JP2015198645A - Method for producing cell structure - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞シートの形態のような細胞構造体の作製方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a cell structure such as a cell sheet.
再生医療分野では、患者から採取した細胞を生体外で培養し、シート形状の細胞構造体（以下、「細胞シート」とも記載する）を作製した上で、該細胞シートを患者の生体内へ移植する技術が開発されている。特に、近年では、高齢化の進展に伴い、軟骨細胞由来の細胞構造体を用いる再生医療用途の製品に対する関心が高まっている。 In the field of regenerative medicine, cells collected from a patient are cultured in vitro to produce a sheet-shaped cell structure (hereinafter also referred to as “cell sheet”), and then the cell sheet is transplanted into the patient's living body. Technology has been developed. In particular, in recent years, with the progress of aging, interest in products for regenerative medicine using cell structures derived from chondrocytes is increasing.
例えば、特許文献1は、インビトロで培養され、移植対象細胞を含むと共に培養後に生体へ移植可能な三次元構造の移植用組織等価物において、三次元構造を構築する細胞培養担体により主として構成される担体層と、前記移植用組織等価物の表面の少なくとも一部に、前記担体層に連続して局在し、前記担体層よりも前記移植対象細胞又は細胞基質が豊富な細胞層と、を備えたことを特徴とする移植用組織等価物を記載する。当該文献は、前記細胞として、軟骨細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞を記載する。 For example, Patent Document 1 is mainly composed of a cell culture carrier that constructs a three-dimensional structure in a tissue equivalent of a three-dimensional structure that is cultured in vitro and includes cells to be transplanted and can be transplanted into a living body after culture. A carrier layer, and a cell layer that is continuously localized on the carrier layer on at least a part of the surface of the tissue equivalent for transplantation and that is richer in the cells to be transplanted or cell matrix than the carrier layer. A tissue equivalent for transplantation is described. This document describes chondrocytes, osteoblasts or their precursor cells as the cells.
細胞構造体は、通常は、シャーレ又はフラスコのような細胞培養容器の底面に細胞を播種し、次いで該底面上で該細胞を培養して細胞構造体を形成させることによって作製される。前記作製方法の場合、形成された細胞構造体は、細胞から分泌される接着分子を介して細胞培養容器の底面と強固に結合する。このため、形成された細胞構造体を回収するために、該細胞構造体を細胞培養容器の底面から剥離する必要がある。前記剥離処理としては、トリプシンのような酵素又は薬剤で細胞構造体を処理することによって接着分子を切断する方法が知られている。また、前記剥離処理として、外部刺激に応答して細胞接着性が変化する材料を用いる方法も開発されている。 The cell structure is usually produced by seeding cells on the bottom surface of a cell culture container such as a petri dish or flask, and then culturing the cells on the bottom surface to form a cell structure. In the case of the production method, the formed cell structure is firmly bonded to the bottom surface of the cell culture container via an adhesion molecule secreted from the cell. For this reason, in order to collect | recover the formed cell structure, it is necessary to peel this cell structure from the bottom face of a cell culture container. As the peeling treatment, there is known a method of cleaving an adhesion molecule by treating a cell structure with an enzyme or a drug such as trypsin. In addition, a method using a material whose cell adhesion changes in response to an external stimulus has been developed as the peeling treatment.
例えば、特許文献2は、細胞培養方法であって、接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備する準備工程と、該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性化した第２の細胞を播種する播種工程と、前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に引き付ける磁気誘導工程と、該磁気誘導工程によって得られた細胞配置状態で前記第１の細胞及び第２の細胞を培養する培養工程、とを備える、細胞培養方法を記載する。 For example, Patent Document 2 is a cell culturing method, which comprises preparing a first cell that is an adhesion-dependent cell and is monolayered or layered on the culture surface of a culture substrate; A seeding step of seeding a second cell, which is an adhesion-dependent cell and magnetized, and a magnetic induction step of attracting the second cell to the first cell by a magnetic force. And a culture step of culturing the first cell and the second cell in a cell arrangement state obtained by the magnetic induction step.
特許文献3は、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した細胞培養基材上で、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞から選択される1種類またはそれ以上の種類の細胞を培養し、（1）培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、（2）培養した培養細胞シートをキャリアとしての支持膜に密着させ、（3）そのままキャリアと共に剥離し、（4）工程（3）で得られたキャリアに密着した培養細胞シートを、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した別の細胞培養基材上で培養された別の細胞シート上に密着させ、（5）前記（1）〜（4）の操作を繰り返すことを特徴とする、積層化培養細胞シートの製造方法を記載する。 Patent Document 3 describes a chondrocyte, a cartilage progenitor cell, a synovial cell, a synovial membrane on a cell culture substrate whose surface is coated with a temperature-responsive polymer whose upper or lower critical dissolution temperature in water is 0 to 80 ° C. One or more types of cells selected from stem cells, osteoblasts, mesenchymal stem cells, adipose-derived cells, and adipose-derived stem cells are cultured. (1) The culture solution temperature is higher than the upper critical solution temperature or lower critical temperature (2) The cultured cell sheet that has been cultured is closely attached to the support membrane as a carrier, (3) is peeled off with the carrier as it is, and (4) the cultured cell sheet that is closely attached to the carrier obtained in step (3) Is adhered to another cell sheet cultured on another cell culture substrate whose surface is coated with a temperature-responsive polymer whose upper or lower critical dissolution temperature in water is 0 to 80 ° C., (5) (1) to (4) A method for producing a laminated cultured cell sheet, characterized by repeating the operation, is described.
従来技術の細胞構造体の作製方法においては、細胞構造体の形成、及び形成された細胞構造体の回収で改善すべき点が存在した。例えば、特許文献1に記載の方法の場合、三次元構造を有する細胞構造体を形成させる工程が煩雑であるため、細胞構造体の作製に時間を要する可能性がある。また、特許文献2及び3に記載の方法の場合、使用される刺激応答性材料が高価であるため、製造コストが高くなる可能性がある。 In the conventional method for producing a cell structure, there is a point to be improved in the formation of the cell structure and the recovery of the formed cell structure. For example, in the case of the method described in Patent Document 1, since the process of forming a cell structure having a three-dimensional structure is complicated, it may take time to produce the cell structure. In addition, in the case of the methods described in Patent Documents 2 and 3, since the stimulus-responsive material used is expensive, the production cost may increase.
それ故、本発明は、高価な材料を使用することなく、且つ単純な工程で、細胞構造体を効率的に作製する手段を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a means for efficiently producing a cell structure without using an expensive material and by a simple process.
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、軟骨細胞のような、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、特定の条件で培養することにより、強固な細胞間接着を有する細胞構造体が形成されることを見出した。また、本発明者らは、タンパク質分解酵素を用いる酵素処理によって、実質的に損傷を生じることなく、前記細胞構造体を細胞培養容器の培養面から容易に剥離し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。 As a result of various investigations of means for solving the above problems, the present inventors have identified a cell having the ability to produce type II collagen that is substantially maintained in a differentiated state, such as a chondrocyte. It was found that by culturing under conditions, a cell structure having strong cell-cell adhesion was formed. In addition, the present inventors have found that the cell structure can be easily detached from the culture surface of the cell culture container without substantial damage by enzyme treatment using a proteolytic enzyme. Based on the above findings, the present inventors have completed the present invention.
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（1） 実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、アスコルビン酸を含有する培養液中で培養して、細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程；
前記細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体を酵素処理して、該細胞構造体を取得する、酵素処理工程；
を含む、細胞構造体の作製方法。
（2） 前記II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞が、全体としてII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞の集団であって、該細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合が30％以上である、前記（1）に記載の細胞構造体の作製方法。
（3） 前記細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合が88％以上である、前記（2）に記載の細胞構造体の作製方法。
（4） 前記細胞構造体形成工程において、前記細胞を少なくとも80％コンフルエントの状態となるまで培養する、前記（1）〜（3）のいずれかに記載の細胞構造体の作製方法。
（5） 前記細胞が、軟骨細胞である、前記（1）〜（4）のいずれかに記載の細胞構造体の作製方法。
（6） 前記細胞構造体が、シート状の形態である、前記（1）〜（5）のいずれかに記載の細胞構造体の作製方法。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A cell structure formation step in which cells having the ability to produce type II collagen that is substantially maintained in a differentiated state are cultured in a culture solution containing ascorbic acid to form a cell structure. ;
An enzyme treatment step of obtaining the cell structure by subjecting the cell structure formed in the cell structure formation step to an enzyme treatment;
A method for producing a cell structure, comprising:
(2) The cells having the ability to produce type II collagen are a population of cells having the ability to produce type II collagen as a whole, and produce type II collagen relative to the total number of cells in the population of cells. The method for producing a cell structure according to (1) above, wherein the ratio of the number of cells having ability is 30% or more.
(3) The method for producing a cell structure according to (2), wherein the ratio of the number of cells capable of producing type II collagen to the total number of cells in the cell population is 88% or more.
(4) The method for producing a cell structure according to any one of (1) to (3), wherein, in the cell structure formation step, the cells are cultured until they are at least 80% confluent.
(5) The method for producing a cell structure according to any one of (1) to (4), wherein the cells are chondrocytes.
(6) The method for producing a cell structure according to any one of (1) to (5), wherein the cell structure is in a sheet form.
本発明により、高価な材料を使用することなく、且つ単純な工程で、細胞構造体を効率的に作製する手段を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide means for efficiently producing a cell structure without using an expensive material and in a simple process.
＜1. 細胞構造体の作製方法＞
本発明は、細胞構造体の作製方法に関する。本発明の細胞構造体の作製方法は、細胞構造体形成工程、及び酵素処理工程を含むことが必要である。以下、各工程について、詳細に説明する。
<1. Production method of cell structure>
The present invention relates to a method for producing a cell structure. The method for producing a cell structure of the present invention needs to include a cell structure formation step and an enzyme treatment step. Hereinafter, each step will be described in detail.
［1-1. 細胞構造体形成工程］
本発明の方法は、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、アスコルビン酸を含有する培養液中で培養して、細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程を含むことが必要である。
[1-1. Cell structure formation process]
The method of the present invention is a cell structure in which cells having the ability to produce type II collagen that is substantially maintained in a differentiated state are cultured in a culture medium containing ascorbic acid to form a cell structure. It is necessary to include a body forming step.
本工程において培養に使用される細胞は、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞であることが必要である。コラーゲンは、哺乳動物をはじめとする多細胞生物の細胞から分泌される接着性のタンパク質であって、フィブロネクチン、ヒドロネクチン、オステオネクチン及びプロテオグリカン等の糖タンパク質とともに細胞外マトリクスの主要成分であることが知られている。コラーゲンは、多種類のタンパク質スーパーファミリーからなり、それぞれ、I型、II型、III型、…等のように分類される。各型のコラーゲン分子は、それぞれ3本の同種又は異種ポリペプチド鎖からなる。各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、異なる型のコラーゲン分子間で多様性を有しており、この多様性に基づき、各型のコラーゲン分子はそれぞれ異なる特性を示す。本発明者らは、II型コラーゲンを豊富に産生する能力を有する細胞である軟骨細胞由来の細胞構造体は、その細胞間接着が、細胞培養容器の表面との接着と比較して非常に強固であることを見出した。前記の結果は、細胞間接着を形成する主要成分であるII型コラーゲンが、I型コラーゲンのような他のコラーゲン分子及び他の細胞外マトリクス成分と比較して、トリプシンのような高い酵素活性を有するタンパク質分解酵素に対する耐性が高いことに起因すると考えられる。それ故、本工程において、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を用いることにより、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することができる。また、これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 The cells used for culture in this step need to be cells having the ability to produce type II collagen. Collagen is an adhesive protein secreted from cells of multicellular organisms including mammals, and is a major component of the extracellular matrix together with glycoproteins such as fibronectin, hydronectin, osteonectin and proteoglycan. Are known. Collagen consists of many types of protein superfamily, and is classified as type I, type II, type III,. Each type of collagen molecule consists of three homologous or heterologous polypeptide chains. The amino acid sequence of each polypeptide chain has diversity among different types of collagen molecules, and each type of collagen molecule exhibits different properties based on this diversity. The present inventors have found that cell structures derived from chondrocytes, which are cells capable of producing abundant type II collagen, have a very strong intercellular adhesion compared to adhesion to the surface of a cell culture container. I found out. The above results show that type II collagen, which is the main component that forms cell-cell adhesion, has higher enzyme activity like trypsin compared to other collagen molecules like type I collagen and other extracellular matrix components. This is considered to be due to the high resistance to the proteolytic enzyme possessed. Therefore, in this step, a cell structure having strong intercellular adhesion can be formed by using cells having the ability to produce type II collagen. Thereby, in the enzyme treatment step described below, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
本工程において使用されるII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞としては、限定するものではないが、例えば、軟骨細胞を挙げることができる。また、眼球の硝子体においても、II型コラーゲンの発現が確認されている。軟骨細胞は、細胞外マトリクスの成分としてII型コラーゲンを豊富に産生する。それ故、本工程において、前記細胞をII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞として用いることにより、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することができる。また、これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 Examples of cells having the ability to produce type II collagen used in this step include, but are not limited to, chondrocytes. Expression of type II collagen has also been confirmed in the vitreous body of the eyeball. Chondrocytes produce abundant type II collagen as a component of the extracellular matrix. Therefore, in this step, by using the cells as cells having the ability to produce type II collagen, a cell structure having strong intercellular adhesion can be formed. Thereby, in the enzyme treatment step described below, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
本発明において、「II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞」は、本明細書で定義されるII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞自体を意味するだけでなく、全体としてII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞の集団も包含する。後者の場合、例えば、細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合（％）が、通常は30％以上であり、例えば50％以上であり、特に88％以上である。前記割合（％）は、通常は30〜100％の範囲であり、60〜100％の範囲であることが好ましく、70〜100％の範囲であることがより好ましく、80〜100％の範囲であることがさらに好ましく、88〜100％の範囲であることがさらにより好ましく、90〜100％の範囲であることがとりわけ好ましく、100％であることが特に好ましい。前記割合が下限値未満の場合、細胞の集団におけるII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数が少なくなり、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することが困難となる可能性がある。このような場合、以下において説明する酵素処理工程において、細胞同士が解離する可能性がある。それ故、前記の特徴を有する細胞を用いることにより、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することができる。また、これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 In the present invention, the “cell having the ability to produce type II collagen” not only means the cell itself having the ability to produce type II collagen as defined herein, but also produces type II collagen as a whole. A population of cells having the ability to In the latter case, for example, the ratio (%) of the number of cells capable of producing type II collagen to the total number of cells in the population of cells is usually 30% or more, for example 50% or more, in particular 88 % Or more. The ratio (%) is usually in the range of 30 to 100%, preferably in the range of 60 to 100%, more preferably in the range of 70 to 100%, and in the range of 80 to 100%. More preferably, it is even more preferably in the range of 88-100%, particularly preferably in the range of 90-100%, particularly preferably 100%. When the ratio is less than the lower limit, the number of cells having the ability to produce type II collagen in the cell population decreases, and it may be difficult to form a cell structure having strong intercellular adhesion. . In such a case, cells may be dissociated in the enzyme treatment step described below. Therefore, a cell structure having strong cell-to-cell adhesion can be formed by using cells having the above characteristics. Thereby, in the enzyme treatment step described below, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
なお、II型コラーゲンを産生する能力は、限定するものではないが、例えば、抗II型コラーゲン抗体を用いる免疫染色法により、対象の細胞又は細胞の集団におけるII型コラーゲンの発現を評価する方法、抗II型コラーゲン抗体を用いるウェスタンブロッティング法により、対象の細胞又は細胞の集団が産生するタンパク質中のII型コラーゲンの発現を評価する方法、或いはRT-PCR法により、対象の細胞又は細胞の集団におけるII型コラーゲン遺伝子の発現を評価する方法により、決定することができる。また、対象の細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合（％）は、例えば、免疫染色法又はフローサイトメトリー法により、対象の細胞又は細胞の集団におけるII型コラーゲンを産生している細胞の割合を直接算出する方法により、決定することができる。或いは、前記割合は、抗II型コラーゲン抗体及び抗I型コラーゲン抗体を用いるウェスタンブロッティング法によって算出される、対象の細胞又は細胞の集団が産生するタンパク質中のII型コラーゲン及びI型コラーゲンの発現量の比、又はRT-PCR法によって算出される、対象の細胞又は細胞の集団におけるII型コラーゲン遺伝子及びI型コラーゲン遺伝子の発現量の比に基づき、決定することができる。 In addition, the ability to produce type II collagen is not limited, for example, a method for evaluating the expression of type II collagen in a target cell or a population of cells by immunostaining using an anti-type II collagen antibody, A method of evaluating the expression of type II collagen in a protein produced by a target cell or population of cells by Western blotting using an anti-type II collagen antibody, or a target cell or population of cells by RT-PCR It can be determined by a method for evaluating the expression of type II collagen gene. The ratio (%) of the number of cells having the ability to produce type II collagen to the total number of cells in the target cell population is determined by, for example, immunostaining or flow cytometry. It can be determined by a method for directly calculating the proportion of cells producing type II collagen. Alternatively, the ratio is calculated by Western blotting using anti-type II collagen antibody and anti-type I collagen antibody, and the expression level of type II collagen and type I collagen in the protein produced by the target cell or cell population Or the ratio of the expression level of the type II collagen gene and type I collagen gene in the target cell or population of cells calculated by the RT-PCR method.
本工程において培養に使用される細胞は、実質的に分化状態を維持している細胞であることが必要である。本発明において、「実質的に分化状態を維持している」とは、対象となる細胞が、該細胞を単離した時点の組織又は器官が有する分化の特徴を実質的に発現していること、すなわち、対象となる細胞が、単離時点の分化状態から実質的に脱分化していない状態を意味する。前記分化の特徴は、形態学的特徴、生化学的特徴、分子生物学的特徴、及び電気生理学的特徴からなる群より選択される少なくともいずれかの特徴であることが好ましい。前記分化の特徴が形態学的特徴の場合、該特徴の発現は、対象となる細胞を単離した時点の組織又は器官における特有の形態を維持しているか否かを観察することにより、決定することができる。前記分化の特徴が生化学的特徴の場合、対象となる細胞を単離した時点の組織又は器官に特有のタンパク質等の生合成若しくは代謝産物を定性的又は定量的に検出することにより、決定することができる。前記分化の特徴が分子生物学的特徴の場合、対象となる細胞を単離した時点の組織又は器官に特有の遺伝子の発現を定性的又は定量的に検出することにより、決定することができる。例えば、軟骨細胞の場合、実質的に分化状態を維持していることは、II型コラーゲンの産生能力のような、軟骨細胞に特有の生化学的特徴に基づき、決定することが好ましい。軟骨細胞の場合、初代培養細胞ではII型コラーゲンを豊富に産生するが、該初代培養細胞を数代に亘って継代した継代培養細胞系では、II型コラーゲンの産生が実質的に抑制され、I型コラーゲンの産生量が増加することが知られている（Hamahashiら, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 出版中, 2012年）。それ故、II型コラーゲンの産生能力を指標とすることにより、軟骨細胞が実質的に分化状態を維持していることを確認することができる。 The cell used for culture in this step needs to be a cell that substantially maintains a differentiated state. In the present invention, “substantially maintaining a differentiated state” means that the target cell substantially expresses the differentiation characteristics of the tissue or organ at the time of isolation of the cell. That is, it means a state in which the subject cells are not substantially dedifferentiated from the differentiated state at the time of isolation. The differentiation characteristic is preferably at least one characteristic selected from the group consisting of morphological characteristics, biochemical characteristics, molecular biological characteristics, and electrophysiological characteristics. When the differentiation characteristic is a morphological characteristic, the expression of the characteristic is determined by observing whether or not the characteristic morphology in the tissue or organ at the time of isolation of the target cell is maintained. be able to. When the differentiation characteristic is a biochemical characteristic, it is determined by qualitatively or quantitatively detecting a biosynthesis or metabolite such as a protein peculiar to a tissue or an organ at the time of isolation of a target cell. be able to. When the differentiation characteristic is a molecular biological characteristic, it can be determined by qualitatively or quantitatively detecting the expression of a gene peculiar to the tissue or organ at the time of isolation of the target cell. For example, in the case of chondrocytes, it is preferable to determine that a substantially differentiated state is maintained based on biochemical characteristics unique to chondrocytes, such as the ability to produce type II collagen. In the case of chondrocytes, primary cultured cells produce abundant type II collagen, but in subcultured cell systems in which the primary cultured cells have been passaged for several generations, type II collagen production is substantially suppressed. It is known that the production amount of type I collagen increases (Hamahashi et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, published, 2012). Therefore, it can be confirmed that chondrocytes substantially maintain a differentiated state by using the type II collagen production ability as an index.
本発明において、「実質的に分化状態を維持している細胞」は、本明細書で定義される実質的に分化状態を維持している細胞自体を意味するだけでなく、全体として実質的に分化状態を維持している細胞の集団も包含する。後者の場合、例えば、細胞の集団における細胞の総数に対する、実質的に分化状態を維持している細胞数の割合（％）が、通常は30％以上であり、例えば50％以上であり、特に88％以上である。前記割合（％）は、通常は30〜100％の範囲であり、60〜100％の範囲であることが好ましく、70〜100％の範囲であることがより好ましく、80〜100％の範囲であることがさらに好ましく、88〜100％の範囲であることがさらにより好ましく、90〜100％の範囲であることがとりわけ好ましく、100％であることが特に好ましい。前記割合が下限値未満の場合、細胞の集団における実質的に分化状態を維持している細胞数が少なくなり、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することが困難となる可能性がある。このような場合、以下において説明する酵素処理工程において、細胞同士が解離する可能性がある。それ故、前記の特徴を有する細胞を用いることにより、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することができる。また、これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 In the present invention, “a cell that substantially maintains a differentiated state” not only means the cell itself that is substantially maintained in a differentiated state as defined herein, but also substantially as a whole. Also encompassed are populations of cells that maintain a differentiated state. In the latter case, for example, the ratio (%) of the number of cells substantially maintaining a differentiated state to the total number of cells in the population of cells is usually 30% or more, for example 50% or more, More than 88%. The ratio (%) is usually in the range of 30 to 100%, preferably in the range of 60 to 100%, more preferably in the range of 70 to 100%, and in the range of 80 to 100%. More preferably, it is even more preferably in the range of 88-100%, particularly preferably in the range of 90-100%, particularly preferably 100%. When the ratio is less than the lower limit, the number of cells substantially maintaining a differentiated state in the cell population is reduced, and it may be difficult to form a cell structure having strong intercellular adhesion. is there. In such a case, cells may be dissociated in the enzyme treatment step described below. Therefore, a cell structure having strong cell-to-cell adhesion can be formed by using cells having the above characteristics. Thereby, in the enzyme treatment step described below, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
本工程において使用される細胞は、本明細書で定義される、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞の範囲内であれば、細胞の由来は特に限定されない。本工程において使用される細胞は、前記組織又は器官から直接採取した初代培養細胞でもよく、該初代培養細胞を数代に亘って継代した継代培養細胞系であってもよい。或いは、胚性幹細胞（ES細胞）、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。或いは、一旦脱分化した後、再分化した細胞であってもよく、脱分化を抑制することで実質的に分化状態を維持している細胞であってもよい。細胞が由来する生物種も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ラット、マウス、ウシ、ウサギ又はヒツジ等の動物に由来する細胞であればよい。いずれに由来する細胞であっても、本工程で使用することができる。 As long as the cells used in this step are within the range of cells having the ability to produce type II collagen that is substantially in a differentiated state as defined herein, the origin of the cells is particularly limited. Not. The cells used in this step may be primary cultured cells collected directly from the tissue or organ, or may be a subcultured cell system obtained by subculturing the primary cultured cells for several generations. Alternatively, embryonic stem cells (ES cells), pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells having unipotency, or induced pluripotent stem cells (iPS) A cell derived from a stem cell such as a cell) may be used. Alternatively, it may be a cell that has been once dedifferentiated and then re-differentiated, or may be a cell that substantially maintains a differentiated state by suppressing dedifferentiation. The biological species from which the cells are derived is not particularly limited as long as it is derived from animals such as humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, rats, mice, cows, rabbits or sheep. Good. Any cell derived from these can be used in this step.
本工程において使用される細胞は、本明細書で定義される、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞に包含される1種類の細胞又は細胞の集団からなっていてもよく、前記定義に包含される2種類以上の細胞又は細胞の集団からなっていてもよい。いずれの場合も、本発明の実施形態に包含される。 The cells used in this step are from a single cell or population of cells encompassed by a cell having the ability to produce type II collagen that is substantially differentiated as defined herein. It may be composed of two or more types of cells or a group of cells included in the above definition. Either case is included in the embodiment of the present invention.
本工程において、本明細書で定義される実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、アスコルビン酸を含有する培養液中で培養することが必要である。アスコルビン酸は、細胞におけるコラーゲンの生合成に関与していることが知られている（Danielら, Journal of Cell Biology, 第99巻, p. 1960-1969, 1984年）。このため、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、アスコルビン酸を含有する培養液中で培養することにより、II型コラーゲンが産生されて、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成することができる。また、これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 In this step, it is necessary to culture cells having the ability to produce type II collagen that is substantially maintained in a differentiated state as defined herein in a culture medium containing ascorbic acid. Ascorbic acid is known to be involved in collagen biosynthesis in cells (Daniel et al., Journal of Cell Biology, Vol. 99, p. 1960-1969, 1984). For this reason, by culturing cells having the ability to produce type II collagen in a culture medium containing ascorbic acid, type II collagen is produced and a cell structure having strong intercellular adhesion is formed. be able to. Thereby, in the enzyme treatment step described below, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
本工程において使用されるアスコルビン酸は、アスコルビン酸自体だけでなく、細胞培養分野で通常使用される、薬学的に許容されるその塩若しくは誘導体、又はそれらの溶媒和物の形態であってもよい。いずれの場合も、本工程において使用されるアスコルビン酸に包含される。薬学的に許容されるアスコルビン酸の塩を形成し得る対イオンとしては、限定するものではないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン若しくはマグネシウムイオン、亜鉛イオン、モリブデンイオン、クロムイオン、マンガンイオン若しくはリン酸イオンのような無機イオン、アンモニウムイオン、又はトリエチルアミン、ジエチルアミンのような有機塩基のイオンが好ましい。薬学的に許容されるアスコルビン酸の誘導体としては、限定するものではないが、例えば、アスコルビン酸2-リン酸エステル、アスコルビン酸2-硫酸エステル、2-O-α-D-グルコピラノシルアスコルビン酸、アスコルビン酸パルミチン酸エステル、アスコルビン酸-2-リン酸-6-パルミチン酸、又はアスコルビン酸-2-グルコシド等が好ましい。前記アスコルビン酸の誘導体は、前記で挙げた対イオンとの塩の形態であってもよい。薬学的に許容されるアスコルビン酸又はその塩若しくは誘導体の溶媒和物を形成し得る溶媒としては、限定するものではないが、例えば、水、又はメタノール、エタノール、2-プロパノール（イソプロピルアルコール）、ジメチルスルホキシド（DMSO）若しくはエタノールアミンのような有機溶媒が好ましく、水がより好ましい。前記で定義されるアスコルビン酸、及び薬学的に許容されるその塩若しくは誘導体、又はそれらの溶媒和物の立体化学は、特に限定されないが、アスコルビン酸部分がL-型の絶対立体配置を有することが好ましい。前記アスコルビン酸の誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物は、アスコルビン酸自体と比較して、生体内における安定性が高い。それ故、前記アスコルビン酸の誘導体の形態のアスコルビン酸を使用することにより、培養中のアスコルビン酸の分解を実質的に抑制することができる。 The ascorbic acid used in this step may be in the form of not only ascorbic acid itself but also a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof or a solvate thereof, which is usually used in the field of cell culture. . In either case, it is included in the ascorbic acid used in this step. Counterions that can form pharmaceutically acceptable salts of ascorbic acid include, but are not limited to, sodium ions, potassium ions, calcium ions or magnesium ions, zinc ions, molybdenum ions, chromium ions, manganese, for example. Inorganic ions such as ions or phosphate ions, ammonium ions, or ions of organic bases such as triethylamine and diethylamine are preferred. Examples of pharmaceutically acceptable derivatives of ascorbic acid include, but are not limited to, ascorbic acid 2-phosphate ester, ascorbic acid 2-sulfate ester, 2-O-α-D-glucopyranosyl ascorbine Acid, ascorbic acid palmitic acid ester, ascorbic acid-2-phosphate-6-palmitic acid, or ascorbic acid-2-glucoside is preferable. The derivative of ascorbic acid may be in the form of a salt with the counter ion mentioned above. Solvents that can form pharmaceutically acceptable solvates of ascorbic acid or a salt or derivative thereof include, but are not limited to, for example, water, methanol, ethanol, 2-propanol (isopropyl alcohol), dimethyl Organic solvents such as sulfoxide (DMSO) or ethanolamine are preferred, and water is more preferred. The stereochemistry of ascorbic acid as defined above and pharmaceutically acceptable salts or derivatives thereof, or solvates thereof is not particularly limited, but the ascorbic acid moiety has an absolute configuration of L-type. Is preferred. The derivative of ascorbic acid or a salt thereof, or a solvate thereof has higher in vivo stability than ascorbic acid itself. Therefore, by using ascorbic acid in the form of the derivative of ascorbic acid, the degradation of ascorbic acid during culture can be substantially suppressed.
本工程において使用されるアスコルビン酸は、培養液中の濃度として、500 μM以下の濃度であることが好ましく、5〜500 μMの範囲の濃度であることがより好ましく、5〜250 μMの範囲の濃度であることがさらに好ましい。アスコルビン酸は、培養液中に高濃度で存在する場合、細胞の増殖に好ましくない影響を与える可能性がある。例えば、間葉系幹細胞の場合、500 μMのアスコルビン酸存在下で培養すると、増殖が抑制されることが知られている（Choiら, J. Biosci and Bioeng, 第105巻, p. 586-594, 2008年）。また、線維芽細胞の場合、2000 μM以下の濃度では、アスコルビン酸が細胞毒性を発現しないことが知られている（Schmidtら, J. Biomed Mater Res, 第27巻, p. 521-530, 1993年）。それ故、前記濃度のアスコルビン酸存在下で細胞を培養することにより、細胞の増殖に好ましくない影響を与えることなく、細胞構造体を形成させることができる。 Ascorbic acid used in this step is preferably 500 μM or less, more preferably in the range of 5 to 500 μM, and more preferably in the range of 5 to 250 μM. More preferably, it is a concentration. Ascorbic acid can adversely affect cell growth if present in high concentrations in the culture medium. For example, in the case of mesenchymal stem cells, proliferation is known to be suppressed when cultured in the presence of 500 μM ascorbic acid (Choi et al., J. Biosci and Bioeng, Vol. 105, p. 586-594). , 2008). In the case of fibroblasts, it is known that ascorbic acid does not express cytotoxicity at a concentration of 2000 μM or less (Schmidt et al., J. Biomed Mater Res, Vol. 27, p. 521-530, 1993). Year). Therefore, by culturing cells in the presence of the ascorbic acid at the above concentration, a cell structure can be formed without adversely affecting cell growth.
本工程において、細胞を培養する細胞培養容器は、特に限定されない。当該技術分野で通常使用されるディッシュ型、プレート型又はフラスコ型等の各種形状の細胞培養容器を使用することができる。前記細胞培養容器の内部の表面の少なくとも一部は、細胞接着性であることが好ましい。本明細書において、細胞培養容器の内部の表面を、「培養面」と記載する場合がある。内部の表面の少なくとも一部が細胞接着性である細胞培養容器を用いることにより、細胞接着性である培養面に、細胞構造体を形成させることができる。底部表面の略全体が細胞接着性である細胞培養容器を用いることが好ましい。従来技術において、外部刺激に応答して培養面の表面特性が細胞接着性から細胞非接着性に変化する細胞培養容器が知られている（例えば、特許第4322253号公報又は特許第4921353号公報を参照）。しかしながら、以下において説明するように、本発明の方法は、タンパク質分解酵素を用いる酵素処理によって、実質的に損傷を生じることなく、細胞接着性である培養面から、細胞構造体を容易に剥離することができる。このため、本工程において使用される細胞培養容器は、刺激応答性材料のような特殊な材料を用いる必要がない。それ故、本発明の方法を実施することにより、当該技術分野で使用される一般的な細胞培養容器を用いて、細胞構造体を容易に作製することができる。また、本発明の方法では、底部表面の略全体が細胞接着性である細胞培養容器を用いる場合であっても、細胞構造体を確実に剥離することができる。それ故、寸法の大きい細胞構造体を容易に作製することができる。 In this step, the cell culture vessel for culturing cells is not particularly limited. Various types of cell culture containers of various shapes such as a dish type, a plate type, or a flask type that are usually used in the art can be used. It is preferable that at least a part of the inner surface of the cell culture container is cell adhesive. In the present specification, the internal surface of the cell culture container may be referred to as a “culture surface”. By using a cell culture vessel in which at least a part of the inner surface is cell-adhesive, a cell structure can be formed on the culture surface that is cell-adhesive. It is preferable to use a cell culture vessel in which substantially the entire bottom surface is cell-adhesive. In the prior art, cell culture containers in which the surface characteristics of the culture surface change from cell adhesiveness to cell nonadhesiveness in response to an external stimulus are known (for example, Japanese Patent No. 4322253 or Japanese Patent No. 4921353). reference). However, as described below, the method of the present invention easily peels cell structures from a culture surface that is cell-adhesive without substantial damage by enzymatic treatment using a proteolytic enzyme. be able to. For this reason, the cell culture container used in this step does not need to use a special material such as a stimulus-responsive material. Therefore, by carrying out the method of the present invention, a cell structure can be easily prepared using a general cell culture vessel used in the art. Further, in the method of the present invention, the cell structure can be reliably peeled even when a cell culture vessel in which substantially the entire surface of the bottom portion is cell adhesive is used. Therefore, a cell structure having a large size can be easily produced.
本発明において、「細胞接着性」及び「細胞非接着性」は、一の表面領域と他の表面領域とにおける細胞の接着度合いの相対的な強さを意味し、典型的には、「細胞接着性」は、細胞が接着しやすい表面特性を意味する。細胞接着性は、通常は、表面の化学的性質及び／又は物理的性質等に起因して、細胞の接着及び／又は伸展が起こりやすいか否かに基づき、決定される。細胞培養容器の培養面の細胞接着性を判断する指標としては、例えば、実際に該細胞培養容器で細胞を培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。本発明において、細胞培養容器の培養面が細胞接着性を示す状態の場合、該細胞培養容器の培養面は、細胞接着伸展率が60％以上であることが好ましく、細胞接着伸展率が80％以上であることがより好ましい。細胞培養容器の培養面の細胞接着伸展率が高い場合、効率的に細胞を培養することができる。また、細胞培養容器の培養面が細胞非接着性を示す状態の場合、該細胞培養容器の培養面は、細胞接着伸展率が60％未満であることが好ましく、40％未満であることがより好ましく、5％以下であることがさらに好ましく、2％以下であることが特に好ましい。 In the present invention, “cell adhesion” and “cell non-adhesion” mean the relative strength of the degree of cell adhesion between one surface region and another surface region. “Adhesive” means a surface property that allows cells to adhere easily. Cell adhesion is usually determined based on whether cell adhesion and / or spreading is likely to occur due to the chemical and / or physical properties of the surface. As an index for judging the cell adhesiveness of the culture surface of the cell culture container, for example, the cell adhesion extension rate when cells are actually cultured in the cell culture container can be used. In the present invention, when the culture surface of the cell culture container shows cell adhesion, the culture surface of the cell culture container preferably has a cell adhesion extension rate of 60% or more, and a cell adhesion extension rate of 80%. More preferably. When the cell adhesion extension rate on the culture surface of the cell culture container is high, the cells can be efficiently cultured. When the culture surface of the cell culture container is in a state of non-cell adhesion, the cell culture container preferably has a cell adhesion extension rate of less than 60%, more preferably less than 40%. Preferably, it is 5% or less, more preferably 2% or less.
なお、細胞接着性の指標となる細胞接着伸展率は、例えば、以下の方法で決定することができる。培養しようとする細胞を、4000〜30000 cells/cm2の範囲の初期播種密度で測定対象表面に播種した後、該細胞の培養における通常の条件（例えば、37℃、5％のCO2濃度の条件）下で培養する。培養開始3時間後に、培地交換を行い、接着していない細胞を除去した後、細胞が接着している数箇所を観察する。細胞接着伸展率を、次の式：（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×100（％））に基づき算出する。 In addition, the cell adhesion extension rate used as an index of cell adhesiveness can be determined by the following method, for example. After the cells to be cultured are seeded on the surface to be measured at an initial seeding density in the range of 4000 to 30000 cells / cm 2 , normal conditions for culturing the cells (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration) Cultivation under conditions). Three hours after the start of the culture, the medium is changed to remove non-adhered cells, and then several places where the cells adhere are observed. The cell adhesion spreading rate is calculated based on the following formula: ({(number of adherent cells) / (number of seeded cells)} × 100 (%)).
本工程において、細胞を培養する培地及び外部環境（例えば、温度、湿度、光周期又はCO2濃度）等の培養条件は、使用される細胞の種類に基づき、当該技術分野で通常使用される培養条件を適宜適用することができる。 In this step, the culture conditions such as the medium for culturing the cells and the external environment (eg, temperature, humidity, photoperiod or CO 2 concentration) are based on the type of cells used and are commonly used in the art. Conditions can be applied as appropriate.
本工程において、細胞の培養は、本明細書で定義される、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞に包含される1種類以上の細胞又は細胞の集団に加えて、1種類以上の他の細胞又は細胞の集団の共存下で実施してもよい。本明細書において、このような実施形態を、「共培養」と記載する場合がある。本工程において、共培養に使用される細胞としては、限定するものではないが、例えば、滑膜由来細胞及び線維芽細胞等を挙げることができる。或いは、共培養に使用される細胞は、本工程において使用される細胞と同一の由来であるが、分化状態の維持能力及びII型コラーゲンの産生能力の少なくともいずれかを喪失した細胞であってもよい。共培養は、例えばセルカルチャーインサートのような当該技術分野で通常使用される器具を用いて実施することができる。本工程において、前記細胞との共培養を実施することにより、実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞の増殖を促進させることができる。 In this step, the cell culture is defined as one or more types of cells or a group of cells encompassed by cells having the ability to produce type II collagen that is substantially differentiated as defined herein. In addition, it may be performed in the presence of one or more other cells or populations of cells. In this specification, such an embodiment may be described as “co-culture”. In this step, the cells used for co-culture are not limited, and examples thereof include synovial cells and fibroblasts. Alternatively, the cells used for co-culture may be cells that have the same origin as the cells used in this step, but have lost at least one of the ability to maintain a differentiated state and the ability to produce type II collagen. Good. Co-culture can be performed using instruments commonly used in the art, such as cell culture inserts. In this step, by carrying out co-culture with the cells, it is possible to promote the growth of cells having the ability to produce type II collagen that is substantially in a differentiated state.
本工程において、本明細書で定義される実質的に分化状態を維持しているII型コラーゲンを産生する能力を有する細胞を、少なくとも80％コンフルエントの状態となるまで培養することが好ましく、80〜100％コンフルエントの状態となるまで培養することがより好ましく、90〜100％コンフルエントの状態となるまで培養することがさらに好ましく、100％コンフルエントの状態となるまで培養することが特に好ましい。細胞構造体の形成においては、播種された細胞が増殖し、隣接する細胞間に細胞外マトリクスを介した細胞間接着を形成することが必要となる。この際、細胞のコンフルエンシーが低いと、隣接する細胞間に細胞間接着を形成することができないか、又は弱い細胞間接着しか形成することができない場合がある。このような状態で酵素処理を行うと、弱い細胞間接着が切断されて、単離細胞の形態となる可能性がある。これに対し、前記範囲のコンフルエントの状態となるまで細胞を培養することにより、隣接する細胞間に強固な細胞間接着を形成することができる。これにより、以下において説明する酵素処理工程において、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 In this step, it is preferable to culture the cells having the ability to produce type II collagen that is substantially maintained in a differentiated state as defined herein until at least 80% confluent. It is more preferable to culture until 100% confluent, more preferable to culture until 90 to 100% confluent, and particularly preferable to culture until 100% confluent. In the formation of a cell structure, it is necessary for the seeded cells to proliferate and to form an intercellular adhesion via an extracellular matrix between adjacent cells. At this time, if the cell confluency is low, cell-cell adhesion may not be formed between adjacent cells, or only weak cell-cell adhesion may be formed. When the enzyme treatment is performed in such a state, weak cell-cell adhesion may be cut and may be in the form of isolated cells. On the other hand, by culturing the cells until they reach a confluent state in the above range, it is possible to form a strong intercellular adhesion between adjacent cells. Thereby, in the enzyme treatment process demonstrated below, damage to a cell structure can be suppressed substantially.
なお、細胞のコンフルエンシーは、限定するものではないが、例えば、培養中の細胞を顕微鏡下で観察し、視野内における総面積に対する細胞の専有面積を評価することによって、決定することができる。前記面積の評価は、目視によって行ってもよく、画像解析装置を用いて行ってもよい。 The cell confluency is not limited, but can be determined, for example, by observing cells in culture under a microscope and evaluating the area occupied by the cells relative to the total area in the visual field. The evaluation of the area may be performed visually or using an image analysis device.
本工程により、細胞構造体が形成される。本発明において、「細胞構造体」は、細胞同士が細胞外マトリクスを介して細胞間接着を形成することによって生じる、複数の細胞からなる細胞の集合体を意味する。本工程において形成される細胞構造体は、特定の組織又は器官に分化した形態であってもよく、未分化の形態であってもよい。また、本工程において形成される細胞構造体は、培養面に複数の細胞が配列することによって形成される二次元構造の一層形態であってもよく、培養面に配列した複数の細胞の上部にさらに複数の細胞が配列することによって形成される三次元構造の多層形態であってもよい。本工程において形成される細胞構造体としては、例えば、シート状の形態の細胞シートを挙げることができる。 By this step, a cell structure is formed. In the present invention, the “cell structure” means an aggregate of cells composed of a plurality of cells, which are produced when cells form an intercellular adhesion via an extracellular matrix. The cell structure formed in this step may be in a form differentiated into a specific tissue or organ, or may be in an undifferentiated form. In addition, the cell structure formed in this step may be a one-dimensional form having a two-dimensional structure formed by arranging a plurality of cells on the culture surface, and may be formed above the plurality of cells arranged on the culture surface. Furthermore, it may be a multilayer form having a three-dimensional structure formed by arranging a plurality of cells. Examples of the cell structure formed in this step include a sheet-like cell sheet.
［1-2. 酵素処理工程］
本発明の方法は、前記細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体を酵素処理して、該細胞構造体を取得する、酵素処理工程を含むことが必要である。
[1-2. Enzyme treatment process]
The method of the present invention needs to include an enzyme treatment step in which the cell structure formed in the cell structure formation step is treated with an enzyme to obtain the cell structure.
本発明者らは、前記細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体は、トリプシンのような高い酵素活性を有するタンパク質分解酵素で処理しても、該細胞構造体自体に実質的な損傷を生じることなく、細胞培養容器の培養面から剥離できることを見出した。従来技術においては、細胞培養容器の培養面からの細胞構造体の剥離に、高い酵素活性を有するタンパク質分解酵素を使用すると、該細胞構造体自体に損傷を生じる可能性があると考えられてきた。これに対し、本発明の方法では、強固な細胞間接着を有する細胞構造体を形成させることができる。それ故、本工程において、前記細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体を酵素処理することにより、該細胞構造体を容易に取得することができる。 The inventors of the present invention, even if the cell structure formed in the cell structure formation step is treated with a proteolytic enzyme having high enzymatic activity such as trypsin, the cell structure itself is not substantially damaged. It has been found that it can be peeled off from the culture surface of the cell culture vessel without occurring. In the prior art, it has been considered that the use of a proteolytic enzyme having a high enzymatic activity for peeling the cell structure from the culture surface of the cell culture container may cause damage to the cell structure itself. . In contrast, in the method of the present invention, a cell structure having strong cell-cell adhesion can be formed. Therefore, in this step, the cell structure can be easily obtained by enzymatic treatment of the cell structure formed in the cell structure formation step.
本工程において、酵素処理に使用される酵素は、1種類以上のタンパク質分解酵素を少なくとも含む。前記酵素は、1種類以上のタンパク質分解酵素のみからなる形態であってもよく、1種類以上のタンパク質分解酵素と、場合により1種類以上のタンパク質分解酵素以外の他の酵素と、場合により1種類以上のさらなる成分とを含む酵素組成物の形態であってもよい。いずれの場合も、本発明の実施形態に包含される。本工程において使用されるタンパク質分解酵素は、特に限定されず、当該技術分野で通常使用される各種タンパク質分解酵素を使用することができる。前記タンパク質分解酵素としては、限定するものではないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、ディスパーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、及びAccutase（商標）を挙げることができる。前記酵素組成物としては、限定するものではないが、例えば、Accumax（商標）を挙げることができる。本工程において使用される酵素は、トリプシン、Accutase（商標）、又はAccumax（商標）であることが好ましく、トリプシンであることがより好ましい。前記酵素、とりわけトリプシンは、タンパク質分解活性が非常に高い酵素である。それ故、前記酵素を用いることにより、形成された細胞構造体を培養面から効率的に剥離することができる。 In this step, the enzyme used for the enzyme treatment includes at least one or more types of proteolytic enzymes. The enzyme may be in a form consisting of only one or more types of proteolytic enzymes, and may be one or more types of proteolytic enzymes and optionally other enzymes other than one or more types of proteolytic enzymes and optionally one type The form of the enzyme composition containing the above further components may be sufficient. Either case is included in the embodiment of the present invention. The proteolytic enzyme used in this step is not particularly limited, and various proteolytic enzymes usually used in the technical field can be used. Examples of the proteolytic enzyme include, but are not limited to, trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, dispase, elastase, hyaluronidase, and Accutase (trademark). Examples of the enzyme composition include, but are not limited to, Accumax (trademark). The enzyme used in this step is preferably trypsin, Accutase (trademark), or Accumax (trademark), more preferably trypsin. Said enzymes, especially trypsin, are enzymes with very high proteolytic activity. Therefore, by using the enzyme, the formed cell structure can be efficiently detached from the culture surface.
本工程において使用されるタンパク質分解酵素は、コラゲナーゼ活性が低いことが好ましく、コラゲナーゼを実質的に含まないことがより好ましい。本発明において、「コラゲナーゼ活性が低い」とは、タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性全体に対するコラゲナーゼ活性の割合（％）が50％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは10％以下を意味する。本発明において、「コラゲナーゼを実質的に含まない」とは、タンパク質分解酵素の総量に対するコラゲナーゼの割合（mol％）が10％以下、好ましくは5％以下、より好ましくは1％以下、特に好ましくは0％を意味する。コラゲナーゼは、コラーゲンを特異的に切断するタンパク質分解酵素である。すでに説明したように、本発明の方法で形成される細胞構造体は、II型コラーゲンを主要成分とする細胞外マトリクスを介して強固な細胞間接着を形成する。このため、本工程において使用される酵素がコラゲナーゼを多量に含む場合、細胞構造体の細胞間接着が切断されて、該細胞構造体が損傷する可能性がある。それ故、コラゲナーゼ活性が低い酵素、特にコラゲナーゼを実質的に含まない酵素を用いて細胞構造体を酵素処理することにより、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 The proteolytic enzyme used in this step preferably has a low collagenase activity, and more preferably does not substantially contain collagenase. In the present invention, “low collagenase activity” means that the ratio (%) of collagenase activity to the total proteolytic activity of the proteolytic enzyme is 50% or less, preferably 30% or less, more preferably 10% or less. In the present invention, “substantially free of collagenase” means that the ratio (mol%) of collagenase to the total amount of proteolytic enzyme is 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 1% or less, particularly preferably It means 0%. Collagenase is a proteolytic enzyme that specifically cleaves collagen. As already explained, the cell structure formed by the method of the present invention forms strong intercellular adhesion through an extracellular matrix mainly composed of type II collagen. For this reason, when the enzyme used in this step contains a large amount of collagenase, cell-cell adhesion of the cell structure may be cut and the cell structure may be damaged. Therefore, the damage to the cell structure can be substantially suppressed by treating the cell structure with an enzyme having a low collagenase activity, particularly an enzyme substantially free of collagenase.
本工程において、細胞構造体を酵素処理する条件は、使用される細胞及び酵素の組合せに応じて、適宜設定することができる。例えば、酵素処理における該酵素の濃度は、0.01〜0.5質量％の範囲であることが好ましく、0.02〜0.3質量％の範囲であることがより好ましい。前記酵素処理の時間は、0.5分以上であることが好ましく、0.5分〜1時間の範囲であることがより好ましく、0.5〜10分の範囲であることがさらに好ましい。前記酵素処理の温度は、20〜50℃の範囲であることが好ましく、20〜45℃の範囲であることがより好ましく、30〜40℃の範囲であることがさらに好ましい。前記条件で細胞構造体を酵素処理することにより、細胞構造体の損傷を実質的に抑制することができる。 In this step, the conditions for enzyme treatment of the cell structure can be appropriately set according to the combination of cells and enzymes used. For example, the enzyme concentration in the enzyme treatment is preferably in the range of 0.01 to 0.5% by mass, and more preferably in the range of 0.02 to 0.3% by mass. The enzyme treatment time is preferably 0.5 minutes or more, more preferably in the range of 0.5 minutes to 1 hour, and still more preferably in the range of 0.5 to 10 minutes. The temperature of the enzyme treatment is preferably in the range of 20 to 50 ° C, more preferably in the range of 20 to 45 ° C, and further preferably in the range of 30 to 40 ° C. By treating the cell structure with an enzyme under the above conditions, damage to the cell structure can be substantially suppressed.
本工程において、前記酵素処理によって培養面から剥離した細胞構造体を回収することによって、該細胞構造体を取得することができる。細胞構造体を取得する手段としては、アスピレーター又はピペット等の当該技術分野で通常使用される手段を適用することができる。 In this step, the cell structure can be obtained by collecting the cell structure peeled from the culture surface by the enzyme treatment. As means for obtaining the cell structure, means usually used in the art such as an aspirator or pipette can be applied.
本発明の方法では、底部表面の略全体が細胞接着性である細胞培養容器を用いる場合であっても、酵素処理によって細胞構造体を培養面から確実に剥離することができる。例えば、本工程において、通常は少なくとも90％、典型的には約100％の高い効率で、実質的に損傷のない細胞構造体を得ることができる。それ故、本発明の方法によって作製される細胞構造体は、細胞培養容器及びその培養面の寸法を適宜選択することにより、任意の寸法を有するものとすることができる。 In the method of the present invention, even when a cell culture vessel in which substantially the entire bottom surface is cell-adhesive is used, the cell structure can be reliably peeled off from the culture surface by enzyme treatment. For example, in this step, a substantially intact cell structure can be obtained with a high efficiency, usually at least 90%, typically about 100%. Therefore, the cell structure produced by the method of the present invention can have any dimensions by appropriately selecting the dimensions of the cell culture vessel and its culture surface.
以上、詳細に説明したように、本発明の方法では、刺激応答性材料を用いる細胞培養容器のような高価な材料を使用することなく、酵素処理によって細胞構造体を培養面から剥離することができる。それ故、本発明の方法により、従来技術と比較して低コストで、高品質の細胞構造体を作製することができる。 As described above in detail, in the method of the present invention, the cell structure can be detached from the culture surface by enzyme treatment without using an expensive material such as a cell culture vessel using a stimulus-responsive material. it can. Therefore, by the method of the present invention, it is possible to produce a high-quality cell structure at a lower cost than in the prior art.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例1：軟骨細胞を用いる細胞シートの作製］
本試験においては、実施例1として、ラット由来の軟骨細胞であるMK442細胞（タカラバイオ社）を、比較例1-1として、線維芽細胞であるCCL163細胞を、比較例1-2として、ウシ血管内皮細胞であるB27細胞を、それぞれ用いた。3.5 cmサイズの細胞培養用ディッシュ（Thermo Fisher Scientific社）に、10％のウシ胎児血清（FBS）及び25 μg/ml（126 μM）のアスコルビン酸ナトリウム（和光純薬工業社）を含むRPMI培地を加え、該培地中にMK442細胞を播種した。前記細胞を、所定の条件下で、100％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。比較例の場合、3.5 cmサイズの細胞培養用ディッシュに、10％のFBSを含むDMEM培地を加え、該培地中にCCL163細胞又はB27細胞を播種した。前記細胞を、所定の条件下で、100％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。なお、細胞のコンフルエンシーは、培養中のディッシュ内を顕微鏡下で観察し、視野内における総面積に対する細胞の専有面積を評価することによって、決定した。
[Example 1: Production of cell sheet using chondrocytes]
In this test, as Example 1, MK442 cells (Takara Bio Inc.), which are rat-derived chondrocytes, as Comparative Example 1-1, CCL163 cells as fibroblasts, as Comparative Example 1-2, bovine B27 cells, which are vascular endothelial cells, were used. A RPMI medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 25 μg / ml (126 μM) sodium ascorbate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 3.5 cm cell culture dish (Thermo Fisher Scientific) In addition, MK442 cells were seeded in the medium. The cells were cultured under predetermined conditions until they became 100% confluent. In the case of the comparative example, a DMEM medium containing 10% FBS was added to a 3.5 cm sized cell culture dish, and CCL163 cells or B27 cells were seeded in the medium. The cells were cultured under predetermined conditions until they became 100% confluent. The cell confluency was determined by observing the dish in culture under a microscope and evaluating the area occupied by the cell relative to the total area in the visual field.
培養終了後、培養液を除去し、ディッシュ底面に接着した細胞及び細胞構造体を、PBSを用いて洗浄した。次いで、ディッシュ底面に接着した細胞及び細胞構造体に、タンパク質分解酵素を加えて、37℃、1〜5分間の条件で酵素処理した。実施例1の場合、タンパク質分解酵素として、0.25質量％トリプシン（Life Technologies社）、0.05質量％トリプシン、Accumax又はAccutase（共にICT社）を用いた。Accutaseは、トリプシンより酵素活性の低いタンパク質分解酵素であり、Accumaxは、AccutaseにDNaseを加えた酵素混合物である。Accumax及びAccutaseは、原液濃度のまま用いた。比較例1-1及び1-2の場合、より穏和なタンパク質分解酵素として、0.05質量％トリプシン又はAccutaseを用いた。酵素処理の終了時点は、ディッシュ底面からの細胞及び細胞構造体の剥離状態を、顕微鏡を用いて観察することによって判断した。実施例1、並びに比較例1-1及び1-2の結果を表1に示す。表中、「細胞構造体」の行は、細胞シートの形態の細胞構造体が得られた場合を○で、細胞シートの形態の細胞構造体が得られなかった場合を×で、それぞれ示す。また、実施例1において、Accutaseを用いて酵素処理することによって得られた細胞シートの写真を図1に示す。 After completion of the culture, the culture solution was removed, and the cells and cell structures adhered to the bottom of the dish were washed with PBS. Next, proteolytic enzymes were added to the cells and cell structures adhered to the bottom of the dish, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 1 to 5 minutes. In the case of Example 1, 0.25 mass% trypsin (Life Technologies), 0.05 mass% trypsin, Accumax or Accutase (both ICT) was used as a proteolytic enzyme. Accutase is a proteolytic enzyme with lower enzyme activity than trypsin, and Accumax is an enzyme mixture obtained by adding DNase to Accutase. Accumax and Accutase were used at the stock solution concentration. In Comparative Examples 1-1 and 1-2, 0.05 mass% trypsin or Accutase was used as a milder proteolytic enzyme. The end point of the enzyme treatment was judged by observing the peeled state of the cells and cell structures from the dish bottom using a microscope. The results of Example 1 and Comparative Examples 1-1 and 1-2 are shown in Table 1. In the table, the row of “cell structure” indicates a case where a cell structure in the form of a cell sheet is obtained, and a case where a cell structure in the form of a cell sheet is not obtained, respectively. In addition, FIG. 1 shows a photograph of the cell sheet obtained by enzyme treatment with Accutase in Example 1.
表1に示すように、軟骨細胞（実施例1）を用いた場合、いずれの酵素を用いて酵素処理を行った場合であっても、細胞シートの形態の細胞構造体を得ることができた。軟骨細胞の場合、細胞間接着を形成する細胞外マトリクスの主要成分としてII型コラーゲンを豊富に産生する。II型コラーゲンは、トリプシンのような高い酵素活性を有するタンパク質分解酵素に対しても耐性が高い。このため、前記条件で酵素処理を行っても、細胞間接着よりディッシュ底面と細胞との接着が優先的に切断されて、細胞シートの形態の細胞構造体を得ることができたと考えられる。 As shown in Table 1, when chondrocytes (Example 1) were used, a cell structure in the form of a cell sheet could be obtained even when any enzyme was used for enzyme treatment. . In the case of chondrocytes, type II collagen is abundantly produced as the main component of the extracellular matrix that forms intercellular adhesion. Type II collagen is highly resistant to proteolytic enzymes having high enzymatic activity such as trypsin. For this reason, it is considered that even when the enzyme treatment was performed under the above conditions, the adhesion between the dish bottom surface and the cells was preferentially cut over the cell-cell adhesion, and a cell structure in the form of a cell sheet could be obtained.
これに対し、線維芽細胞（比較例1-1）及び血管内皮細胞（比較例1-2）を用いた場合、穏和なタンパク質分解酵素を用いて酵素処理を行っても、細胞シートの形態の細胞構造体を得ることができなかった。線維芽細胞及び血管内皮細胞の場合、II型コラーゲンを産生せず、I型コラーゲンのみを産生する。このため、前記条件で酵素処理を行った場合、細胞間接着及びディッシュ底面と細胞との接着のいずれもが同程度に切断されて、細胞構造体の形態が破壊されたと考えられる。 On the other hand, when fibroblasts (Comparative Example 1-1) and vascular endothelial cells (Comparative Example 1-2) are used, even if the enzyme treatment is performed using a mild proteolytic enzyme, A cell structure could not be obtained. In the case of fibroblasts and vascular endothelial cells, type II collagen is not produced, but only type I collagen is produced. For this reason, when the enzyme treatment is performed under the above-described conditions, it is considered that the intercellular adhesion and the adhesion between the dish bottom surface and the cells are cut to the same extent, and the form of the cell structure is destroyed.
［実施例2：細胞シート形成におけるアスコルビン酸の効果］
本試験においては、実施例2及び比較例2のいずれも、実施例1と同一のラット由来の軟骨細胞であるMK442細胞を用いた。
[Example 2: Effect of ascorbic acid on cell sheet formation]
In this test, MK442 cells, which are the same rat-derived chondrocytes as in Example 1, were used in both Example 2 and Comparative Example 2.
実施例2は、実施例1と同様の手順で培養を行った。比較例2の場合、実施例1の手順において、アスコルビン酸ナトリウムを含まない培地を用いた他は前記と同様の手順で培養を行った。いずれの場合も、前記細胞を、所定の条件下で、100％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。 In Example 2, the culture was performed in the same procedure as in Example 1. In the case of Comparative Example 2, the culture was performed in the same procedure as described above except that a medium not containing sodium ascorbate was used in the procedure of Example 1. In either case, the cells were cultured under predetermined conditions until they became 100% confluent.
培養終了後、実施例1と同様の手順で酵素処理を行った。実施例2及び比較例2の場合とも、実施例1の手順において、0.25質量％トリプシン又は0.05質量％トリプシンを用いた他は前記と同様の手順で酵素処理を行った。0.25質量％トリプシンを用いて酵素処理することによって得られた細胞シートの写真を図2に示す。図中、Aは、実施例2の結果を、Bは、比較例2の結果を、それぞれ示す。 After completion of the culture, enzyme treatment was performed in the same procedure as in Example 1. In both cases of Example 2 and Comparative Example 2, the enzyme treatment was performed in the same procedure as described above except that 0.25 mass% trypsin or 0.05 mass% trypsin was used in the procedure of Example 1. A photograph of the cell sheet obtained by enzyme treatment with 0.25% by mass trypsin is shown in FIG. In the figure, A shows the results of Example 2, and B shows the results of Comparative Example 2.
図2Aに示すように、実施例2においてアスコルビン酸ナトリウムを含む培地で軟骨細胞の培養を行った場合、細胞シートの形態の細胞構造体が形成され、前記酵素処理によって該細胞シートをディッシュ底面から剥離することができた。結果は示していないが、0.05質量％トリプシンを用いて酵素処理した場合も、同様の結果が得られた。これに対し、図2Bに示すように、比較例2においてアスコルビン酸ナトリウムを含まない培地で軟骨細胞の培養を行った場合、細胞構造体が形成されず、単離細胞の形態のままであった。アスコルビン酸ナトリウムを含まない培地で軟骨細胞の培養を行った比較例2の場合、II型コラーゲンの生合成が阻害されて、結果として細胞間接着の形成が阻害されたと考えられる。 As shown in FIG. 2A, when chondrocytes were cultured in a medium containing sodium ascorbate in Example 2, a cell structure in the form of a cell sheet was formed, and the cell sheet was removed from the bottom of the dish by the enzyme treatment. It was possible to peel off. Although the results are not shown, similar results were obtained when the enzyme treatment was performed using 0.05% by mass trypsin. On the other hand, as shown in FIG. 2B, when chondrocytes were cultured in a medium not containing sodium ascorbate in Comparative Example 2, no cell structure was formed and the form of isolated cells remained. . In the case of Comparative Example 2 in which chondrocytes were cultured in a medium not containing sodium ascorbate, it is considered that the biosynthesis of type II collagen was inhibited, and as a result, the formation of intercellular adhesion was inhibited.
［実施例3：細胞のコンフルエンシーと細胞シート形成との関係］
本試験においては、実施例3及び比較例3のいずれも、実施例1と同一のラット由来の軟骨細胞であるMK442細胞を用いた。
[Example 3: Relationship between cell confluency and cell sheet formation]
In this test, MK442 cells, which are the same rat-derived chondrocytes as in Example 1, were used in both Example 3 and Comparative Example 3.
実施例3及び比較例3は、実施例1と同様の手順で培養を行った。実施例3の場合、前記細胞を、所定の条件下で、80％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。比較例3の場合、前記細胞を、所定の条件下で、50％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。 In Example 3 and Comparative Example 3, the culture was performed in the same procedure as in Example 1. In the case of Example 3, the cells were cultured under predetermined conditions until they became 80% confluent. In the case of Comparative Example 3, the cells were cultured under a predetermined condition until the cells became 50% confluent.
培養終了後、実施例1と同様の手順で酵素処理を行った。実施例3及び比較例3の場合とも、実施例1の手順において、0.25質量％トリプシン又は0.05質量％トリプシンを用いた他は前記と同様の手順で酵素処理を行った。酵素処理後、反応を停止させるために、フェノールレッドを含む血清培地を酵素反応溶液に加えた。0.25質量％トリプシンを用いて酵素処理することによって得られた細胞シートの写真を図3に示す。 After completion of the culture, enzyme treatment was performed in the same procedure as in Example 1. In both cases of Example 3 and Comparative Example 3, the enzyme treatment was performed in the same procedure as described above except that 0.25 mass% trypsin or 0.05 mass% trypsin was used in the procedure of Example 1. After the enzyme treatment, a serum medium containing phenol red was added to the enzyme reaction solution in order to stop the reaction. A photograph of the cell sheet obtained by enzyme treatment with 0.25% by mass trypsin is shown in FIG.
図3に示すように、実施例3の場合、細胞構造体が形成された。前記細胞構造体の形態は、細胞シートの形態ではなく、小塊状の形態であった。これに対し、比較例3の場合、細胞構造体が形成されず、単離細胞の形態のままであった。細胞構造体の形成においては、播種された単離細胞が増殖し、隣接する細胞間に細胞外マトリクスを介した細胞間接着を形成することが必要となる。この際、細胞のコンフルエンシーが低いと、隣接する細胞間に細胞間接着を形成することができないか、又は弱い細胞間接着しか形成することができない場合がある。このような状態で酵素処理を行うと、弱い細胞間接着は切断されて、単離細胞の形態となると考えられる。 As shown in FIG. 3, in the case of Example 3, a cell structure was formed. The cell structure was not in the form of a cell sheet but in the form of a small lump. On the other hand, in the case of Comparative Example 3, the cell structure was not formed and the form of the isolated cell remained. In the formation of a cell structure, it is necessary for the seeded isolated cells to proliferate and to form an intercellular adhesion via an extracellular matrix between adjacent cells. At this time, if the cell confluency is low, cell-cell adhesion may not be formed between adjacent cells, or only weak cell-cell adhesion may be formed. When the enzyme treatment is performed in such a state, it is considered that the weak intercellular adhesion is cut to form an isolated cell.
［実施例4：細胞の分化状態と細胞シート形成との関係］
本試験においては、実施例4は、実施例1と同一のラット由来の軟骨細胞であるMK442細胞を用いた。比較例4は、MK442細胞を数代に亘って継代培養を繰り返した結果、軟骨細胞から形態変化した脱分化状態の細胞を用いた。播種前の細胞の写真を図4に示す。図中、Aは、実施例4に用いた播種前のMK442細胞の写真を、Bは、比較例4に用いた播種前の脱分化状態の細胞を、それぞれ示す。
[Example 4: Relationship between cell differentiation state and cell sheet formation]
In this test, Example 4 used the same rat-derived chondrocyte MK442 cells as in Example 1. Comparative Example 4 used cells in a dedifferentiated state in which MK442 cells were repeatedly subcultured over several generations, resulting in a morphological change from chondrocytes. A photograph of the cells before seeding is shown in FIG. In the figure, A shows a photograph of MK442 cells before seeding used in Example 4, and B shows a cell in a dedifferentiated state before seeding used in Comparative Example 4, respectively.
図4Aに示すように、実施例4に使用したMK442細胞は、実質的に軟骨細胞の分化状態を維持していた。これに対し、比較例4に使用した継代培養後の細胞は、軟骨細胞の分化状態を維持しておらず、脱分化状態であった。 As shown in FIG. 4A, the MK442 cells used in Example 4 substantially maintained the differentiation state of chondrocytes. In contrast, the cells after subculture used in Comparative Example 4 did not maintain the differentiated state of chondrocytes and were in a dedifferentiated state.
実施例4及び比較例4は、実施例1と同様の手順で培養を行った。実施例4の場合、前記細胞を、所定の条件下で、100％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。比較例4の場合、前記細胞を、所定の条件下で培養を行った。しかしながら、増殖能力が低いため、コンフルエントの状態となる前に細胞増殖がプラトーに達した。比較例4の場合、この時点で培養を終了した。 In Example 4 and Comparative Example 4, the culture was performed in the same procedure as in Example 1. In the case of Example 4, the cells were cultured under predetermined conditions until they became 100% confluent. In the case of Comparative Example 4, the cells were cultured under predetermined conditions. However, cell growth reached a plateau before becoming confluent due to low proliferation ability. In the case of Comparative Example 4, the culture was terminated at this point.
培養終了後、実施例1と同様の手順で酵素処理を行った。実施例4及び比較例4の場合とも、実施例1の手順において、0.25質量％トリプシン又は0.05質量％トリプシンを用いた他は前記と同様の手順で酵素処理を行った。その結果、実施例4の場合、細胞シートの形態の細胞構造体が形成され、前記酵素処理によって該細胞シートをディッシュ底面から剥離することができた。これに対し、比較例4の場合、細胞構造体が形成されず、単離細胞の形態のままであった。 After completion of the culture, enzyme treatment was performed in the same procedure as in Example 1. In both cases of Example 4 and Comparative Example 4, the enzyme treatment was performed in the same manner as described above except that 0.25 mass% trypsin or 0.05 mass% trypsin was used in the procedure of Example 1. As a result, in Example 4, a cell structure in the form of a cell sheet was formed, and the cell sheet could be peeled from the dish bottom by the enzyme treatment. On the other hand, in the case of Comparative Example 4, no cell structure was formed, and the form of isolated cells remained.
抗II型コラーゲン抗体を用いる免疫染色法により、前記培養終了後の実施例4及び比較例4の細胞におけるII型コラーゲンの発現を評価した。培養終了後の実施例4及び比較例4の細胞から、細胞サンプルを採取した。実施例4及び比較例4の細胞サンプルを、4％パラホルムアルデヒド溶液に、室温で20分間浸漬した（固定化）。前記手順で固定化処理した実施例4及び比較例4の細胞サンプルを、1％正常ヤギ血清（NGS；DAKO社）及び0.1％ Triton X-100（Sigma社）を含むPBS（以下、「ブロッキング溶液」とも記載する）に入れて、室温で30分間インキュベートした（ブロッキング）。前記手順でブロッキング処理した実施例4及び比較例4の細胞サンプルに、前記ブロッキング溶液で希釈したウサギIgG標識コントロール抗体（DAKO社；希釈率1/5000）又はウサギIgG標識抗II型コラーゲン抗体（ROCKLAND社：希釈率1/500）を適用して、4℃で1晩反応させた（一次抗体反応）。反応終了後、実施例4及び比較例4の細胞サンプルを、PBSで3回洗浄した。次いで、洗浄後の実施例4及び比較例4の細胞サンプルに、PBSで希釈したAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（Molecular Probe社；希釈率1/1000）を適用して、室温で1時間反応させた（二次抗体反応）。反応終了後、実施例4及び比較例4の細胞サンプルを、PBSで3回洗浄した。次いで、洗浄後の実施例4及び比較例4の細胞サンプルに、Hoechst33342（Molecular Probes；希釈率1/1000）を適用して、室温で10分間反応させた（細胞核染色）。細胞核染色後の実施例4及び比較例4の細胞サンプルを、封入剤及びカバーガラス（松浪硝子社）を用いて封入した。得られた実施例4及び比較例4の細胞サンプル標本を、共焦点顕微鏡（Zeiss社）を用いて観察した。実施例4の細胞サンプル標本における蛍光染色の結果を示す写真を図5に示す。図中、Aは、抗II型コラーゲン抗体による免疫蛍光染色の写真を、Bは、Hoechst33342による細胞核染色の写真を、Cは、A及びBの写真の重ね合わせ画像を、それぞれ示す。 Expression of type II collagen in the cells of Example 4 and Comparative Example 4 after completion of the culture was evaluated by immunostaining using an anti-type II collagen antibody. Cell samples were collected from the cells of Example 4 and Comparative Example 4 after completion of the culture. The cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 were immersed in a 4% paraformaldehyde solution for 20 minutes at room temperature (immobilization). The cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 immobilized by the above procedure were prepared by adding PBS containing 1% normal goat serum (NGS; DAKO) and 0.1% Triton X-100 (Sigma) (hereinafter “blocking solution”). And also incubated at room temperature for 30 minutes (blocking). The cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 subjected to blocking treatment by the above procedure were added to the rabbit IgG-labeled control antibody (DAKO; dilution ratio 1/5000) or the rabbit IgG-labeled anti-type II collagen antibody (ROCKLAND) diluted with the blocking solution. Company: dilution ratio 1/500) was applied, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight (primary antibody reaction). After completion of the reaction, the cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 were washed 3 times with PBS. Subsequently, Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody diluted with PBS (Molecular Probes; dilution ratio 1/1000) was applied to the cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 after washing, and reacted at room temperature for 1 hour. (Secondary antibody reaction). After completion of the reaction, the cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 were washed 3 times with PBS. Next, Hoechst33342 (Molecular Probes; dilution ratio 1/1000) was applied to the cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 after washing, and reacted at room temperature for 10 minutes (cell nucleus staining). The cell samples of Example 4 and Comparative Example 4 after cell nucleus staining were encapsulated using an encapsulant and a cover glass (Matsunami Glass Co., Ltd.). The obtained cell sample specimens of Example 4 and Comparative Example 4 were observed using a confocal microscope (Zeiss). A photograph showing the result of fluorescent staining in the cell sample specimen of Example 4 is shown in FIG. In the figure, A shows a photograph of immunofluorescence staining with an anti-type II collagen antibody, B shows a photograph of cell nucleus staining with Hoechst33342, and C shows a superimposed image of the photographs of A and B, respectively.
図5に示すように、抗II型コラーゲン抗体を用いる免疫染色の結果、実施例4の細胞サンプルでは、II型コラーゲンの発現が観察された。これに対し、比較例4の細胞サンプルでは、II型コラーゲンの発現が観察されなかった。 As shown in FIG. 5, expression of type II collagen was observed in the cell sample of Example 4 as a result of immunostaining using an anti-type II collagen antibody. In contrast, type II collagen expression was not observed in the cell sample of Comparative Example 4.
［実施例5：細胞の生物種及び継代数と細胞シート形成との関係］
本試験においては、ウサギ由来の軟骨細胞を用いた。ネンブタール投与により安楽死させたウサギ関節より、軟骨組織を採取した。得られた軟骨組織を、PBSに希釈した0.1質量％のコラゲナーゼ（Collagenase L、新田ゼラチン社）を用いて、37℃で2時間酵素処理して組織を分解した。得られた軟骨組織の酵素処理物を、40 μmの孔径のセルストレイナー（BD Falcon社）を通すことにより、単離細胞の形態の軟骨細胞を得た。得られた軟骨細胞を、初代培養細胞とした。また、この初代培養細胞を1又は2回継代して、前記軟骨細胞の1代目又は2代目の継代培養細胞を得た。なお、継代培養における培地組成及び培養条件は、公知文献（Kaneshiroら, Biochemical and Biophysical Research Communications, 第349巻, p. 723-731, 2006年）に基づいた。
[Example 5: Relationship between cell species and passage number and cell sheet formation]
In this test, rabbit-derived chondrocytes were used. Cartilage tissue was collected from a rabbit joint euthanized by Nembutal administration. The obtained cartilage tissue was digested with 0.1 mass% collagenase (Collagenase L, Nitta Gelatin) diluted in PBS for 2 hours at 37 ° C. to decompose the tissue. The obtained enzyme-treated product of cartilage tissue was passed through a cell strainer (BD Falcon) having a pore size of 40 μm to obtain chondrocytes in the form of isolated cells. The obtained chondrocytes were used as primary cultured cells. Further, the primary cultured cells were passaged once or twice to obtain the first or second passage subcultured cells of the chondrocytes. The medium composition and culture conditions in the subculture were based on known literature (Kaneshiro et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 349, p. 723-731, 2006).
実施例5として、前記ウサギ由来の軟骨細胞の初代培養細胞を、比較例5-1として、前記1代目の継代培養細胞を、比較例5-2として、前記2代目の継代培養細胞を、それぞれ用いた。3.5 cmサイズの細胞培養用ディッシュ（Thermo Fisher Scientific社）に、25 μg/ml（126 μM）のアスコルビン酸ナトリウム（和光純薬工業社）を含む培地を加え、該培地中に前記手順で得られた細胞を播種した。前記細胞を、所定の条件下で、100％コンフルエントの状態となるまで培養を行った。なお、培地組成及び培養条件は、前記公知文献に基づいた。培養終了後、実施例1の手順において、0.05質量％トリプシンを用いた他は前記と同様の手順で酵素処理を行った。 As Example 5, the primary cultured cells of the rabbit-derived chondrocytes, Comparative Example 5-1, the first passage cell, the Comparative Example 5-2, the second passage cell , Respectively. A medium containing 25 μg / ml (126 μM) sodium ascorbate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to a 3.5 cm cell culture dish (Thermo Fisher Scientific). Cells were seeded. The cells were cultured under predetermined conditions until they became 100% confluent. The medium composition and culture conditions were based on the above-mentioned known literature. After completion of the culture, the enzyme treatment was performed in the same manner as described above except that 0.05% by mass trypsin was used in the procedure of Example 1.
前記と同様の手順で、実施例5、並びに比較例5-1及び5-2の細胞を別途培養した。実施例4と同様の手順で、抗II型コラーゲン抗体を用いる免疫染色法により、培養終了後の実施例5、並びに比較例5-1及び5-2の細胞におけるII型コラーゲンの発現を評価した。また、実施例4と同様の手順で、細胞核染色法により、全細胞数を決定した。得られた結果に基づき、実施例5、又は比較例5-1若しくは5-2の細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合（％）を算出した。 The cells of Example 5 and Comparative Examples 5-1 and 5-2 were separately cultured in the same procedure as described above. In the same procedure as in Example 4, the expression of type II collagen in the cells of Example 5 and Comparative Examples 5-1 and 5-2 after completion of the culture was evaluated by immunostaining using an anti-type II collagen antibody. . Further, the total number of cells was determined by the cell nucleus staining method in the same procedure as in Example 4. Based on the obtained results, the ratio (%) of the number of cells having the ability to produce type II collagen to the total number of cells in the cell population of Example 5 or Comparative Example 5-1 or 5-2 was calculated. .
実施例5、並びに比較例5-1及び5-2の結果を表2に示す。表中、「継代数」の行は、軟骨細胞の初代培養細胞を0で、1代目の継代培養細胞を1で、2代目の継代培養細胞を2で、それぞれ示す。「細胞割合（％）」の行は、前記で説明した手順によって決定された、各試験区の細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合（％）を示す。「細胞構造体」の行は、細胞シートの形態の細胞構造体が得られた場合を○で、細胞シートの形態の細胞構造体が得られなかった場合を×で、それぞれ示す。 The results of Example 5 and Comparative Examples 5-1 and 5-2 are shown in Table 2. In the table, the “passage number” row indicates the primary culture cell of the chondrocyte as 0, the first subculture cell as 1, and the second subculture cell as 2. The “% cell” row indicates the percentage of cells having the ability to produce type II collagen relative to the total number of cells in the population of cells in each test zone, as determined by the procedure described above. Indicates. The row of “cell structure” indicates a case where a cell structure in the form of a cell sheet is obtained, and a case where a cell structure in the form of a cell sheet is not obtained, as x.
表2に示すように、実施例5の場合、細胞シートの形態の細胞構造体が形成され、前記酵素処理によって該細胞シートの形態の細胞構造体をディッシュ底面から剥離することができた。これに対し、比較例5-1及び5-2の場合、細胞構造体が形成されず、単離細胞の形態のままであった。前記結果から、細胞の集団における細胞の総数に対する、II型コラーゲンを産生する能力を有する細胞数の割合が30％以上、特に88％以上の場合には、細胞シートの形態の細胞構造体を得られることが示唆された。また、ラットに限らず、他種動物由来の細胞を用いた場合であっても、同様に細胞シートの形態の細胞構造体を得られることが示された。 As shown in Table 2, in the case of Example 5, a cell structure in the form of a cell sheet was formed, and the cell structure in the form of the cell sheet could be peeled from the dish bottom by the enzyme treatment. On the other hand, in Comparative Examples 5-1 and 5-2, no cell structure was formed, and the form of isolated cells remained. From the above results, when the ratio of the number of cells capable of producing type II collagen to the total number of cells in the cell population is 30% or more, particularly 88% or more, a cell structure in the form of a cell sheet is obtained. It was suggested that Moreover, it was shown that a cell structure in the form of a cell sheet can be obtained in the same manner even when cells derived not only from rats but also from other species are used.
［実施例6：細胞シート形成におけるコラーゲンの関与］
実施例5と同様の手順で、細胞シートの形態の細胞構造体を得た。得られた細胞構造体を、PBSに希釈した0.1質量％のコラゲナーゼ（Collagenase L）を用いて、37℃で2時間酵素処理した。その結果、細胞シートの形態の細胞構造体は、単細胞の状態まで分解された。この結果から、細胞シートの形態の細胞構造体を形成する細胞間接着には、コラーゲン、特にII型コラーゲンが関与していることが示唆された。また、酵素処理工程においてコラゲナーゼを使用した場合、他の酵素と比較して細胞シートの形態の細胞構造体を形成する細胞間接着が切断される可能性が高いことが示唆された。それ故、酵素処理工程において使用される酵素として、コラゲナーゼは好ましくないと考えられる。
[Example 6: Involvement of collagen in cell sheet formation]
A cell structure in the form of a cell sheet was obtained in the same procedure as in Example 5. The obtained cell structure was enzyme-treated at 37 ° C. for 2 hours using 0.1% by mass of collagenase (Collagenase L) diluted in PBS. As a result, the cell structure in the form of a cell sheet was decomposed to a single cell state. From these results, it was suggested that collagen, particularly type II collagen, is involved in the intercellular adhesion forming the cell structure in the form of a cell sheet. In addition, when collagenase was used in the enzyme treatment step, it was suggested that the cell-cell adhesion forming the cell structure in the form of a cell sheet is likely to be cut as compared with other enzymes. Therefore, it is considered that collagenase is not preferred as an enzyme used in the enzyme treatment step.
Claims (6)
前記細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体を酵素処理して、該細胞構造体を取得する、酵素処理工程；
を含む、細胞構造体の作製方法。 A cell structure forming step in which cells having the ability to produce type II collagen that is substantially in a differentiated state are cultured in a culture medium containing ascorbic acid to form a cell structure;
An enzyme treatment step of obtaining the cell structure by subjecting the cell structure formed in the cell structure formation step to an enzyme treatment;
A method for producing a cell structure, comprising:
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