JP2015071549A - アトロジン−１抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】筋機能低下や筋萎縮を抑制し、寝たきり予防に有用な、安全性が高い医薬品又は飲食品を提供する【解決手段】ε−ヴィニフェリンを有効成分とするアトロジン−１遺伝子発現抑制剤とする。【選択図】 図１

Description

本発明は、アトロジン−１抑制剤およびそれを含有する筋萎縮予防または筋力低下予防・改善剤に関する。

高齢者は、加齢による筋萎縮や筋力の低下が認められ、筋肉損傷や骨折しやすくなるなどの傷害が発生しやすくなる。この治療・療養のための安静状態やギプス固定等の活動制限下におかれるとさらに筋力が低下してくる。
また一般に、高齢者に発生する筋肉の筋質量や筋力が減少する筋萎縮には、廃用性筋萎縮やサルコペニア等が挙げられる。筋萎縮が起こると、それに伴ってさらに筋機能の低下がみられるようになる。
高齢者は、筋力の低下から筋萎縮となり、筋萎縮からさらに上記のような悪循環に陥りやすく、最悪の場合には寝たきりになる。このため、生活機能を改善し、クオリティオブライフ（ＱＯＬ）を維持するためには、ある程度の強制的な運動により廃用性筋萎縮や筋機能の低下を抑制することができると言われている（非特許文献１：寝たきりゼロへの１０カ条の普及について、厚生省、平成３年）。

これまで、筋萎縮や筋機能の低下を防ぐ試みとしては、健常時に適度な運動の継続或いはリハビリテーションの理学療法等に限られており、より効果的な筋萎縮の抑制方法が望まれている。
すでに運動や理学療法のみならず、筋萎縮及びそれに伴う筋機能の低下、ひいては寝たきりを予防しうる成分の探索が行われている。
果実ポリフェノールによる筋萎縮抑制（特許文献１：特開２００１−８９３８７号公報）、リコピンによる筋蛋白分解抑制（特許文献２：特開２００４−５９５１８号公報）、スーパーオキシドジスムターゼによる筋の酸化ストレス軽減（特許文献３：特開２００６−６２９７６号公報）、カテキン類を有効成分とする筋力機能低下抑制剤（特許文献４：特開２００８−１３４７３号公報）、ミオスタチンペプチドによるミオスタチン拮抗物質（特許文献５：特表２００８−５３０００４号公報）、トゲドコロ抽出物を有効成分とする筋肉増強剤（特許文献６：ＷＯ２００８／１２３４１７号国際公開公報）、Ｌ−ロイシンを総必須アミノ酸中にモル比で３５〜６６％を含有させた骨格筋量減少予防剤（特許文献７：特開２０１２−１３１８１９号公報）などが挙げられる。

一方、遺伝子的な研究もおこなわれており、筋萎縮原因遺伝子（アトロジン：ａｔｒｏｇiｎｓ）が特定され廃用性筋萎縮の分子メカニズムが明らかにされてきた。とくにアトロジン−１と呼ばれる遺伝子の発現を抑制することで、廃用性筋萎縮を抑制できることが明らかになってきた（非特許文献２：生化学第８１巻第７号、６１４−６１８ページ、２００９年）。したがってアトロジン−１遺伝子の発現を抑制できれば、サルコペニアなどアトロジン−１遺伝子の発現活性化に伴って発生する筋萎縮を予防改善できるといわれている。

特開２００１−８９３８７号公報 特開２００４−５９５１８号公報 特開２００６−６２９７６号公報 特開２００８−１３４７３号公報 特表２００８−５３０００４号公報 ＷＯ２００８／１２３４１７号国際公開公報 特開２０１２−１３１８１９号公報

「寝たきりゼロへの１０カ条」の普及について：平成３年３月７日 老健第１８号（厚生省発表） 雑誌「生化学」第８１巻第７号、６１４−６１８ページ、２００９年、日本生化学会発行

本発明の目的は、筋機能低下や筋萎縮を抑制し、寝たきり予防に有用な医薬品又は飲食品を提供することにある。

そこで本発明者は、天然物由来の成分について検討を行ったところ、植物由来の天然成分であるε−ヴィニフェリンに強いアトロジン−１遺伝子発現の抑制作用を見出した。

本発明は、次の構成からなる。
（１）ε−ヴィニフェリンを有効成分とするアトロジン−１遺伝子発現抑制剤。
（２）（１）記載のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤を含む筋萎縮抑制剤。
（３）（２）記載の筋萎縮抑制剤を含む飲食品。
（４）（２）記載の筋萎縮抑制剤を含むサルコペニア予防・改善剤。

本発明により、アトロジン−１遺伝子発現の抑制剤が提供される。本発明のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤はε−ヴィニフェリンを有効成分としており、アトロジン―１の遺伝子発現を抑制することで最終的に廃用性筋萎縮あるいはサルコペニアの進行を抑制する。その結果筋肉筋機能の低下を抑える。したがって、寝たきりを予防するための医薬または健康食品として利用できる。

ε−ヴィニフェリンが横紋筋由来の筋芽細胞において、アトロジン−１遺伝子の発現を抑制していることを示すグラフである。

以下、本発明について詳述する。

本発明において、「筋萎縮」とは、筋細胞の減少や縮小により筋量が低下することをいい、長期間の安静臥床や骨折などによるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）、加齢に伴うもの（サルコペニアという。）が挙げられる。したがって筋萎縮の抑制とは、不活動や加齢に伴う筋量の低下を抑制することを意味する。
本発明は、ε−ビニフェリンを有効成分とするアトロジン−１の抑制剤である。アトロジン−１遺伝子が活性化すると骨格筋肉蛋白質の分解が促進され筋萎縮がすすむ。一方ＩＧＦ−１によって筋肉が肥大する際には、アトロジン−１遺伝子の発現が抑制され、筋肉が増強される。したがってε−ヴィニフェリンは、筋萎縮やサルコペニアの予防・改善剤として利用できる。

本発明で用いるε−ヴィニフェリンは、スチルベン化合物であり、ブドウのファイトアレキシンの一種として知られている。本発明でいうレスベラトロールは、スチルベン骨格を基本構造とするポリフェノールのモノマーを言う。ε−ヴィニフェリンはこのダイマーである。スチルベン化合物を含有する植物体、好ましくはブドウ側枝より、各種抽出溶媒、好ましくは７０％メタノールを用いてε−ヴィニフェリンを抽出することができる。抽出されたε−ヴィニフェリンは分取高速液体クロマトグラフィなどの分離精製手段によって分離、精製できる。

ε−ヴィニフェリンは、レスベラトロール類と総称されているが、本発明においては区別して用いることとする。本発明においてはレスベラトロールは上述のとおり、ブドウの葉、新芽、果皮等に存在するポリフェノールの一種で、スチルベン化合物の単量体を言い、ｔｒａｎｓ−レスベラトロールが代表的な化合物である。

ε−ヴィニフェリンは、有機化学的または微生物を用いて合成した高純度品を用いることが好ましい。しかし、まだ大量に供給することはできない。また、上述のブドウなどの植物体から抽出して用いることができ、その場合、抽出物を用いてもよく、またはその抽出物から得たレスベラトロール類をε−ヴィニフェリン高濃度含有物としてそのまま用いてもよい。天然物としては、ε−ヴィニフェリンの含有量がコントロールされているものであればよく、例えば、ブドウ、落花生、およびイタドリやツルドクダミ等のタデ科植物等が挙げられる。

天然物から抽出する場合の原料としてはブドウが特に好ましい。ブドウの種類は、特に限定されるものではないが、デラウエア、巨峰、甲州、ピオーネ、マスカット、シュナンブラン、グレナッシュ、マタロ、ミュラーテュルガウ、トレッビアーノ、ベリーＡ、カベルネソービニオン、メルロー、ピノノアール、カベルネフラン、シラー、シャルドネ、ソービニヨンブラン、セミヨン、シラー、ガメイ、リースリング、アリゴテ等が好ましい。
ブドウ抽出物とは、ブドウ果実、ブドウ葉またはブドウに由来する物からの抽出物を指す。ブドウに由来する物としては、ブドウジュース、ワイン、ワイン製造時の残渣、ワイン濃縮物等をいう。
抽出は、例えば、レスベラトロール類はブドウの果皮や新芽、葉、蔓に多く含まれていることが知られているので、それらを必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮し、さらに上述の分取クロマトによって分取することができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。
上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。また、ワイン、ワインの濃縮物または濃縮乾固した固形物中にも含まれているので、それらを用いることもできる。また、ワイン製造時に発生するブドウの残渣をそのまま用いるか、それから上記抽出方法と同様にして抽出することもできる。有機溶剤としてはエタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。

本発明のアトロジン−１抑制剤は医薬製剤としてヒトおよび動物に投与することができる他、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合しても摂取させることができる。

医薬製剤は、経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。
剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。
これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。

本発明医薬製剤において、有効成分であるε−ヴィニフェリンの投与量は、その純度、その剤型、また患者の年令、体重、適応症状などによって異なるが、例えば経口投与の場合は、成人１日１回〜数回投与され、１日あたり１回約１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは３ｍｇ〜２０ｍｇ／人程度投与するのがよい。

飲食品の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状に任意に成形することができる。これらには、食品中に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。

本発明の飲食品中に含まれる有効成分であるε−ヴィニフェリンの含有量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、１〜１０質量％程度とすることができる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。従ってこのような場合には、本発明の飲食品は、ε−ヴィニフェリンを含有し、筋萎縮により活動困難となる種々の疾患の予防または改善等に用いられるものである旨の表示を付した飲食品とすることができる。

以下、本発明を参考例、実施例に基づきさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、配合量はすべて質量％で示す。

実施例
＜横紋筋筋芽細胞におけるアトロジン−１遺伝子の抑制試験＞
マウス横紋筋筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞株は筋タンパク質合成系や分解系の研究や筋分化の研究に用いられており、筋肉の遺伝子発現を観察する目的に適している。

１．細胞株及び培養
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）は、ｖｉａｌ（＞１０^６個）で購入し、これをコンフルエントに達するまで培養し、さらに１：２０の割合で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）を行い、２４ｈｒ後に、約３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した細胞を試験に用いた。なお培養は３７℃、５％、ＣＯ_２の条件とした。
細胞剥離には、アクターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。
細胞培養用培地は、低グルコース（１，０００ ｍｇ／ｌ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）を基本液体培地として選択し、１０％ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び抗菌−抗真菌剤を１０ｍｇ／ｌ添加した。抗菌−抗真菌剤はペニシリンＧ；１００mｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩；１００mｇ／ｍｌ、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ；０．２５mｇ／ｍｌの混合物である。

２．アトロジン−１遺伝子発現抑制の測定
培養直前に、最終濃度１０、３０mＭになるようにｔｒａｎｓレスベラトロール（和光純薬工業株式会社）、同じく最終濃度１０、３０mＭになるようにε−ヴィニフェリン（和光純薬工業株式会社）を添加した。また、対照群の培養上清には、上記成分の調製に用いた溶媒であるエタノールを１０mｌ添加した。試験開始２４ｈｒ後に培養上清を吸引除去し、細胞を回収しｍＲＮＡ回収サンプルとした。
回収した細胞（１０×１０^６個／サンプル）は、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、（−）ＣａＣｌ２（−）ＭｇＣｌ２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄後、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、全ＲＮＡを細胞より抽出した。次に、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、ターゲット遺伝子プライマーは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ社にて合成したものを用い、リファレンスプライマー（マウスＡＣＴＢ）及び、他の試薬は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｎｉｓｉｔｉｃｓ社指定のものを用いた。
またターゲット遺伝子である、マウスＡｔｒｏｇｉｎ−１のプライマーシークエンスは、以下の通りである。
ｍＡｔｒｏｇｉｎ−１ ｆｏｒｗａｒｄ：５’−AGTGAGGACCGGCTACTGTG−３’
ｍＡｔｒｏｇｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−GATCAAACGCTTGCGAATCT−３’

３．解析方法
データ処理は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(R) ４８０システム内の解析用ソフトウエアを用いた。プローブ法によりＰＣＲ反応を行ったため、ターゲット遺伝子発現量は、リファレンス遺伝子発現量との比較による相対定量法：ΔＣｔ法により算出した。

４．結果
測定、解析結果を図１に示す。１０μＭのレスベラトロール、３０μＭのレスベラトロール及び１０μＭのε−ヴィニフェリンは横紋筋筋芽細胞のアトロジン−１遺伝子の発現を抑制しなかったが、３０μＭのε−ヴィニフェリンはアトロジン−１遺伝子の発現を抑制した。また３０μＭのレスベラトロールはアトロジン−１遺伝子の発現を促進させた。アトロジン−１遺伝子の発現抑制はレスベラトロール類のなかのε−ヴィニフェリン特有な作用であるといえる。
以上の結果から、ε−ヴィニフェリンはアトロジン−１遺伝子の発現によって引き起こされる筋委縮を抑制できる。

参考例１
天然物からのε−ヴィニフェリンの調製例
ブドウ側枝（品種デラウエア）約５ｋｇよりε−ヴィニフェリンを７０％メタノール１０ｌにより抽出し、分取ＨＰＬＣにより分離・精製して約２００ｍｇのε−ヴィニフェリンを得た。
ＨＰＬＣ分取時の移動相としてはアセトニトリル／水（７：１３）を用い、１ｍｌ／分の流速で約８分後に検出される。検出は紫外吸収２８８ｎｍで行った。
またメタノール抽出後溶媒を留去して得た残渣を、粗精製ε−ヴィニフェリンとして、以下の処方例におけるヴィニフェリンとして用いた。

処方例１：サプリメント
（配合成分） （質量％）
乳糖 ５４．０
結晶セルロース ３５．０
澱粉分解物 １０．０
ε−ヴィニフェリン １．０

処方例２：ソフトカプセル
（配合成分） （質量％）
食用大豆油 ５０．０
ε−ヴィニフェリン １．０
グリセリン脂肪酸エステル １２．０
ミツロウ ５．０
ゼラチン １２．０
水 ２０．０

処方例３：グミ
（配合成分） （質量％）
還元水飴 ４４．０
グラニュー糖 ２０．０
ブドウ糖 ２０．０
ゼラチン ４．７
水 ９．６
ε−ヴィニフェリン １．０
フレーバー ０．６
色素 ０．１

処方例４：清涼飲料
（配合成分） （質量％）
果糖ブドウ糖液糖 ３０．０
ブドウ果汁 ２０．０
乳化剤 ０．５
ε−ビニフェリン １．０
香料 適量
精製水 残余

処方例５：錠菓
（配合成分） （質量％）
砂糖 ７６．０
グルコース １９．０
ε−ヴィニフェリン １．０
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
精製水 ３．８

処方例６：キャンディー
（配合成分） （質量％）
砂糖 ５０．０
水飴 ３３．０
水 １４．０
有機酸 ２．０
ε−ヴィニフェリン ０．５
香料 ０．５

Claims (4)

1. ε−ヴィニフェリンを有効成分とするアトロジン−１遺伝子発現抑制剤。
2. 請求項１に記載のアトロジン−１遺伝子発現抑制剤を含む筋萎縮抑制剤。
3. 請求項２に記載の筋萎縮抑制剤を含む飲食品。
4. 請求項２に記載の筋萎縮抑制剤を含むサルコペニア予防・改善剤。