JP2015188381A - 分離装置および分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】血小板と巨核球が混在する培養液から、巨核球を効率よく取り除き、かつ血小板に悪影響を及ぼさない分離装置及び分離方法の提供。【解決手段】巨核球Ｍと血小板Ｐが混在する培養液から巨核球を除去する分離装置１であって、培養液ＳＩを貯える培養液貯槽２と、培養液貯槽２内の培養液ＳＩを送液する機能を有する培養液送液手段と、電荷供給手段８により電荷供給流路７の壁面に、巨核球Ｍ表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給し、培養液ＳＩ中の巨核球Ｍを電荷供給流路７の壁面に付着して除去し、培養液ＳＩから巨核球Ｍを除去した回収液ＳＯを回収して貯える回収液貯槽１０と、を備える分離装置及び分離方法。【選択図】図１

Description

本発明は培養液から特定の成分を除去する分離装置および分離方法に関する。詳しくは、巨核球と血小板が含まれる培養液から、巨核球を除去する分離装置および分離方法に関する。

血液関連疾患の治療において血球細胞の輸血が行われている。なかでも血小板は止血において必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいては血小板の量的・質的低下に基づいた出血の予防や治療のための唯一の対処療法として、血小板輸血が行われている。輸血に用いられる血小板製剤は献血により賄われ、また、昨今では、献血者の全体数が減少する一方でウイルス感染症に汚染された献血者は増加するという現象もあり、献血に代わる安定した血小板供給源が求められ、その研究が活発に行われている。

その中でも、非特許文献１に記載の方法は、ヒトｉＰＳ細胞から自己複製が可能な巨核球を誘導することに成功している。巨核球は血小板を産生する細胞であることから、これにより血小板を安定的に大量に供給することも可能と成り得る。

非特許文献１の方法においては、培養液中の巨核球の自己複製を強制的に止めることにより、巨核球が成熟して血小板を産生する旨が記されている。ところで、培養液中の巨核球は同時に成熟して血小板を産生するのではなく、全ての巨核球が血小板を産生するのには時間を要する。一方において、血小板の特性は経時劣化するため、全ての巨核球が血小板を産生した段階においては初期に産生された血小板の劣化が進んでいる可能性がある。

また、血小板と巨核球が混在した状態で血小板製剤とすると、免疫系が活性化するという影響があって好ましくない。このため、血小板と巨核球が存在する培養液から巨核球を除去する必要がある。

Ｎａｋａｍｕｒａら、"Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｅｎａｂｌｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ−Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ"、［ｏｎｌｉｎｅ］、２０１４／２／１３、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、［平成２６年３月２７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ／ｎｅｗａｒｔｃｌｅｓ＞

培養液から特定の細胞成分を除去する方法としては、遠心分離が一般的に用いられるが、巨核球と血小板とは比重が近いため、大きな遠心加速度を付与する必要がある。このため、遠心分離法では、巨核球と血小板が分離できても、大きな遠心加速度により破壊される血小板が増え、血小板の回収率が低下する問題がある。

本発明は、このような事情を鑑みてなされたものであり、血小板と巨核球が混在する培養液から、巨核球を効率よく取り除き、かつ血小板に悪影響を及ぼさない分離装置および分離方法を提供するものである。

上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、巨核球と血小板が混在する培養液から巨核球を除去する分離装置であって、培養液を貯える培養液貯槽と、前記培養液貯槽内の培養液を送液する機能を有する培養液送液手段と、培養液から巨核球を除去した回収液を回収して貯える回収液貯槽と、電荷供給手段とを備える分離装置である。

本発明の分離装置により、培養液から巨核球を除去した回収液を得ることが出来る。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の分離装置であって、培養液貯槽と回収液貯槽間に電荷供給手段として機能する電荷供給流路を備え、前記電荷供給流路の回収液貯槽側の接続先を、回収液貯槽または、培養液貯槽への帰還流路の何れかに切り換える機能を有する流出先切換バルブを備え、前記電荷供給流路に巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給することで、流動する培養液中の巨核球を前記電荷供給流路の壁面に付着させる機能を有していることを特徴とする分離装置である
本発明の分離装置では、電荷供給流路で巨核球が壁面に付着して行くため、流体中の巨核球の比率が下がる。このため、最終的には培養液から巨核球を除去することが出来る。

請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の分離装置であって、緩衝液を貯える緩衝液貯槽と、前記緩衝液貯槽内の緩衝液を送液する緩衝液送液手段と、前記電荷供給流路入口の接続先を、培養液送液手段または緩衝液送液手段の何れかに切り換える機能を有する流入先切換バルブを備え、緩衝液で前記壁面に付着している付着物を剥離して、電荷供給流路を洗浄する機能を有していることを特徴とする分離装置である。

本発明の分離装置によると、電荷供給流路の壁面に付着している付着物による分離性能低下を防ぐことが出来る。

請求項４に記載の発明は、巨核球と血小板が混在する培養液を、培養液貯槽から流路に流動させる過程において、培養液貯槽及び流路の壁面に、巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給して、巨核球を前記壁面に付着させることにより、培養液から巨核球を除去することを特徴とする分離方法である。

本発明の分離方法により、流路の流動方向に沿って、巨核球が流路の壁面に付着して行くため、流体中の巨核球の比率が下がる。このため、最終的には培養液から巨核球を除去することが出来る。

請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の分離方法であって、流路の壁面に、巨核球に帯電している電荷と同じ極性の電荷を供給することで、前記壁面に付着している付着物を剥離して、流路を洗浄することを特徴とする分離方法である。

本発明の分離方法によると、流路の壁面に付着している主な付着物である巨核球を容易に剥離することが出来、流路を効率的に洗浄することが出来る。

血小板と巨核球が混在する培養液から、巨核球を効率よく取り除き、かつ血小板に悪影響を及ぼさない分離が可能となる。

本発明の一実施形態における分離装置の構成を説明する図である。 本発明の一実施形態における電荷供給流路の機能を説明する図である。 本発明の一実施形態における電荷供給流路の機能を断面で説明する図である。 本発明の別の実施形態における分離装置の構成を説明する図である。 本発明の別の実施形態における筒型モジュールについて説明する図である。 本発明の別の実施形態を用いた巨核球の分離を説明する図である。 本発明の別の実施形態を用いた機能例を説明する図である。 培養液貯槽で巨核球を付着させる実施形態を説明するための図である。

以下に、本発明の実施形態について、図を用いて説明する。

図１は、巨核球Ｍおよび血小板Ｐが混在する培養液ＳＩから、巨核球Ｍを除去する分離装置１の構成を示している。培養液貯槽２には培養液ＳＩが貯えられており、ポンプ３は培養液貯槽２中の培養液ＳＩを送液する培養液送液手段である。また、緩衝液貯槽４には緩衝液Ｂが貯えられており、ポンプ５は緩衝液貯槽４中の緩衝液Ｂを送液する緩衝液送液手段である。ポンプ３およびポンプ５の送液側には切換バルブ６があり、切換バルブ６の先には電荷供給流路７があって、ポンプ３またはポンプ５から送液される液の何れかを電荷供給流路７に通液する流入先切換機能をバルブ６は有している。電荷供給流路７は、液体を流す流路であるが、壁面に電荷が供給される構成となっている。電荷供給手段８は、電荷供給流路７の壁面に電荷を供給する機能を有している。電荷供給流路７の流出側には切換バルブ９があり、切換バルブ９は流出先を回収液貯槽１０または帰還流路１１の何れかに切り換える流出先切換機能を有している。回収液貯槽１０は電荷供給流路７で巨核球Ｍを除去した回収液ＳＯが貯えられるようになっている。また、帰還流路１１は培養液貯槽２と接続されている。

次に、分離装置１により培養液ＳＩから巨核球Ｍを除去する方法について説明する。まず、切換バルブ６の流入先をポンプ３とし、切換バルブ９の流出先を回収液貯槽１０とした状態で、ポンプ３を駆動すれば培養液貯槽２中の培養液ＳＩが電荷供給流路７内を流動する。この段階で、電荷供給手段８により電荷供給流路７の壁面に巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給する。そうすると、図２（ａ）のように、培養液ＳＩ中の巨核球Ｍが電荷供給流路７の壁面に付着するようになる。すなわち、流路の断面が円筒形状の場合を例にとると、図３（ａ）のように培養液ＳＩ中の巨核球Ｍには主流路７の壁面側へのクーロン力が働き、壁面に付着する。このため、電荷供給流路７を培養液ＳＩが流動することにより、培養液ＳＩから壁面に付着し、上流から下流に行く程、巨核球の比率が減少することになる。そこで、電荷供給流路７の長さおよび、電荷供給流路７の壁面への供給電荷量を適切に設定することにより、回収液貯槽１０には巨核球Ｍを含まない回収液ＳＯが流れ込む。電荷供給流路７の長さおよび壁面への電荷供給量が不足すると、回収液ＳＯ中に巨核球Ｍが残り、回収液ＳＯを培養液貯槽２に戻して再度分離を行う必要がある。なお、培養液を電荷供給流路７に１回だけ流しただけで全ての巨核球を分離出来ないことが明らかな場合は、切換バルブ９の流出先を帰還流路１１としてもよい。この場合、ポンプ３を駆動すれば培養液貯槽３→電荷供給流路７→帰還流路１１→培養液貯槽３の循環を所定時間行った後に切換バルブ９の流出先を回収液貯槽１１にすることで、巨核球を含まない回収液ＳＯを得ることが出来る。

以上のように、分離装置１により培養液ＳＩから巨核球Ｍを除去する操作を行うと、電荷供給流路７の壁面に巨核球Ｍが付着した状態となる。このため、この巨核球除去操作を続けると、電荷供給流路７の壁面に多数の巨核球Ｍが付着することになる。このような状態では、培養液ＳＩの流動により電荷供給流路７の壁面から巨核球Ｍが剥離することも起こりうる。また、長期使用しなかった場合等においては、電荷供給流路７の壁面への不純物蓄積も懸念される。そこで、分離装置１は、電荷供給流路７を洗浄する機能を備えていることが望ましい。

電荷供給流路７を洗浄するために、図１の分離装置１において、切換バルブ６の流入先をポンプ５、切換バルブ９の流出先を帰還流路１１としてポンプ５を駆動すれば、電荷供給流路７に緩衝液Ｂが流動する。この緩衝液Ｂの流速を上げることにより、電荷供給流路７の壁面に付着した巨核球Ｍおよび不純物は剥離し、培養液貯槽２側に流れ込むため電荷供給流路７が洗浄される。

更に、緩衝液Ｂを電荷供給流路７に流動させる過程において、電荷供給流路７の壁面に巨核球表面に帯電している電荷と同じ極性の電荷を供給すれば、前記壁面付着した巨核球Ｍを容易に剥離することが出来る。

これを分離装置１を用いて説明する。まず、切換バルブ６の流入先をポンプ５とし、切換バルブ９の流出先を帰還流路１１とした状態で、ポンプ５を駆動すれば緩衝液貯槽４中の緩衝液Ｂが電荷供給流路７内を流動する。この段階で、電荷供給手段８により電荷供給流路７の壁面に巨核球表面に帯電している電荷と同じ極性の電荷を供給する。そうすると、図２（ｂ）のように、主流路７の壁面に付着した巨核球Ｍが壁面から剥離し緩衝液Ｂに混ざった状態となる。すなわち、流路の断面が円筒形状の場合を例にとると、図３（ｂ）のように電荷供給流路７の壁面に付着したの巨核球Ｍには壁面から離れるクーロン力が働き、壁面から剥離する。剥離した巨核球Ｍおよび血小板Ｐは緩衝液Ｂの流動により、帰還流路１１を経て培養液貯槽２に流れ込む。

図４は本発明の別の実施形態である分離装置１００の構成を示している。図１の分離装置１との違いは、電荷供給流路７が複数の筒型モジュールによって構成されていることである。図１における電荷供給流路７と、図４における筒型モジュール７１（筒型モジュール７２、７３、７４についても同じ）との関係は図５（ａ）と図５（ｂ）に示すとおり筒の長さが短くなっている。なお、図５において、電荷供給流路７および筒型モジュールを円筒形としているが、断面形状は円に限定されるものではなく流路を形成出来れば、多角形形状等であっても良い。また、図４においては、筒型モジュール７１、７２、７３、７４によって主流路７を構成しているが、筒型モジュールの数は４個に限るわけではなく、これより少なくても、多くても良く、必要に応じて電荷供給流路７の長さ（筒型モジュールの数）を決めれば良い。

図４の分離装置１００によって、各筒型モジュール７１、７２、７３、７４に巨核球表面に帯電している電荷と逆極性の電荷を供給した状態で、培養液が流動する際の巨核球Ｍと血小板Ｐの混合状態を例示したのが図６であり、巨核球Ｍが壁面に付着することにより、徐々に除去される様子を表している。なお、前述のとおり、連結する筒型モジュールの数が換えられるので、図７のように巨核球Ｍの濃度が低い培養液ＳＩの分離操作においては、分離モジュール７４を省いても良い。

ここまで説明した実施の形態においては、電荷供給流路７の壁面に電荷を供給して巨核球Ｍを付着しているが、培養液貯槽２に電荷を供給して培養液貯槽の壁面に巨核球Ｍを吸着させることも可能である。その場合の一例を、図１の分離装置１の培養液貯槽２の壁面にも電荷供給手段８から電荷を供給出来るようにした、図８の分離装置１０１について説明する。分離装置１０１では、電荷供給手段８から培養液貯槽２の壁面に、巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給した状態で、切換バルブ６の流入先をポンプ３、切換バルブ９の流出先を帰還流路１１としてポンプ３を駆動する。こうすることで、培養液ＳＩは、培養液貯槽２→電荷供給流路７→帰還流路１１→培養液貯槽２を循環することにより、循環する液体内の巨核球Ｍが、培養液貯槽２の壁面に吸着していく。そこで、所定の循環条件（流速、時間、等）を経た段階で、切換バルブ９の流出先を回収液貯槽１０とすれば、巨核球Ｍが含まれない回収液ＳＯが得られる。また、この段階の、巨核球Ｍを含まない回収液ＳＯを回収液貯槽１０に導入するのに際して、ポンプ３の流出先が回収液貯槽１０になるような流路およびバルブを設けて送液しても良い。

なお、培養液貯槽２の壁面に電荷を供給して巨核球Ｍを除去する場合においては、電荷供給流路７の部分は電荷供給機能のない通常の流路であっても良いが、培養液貯槽２と電荷供給流路７の両方に、巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給して、巨核球Ｍを付着させても良い。

本発明は巨核球と血小板が混在する培養液から巨核球を除去する用途に適するが、これに限定されるものではなく、微粒子や細胞が混在する懸濁液から特定の微粒子または細胞を除去するような用途全般にも適用可能である。

１、１００ 分離装置
２ 培養液貯槽
３ ポンプ
４ 緩衝液貯槽
５ ポンプ
６ 切換バルブ
７ 電荷供給流路
８ 電荷供給手段
９ 切換バルブ
１０ 回収液貯槽
１１ 帰還流路
７１、７２、７３、７４ 筒型モジュール
Ｂ 緩衝液
Ｍ 巨核球
Ｐ 血小板
ＳＩ 培養液
ＳＯ 回収液

Claims (5)

1. 巨核球と血小板が混在する培養液から巨核球を除去する分離装置であって、
   培養液を貯える培養液貯槽と、
   前記培養液貯槽内の培養液を送液する機能を有する培養液送液手段と、
   培養液から巨核球を除去した回収液を回収して貯える回収液貯槽と、
   電荷供給手段とを備える分離装置。
2. 請求項１に記載の分離装置であって、
   培養液貯槽と回収液貯槽間に電荷供給手段として機能する電荷供給流路を備え、
   前記電荷供給流路の回収液貯槽側の接続先を、回収液貯槽または、培養液貯槽への帰還流路の何れかに切り換える機能を有する流出先切換バルブを備え、
   前記電荷供給流路に巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給することで、流動する培養液中の巨核球を前記電荷供給流路の壁面に付着させる機能を有していることを特徴とする分離装置。
3. 請求項２に記載の分離装置であって、
   緩衝液を貯える緩衝液貯槽と、
   前記緩衝液貯槽内の緩衝液を送液する緩衝液送液手段と、
   前記電荷供給流路入口の接続先を、培養液送液手段または緩衝液送液手段の何れかに切り換える機能を有する流入先切換バルブを備え、
   緩衝液で前記壁面に付着している付着物を剥離して、電荷供給流路を洗浄する機能を有していることを特徴とする分離装置。
4. 巨核球と血小板が混在する培養液を、培養液貯槽から流路に流動させる過程において、
   培養液貯槽及び流路の壁面に、巨核球表面に帯電している電荷と逆の極性の電荷を供給して、巨核球を前記壁面に付着させることにより、培養液から巨核球を除去することを特徴とする分離方法。
5. 請求項４に記載の分離方法であって、全電荷供給流路の壁面に巨核球に帯電している電荷と同じ極性の電荷を供給することで、前記壁面に付着している付着物を剥離して、電荷供給流路を洗浄することを特徴とする分離方法。

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