顆粒の濃度を定量的且つ迅速的に測定する方法に好適な技術に関する。

基礎医学の目覚しい進歩により優れた治療薬や先進医療技術が開発されているものの、食生活・生活環境等の様々な要因により、がんや自己免疫疾患、感染症、循環器系疾患等の多種多様な疾患による不安は極めて大きい。こうした不安の解消には疾患の早期発見が重要である。近年、正常細胞およびがん細胞から分泌される細胞外顆粒が病態を示すバイオマーカーとして注目されている。

分泌された細胞外顆粒は、一般的にマイクロベシクルやエクソソームという呼び方をされている。このエクソソームは血液、唾液、汗、尿、精液、リンパ液など生体内のあらゆる試料中に存在している。２００７年にこのエクソソーム中にｍｉｃｒｏＲＮＡが存在することが発見され、新たな細胞間輸送による情報伝達が示唆された（非特許文献１）。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡががんの病態を示していることも示唆されている（非特許文献２）。つまり、エクソソームに含まれるｍｉｃｒｏＲＮＡは疾患特異的な役割を持ち、エクソソームならびエクソソーム中のｍｉｃｒｏＲＮＡを検出することは診断に有用であると示唆され、正常細胞特異的エクソソーム、がん特異的エクソソームなど分泌細胞別エクソソームを迅速かつ簡便に定量測定することにより、早期診断が可能と考えられる。

しかし、エクソソームは直径約４０〜１００ｎｍであるため、試料中から単離するには、超遠心分離法、限外濾過法、クロマトグラフィー法、イムノキャプチャー法など非常に煩雑な手法を用いる必要がある。これらの方法により、一般的にエクソソームを単離し回収したものを測定する場合、装置や煩雑な手法を要する。
上記問題を解決する為、エクソソームを特異的かつ定量的に検出する方法として、エクソソーム表面抗原を認識する抗体を標識したビーズを２種用意し、検出する方法がある（特許文献１）。この手法はアクセプタービーズとドナービーズ２種準備し、それぞれに異なるエクソソーム表面抗原を認識する抗体を標識する。エクソソームが存在していれば、エクソソームを抗原抗体反応で２種のビーズが結合する。その後、ドナービーズを励起することにより一重項酸素がアクセプターに達し、蛍光を発する。この手法は試料とビーズを混合し、反応させ、装置で検出するのみなので操作は簡便かつ定量的に試料中のエクソソームを検出することが可能である。

国際公開２０１３／０９４３０７号

Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ(２００７)９：６５４−６５９ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ（２０１０）１０１：２０８７−２０９２

しかしながら、特許文献１では試料とビーズを混合し反応させるだけで、エクソソームを簡便かつ定量的に測定が可能であるが、蛍光による励起と蛍光検出が必要な為、光学系の専用装置が必須である。その為、専用の装置を導入できない場合、測定が不可能である。
上記方法で試料中に含まれた分析対象物の濃度を測定する際、シグナルを十分に検出するまで待機を要する等、実働における時間制限を要し、迅速な検出においては大きな障害となることがある。このため、簡易であり、より迅速な方法で分析対象物の分析が可能な方法が求められている。

そこで、本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、従来技術と比較して、より迅速に生体試料に含まれる分析対象物の測定可能な検出方法及びその方法を用いたラテラルフロー用テストストリップを提供することを目的とする。

課題を解決するために、本発明の一態様である分析対象物の検出方法は、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって形成された複合物と、第二物質とを反応させることで発生する検出可能なシグナルを測定し、測定した上記シグナルを予め測定したシグナル基準値と比較することで上記分析対象物の濃度を判断することを特徴とする。
また、本発明の一態様であるラテラルフロー用テストストリップは、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部と、前記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部とを備えることを特徴とする。

本発明の一態様であれば、試料に含まれる分析対象物の反応開始後、所定時間における検出シグナルを測定する。
例えば、ラテラルフローアッセイを用いることによって、分泌細胞別エクソソームを簡便に検出でき、エクソソームを対象とした疾患診断が可能となる。

本発明に基づく実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップの基本構造を示す模式図である。

まず、本実施形態で使用される試料と、本実施形態で測定される分析対象物について、具体例を挙げつつ説明する。
（試料について）
本実施形態で使用される試料は、生体試料であって液状のものが好ましい。生体試料は、例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血等である。また、未希釈の試料を測定試料としても、溶媒にて希釈したものを測定試料としても良い。

（分析対象物について）
本実施形態における分析対象物は、例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血のいずれか１つに存在するエクソソームである。以下、これらの分析対象物の具体例について説明する。

（エクソソームについて）
エクソソームは、直径４０〜１００ｎｍでリン脂質二重膜にて形成され、膜にはテトラスパニン類（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１など）、抗原提示タンパク質（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）、ＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ−１、ＴＧＦ−βなど抗原となりうるタンパク質、膜内には核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）やヒートショックタンパク質などが存在している。本発明では、膜に存在している分子に対し、特異的親和性がある物質を使用し検出や単離させる。例えば、膜表面のタンパク質であれば抗原として、タンパク質に特異的親和性のある物質の抗体で検出や単離することができる。

（ラテラルフロー用テストストリップ）
以下、本実施形態に係る分析対象物の濃度測定方法で用いられるラテラルフロー用テストストリップについて説明する。
図１は本実施形態におけるラテラルフロー用テストストリップの基本構造である。
本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１は、試料に含まれる分析対象物を検出して濃度を定量するものであって、試料滴下部材であるサンプルパッド１１、試料が流れる方向に分析対象物に特異的親和性のある第一の検出対象捕捉物質（第一物質）が標識された粒子が乾燥固化されている結合パッド１２、そして分析対象物に特異的親和性のある第二の検出対象捕捉物質（第二物質）が固相化された部位（テストライン１３ａ）と粒子表面の検出対象捕捉物質を認識する捕捉物質が固相化された部位（コントロールライン１３ｂ）を持つ展開膜（メンブレン１３）更にその下流に毛細管現象により浸潤してきた試料を吸収する吸収パッド１４の４種の部材がバッキングシート１０を介して直列に連結されたものである。

結合パッド１２が、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部を構成する。メンブレン１３が、前記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部を構成する。
なお、上述の分析対象物に特異的親和性のある第一物質が標識された粒子は、例えば、平均粒径２０〜１００ｎｍの金コロイド粒子である。また、分析対象物を検出するための第二物質は、例えば、メンブレン１３においては線状に固定化されている。また、ラテラルフロー用テストストリップ１の幅は、例えば、１．５ｍｍ〜５ｍｍであり、サンプルパッド１１に滴下する分析対象物を含む試料の体積は、例えば２５μｌ〜１００μｌである。

本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１は、テストライン１３ａにおいては分析対象物と第一物質との混合物と、第二物質との複合体が形成されることにより、検出強度が分析対象物の濃度依存的に上昇し、コントロールライン１３ｂにおいては第一物質標識粒子が毛細管現象にて流れてきたものを検出するものである。より詳しくは、サンプルパッド１１に試料を滴下した時点から、光学的手法を用いて、第二物質が固定化された部位のシグナルを経時的に検出するものである。
以下、本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１を構成する部材の材料及び構成について、詳細に説明する。

（部材の材料について）
上述の第一物質と第二物質のそれぞれは、例えば、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖質、多糖、低分子化合物、無機物質及びこれらの融合体のいずれか１つである。
また、上述のアミノ酸とポリペプチドのそれぞれは、例えば、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジンのいずれか１つである。

また、上述の核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡのいずれか１つである。
また、上述の第一物質が標識された粒子（第一支持体）は、例えば、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、アルミニウムコロイド、または白金コロイドを含む金属コロイド粒子、または高分子化合物を材料とする粒子である。より詳しくは、高分子化合物を材料とする粒子は、蛍光色素内包粒子または可視色素内包粒子である。

また、蛍光色素内包粒子に内包される蛍光色素は、例えば、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価または三価の鉄、三価または四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素である。

有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物としては、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが例示出来る。

また、上述の第二物質が固定化されたメンブレン１３（第二支持体）は、例えば、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ニトロセルロース、シリコンの樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（商標登録）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス、セラミックス及びその複合体のいずれか１つによって構成される。
なお、上述の第一物質は、化学結合または物理結合によって第一支持体に固定化されている。また、上述の第二物質は、化学結合または物理結合によって第二支持体に固定化されている。

（構造について）
ラテラルフロー用テストストリップ１の形状は、滴下する試料がテストストリップ中を毛細管現象により移動することができる限り、特に制限を受けない。例えば、サンプルパッド１１、結合パッド１２、メンブレン１３、吸水パッドの４部材が、基板となるバッキングシート上にこの順番で一方向に直列連結して固定化された構造が代表的である。各部材をバッキングシートに固定化した後、そのバッキングシートを裁断機で２ｍｍ〜５ｍｍ幅に裁断してテストストリップとするのが好ましい。

以下、ラテラルフロー用テストストリップ１を構成する上記４部材の詳細について説明する。
（１）サンプルパッド
サンプルパッド１１は、滴下された、分析対象物を含む液体試料（生体試料）を一定時間保持する部材である。サンプルパッド１１としては、セルロースを素材としたものを使用するのが好ましく、より詳しくは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐａｄ（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。また、滴下された試料によりｐＨが異なることを鑑み、サンプルパッド１１に緩衝液を浸潤させて乾燥させた後に、そのサンプルパッド１１を使用するのが好ましい。

（２）結合パッド
結合パッド１２は、分析対象物に対する標識粒子が乾燥固化された部材であり、サンプルパッド１１から毛細管現象により移動してきた試料に含まれる分析対象物が抗原抗体反応等の特異的認識反応で上記標識粒子と結合される部分である。結合パッド１２の材質は、ガラス繊維で不織状のものが好ましく、より詳しくは、例えばＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｐａｄ（Millipore社製）等が挙げられる。なお、上述の分析対象物と標識粒子に備わる抗体（第一物質）との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われるものである。

結合パッド１２における単位面積（ｃｍ^２）当たりの上記標識粒子の含有量は、特に制限はないが、１μｇ以上４μｇ以下であることが好ましい。また、結合パッド１２への上記標識粒子の浸潤方法としては、例えば、標識粒子を懸濁させ分散させた液体を、結合パッド１２に塗布、滴下又は噴霧した後に、その結合パッド１２を乾燥させる方法が好ましい。

また、上記標識粒子は、上述の材料の中でも、金属コロイド粒子、蛍光色素粒子、着色ラテックス粒子、アップコンバージョン燐光体粒子、量子ドット粒子等が好ましい。また、上記標識粒子の粒子径は、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。
また、上記標識粒子に備わる抗体としては、上述の抗体の中でも、マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧの他、例えば、ウサギＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ、マウスＩｇＥ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＥ等が好ましい。

（３）メンブレン
メンブレン１３は、上記標識粒子と分析対象物との複合体、上記標識粒子及び試料が毛細管現象によって移動する部材であり、固定化抗体−分析対象物−標識粒子からなる免疫反応が行われる抗体固定化部（テストライン１３ａ）と、固定化抗体−標識粒子からなる免疫反応が行われる抗体固定化部（コントロールライン１３ｂ）とを有している。上述の分析対象物と固定化抗体（第二物質）との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われるものである。

メンブレン１３は、タンパク質を物理吸着可能な素材で構成されたもの、特にニトロセルロースで構成されたものが好ましく、より詳しくは、例えたＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（Millipore社製）等が挙げられる。
上記メンブレン１３における抗体固定化部（判定部）の形状としては、局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、例えば、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。その形状の中でも、幅０．５〜２．０ｍｍのライン状であることが好ましく、また、１ｃｍあたりの抗体量が０．１〜２μｇであることが好ましい。

メンブレン１３に備わる抗体としては、上述の抗体の中でも、マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧの他、例えば、ウサギＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ、マウスＩｇＥ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＥ等が好ましい。例えば、標識粒子にマウスＩｇＧが表面修飾されている場合は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が固定化された抗体固定化部をコントロールライン１３ｂとして用いることができる。また、抗体をメンブレン１３に固定化した後、タンパク質の非特異的吸着を防ぐために、例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤の溶液でそのメンブレン１３を浸潤させた後に乾燥させるのが好ましい。

テストライン１３ａにおいては、固定化抗体−分析対象物−標識粒子からなる免疫反応により、形成された複合体（分析対象物−標識粒子）が捕捉される。そして、このテストライン１３ａで、捕捉された標識粒子に由来する発色又は蛍光等（具体的には、蛍光、発光、呈色、着色等）の強度（シグナル）の程度により分析対象物の有無を判定、すなわち陽性・陰性を判定する。一方、コントロールライン１３ｂにおいては、固定化抗体−標識粒子からなる免疫反応により、試料の移動を確認できる。こうして、抗体固定化部に標識粒子が濃縮され、シグナルを目視的に又は検出機器を用いて検出、判定できる。

（４）吸水パッド
吸水パッドは、毛細管現象でメンブレン１３を移動してきた試料及び標識粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための部材である。吸水パッドの材質としては、セルロース素材の繊維状のものが好ましく、より詳しくは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（Millipore社製）等が挙げられる。

（５）バッキングシート
バッキングシートは、上記のサンプルパッド１１、結合パッド１２、メンブレン１３、吸収パッド１４の４部材を固定化させるための粘着性を有したシートである。バッキングシートとしては、例えばバッキングシートＡＲ９０２０（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。

以下、上記テストライン１３ａで、捕捉された標識粒子に由来するシグナルの検出方法について説明する。
上記テストストリップにおいて、分析対象物と、対象物特異的物質が標識された粒子との反応で生じるシグナル（検出シグナル）は、光学的な方法で検出するのが好ましい。光学的な方法としては、例えば反射光度又は蛍光検出、発光検出、あるいは電気化学発光等が挙げられる。より詳しくは、赤色系／青色系を経時的に検出できる装置としては、イムノクロマトリーダＣ１００６６−１０（浜松ホトニクス社製）等が挙げられる。

次に、測定方法について説明する。上記の通り、分析対象物と対象物特異的物質は免疫学的反応を利用したテストストリップにて検出される。テストストリップにて分析対象物における既知濃度試料を滴下し測定を開始する。一定のシグナルを得るために３０分程度テストストリップを展開させるのが好ましい。
ここで、免疫学的方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法を例示出来る。

本実施形態に係る分析対象物のエクソソームの測定方法はテストストリップを用い、エクソソームと第一物質の反応によって形成された複合物と第二物質とを反応させることで発生する検出可能なシグナルを測定し、予め設定したシグナルの基準値と比較することでエクソソームの濃度を判断するものである。
上述の実施形態では、分析対象物と第一物質との反応は、結合パッド１２で開始される場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。また、上述の実施形態では、複合物と第二物質との反応は、メンブレン１３で開始される場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（１）抗体調製
分析対象物をエクソソーム表面抗原（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）とし、エクソソーム を検出する為、メンブレン１３固相化抗体は抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ Ｍ−Ｌ１３、抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ Ｈ５Ｃ６、抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ ＪＳ８１（以上、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、）を使用した。また、コントロールライン１３ｂは抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｄａｋｏ社）を使用した。この２種の抗体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析カートリッジＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ １０，０００ＭＷＣＯ(商品名、Ｐｉｅｒｃｅ社)にて４℃で透析した。透析後の抗体濃度を測定し、抗エクソソーム表面抗原抗体は１ｍｇ／ｍｌ、抗マウスイムノグロブリンは０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。

（２）金コロイド溶液の調製
上記３種の抗エクソソーム表面抗原抗体を透析し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて６０μｇ／ｍｌに調製し、１ＯＤになるよう調製した金コロイド（粒子径４０ｎｍ，田中貴金属工業社）溶液９ｍｌとリン酸二水素カリウム溶液（ｐＨ８．０）１ｍｌの混合液に本抗体溶液を加えピペッティング後、室温で１５分静置し、１％ＰＥＧ２０，０００溶液、１０％ＢＳＡ 溶液を加え混合した。この混合溶液を８０００×ｇ で１５分遠心分離後上清を廃棄し、結合パッド塗布液を加え攪拌・超音波処理し、再び遠心分離後上清を廃棄した。この操作を計２回繰り返し金コロイド溶液とした。

（３）サンプルパッドの作製
セルロースを素材としたサンプルパッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐａｄ ＃１１１， Ｐａｌｌ社）を１．８ｍｍ×１５０ｍｍに裁断し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ滴下して、５０℃にて１時間乾燥させた。
（４）結合パッドの作製
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに塗布液と金コロイド溶液を加え、２８ｋＨｚで超音波処理後、計９００μｌの金コロイド塗布溶液を１０ｍｍ×１５０ｍｍのガラスファイバーパッド（glass fwiber Pad, millipore社）に滴下し、真空減圧ポンプにて減圧下１８ 時間乾燥した。

（５）メンブレンの作製
メンブレンであるＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０（Milipore社）に抗体塗布機ＸＹＺ３０６０(商品名、BioDot社)にて上記固相化抗体（１）を１μｌ／ｃｍで塗布した。塗布後、０．５％乳性カゼイン溶液でブロッキングし、スクロースや界面活性剤を含む洗浄液にて洗浄・安定化し、一晩室温で乾燥させた。

（６）テストストリップの作製
乾燥させたメンブレン、吸収パッド(CFSP203000,Milipore社)、結合パッド、サンプルパッドをバッキングシート(AdhesiveResearch社)に貼り付け、カッティング機器ＣＭ４０００（商品名、BioDot社）にて５ｍｍ幅で裁断後、ハウジングケースに収め、テストストリップキットとした。
（７）抗原溶液の調製
検出標的であるエクソソームを含む試料は血清を使用した。この抗原溶液を１×ＰＢＳ，５％ＢＳＡ溶液にて、５０％に希釈し測定用抗原溶液とした。血清は全部で８個体分準備した。

（８）テストストリップでの対象物の測定
上記（６）で作製したテストストリップを水平に置き、上記（７）の抗原溶液を1枚のテストストリップあたり１００μl滴下した。滴下開始後、イムノクロマトリーダＣ１００６６（商品名、浜松ホトニクス社）内の測定位置に設置し、反応開始後２０分でデータを取得した。測定データは、テストストリップの展開方向にスキャニングし、テストライン、コントロールラインにおけるピーク中心（Ｈｅｉｇｈｔ：ピークトップ）における強度を測定データとした。

（９）試料中の対象物量の把握
上記（８）の結果から、反応開始後２０分での強度を測定し、テストラインでの強度とテストライン以外の強度比（Ｓ／Ｎ比）を確認した。各検体のＳ／Ｎ比の結果を測定した。Ｓ／Ｎ比を比較したところ５以上となり、このＳ／Ｎ比を達成すればエクソソームの存在を示すことが確認された。

１ ラテラルフロー用テストストリップ
１０ バッキングシート
１１ サンプルパッド
１２ 結合パッド
１３ メンブレン
１３ａ テストライン
１３ｂ コントロールライン
１４ 吸収パッド

Claims (31)

1. 生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって形成された複合物と、第二物質とを反応させることで発生する検出可能なシグナルを測定し、測定した上記シグナルを予め測定したシグナル基準値と比較することで上記分析対象物の濃度を判断することを特徴とする分析対象物の検出方法。
2. 上記測定は、ラテラルフロー用テストストリップを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の分析対象物の検出方法。
3. 上記第二物質は、上記ラテラルフロー用テストストリップを構成するメンブレンの設定位置に固定化されていることを特徴とする請求項２に記載の分析対象物の検出方法。
4. 上記分析対象物と上記第一物質との反応は、両者を混合することで行われることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
5. 上記複合物と上記第二物質との反応は、両者を混合することで行われることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
6. 上記分析対象物と上記第一物質との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
7. 上記複合物と上記第二物質との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
8. 上記免疫学的方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法のいずれか１つを用いて測定可能な方法であることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の分析対象物の検出方法。
9. 上記第一物質は、化学結合または物理結合によって第一支持体に固定化されていることを特徴とする請求項１〜請求項８いずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
10. 上記第一支持体は、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、アルミニウムコロイド、または白金コロイドを含む金属コロイド粒子、または高分子化合物を材料とする粒子であることを特徴とする請求項９に記載の分析対象物の検出方法。
11. 上記高分子化合物を材料とする粒子は、蛍光色素内包粒子または可視色素内包粒子であることを特徴とする請求項１０に記載の分析対象物の検出方法。
12. 上記蛍光色素内包粒子に内包された蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価または三価の鉄、三価または四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素であることを特徴とする請求項１１に記載の分析対象物の検出方法。
13. 上記第二物質は、化学結合または物理結合によって第二支持体に固定化されることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
14. 上記第二支持体は、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ニトロセルロース、シリコンの樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（商標名）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス、セラミックス及びその複合体のいずれか１つによって構成されることを特徴とする請求項１３に記載の分析対象物の検出方法。
15. 上記第一物質と上記第二物質のそれぞれは、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖質、多糖、低分子化合物、無機物質及びこれらの融合体のいずれか１つであることを特徴とする請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
16. 上記アミノ酸と上記ポリペプチドのそれぞれは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジンのいずれか１つであることを特徴とする請求項１５に記載の分析対象物の検出方法。
17. 上記核酸は、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡのいずれか１つであることを特徴とする請求項１５に記載の分析対象物の検出方法。
18. 上記分析対象物は、脂質、炭水化物、タンパク質、抗体、抗原、代謝産物、ホルモン、ウイルス、微生物、細胞、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血のいずれか１つに存在するエクソソームであることを特徴とする請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
19. 上記シグナルは、光学的、電気化学的、磁気化学的手法によって検出可能なものであり、
    上記測定は、光学的、電気化学的、磁気化学的手法を用いた測定であることを特徴とする請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。
20. 生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部と、前記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部とを備えることを特徴とするラテラルフロー用テストストリップ。
21. 上記第二物質は、メンブレンの設定位置に固定化されていることを特徴とする請求項２０に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
22. 上記第一物質は、化学結合または物理結合によって第一支持体に固定化されていることを特徴とする請求項２０又は請求項２１に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
23. 上記第一支持体は、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、アルミニウムコロイド、または白金コロイドを含む金属コロイド粒子、または高分子化合物を材料とする粒子であることを特徴とする請求項２２に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
24. 上記高分子化合物を材料とする粒子は、蛍光色素内包粒子または可視色素内包粒子であることを特徴とする請求項２３に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
25. 上記蛍光色素内包粒子に内包された蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価または三価の鉄、三価または四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素であることを特徴とする請求項２４に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
26. 上記第二物質は、化学結合または物理結合によって第二支持体に固定化されることを特徴とする請求項２０〜請求項２５のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
27. 上記第二支持体は、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ニトロセルロース、シリコンの樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（商標登録）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス、セラミックス及びその複合体のいずれか１つによって構成されることを特徴とする請求項２６に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
28. 上記第一物質と上記第二物質のそれぞれは、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖質、多糖、低分子化合物、無機物質及びこれらの融合体のいずれか１つであることを特徴とする請求項２０〜請求項２７のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
29. 上記アミノ酸と上記ポリペプチドのそれぞれは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジンのいずれか１つであることを特徴とする請求項２８に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
30. 上記核酸は、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡのいずれか１つであることを特徴とする請求項２８に記載のラテラルフロー用テストストリップ。
31. 上記分析対象物は、脂質、炭水化物、タンパク質、抗体、抗原、代謝産物、ホルモン、ウイルス、微生物、細胞、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血のいずれか１つに存在するエクソソームであることを特徴とする請求項２０〜請求項３０のいずれか１項に記載のラテラルフロー用テストストリップ。

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