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JP2015057068A - 膀胱癌及びその他の癌の治療及び検出に有用な名称１５８ｐ１ｄ７の核酸及び対応タンパク質 - Google Patents

膀胱癌及びその他の癌の治療及び検出に有用な名称１５８ｐ１ｄ７の核酸及び対応タンパク質 Download PDF

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Abstract

【課題】１５８Ｐ１Ｄ７と命名された新規な遺伝子及びそのコードするタンパク質を開示する。
【解決手段】１５８Ｐ１Ｄ７は正常成人組織においては組織特異的な発現を示すが、表１に示した複数の癌において異常に発現される。従って、１５８Ｐ１Ｄ７は癌の診断及び／又は治療のための標的を提供する。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子若しくはそのフラグメント、又はそのコードするタンパク質若しくはそのフラグメントは免疫応答を誘発するために用いることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７と命名された新規な核酸配列及びそのコードタンパク質、及びその変異体、並びに１５８Ｐ１Ｄ７及びその変異体を発現する種々の癌の処置に有用な診断及び治療方法及び組成物に関する。
癌は、冠状動脈性疾患に次いで２番目に多い人間の死因である。世界的にみても、毎年数百万の人々が癌で死亡している。米国癌協会（ＡＣＳ）の報告によれば、米国だけでも、年間５０万人を遥かに超える人々の死因となっており、年間１２０万人を超える人々が新規に癌と診断される。心疾患による死亡が大きく減少しつつあるのに対し、癌による死亡は一般的に増加している。次世紀の初期には、癌は最大の死因になると予測されている。
米国での癌の新患の全体のうち、膀胱癌は、男性では凡そ５％（５番目に多い腫瘍）、女性では凡そ３％（８番目に多い腫瘍）を占める。発症率は、世代が上がるに連れて漸増する。１９９８年には、推定で５４，５００症例あり、うち３９，５００症例が男性で、１５，０００症例が女性であった。米国における年齢調整した発症率は、男性では３２／１００，０００、女性では８／１００，０００である。３：１という歴史的な男性／女性比は、女性の喫煙動向に応じて減少しているであろう。１９９８年では、膀胱癌により推定１１，０００人が死亡した（男性７，８００人、女性３，９００人）。膀胱癌の発症率及び死亡率は、年齢とともに著しく増加しかつ世代が上がるに連れ問題が大きくなる。
膀胱癌は、一群の異種の疾患から構成される。疾患制御及び生存の主要な決定要因は、疾患の組織構造及び進行度である。これらの要因の主要なコードには、病態の分類：国際疾病分類腫瘍学（the International Classification of Diseases-Oncology）（ＩＣＤＯ）及び疾患の進行度のステージ分類：ＴＮＭ分類が含まれる。（表２１。）膀胱癌及びその他の泌尿生殖器の癌の一般的な考察については、例えば、Volgelzang, et al, Eds. Comprehensive Textbook of Genitourinarv Oncology, (Williams & Wilkins, Baltimore 1996), とりわけ295-556頁を参照されたい。
膀胱における腫瘍については３つの主要な形態が報告されている。膀胱癌の最も多い形態は移行上皮癌（ＴＣＣ）である。これは膀胱癌全体の凡そ９０％に達する。膀胱癌の２番目に多い形態は扁平上皮癌であり、膀胱癌全体の凡そ８％を占めるが、これは住血吸虫病が風土病でない場合である。住血吸虫病が風土病である場合は、扁平上皮癌は膀胱腫瘍の凡そ７５％に達する。扁平上皮癌は膀胱のより深い層に浸潤する傾向がある。膀胱癌の３番目に多い形態は腺癌であり、膀胱癌の１％〜２％を占める。これらの形態は癌の主要な浸潤性形態である。
膀胱癌は、通常、細胞顕微鏡法及び尿中細胞診断法を用いて検出及び診断される。しかしながら、これらの方法は感度がよくないことが示されている。現在診療的に使用されている比較的より信頼性の大きい検出方法としては、例えば、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）ｓｔａｔ検査、ＮＭＰ２２タンパク質アッセイ、テロメラーゼ発現及びヒアルロン酸及びヒアルロニダーゼ（ＨＡ−ＨＡａｓｅ）尿検査法がある。膀胱癌の診断にそのようなマーカーを使用することの利点は、標準的な細胞診断法と比べて、初期段階の腫瘍に対する感度が比較的大きいことである。
例えば、ＢＴＡｓｔａｔ検査は、膀胱癌に対し感度が６０〜８０％、特異性が５０〜７０％であり、他方、ＨＡ−ＨＡａｓｅ尿検査法は、膀胱癌に対し感度が９０〜９２％、特異性が８０〜８４％である（J Urol 2001 165:1067）。一般的には、ステージＴａの腫瘍に対する感度は、核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）では８１％、テロメラーゼでは７０％、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）では３２％、細胞診断法では２６％である（J Urol 2001 166:470; J Urol 1999, 161:810）。テロメラーゼ活性を測定するテロメア反復配列アッセイは比較的感度は大きいが、テロメラーゼは尿中では不安定なので、現状ではこの検出方法は信頼性は小さい。
大抵の膀胱癌は膀胱で再発する。膀胱癌は、通常、膀胱の経尿道的切除（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法又は免疫療法との組合せによって処置される。膀胱癌の多巣性及び再発性の性質は、ＴＵＲには限界があることを示している。大抵の筋肉浸潤癌は、ＴＵＲ単独では治療されない。根治的な嚢胞切除及び代替尿路形成は、膀胱癌を除去するための最も効果的な手段であるが、排尿及び生殖機能に対する影響は避けることができない。
膀胱内カルメット-ゲラン菌（ＢＣＧ）は、膀胱癌の治療に使用される一般的かつ有効な免疫療法剤である。しかしながら、患者の３０％はＢＣＧ療法が効かず、更に進行して浸潤性・転移性の疾患に至る（Catalona et al. J Urol 1987, 137:220-224）。とりわけ薬物性膀胱炎、細菌感染の危険及び血尿のようなＢＣＧ関連の副作用がたびたび観察された。その他の代替可能な免疫療法も膀胱癌の治療に使用されてきた。例えば、ＫＬＨ（Flamm et al. Urologe 1994; 33:138-143）、インターフェロン（Bazarbashi et al. J Surg Oncol. 2000; 74:181-4）及びＭＡＧＥ−３ペプチド結合樹状細胞（Nishiyama et al. Clin Cancer Res 2001; 7:23-31）等である。これらのアプローチは全て依然として実験段階に留まっている（Zlotta et al. Eur Urol 2000;37 Suppl 3:10-15）。膀胱癌患者に有益な診断及び治療法に対する大きな要求が引き続き存在する。更に、世界レベルからみれば、幾つかの癌は主要な死因として際立っている。とりわけ、肺、前立腺、乳房、結腸（大腸）、膵臓及び卵巣の癌は、癌による主要な死因である。更に、これらの及び事実上全てのその他の癌は、共通の致死的特徴を共有している。極めて稀な例外はあるが、癌に由来する転移性疾患は致死的である。更に、これらの癌の患者が最初の癌に対しては差し当たり乗り切ったとしても、彼等の生活ないし人生は大きく変容される。多くの癌患者は、再発又は治療の失敗の可能性に対する意識によって引き起こされる強い不安を経験する。多くの癌患者は、治療後の肉体的衰弱を経験する。更に、多くの癌患者は再発を経験する。
前立腺癌は、男性に関し世界で４番目に多い癌である。北アメリカ及び北ヨーロッパでは、前立腺癌は男性の最も一般的な癌であり、男性の癌による２番目に多い死因である。米国だけでも、年間３０，０００人を遥かに超える男性が前立腺癌で死亡しており、肺癌に続いて２番目である。これほど数値が大きいにも関わらず、依然として転移性前立腺癌に対する有効な治療法はない。外科的前立腺切除、放射線治療、ホルモン摘除療法、外科的精巣摘出及び化学療法が主要な治療法として利用されている。残念なことに、これらの治療法は、多くの場合効果がなく、また望ましくない結果を伴うことも多い。
診断の最前線では、初期ステージ、即ち局在腫瘍を正確に検出することのできる前立腺主要マーカーが存在しないため、前立腺癌の診断及び処置は著しく制限されている。血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用な手段であったが、その特異性及び一般的有用性は、幾つかの重要な点において不足があると広く考えられている。ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ及びＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは前立腺癌の診断及び治療の労力を軽減したが、診断及び治療を一層改善するために、前立腺及び関連する癌に対する付加的マーカー及び治療ターゲットの同定に対する要求がある。
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、成人の悪性腫瘍の凡そ３％を占める。腺腫の直径が２〜３ｃｍになった場合、悪性腫瘍に転じた可能性がある。成人では、２つの主要な悪性腎腫瘍は、腎盂又は尿管の腎細胞腺癌及び移行細胞癌である。米国では、１９９８年には、腎細胞腺癌の発症は２９，０００例を超えており、１１，６００人より多くの患者が腎細胞腺癌で死亡したと推定されている。移行細胞癌は頻度はより小さいが、米国では年間凡そ５００例発症している。
何十年もの間、腎細胞腺癌に対する主要な治療法は手術であった。最近まで、転移性疾患はどのような全身療法に対しても難治性であった。全身療法、とりわけ免疫療法の最近の発展により、転移性腎細胞癌は、持続的反応の可能性を有する適切な患者において強力にアプローチされるであろう。しかしながら、これらの患者に対する有効な治療法に対する要求は依然として存在する。
米国では、２０００年に、推定１３０，２００例の結腸直腸癌が発症したが、そのうち９３，８００例は結腸癌、３６，４００例が直腸癌であった。結腸直腸癌は、男性及び女性の３番目に多い癌である。その発症率は１９９２年から１９９６年の間に著しく減少した（年率−２．１％）。この減少は、検診及びポリープ除去の増加によりポリープから浸潤性癌への移行が阻止されたことに起因することを示唆する研究もある。２０００年には推定で５６，３００の死亡例があったが（うち４７，７００例が結腸癌、８，６００例が直腸癌）、これは、米国における癌による死亡例全体の凡そ１１％に達する。
現在、手術は、結腸直腸癌に対する最も多い治療形態であり、転移していない癌に対しては、治癒的であることが多い。化学療法、又は化学療法プラス放射線療法は、癌が腸壁を深く穿孔した又はリンパ節に転移した多くの患者に対し手術前後に実施される。永久人工肛門形成（排泄物を排出するための腹部開口の形成）の必要は、結腸癌に対しては度々あり、直腸癌に対しても稀にある。従って、結腸直腸癌に対する有効な診断及び治療方法に対する要求は依然として存在する。
２０００年には、肺癌及び気管支癌の新患は推定１６４，１００例であったが、これは米国で癌と診断された症例全体の１４％を占める。肺癌及び気管支癌の発症率は、男性では、１９８４年の最高値８６．５／１００，０００から１９９６年の７０．０／１００，０００へと著しく減少し続けている。１９９０年代では、女性でも増加率は減少し始めた。１９９６年には、女性の発症率は４２．３／１００，０００であった。
肺癌及び気管支癌により、２０００年には推定１５６，９００人が死亡したが、これは癌による死者数全体の２８％を占める。１９９２年から１９９６年の間、肺癌の死亡率は男性では大きく減少したが（年率−１．７％）、女性の死亡率は引き続き大きく上昇し続けた（年率０．９％）。１９８７年以降、毎年、より多くの女性が乳癌よりも肺癌で死亡したが、肺癌は、４０歳以上では、女性の癌による最も多い死因であった。肺癌の発症率及び死亡率の減少は、過去３０年に亘る喫煙率の減少に起因する可能性は最も大きいが、女性の喫煙習慣の減少は、男性のそれに遅れを取っている。成人のタバコの使用の減少のペースが落ちるとともに、若年層のタバコの使用が再び増加していることは問題である。
肺癌及び気管支癌の治療手段は癌の種類とステージによって決定される。治療手段としては、例えば、手術、放射線療法及び化学療法がある。多くの局在癌に対しては、手術が通常選択される治療手段である。この癌は発見された時には既に転移していることが通常であるので、放射線療法及び化学療法が手術と組合せて使用されることが多い。化学療法単独又は放射線療法との組合せは、小細胞肺癌に対して選択される（唯一の）治療手段であるが、この処置では、患者の多くが緩解を経験し、これは、場合によっては長く続く。しかしながら、肺癌及び気管支癌に対する有効な治療及び診断法に対する要求は依然として存在する。
米国では２０００年に、女性の間で推定１８２，８００例の浸潤性乳癌が新たに発症したと考えられている。更に、２０００年には、凡そ１，４０００例の乳癌の新患が男性の間で診断されたと考えられている。１９８０年代に年率凡そ４％増加した後、女性の乳癌の発症率は、１９９０年代には一定水準に達し、凡そ１１０．６／１００，０００例となった。
２０００年には、米国だけでも、推定４１，２００人（女性４０，８００人、男性４００人）が乳癌で死亡した。乳癌は女性の２番目に多い癌の死因である。ごく最近のデータによると、死亡率は、１９９２年から１９９６年の間に大きく減少したが、白人黒人に限らず若い女性の減少が最も大きかった。このような減少は、恐らく、早期発見と治療法の改善によるのものであろう。
医療事情及び患者の意向を考慮すると、乳癌の治療は、乳腺腫瘤摘出（腫瘍の局所的除去）及び腋窩リンパ節郭清；乳房切除（乳房の外科的除去）及び腋窩リンパ節郭清；放射線療法；化学療法；又はホルモン療法を含むであろう。これらの方法のうち２以上が組み合わされて使用されることもよくある。数多くの研究により、初期ステージの癌に対しては、乳腺腫瘤摘出と放射線療法の併用処置後の長期間生存率は、胸筋温存乳房切除後の生存率とほぼ等しいことが示されている。再建技術の大きな進歩により、乳房切除後の乳房再建のために選択可能な幾つかの手段が提供されている。最近では、そのような乳房再建は、乳房切除と同時に実施された。
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）を適切な量の周囲の正常乳房組織とともに局所的に切除することにより、ＤＣＩＳの局所的再発は阻止されるであろう。乳房への放射線照射及び／又はタモキシフェンは、残存する乳房組織におけるＤＣＩＳ発症の可能性を減じるであろう。これは、ＤＣＩＳは、未処置のまま残存したとしても、浸潤性乳癌に移行しないと考えられているので重要である。しかしながら、これらの治療法に応じた深刻な副作用ないし後遺症は存在する。従って、乳癌にたいする有効な治療法に対する要求は存在する。
米国では２０００年に推定２３，１００例の卵巣癌の新患があった。これは、女性の全ての癌のうち４％を占め、婦人科系の癌のうち２番目に多い癌であった。１９９２年から１９９６年の間、卵巣癌の発症率は著しく減少した。卵巣癌のために、２０００年には推定１４，０００人が死亡した。卵巣癌は、女性の生殖系の他のどの癌より多くの死者を出している。
手術、放射線療法及び化学療法が、卵巣癌の治療に対し選択可能な手段である。手術は、通常、一方又は両方の卵巣の摘出、卵管の摘出（卵管卵巣摘出）及び子宮の摘出（子宮摘出）を含む。ごく早期の腫瘍の場合、とりわけ妊娠出産を望む若い女性の場合は、関係する卵巣のみが摘出される。進行癌では、化学療法の効果を高めるために、腹腔内の疾患部位の全摘が試みられる。従って、卵巣癌の有効な治療手段に対する大きな要求が存在する。
米国では２０００年に推定２８，３００例の膵臓癌の新患がみられた。過去２０年にわたって、膵臓癌の発症率は男性では減少した。女性の発症率はほぼ一定に留まっているが、何れ減少し始めるであろう。膵臓癌により、米国では２０００年に推定２８，２００人が死亡した。過去２０年にわたり、男性の死亡率は僅かであるが有意に減少した（年率凡そ−０．９％）のに対し、女性では僅かに上昇した。
手術、放射線療法及び化学療法が、膵臓癌の治療に対し選択可能な手段である。これらの治療手段は、多くの患者に対し生存率の向上及び／又は症状の緩和を及し得るが、大抵の場合は治癒の可能性は低い。従って、膵臓癌に対する付加的な治療及び診断方法に対する大きな要求が存在する。
本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７と命名された新規な核酸配列及びそのコードペプチドに関する。本書においては、「１５８Ｐ１Ｄ７」は、新規なポリヌクレオチド又はポリペプチド又はそれらの変異体又は開示された発明の両者をいうものとする。
１５８Ｐ１Ｄ７をコードする核酸は、表１に列挙された癌において過剰発現される。正常組織における１５８Ｐ１Ｄ７発現のノーザンブロット発現分析は、成人の組織では制限された発現パターンを示している。１５８Ｐ１Ｄ７のヌクレオチド配列（図２）及びアミノ酸配列（図２及び図３）が求められた。成人の正常組織における１５８Ｐ１Ｄ７の組織関連プロファイルは、膀胱腫瘍で観察された過剰発現と組合せると、１５８Ｐ１Ｄ７は少なくとも複数の癌において異常なまでに過剰発現されることを示している。従って、１５８Ｐ１Ｄ７核酸及びポリペプチドは、有用な診断薬（又は指示薬）及び／又は表１に列挙したもののような組織の癌に対する有用な治療ターゲットとして利用可能である。
本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７核酸、ｍＲＮＡ及び／又はコード配列の全部又は一部に対応する又は相補的な、好ましくは単離型の、ポリヌクレオチド、例えば１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及び４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６以上の連続アミノ酸をコードするポリヌクレオチド；１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の少なくとも凡そ３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５，１００又は１００超の連続アミノ酸、及びペプチド／タンパク質それ自体；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及び関連分子（ＰＮＡ等）、１５８Ｐ１Ｄ７核酸配列又はｍＲＮＡ配列又はそれらの部分に相補的な又は少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子、ｍＲＮＡ、又は１５８Ｐ１Ｄ７コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを提供する。更に、ｃＤＮＡ及び１５８Ｐ１Ｄ７をコードする遺伝子の単離手段が提供される。更に、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、当該分子で形質転換又は形質導入された細胞、及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系も提供される。更に、本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質及びそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体、例えば、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、マウス及びその他の哺乳類の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト型抗体、及び検出可能なマーカーで標識された抗体等を提供する。更に、本発明は、特殊なＨＬＡ分子という意義における１５８Ｐ１Ｄ７のエピトープを認識するＴ細胞クローンを含む。
更に、本発明は、種々の生物学的サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びタンパク質の存在、量及び状態の検出方法、並びに１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びポリペプチドを発現する細胞の同定方法を提供する。本発明の典型的な一実施形態は、癌のようなある形態の増殖調節不全を有するか有する疑いのある組織又は血液サンプル中における１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びポリペプチドのモニター方法を提供する。
なお、表５〜表１８及び表２２〜４９（ＨＬＡペプチド表と総称する）に示した各ペプチドのそれら自身の親タンパク質、例えば変異体１、変異体２等に対する開始位置を決定するために、以下の３つのファクタ、即ち特定の変異体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ及び表ＶＩＩのサーチペプチドが基準とされることに注意すべきである。一般的には、独特のサーチペプチドが、特定の変異体のＨＬＡペプチドを得るために使用される。各々の親分子に対する各サーチペプチドの位置は表５５に列挙されている。従って、サーチペプチドが位置“Ｘ”で開始する場合、各々の親分子におけるＨＬＡペプチドの正確な位置を得るためには、表５〜表１８及び表２２〜表４９中の各々の位置に値“Ｘ−１”を加えなければならない。例えば、ある特定のサーチペプチドがその親分子の位置１５０で開始する場合、親分子におけるアミノ酸の位置を計算するためには、１５０−１、即ち１４９を各々のＨＬＡペプチドアミノ酸位置に加えなければならない。
更に、本発明は、種々の免疫原性又は治療組成物及び膀胱癌のような１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の治療方法、例えば１５８Ｐ１Ｄ７の転写、翻訳、プロセッシング又は機能の阻害を目的とする治療法、並びに癌ワクチンを提供する。
更に、本発明は、図２のタンパク質に向けられた哺乳類の免疫応答の惹起方法であって、哺乳類の免疫系の細胞と、ａ）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及び／又はｂ）当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とを接触させ、以って当該タンパク質に対する免疫応答が惹起されることを含む方法を提供する。１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞又は少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含み得る；そして、当該エピトープと哺乳類免疫系Ｔ細胞又はＢ細胞とをそれぞれ接触させることにより、Ｔ細胞又はＢ細胞は活性化される。免疫系細胞とは、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及び／又はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）である。免疫系細胞がＢ細胞の場合、活性化されたＢ細胞は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生する。免疫系細胞が細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）としてのＴ細胞の場合、活性化されたＣＴＬは、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を産生する自己細胞を死滅する。免疫系細胞がヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）としてのＴ細胞の場合、活性化されたＨＴＬは、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞障害活性又はＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する。
１５８Ｐ１Ｄ７ＳＳＨ核酸配列。１５８Ｐ１Ｄ７ＳＳＨ配列は２３１ｂｐを含む。 図２Ａに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１”又は“１５８Ｐ１Ｄ７変異体１”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ａに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１”又は“１５８Ｐ１Ｄ７変異体１”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ａに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１”又は“１５８Ｐ１Ｄ７変異体１”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ｂに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体２（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.２”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ｂに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体２（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.２”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ｂに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体２（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.２”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２５４８の領域にわたる。 図２Ｃに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体３（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２２２１の領域にわたる。 図２Ｃに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体３（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２２２１の領域にわたる。 図２Ｃに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体３（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜２２２１の領域にわたる。 図２Ｄに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体４（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.４”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜１２１０の領域にわたる。 図２Ｄに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体４（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.４”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜１２１０の領域にわたる。 図２Ｅに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体５（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.５”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸４８０〜３００５の領域にわたる。 図２Ｅに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体５（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.５”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸４８０〜３００５の領域にわたる。 図２Ｅに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体５（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.５”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸４８０〜３００５の領域にわたる。 図２Ｆに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体６（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.６”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜１６１２の領域にわたる。 図２Ｆに、１５８Ｐ１Ｄ７変異体６（“１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.６”と称することもある）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。開始メチオニンのコドンには下線を引いた。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸２３〜１６１２の領域にわたる。 図３Ａに、１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１のアミノ酸配列を示す。８４１アミノ酸を含む。本書においては、１５８Ｐ１Ｄ７という場合、特段の明示がない限り、図２、図３、図１０、図１１及び図１２に示したものを含む、１５８Ｐ１Ｄ７の全ての変異体を含むものとする。 図３Ｂに、１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３のアミノ酸配列を示す。７３２アミノ酸を含む。本書においては、１５８Ｐ１Ｄ７という場合、特段の明示がない限り、図２、図３、図１０、図１１及び図１２に示したものを含む、１５８Ｐ１Ｄ７の全ての変異体を含むものとする。 図３Ｃに、１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.４のアミノ酸配列を示す。３９５アミノ酸を含む。本書においては、１５８Ｐ１Ｄ７という場合、特段の明示がない限り、図２、図３、図１０、図１１及び図１２に示したものを含む、１５８Ｐ１Ｄ７の全ての変異体を含むものとする。 図３Ｄに、１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.６のアミノ酸配列を示す。５２９アミノ酸を含む。本書においては、１５８Ｐ１Ｄ７という場合、特段の明示がない限り、図２、図３、図１０、図１１及び図１２に示したものを含む、１５８Ｐ１Ｄ７の全ての変異体を含むものとする。 仮想タンパク質ＦＬＪ２２７７４と１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１アミノ酸とのアラインメントＢＬＡＳＴホモロジ。 １５８Ｐ１Ｄ７とヒトタンパク質とのアミノ酸配列アラインメント。 １５８Ｐ１Ｄ７と、ＩＧＦＡＬＳに類似するヒトタンパク質とのアミノ酸配列アラインメント。 ＲＴ−ＰＣＲによる１５８Ｐ１Ｄ７の発現。第一鎖ｃＤＮＡは、生体プール１（ＶＰ１：肝臓、肺及び腎臓）、生体プール２（ＶＰ２：膵臓、大腸及び胃）、前立腺異種移植片プール（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌プール、膀胱癌プール、大腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール、乳癌プール及び転移プールから調製した。ノーマライゼーションは、アクチン及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いるＰＣＲによって実行した。１５８Ｐ１Ｄ７に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを３０サイクルの増幅で実行した。膀胱癌プール及び乳癌プールでは１５８Ｐ１Ｄ７の大きな発現が見られる。ＶＰ１、ＶＰ２、異種移植片プール、前立腺癌プール、大腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール及び転移プールではより低いレベルの発現が見られる。 正常ヒト組織における１５８Ｐ１Ｄ７の発現。２μｇ ｍＲＮＡ／レーンによる２つのmultiple tissueノーザンブロットを１５８Ｐ１Ｄ７フラグメントによってプローブした。サイズの目盛（単位：キロベース（ｋｂ））は縦軸に示した。実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、前立腺、肝臓、胎盤及び心臓において発現し、低レベルではあるが小腸及び大腸においても発現したことが分かる。 膀胱癌患者試料における１５８Ｐ１Ｄ７の発現。ＲＮＡは膀胱癌患者から単離した膀胱癌細胞株（ＣＬ）、正常膀胱（Ｎ）、膀胱腫瘍（Ｔ）及び適合正常隣接組織（ＮＡＴ）から抽出した。１０μｇ 全ＲＮＡ／レーンによるノーザンブロットを１５８Ｐ１Ｄ７フラグメントによってプローブした。サイズの目盛（単位：キロベース（ｋｂ））は縦軸に示した。実験結果から、３つの膀胱癌細胞株のうちの１つで１５８Ｐ１Ｄ７が発現したことが分かる。患者試料では、６つの被検腫瘍のうちの４つで１５８Ｐ１Ｄ７の発現が検出される。 膀胱癌患者試料における１５８Ｐ１Ｄ７の発現。別の実験では、全ての被検患者腫瘍において１５８Ｐ１Ｄ７の発現が検出される（８Ｂ）。健康なドナーから単離された正常組織においてではなく、（疾患組織から単離された）正常隣接組織において見られる発現は、これらの組織は完全には正常ではないこと及び１５８Ｐ１Ｄ７は初期ステージの腫瘍において発現され得ることを示していると考えられる。 肺癌患者試料における１５８Ｐ１Ｄ７の発現。ＲＮＡは肺癌患者から単離した肺癌細胞株（ＣＬ）、肺腫瘍（Ｔ）及び正常隣接組織（ＮＡＴ）から抽出した。１０μｇ 全ＲＮＡ／レーンによるノーザンブロットを１５８Ｐ１Ｄ７フラグメントによってプローブした。サイズの目盛（単位：キロベース（ｋｂ））は縦軸に示した。実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、３つの肺癌細胞株のうちの１つ及び３つの被検肺腫瘍のすべてで発現したが、正常肺組織では発現しなかったことが分かる。 乳癌患者試料における１５８Ｐ１Ｄ７の発現。ＲＮＡは乳癌患者から単離した乳癌細胞株（ＣＬ）、正常乳房（Ｎ）、及び乳房腫瘍（Ｔ）から抽出した。１０μｇ 全ＲＮＡ／レーンによるノーザンブロットを１５８Ｐ１Ｄ７フラグメントによってプローブした。サイズの目盛（単位：キロベース（ｋｂ））は縦軸に示した。実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、３つの乳癌細胞株のうちの２つ及び２つの乳房腫瘍において発現したが、正常乳房組織では発現しなかったことが分かる。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtscale社のウェブサイトでアクセス可能な、ホップ（Hopp）及びウッズ（Woods）の方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtscale社のウェブサイトでアクセス可能な、ホップ（Hopp）及びウッズ（Woods）の方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtscale社のウェブサイトでアクセス可能な、ホップ（Hopp）及びウッズ（Woods）の方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtscale社のウェブサイトでアクセス可能な、ホップ（Hopp）及びウッズ（Woods）の方法（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）の方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の疎水性親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）の方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の疎水性親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）の方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の疎水性親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle）の方法（Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の疎水性親水性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ジャナン（Janin）の方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のパーセントアクセス可能残基アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ジャナン（Janin）の方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のパーセントアクセス可能残基アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ジャナン（Janin）の方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のパーセントアクセス可能残基アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ジャナン（Janin）の方法（Janin J., 1979 Nature 277:491-492）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のパーセントアクセス可能残基アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、バスカラン（Bhaskaran）及びポナスワミィ（Ponnuswamy）の方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の平均可撓性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、バスカラン（Bhaskaran）及びポナスワミィ（Ponnuswamy）の方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の平均可撓性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、バスカラン（Bhaskaran）及びポナスワミィ（Ponnuswamy）の方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の平均可撓性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、バスカラン（Bhaskaran）及びポナスワミィ（Ponnuswamy）の方法（Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６の平均可撓性アミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ディリージ（Deleage）及びルー（Roux）の方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のベータターンアミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ディリージ（Deleage）及びルー（Roux）の方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のベータターンアミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ディリージ（Deleage）及びルー（Roux）の方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のベータターンアミノ酸プロファイル。 ExPasy molecular biology serverによりWorld Wide Webのアドレス（URL:expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl）に置かれたProtScale社のウェブサイトでアクセス可能な、ディリージ（Deleage）及びルー（Roux）の方法（Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294）を用いたコンピュータアルゴリズム配列分析によって決定された１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１、ｖ.３、ｖ.４及びｖ.６のベータターンアミノ酸プロファイル。 １５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の２次構造及び膜貫通ドメイン予測。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１（配列番号１０４）、ｖ.３（配列番号１０５）、ｖ.４（配列番号１０６）及びｖ.６（配列番号１０７）の２次構造は、それぞれ、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる、HNN-Hierarchical Neural Network method（NPS＠: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25, No 3 [291]:147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質の１次配列から、アルファヘリックス、エクステンドストランド及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の２次構造中のタンパク質変異体のパーセントも併記してある。 １５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の２次構造及び膜貫通ドメイン予測。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１（配列番号１０４）、ｖ.３（配列番号１０５）、ｖ.４（配列番号１０６）及びｖ.６（配列番号１０７）の２次構造は、それぞれ、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる、HNN-Hierarchical Neural Network method（NPS＠: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25, No 3 [291]:147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質の１次配列から、アルファヘリックス、エクステンドストランド及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の２次構造中のタンパク質変異体のパーセントも併記してある。 １５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の２次構造及び膜貫通ドメイン予測。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１（配列番号１０４）、ｖ.３（配列番号１０５）、ｖ.４（配列番号１０６）及びｖ.６（配列番号１０７）の２次構造は、それぞれ、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる、HNN-Hierarchical Neural Network method（NPS＠: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25, No 3 [291]:147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質の１次配列から、アルファヘリックス、エクステンドストランド及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の２次構造中のタンパク質変異体のパーセントも併記してある。 １５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の２次構造及び膜貫通ドメイン予測。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１（配列番号１０４）、ｖ.３（配列番号１０５）、ｖ.４（配列番号１０６）及びｖ.６（配列番号１０７）の２次構造は、それぞれ、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる、HNN-Hierarchical Neural Network method（NPS＠: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25, No 3 [291]:147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Deleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて予測された。この方法は、タンパク質の１次配列から、アルファヘリックス、エクステンドストランド及びランダムコイルの存在及び位置を予測する。所与の２次構造中のタンパク質変異体のパーセントも併記してある。 TMBASE（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）を用いるホフマン（Hofmann）及びシュトッフェル（Stoffel）のTMpredアルゴリズムに基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。 ゾンハマー（Sonnhammer）、フォン・ヘイーン（von Heijne）及びクロー（Krogh）のTMHMMアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。TMpredアルゴリズム及びTMHMMアルゴリズムは、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる。タンパク質変異体１及び３は１つの膜貫通領域を含むと予測され、タンパク質変異体３及び４は１膜貫通領域を含まないと予測される。変異体はすべて、シグナルペプチドをコードすると考えられるアミノ末端に疎水性領域を含む。 TMBASE（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）を用いるホフマン（Hofmann）及びシュトッフェル（Stoffel）のTMpredアルゴリズムに基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。 ゾンハマー（Sonnhammer）、フォン・ヘイーン（von Heijne）及びクロー（Krogh）のTMHMMアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。TMpredアルゴリズム及びTMHMMアルゴリズムは、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる。タンパク質変異体１及び３は１つの膜貫通領域を含むと予測され、タンパク質変異体３及び４は１膜貫通領域を含まないと予測される。変異体はすべて、シグナルペプチドをコードすると考えられるアミノ末端に疎水性領域を含む。 TMBASE（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）を用いるホフマン（Hofmann）及びシュトッフェル（Stoffel）のTMpredアルゴリズムに基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。 ゾンハマー（Sonnhammer）、フォン・ヘイーン（von Heijne）及びクロー（Krogh）のTMHMMアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。TMpredアルゴリズム及びTMHMMアルゴリズムは、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる。タンパク質変異体１及び３は１つの膜貫通領域を含むと予測され、タンパク質変異体３及び４は１膜貫通領域を含まないと予測される。変異体はすべて、シグナルペプチドをコードすると考えられるアミノ末端に疎水性領域を含む。 TMBASE（K.Hofmann, W.Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）を用いるホフマン（Hofmann）及びシュトッフェル（Stoffel）のTMpredアルゴリズムに基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。 ゾンハマー（Sonnhammer）、フォン・ヘイーン（von Heijne）及びクロー（Krogh）のTMHMMアルゴリズム（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）に基づいた、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４及び６の膜貫通領域の存在確率の概略的グラフ。TMpredアルゴリズム及びTMHMMアルゴリズムは、World Wide Webのアドレス（.expasy.ch/tools/）に置かれたExPasy molecular biology serverからアクセスされる。タンパク質変異体１及び３は１つの膜貫通領域を含むと予測され、タンパク質変異体３及び４は１膜貫通領域を含まないと予測される。変異体はすべて、シグナルペプチドをコードすると考えられるアミノ末端に疎水性領域を含む。 １５８Ｐ１Ｄ７のＳＮＰ変異体の概略的配列。変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.２は、１５４６に一塩基変異を有する変異体である。このＳＮＰ変異体は転写物変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１に関して示されているが、当該塩基対を含むものであれば他の任意の転写物変異体においても生じ得る。番号は１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１の番号に相応する。ブラックボックスは１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１と同様の配列を示す。ＳＮＰはブラックボックスの上側に示した。 １５８Ｐ１Ｄ７のタンパク質変異体の概略的配列。１５８Ｐ１Ｄ７のタンパク質変異体の概略的配列。タンパク質変異体はヌクレオチド変異体に相応する。ヌクレオチド変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.２及びｖ.５はｖ.１と同じタンパク質をコードしている。ヌクレオチド変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３及びｖ.４は、図１２に示したように、ｖ.１の転写物変異体である。変異体ｖ.６は、ｖ.４と一塩基異なるが、ｖ.４によってコードされるタンパク質とはＣ末端領域において異なるタンパク質をコードしている。ブラックボックスはｖ.１と同様の配列を示す。ハッチングボックスはｖ.１に存在しないアミノ酸配列を示す。ブラックボックスの下側の番号は１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１に相応する。 １５８Ｐ１Ｄ７の転写物変異体のエキソン組成。変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３、ｖ.４、ｖ.５及びｖ.６は、変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１の転写物変異体である。変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.３は、変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１から２０６９〜２３９５がスプライスされたものであり、変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.４は、ｖ.１から１１６２〜２０９６がスプライスされたものである。変異体ｖ.５は、変異体ｖ.１の５’末端に他のエキソンと２ｂｐが付加され、３’末端が２８８ｂｐ延長されたものである。変異体ｖ.６は、ｖ.４と同じ部位がスプライスされたものであるが、更に境界において１つの'ｇ'がスプライスされている。ブラックボックスの下側の“（）”内の番号は、１５８Ｐ１Ｄ７ｖ.１の番号に相応する。イントロン及びエキソンの長さは比例していない。 メラノーマにおける１５８Ｐ１Ｄ７発現。ＲＮＡは正常皮膚細胞株デトロイト（Detroit）５５１と、メラノーマ細胞株Ａ３７５から抽出した。１０μｇ全ＲＮＡによるノーザンブロットは、１５８Ｐ１Ｄ７ＤＮＡプローブでプローブした。サイズ目盛（単位：キロベース）は縦軸に示した。実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、メラノーマ細胞株では発現したが、正常細胞株では発現しなかったことが分かる。 子宮頚癌患者試料における１５８Ｐ１Ｄ７発現。第一鎖ｃＤＮＡは、正常子宮頚、子宮頚癌細胞株Ｈｅｌａ、及び子宮頚癌患者試料のパネルから調製した。ノーマライゼーションは、アクチン及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いるＰＣＲによって実行した。１５８Ｐ１Ｄ７に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを２６サイクルと３０サイクルの増幅で実行した。実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、１４の被検腫瘍試料のうちの５つでは発現したが、正常子宮頚においても細胞株においても発現しなかったことが分かる。 モノクローナル抗体による組換え細胞中の１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出。表示の細胞株からの細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースに移した。ブロットは、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％スキムミルク中の表示の抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）５μｇ／ｍｌによってプローブし、洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ２次Ａｂとともにインキュベートした。次に、免疫反応性バンドを、エンハンストケミルミネセンス及びオートラジオグラフフィルムへの曝露によってビジュアル化した。矢印は、〜９５ｋＤ及び９０ｋＤ１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質ダブレットバンドを示すが、これは、１５８Ｐ１Ｄ７は翻訳後修飾を受けて、異なる２つの分子量種を生成することを示唆している。これらの実験結果から、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、組換え細胞内で発現すること及びモノクローナル抗体によって特異的に検出されることが分かる。 抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体による１５８Ｐ１Ｄ７発現２９３Ｔ及びＵＭＵＣ細胞の表面染色。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する過渡的に形質移入された２９３Ｔ細胞及び安定的な１５８Ｐ１Ｄ７発現ＵＭＵＣ膀胱癌細胞を、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）による１５８Ｐ１Ｄ７の表面発現に関し、フローサイトメトリーを用いて分析した。形質移入２９３対照ベクター及び１５８Ｐ１Ｄ７ベクター細胞及び安定ＵＭＵＣ−ｎｅｏ及びＵＭＵＣ−１５８Ｐ１Ｄ７細胞を、それぞれ、１０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの表示のＭＡｂｓで染色した。表面結合ＭＡｂｓを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ２次Ａｂとともにインキュベートすることにより検出した後、ＦＡＣＳ分析にかけた。１５８Ｐ１Ｄ７発現２９３Ｔ及びＵＭＵＣ細胞は、表面発現及び各々のＭＡｂｓによる１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出を示す対照細胞と比べて相対蛍光の増加を示した。 ＭＡｂ Ｍ１５−６８（２）２２．１．１による内因性１５８Ｐ１Ｄ７発現ＬＡＰＣ９前立腺癌及びＵＧＢ１膀胱癌異種移植細胞の表面染色。ＬＡＰＣ９及びＵＧＢ１異種移植細胞を、それぞれ１μｇ／ｍｌの対照マウスＩｇＧ抗体又はＭＡｂ Ｍ１５−６８（２）２２．１．１による表面染色にかけた。表面結合ＭＡｂｓを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ２次Ａｂとともにインキュベートすることにより検出した後、ＦＡＣＳ分析にかけた。ＬＡＰＣ９及びＵＧＢ１細胞は、何れも、表面発現及び１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出を示す抗１５８Ｐ１Ｄ７ＭＡｂによって相対蛍光の増加を示した。 ＮＣＩ−Ｈ１４６小細胞肺癌細胞中の内因性表面１５８Ｐ１Ｄ７のモノクローナル抗体性内部移行。ＮＣＩ−Ｈ１４６細胞を、表示のＭＡｂｓ５μｇ／ｍｌにより４℃で１．５時間染色し、洗浄した後、４℃に維持するか、１０〜３０分間３７℃にする。次に、残存する表面結合ＭＡｂを抗マウスＩｇＧ−ＰＥ２次抗体で検出した。４℃に維持した細胞と比べて３７℃に移した細胞の平均蛍光強度（ＭＦ）が減少したことから、表面結合１５８Ｐ１Ｄ７／ＭＡｂ複合体が内部移行したことが分かる。 ＮＣＩ−Ｈ１４６小細胞肺癌細胞中の内因性表面１５８Ｐ１Ｄ７のモノクローナル抗体性内部移行。ＮＣＩ−Ｈ１４６細胞を、表示のＭＡｂｓ５μｇ／ｍｌにより４℃で１．５時間染色し、洗浄した後、４℃に維持するか、１０〜３０分間３７℃にする。次に、残存する表面結合ＭＡｂを抗マウスＩｇＧ−ＰＥ２次抗体で検出した。４℃に維持した細胞と比べて３７℃に移した細胞の平均蛍光強度（ＭＦ）が減少したことから、表面結合１５８Ｐ１Ｄ７／ＭＡｂ複合体が内部移行したことが分かる。 ヒト臍静脈内皮細胞に対する１５８Ｐ１Ｄ７細胞外ドメインの結合。１５８Ｐ１Ｄ７の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（アミノ酸１６〜６０８）を、ヨードゲン（1,3,4,5-テトラクロロ-3a,6a-ジフェニルグリコルリル）法を用いてヨウ素化し高特異的活性にした。６ウェルプレートで９０％コンフルエントのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５０倍過剰非標識ＥＣＤの存在下（非特異的結合）又は不存在下（完全結合）での１ｎＭの１２５Ｉ−１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤとともに４℃又は３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、ガンマカウントにかけた。実験データから、１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤはＨＵＶＥＣ細胞に特異的に結合することが分かるが、これは、ＨＵＶＥＣ細胞上に１５８Ｐ１Ｄ７レセプターが存在することを示唆している。図２６Ａは、１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤが、１５８Ｐ１Ｄ７特異的ＭＡｂｓによって検出されるようなＨＵＶＥＣ細胞の表面に直接結合したことを示している。図２６Ｂは、１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤがＨＵＶＥＣ細胞に特異的に結合したことを示しているが、これは、ＨＵＶＥＣ細胞上に１５８Ｐ１Ｄ７レセプターが存在することを示唆している。 １５８Ｐ１Ｄ７によるマウスにおける膀胱癌の増殖の促進。５〜６週齢のオスのＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリー、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を、ＮＩＨ実験動物の管理と使用に関する指針に応じた厳格に制御された環境下で使用及び管理した。１５８Ｐ１Ｄ７形質移入ＵＭ−ＵＣ−３細胞及び親細胞を、ＳＣＩＤマウスの皮下領域に注入した。各マウスは、５０％（ｖ／ｖ）のマトリゲルに懸濁された４×１０６細胞を受容した。腫瘍の寸法は、週に２回、キャリパ測定によってモニターした。最長寸法（Ｌ）及び当該最長寸法に垂直な方向の寸法（Ｗ）を測定し、式Ｗ２×Ｌ／２に基づいて腫瘍体積を計算した。マン−ホイットニーＵ検定を使用して、腫瘍増殖の差異を評価した。試験は全て両側にα＝０．０５を有した。 ＮＣＩ−Ｈ１４６細胞中のＭ１５−６８（２）．３１．１．１の内部移行。内因性１５８Ｐ１Ｄ７発現ＮＣＩ−Ｈ１４６細胞を、５μｇ／ｍｌのＭＡｂ Ｍ１５−６８（２）．３１．１．１とともに４℃で１時間インキュベートし、洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ２次抗体とともにインキュベートし、洗浄した。次に、細胞を、４℃に維持するか、又は３０分間３７℃に移した。次に、細胞を蛍光及び明視野顕微鏡で観察した。４℃に維持された細胞は、細胞上の蛍光のハローを形成したが、これは細胞染色を示している。３７℃に移された細胞は、表面蛍光のハローの消失と、点状の内部蛍光の生成を示したが、これらは１５８Ｐ１Ｄ７／ＭＡｂ複合体の内部移行を示している。 細胞生存に対する１５８Ｐ１Ｄ７ ＲＮＡｉの効果。対照として、１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＲＮＡの検出可能な発現を示さない細胞株である３Ｔ３細胞も（オリゴ１５８Ｐ１Ｄ７.ｂを含む）ｓｉＲＮＡのパネルによって処理したが、表現型は観察されなかった。この結果は、ＬＮＣａＰ及びＰＣ３細胞中の特定のタンパク質ノックダウンは一般的毒性の機能ではないという事実を反映している。というのは、３Ｔ３細胞は、１５８Ｐ１Ｄ７.ｂオリゴに反応しなかったからである。Ｅｇ５対照に対するこの３つの細胞株の特異な反応は、細胞形質移入のレベル及びこれら細胞株のオリゴ処理に対する反応性の相違の反映である。 １５８Ｐ１Ｄ７ＭＡｂによるマウス中におけるヒト膀胱癌異種移植片の増殖の阻害。５〜６週齢のオスのＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリー、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を、ＮＩＨ実験動物の管理と使用に関する指針に応じた厳格に制御された環境下で使用及び管理した。患者の膀胱癌であるＵＧ−Ｂ１を用いて異種移植片モデルを確立した。ＳＣＩＤマウス中に適切に維持されたストック腫瘍を無菌的に切開し、切り刻み、プロナーゼ（カルバイオヒェム（Calbiochem）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて消化した。生じた細胞懸濁液を３７℃で終夜インキュベートし、均一な単細胞懸濁液を得た。マウスは、それぞれ、右脇腹の皮下部位に２．５×１０６細胞を受容した。１５８Ｐ１Ｄ７に対するマウスモノクローナル抗体を、この実験では、５００μｇ／マウスの用量で試験した。対照としてＰＢＳを用いた。ＭＡｂの投与は、腫瘍細胞の注入と同日に開始して、週に２回、全部で１２用量を腹腔内で行った。腫瘍の寸法は、週に２回、キャリパ測定によってモニターした。最長寸法（Ｌ）及び当該最長寸法に垂直な方向の寸法（Ｗ）を測定し、式Ｗ２×Ｌ／２に基づいて腫瘍体積を計算した。結果から、抗１５８Ｐ１Ｄ７ＭＡｂはマウス中のヒト膀胱癌増殖の阻害能を有することが分かる。 １５８Ｐ１Ｄ７ＭＡｂによるマウス中におけるヒト前立腺癌異種移植片の増殖の阻害。５〜６週齢のオスのＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリー、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を、ＮＩＨ実験動物の管理と使用に関する指針に応じた厳格に制御された環境下で使用及び管理した。アンドロゲン依存性ヒト前立腺癌であるＬＡＰＣ−９ＡＤを用いて異種移植片モデルを確立した。ストック腫瘍はＳＣＩＤマウス中に適切に維持した。移植日に、ストック腫瘍を採取し、壊死組織を切除し、１ｍｍ３片の大きさに切り刻んだ。マウスは、それぞれ、右脇腹の皮下部位に４ピースの組織を受容した。１５８Ｐ１Ｄ７に対するマウスモノクローナル抗体を、５００μｇ／マウス及び５００μｇ／マウスの用量でそれぞれ試験した。対照としてＰＢＳと抗ＫＬＨモノクローナル抗体を用いた。実験コホートは、各グループに４匹づつ含む４つのグループから構成した。ＭＡｂは、週に２回、全部で８用量を腹腔内投与した。腫瘍体積が４５ｍｍ３に達したとき処置を開始した。腫瘍の寸法は、週に２回、キャリパ測定によってモニターした。最長寸法（Ｌ）及び当該最長寸法に垂直な方向の寸法（Ｗ）を測定し、式Ｗ２×Ｌ／２に基づいて腫瘍体積を計算した。該当する場合、スチューデントｔ検定及びマン−ホイットニーＵ検定を用いて腫瘍増殖の差異を評価した。試験は全て両側にα＝０．０５を有した。 ラット１細胞の増殖に対する１５８Ｐ１Ｄ７の効果。細胞を０．５％ＦＢＳ中で終夜増殖させた後、１０％ＦＢＳで処置した細胞と比較した。細胞は、処置後１８〜９６時間に、増殖については３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって、細胞サイクル分析についてはＢｒｄＵ取り込み／ヨウ化プロピジウム染色アッセイによって評価した。結果から、１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現するラット−１細胞は、ラット−１−Ｎｅｏ細胞と比べると、低濃度（０．１％）血清中で効率的に成長することが分かる。 １５８Ｐ１Ｄ７によるＳ期への移行の促進。細胞を、１０ Ｍ ＢｒｄＵによって標識し、洗浄し、トリプシン処理し、０．４％パラホルムアルデヒド及び７０％エタノール中で固定した。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ファーミゲン（Pharmigen））を細胞に添加し、この細胞を洗浄した後、ヨウ化プロピジウム１０ ｇ／ｍｌとともに２０分間インキュベートし、その後、洗浄し、４８８ｎｍで蛍光分析した。結果から、対照細胞と比べると、１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現した３Ｔ３細胞中のＳ期（細胞周期のＤＮＡ合成期）の細胞の標識が増加したことが分かる。 図３４Ａ：Ｍ１５／Ｘ６８（２）１８ＶＨクローン＃１のｃＤＮＡ（配列番号１０８）及びアミノ酸配列（配列番号１０９）。図３４Ｂ：Ｍ１５／Ｘ６８（２）１８ＶＬクローン＃２のｃＤＮＡ（配列番号１１０）及びアミノ酸配列（配列番号１１１）。 図３５Ａ：Ｍ１５／Ｘ６８（２）１８ＶＨクローン＃１のアミノ酸配列（配列番号１１２）。図３５Ｂ：Ｍ１５／Ｘ６８（２）１８ＶＬクローン＃２のアミノ酸配列（配列番号１１３）。 種々の癌患者試料における免疫組織化学による１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出。組織は、膀胱移行細胞癌、乳管癌及び肺癌の患者から得た。結果から、１５８Ｐ１Ｄ７は、癌患者組織の腫瘍細胞中において以下のように発現したことが分かった：パネル（Ａ）膀胱移行細胞癌、浸潤度ＩＩＩ；パネル（Ｂ）膀胱移行細胞癌、乳頭度ＩＩ；パネル（Ｃ）浸潤性乳管癌、中度に分化；パネル（Ｄ）浸潤性乳管癌、中度から低度に分化；パネル（Ｅ）扁平上皮肺癌；パネル（Ｆ）肺腺癌、高度に分化。膀胱移行細胞癌組織中における１５８Ｐ１Ｄ７の発現は細胞膜の周囲で最も多く検出された。これは、１５８Ｐ１Ｄ７は膜結合型であることを示している。
セクションの概要
Ｉ．） 定義
ＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの具体例
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主‐ベクター系
ＩＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ含有タンパク質の態様
ＩＩＩ．Ｂ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の修飾
ＩＩＩ．Ｄ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の用途
ＩＶ．）１５８Ｐ１Ｄ７抗体
Ｖ．）１５８Ｐ１Ｄ７細胞性免疫応答
ＶＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７の検出方法
ＶＩＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連遺伝子及びその産物のモニター方法
ＩＸ．）１５８Ｐ１Ｄ７と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療方法及び組成物
Ｘ.Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ.Ｂ．）抗体に基づく治療の標的としての１５８Ｐ１Ｄ７
Ｘ.Ｃ．）細胞性免疫応答の標的としての１５８Ｐ１Ｄ７
Ｘ.Ｃ.１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ.Ｃ.２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
Ｘ.Ｃ.３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合わせ
Ｘ.Ｃ.４．ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含んで
なるワクチン組成物
Ｘ.Ｄ．）養子免疫治療
Ｘ.Ｅ．）治療又は予防を目的とするワクチンの投与
ＸＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７の診断及び予測の態様
ＸＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体による１５８Ｐ１Ｄ７の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組み換えタンパク質による１５８Ｐ１Ｄ７の阻害
ＸＩＩ.Ｃ．）１５８Ｐ１Ｄ７の転写又は翻訳の阻害
ＸＩＩ.Ｄ．）治療戦略の一般的考察
ＸＩＩＩ.）１５８Ｐ１Ｄ７モジュレーターの同定、特徴付け、及び、使用
ＸＩＶ．）ＲＮＡｉ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の治療的使用
ＸＶ．）キット
Ｉ．） 定義
別に定義されていない場合、ここで使用される全ての技術用語、表記法、及び、他の科学用語若しくは用語法は、本発明が属する技術分野の当業者によって、一般に理解されている意味を有することを意図するものである。幾つかの場合には、一般に使用されている用語を、この中で、明瞭さのために及び／又は手早い参照（ready reference）のために定義し、並びに、この中でのそのような定義の包含は、必ずしも当業者に一般に理解されている事柄との間の相当の差異を表すために説明されるものではない。この中で説明又は参照される多くの技術及び手順は、当業者によって、よく理解され通常使用される常套的な方法論―例えば、Sambrook et al.によるMolecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.中で記載されている広範に使用されている分子クローニングの方法論―である。適切な、市販されているキット及び試薬の使用を含む手順としては、他に記載されていなければ一般的には製造業者の規定したプロトコール及び／又はパラメータに従って行われる。
用語「浸潤性膀胱癌（invasive bladder cancer）」は、膀胱筋肉壁内へ広がった膀胱癌を意味し、そして、ステージＴ２‐Ｔ４を含むこと及びＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）系の下にある疾病を意味する。一般的には、これらの患者では、非浸潤性癌の患者と比較して、好ましい成果が得られることが少ない。胆嚢切除の後、５０％又はそれ以上の浸潤性癌の患者が転移を起こしている（Whittmore. Semin Urol 1983; 1:4-10）。
「天然型糖修飾パターンの改変（altering the native glycosylation pattern）」とは、天然型１５８Ｐ１Ｄ７配列内に見出された１以上の糖質成分の欠失（内在性糖修飾部位の除去或いは化学的及び／又は酵素学的方法による糖修飾の削除）及び／又は、天然型１５８Ｐ１Ｄ７配列内に存在しない１以上の糖修飾の付加を、意味することをここでの目的のために意図している。さらに、この言い回しは、天然型タンパク質の糖修飾における質的変化を含む（種々の糖成分の性質及び比率の変化を含む）。
用語「類似体（analog）」とは、もう一つの分子（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質）と、構造的に類似した、又は、類似な若しくは相当する特性を共有する分子のことを言う。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の類似体は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と特異的に結合する抗体又はＴ細胞によって、特異的に結合され得る。
用語「抗体」は、最も広義な意味で用いている。そのため、「抗体」は、自然に生成することも、又、従来のハイブリドーマ技術によって生産されたモノクローナル抗体のようなヒトによる作成も可能である。坑１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質、又はそのフラグメントと結合し、そして、モノクローナル及びポリクローナル抗体と同様に抗原結合領域及び／又は１以上のこれらの抗体の相補性決定領域も含む。
「抗体フラグメント（antibody fragment）」は、少なくともイムノグロブリン分子のその標的に結合する可変領域の部分すなわち抗原結合領域として定義される。一つの態様においては、一つの坑１５８Ｐ１Ｄ７抗体及びそのクローン（作用物質、拮抗物質、及び、中和抗体を含む）及びポリエピトープに特異性（polyepitopic specificity）がある坑１５８Ｐ１Ｄ７抗体組成物を包含する。
用語「コドン最適化配列」とは、使用頻度が２０％より少ない、より好ましくは３０％又は４０％よりも少ない、あるコドンを任意の１以上のコドンで置換することにより、特定の宿主の種に最適化された核酸配列のことを言う。配列は、２０％より少ない、より好ましくは凡そ３０％又は４０％よりも少ない使用頻度のコドンを全く含まないように、「完全に最適化（completely optimized）」されていてもよい。コドンの最適化に加え、偽のポリアデニル化部位の除去、エクソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポゾン様リピートの除去、及び／又は、ＧＣ含量の最適化によって、特定の宿主種の中での発現に対し最適化された核酸配列を、ここでは、「発現増強配列（expression enhanced sequences）」と呼ぶ。
用語「細胞毒性薬剤（cytotoxic agent）」とは、一つ以上の細胞機能を抑制若しくは阻害する物質、及び／又は、細胞破壊を惹起する物質を言う。本用語は、放射性同位元素化学療法剤、並びに、細菌、真菌、植物若しくは動物組織の小分子毒素若しくは酵素的に活性化する毒素のような毒素（それらのフラグメント及び／又は変異体を含む）を含むことを意図している。細胞毒性薬剤の例として、マイタンシノイドス（maytansinoids）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、キソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシ アントラシン ジオン、アクチノマイシン、ジフテリアトキシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α‐サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロスズ、カリケアミシン、サパオナリア公定インヒビター（sapaonaria officinalis inhibitor）、及び、グルココルチコイド、及びその他の化学療法剤と同様に、 ２１１ Ａｔ、 １３１ Ｉ、 １２５ Ｉ、 ９０ Ｙ、 １８６ Ｒｅ、 １８８ Ｒｅ、 １５３ Ｓｍ、 ２１２ Ｂｉ、 ３２ Ｐ及びＬｕの放射性同位元素のような放射性同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。抗体は、また、プロドラックをその活性化型に転換可能な坑癌プロドラック活性化酵素と結合してもよい。
用語「相同体（homolog）」とは、他の分子に対して、例えば、対応する位置で同一か類似である化学残基の配列を有することによって、相同性を示す分子を言う。
「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩタンパク質である（例えば、Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8th ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)を参照）。
用語「ハイブリダイズ（hybridize）」、「ハイブリダイジング（hybridizing）」、「ハイブリダイジズ（hybridizes）」などは、ポリヌクレオチドの文脈で使用され、通常のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中で、ここでハイブリダイゼーション中の温度は３７℃以上、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄中の温度は５５℃以上であるハイブリダイゼーションであるような条件を意味する。
「単離された（isolated）」又は「生物学的に純粋な（biologically pure）」という表現は、その自然状態で見られる時に通常その物質に付随する成分が実質的または本質的に含まれていない物質を言う。よって、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、in situの環境下のペプチドと共に通常結合している又は存在している物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物又はそのフラグメントとは違った１５８Ｐ１Ｄ７のそれ又はポリペプチドをコードするそれとは違った核酸に相当する又は相補的なポリヌクレオチド夾雑物から、実質的に分離された時に、「単離された」と言われる。熟練した技術者は、単離された１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを得るために即座に核酸単離手順を使用出来る。例えば、物理的及び／又は化学的方法が、通常、該タンパク質と共に結合しているか存在している細胞の構成物質から１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を移すために使用された場合、タンパク質は「単離された」と言われる。熟練した技術者は、単離された１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を得るために、即座に、標準的な精製法を使用可能である。或いは、単離されたタンパク質は、合成又は化学的方法によっても調製可能である。
用語「哺乳動物（mammal）」とは、哺乳動物として分類される任意の生物を意味し、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒトを含む。本発明の一つの態様において、哺乳動物はマウスである。本発明のもう一つの態様においては、哺乳動物はヒトである。
用語「転移性膀胱癌（metastatic bladder cancer）」及び「転移性疾患（metastatic disease）」とは局所リンパ節又は離れた部位に広がった膀胱癌を意味し、ＴＮＭ系の下でステージＴｘＮｘＭ＋を意味する。膀胱癌転移で最も普通に見られるのが、リンパ節である。他に転移が普通に見られるのは、肺、骨、及び、肝臓である。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた一つの抗体を意味する―すなわち集団を構成する抗体が同一（自然発生的に起こり得る少数の変異を除く）である。
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の生物学的モチーフにおける「モチーフ（motif）」とは、タンパク質の一次配列の部分を形成するアミノ酸の任意のパターンを言う―すなわち特定の機能（例えば、タンパク質‐タンパク質相互作用、タンパク質‐ＤＮＡ相互作用など）又は修飾（例えば、リン酸化される、糖修飾される、又は、アミド化される）又は局在化（例えば分泌性配列、核移行配列など）又は液性若しくは細胞性いずれかの免疫原性に関連した配列である。モチーフは、一般的に一定の機能又は特性と関連した特定の位置と隣接するか又はアライメント（aligned）する能力を有しうる。ＨＬＡモチーフの文脈中では「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンを言い、通常、クラスＩ ＨＬＡモチーフについては凡そ８から凡そ１３アミノ酸からなるペプチド、そしてクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについては凡そ６から凡そ２５アミノ酸からなるペプチドで、それらは特定のＨＬＡ分子によって認識される。ＨＬＡ結合のためのペプチドモチーフは、典型的には各ヒトＨＬＡアレルによってコード化された各タンパク質毎に異なっており、そして、１次及び２次アンカー残基のパターンにおいて差がある。
「医薬賦形剤（pharmaceutical excipient）」には、アジュバント、キャリアー、ｐＨ-調整及び緩衝剤、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤、防腐剤などのような物質を含む。
「医薬的に許容し得る（Pharmaceutically acceptable）」とは、無毒、不活性、及び／又は、ヒトのような哺乳動物に生理学的に適合性のある組成物を意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基の核酸の重合体、或いは、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドの何れか又は何れかの型の核酸の修飾型である長さのある塩基対を意味し、且つ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの一重及び二重鎖型を意味する。本技術分野においては「オリゴヌクレオチド」は凡そ５０ヌクレオチドより少ないポリヌクレオチドの下位集団を呼ぶために使用されるにもかかわらず、この用語は、しばしば、「オリゴヌクレオチド」と置き換え可能なように使用されている。ポリヌクレオチドは、この中で開示されたヌクレオチド配列を含む事が出来るが、ここで、例えば示されているようにチミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であることも可能；この定義はＤＮＡとＲＮＡとの化学構造における違い（特にＲＮＡの４つの主要な塩基の一つがチミジン（Ｔ）からウラシル（Ｕ）に置き換わっているという知見）に関係している。
用語「ポリペプチド」は、少なくとも凡そ４、５、６、７、又は８アミノ酸の重合体を意味する。明細書を通して、アミノ酸表記のために標準的な３文字又は１文字表記を用いる。本技術分野において、この用語は、しばしば、「タンパク質」又は「ペプチド」と置き換え可能なように使用されているので、「ペプチド」は凡そ５０アミノ酸より少ないポリペプチドの下位集団を呼ぶために使用されてよい。
ＨＬＡ「一次（プライマリー）アンカー残基（primary anchor residue）」とは、免疫原ペプチドとＨＬＡ分子との接触点を提供するものと理解されているペプチド配列に沿った特異的な位置にあるアミノ酸である。１から３、普通は２の、限定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、免疫原ペプチドに関する「モチーフ」と定義される。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（groove）と、結合溝の特異的ポケット内に埋め込まれる側鎖と共に密に接触するものと理解されている。一つの態様では、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に対する一次アンカー残基は、本発明に従うと、ペプチドエピトープのアミノ末端から２位の位置、及び、カルボキシ末端から８、９、１０、１１、又は１２位の位置にある。もう一つの態様において、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチド末端（該ペプチドは少なくとも９アミノ酸の長さである）からではなく、各々が互いに相対的な間隔を有している。各モチーフに対する一次アンカー残基は、表４で説明する。例えば、類似体ペプチド（analog peptides）は、表４に示した一次（primary）及び／又は二次（secondary）アンカー位置内の特定残基の存在若しくは不存在を変えることにより創出できる。そのような類似体は、特定のＨＬＡモチーフ若しくはスパーモチーフを含むペプチドの、結合親和性、及び／又は、集合範囲（population coverage）を調節するために使用される。
「組換え（recombinant）」ＤＮＡ又はＲＮＡ分子とは、in vitroにおいて分子操作を受けたＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（stringency）」は、本技術分野の通常の技術を有する者により即座に決定可能であり、一般的には、プローブ長、洗浄温度、及び、塩濃度に依存して経験的に予想される。一般に、適切なアニーリングのためには、短いプローブでは低い温度が必要なのに対し、長いプローブは高い温度が要求される。ハイブリダイゼーションは、相補鎖がその融解温度以下の環境で存在する場合には、一般的には、再アニーリングするための変性核酸配列の能力に依存する。プローブとハイブリダイズされる配列との所望のホモロジーの程度が高ければ、より高い相対的温度を使用し得る。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにし、一方でより低い温度はストリンジェンシーを低める傾向があることが分かる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更に詳細な説明は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。
ここで定義されたような「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」又は「高ストリンジェンシーな条件（high stringency conditions）」を、以下により確認するが、これらに限定されるものではない：（１）洗浄中の低イオン強度及び高温、例えば５０℃中で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドのような変性剤を使用する、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと共に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムでｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；又は、（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μg／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸にて処理し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２ｏＣにて及び５０％ホルムアミド中にて５５ｏＣにて洗浄し、続いて、５５ｏＣにてＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣで高ストリンジェンシーな洗浄をする。「中程度のストリンジェントな条件（moderately stringent conditions）」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989中にて記述されているがこれに限定されるものではなく、そして上述したものよりも低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び、％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一つの例としては、以下の溶液中で３７℃で終夜インキュベートする：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び、２０ｍｇ／ｍＬの変性し剪断されたサケ精子ＤＮＡ、続いて、凡そ３７‐５０ｏＣにて１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。熟練した技術者であれば、プローブ長などのような要因を適応させるのに必要な、温度、イオン強度その他を、どのように調整するかについて認識している。
ＨＬＡ「スーパーモチーフ（supermotif）」とは、２以上のＨＬＡアレルによってコード化されたＨＬＡ分子によって結合特異性が共有（shared）されるペプチドである。
「トランスジェニック動物」（例えばマウス又はラット）とは、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、該導入遺伝子は該動物又は該動物の出生前（例えば胎児期）にその祖先に導入される。「導入遺伝子（transgene）」とは、トランスジェニック動物がそれから発生するための細胞のゲノム内に組み込まれるべきＤＮＡを言う。
ここでのＨＬＡ又は細胞性免疫反応の使用における、「ワクチン」とは、本発明の１以上のペプチドを含むか又はコード化する組成物である。そのようなワクチンの多数の態様、すなわち、１以上の単一ペプチドのカクテル；一つのポリエピトープ性ペプチドを含む１以上の本発明のペプチド；又は、そのような単一ペプチド若しくはポリペプチドをコード化する核酸（例えばポリエピトープ性ペプチドをコード化するミニ遺伝子）のような態様がある。「１以上のペプチド（one or more peptides）」は、１‐１５０又はそれ以上の任意の整数単位、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５若しくは１５０又はそれ以上の本発明のペプチドを含むことが可能である。ペプチド又はポリペプチドは、脂質化（lipidation）、ターゲティング又はその他の配列の付加によるなどして、任意的に修飾されることも可能である。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両者の活性化を促進するために、ＨＬＡクラスＩＩペプチドに混合又は結合させることが可能である。ＨＬＡワクチンは、またペプチドパルスした抗原提示細胞たとえば樹状細胞を含むことも可能である。
用語「変異体（variant）」とは、記述された型又は標準からの変異が存在する分子を言い、例えば、具体的に記述されたタンパク質（例えば図２又は図３で示した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質）の相当する位置に１以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質である。類似体は変異体タンパク質の一つの例である。
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質は、ここで具体的に同定（identify）されたタンパク質と同様に、アレル変異体、保存された置換変異体、類似体及びホモログ（それらは、ここで概説される又は本技術分野における容易で有効な方法に従って、過度の実験を伴うこと無く、単離／生成、及び特徴づけがなされ得る）を含む。異なる１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントの一部を組み合わせた融合タンパク質、と同様に、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質をも、また含む。そのような１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を、集合的に、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質、本発明のタンパク質、又は、１５８Ｐ１Ｄ７と呼ぶ。
用語１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５若しくは２５以上のアミノ酸、又は、少なくとも凡そ３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００若しくは１００以上のアミノ酸からなるポリペプチドフラグメント又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質配列を言う。
ＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド
本発明の一側面においては、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子、ｍＲＮＡ、及び／又は、コーディング配列の全部若しくは一部に相当するか若しくは相補性であるポリヌクレオチドを、好ましくは単離した形状で提供する；該ポリヌクレオチドは１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及びそのフラグメントをコード化するポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及び関連分子、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子若しくはｍＲＮＡ配列又はその一部に相補性のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子若しくはｍＲＮＡ配列に、又は、１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するポリヌクレオチド（総括的に「１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを包含する。このセクションで言及するすべての場合において、図２のＴはＵであってもよい。
１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドの態様は以下のとおりである：図２に示した配列を有する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド；図２に示した１５８Ｐ１Ｄ７のヌクレオチド配列（ただし、ＴはＵである）；図２に示した配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも連続する１０ヌクレオチド；図２に示した配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも連続する１０ヌクレオチド（ただし、ＴはＵである）。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７ヌクレオチドの態様は、制限されるものではないが、以下を包含する：
（ａ）図２で示される配列を含んでなるか、又はそれから構成されるポリヌクレオチド（ただし、ＴはＵであってもよい）；
（ｂ）図２で示される配列を含んでなるか、又はそれから構成されるポリヌクレオチドであって、ヌクレオチド残基番号２３からヌクレオチド残基番号２５４８までのポリヌクレオチド（ただし、ＴはＵであってもよい）；
（ｃ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ−３６６２として２００１年８月２２日に寄託されているプラスミド名ｐ１５８Ｐ１Ｄ７−ターボ（Turbo）／３ＰＸに含有されるｃＤＮＡによりその配列がコード化される１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド（２００１年８月２０日にFederal Expressにより送った）；
（ｄ）図２で示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％相同（homologous）である１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド；
（ｅ）図２で示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％同一（identical）である１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド；
（ｆ）表５〜１８に示す少なくとも１個のペプチドをコード化するポリヌクレオチド；
（ｇ）図１１の親水性プロフィールが０.５を超える値を有するアミノ酸位置を含み、８４１まで任意の整数で増加する図３の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域をコード化するポリヌクレオチド；
（ｈ）図１２の疎水性親水性プロフィールが０.５未満の値を有するアミノ酸位置を含み、８４１まで任意の整数で増加する図３の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域をコード化するポリヌクレオチド；
（ｉ）図１３のパーセント接触可能残基プロフィールが０.５を超える値を有するアミノ酸位置を含み、８４１まで任意の整数で増加する図３の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域をコード化するポリヌクレオチド；
（ｊ）図１４の平均可撓性プロフィールが０.５を超える値を有するアミノ酸位置を含み、８４１まで任意の整数で増加する図３の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域をコード化するポリヌクレオチド；
（ｋ）図１５のベータ−ターンプロフィールが０.５を超える値を有するアミノ酸位置を含み、８４１まで任意の整数で増加する図３の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域をコード化するポリヌクレオチド；
（ｌ）（ａ）〜（ｋ）の何れか１項に記載のポリヌクレオチドと完全に相補的であるポリヌクレオチド；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ａ）〜（ｋ）の何れかがコード化するペプチド；及び
（ｏ）医薬添加剤と共存するか及び／又はヒトの単位投与形状にある（ａ）〜（ｍ）の何れかのポリヌクレオチド又は（ｎ）のペプチド。
本明細書にて使用する場合、範囲は、その全整数単位の位置を具体的に開示するものと理解される。
本明細書に開示された発明の代表的な態様は、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ配列（及びかかる配列に相補的な配列）の特定の位置をコード化する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド、例えば、該タンパク質とそのフラグメント、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５又は８４１の連続アミノ酸をコード化するポリヌクレオチドである。
例えば、本明細書に開示した本発明の代表的な態様は：図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１からアミノ酸１０近傍をコード化するポリヌクレオチド及びそのコード化されたペプチドそれ自体、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１０からアミノ酸２０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸２０からアミノ酸３０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸３０からアミノ酸４０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸４０からアミノ酸５０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸５０からアミノ酸６０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸６０からアミノ酸７０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸７０からアミノ酸８０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸８０からアミノ酸９０近傍をコード化するポリヌクレオチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸９０からアミノ酸１００近傍をコード化するポリヌクレオチドなどであり、凡そ１０アミノ酸区切りで、図２又は図３に示すカルボキシル末端アミノ酸で終結する。
従って、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸までのアミノ酸１００の（凡そ１０アミノ酸の）アミノ酸配列の部分をコード化するポリヌクレオチドは本発明の態様である。この場合、それぞれ特定のアミノ酸の位置は、その位置のプラスマイナス５アミノ酸残基を開示すると理解される。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の比較的長い部分をコード化するポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内である。例えば、図２又は図３に示した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１近傍（又は２０又は３０又は４０など）からアミノ酸２０近傍（又は３０又は４０又は５０など）までをコード化するポリヌクレオチドは、技術上既知の様々な技法により生成させることができる。これらのポリヌクレオチドフラグメントは図２又は図３に示した１５８Ｐ１Ｄ７配列の何れの部分をも包含し得る。
本明細書に開示した本発明のさらなる説明のための態様は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質配列内に含まれる生物学的モチーフの１つ以上（例えば、表５〜１８に示した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の１つ以上のモチーフ含有配列）をコード化する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドフラグメントを包含する。もう一つの態様において、本発明の典型的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知分子に相同性を有する１５８Ｐ１Ｄ７の１つ以上の領域をコード化する。本発明のもう一つの態様において、典型的なポリヌクレオチドフラグメントは、１５８Ｐ１Ｄ７ Ｎ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、又は、Ｎ−ミリストイル化部位及びアミド化部位の１つ以上をコード化し得る。
ＩＩ．Ａ．）１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
前項のポリヌクレオチドは、多数の、異なる特別な用途を有する。ヒトの１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子は実施例３に示す染色体上の場所に位置付けられている。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子はこの染色体上に位置付けられているので、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の異なる領域をコード化するポリヌクレオチドは、この染色体位置における細胞遺伝学的異常（種々の癌と関連があるとして同定された異常など）を特徴づけるために使用される。ある種の遺伝子では、再配列を含む様々な染色体異常が、多種の癌において、頻度の高い細胞遺伝学的異常として同定されている（参照例：Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83(1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914(1995) 及び Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)）。従って、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の特定の領域をコード化するポリヌクレオチドは、悪性表現型に寄与し得る１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する染色体領域における細胞遺伝学的異常について、これまで可能であったものよりも遥かに正確に描写するために使用することの可能な新規手段を提供する。これに関連して、これらのポリヌクレオチドは、より細かい、あまり共通性のない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感度を拡張する技術においてその必要性を満足する（参照例：Evans et al., Am.J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)）。
さらに、１５８Ｐ１Ｄ７は膀胱癌及びその他の癌において高度に発現されることが示されたので、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、正常組織対癌性組織における１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態を評価する方法に使用される。典型的には、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の特定の領域をコード化するポリヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の特定の領域（１つ以上のモチーフを含むかかる領域など）における撹乱（欠失、挿入、点突然変異、又は抗原の喪失に至る変化など）の存在を評価するために使用される。例示としてのアッセイ法は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ及び１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（参照例：Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)）の両者を含み、この両者によって、これらタンパク質内の領域を調べるために、タンパク質の特定領域をコード化するポリヌクレオチドを利用される。
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの具体例
本明細書に開示した本発明の他の具体的に考慮される核酸関連の態様は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム及びアンチセンス分子、並びに天然資源由来若しくは合成による代替骨格に基づく核酸分子（又は代替塩基を含む）であり、また、１５８Ｐ１Ｄ７のＲＮＡ又はタンパク質発現を阻害し得る分子を含む。例えば、アンチセンス分子はＲＮＡであっても他の分子であってもよく、塩基対依存性に特異的にＤＮＡ又はＲＮＡに結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）又はホスホロチオアート誘導体などの非核酸分子を包含する。当業者は１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及び本明細書に開示したポリヌクレオチド配列を用いて、これらの部類の核酸分子を容易に得ることができる。
アンチセンス法は細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外来オリゴヌクレオチドの投与を必要とする。用語「アンチセンス」は、かかるオリゴヌクレオチドがその細胞内標的（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７）に相補的であるという事をいう。参照例：Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression (オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンスインヒビター), CRC Press, 1989; 及び Synthesis 1:1-5 (1988)。本発明の１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオアート誘導体又はＳ−オリゴ体、参照：上記のJack Cohen）などの誘導体を含み、癌細胞増殖阻害作用が強化されたものである。Ｓ−オリゴ体（ヌクレオシドホスホロチオアート）はオリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電類似体であり、そのリン酸基の非架橋酸素原子がイオウに置き換わったものである。
本発明のＳ−オリゴ体は対応するＯ−オリゴ体をイオウ転移試薬である３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシドで処理することにより調製可能である。参照：Iyer, R.P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); 及びIyer, R.P. et al., J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254 (1990)。本発明の、さらなる１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、技術上既知のモルホリノ・アンチセンスオリゴヌクレオチドである（参照例：Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175）。
本発明の１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、１５８Ｐ１Ｄ７ゲノム配列の５’の最初の１００コドン若しくは３’の最後の１００コドン又はその対応するｍＲＮＡに相補的であり及び安定的にハイブリダイズするＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。絶対的相補性は必要としないが、高度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡに対する選択的なハイブリダイズを可能とするが、タンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡにはハイブリダイズしない。一態様において、本発明の１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列をもつアンチセンスＤＮＡ分子の１５ないし３０マーのフラグメントである。任意的には、１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７の、最初の１０の５’コドン又は最後の１０の３’コドンの領域に相補的である３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、該アンチセンス分子は、１５８Ｐ１Ｄ７発現の阻害にリボザイムを採用するために修飾される；参照例：L.A. Couture & D.T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996)。
ＩＩ．Ａ．３．）プライマー及びプライマー対
本発明のこのヌクレオチドのさらに具体的な態様は、本発明のポリヌクレオチド又はそれらの任意の特定部分の特異的増幅を可能とするプライマー及びプライマー対、並びに、本発明の核酸分子又はそれらの任意の部分に選択的又は特異的にハイブリダイズするプローブを包含する。プライマーはまたプローブとしても使用可能であり、検出可能なマーカー、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート形成剤又は酵素などで標識し得る。かかるプローブ及びプライマーは、サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドの存在を検出するために、また１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を発現する細胞の検出手段として使用される。
かかるプローブの例は、図２に示したヒト１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡ配列の全部又は一部からなるポリペプチドを含む。１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例は、実施例にも記載する。当業者も理解するように、非常に多くの異なるプライマーとプローブが本明細書において提供した配列に基づき調製可能であり、それらを効果的に使用して１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡを増幅及び／又は検出することができる。本発明の好適なプローブは、本発明に開示した１５８Ｐ１Ｄ７核酸に見出される凡そ９個、凡そ１２個、凡そ１５個、凡そ１８個、凡そ２０個、凡そ２３個、凡そ２５個、凡そ３０個、凡そ３５個、凡そ４０個、凡そ４５個、及び、凡そ５０個、以上の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
本発明の１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、多様な目的において有用であるが、これらに限定されるものではない：例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子、ｍＲＮＡ又はそのフラグメントの増幅及び／又は検出用のプローブ及びプライマーとして；膀胱癌及びその他の癌の診断及び／又は予測用の試薬として；１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドの発現を指向し得るコーディング配列として；１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の発現及び／又は１５８Ｐ１Ｄ７転写物の翻訳を修飾又は阻害する手段として；及び、治療剤として、有用である。
ＩＩ．Ａ．４．）１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する核酸分子の単離
本明細書に記載された１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡ配列は、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物をコード化する他のポリヌクレオチドの単離、並びに、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物相同体、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子変異体、及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の突然変異体型をコード化するポリヌクレオチド並びに１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の類似体をコード化するポリヌクレオチドの単離を、可能とする。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子をコード化する全長ｃＤＮＡを単離するため採用し得る様々な分子クローニング法は周知である（参照例：Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995）。例えば、ラムダ・ファージ・クローニング法を、市販品として入手可能なクローニングシステム（例：ラムダＺＡＰエキスプレス、ストラタジーン）を用いて、簡便に採用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡ又はそのフラグメントで探索することにより、同定し得る。例えば、一態様において、１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡ（図２）又はその一部を合成し、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子に対応する重複した全長ｃＤＮＡを回収するためのプローブとして使用することができる。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子それ自体は、１５８Ｐ１Ｄ７ＤＮＡプローブ又はプライマーにより、ゲノムＤＮＡライブラリー、バクテリア人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、スクリーニングして単離し得る。
本発明はヒト又は他の哺乳動物などの天然資源から１５８Ｐ１Ｄ７又は１５８Ｐ１Ｄ７関連核酸配列を同定単離するための本明細書記載の任意のプローブの使用、並びに、プローブの使用により見出した配列の全部又はその大部分からなる単離された核酸配列それ自体の使用を、包含する。
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子及び宿主‐ベクター系
本発明はまた、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを含有する組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子、そのフラグメント、類似体若しくは相同体（例えば、限定されるものではないが、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、及び、技術上周知の種々のウイルス性若しくは非ウイルス性ベクターを含む）、並びに、かかる組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子で形質転換又は形質移入された細胞を、提供する。かかる分子を生成させる方法は周知である（参照例：Sambrook et al., 1989, 上記）。本発明はさらに適切な原核又は真核宿主細胞中に、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド、そのフラグメント、類似体若しくは相同体を含有する組換えＤＮＡ分子を含んでなる宿主‐ベクター系を提供する。適切な真核宿主細胞の例は、酵母細胞、植物細胞、又は、哺乳動物細胞若しくは昆虫細胞（例：Ｓf９若しくはハイファイブ細胞などのバキュロウイルス感染性細胞）などの動物細胞である。適切な哺乳動物細胞の例は、種々の膀胱癌細胞株、例えば、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ−ＵＣ３、ＨＴ１３７６、ＲＴ４、Ｔ２４、ＴＣＣ−ＳＵＰ、Ｊ８２及びＳＷ７８０；その他の形質移入又は形質導入可能な膀胱癌細胞株；並びに、組換えタンパク質の発現に常套的に使用する多くの哺乳動物細胞（例：ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ細胞）を含む。より詳しくは、１５８Ｐ１Ｄ７のコーディング配列を含んでなるポリヌクレオチド又はそのフラグメント、類似体若しくは相同体は、本技術分野で日常的に使用されよく知られている多数の宿主‐ベクター系の使用により、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントを生成するのに使用され得る。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントの発現に適した広範な宿主‐ベクター系が利用可能である；参照例：Sambrook et al., 1989, 上記；Current Protocols in Molecular Biology, 1995, 上記。哺乳動物発現用の好適なベクターは、限定されるものではないが、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（インビトロジェン）及びレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785)である。これらの発現ベクターを使用して、数種の膀胱癌細胞株及び非膀胱細胞株、例えば、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ−ＵＣ３、ＨＴ１３７６、ＲＴ４、Ｔ２４、ＴＣＣ−ＳＵＰ、Ｊ８２及びＳＷ７８０などにより１５８Ｐ１Ｄ７を発現させることができる。本発明の宿主‐ベクター系は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントの生産に有用である。かかる宿主‐ベクター系は１５８Ｐ１Ｄ７及び１５８Ｐ１Ｄ７突然変異体若しくは類似体の機能的性質の研究に採用し得る。
組換えヒト１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はその類似体若しくは相同体若しくはフラグメントは、１５８Ｐ１Ｄ７関連ヌクレオチドをコード化する構築物で形質移入した哺乳動物細胞により生産することができる。例えば、２９３Ｔ細胞は１５８Ｐ１Ｄ７又はそのフラグメント、類似体若しくは相同体をコード化する発現プラスミドで形質移入することができ、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又は関連タンパク質は２９３Ｔ細胞中で発現され、また、組換え１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は標準的な精製方法により単離する（例：抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を使用するアフィニティ精製）。もう一つの態様において、１５８Ｐ１Ｄ７コーディング配列を、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏにサブクローニングし、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞株を樹立するためにＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰr１，２９３及びｒａｔ−１などの種々の哺乳動物細胞株に感染させるのに使用する。技術上周知の様々な他の発現系もまた採用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７コーディング配列にインフレームで結合するリーダーペプチドをコード化する発現構築物は、分泌型の組換え１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の生成に使用することができる。
本明細書にて考察するように、遺伝暗号の重複性が１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子配列の変化を可能とする。とりわけ、特定の宿主種はしばしば特定のコドン優先性を有し、その結果、開示された配列を所望の宿主に対して好適であるとして適合させ得ることは既知である。例えば、好適な類似のコドン配列は、一般に稀なコドン（すなわち、所望の宿主の既知配列において凡そ２０％未満の使用頻度をもつコドン）を有し、高頻度のコドンと置換されている。特定種に対するコドンの優先性は、例えば、ＵＲＬなどのインターネット上で利用可能なコドン使用表を利用することにより計算する；ＵＲＬ：dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html。
配列のさらなる修飾は、細胞性の宿主におけるタンパク質発現を上昇させることが知られている。これらの修飾は、擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン／イントロンのスプライス部位シグナルをコード化する配列、トランスポゾン様の反復、及び／又は、遺伝子発現に有害な他のこのようなよく特性化されている配列を除去することを含む。該配列のＧＣ含量は、宿主細胞で発現される既知遺伝子を参考にして計算し、任意の細胞性の宿主における平均レベルに調整する。可能な場合には、該配列の修飾により、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。その他の有用な修飾は、オープン・リーディング・フレームの開始点に、翻訳開始共通（コンセンサス）配列を付加することである；記載例：Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989)。真核細胞リボソームがもっぱら５’近位ＡＵＧコドンで翻訳を開始するという一般則は、稀な条件下でのみ棄却されることを当業者なら理解している（参照例：Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) 及び Kozak NAR 15(20):8125-8148 (1987)）。
ＩＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質
本発明のもう一つの側面では１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を提供する。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の具体的態様は、図２又は図３に示したように、ヒト１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチドを含んでなる。あるいは、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の態様は、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸配列に変更を有する変異体、相同体又は類似体ポリペプチドを含んでなる。
一般に、ヒト１５８Ｐ１Ｄ７の天然に存在する対立遺伝子変異体は、高度の構造同一性と相同性をもつ（例：９０％以上の相同性）。典型的には、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の対立遺伝子変異体は、本明細書に記載した１５８Ｐ１Ｄ７配列内に保存されたアミノ酸置換を含むか、又は１５８Ｐ１Ｄ７相同体に相当する位置からのアミノ酸置換を含む。一群の１５８Ｐ１Ｄ７対立遺伝子変異体は、特定の１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高度の相同性をもつタンパク質であるが、しかし、さらに該配列から離脱した遊離基、例えば、非保存置換、末端切除、挿入又はフレームシフトを含む。タンパク質配列を比較すると、類似性、同一性、及び相同性という用語は、それぞれが遺伝学分野で評価される明瞭な意味をもつ。さらに、パラロジー（paralogy）及びオルソロジー（orthology）は、一つの生物の所定のタンパク質ファミリーのメンバーと他の生物の同じファミリーのメンバーとの関係を記載する重要な概念であり得る。
アミノ酸の略号を表２に提供する。タンパク質の保存されたアミノ酸置換は、多くの場合タンパク質のコンホメーション（高次構造）又は機能の何れも変えることなしに実施し得る。本発明のタンパク質は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の保存された置換を包含し得る。かかる変更は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、及びロイシン（Ｌ）の何れかをこれらの疎水性アミノ酸の他のものの代わりに用い；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）の代わりに、又はその逆を；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）の代わりに、又はその逆を；また、セリン（Ｓ）をトレオニン（Ｔ）の代わりに、又はその逆を置換に用いる。他の置換は、特定アミノ酸の環境及びそのタンパク質の三次元構造での役割により、保存的とも考え得る。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は多くの場合相互交換可能であり、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は多くの場合、ロイシン及びイソロイシンと交換可能であり、場合によりバリンと交換可能である。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であるような位置において、高頻度に交換可能であり、これら２つのアミノ酸残基のｐＫの違いは有意ではない。さらに他の変化は特定の環境において「保存的」であると考え得る（参照例：本明細書の表３；pages 13-15 “Biochemistry” 2nd ED. Lubert Stryer ed (スタンフォード大学)；Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19: 270(20):11882-6）。
本明細書に開示された本発明の態様は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の、広範な種類の技術的に許容される変異体又は類似体、例えば、アミノ酸挿入、欠失及び置換を有するポリペプチドなどを含む。１５８Ｐ１Ｄ７変異体は、部位特異的変異誘発方、アラニンスキャニング、及び、ＰＣＲ‐変異誘発法などの技術上既知の方法を用いて実施し得る。部位指向性変異誘発（Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット変異誘発法（Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)）、制限選択変異誘発法（restriction selection mutagenesis ）（Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の既知の技法をクローン化ＤＮＡ上で実施し、１５８Ｐ１Ｄ７変異体ＤＮＡを生産し得る。
アミノ酸スキャニング解析もまた、タンパク質−タンパク質相互作用などの特定の生物活性に関与する連続する配列中の１個以上のアミノ酸を同定するために採用し得る。スキャンしたアミノ酸の中で好適なのは、比較的小さな中性アミノ酸である。かかるアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインである。アラニンは典型的にこの群の中での好適なアミノ酸であるが、その理由はベータ炭素の先の側鎖が除かれており、変異体の主鎖のコンホメーションをあまり変化させるとは思えないからである。アラニンはまた最もありふれたアミノ酸なので、一般的に好適である。さらに、アラニンは埋没した位置及び露出した位置の両方にしばしば見出される（Creighton, The proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)）。もしアラニン置換が十分量の変異体を生じないならば、立体的等価のアミノ酸を使用することができる。
本明細書に定義するように、１５８Ｐ１Ｄ７変異体、類似体又は相同体は、図２のアミノ酸配列を有する１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と「交差反応性」である少なくとも１個のエピトープをもつという識別可能な属性をもつ。本文で使用する場合、「交差反応性」とは１５８Ｐ１Ｄ７変異体に特異的に結合する抗体又はＴ細胞が、図２のアミノ酸配列をもつ１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質にも特異的に結合するということを意味する。ポリペプチドは、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と特異的に結合する抗体又はＴ細胞によって認識され得るエピトープをもはや含まない場合、図２に示すタンパク質の変異体ではなくなる。タンパク質を認識する抗体が種々の大きさのエピトープに結合し、そして、凡そ４又は５個程度の連続した又は連続していないアミノ酸の集まりが、最小エピトープにおける典型的なアミノ酸数とみなされるということを、当業者は理解している。参照例：Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4): 2598-608。
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質変異体のもう一つのクラスは、図２のアミノ酸配列又はそのフラグメントと７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％以上の類似性をもつ。もう一つの特定のクラスの１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体又は類似体は、本明細書に記載の１５８Ｐ１Ｄ７生物学的モチーフ又は現在技術的に既知のモチーフを１個以上含んでなる。従って、元のフラグメントから相対的に変化した機能的性質（例えば、免疫原性）を有する１５８Ｐ１Ｄ７フラグメント（核酸又はアミノ酸）の類似体は、本発明に包含される。現在のモチーフ又は技術の一部となるモチーフは、図２又は図３の核酸又はアミノ酸配列に適用されるべきことが認識される。
本明細書にて考察するように、特許請求した本発明の態様は、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の全アミノ酸よりも少ない配列を含むポリペプチドを、包含する。例えば、本発明の代表的態様は、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含んでなる。
さらに、本明細書に開示した本発明の代表的態様は、１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列全体を通して、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１ないしアミノ酸１０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１０ないしアミノ酸２０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸２０ないしアミノ酸３０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸３０ないしアミノ酸４０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸４０ないしアミノ酸５０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸５０ないしアミノ酸６０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸６０ないしアミノ酸７０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸７０ないしアミノ酸８０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸８０ないしアミノ酸９０近傍からなるポリペプチド、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸９０ないしアミノ酸１００近傍からなるポリペプチドなどである。さらに、図２又は図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ酸１（又は２０又は３０又は４０など）近傍ないしアミノ酸２０（又は１３０、又は１４０又は１５０など）近傍からなるポリペプチドも本発明の態様である。本項において開始位置と停止位置は、特定した位置並びにその特定した位置のプラスマイナス５個の残基をいうものと認識する。
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質は、標準のペプチド合成法を用いるか、又は、技術上既知の化学的開裂方法（chemical cleavage method）を用いて生成させる。あるいは、組換え方法を用いて１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化する核酸分子を生成させることもできる。一態様において、核酸分子は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質（又は、その変異体、相同体若しくは類似体）の所定のフラグメントを生成させる手段を提供する。
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ含有タンパク質の態様
本明細書に開示する本発明のさらなる説明の態様は、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチド配列内に含まれる１個以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含んでなる１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドを包含する。様々なモチーフが技術分野で既知であり、タンパク質を、公的に利用可能な多数のインターネットサイトにより、かかるモチーフの存在について評価し得る（参照例：ＵＲＬアドレス：pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; URL:cbs.dtu.dk/;ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 及び BIMAS, bimas,dcrt.nih.gov/.）。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のモチーフ含有配列を表１９に示し、確認する。
表２０はpfamサーチ（参照：ＵＲＬアドレス pfam.wustl.edu/）に基づいて、数種のしばしば出現するモチーフを示す。表２０の各欄は（１）モチーフ名略号；（２）モチーフファミリーの異なるメンバーの中に見出されるパーセント同一性；（３）モチーフ名又は説明；及び、（４）最も共通の機能；位置情報はモチーフが位置に関連する場合に含めた。
上に考察した１５８Ｐ１Ｄ７モチーフを１以上含んでなるポリペプチドは、上に考察した１５８Ｐ１Ｄ７モチーフが増殖制御不全と関わりがあるという知見の観点より、また、１５８Ｐ１Ｄ７が特定の癌で過剰発現されるという理由で、悪性表現型の特別の性質を解明する上で有用である（参照例：表１）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰ及びｃａｍｐ依存性タンパク質キナーゼ、並びに、プロテインキナーゼＣは、例えば、悪性表現型の進展と関連することが分かっている酵素である（参照例：Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) 及びO’Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)）。さらに、グリコシル化とミリストイル化の両方は、癌、及び、癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（参照例：Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)）。アミド化も、癌、及び、癌の進行に関連するもう一つのタンパク質修飾である（参照例：Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)）。
もう一つの態様において、本発明のタンパク質は表５〜１３に示すペプチドなど、技術的に認められている方法に従って同定される１以上の免疫反応性エピトープを含んでなる。ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（例：表４；EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University,URL: brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 及び BIMAS, URL: bimas,dcrt.nih.gov/.）。さらに、ＨＬＡ分子に対し十分な結合親和性をもつエピトープを同定する方法であって、免疫原性エピトープであることと関連させる方法は、技術上周知であり、過度な実験をせずとも実施し得る。加えて、免疫原性エピトープであるペプチドを同定する方法は技術上周知であり、過度な実験をせずともインビトロ又はインビボの何れでも実施し得る。
また、免疫原性を調節させるために、かかるエピトープの類似体を創製する原理も技術上既知である。例えば、ＣＴＬ又はＨＴＬモチーフを含有するエピトープから開始する（参照例：表４のＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ モチーフ／スーパーモチーフ）。該エピトープは、一ヶ所の特定の位置で一つのアミノ酸を取り除き、それをその特定の位置で他の一つのアミノ酸と置き換えることにより類似体化する。例えば、表４に規定した好適な残基など他の残基を選定して、有害な（deleterious）残基を置き換える；表４に規定した好適な残基と、あまり好ましくない残基とを置き換える；又は表４に規定した他の好適な残基と当初に存在する好適な残基とを置き換えることができる。置換はペプチドの一次アンカー位置又は他の位置で起こり得る；参照、例えば、表４。
様々な文献が、対象とするタンパク質及びその類似体におけるエピトープの同定と生成についての技術を示している。参照例：ＷＯ９７３３６０２（Chesnut et al.）; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; 及び Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O’Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 1663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 及び Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92。
本発明の関連する態様は、表１９に示す異なるモチーフ、及び／又は、表５ないし表１８の予測した１種以上のＣＴＬエピトープ、及び／又は、技術分野で既知の１種以上のＴ細胞結合モチーフの組合せからなるポリペプチドを含む。好適な態様は、該ポリペプチドのモチーフ又は介在配列内に、挿入、欠失又は置換を含まない。加えて、これらモチーフの両側に、多くのＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基を含む態様が望ましい（例えば、該モチーフが位置するポリペプチド構築物のより大きな部分を含むために）。典型的には、モチーフの両側上のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸残基の数は、凡そ１個ないし凡そ１００個のアミノ酸残基、好ましくは５個ないし凡そ５０個のアミノ酸残基の間である。
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質は、具体的には、多くの形状で存在するが、好ましくは単離された形状で存在する。精製した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドと１５８Ｐ１Ｄ７が結合するのを妨げる他のタンパク質又は分子を、実質的に含まない。単離精製の性質と度合いは、意図する用途に左右される。１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の態様は、精製した１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及び機能的な可溶性１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を包含する。一態様において、機能的な可溶性１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞又は他のリガンドを結合させる能力を保持する。
本発明はまた、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含んでなる１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を提供する。かかるタンパク質は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の性質、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と会合するエピトープに特異的に結合する抗体の生成をもたらす能力；かかる抗体を結合させる能力；ＨＴＬ又はＣＴＬの活性化をもたらす能力；及び／又は、ＨＴＬ又はＣＴＬに認識させる能力；などを示す。
特に対象とする構造を含む１５８Ｐ１Ｄ７関連ポリペプチドは、技術上周知の様々な分析法、例えば、チョウ−ファスマン（Chou-Fasman）、ガミエル−ロブソン（Gamier-Robson）、カイト−ドーリットル（Kyte-Doolittle）、アイゼンベルグ（Eisenberg）、カープラス−シュルツ（Karplus-Schultz）、又は、ジェイムソン−ウオルフ（Jameson-Wolf）解析の方法を用い、或いは、免疫原性に基づき、予測及び／又は同定することができる。かかる構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体若しくはＴ細胞の生成に、又は、１５８Ｐ１Ｄ７に結合する細胞性因子の同定に特に有用である。
ＣＴＬエピトープは、特定したＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（例：ワールドワイド・ウエブのＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイトを使用することによる。URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; 表４（Ａ）−（Ｅ）に掲載；EpimatrixTM and EpimerTM, Brown University, URL (URL: brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatris.html); 及び BIMAS, URL;bimas.dcrt.nih.gov/）。これを説明すると、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７及びＢ３５の状況において、提示される１５８Ｐ１Ｄ７からペプチドエピトープが予測された（表５〜１３）。具体的には、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の完全アミノ酸配列を、上記のウエブサイト、バイオインフォマティクス・アンド・モレキュラー・アナリシス・セクション（ＢＩＭＡＳ）に見出したＨＬＡペプチド・モチーフ・サーチ・アルゴリズムに入力した。ＨＬＡペプチド・モチーフ検索アルゴリズムはパーカー博士（Dr. Ken Parker）が開発したもので、ＨＬＡクラスＩ分子の溝、特にＨＬＡ−Ａ２における特異的ペプチド配列の結合に基づくものである（参照例：Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２及び多くの他のＨＬＡクラスＩ分子に対し予測される結合について、完全なタンパク質配列から８マー、９マー及び１０マーペプチドの位置と順位を提供する。多くのＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは８、９、１０又は１１マーである。例えば、クラスＩのＨＬＡ−Ａ２については、エピトープは、好ましくは、ロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）を位置２に、また、バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）をＣ末端に含む（参照例：Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)）。１５８Ｐ１Ｄ７予測結合ペプチドの選択結果を本明細書の表５〜１３に示す。表５〜１３に、各ファミリーメンバーについての上位５０位の候補、９マー及び１０マーを、それらの位置、各特異的ペプチドのアミノ酸配列、及び、予測される結合スコアとともに示す。結合スコアは３７℃、ｐＨ６.５での該ペプチドを含む複合体が解離する推定半減時間に相当する。最高の結合スコアをもつペプチドは、細胞表面のＨＬＡクラスＩに、最長時間、最も堅固に結合することが予測され、従って、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原標的を示すものである。
ＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上での、ＨＬＡ発現の安定化により評価し得る（参照例：Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) 及び Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)）。特異ペプチドの免疫原性は、樹状細胞などの抗原提示細胞の存在下、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によりインビトロで評価し得る。
評価すべきことは、ＢＩＭＡＳサイト、EpimerTM及びEpimatrixTMサイトにより予測される何れのエピトープ、或いは、技術的に利用可能な又は表４に示すように技術の一部となる（又はワールドワイド・ウエブサイト URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/を使用して決定される）ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩのモチーフにより特定された何れのエピトープも、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質に対して「適用される」べきことである。この文脈で使用する場合、「適用される」とは１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を、例えば、関連分野の当業者が評価するように、目視にて、又はコンピュータに基づくパターン・ファインディング法により評価する。ＨＬＡクラスＩモチーフを含有する８、９、１０、又は１１のアミノ酸残基の１５８Ｐ１Ｄ７のサブ配列、又は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフを含有する９以上のアミノ酸残基のサブ配列は、何れも本発明の範囲内である。
ＩＩＩ．Ｂ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の発現
以下の例に記載する態様において、１５８Ｐ１Ｄ７は、Ｃ末端６×ＨｉｓとＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、インビトロジェン、又は、Ｔａｇ５、ジェンハンターコーポレーション（GenHunter Corporation）ナッシュビル、ＴＮ）とともに１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するＣＭＶ駆動ベクターなどの市販品として入手し得る発現ベクターにより形質移入した細胞（２９３Ｔ細胞など）で簡便に発現し得る。Ｔａｇ５ベクターは形質移入細胞中で分泌された１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の生産を容易にするために使用されるＩｇＧＫ分泌シグナルを提供する。培地中で分泌されたＨＩＳタグ標識−１５８Ｐ１Ｄ７は、例えば、標準法によりニッケルカラムを用いて精製し得る。
ＩＩＩ．Ｃ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の修飾
共有結合修飾などの１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の一つのタイプは、１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドの標的アミノ酸残基と１５８Ｐ１Ｄ７の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導化剤との反応である。本発明の範囲に包含される１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドのもう一つのタイプの共有結合修飾は、本発明タンパク質の本来のグリコシル化パターンを変化させることからなる。１５８Ｐ１Ｄ７のもう一つのタイプの共有結合修飾は、様々な非タンパク質ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンなどに、米国特許（USP4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192又は4,179,337）に開示された方法により、１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドを結合させることからなる。
本発明の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質はまた、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した１５８Ｐ１Ｄ７を含んでなるキメラ分子を形成するように、修飾することができる。かかるキメラ分子は、化学的に又は組換えにより合成し得る。キメラ分子は、本発明のタンパク質が別の腫瘍関連抗原又はそのフラグメントと融合したものを、持ち得る。あるいは、本発明によるタンパク質は、１５８Ｐ１Ｄ７配列（アミノ酸又は核酸）のフラグメントの融合を含んでなり、その結果、分子はその全長で図２又は図３に示されるアミノ酸又は核酸配列に直接相同ではないものとして創製される。かかるキメラ分子は１５８Ｐ１Ｄ７の複数の同じサブ配列を含み得る。キメラ分子は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質と、ポリヒスチジンエピトープタグ（固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する）、サイトカイン、又は、増殖因子、との融合物を含んでなる。エピトープタグは一般に、１５８Ｐ１Ｄ７の、アミノ又はカルボキシル末端に設置する。代わり得る態様において、キメラ分子は１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合物を含んでなる。キメラ分子の二価形状（「イムノアドヘシン」ともいう）の場合、かかる融合物はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対し得る。Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドの可溶性（膜透過性ドメインの欠失又は不活化）形状との置換を含む。好適な態様において、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧｌ分子のヒンジＣＨ２及びＣＨ３を、又は、ヒンジＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合物の生産についての参照例：米国特許５,４２８,１３０（１９９５年６月２７日発行）。
ＩＩＩ．Ｄ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の用途
本発明のタンパク質は多くの異なる用途を有する。１５８Ｐ１Ｄ７は膀胱癌及び他の癌で高度に発現されるので、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質は正常組織とそれに対する癌組織中での１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態を評価し、それによって悪性表現型を解明する方法に使用する。典型的には、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の特定領域からのポリペプチドは、これら領域（１個以上のモチーフを含む領域など）の変異（perturbation）（欠失、挿入、点突然変異など）の存在を評価するために使用する。模範となるアッセイ法では、正常組織とそれに対する癌組織中でのこの領域の特性を評価するために、又は、エピトープに対する免疫応答を惹起するために、１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチド配列内に含まれる１個以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含んでなる１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を標的とする抗体又はＴ細胞を利用する。別法としては、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を、１５８Ｐ１Ｄ７の当該領域と相互作用する因子をスクリーニングするために使用する。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質フラグメント／サブ配列は、１５８Ｐ１Ｄ７又はその特定の構造ドメインに結合する物質又は細胞性因子を同定するために、ドメイン特異的抗体（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の細胞外又は細胞内エピトープを認識する抗体）の生成及び特徴付けに特に有用であり、また種々の治療及び診断状況、例えば、限定されるものではないが、診断アッセイ、癌ワクチン及びかかるワクチンの製造法に有用である。
１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子がコード化するタンパク質、又は、その類似体、相同体若しくはフラグメントがコード化するタンパク質は、様々な用途を有する；例えば、限定されるものではないが、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物に結合する抗体の生成、並びに、リガンド及びその他の物質及び細胞性成分を同定する方法などである。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのフラグメントに対する抗体は、表１に掲載したような１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現により特徴づけられるヒトの癌の管理における診断及び予知のアッセイ並びに画像化方法に有用である。かかる抗体は細胞内で発現可能であり、かかる癌をもつ患者の治療方法に使用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７関連の核酸又はタンパク質もまた、ＨＴＬ又はＣＴＬ反応を生成させる際に使用する。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出に有用な種々の免疫学的アッセイ法が使用される；例えば、限定されるものではないが、種々タイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学法などである。抗体は標識して、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞を検出し得る免疫学的画像形成剤として使用し得る（例：ラジオシンチグラフ画像化法にて）。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質はまた、さらに本明細書に記載するように、癌ワクチンの生成に特に有用である。
ＩＶ．）１５８Ｐ１Ｄ７抗体
本発明のもう一つの側面は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好適な抗体は１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に特異的に結合し、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質ではないペプチド又はタンパク質には結合しない（結合してもわずかである）。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７に結合する抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質、例えばその相同体又は類似体、に結合する。
本発明の１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、膀胱癌の診断及び予測のアッセイにおいて並びに画像化方法において、特に有用である。同様に、かかる抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７が他の癌にも発現又は過剰発現される限りにおいて、それらの癌の治療、診断、及び／又は予測において、特に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例：一本鎖抗体）は、進行又は転移した膀胱癌など、１５８Ｐ１Ｄ７の発現が関与する癌の治療において、治療上有用である。
本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７及び突然変異１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の検出と定量に有用な種々の免疫学的アッセイ法をも提供する。かかるアッセイ法は、適切な場合、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を認識及び結合し得る１種以上の１５８Ｐ１Ｄ７抗体を含み得る。これらのアッセイは技術上周知の種々の免疫学的アッセイ形式に基づいて実施する；該方法は限定されるものではないが、種々タイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）などである。
本発明の免疫学的な非抗体アッセイは、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性又は刺激性）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）結合アッセイをも含む。
加えて、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する膀胱癌及びその他の癌を検出し得る免疫学的画像化法もまた本発明により提供される；かかる方法は限定されるものではないが、標識した１５８Ｐ１Ｄ７を使用するラジオシンチグラフ画像化法である。かかるアッセイ法は、膀胱癌などの１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の検出、モニター、及び、予測において臨床的に有用である。
１５８Ｐ１Ｄ７抗体はまた、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の精製法、並びに、１５８Ｐ１Ｄ７相同体及び関連分子の単離方法にも、使用される。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の精製法は、固体マトリックスに結合されている１５８Ｐ１Ｄ７抗体を、１５８Ｐ１Ｄ７抗体が１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質と結合することが可能な条件下で、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を含む溶出液又はその他の溶液とインキュベートし；該固体マトリックスを洗浄して不純物を除き；結合した抗体から１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を溶出することからなる。本発明の１５８Ｐ１Ｄ７抗体のその他の用途は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を模倣（mimic）する抗イディオタイプ抗体の生成を含む。
様々な抗体調製法が技術上周知である。例えば、単離された形状の又は免疫コンジュゲート形状の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質、ペプチド又はフラグメントを用い、適当な哺乳動物宿主を免疫することにより、抗体を調製し得る（Antibodies: A Laboratory Manual (抗体：実験室マニュアル)、CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)）。加えて、１５８Ｐ１Ｄ７の融合タンパク質、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７ ＧＳＴ融合タンパク質なども使用し得る。特定の態様においては、図２又は図３のアミノ酸配列の全部又は大部分を含んでなるＧＳＴ融合タンパク質を製造し、それを免疫原として使用し、適切な抗体を生成する。もう一つの態様においては、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を合成し、免疫原として使用する。
加えて、技術上既知の、裸のＤＮＡ（naked DNA）免疫化技法は、コード化された免疫原に免疫応答を生じさせるために（精製した１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又は１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞とともに又は不存在下に）使用される（参照総説：Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648）。
図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸配列を分析して、抗体を生成させるための１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の特異的領域を選択することができる。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列の疎水性及び親水性分析を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７構造中の親水性領域を同定する（参照例：標題「抗原性プロフィール」の実施例）。免疫原構造を示す１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の領域、並びに、その他の領域及びドメインを、技術上既知のその他の種々の方法を用いて容易に同定し得る；例えば、チョウ−ファスマン（Chou-Fasman）、ホップとウッズ（Hopp and Woods）、カイト−ドーリットル（Kyte-Doolittle）、ジャニン（Janin）、バスカランとポヌスワミイ（Bhaskaran and Ponnuswamy）、デリージとロー（Deleage and Roux）、ガミエル−ロブソン（Gamier-Robson）、アイゼンベルグ（Eisenberg）、カープラス−シュルツ（Karplus-Schultz）、又は、ジェイムソン−ウオルフ（Jameson-Wolf）分析などである。従って、これらのプログラム又は方法の何れかにより同定される各領域は、本発明の範囲内である。１５８Ｐ１Ｄ７抗体を生成させる方法については、本明細書中に提供した実施例の方法によりさらに説明する。免疫原として使用するタンパク質又はポリペプチドの調製法は技術上周知である。ＢＳＡ、ＫＬＨ又はその他の担体タンパク質などの担体と、タンパク質との免疫原抱合体の調製法も、また技術上周知である。ある場合には、例えば、カルボジイミド試薬を用いる直接抱合を用いる；他の場合にはピアス・ケミカル（ロックフォード、ＩＬ）が供給するような連結試薬が有効である。１５８Ｐ１Ｄ７免疫原の投与は、しばしば適当な時間間隔の注射により実施し、技術上理解されるように、適当なアジュバントと共に使用する。免疫化スケジュールの期間に、抗体形成の適正を確認するために、抗体力価を測定し得る。
１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体は技術的に周知の種々の手段により製造し得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化した細胞は、一般的に知られているように、コーラーとミルシュタイン（Kohler and Milstein）の標準的ハイブリドーマ法、又は、抗体産生Ｂ細胞を不死化するような修飾、を用いて調製する。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質である免疫学的検定（イムノアッセイ）によりスクリーニングする。適切な不死化細胞培養が同定された場合、該細胞培養を拡張し、インビトロ培養系又は腹水液から坑体を産生させ得る。
本発明の一態様はマウスモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマであり、Ｘ６８（２）１８（a.k.a.M15-68(2)18.1.1）と命名し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した（P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108；２００４年２月６日；受託番号ＰＴＡ−５８０１）。
本発明の抗体又はフラグメントは、組換えの手法によっても製造し得る。キメラの又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植された、多種由来の抗体の状態において、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域を製造することもできる。ヒト化又はヒトの１５８Ｐ１Ｄ７抗体もまた製造可能であり、治療における使用に好ましい。１種以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することにより、マウス又はその他の非ヒト抗体を、ヒト化する方法は周知である（参照例：Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536）。Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 及び Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296 も参照。
完全ヒトモノクローナル抗体の製造法は、ファージディスプレイ及びトランスジェニック法を含む（参照総説：Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-639）。完全ヒト１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体は、大規模ヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリーを用いたクローニング技法（すなわち、ファージディスプレイ）により生成させ得る（Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries (インビトロ免疫系の構築：ファージディスプレイライブラリイからのヒト抗体). Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man (ヒトにおける予防及び治療適用抗体分子のタンパク質エンジニアリング), Clark, M.(Ed.), Nottingham Academic, pp45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries (コンビナトリアルライブラリーからのヒト抗体), Id., pp65-82）。完全ヒト１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように設計したトランスジェニックマウスを用いて製造することができる；記載例は１９９７年１２月３日公開されたKucherlapati及びJakobovitsらによるＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（また、Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614； 米国特許６,１６２,９６３（２０００年１２月１９日発行）；ＵＳＰ６,１５０,５８４（２０００年１１月１２日発行）；及び、６,１１４,５９８（２０００年９月５日発行）も参照）。この方法は、ファージディスプレイ技法で必要なインビトロ操作を回避し、効率的に高親和性で真正のヒト抗体を産生する。
１５８Ｐ１Ｄ７抗体の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質との反応性は、多くの既知の方法、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞又はその抽出物を適切に使用した、ウエスタンブロット、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析により立証可能である。１５８Ｐ１Ｄ７抗体若しくはそのフラグメントは検出可能なマーカーで標識するか、又は、第二分子に抱合させ得る。適当な検出可能マーカーは、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート又は酵素である。さらに、２つ以上の１５８Ｐ１Ｄ７エピトープに特異的な二重特異性抗体は、技術上一般に知られた方法を用いて生成させる。ホモダイマー抗体もまた、技術上既知の架橋法により生成させ得る（例：Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565）。
Ｖ.）１５８Ｐ１Ｄ７細胞性免疫応答
Ｔ細胞が抗体を認識するメカニズムについて、(詳細が)描写されてきている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界的な集団の非常に広範な部分において、治療的又は予防的な免疫反応を誘導する。細胞性免疫応答を誘発する本発明組成物の価値及び有効性を理解するために、免疫学関連技法の簡潔な概説が提供されている。
ＨＬＡ分子とペプチド抗原の複合体は、ＨＬＡ制限Ｔ細胞により認識されるリガンドとして作用する（Buus, S. et al., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B.P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. and Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R.N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993）。単一アミノ酸置換の抗原類似体の研究、及び、内因性に結合する天然に作用するペプチドの配列決定を経て、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要なモチーフに対応する重要な（決定的な）残基が同定されており、それを表４に示す（参照例：Southwood, et al., J. Immunol. 160: 3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41: 178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, access via World Wide Web at URL syfpeithi,bmi-heidelberg.com/; Settem A. and Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. and Grey, H.M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J. Curr. Biol. 6: 52, 1994; Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155: 4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996; Sette, A. and Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4): 201-12, 総説）。
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶解析により、ペプチドリガンドが保持する残基をアレル特異的様式で収容するＨＬＡ分子の該ペプチドが結合する割れ目／溝の中に、ポケットがあることが明らかになった；結果として、これらの残基が、これらの残基を有するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（参照例：Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587; Smith, et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J.H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053,1993; Guo, H.C. et al., Nature 360:364,1992; Silver, M.L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D.H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M.A., Bjorkman, P.J. and Wiley, D.C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991）。
従って、クラスＩ及びクラスＩＩアレル特異的ＨＬＡ結合モチーフ、又は、クラスＩ若しくはクラスＩＩスーパーモチーフを限定することで、特定のＨＬＡ抗原に対する結合と（相関）関係にあるタンパク質内領域を、同定することが可能となる。
従って、ＨＬＡモチーフの同定によって、エピトープに基づくワクチンの候補が同定されている；かかる候補はＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価し、該エピトープ及びその相当するＨＬＡ分子の結合親和性及び／又は会合時間を決定することができる。さらなる確認作業は、これらのワクチン候補の中で、集団の適用範囲の点で、及び／又は、免疫原性の点で、好適な特性をもつエピトープを選択するために実施し得る。
細胞性の免疫原性を評価するためには、以下の様々な戦略を利用し得る：
１）正常個体からの一次Ｔ細胞培養物の評価（参照例：Wentworth, P.A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998）。この手法は、正常被験者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、抗原提示細胞の存在下にインビトロでテストペプチドにより数週間にわたり刺激することからなる。該ペプチドに特異的なＴ細胞はこの期間に活性化されることとなり、例えば、リンホカイン又は５１Ｃｒ放出アッセイ（ペプチド感作標的細胞を含む）により検出する。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化（参照例：Wentworth, P.A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P.A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997）。例えば、かかる方法では、不完全フロインドアジュバント中のペプチドをＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与する。免疫の数週間後、脾細胞を取り出し、テストペプチドの存在下に約１週間培養する。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイ（ペプチド感作標的細胞及び内因性に生成される抗原を発現する標的細胞を含む）により、検出する。
３）効果的にワクチン接種した免疫個体からの、及び／又は、慢性段階ＩＩＩの患者からのリコールＴ細胞応答の証明（参照例：Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181;1047, 1995; Doolan, D.L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S.C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H.M. et al., J. Virol. 71:6011, 1997）。従って、病気のため該抗原に接触し結果として免疫応答を「自然に」生じた被験者からの、又は、該抗原に対しワクチン接種した患者からのＰＢＬを培養することにより、リコール応答は検出される。被験者からのＰＢＬは、テストペプチドと抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下に１〜２週間インビトロで培養することにより、「メモリー」Ｔ細胞の活性化（「ナイーブ」Ｔ細胞に比較して）が可能となる。培養終了時点において、５１Ｃｒ放出（ペプチド感作標的を含む）、Ｔ細胞増殖、又はリンホカイン放出を含むアッセイにより、Ｔ細胞活性を検出する。
ＶＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７トランスジェニック動物
１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化する核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の生成にも使用し得るが、該動物は結果として治療的に有用な試薬の開発及びスクリーニングにおいて有用である。確立された技法に従い、１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するｃＤＮＡは、１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するゲノムＤＮＡのクローニングに使用し得る。クローン化ゲノム配列は、次いで１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成させるために使用し得る。トランスジェニック動物、特にマウス又はラットなどの動物についての生成方法は技術上常套のものとなっており、例えば、米国特許４,７３６,８６６（１９８８年４月１２日発行）及び４,８７０,００９（１９８９年９月２６日発行）に記載されている。典型的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを含む１５８Ｐ１Ｄ７導入遺伝子の標的となろう。
１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を使用して、１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するＤＮＡの発現増加の効果を試験することができる。かかる動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的症状から保護すると考えられる試薬についての試験動物として、使用し得る。本発明のこの側面によると、動物を試薬で処理し、該導入遺伝子を含有する未処置動物に比較して病理学的症状の発生率が低下している場合、その病理学的症状に対する潜在的な治療的介在があったとする。
あるいは、１５８Ｐ１Ｄ７の非ヒト相同体は、１５８Ｐ１Ｄ７「ノックアウト」動物を構築するために使用し得る；ノックアウト動物は１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する内在性遺伝子と、その動物の胚細胞に導入した１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する改変ゲノムＤＮＡとの間の相同的組み換えの結果として、１５８Ｐ１Ｄ７のコード化に欠陥のある遺伝子又は改変された遺伝子をもつ動物である。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するｃＤＮＡを用い、確立された技法に従って１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するゲノムＤＮＡをクローン化することができる。１５８Ｐ１Ｄ７をコード化するゲノムＤＮＡの一部は削除するか、又は組込みをモニターするために使用し得る選択可能なマーカーをコード化する遺伝子などの別の遺伝子と置き換え得る。典型的には、数キロベースの未変化末端切除ＤＮＡ（５’及び３’両末端）が該ベクターに含まれている（参照例：相同的組み換えベクターの説明 Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)）。該ベクターは胚性幹細胞株に導入し（例えば、エレクトロポレーションにより）、導入したＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同性に組み換った細胞を選択する（参照例：Li et al., Cell, 69:915 (1992)）。選択した細胞は、次いで動物（例：マウス又はラット）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成させる（参照例：Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (奇形癌腫及び胚性幹細胞：実用法)、E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.113-152）。キメラ胚は次いで適当な偽妊娠メス里子哺育動物に移植し、該胚が「ノックアウト」動物を創生する条件とする。その幹細胞に相同的組み換えＤＮＡを保持する子孫は標準的技法により同定可能であり、その動物の細胞すべてが相同的組み換えＤＮＡを含む動物に繁殖するために使用することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的症状に対しての防御能力、又は、１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドの存在しないことによる病理学的症状の発症において、特徴付けることができる。
ＶＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７の検出方法
本発明のもう一つの側面は、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドとポリペプチド及び１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の検出方法、並びに１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞の同定方法に関する。１５８Ｐ１Ｄ７の発現プロフィールは転移性疾患の診断マーカーとなる。従って、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態は、疾患のステージが進行する可能性、進行速度、及び／又は、腫瘍攻撃性などを含む種々の因子を予測するために有用な情報を提供する。本明細書で詳細に考察するように、患者サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態は、技術上周知の様々なプロトコール、例えば、免疫組織化学分析、in situ ハイブリダイゼーションなどの様々なノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉顕微解剖サンプル）、ウエスタンブロット分析、及び組織アレイ分析などにより分析し得る。
より詳しくは、本発明は、生体サンプル、例えば、尿、血清、骨、前立腺液、組織、精液、細胞調製品など中の１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを検出するアッセイ法を提供する。検出可能な１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子又はそのフラグメント、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ、選択的スプライス変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ、及び、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子である。１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドの存在を、増幅及び／又は検出する多くの方法が技術上周知であり、本発明のこの局面の実施に採用し得る。
一態様において、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも１種のプライマーを用い、逆転写によりサンプルからｃＤＮＡを生産し、そのように生産したｃＤＮＡを、センス及びアンチセンスプライマーとしての１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドにより増幅して、サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡを増幅し、次いで増幅した１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡの存在を検出することからなる。任意的に、増幅した１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡの配列を決定し得る。
もう一つの態様において、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を検出する方法は、先ずサンプルからゲノムＤＮＡを分離すること；センス及びアンチセンスプライマーとして１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを用い、単離したゲノムＤＮＡを増幅すること；及び増幅した１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の存在を検出すること；からなる。いくつもの適切なセンス及びアンチセンスプローブの組合せを、１５８Ｐ１Ｄ７用に提供されるヌクレオチド配列（図２）から設計し、この目的に使用し得る。
本発明はまた、組織又は他の生体サンプル、例えば、尿、血清、精液、骨、前立腺、細胞調製品など中の１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の存在を検出するアッセイ法を提供する。１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を検出する方法もまた周知であり、例えば、免疫沈降法、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどを含む。例えば、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の存在を検出する方法は、先ずサンプルを１５８Ｐ１Ｄ７抗体、その１５８Ｐ１Ｄ７反応性フラグメント、又は１５８Ｐ１Ｄ７抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と接触させること；次いでサンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の結合を検出すること；からなる。
１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞の同定法もまた、本発明の範囲内である。一態様において、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を発現する細胞の同定アッセイ法は、細胞中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの存在を検出することからなる。細胞中の特定のｍＲＮＡの検出方法は周知であり、例えば、相補性ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（標識した１５８Ｐ１Ｄ７リボプローブを用いるin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技法など）及び種々の核酸増幅アッセイ法（１５８Ｐ１Ｄ７に特異的な相補性プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ、及び他の増幅型検出法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）を含む。あるいは、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を発現する細胞の同定アッセイ法は、細胞中の、又は細胞が分泌する１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の存在を検出することからなる。様々なタンパク質検出法が技術的に周知であり、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の検出及び１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を発現する細胞の検出に採用される。
１５８Ｐ１Ｄ７発現分析はまた１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子発現を調節する薬剤の同定及び評価用の手段としても有用である。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７発現は膀胱癌で有意に上方制御され、表１に掲載した組織の癌において発現される。癌細胞中で１５８Ｐ１Ｄ７発現又は過剰発現を阻害する分子又は生物学的物質の同定には治療上の価値がある。例えば、かかる物質はＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又は抗体結合により１５８Ｐ１Ｄ７の発現を定量するスクリーニングを用いることにより同定することができる。
ＶＩＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７関連遺伝子及びその産物のモニター方法
発癌は多段階プロセスであることが知られており、細胞増殖が進行性に制御不全となり、細胞が正常の生理的状態から前癌状態、さらには癌状態にまで進行する（参照例：Alers et al., Lab Invest. 77(5):437-438 (1997) 及び Isaacs et al., Cancer Surv. 23:19-32 (1995)）。この状況下で、制御不全細胞増殖を証明するために生体サンプルを調べることにより（癌における異常な１５８Ｐ１Ｄ７発現など）、治療選択のさらに限定される段階及び／又は予後の悪化する段階へと癌が進行するような病的状態になる前に、かかる異常な生理状態の初期検出が可能となる。かかる試験においては、対象の生体サンプルの状態を、例えば、対応する正常サンプル（例：病理学的影響を受けていない個体あるいは別の個体からのサンプル）中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態と比較することができる。生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態の変化は（正常サンプルと比較した場合）、制御不全細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルとして病理学的に影響を受けていない生体サンプルを使用することに加えて、ｍＲＮＡ発現を予め決定した正常レベルなど予め決定した基準値を、サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態を比較するために使用することもできる（参照例：Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dec 9:376(2):306-14 及び米国特許５,８３７,５０１）。
この状況下、用語「状態」はその技術的に受け入れられている意味に従って使用され、また遺伝子及びその産物の条件又は状態をいう。一般的に、当業者は多くのパラメーターを使用し、遺伝子及びその産物の条件又は状態を評価する。これらは、限定されるものではないが、発現された遺伝子産物の位置（１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞の位置を含む）並びにそのレベル、及び発現された遺伝子産物の生物活性（１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド及びポリペプチドなど）を含む。一般的に、１５８Ｐ１Ｄ７の状態の変化は、１５８Ｐ１Ｄ７及び／又は１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞の位置における変化、及び／又は１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の増加からなる。
サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態は、技術上周知の多くの手段により分析し得る；その手段は限定されるものではなく、免疫組織化学的分析、in situ ハイブリダイゼーション、レーザー捕捉顕微解剖サンプル上のＲＴ−ＰＣＲ分析、ウエスタンブロット分析、及び組織アレイ分析などを含む。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価する代表的なプロトコールは、例えば、以下の文献に見出される；Ausubel et al., eds. 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Unite 2 (ノーザンブロッティング)、4 (サザーンブロッティング)、15 (免疫ブロッティング)及び18（ＰＣＲ分析）。従って、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態は、当業者が利用する様々な方法によって評価される；かかる方法は、限定されるものではないが、ゲノム・サザーン分析（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の変異（perturbation）を試験するため）、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡのノーザン分析及び／又はＰＣＲ分析（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列又は発現レベルの変化を試験するため）、及びウエスタン及び／又は免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列の変化、サンプル内のポリペプチド位置の変化、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現レベルの変化及び／又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）などを含む。検出可能な１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子又はそのフラグメント、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ、選択スプライス変異体、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ、及び１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
１５８Ｐ１Ｄ７の発現プロフィールは、それを局所及び／又は転移疾患に対する診断マーカーとし、生体サンプルの増殖又は発癌の潜在能力についての情報を提供する。特に、１５８Ｐ１Ｄ７の状態は特定疾患の病期、進行、及び／又は腫瘍攻撃性を予測するために有用な情報を提供する。本発明は１５８Ｐ１Ｄ７の状態を決定し、表１に掲載した組織の癌など、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌を診断する方法及びアッセイ法を提供する。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡは、正常膀胱組織に比較して、膀胱癌、その他の癌においてかなり高度に発現されるので、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ転写物又はタンパク質のレベルは、１５８Ｐ１Ｄ７制御不全と関連する疾患の診断に使用することが可能であり、適切な治療選択肢を決定する際に有用な予後情報を提供し得る。
１５８Ｐ１Ｄ７の発現状態は、形成異常、前癌及び癌状態の存在、段階及び位置などについての情報、疾患が種々の段階へ進行する可能性を予測する情報、及び／又は、腫瘍攻撃性を正確に測定するための情報を提供する。さらに、発現プロフィールは、それを転移疾患用の画像化剤として有用なものとする。結果として、本発明の一つの側面は、癌などの制御不全細胞増殖を特徴とする病態に罹患している個体又は罹患している疑いのある個体からのサンプルなど、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態を試験するための種々の分子レベルの予測法及び診断法を目指すものである。
上述のように、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態は、技術上周知の多くの手法により試験することができる。例えば、身体の特定部分から採取した生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態は、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞（例：１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又はタンパク質を発現する細胞）の存在又は不存在についてサンプルを評価することにより試験し得る。この試験において、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞が、通常かかる細胞を含まない生体サンプル（リンパ節など）に見出される場合、制御不全細胞増殖の証拠を提供し得る；その理由は生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７の状態のかかる変化が、しばしば制御不全細胞増殖と関連するからである。具体的には、制御不全細胞増殖の一指標は、元の臓器（膀胱など）から身体の異なる領域（リンパ節など）への癌細胞の転移である。例によると、制御不全細胞増殖の証拠は、潜在性のリンパ節転移が前立腺癌の相当数の患者の集団に検出されるので重要であり、かかる転移は疾患進行の既知予測因子と関連する（参照例：Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Sur. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) 及び Freeman et al., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1): 474-8）。
一側面において、本発明は１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物をモニターする方法を提供するが、該方法は制御不全細胞増殖（過形成又は癌など）と関連する疾患をもつ疑いのある個体からの細胞が発現する１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態を決定し、そのように決定した状態を、相当する正常サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態と比較することからなる。正常サンプルに比較して、テストサンプル中に異常な１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物が存在する場合、これはその個体の細胞内に制御不全細胞増殖の存在を示すものとなる。
もう一つの側面において、本発明は個体に癌の存在することを決定する際の有用なアッセイ法を提供するが、該アッセイ法はテスト細胞又は組織における１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又はタンパク質発現が、相当する正常細胞又は組織における発現レベルと比較して、有意な増大のあることを検出することからなる。１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの存在は、例えば、表１に掲載した組織に限定されるものではないが、該組織サンプル中で評価し得る。これら組織の何れかにおける有意な１５８Ｐ１Ｄ７発現の存在は、癌の発生、存在及び／又は重篤度を示すために有用であるが、その理由は相当する正常組織が１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡを発現しないか又は低レベルでしか発現しないからである。
関連する態様において、１５８Ｐ１Ｄ７の状態は核酸レベルよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、かかる方法はテスト組織サンプル中の細胞が発現する１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のレベルを決定し、そのように決定されたレベルを相当する正常サンプル中で発現される１５８Ｐ１Ｄ７のレベルと比較することからなる。一態様において、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法により評価する。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質発現を検出し得る１５８Ｐ１Ｄ７抗体又は結合パートナーは、この目的のために技術上周知の様々なアッセイ形式で使用される。
さらなる態様においては、これら分子構造の変異（perturbation）を同定するために、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ヌクレオチド及びアミノ酸配列の状態を評価することができる。これらの変異（perturbation）は挿入、欠失、置換などを含むことが出来る。かかる評価は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の変異（perturbation）が、増殖制御不全表現型と関連する多くのタンパク質に観察されるため有用である（参照例：Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378）。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７の配列内における突然変異は、腫瘍の存在又は促進を示すものであり得る。従って、かかるアッセイ法は１５８Ｐ１Ｄ７の突然変異は、機能の潜在的な喪失又は腫瘍増殖の増大を示す場合、診断的又は予後的価値を有する。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列における変異（perturbation）を観察するための幅広いアッセイ法は、技術上周知である。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の核酸及びアミノ酸配列のサイズ及び構造は、本明細書にて考察したノーザン、サザーン、ウエスタン、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定プロトコールにより観察される。加えて、１本鎖高次構造多型など、ヌクレオチド及びアミノ酸配列における変異（perturbation）を観察するためのその他の方法は、技術上周知である（参照例：米国特許５,３８２,５１０（１９９９年９月７日発行）及びＵＳＰ５,９５２,１７０（１９９５年１月１７日発行））。
さらには、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子５’制御領域におけるＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化及び／又は過剰メチル化が不死化及び形質転換細胞に起こり、結果として種々の遺伝子の発現に変化を起こし得る。例えば、ＤＢＣＣＲ１、ＰＡＸ６及びＡＰＣ遺伝子の過剰メチル化されたプロモーターが膀胱癌に検出されており、これが該遺伝子の異常発現を導いている（Esteller et al., Cancer Res 2001; 61:3225-3229）。遺伝子のメチル化状態を試験する様々な方法が技術上周知である。例えば、サザーンハイブリダイゼーション法では、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価するために、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断することのできないメチル化感受性制限酵素を利用することができる。加えて、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランドに存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態の概略を迅速に描き出すことができる。この手法では、重亜硫酸ナトリウムにより最初にＤＮＡを修飾（すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換する）、次いでメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの各々に特異的なプライマーを用いて増幅することからなる。メチル化干渉に関わるプロトコールはまた、例えば、文献に見出される（Current Protocols in Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel el al., eds., 1995）。
遺伝子増幅は１５８Ｐ１Ｄ７の状態を評価するさらなる方法である。サンプル中における遺伝子増幅を直接測定する；例えば、本明細書に提供した配列に基づき、適切に標識したプローブを用い、ｍＲＮＡ転写を定量する常套のサザーンブロッティング若しくはノーザンブロッティング（Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又は、in situ ハイブリダイゼーションによる。あるいは、特異的二重鎖、例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を認識する抗体を採用する。該抗体を次に標識し、二重鎖が表面に結合している場合、アッセイを実施し、その結果、表面の二重鎖の形成に基づき、二重鎖に結合した抗体の存在を検出し得る。
生検組織又は末梢血は、１５８Ｐ１Ｄ７の発現を検出するために、例えば、ノーザン、ドットブロット又はＲＴ−ＰＣＲ分析を用い、癌細胞の存在について簡便にアッセイすることができる。ＲＴ−ＰＣＲで増幅可能な１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの存在は、癌の存在を示すものとなる。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは技術上周知である。末梢血腫瘍細胞のＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイについては、多くのヒトの固形腫瘍の診断及び管理に使用するために、現在評価されつつある。
本発明のさらなる側面は、癌の発生について、個体が有する罹患率を評価することである。一態様において、罹患率を予測する方法は、組織サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を検出することからなり、その存在は癌に罹患可能性であることを示し、その場合、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ発現の度合いは、罹患可能性の度合いと相関する。具体的な態様において、膀胱又はその他の組織における１５８Ｐ１Ｄ７の存在を試験し、サンプル中に１５８Ｐ１Ｄ７が存在する場合は、膀胱癌の罹患可能性（又は膀胱腫瘍の発生又は存在）を示すものとする。同様に、挿入、欠失、置換などのこれら分子の構造における変異（perturbation）を同定するために、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ヌクレオチドとアミノ酸配列の完全性を評価し得る。サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物に１つ以上の変異（perturbation）の存在する場合は、癌の罹患可能性（又は腫瘍の発生又は存在）を示している。
本発明はまた腫瘍攻撃性を正確に測定する方法を含んでなる。一態様において、腫瘍の攻撃性を正確に測定する方法は、腫瘍細胞が発現する１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のレベルを決定し、そのように決定したレベルと、同じ個体から採取した対応する正常組織又は正常組織対照サンプルにて発現される１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のレベルとを比較することからなり、その際、腫瘍サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の、正常サンプルに比較した発現度によって、攻撃度を示すものとする。特定の態様において、腫瘍の攻撃性は腫瘍細胞中で１５８Ｐ１Ｄ７がどの程度発現されるかを決定し、発現レベルが高いほど、より攻撃性の腫瘍であるとする。もう一つの態様では、挿入、欠失、置換などのこれら分子構造の変異（perturbation）を確認するために、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ヌクレオチド及びアミノ酸配列の完全性を評価する。１つ以上の変異（perturbation）の存在は、腫瘍がより攻撃的であることを示す。
本発明のもう一つの態様は、個体の悪性度の進行を経時的に観察する方法を指向する。一態様において、個体の悪性度の進行を経時的に観察する方法は、腫瘍細胞が発現する１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のレベルを決定し、そのように決定したレベルと、同じ個体から異なる時間に採取した等価の組織サンプルにて発現される１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のレベルとを比較することからなるが、その際、腫瘍サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の経時的な発現度が、癌進行に関する情報を提供する。特定の態様において、癌の進行は腫瘍細胞中の１５８Ｐ１Ｄ７の発現を経時的に測定することにより評価するが、その際、発現が経時的に増大しているならば、癌が進行しているとする。また、挿入、欠失、置換などのこれら分子構造の変異（perturbation）を確認するために、生体サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ヌクレオチド及びアミノ酸配列の完全性を評価するが、その場合、１つ以上の変異（perturbation）の存在は、癌が進行していることを示す。
上記の診断方法は、技術上既知の様々な予測及び診断プロトコールの何れか１つと組合わせることができる。例えば、本発明のもう一つの態様は、組織サンプルの状態を診断及び予測する手段として、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の発現（又は、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の変異（perturbation））及び悪性度と関連する因子の間の同時発生を観察する方法を目的とする。悪性度と関連する多様な因子、例えば、悪性度と関連する遺伝子発現（例：ＰＳＣＡ、Ｈ−rasand p53 発現など）並びに肉眼による細胞学的観察（参照例：Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al.,1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24）が利用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の発現（又は、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の変異（perturbation））及び悪性度と関連するもう１つの因子の間の同時発生を観察する方法は、例えば、疾患と同時に生じる１セットの因子の存在が組織サンプルの状態を診断し、予測するために決定的な情報を提供するので有用である。
一態様において、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の発現（又は１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子及び１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の変異（perturbation））及び悪性度と関連するもう１つの因子の間の同時発生を観察する方法は、組織サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＢＬＣＡ−４ＡｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ発現）を検出すること、及び１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ若しくはタンパク質及びＢＬＣＡ−４ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の過剰発現（又はＰＳＣＡ発現）の同時発生を観察することを必要とする（Amara et al., 2001, Cancer Res 61:4660-4665; Konety et al., Clin Cancer Res. 2000, 6(7):2618-2625）。特定の態様において、膀胱組織における１５８Ｐ１Ｄ７及びＢＬＣＡ−４ｍＲＮＡの発現を試験するが、その場合、サンプル中の、１５８Ｐ１Ｄ７及びＢＬＣＡ−４ｍＲＮＡの過剰発現の同時発生は、膀胱癌の存在、膀胱癌の罹患可能性又は膀胱腫瘍の発生若しくは状態を示す。
１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出し、定量する方法は本明細書に記載され、標準的核酸とタンパク質の検出及び定量法は、技術上周知である。１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの標準的検出及び定量法は、標識した１５８Ｐ１Ｄ７リボプローブを用いるin situ ハイブリダイゼーション、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロット及び関連技法、１５８Ｐ１Ｄ７に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析、及びその他の増幅型検出法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどを含む。特定の態様において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの発現を検出及び定量するために使用される。１５８Ｐ１Ｄ７を増幅し得る数種のプライマーがこの目的に使用し得る；プライマーは制限されるものではないが、本明細書に具体的に記載した種々のプライマーセットを含む。特定の態様において、野生型の１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と特異的に反応するポリクローナル又はモノクローナル抗体が、剖検組織の免疫組織化学アッセイに使用し得る。
ＩＸ．）１５８Ｐ１Ｄ７と相互作用する分子の同定
本明細書に開示した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質及び核酸配列は、１５８Ｐ１Ｄ７と相互作用するタンパク質、小分子及びその他の物質並びに１５８Ｐ１Ｄ７が活性化する経路を、技術的に受け容れられている種々のプロトコールの何れか一つにより当業者が同定することを可能とする。例えば、いわゆる相互作用トラップシステム（「ツーハイブリッドアッセイ」ともいう）の一つを利用する。かかるシステムにおいては、分子同士が作用し合い、レポーター遺伝子の発現を指示する転写因子を再構築し、それによってレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他のシステムでは、真核細胞転写活性化因子の再構築を介してインビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する；参照例：米国特許５,９５５,２８０（１９９９年９月２１日発行）、ＵＳＰ５,９２５,５２３（１９９９年７月２０日発行）、ＵＳＰ５,８４６,７２２（１９９８年１２月８日発行）、及び、ＵＳＰ６,００４,７４６（１９９９年１２月２１日発行）。アルゴリズムも、タンパク質機能のゲノムに基づく予測のために、技術的に利用し得る（参照例：Marcotte, et al., Nature 402:4 November 1999, 83-86）。
あるいは、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。かかる方法において、１５８Ｐ１Ｄ７に結合するペプチドを、ランダム又は調整されたコレクションのアミノ酸をコード化するライブラリーをスクリーニングすることにより同定する。該ライブラリーがコード化するペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現されるので、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質に対してバクテリオファージ粒子をスクリーニングする。
従って、治療、予測又は診断薬などの多様な用途をもつペプチドは、予想されるリガンド又はレセプター分子の構造に関する事前の情報がなくても、このように同定される。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用し得る代表的なペプチドライブラリー及びスクリーニング方法は、例えば、米国特許５,７２３,２８６（１９９８年３月３日発行）及びＵＳＰ５,７３３,７３１（１９９８年３月３１日発行）に開示されている。
あるいは、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞株は、１５８Ｐ１Ｄ７が介在するタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用する。かかる相互作用は免疫沈降法を用いて試験し得る（参照例：Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51）。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を用いて１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞株から免疫沈降させ得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対する抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７とＨｉｓタグの融合物を発現するように調製した細胞株中で使用し得る（上記ベクター）。免疫沈降複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識化、タンパク質マイクロシークエンシング、銀染色及び二次元ゲル電気泳動などの手法により、タンパク質会合について試験し得る。
１５８Ｐ１Ｄ７と相互作用する小分子及びリガンドは、かかるスクリーニングアッセイの関係する態様を介して同定し得る。例えば、タンパク質機能に干渉する小分子は同定可能であり、リン酸化と脱リン酸化、細胞周期の調節を示すものとしてのＤＮＡ又はＲＮＡ分子との相互作用、センカンドメッセンジャーシグナル伝達又は腫瘍形成を仲介する１５８Ｐ１Ｄ７の能力に干渉する小分子である。同様に、１５８Ｐ１Ｄ７関連イオンチャンネル、タンパク質ポンプ、又は、１５８Ｐ１Ｄ７の細胞間コミュニケーション機能を調節する小分子を同定し、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌を有する患者の治療に使用する（参照例：Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes（興奮性膜のイオンチャンネル）2nd Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992）。さらに、１５８Ｐ１Ｄ７の機能を調節するリガンドを、１５８Ｐ１Ｄ７と結合しレポーター構築物を活性化する能力に基づいて、同定し得る。代表的な方法は、例えば、米国特許５,９２８,８６８（１９９９年７月２７日発行）に考察されており、少なくとも１個のリガンドが小分子であるハイブリッドリガンドを形成する方法を含む。実例となる態様においては、１５８Ｐ１Ｄ７とＤＮＡ結合タンパク質の融合タンパク質を発現するように調製した細胞を用い、ハイブリッドリガンド／小分子とｃＤＮＡライブラリー転写活性化因子タンパク質の融合タンパク質を同時発現する。該細胞はさらにレポーター遺伝子を含み、その発現が第一と第二融合タンパク質の近傍上で条件付け、その事象はハイブリッドリガンドが両ハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合した場合にのみ起こる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、未知小分子又は未知リガンドが同定される。この方法は、１５８Ｐ１Ｄ７を活性化するか又は阻害するモジュレーターを同定する手段を提供する。
本発明の態様は、図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法を包含し、該方法は分子集団と１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列とを接触させる工程、該分子集団と１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列とが容易に相互作用する条件下で相互作用させる工程、１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、及び、続いて１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列と相互作用しない分子を相互作用する分子から分離する工程からなる。特定の態様において、該方法はさらに１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列と相互作用する分子を精製、特徴づけ及び同定する工程を含んでなる。同定した分子は、１５８Ｐ１Ｄ７が果たす機能を調節するために使用し得る。好適な態様において、１５８Ｐ１Ｄ７アミノ酸配列はペプチドライブラリーと接触させる。
Ｘ．）治療方法及び組成物
限定された一群の組織において正常に発現されるが、膀胱癌及びその他の癌でも発現されるタンパク質として１５８Ｐ１Ｄ７を同定することは、かかる癌の治療において多くの治療方法の道を開く。本明細書で注目するように、１５８Ｐ１Ｄ７は腫瘍促進遺伝子の活性化又は腫瘍発生を遮断する遺伝子の抑制に関与する転写因子として機能する。
従って、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の活性を阻害する治療方法は、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌罹患患者にとって有用である。これらの治療方法は一般に、２種類に分けられる。１つの種類は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質とその結合パートナー又は他のタンパク質との結合又は会合を阻害する種々の方法からなる。もう一つの種類は１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の転写又は１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの翻訳を阻害する種々の方法からなる。
Ｘ.Ａ．）抗癌ワクチン
本発明は１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又は１５８Ｐ１Ｄ７関連核酸を含んでなる癌ワクチンを提供する。１５８Ｐ１Ｄ７を発現するという観点で、癌ワクチンは１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌を予防及び／又は治療するが、非標的組織に対しては影響が無いか又は殆ど無い。体液性及び／又は細胞仲介免疫応答を生じるワクチンにおいて腫瘍抗原を、抗癌療法に使用することは技術上周知である（参照例：Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117）。
かかる方法は１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を採用することにより、又は１５８Ｐ１Ｄ７エンコーディング核酸分子及び１５８Ｐ１Ｄ７免疫原（一般的には多くの抗体又はＴ細胞エピトープを含んでなる）を発現・提示し得る組換えベクターを採用することにより、容易に実施し得る。当業者も理解するように、免疫反応性エピトープを送達するための多様なワクチン系が技術上既知である（参照例：Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32）。簡単に説明すると、哺乳動物で（体液性及び／又は細胞仲介などの）免疫応答を生成するかかる方法は、哺乳動物免疫系を免疫反応性エピトープ（例：図２に示す１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はその類似体若しくは相同体に存在するエピトープ）に接触させる工程、結果として該哺乳動物がそのエピトープに特異的な免疫応答を生じる（例えば、そのエピトープを特異的に認識する抗体を生じる）工程からなる。好適な方法において、１５８Ｐ１Ｄ７免疫原は生物学的モチーフを含む；例えば、表５〜１８、又は、図１１、図１２、図１３、図１４、及び図１５に示す１５８Ｐ１Ｄ７からのサイズ範囲のペプチドを参照されたい。
全１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質、その免疫原性領域又はエピトープを組合わせ、種々の手段で送達する。かかるワクチン組成物は、例えば、リポペプチド（例：Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）微粒子のカプセルに詰めたペプチド組成物（参照例：Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991; Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるペプチド組成物（参照例：Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998）、多重抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（参照例：Tam, J.P., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996）、多価ペプチドとして調製したペプチド；射出送達系に使用するペプチド、典型的な結晶化ペプチド、ウイルス送達ベクター（Perkus, M.E. et al.,In: Concepts in vaccine development (ワクチン開発の概念) Kaufmann, S.H.E., ed., p,379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535,1986; Hu, S.L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F.H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P.K. et al., Virology 175:535, 1990）、ウイルス又は合成起源の粒子（例：Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods, 192:25, 1996; Eldridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995）、アジュバント（Warren, H.S., Vogel, F.R., and Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R.K. et al., Vaccine 11:293, 1993）、リポソーム（Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996）、裸又は粒子吸収ｃＤＮＡ（Ulmer, J.B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H.L., Hunt, L.A., and Webster, R.G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J.W. et al., Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p.423, 1996; Cease, K.B., and Berzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 and Eldridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993）を、包含する。レセプター仲介標的化としても知られる毒素標的化送達法、例えば、アバント・イムノセラピューティックス・インク（Avant Immunotherapeutics, Inc.）（ニーダム、マサチューセッツ）のものも、また使用し得る。
本発明のワクチン組成物はまた、１５８Ｐ１Ｄ７関連癌の患者において、癌に使用される他の治療法、例えば、手術、化学療法、薬物療法、放射線療法などと共に使用し得るし、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどの免疫補助剤との組合わせでも使用し得る。
細胞性ワクチン
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡアレルに結合する１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質内のペプチドを同定するための特別のアルゴリズムを用いて決定し得る（参照例：
表４；EpimerTM and EpimatrixTM, Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); 及び BIMAS,(URL. bimas,dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI at URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。好適な態様において、１５８Ｐ１Ｄ７免疫原は表５〜１８に示した配列など、技術上周知の技法を用いて同定した１つ以上のアミノ酸配列、又はＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフにより特定される８、９、１０又は１１個のアミノ酸のペプチド（例：表４（Ａ）、表４（Ｄ）、又は表４（Ｅ））及び／又はＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを含んでなる少なくとも９個のアミノ酸のペプチド（例：表４（Ｂ）又は表４（Ｃ））を含む。技術上認められているように、ＨＬＡクラスＩ結合の溝は本質的に閉じた終末であり、その結果、特定サイズ範囲のペプチドのみがその溝に嵌合し、結合することができる；一般にＨＬＡクラスＩのエピトープは、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸の長さである。対して、ＨＬＡクラスＩＩの結合溝は本質的に開放された終末である；従って、約９個以上のアミノ酸のペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することができる。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ間の結合溝の差のために、ＨＬＡクラスＩモチーフは鎖長特異的である、すなわち、クラスＩモチーフの位置２は該ペプチドのアミノからカルボキシルの方向に２番目のアミノ酸である。クラスＩＩモチーフにおけるアミノ酸位置は、ペプチド全体ではなく互いに対してのみの関係である、すなわち、追加されたアミノ酸は、モチーフ含有配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端に付着することができる。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、多くの場合、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸の長さであるか、又は２５個を超えるアミノ酸長である。
抗体に基づくワクチン
哺乳動物において免疫応答を生じさせる多様な方法が技術上既知である（例えば、ハイブリドーマ生成における第一ステップとして）。哺乳動物において免疫応答を生成させる方法は、哺乳動物の免疫系を、タンパク質（例：１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質）上の免疫原エピトープに接触させ、その結果として、免疫応答を生じさせる。典型的な態様は宿主中に１５８Ｐ１Ｄ７に対する免疫応答を生じさせる方法からなり、該方法は該宿主を十分量の少なくとも１種の１５８Ｐ１Ｄ７ Ｂ細胞若しくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はその類似体と接触させること、そしてその後、少なくとも一定の期間間隔で該宿主を１５８Ｐ１Ｄ７ Ｂ細胞若しくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はその類似体と再接触させることからなる。特定の態様は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又は人工的多重エピトープペプチドに対して免疫応答を生じさせる方法からなる；該方法はワクチン製剤中の１５８Ｐ１Ｄ７免疫原（例：１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのペプチドフラグメント、１５８Ｐ１Ｄ７融合タンパク質又は類似体など）をヒト又は別の哺乳動物に投与することからなる。一般的に、かかるワクチン製剤はさらに適切なアジュバント（参照例：米国特許６,１４６,６３５）又はＰＡＤＲＥＴＭペプチド（エピミューン・インク（Epimmune Inc.）、サンディエゴ、ＣＡ）などの普遍性ヘルパーエピトープを含む（参照例：Alexander et al., J.Immunol. 2000 164(3)：1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 及び Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92）。代替方法は１５８Ｐ１Ｄ７免疫原に対し個体に免疫応答を生じさせることからなるが、該方法は個体身体の筋肉又は皮膚に、１５８Ｐ１Ｄ７免疫原をコード化するＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ分子をインビボ投与することによる；該ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の発現を制御する調節配列に有効に結合している；ＤＮＡ分子が細胞に取り込まれると、そのＤＮＡ配列は細胞内で発現し、該免疫原に対して免疫応答を生じる（参照例：米国特許５,９６２,４２８）。選択肢として、遺伝子ワクチン促進因子、例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；及び尿素なども投与する。
核酸ワクチン
本発明のワクチン組成物は核酸仲介様式のものである。本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ又はＲＮＡを患者に投与し得る。遺伝子免疫化法は、１５８Ｐ１Ｄ７発現癌細胞に対して予防的又は治療的体液性及び細胞性免疫応答を生じさせるために採用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質／免疫原及び適切な調節配列をコード化するＤＮＡを含んでなる構築物は、個体の筋肉又は皮膚に直接注射することができ、その結果、筋肉又は皮膚の細胞は該構築物を取り込み、コード化された１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を含んでなる。１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質免疫原の発現は、結果として１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を含有する細胞に対して予防的又は治療的体液性及び細胞性免疫を生じさせる。技術上既知の予防的及び治療的遺伝子免疫化法が使用し得る（概説については、インターネットアドレス URL: genweb.com で公開されている情報及び文献参照）。核酸に基づく送達については、文献に記載されている（例えば、Wolff et al., Science 247:1465 (1990) 並びに、米国特許５,５８０,８５９；５,５８９,４６６；５,８０４,５６６；５,７３９,１１８；５,７３６,５２４；５,６７９,６４７；国際特許出願ＷＯ９８／０４７２０）。ＤＮＡに基づく送達法の例は、「裸のＤＮＡ」促進化（ブピビカイン、ポリマー、ペプチド仲介）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子仲介（「遺伝子銃」）又は圧力仲介送達（参照例：ＵＳＰ５,９２２,６８７）を含む。
治療又は予防的な免疫化を目的に、本発明のタンパク質はウイルス又はバクテリアベクター経由で発現させ得る。本発明の実施に使用し得る種々のウイルス遺伝子送達系は、制限されるものではないが、ワクチニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、及びシンドビスウイルスを含む（参照例：Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)）。非ウイルス送達系を採用し、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコード化する裸のＤＮＡを患者に（例えば、筋肉内又は皮内に）導入し、抗腫瘍応答を誘導することもできる。
ワクチニアウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用する。宿主への導入により、組換えワクチニアウイルスは免疫原性ペプチドのタンパク質を発現し、それによって宿主の免疫応答を引き出す。免疫化プロトコールに有用なワクチニアベクター及び方法は、米国特許４,７２２,８４８に記載されている。もう一つのベクターはＢＣＧ（Bacille Calmette Guerin）である。ＢＣＧベクターは文献（Stover et al., Nature 351:456-460 (1991)）に記載がある。本発明ペプチドの治療目的投与又は免疫化に有用な、多様な他のベクター、例えば、アデノ及びアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、サルモネラ・ティフィ・ベクター、解毒化炭疽菌毒素ベクターなどは、本明細書の記載から、当業者に明らかであろう。
従って、遺伝子送達系は１５８Ｐ１Ｄ７関連核酸分子の送達に使用する。一態様においては、全長ヒト１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡを採用する。もう一つの態様においては、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び／又は抗体エピトープをコード化する１５８Ｐ１Ｄ７核酸分子を採用する。
エキソビボ（生体外）・ワクチン
免疫応答を生成させるために、種々のエキソビボ（生体外）戦略も採用し得る。一つの方法は、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用して、患者の免疫系に１５８Ｐ１Ｄ７抗原を提示することである。樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、Ｂ７共刺激因子、及びＩＬ−１２を発現するので、高度特殊化抗原提示細胞である。膀胱癌では、ＭＡＧＥ−３抗原のペプチドでパルスした自己樹状細胞が、膀胱癌患者の免疫系を刺激するために、第Ｉ相臨床試験にて使用されている（Nishiyama et al., 2001, Clin Cancer Res. 7(1):23-31）。従って、樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の環境下で、１５８Ｐ１Ｄ７ペプチドをＴ細胞に提示するために使用する。一態様において、自己樹状細胞はＭＨＣクラスＩ及び／又はＩＩ分子に結合し得る１５８Ｐ１Ｄ７ペプチドでパルスする。もう一つの態様において、樹状細胞は完全１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質にてパルスする。さらにもう一つの態様は、技術上既知の、アデノウイルス（Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25）、レトロウイルス（Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770）、レンチウイルス，アデノ関連ウイルス、ＤＮＡ形質移入（Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869）、又は腫瘍由来ＲＮＡ形質移入（Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182）など、種々の手段のベクターを使用し、樹状細胞中で１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子が過剰発現するように設計することからなる。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞は、ＧＭ−ＣＳＦなど、免疫モジュレーターを発現するように設計し、免疫化剤としても使用し得る。
Ｘ.Ｂ．）抗体に基づく治療の標的としての１５８Ｐ１Ｄ７
１５８Ｐ１Ｄ７は、抗体に基づく治療戦略にとって魅力的な標的である。細胞外及び細胞内分子双方を標的とする多数の抗体戦略が、技術上既知である（参照例：補体及びＡＤＣＣ仲介死滅並びに細胞内発現抗体の使用）。１５８Ｐ１Ｄ７は、対応する正常細胞に比較した場合、種々系統の癌細胞により発現されるので、全身投与用の１５８Ｐ１Ｄ７免疫反応組成物は、それが非標的臓器と組織に結合に起因する毒性の非特異的及び／又は非標的作用無しに優れた感受性を示すように調製する。１５８Ｐ１Ｄ７のドメインと特異的に反応する抗体は、毒素又は治療剤との抱合体として、又は、細胞増殖又は機能を阻害し得る裸の抗体として、１５８Ｐ１Ｄ７発現癌を全身的に治療するために有用である。
１５８Ｐ１Ｄ７抗体は患者に導入し、該抗体が１５８Ｐ１Ｄ７に結合して、結合パートナーとの相互作用などの機能を調節するようにする；その結果、腫瘍細胞の分解を仲介し、及び／又は腫瘍細胞の増殖を阻害する。かかる抗体が治療効果を発揮するメカニズムは、補体仲介の細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞毒性、１５８Ｐ１Ｄ７の生理的機能の調節、リガンド結合若しくはシグナル伝達経路の阻害、腫瘍細胞分化の調節、腫瘍血管形成因子プロフィールの変更、及び／又はアポトーシスなどである。
当業者が理解するように、抗体は図２又は図３に示す１５８Ｐ１Ｄ７配列の免疫原領域などの免疫原分子を特異的に標的とし、それに結合するように使用し得る。加えて、当業者は、抗体を細胞毒性剤に抱合させることが常套的であることを理解している（参照例；Slevers et al. Blood 93:11 3678-3884 (June 1, 1999)）。細胞傷害性製剤及び／又は治療剤を直接細胞に送達する場合（例えば、該細胞が発現する分子（例：１５８Ｐ１Ｄ７）に特異的な抗体にそれらを抱合させる）、細胞傷害性剤はそれらの細胞上で、その既知の生物学的作用（例えば、細胞毒性）を発揮する。
細胞を死滅させる抗体−細胞傷害性剤抱合体を用いる多様な組成物と方法が、技術上既知である。癌の場合、代表的な方法では、細胞表面上で発現するか、結合に接近し得るか、又は局在するマーカー（例：１５８Ｐ１Ｄ７）と結合する標的化剤（例：抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体）と結合した、選択した細胞傷害性剤及び／又は治療剤を含んでなる生物学的有効量の抱合体を、腫瘍をもつ動物に投与することが必要である。代表的な態様は、細胞傷害性剤及び／又は治療剤を１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞に送達する方法である；該方法は１５８Ｐ１Ｄ７エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性剤を抱合させ、次いで抗体−傷害性剤抱合体に該細胞を接触させることからなる。もう一つの例示となる態様は、転移癌に罹患している疑いのある個体の治療方法であって、当該個体に治療有効量の細胞傷害性剤及び／又は治療剤に抱合した抗体を含んでなる医薬組成物を投与する工程からなる。
抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を用いる癌免疫療法は、他の型の癌の治療に成功裏に採用されている種々の方法に従って実施し得る；他の型の癌とは、限定されるものではないが、結腸癌（Arien et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138）、多発性骨髄腫（Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444）、胃癌（Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776）、Ｂ細胞リンパ腫（Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101）、白血病（Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589）、結腸直腸癌（Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403）、及び乳癌（Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127）を含む。一部の治療方法では裸の抗体を毒素に抱合すること、例えば、Ｙ９１又はＩ１３１と抗ＣＤ２０抗体（例：ゼバリンＴＭ（Zevalin）、ＩＤＥＣファーマシューティカルズ・コープ、又は、ベクサーＴＭ（Bexxar）、クールター・ファーマシューティカルズ）との抱合であり、一方、他の場合には、抗体と他の治療剤、例えば、ハーセプチンＴＭ（Herceptin）（トラスツズマブ（trastuzumab））とパクリタクセル（paclitaxel）(ジェネンテック・インク）、とを同時に投与することからなる。膀胱癌の治療には、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７抗体を放射線照射、化学療法又はホルモン切除などと連携して投与することができる。
１５８Ｐ１Ｄ７抗体療法は癌のすべての段階で有用であるが、抗体療法は進行癌又は転移癌に特に適切である。本発明の抗体療法での治療は、１回以上の化学療法を受けたことのある患者に対して必要である。あるいは、本発明の抗体療法は化学療法治療を受けたことのない患者に対して、化学療法又は放射線療法と組合わせる。さらに、抗体療法は、特に化学療法剤の毒性によく耐え切れない患者にとって、同時に実施する化学療法の用量を低下させて使用することを可能とする。
癌患者は１５８Ｐ１Ｄ７発現の存在及びレベルについて、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学評価、定量的１５８Ｐ１Ｄ７画像化、又は１５８Ｐ１Ｄ７発現の存在及び程度を信頼し得るものとして示すその他の技法により評価し得る。腫瘍生検又は手術標本についての免疫組織化学分析は、この目的に好適である。腫瘍組織の免疫組織化学分析方法は技術上周知である。
膀胱癌及びその他の癌を治療する抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体は、腫瘍又は直接細胞毒性であるものに対し強力な免疫応答を引き起こす抗体である。この観点で、抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体仲介又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）メカニズムにより腫瘍細胞溶解を引き起こす；両メカニズムは補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、免疫グロブリン分子の未処理Ｆｃ部分を必要とする。加えて、腫瘍増殖に直接の生物学的影響を及ぼす抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂは、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の治療に有用である。直接に細胞傷害性ｍＡｂが作用するメカニズムは以下のとおりである：細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管形成因子プロフィールの調節、及びアポトーシスの誘導。特定の抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂが抗腫瘍作用を発揮するメカニズムは、技術上一般に知られるように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体仲介細胞溶解などの細胞死を評価するいくつかのインビトロアッセイを用いて評価する。
一部患者において、マウス又は他の非ヒトモノクローナル抗体、又はヒト／マウスキメラｍＡｂを使用することは、非ヒト抗体に対する穏和ないし強力な免疫応答を誘導し得る。これは循環系からの抗体のクリアランスと効力の低下に至る。最も深刻な場合、かかる免疫応答は大量の免疫複合体の形成に導き、それが潜在的に腎不全の原因となる。従って、本発明の治療法に使用される好適なモノクローナル抗体は、完全なヒトの、又はヒト化した抗体であり、標的の１５８Ｐ１Ｄ７抗原に高い親和性で特異的に結合するが、患者での抗原性は示さないか、又は低い抗体である。
本発明の治療方法では、単一の抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂ並びに異なるｍＡｂの組合せ、又はカクテルの投与を期待する。かかるｍＡｂカクテルは、それらが異なるエピトープを標的とするか、異なるエフェクターメカニズムを活用するか、又は細胞毒性ｍＡｂと免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂとを直接組合わせたものである限り、確実な進歩性を有し得る。加えて、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂは他の治療様式、例えば、限定されるものではないが、種々の化学療法剤、アンドロゲン遮断剤、免疫調節剤（例：ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術又は放射線照射などと同時に投与し得る。抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂはそれらの「裸の」又は非抱合の形状で投与するか、又はそれらに抱合させた治療剤を有し得る。
抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の製剤は、該抗体を腫瘍細胞に送達し得る何れかの経路によって投与する。投与経路は、制限されるものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などである。治療は一般に静脈内投与（ＩＶ）などの許容し得る投与経路を経て、典型的には約０.１ないし１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体製剤を繰返し投与することからなる。一般に、１週間あたりｍＡｂ１０〜５００ｍｇの範囲の用量が有効であり、また十分に寛容である。
転移乳癌の治療におけるハーセプチン（Herceptin）ｍＡｂでの臨床試験に基づくと、当初の負荷用量が約４ｍｇ／ｋｇ（患者体重）静注、次いで週用量約２ｍｇ／ｋｇ静注の抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂ製剤が、許容し得る用量投与計画の代表である。好ましくは、初期負荷用量を９０分以上の点滴として投与する。断続的維持用量は、初期用量が十分に寛容である場合に、３０分以上の点滴として投与する。当業者が認めるように、特定の事例では、様々な因子が理想的な用量投与計画に影響し得る。かかる因子とは、例えば、使用したＡｂ又はｍＡｂの結合親和性及び半減期、患者における１５８Ｐ１Ｄ７発現の程度、遊離する１５８Ｐ１Ｄ７抗原の循環の範囲、所望の恒常状態抗体濃度レベル、治療の頻度、及び本発明治療方法と組合わせて使用する化学療法剤又はその他の物質の影響、並びに特定患者の健康状態である。
選択肢として、最も有効な投与計画などの決定に役立てるために、所定のサンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７レベル（例：循環する１５８Ｐ１Ｄ７抗原及び／又は１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞のレベル）について患者を評価すべきである。かかる評価はまた治療全般のモニターの目的にも使用され、他のパラメータ（例えば、尿細胞診断及び／又は膀胱癌治療における免疫Ｃｙｔレベル、又は類推による前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）の評価と組合わせて、治療の成功を正確に測定するために有用である。
抗イディオタイプ抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、抗癌治療において、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を発現する細胞に免疫応答を誘発するワクチンとして有用である。特に、抗イディオタイプ抗体の生成は、技術上周知である；この方法論は１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を生成するために、容易に適合させることができる（参照例：Wagner et al., 1997, Hybridoma 16:33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76）。かかる抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチン戦略に使用することができる。
Ｘ.Ｃ．）細胞性免疫応答の標的としての１５８Ｐ１Ｄ７
本明細書に記載した１種以上のＨＬＡ結合ペプチドの免疫原としての有効量を含むワクチン及びワクチンの調製法は、本発明のさらなる態様である。さらに、本発明によるワクチンは、請求項記載の１種以上のペプチドからなる組成物を包含する。ペプチドは個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、該ペプチドは同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、又は、種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは免疫反応を増大させる利点を有し、また、ポリマー作製のために異なるエピトープが使用される場合、病原性生物体の異なる抗原決定基と、又は免疫応答を目標とする腫瘍関連ペプチドと反応する抗体及び／又はＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。その構成成分は天然起源の抗原でもよく、又は、例えば、組換えにより若しくは化学合成により調製してもよい。
本発明のワクチンとともに使用し得る担体は、技術上周知のものであり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風菌毒素、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などである。該ワクチンは生理学的に耐性を示す（すなわち、許容し得る）希釈剤、例えば、水又は食塩水、好ましくはリン酸緩衝食塩水を含み得る。該ワクチンは一般的にアジュバントを含む。技術上周知のアジュバントの例は、不完全フロイントのアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はアルムなどの物質である。さらに、本明細書に開示するように、ＣＴＬ応答は本発明のペプチドを、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの脂質に抱合させることにより、あらかじめ刺激することができる。さらに、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、ＣＴＬ応答を１０倍ないし１００倍増大させることが見出されている（参照例：Davila and Cells, J. Immunol. 165:539-547 (2000)）。
本発明によれば、注射、エーロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内、又はその他の適当な経路を経由するペプチド組成物による免疫化により、宿主の免疫系は所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬ及び／又はＨＴＬを生産することにより、該ワクチンに応答する。その結果、宿主は１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現若しくは過剰発現する細胞のその後の成長に、少なくとも部分的に免疫状態となるか、又は該抗原が腫瘍関連であった場合には、少なくともある種の治療上の利益を誘導する。
一部の態様において望ましいことは、クラスＩペプチド成分と、標的抗原に対する抗体及び／又はヘルパーＴ細胞応答の中和を誘発又は促進する成分とを組合わせることである。かかる組成物の好適な態様は、本発明によるクラスＩ及びクラスＩＩエピトープを包含する。かかる構成成分の別の態様は、本発明によるクラスＩ及び／又はクラスＩＩエピトープを、ＰＡＤＲＥＴＭ（エピインミューン（Epimmune）、サンディエゴ、ＣＡ）分子などの交差反応性ＨＴＬエピトープとともに包含する（例えば、米国特許５,７３６,１４２に記載）。
本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示する媒体として、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）をも含み得る。ワクチン組成物は樹状細胞の可動化と採取に続き、インビトロで創生可能であり、それによって樹状細胞の負荷がインビトロで生じる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明によるミニ遺伝子により形質移入するか、又はペプチドでパルスする。樹状細胞は次いで患者に投与し、インビボでの免疫応答を引き出すことができる。ワクチン組成物は、ＤＮＡに基づくものでも、ペプチドに基づくものであっても、樹状細胞可動化と組合わせてインビボでも投与し得るが、それによって樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
ワクチンに使用するポリエピトープ構成成分に包含させるための一連のエピトープを選択する場合、あるいはワクチンに包含させるべき及び／又はミニ遺伝子などの核酸がコード化するべき不連続のエピトープを選択する場合、好ましくは以下の原則を利用する。以下のそれぞれの原則は、選択を実施するために均衡させることが好ましい。所定のワクチン組成物に包含させるべき複数のエピトープは、必ずしもその必要はないが、該エピトープを誘導する元の抗原の配列に相接することがある。
１.）エピトープは、投与したときに、腫瘍クリアランスと相関することが観察されている免疫応答に類似するものを選択する。ＨＬＡクラスＩについて、このものは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩの場合、同様の理論的解釈を採用する；再び、３〜４個のエピトープが少なくとも１つのＴＡＡから選択される（参照例：Rosenberg et al., Science 278:1447-1450）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組合わせて使用し、しばしば発現されるＴＡＡの多様な発現パターンをもつ腫瘍を標的とするワクチンを製造することができる。
２.）免疫原性と相関することの証明された、必要な結合親和性をもつエピトープを選択する；ＨＬＡクラスＩについては、ＩＣ５０が５００ｎＭ以下、多くの場合、２００ｎＭ以下；また、クラスＩＩについては、ＩＣ５０が１０００ｎＭ以下。
３.）十分なスーパーモチーフ含有ペプチド、又は、十分な一連のアレル特異的モチーフ含有ペプチドは、広範な集団を範囲に含むように選択する。例えば、少なくとも８０％の集団を範囲に含むことが好ましい。モンテカルロ分析は技術上既知の統計評価手段であるが、これを採用して集団範囲の幅又は重複性を評価することができる。
４.）癌関連抗原からエピトープを選択する場合、患者は元のエピトープに耐性を生じている可能性があるので、類似体を選択するのがしばしば有用である。
５.）特に関連性のあるのは、「ネステッドエピトープ」といわれるエピトープである。ネステッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重なり合う場合に生じる。ネステッドペプチド配列は、Ｂ細胞、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネステッドエピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列あたりの最大多数のエピトープを提供することである。従って、一側面では、ペプチドのアミノ末端エピトープのアミノ端末よりも長く、またカルボキシル末端エピトープのカルボキシル端末よりも長いペプチドを提供することは避けることである。ネステッドエピトープを含んでなる配列など、複数エピトープの配列を提供する場合、一般的に重要なことは、それが病理学的又は他の有害な生物学的性質をもたないことを保証するために、その配列をスクリーニングにかけることである。
６.）もしポリエピトープタンパク質が創生されているならば、又はミニ遺伝子を創製する場合、目標は対象のエピトープを包含する最小のペプチドを生成させることである。たとえ、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択する場合に採用されるものと同じでなくとも、この原則は同じである。しかし、人工的ポリエピトープペプチドの場合、サイズ最小化の目標は、ポリエピトープタンパク質内のエピトープ間のスペーサー配列を組み込む必要性に対して均衡する。スペーサーアミノ酸配列は、例えば、連結部エピトープ（免疫系が認識するが、標的抗原には存在せず、またエピトープの人工並置によってのみ創生されるエピトープ）を回避するか、又は、エピトープ間の切断を促進するように導入し、それによってエピトープの提示を強めることができる。連結部エピトープは一般には回避すべきである；その理由は、非先天性のエピトープに対し、受容者が免疫応答を生じる可能性があるからである。特に関心のあるのは、「優性エピトープ」である連結部エピトープである。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少するか又は抑制されるような強力な応答へ導く。
７.）同じ標的タンパク質の複数変異体の配列が存在する場合、強力なペプチドエピトープがその保存性に基づき選択され得る。例えば、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの全配列が、又は、クラスＩＩ結合ペプチドの全９マーコアが、特定タンパク質抗原について評価した配列の規定パーセンテージに保存されていることと定義し得る。
Ｘ.Ｃ.１．ミニ遺伝子ワクチン
複数エピトープの同時送達を可能とする多くの異なる方法が利用可能である。本発明のペプチドをコード化する核酸は、特に有用な本発明の態様である。ミニ遺伝子に包含されるエピトープは、前のセクションで述べたガイドラインに従って、好適に選択される。本発明のペプチドをコード化する核酸を投与する好適な手段では、本発明の１個又は複数のエピトープを含んでなるペプチドをコード化するミニ遺伝子構築物を使用する。
複数エピトープミニ遺伝子の使用については、以下の文献に記載されている；Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L and Whitton, J.L., J. Virol. 71:2292 1997; Thomson, S.A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J.L., et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７から誘導されるスーパーモチーフ−及び／又はモチーフ−含有エピトープ、ＰＡＤＲＥ（登録商標）普遍ヘルパーＴ細胞エピトープ（又は１５８Ｐ１Ｄ７からの多重ＨＴＬエピトープ）及び小胞体位置転移シグナル配列をコード化する複数エピトープＤＮＡプラスミドを設計することができる。ワクチンは他のＴＡＡから誘導されるエピトープを含んでいてもよい。
複数エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験するエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためのトランスジェニックマウスにて確認し得る。さらに、ＤＮＡ‐コード化エピトープのインビボ免疫原性は、ＤＮＡプラスミドで形質移入した標的細胞に対する特異的ＣＴＬ株のインビトロ応答と相関させることができる。従って、これらの実験では、ミニ遺伝子が以下の両方に働くことを示し得る； １）ＣＴＬ応答を生じること、また、２）誘発されたＣＴＬが、コード化されたエピトープを発現する細胞を認識すること。
例えば、ヒト細胞での発現のために選択したエピトープ（ミニ遺伝子）をコード化するＤＮＡ配列を創製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳することができる。ヒトコドン用法の表を利用し、各アミノ酸に対するコドン選択を進めることができる。これらのエピトープコード化ＤＮＡ配列は直接隣接させることができ、その結果、翻訳に際し、連続するポリペプチド配列を創出する。発現及び／又は免疫原性を最適化させるために、ミニ遺伝子の設計にさらなる要素を取り込ませることができる。逆翻訳が可能で、ミニ遺伝子配列に包含させ得るアミノ酸配列の例は；ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、及び／又は小胞体標的化シグナルである。加えて、ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬ又はＨＴＬエピトープに隣接して、合成（例：ポリ−アラニン）又は天然フランキング配列を含ませることにより改善し得る；該エピトープを含んでなるこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス及びマイナス鎖をコード化するオリゴヌクレオチドを組み上げることにより、ＤＮＡに変換することができる。オーバーラップしたオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知の技法を用い、適切な条件下で合成し、リン酸化し、精製し、そしてアニールすることができる。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることができる。該エピトープポリペプチドをコード化するこの合成ミニ遺伝子は、次いで所望の発現ベクターにクローン化することができる。
当業者周知の標準的調節配列は、標的細胞中での発現を確かなものとするために、好ましくはベクターに含める。数種のベクター要素が望ましい：ミニ遺伝子挿入用の下流クローニング部位をもつプロモーター；効果的な転写終結用のポリアデニル化シグナル；大腸菌起源の複製；及び大腸菌選択可能マーカー（例：アンピシリン又はカナマイシン耐性）。数種のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターがこの目的のために使用し得る。参照例：他の適切なプロモーター配列について米国特許５,５８０,８５９及び５,５８９,４６６。
ミニ遺伝子の発現と免疫原性を最適化するためには、さらなるベクターの修飾が望まれる。一部の事例においては、効率的な遺伝子発現のために、イントロンが必要であり、１種以上の合成又は天然のイントロンをミニ遺伝子の転写領域に取り込ませ得る。ｍＲＮＡ安定化配列及び哺乳動物細胞中の複製用配列を含有させることが、ミニ遺伝子発現増大のためにも考え得る。
発現ベクターを選択した後、ミニ遺伝子をプロモーター下流のポリリンカー領域にクローン化する。このプラスミドを適切な大腸菌株に形質転換し、標準的技法を用いてＤＮＡを調製する。ミニ遺伝子の方向及びＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる他のすべての要素を、制限マッピング及びＤＮＡ配列分析により確認する。正しいプラスミドを取り込むバクテリア細胞は、マスター細胞バンク及び作業用細胞バンクとして保存し得る。
加えて、免疫刺激性配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすと思われる。これらの配列は、免疫原性を上昇させたい場合、ミニ遺伝子コーディング配列の外側でベクターに含ませ得る。
一部の態様においては、ミニ遺伝子コード化エピトープと第二のタンパク質（免疫原性を上昇させるか、又は低下させるために入れる）両方の産生を可能とするバイシストロン発現ベクターを使用することができる。免疫応答を有益に上昇させ得るタンパク質又はポリペプチドの例は、もし同時に発現されるとするなら、サイトカイン（例：ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例：ＬｅＩＦ）、同時刺激性分子、又はＨＴＬ応答の場合の、パン−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、エピインミューン（Epimmune）、サンディエゴ、ＣＡ）である。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは細胞内標的化シグナルに結合可能であり、発現したＣＴＬエピトープとは別に発現される；このことはＨＴＬエピトープがＣＴＬエピトープの区画とは異なる細胞の区画に向かうことを可能とする。要すれば、このことはＨＴＬエピトープが、ＨＬＡクラスＩＩ経路により効率的な侵入を促進し、それによってＨＴＬの誘発を改善する。ＨＴＬ又はＣＴＬの誘発に対して、免疫抑制分子（例：ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に低下させることは、ある種疾患において有益であり得る。
治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、大腸菌における発酵と、引き続く精製により製造し得る。作業用細胞バンクからの一部を用いて増殖培地に播種し、周知の技法に従ってシェーカーフラスコ又はバイオリアクターにて飽和状態まで増殖させる。プラスミドＤＮＡは標準的バイオ分離技法、例えば、キアゲン・インク（QIAGEN, Inc.）(バレンシア、カリフォルニア)が供給する固相アニオン交換樹脂などにより精製し得る。要すれば、ゲル電気泳動又は他の方法により、開環状及び線状形状からスーパーコイルＤＮＡを単離し得る。
精製したプラスミドＤＮＡは、様々の剤形を用いて注射用に調製し得る。これらの内、最も簡単なのは、凍結乾燥したＤＮＡを無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再構成することである。「裸のＤＮＡ」として知られるこの方法は、現在、臨床治験において、筋肉内（ＩＭ）投与用に使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫療法効果を最大とするために、精製したプラスミドＤＮＡの別の製剤化方法が望まれる。様々な方法が記載されており、新しい技法が利用可能となる可能性がある。カチオン性脂質、糖脂質、及び融合性リポソームが、製剤化にも使用し得る（参照例：国際特許出願ＷＯ９３／２４６４０；Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6(7):682 (1988); 米国特許５,２７９,８３３；国際特許出願ＷＯ９１／０６３０９；及び、 Felgner, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987) に記載）。加えて、予防、相互作用、非縮合化合物（ＰＩＮＣ）のような集合的な属性を有するペプチド及び化合物は、精製したプラスミドＤＮＡと複合体を形成し、安定性、筋肉内分散性、又は特定の臓器若しくは細胞型への輸送などの変数に影響する可能性がある。
標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード化‐ＣＴＬエピトープの発現とＨＬＡクラスＩ提示の機能的アッセイとして使用し得る。例えば、プラスミドＤＮＡを、標準的ＣＴＬクロム放出アッセイの標的として適当な哺乳動物細胞株に導入する。使用する形質導入法は最終の製剤化に左右されるだろう。エレクトロポレーションを「裸の」ＤＮＡについて使用し得る一方で、カチオン性脂質はインビトロでの直接形質導入を可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時形質導入して、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による形質導入細胞の濃縮化を可能とする。次いでこれらの細胞をクロム５１（５１Ｃｒ）標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ株の標的細胞として使用する；５１Ｃｒの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子コード化‐ＣＴＬエピトープの産生とＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するアッセイ法を用いて、同様の方法で評価し得る。
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤を機能的に試験する第二の方法である。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物で免疫化する。投与量及び投与経路は剤形による（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体ＤＮＡについては腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫化の２１日後、膵細胞を採取し、試験する各エピトープをコード化するペプチドの存在下に、１週間再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準法により、ペプチド負荷、５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コード化エピトープに相当するペプチドエピトープを負荷したＨＬＡにより感作した標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導について、ＤＮＡワクチンの機能を証明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、同様の方法でトランスジェニックマウスにて確認する。
あるいは、該核酸は文献（例えば、米国特許５,２０４,２５３）に記載された射出送達法により投与し得る。この技法を用いて、ＤＮＡのみを含んでなる粒子を投与する。さらなる別の態様において、ＤＮＡは金粒子などの粒子に付着させることができる。
ミニ遺伝子はまた、技術上周知の、他のバクテリア又はウイルス送達系を用いて、送達することもできる；例えば、本発明のエピトープをコード化する発現構築物を、ワクチニアなどのウイルスベクターに取り込ませることもできる。
Ｘ.Ｃ.２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
本発明のＣＴＬペプチドを含んでなるワクチン組成物は、修飾、例えば、同族化し、改善された血清半減期、拡大した母集団範囲、又は上昇した免疫原性など、所望の性質を提供し得る。
例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１個のエピトープを含む配列に、該ペプチドを連結することにより増強し得る。ＣＴＬペプチドはＴヘルパーペプチドに直接結合させ得るが、多くの場合、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ抱合体は、スペーサー分子により連結する。該スペーサーは一般に、生理的条件下に実質的に荷電しない、比較的小さな中性分子、例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体などからなる。該スペーサーは一般に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はその他の非極性アミノ酸又は中性極性アミノ酸の中性スペーサーから選択される。理解されることは、任意に存在するスペーサーが同じ残基で構成される必要はなく、従って、ヘテロ−又はホモ−オリゴマーであり得る。スペーサーが存在する場合、そのスペーサーは通常少なくとも１個又は２個の残基、より一般的には３個ないし６個の残基、場合によっては１０個以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、Ｔヘルパーペプチドエピトープに直接つながるか、又はＣＴＬペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のスペーサーを介してつながり得る。免疫原性ペプチド又はＴヘルパーペプチド何れものアミノ末端はアシル化し得る。
ある一定の態様において、Ｔヘルパーペプチドは遺伝的に多様な集団の大多数に存在するＴヘルパー細胞が認識するペプチドである。これはＨＬＡクラスＩＩ分子の多数、大部分又は全部に結合するペプチドを選択することにより実施し得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するかかるアミノ酸の例は、破傷風毒素の位置８３０〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ；配列番号：２４）、熱帯熱マラリア原虫サーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の位置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ；配列番号：２５）、及び連鎖球菌１８ｋＤタンパク質の位置１１６〜１３１（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ；配列番号：２６）などの抗原からの配列である。その他の例としては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフを含有するペプチド又はＤＲ３モチーフの何れかを含む。
あるいは、自然界には見出されていないアミノ酸配列を用い、厳密ではないＨＬＡ制限様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（参照例：ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７）。パン−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥＴＭ、エピインミューン・インク（Epimmune Inc.）、サンディエゴ、ＣＡ）と呼称されるこれら合成化合物は、殆どのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好適に結合するように設計する。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号：２７）（式中、「Ｘ」はシクロへキシルアラニン、フェニルアラニン、又はチロシンの何れかであり、ａはＤ−アラニン又はＬ−アラニンの何れかである）を有するパン−ＤＲ−結合エピトープペプチドは、ＨＬＡタイプに関係なく、殆どのＨＬＡ−ＤＲアレルに結合し、殆どの個体からのＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが判明している。パン−ＤＲ−結合エピトープの代替物は、すべての「Ｌ」天然アミノ酸を含んでなり、該エピトープをコード化する核酸の形状で提供し得る。
ＨＴＬペプチドエピトープも修飾して、その生物学的性質を変えることができる。例えば、それらはＤ−アミノ酸を含むように修飾して、プロテアーゼに対する抵抗性を増し、その血清半減期を延長することが可能であり、又は、それらは脂質、タンパク質、炭水化物などの他の分子に抱合させて、その生物学的活性を上昇させることができる。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ又はカルボキシ末端の何れかで、１個以上のパルミチン酸鎖に抱合させることができる。
Ｘ.Ｃ.３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合わせ
一部態様においては、Ｂリンパ球又はＴリンパ球を初回感作する少なくとも１種の成分を本発明の医薬組成物に含めることが望ましい。脂質はＣＴＬをインビボで感作し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のε−及びα−アミノ基に付着させ、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの１個以上の連結残基を介して、免疫原ペプチドに連結し得る。次いで、リピド化ペプチドをミセル又は粒子に直接処理し、リポソームに取り込ませるか又はアジュバント例えば不完全フロイントアジュバントに乳化することができる。好適な態様において、特に有効な免疫原構成成分は、Ｌｙｓのε−及びα−アミノ基に付着させたパルミチン酸を含んでなり、これがＳｅｒ−Ｓｅｒなどの結合を介して、免疫原ペプチドのアミノ末端に付着する。
ＣＴＬ応答の脂質感作のもう一つの例として、トリパルミトル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌リポタンパク質は、適切なペプチドに共有結合で付着している場合、ウイルス特異的ＣＴＬを初回感作するために使用し得る（参照例：Deres, et al., Nature 342: 561, 1989）。本発明のペプチドは、Ｐ３ＣＳＳ、例えば、及び、標的抗原へ特異的な免疫応答を刺激するために個体に投与されるリポペプチドに、結合させることができる。さらに、Ｐ３ＣＳＳ結合エピトープによって中和抗体の誘導も刺激されるので、２つのかかる構成成分は体液性及び細胞仲介応答をより効果的に引き出すために組合わせることができる。
Ｘ.Ｃ.４．ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含んでなるワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物の態様は、患者血液からのＰＢＭＣへ、又はそこから単離されたＤＣへ、エピトープ含有ペプチドのカクテルを生体外で（ex vivo）投与することからなる。ＤＣの採取を容易にする医薬、例えば、プロゲニポイエチン（ProgenipoietinTM）（ファルマシア−モンサント、セントルイス、ＭＯ）又はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４などを使用し得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、また患者への再導入に先立ち、ＤＣは洗浄して非結合ペプチドを除く。この態様において、ワクチンは表面上にＨＬＡ分子と複合体形成したパルスペプチドエピトープを提示する、ペプチドパルス‐ＤＣを含んでなる。
ＤＣを、ペプチドカクテルにより生体外でパルスすることができ、その一部が１５８Ｐ１Ｄ７に対するＣＴＬ応答を刺激する。選択肢として、天然又は人工のゆるやかに制限されたＨＬＡクラスＩＩペプチドなどのヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチドを包含させて、ＣＴＬ応答を促進することができる。従って、本発明によるワクチンは１５８Ｐ１Ｄ７を発現又は過剰発現する癌の治療に使用する。
Ｘ.Ｄ．養子免疫治療
抗原性１５８Ｐ１Ｄ７関連ペプチドを使用して、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を生体外で同様に引き出す。得られるＣＴＬ又はＨＴＬ細胞は、他の通常形態の療法に反応しない患者の腫瘍、又は本発明による治療用ワクチンペプチド又は核酸に反応しそうにない患者の腫瘍の治療に使用し得る。特定の抗原に対する生体外ＣＴＬ又はＨＴＬ応答は、組織培養において、患者の又は遺伝学的に矛盾のないＣＴＬ又はＨＴＬ前駆体細胞を、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）供給源及び適切な免疫原ペプチドとともにインキュベートすることにより誘導する。適切なインキュベーション時間（典型的には凡そ７〜２８日）（この間、該前駆体細胞が活性化され、エフェクター細胞へと発展する）の後、細胞を点滴で患者に戻す；その際、該細胞は特定の標的細胞（例：腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、又は破壊を促進（ＨＴＬ）する。形質導入された樹状細胞はまた、抗原提示細胞としても使用し得る。
Ｘ.Ｅ．治療又は予防を目的とするワクチンの投与
本発明の医薬組成物及びワクチン組成物は、代表的には１５８Ｐ１Ｄ７を発現又は過剰発現する癌の治療及び／又は予防に使用する。治療適用において、ペプチド及び／又は核酸組成物は、抗原に対し有効なＢ細胞、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を引き出すために、また症候及び／又は合併症を治癒するか、又は少なくとも阻止するか、又は減速するために十分な量、患者に投与する。これを実施するために適切な量は、「治療有効量」と定義する。この用途に有効な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与様式、治療する疾患の段階及び重篤度、患者の体重と全身の健康状態、及び処方医師の判断による。
医薬組成物として、本発明の免疫原性ペプチド、又はそれらをコード化するＤＮＡは、一般に１５８Ｐ１Ｄ７を発現する腫瘍をすでに有する個体に投与する。該ペプチド又はそれらをコード化するＤＮＡは、単独で、又は１種以上のペプチド配列の融合物として投与し得る。患者は免疫原ペプチドにより単独で、又は適切な場合には、その他の治療、例えば、手術などとともに治療され得る。
治療での使用では、投与は一般に１５８Ｐ１Ｄ７関連癌の最初の診断時に開始すべきである。この後、少なくとも症候が実質的に消滅するまで、その後の一定期間、ブースター投与を続ける。患者に送達するワクチン組成物の態様（すなわち、限定されるものではないが、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、又はＴＡＡ特異的ＣＴＬ又はパルスされた樹状細胞などの態様）は、疾患の段階又は患者の健康状態により変わり得る。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する腫瘍をもつ患者において、１５８Ｐ１Ｄ７特異的ＣＴＬを含んでなるワクチンは、進行した疾患の患者の腫瘍細胞を死滅させるのに、別の態様よりもより有効であり得る。
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するような投与様式によって、一定量のペプチドエピトープが送達されることが、一般には重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物は、本発明の態様に従って与えることもできる。
治療免疫開始時の投与量は、低値が凡そ１、５、５０、５００又は１,０００μｇであり、高値が凡そ１０,０００、２０,０００、３０,０００又は５０,０００μｇの単位投与量の範囲にある。ヒトの投与量値は一般に７０キログラムの患者あたり、凡そ５００μｇないし凡そ５０,０００μｇの範囲である。数週間ないし数ヶ月にわたるブースト投与計画に従って、凡そ１.０μｇないし凡そ５０,０００μｇのブースト投与量を、患者の血液から得たＣＴＬ及びＨＴＬの特異活性の測定よって判定した患者の応答及び症状に基づいて、投与し得る。投与は、少なくとも臨床症候又は実験室でのテストにより、その後の期間、異常増殖が除去されるか又は減少していることを示すまで継続すべきである。投与量、投与経路、及び投与計画は、技術上既知の方法に従って調整する。
一定の態様において、本発明のペプチド及び組成物は、深刻な疾病状態、すなわち、生命危機状態又は潜在的な生命の危機状況において採用される。かかる事例において、本発明の好適な組成物中の外来性物質の量が最少であることと、ペプチドの性質が比較的非毒性であることの結果として、ここに示した投与量に比較して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、治療する医師にとっても望ましいと思われる。
本発明のワクチン組成物は、純然たる予防薬としても使用し得る。一般に、当初の予防的免疫化の投与量は、低値が凡そ１、５、５０、５００又は１,０００μｇであり、高値が凡そ１０,０００、２０,０００、３０,０００又は５０,０００μｇの単位投与量の範囲にある。ヒトの投与量値は一般に７０キログラムの患者あたり、凡そ５００μｇないし凡そ５０,０００μｇの範囲である。これに続き、ペプチド凡そ１.０μｇないし凡そ５０,０００μｇのブースト投与量を、最初のワクチン投与後４週間ないし６ヶ月の所定の間隔で投与する。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得たＣＴＬ及びＨＴＬの特異的活性を測定することにより評価することができる。
治療処置用の医薬組成物は、非経口、外用、経口、経鼻、鞘内、又は局所（例；クリーム又は局所軟膏として）投与用を意図する。好ましくは、該医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内に投与する。従って、本発明は、許容し得る担体、好ましくは水性担体に溶解又は懸濁した免疫原ペプチドの溶液からなる非経口用組成物を提供する。
様々な水性担体を使用し得る；例えば、水、緩衝水、０.８％食塩水、０.３％グリシン、ヒアルロン酸などである。これらの組成物は常套の、周知の無菌化法により無菌化するか、又は無菌濾過することができる。得られる水溶液はそのまま使用するようにパッケージに詰めるか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥品は投与前に無菌溶液と組み合わせる。
該組成物は生理的条件に近づけることが必要な場合、医薬的に許容し得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤、保存剤などを含み得る；例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどである。
該医薬組成物中の本発明ペプチドの濃度は、広範に変化し得る；すなわち、重量で凡そ０.１％未満から通常は凡そ２％、又は少なくとも凡そ２％ないし２０％から５０％、又はそれ以上であり、選択した特定の投与様式に従い、液量、粘稠性などにより最初に選択する。
ペプチド組成物のヒトの単位投与形状は、典型的には、許容し得る担体、好ましくは水性担体のヒト単位用量を含んでなる医薬組成物中に含まれ、当業者周知のヒトにかかる組成物を投与するために使用する液量で、投与する（参照例：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985）。
本発明のタンパク質及び／又は該タンパク質をコード化する核酸は、リポソームを介して投与することもできる；リポソームは：１）タンパク質をリンパ組織など特定の組織に目標を定めること；２）疾患細胞に選択的に目標を定めること；又は、３）ペプチド組成物の半減期を延ばすこと；などのためにも働く。リポソームはエマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散、ラメラ層などである。これらの製剤において、送達すべきペプチドはリポソームの一部として、単独で、又はＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体など、リンパ細胞に存在するレセプターに結合する分子とともに、又は他の治療若しくは免疫原組成物とともに取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドが満たされているか又は修飾されているリポソームは、リンパ細胞の当該部位に向かい、そこでリポソームはペプチド組成物を送達する。本発明により使用するリポソームは、標準の小胞形成脂質から形成され、それが一般的には中性及び負に荷電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は一般的には、例えば、リポソームのサイズ、酸に対する不安定性及び血流中での安定性を考慮して導かれる。様々な方法がリポソーム調製のために利用可能であり、例えば、文献（Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)；及び、米国特許４,２３５,８７１；４,５０１,７２８；４,８３７,０２８；及び５,０１９,３６９）に記載されている。
免疫系の細胞を標的とするために、リポソームに取り込むべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体又はそのフラグメントでもよい。ペプチド含有リポソーム懸濁液は、用量を、特にその投与様式、送達するペプチド、及び治療すべき疾患の段階に応じて変化させ、静脈内、局所的、外用的に投与し得る。
固形の組成物では、常套の非毒性固体担体が使用可能であり、例えば、医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。経口投与では、医薬的に許容し得る非毒性組成物は、すでに一覧掲載した担体などの通常使用される賦形剤の何れか、及び、一般的には１０〜９５％の濃度の有効成分すなわち１種以上の本発明ペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で取り込ませることにより形成する。
スプレーによる投与の場合、免疫原ペプチドは、好ましくは微細に分割した形状で、界面活性剤及び噴射剤とともに供給する。ペプチドの典型的パーセントは凡そ０.０１〜２０重量％、好ましくは凡そ１％〜１０％である。界面活性剤は勿論、非毒性でなければならず、また噴射剤に可溶でなければならない。かかる試薬の代表例は、炭素原子凡そ６個ないし２２個を含む脂肪酸のエステル又は部分エステルであり、カプロン酸、オクタン酸、タウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸、リノレイン酸、オレステリン酸、及びオレイン酸などと、脂肪族多価アルコールとのエステル、又はその環状無水物である。混合若しくは天然グリセリドなどの混合エステルも採用し得る。界面活性剤は組成物の凡そ０.１〜２０重量％、好ましくは凡そ０.２５〜５％を構成し得る。該組成物のバランスは通常噴射剤である。担体も望ましい場合含有し得るが、例えば、鼻腔内送達の場合レシチンである。
ＸＩ．１５８Ｐ１Ｄ７の診断及び予測の態様
本明細書に開示するように、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、反応性ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）及び抗ポリペプチド抗体は、癌、特に表１に掲載した癌などの制御不全細胞増殖と関連する症状を試験する周知の診断、予測及び治療アッセイにおいて使用する（参照例：組織発現のその特異的パターン、並びに、例えば、実施例４に記載した特定の癌でのその過剰発現の両方）。
１５８Ｐ１Ｄ７は、イムノＣｙｔＴＭと呼称される診断キットに代表される膀胱関連抗原の組み合わせであるムチン及びＣＥＡと、類似の方法、又は、それを補足するものとして使用し得る。イムノＣｙｔは膀胱癌の存在を同定及びモニターする市販品として入手し得るアッセイである（参照：Fradet et al., 1997, Can J Urol, 4(3):400-405）。他の様々な診断マーカー、ｐ５３及びＨ−ｒａｓもまた同様の状況で有用である（参照例：Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 and Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000; 24(1):1-12）。従って、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドプローブ及び抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体）及びその性質についての本開示は、例えば、癌関連症状を試験することを目的とする様々な診断アッセイに使用する方法と同様の方法において、当業者がこれらの分子を利用することを可能にする。
１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を利用する診断方法の典型的態様は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ポリペプチド、反応性Ｔ細胞及び抗体を採用するよく確立された診断アッセイの方法と同様である。例えば、丁度、ＰＳＡポリヌクレオチドがプローブ（例えば、ノーザン分析；参照例：Sharief et al., Biochem Mol. Biol. Int. 33(3):567-74 (1994)）及びプライマー（例えば、ＰＣＲ分析；参照例：Okegawa et al., J. Urol. 163(4):1189-1190 (2000)）として、ＰＳＡ過剰発現又は前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ ｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを観察するために使用するように、本明細書に記載した１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７過剰発現又は１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を発現する膀胱細胞の腫瘍転移及びその他の癌細胞を検出するために利用し得る。あるいは、ＰＳＡポリペプチドがＰＳＡタンパク質の過剰発現（参照例：Stephen et al., Urology 55(4):560-3 (2000)）又は前立腺細胞の転移（参照例：Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在及び／又はレベルを観察するために使用し得るＰＳＡ特異的抗体を生成させるのに使用するように、本明細書に記載した１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドは、１５８Ｐ１Ｄ７の過剰発現又はこの遺伝子を発現する膀胱細胞の腫瘍転移及びその他の癌の転移を検出するために利用し得る。
具体的には、転移が、起源となった臓器（肺又は膀胱など）から身体の異なる領域（リンパ節など）への癌細胞の移動を伴っているので、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現する細胞の存在について、生体サンプルを試験するアッセイを用いて、転移の証拠を提供することができる。例えば、通常１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞を含まない組織（リンパ節）からの生体サンプルが、ＬＡＰＣ４及びＬＡＰＣ９、リンパ節から分離した異種移植片及び骨転移でそれぞれに見られる１５８Ｐ１Ｄ７発現など、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞を含むと判明した場合、この知見は転移を物語っている。
別法として、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを使用して、癌の証拠を提供することができる；例えば、通常、１５８Ｐ１Ｄ７を発現しないか、又は異なったレベルで１５８Ｐ１Ｄ７を発現する生体サンプルが、１５８Ｐ１Ｄ７を発現するか、又は１５８Ｐ１Ｄ７の発現が増加している（参照例：表１に掲載した癌及び添付の図に示した患者サンプルなどにおける１５８Ｐ１Ｄ７の発現）場合である。かかるアッセイにおいて、熟練した技術者は（１５８Ｐ１Ｄ７に加えて）さらに第二の制限マーカー、例えば、イムノＣｙｔＴＭ、ＰＳＣＡなど（参照例：Fraded et al., 1997, Can J Urol, 4(3):400-405; Amara et al., 2001, Cancer Res 61:4660-4665）の存在について、生体サンプルをテストすることにより、転移の補足的証拠を生み出そうとする。丁度、当業者がＰＳＡのモニター方法に使用するために、ＰＳＡポリヌクレオチドフラグメント及びポリヌクレオチド変異体を採用するように、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドフラグメント及びポリヌクレオチド変異体を同様の方法に使用する。特に、ＰＳＡのモニター法に使用する典型的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブ又はプライマーである。これを説明すると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用するプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応にて機能するために、全長ＰＳＡ配列よりも短いものでなければならない。かかるＰＣＲ反応の環境下、当業者は一般に、対象ポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するか、又は増幅反応を最適化するために、プライマーとして使用し得る多様なポリヌクレオチドフラグメントを創出する（参照例：Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3):472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)）。かかるフラグメント使用のさらなる説明は、実施例４に提供してあるが、そこでは１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドフラグメントをプローブとして使用し、癌細胞における１５８Ｐ１Ｄ７ ＲＮＡの発現を示している。加えて、変異体ポリヌクレオチド配列は、一般にＰＣＲ及びノーザン分析において相当するｍＲＮＡのプライマー及びプローブとして使用される（参照例：Sawai et al., Fetal Diagn, Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 及び Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995）。ポリヌクレオチドフラグメント及び変異体は、それらが高ストリンジェントな条件下に、標的ポリヌクレオチド配列（例：図２に示す１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド）に結合し得るものである環境下で有用である。
さらに、抗体又はＴ細胞が認識し、特異的に結合し得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドは、ＰＳＡのモニター方法に使用する。１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドフラグメント及びポリペプチド類似体又は変異体も同様の方法で使用し得る。抗体（抗ＰＳＡ抗体又はＴ細胞など）を生成させるために、ポリペプチドフラグメント又はポリペプチド変異体を使用する実験は、技術的に一般的であり、実験者が使用している融合タンパク質など、多様な系がある（参照例；Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995）。これに関連して、各エピトープは抗体又はＴ細胞が反応性である構造を提供するように機能する。典型的例として、当業者は対象のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生じさせるために使用し得る多様なポリペプチドフラグメントを創出する（参照例：米国特許５，８４０，５０１及び５,９３９,５３３）。例えば、本明細書にて考察した１５８Ｐ１Ｄ７の生物学的モチーフの一つを含む、又は、技術的に利用可能なモチーフに基づき当業者によって容易に同定されるモチーフ含有配列を含む、ポリペプチドを利用するのが好適である。ポリペプチドフラグメント、変異体又は類似体は、それらが標的のポリペプチド配列（例：図２に示す１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチド）に特異的な抗体又はＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限り、この状況で一般に有用である。
本明細書に示すように、１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びポリペプチド（並びにこれらの分子の存在を同定するために使用する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドプローブ及び抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体又はＴ細胞）は、表１に掲載した癌などを診断する際にそれらを有用とする特別の性質を示す。本明細書に記載する膀胱癌などの病状の存在又は発病を評価するための、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、前立腺癌のモニターがＰＳＡにより成功裏に実施されているのと同様、予防的測定又はさらなるモニター用として、患者の確認に使用する。１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの物質（並びにこれらの分子の存在の確認に使用する１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドプローブ及び抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体）は、膀胱癌の状況下、ＰＳＡに類似の又は補足的特性をもつ分子について、技術上の必要性を満足する。最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加え、本明細書に記載の１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドは、多くの他の用途、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子がマップされている染色体領域における発癌遺伝子関連染色体異常の同定における用途などを有する（下記実施例３参照）。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書に開示した１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及びポリヌクレオチドは、未知起源組織の法医学的分析における使用など、他の用途を有する（参照例：Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28:80(1-2):63-9）。
さらに、本発明の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又はポリヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７の過剰発現を特徴とする病的症状を治療するために使用し得る。例えば、図２又は図３のアミノ酸又は核酸配列は、何れも１５８Ｐ１Ｄ７抗原に対し、免疫応答を生じさせるために使用し得る。１５８Ｐ１Ｄ７と反応する抗体又はその他の分子は、この分子の機能を調節するために使用し得るが、それによって治療上の利益を提供する。
ＸＩＩ．）１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質機能の阻害
本発明は、１５８Ｐ１Ｄ７とその結合パートナーとの結合又は１５８Ｐ１Ｄ７とその他のタンパク質とのその会合を阻害する種々の方法及び組成物、並びに、１５８Ｐ１Ｄ７の機能を阻害する方法を包含する。
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体による１５８Ｐ１Ｄ７の阻害
一方法においては、１５８Ｐ１Ｄ７に特異的に結合する一本鎖抗体をコード化する組み換えベクターを、遺伝子導入技術によって、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞に導入する。従って、コード化された一本鎖抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は細胞内で発現され、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と結合し、それによって１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の機能を阻害する。かかる細胞内一本鎖抗体の設計方法は周知である。かかる細胞内の抗体は「細胞内発現抗体（intrabody）」としても知られ、細胞内の特定の区画を特異的に標的化し、処置の抑制的活性の焦点となる部位を制御する。
この技法は技術的に成功裏に適用されている（参照概説：Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol.13）。細胞内発現抗体は、別の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（参照例：Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1:332-337）。
一本鎖抗体は、柔軟な（flexible）リンカーポリペプチドによって結合する重鎖と軽鎖の可変領域を含んでなり、単一のポリペプチドとして発現される。選択肢として、一本鎖抗体は、軽鎖定常領域と結合する一本鎖可変領域フラグメントとして発現される。
所望の細胞内区画に対し細胞内発現抗体が正確に標的化するように、周知の細胞内トラフィッキングシグナルを、かかる一本鎖抗体をコード化する組み換えポリヌクレオチドベクターに組み込む。
例えば、小胞体（ＥＲ）を標的とする細胞内発現抗体は、リーダーペプチド、及び選択肢としてＫＤＥＬアミノ酸モチーフなどのＣ末端ＥＲ残留シグナルを組込むように設計する。核内で活性を発揮するように意図した細胞内発現抗体は、核局在化シグナルを含むように設計する。原形質膜の細胞質ゾル側に細胞内発現抗体を繋ぎ止めるために、脂質部分を細胞内発現抗体に結合する。細胞内発現抗体はまた、細胞質ゾル内で機能を発揮するために標的となり得る。例えば、細胞質ゾル‐細胞内発現抗体を、因子を細胞質ゾル内に取り込むために使用し、それによって該因子が本来の細胞内目的地に輸送されるのを防ぐ。
一態様において、細胞内発現抗体を、核内で１５８Ｐ１Ｄ７を捕捉するために使用し、それによって核内での１５８Ｐ１Ｄ７の活性を防止する。所望の標的化を達成するために、核標的シグナルをかかる１５８Ｐ１Ｄ７細胞内発現抗体に組み込む。かかる１５８Ｐ１Ｄ７細胞内発現抗体は、特定の１５８Ｐ１Ｄ７ドメインと特異的に結合するように設計する。もう一つの態様において、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と特異的に結合する細胞質ゾル‐細胞内発現抗体を、１５８Ｐ１Ｄ７の核への接近を阻害するのに使用し、それによって、１５８Ｐ１Ｄ７が核内で生物活性を働かせるのを阻害する（例えば、１５８Ｐ１Ｄ７が他の因子と転写複合体を形成するのを阻害する）。
特定の細胞でのかかる細胞内発現抗体の発現を特異的に指向するため、細胞内発現抗体の転写を、適切な腫瘍特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの調節制御下に置く。膀胱に特異的に細胞内発現抗体の発現を標的化するために、例えば、ＰＳＣＡプロモーター及び／又はプロモーター／エンハンサーを利用することができる（参照例：米国特許５,９１９,６５２（１９９９年７月６日発行）；及び、 Lin et al., PNAS, USA 92(3):679-683 (1995)）。
ＸＩＩ．Ｂ．）組み換えタンパク質による１５８Ｐ１Ｄ７の阻害
もう一つの方法においては、組み換え分子が１５８Ｐ１Ｄ７に結合し、それによって１５８Ｐ１Ｄ７の機能を阻害する。例えば、これらの組み換え分子は、１５８Ｐ１Ｄ７がその結合パートナーに接近／結合すること、又は、その他のタンパク質と会合することを防止若しくは阻害する。かかる組み換え分子は、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の態様において、１５８Ｐ１Ｄ７結合パートナーの１５８Ｐ１Ｄ７結合ドメインが、二量体融合タンパク質に組み込まれるが、その場合の融合タンパク質はヒトＩｇＧ１などのヒトＩｇＧのＦｃ部分と結合する２つの１５８Ｐ１Ｄ７リガンド結合ドメインを含んでなる。
かかるＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。かかる二量体融合タンパク質は、１５８Ｐ１Ｄ７の発現と関連する癌に罹患している患者に、可溶性形状で投与する；その場合、当該二量体融合タンパク質は１５８Ｐ１Ｄ７に特異的に結合し、結合パートナーとの１５８Ｐ１Ｄ７相互作用を遮断する。かかる二量体融合タンパク質は、さらに、既知の抗体結合法により多量体タンパク質と組み合わせる。
ＸＩＩ.Ｃ．）１５８Ｐ１Ｄ７の転写又は翻訳の阻害
本発明はまた、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の転写を阻害する種々の方法及び組成物をも包含する。同様に、本発明はまた、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する方法及び組成物をも提供する。
一つの方法において、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の転写を阻害する方法は、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることからなる。もう一つの方法において、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡとアンチセンスポリヌクレオチドとを接触させることからなる。もう一つの方法においては、１５８Ｐ１Ｄ７特異的リボザイムを用いて１５８Ｐ１Ｄ７メッセージを切断し、それによって翻訳を阻害する。かかるアンチセンス及びリボザイムに基づく方法は、１５８Ｐ１Ｄ７プロモーター及び／又はエンハンサー要素など、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の調節領域にも向けることができる。同様に、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質を、１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用する。上記の方法に有用な種々のポリヌクレオチド及び組成物については、上に記載した。転写及び翻訳を阻害するアンチセンス及びリボザイム分子の使用は、技術上周知である。
１５８Ｐ１Ｄ７の転写活性化に干渉することにより１５８Ｐ１Ｄ７の転写を阻害するその他の因子もまた、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の治療に有用でもある。同様に、１５８Ｐ１Ｄ７のプロセシングに干渉する因子は、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の治療に有用である。かかる因子を利用する癌治療方法もまた、本発明の範囲内である。
ＸＩＩ.Ｄ．）治療戦略の一般的考察
遺伝子導入及び遺伝子治療法の技術を、治療用のポリヌクレオチド分子を、１５８Ｐ１Ｄ７を合成する腫瘍細胞に送達するために使用する（すなわち、アンチセンス、リボザイム、細胞内発現抗体及び他の１５８Ｐ１Ｄ７阻害分子をコード化するポリヌクレオチド）。多くの遺伝子治療法が技術上既知である。１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンスポリヌクレオチドをコード化する組み換えベクター、リボザイム、１５８Ｐ１Ｄ７転写に干渉し得る因子などを、かかる遺伝子治療法を利用することにより標的腫瘍細胞に送達し得る。
上記の治療方法を、様々の外科手術、化学療法又は放射線療法プログラムの何れか一つと組み合わせ得る。本発明の治療方法では、化学療法（又は他の療法）での投与量を減量すること及び／又は投与回数を減ずることなどが可能となり、すべての患者にとって、特に化学療法剤の毒性への耐性が弱い患者にとって有利である。
特定の構成成分（例えば、アンチセンス、リボザイム、細胞内発現抗体）又はかかる成分の組み合わせの抗腫瘍活性は、種々のインビトロ及びインビボのアッセイ系を用いて評価し得る。治療活性を評価するインビトロアッセイは、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイ及び腫瘍増進活性を示すその他のアッセイ、及び、治療組成物が１５８Ｐ１Ｄ７の結合パートナーとの結合をどの程度阻害するかを判定し得る結合アッセイ、などである。
１５８Ｐ１Ｄ７治療用組成物のインビボ作用は、適当な動物モデルで評価し得る。例えば、異種間の膀胱癌モデルを使用し得るが、この場合、ヒトの膀胱癌植片片又は継代異種移植組織を、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入する（Shibayama et al., 1991, J Urol., 146(4):1136-7; Beechen et al., 2000, Urology, 56(3):521-526）。腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮又は転移などの阻害を測定するアッセイを用い、有効性を予測し得る。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイは、治療用組成物の評価に有用である。一態様において、治療用組成物で処置した腫瘍保持マウスからの異種移植片を、アポトーシス巣の存在について試験し、異種移植片を有する未処置のマウスと比較し得る。処置マウスの腫瘍において、どの程度のアポトーシスが見出されるか、それが該組成物の治療有効性の指標を提供する。
前記方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適する担体を含んでなる医薬組成物に製剤化することができる。適切な担体は、治療用組成物と組み合わせた場合に治療用組成物の抗腫瘍機能を維持し、かつ、患者の免疫系と一般的に非反応性である物質を包含する。例示としては、限定されるものではないが、多くの標準的医薬用担体、例えば、無菌リン酸緩衝塩溶液、静菌的な水などの何れかである（一般的参照例：Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980）。
治療用製剤は、可溶化され、腫瘍部位に治療用構成成分を送達し得る任意の経路を介して投与し得る。可能性のある有効な投与経路は、限定されるものではないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、正所性（orthotopic）などである。静脈注射用の好適な剤形は、保存性の静菌的な水、無菌非保存水の溶液とした治療用組成物、及び／又は、注射用の塩化ポリビニル又はポリエチレンバッグに入った０.９％無菌塩化ナトリウム中で希釈された治療用組成物（ＵＳＰ）、を含む。
治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥し、無菌粉末として、好ましくは真空下に置き、次いで注射に先立ち、静菌的な水（例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む）又は無菌水中にて再構成され得る。
上記方法による癌治療のための投与量と投与プロトコールは、その方法と標的となる癌により変わり、一般には技術上認められているその他の多くの因子に左右される。
ＸＩＩＩ.）１５８Ｐ１Ｄ７モジュレーターの同定、特徴付け、及び、使用
モジュレーターの同定法と使用法
一態様においては、スクリーニングを、特定の発現プロフィールを誘発又は抑制し、特定の経路、抑制又は誘発するモジュレーター（好ましくはそれによって関連表現型が生成される）を同定するために、実施する。もう一つの態様においては、特定の状況にて重要な示差的（differentially）に発現された遺伝子を同定する；個別遺伝子の発現の増加又は減少の何れかを変化させるモジュレーターを同定するためにスクリーニングを実施する。もう一つの態様において、スクリーニングを、示差的（differentially）に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変化させるモジュレーターを同定するために実施する。さらにまた、特定の状況における遺伝子の重要性を確認し、スクリーニングを、遺伝子産物に結合及び／又はその生物学的活性を調節する物質を同定するために実施する。
加えて、候補物質に応答して誘導される遺伝子について、スクリーニングを実施する。モジュレーター（癌発現パターンを抑制し、正常発現パターンに導くモジュレーター、又は正常組織におけると同様の遺伝子発現に導く癌遺伝子のモジュレーター）を同定した後、該物質に応答して特異的に調節される遺伝子を同定するためにスクリーニングを実施する。正常組織と物質で処理された癌組織間の発現プロフィールを比較することで、正常組織又は癌組織では発現されないが、物質処理組織では発現されるか、又はその逆の場合の遺伝子が明らかとなる。これらの物質特異的な配列を同定し、癌遺伝子又はタンパク質のための本明細書に記載の方法に使用する。特に、これらの配列及びこれらがコード化するタンパク質を用いて、物質を処理された細胞を作成又は同定する。加えて、該物質で誘発されたタンパク質に対する抗体を作成し、治療された癌組織サンプルに対する新規の治療法を目指すために使用する。
モジュレーター関連同定とスクリーニングアッセイ：
遺伝子発現関連アッセイ
本発明のタンパク質、核酸、及び抗体をスクリーニングアッセイに使用する。癌関連タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質及びこれらの配列を含む細胞はスクリーニングアッセイに使用し、例えば、「遺伝子発現プロフィール」、ポリペプチドの発現プロフィール又は生化学的機能の変化などに対する薬物候補の作用を評価する。一態様において、発現プロフィールは、好ましくは、候補物質で処理した後の遺伝子の発現プロフィールのモニターを可能とするハイスループットスクリーニング法とともに使用する（例：Davis, GF, et al., J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik et al., Science 279:84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986-94, 1996）。
癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質及び未改変の、又は改変した癌タンパク質又は遺伝子を含む細胞は、スクリーニングアッセイに使用する。すなわち、本発明は本発明の癌表現型又は癌タンパク質の生理的機能を調節する組成成分のスクリーニング法を含んでなる。この方法は遺伝子そのものについて実施するか、又は「遺伝子発現プロフィール」又は生物学的機能に対する薬物候補の効果を評価することにより実施する。一態様において、発現プロフィールは、好ましくは、候補物質で処理した後のモニターを可能とするハイスループットスクリーニング法とともに使用する（上記、Zlokarmik）。
様々のアッセイが本発明の遺伝子及びタンパク質を対象に実施される。アッセイは個々の核酸又はタンパク質レベルに関し実施する。すなわち、癌により上方制御された特定の遺伝子を同定し、遺伝子発現を調節する能力について、又は本発明の癌タンパク質に対する結合について、テスト化合物をスクリーニングする。この状況での「調節」は遺伝子発現の増加又は低下を意味する。調節の好適な量は、正常組織における遺伝子発現の当初の変化と、対する癌罹患組織における変化に左右されるが、少なくとも１０％の変化、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、そしてある態様では３００〜１０００％以上の変化である。従って、もし遺伝子が正常組織に比べて癌組織で４倍の増加を示すならば、凡そ４倍の低下が多くの場合望ましい；同様に、正常組織に比べて癌組織で１０倍減少しているなら、テスト化合物による発現が１０倍増加した値を目標とすることが、多くの場合望ましい。癌に見られる遺伝子発現型を悪化させるモジュレーターは、例えば、さらなる分析における上方制御標的としても有用である。
遺伝子発現量は核酸プローブを用いてモニターし、遺伝子発現レベルの定量、又は二者択一として、遺伝子産物それ自体を、例えば、癌タンパク質に対する抗体及び標準的イムノアッセイ法の使用を介してモニターする。プロテオミクス及び分離方法もまた発現の定量を可能とする。
遺伝子発現を修飾する化合物を同定するための発現モニタリング
一態様において、遺伝子発現モニタリング、すなわち、発現プロフィールは、多くの実体と同時にモニターする。かかるプロフィールは、典型的には図２の１種以上の遺伝子に関わる。この態様において、例えば、癌核酸プローブはバイオチップに付着させ、特定細胞中の癌配列を検出し、定量する。あるいは、ＰＣＲを使用し得る。従って、一系列の、例えば、マイクロタイタープレートのウエルを用い、所望のウエルにプライマーを分配する。次いでＰＣＲ反応を実施し、各ウエルについて分析する。
発現モニタリングは、１種以上の癌関連配列、例えば、図２に示すポリヌクレオチド配列の発現を修飾する化合物を同定するために実施する。一般に、分析に先立ち、細胞にテストモジュレーターを加える。さらに、癌を調節するか、本発明の癌タンパク質を調節するか、本発明の癌タンパク質に結合するか、又は本発明の癌タンパク質及び抗体又は他の結合パートナーの結合に干渉する物質を同定するためのスクリーニング法も提供される。
一態様において、ハイスループットスクリーニング法は、膨大な数の可能性のある治療用化合物（候補化合物）を含むライブラリを提供することと関わる。かかる「コンビナトリアルケミカルライブラリ」を次いで、所望の特徴的活性を示すこれらのライブラリメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定するための１種以上のアッセイ法でスクリーニングする。このように同定した化合物は、スクリーニング用の化合物としての、又は治療薬としての簡便な「リード化合物」として役立ち得る。
ある態様において、有力なモジュレーターのコンビナトリアルライブラリは、癌ポリペプチドに結合するか、又は活性を調節する能力についてスクリーニングする。簡便には、有用な性質を有する新規化学因子は、ある種所望の性質又は活性（例：阻害活性）を有する化学物質（「リード化合物」と呼称）を同定し、リード化合物の変種を創製し、そしてこれら変種化合物の性質と活性を評価することにより生成させる。多くの場合、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法はかかる分析のために採用する。
上記のように、遺伝子発現モニターリングは候補モジュレーター（例：タンパク質、核酸又は小分子）を試験するために、簡便に使用する。候補物質を加え、細胞をある期間インキュベートした後、分析すべき標的配列を含むサンプルは、例えば、バイオチップに加える。
要すれば、標的配列は既知の技法を用いて調製する。例えば、サンプルは既知溶解バッファー、エレクトロポレーションなどにより細胞を処理溶解し、適切であれば精製及び／又はＰＣＲなどの増幅を実施する。例えば、ヌクレオチドに共有結合付着させた標識によるインビトロ転写を実施する。一般に、核酸は、ビオチン−ＦＩＴＣ又はＰＥで、又はｃｙ３又はｃｙ５で標識する。
標的配列は、例えば、蛍光、化学発光、化学的、又は放射活性シグナルにより標識し、プローブに対する標的配列特異的結合を検出する手段を提供することができる。標識はまた適切な基質を供給したときに、検出可能な産物を生じるアルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素でもよい。あるいは、標識は標識化合物であるか、又は酵素インヒビターなどの小分子であって、結合はするが、酵素が触媒作用を及ぼすことも、変化させることもない分子である。標識はまたエピトープタグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンなどの部分又は化合物でもよい。ビオチンの例では、ストレプトアビジンを上記のように標識し、それによって結合した標的配列に検出可能なシグナルを提供する。非結合標識ストレプトアビジンは、一般に分析の前に除去する。
当業者も承知するように、これらのアッセイ法は直接のハイブリダイゼーションアッセイであるか、又は複数のプローブを使用する「サンドイッチアッセイ」でもよい；その概要は米国特許に記載がある：ＵＳＰ５,６８１,７０２；５,５９７,９０９；５,５４５,７３０；５,５９４,１１７：５,５９１,５８４；５,５７１,６７０；５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,６２４,８０２；５,６３５,３５２；５,５９４,１１８；５,３５９,１００；５,１２４,２４６；及び５,６８１,６９７。この態様において、一般に、標的の核酸は上記のように調製し、ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とする条件下に、複数の核酸プローブからなるバイオチップに加える。
本発明では上に概説した高、中及び低ストリンジェントな条件など、様々なハイブリダイゼーション条件を使用する。該アッセイは一般に、標的の存在下でのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェンシーの程度は熱力学的変数であるステップパラメーター、例えば、限定されるものではないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などを変えることにより制御し得る。これらのパラメーターは、米国特許５,６８１,６９７に概説されているように、非特異的結合を制御するためにも使用し得る。従って、非特異的結合を低減するためには、より高いストリンジェントな条件であるステップを実施することが望ましい。
本明細書に概略した反応は様々な方法で遂行し得る。反応成分は、同時に、又は順序だてて、異なる順序で添加し得るが、下記に示すのが好適な態様である。加えて、反応は多様な他の試薬を含み得る。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などであり、最適のハイブリダイゼーション及び検出を促進し、及び／又は非特異的又はバックグランド相互作用を減少させるために使用し得るものである。アッセイの効率を他の状態でも改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などは、サンプル調製法と標的の純度により、適切な場合に使用してもよい。アッセイデータを分析し、個々の遺伝子の発現レベルと、状態間での発現レベルの変化を決定して、遺伝子発現プロフィールを作成する。
生物活性関連アッセイ
本発明は、本発明の癌関連遺伝子又はタンパク質の活性を調節する化合物の同定方法又はスクリーニング方法を提供する。該方法は上記定義のように、本発明の癌タンパク質を含んでなる細胞にテスト化合物を加えることからなる。該細胞は本発明の癌タンパク質をコード化する組み換え核酸を含有する。もう一つの態様において、候補物質のライブラリを複数の細胞について試験する。
一側面において、該アッセイ法は生理的シグナル、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤などの薬理物質、放射線照射、発癌剤、又は他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）の存在下若しくは不存在下又は事前若しくは事後の接触により評価する。もう一つの例において、判定は細胞周期過程の異なる段階でなされる。この方式で、本発明の遺伝子又はタンパク質を調節する化合物を同定する。薬理活性をもつ化合物は本発明の癌タンパク質の活性を上昇させるか、又は活性に干渉し得る。同定後、同様の構造を評価し、化合物の必須の構造的特長を同定する。
一態様において提供される癌細胞の分裂を調節（例えば、阻害）する方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。もう一つの態様において提供される癌を調節（例えば、阻害）する方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。さらなる態様において提供される癌細胞又は癌を有する個体の治療方法は、癌モジュレーターを投与することからなる方法である。
一態様においては、本発明の遺伝子を発現する細胞の状態を調節する方法が提供される。本明細書にて使用する場合、状態とは技術上受け容れられているパラメーター、例えば、細胞の成長、増殖、生存、機能、アポトーシス、老化、局在、酵素活性、シグナル伝達などを意味する。一態様において、癌インヒビターは上記考察の抗体である。もう一つの態様において、癌インヒビターはアンチセンス分子である。本明細書に記載したように、様々の細胞成長、増殖、及び転移アッセイ法が当業者に既知である。
モジュレーター同定のためのハイスループットスクリーニング
適切なモジュレーターを同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れられる。好適なアッセイ法は、従って、癌遺伝子転写の上昇又は阻害、ポリペプチド発現の阻害又は上昇、及びポリペプチド活性の阻害又は上昇を検出することである。
一態様において、ハイスループットスクリーニング法により評価されたモジュレーターは、タンパク質であり、多くの場合、天然型タンパク質又は天然型タンパク質のフラグメントである。従って、例えば、タンパク質含有細胞性抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物の無作為若しくは企図した消化物を使用する。タンパク質ライブラリはこの方式で本発明方法においてスクリーニングする。この態様において特に好適なのは、バクテリア、カビ、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリであるが、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。特に有用なテスト化合物は、標的が属するタンパク質の群に、例えば、酵素の基質、又はリガンド及びレセプターなどを指向する。
モジュレーターの同定及び特徴付けにおける軟寒天増殖コロニー形成の使用
正常細胞は付着と増殖のために固体基質を必要とする。細胞を形質転換する場合、細胞はその表現型を失い、基質から切り離されて増殖する。例えば、形質転換細胞は、攪拌懸濁培養において、又は半固体若しくは軟寒天などの半固体培地に懸濁した状態で増殖することが可能である。形質転換細胞は、腫瘍抑制因子遺伝子で形質移入したとき、正常表現型を再生し、再び付着、増殖するための固体基質を必要とする。アッセイにおける軟寒天増殖又はコロニー形成は、癌配列のモジュレーターを同定するために使用するが、宿主細胞で発現された場合、異常細胞増殖及び形質転換を阻害する。モジュレーターは寒天などの固体又は半固体培地に懸濁した宿主細胞の増殖能力を低下させるか、又は除去する。
懸濁アッセイにおける軟寒天増殖又はコロニー形成の技法については、文献に記載がある：Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basich Technique (3rd ed., 1994)。上記文献（Garkavtsev et al. (1996)の方法に関する章）も参照されたい。
モジュレーターの同定と特徴付けのための接触阻害と増殖密度の評価
正常細胞は細胞培養において、一般に他の細胞と接触するまで、平床組織化パターンで増殖する。細胞が互いに触れ合うと、接触を阻害され、増殖を止める。しかし、形質転換細胞は非組織化巣で、接触を阻害されることなく、高密度まで増殖を続ける。従って、形質転換細胞は、対応する正常細胞よりも高飽和密度に増殖する。このことは細胞の無秩序な単層の形成により、又は巣中の細胞により形態的に検出される。別法として、飽和密度での（３Ｈ）チミジンによる標識指数を用いて、増殖の密度限界を測定する；同様に、ＭＴＴ又はアラマー（Alama）ブルーアッセイは、細胞の増殖能力と、それに影響するモジュレーターの能力を明らかにしよう。参照文献：Freshney (1994), supra。形質転換細胞は、腫瘍抑制因子遺伝子で形質転換した場合、正常表現型を再生し、接触が阻害されるようになり、低密度に増殖する。
このアッセイにおいて、飽和密度での（３Ｈ）チミジンによる標識指数は、増殖密度限界を測定する好適な方法である。形質転換宿主細胞は癌関連配列で形質移入し、非限界培地条件下、飽和密度で２４時間増殖する。（３Ｈ）チミジンによる細胞標識化のパーセントは、取り込まれたｃｐｍで判定する。
接触非依存性の増殖は、異常細胞の増殖と形質転換に導いた癌配列のモジュレーターを同定するために使用する。モジュレーターは接触非依存性の増殖を低下させるか、又は除去し、該細胞を正常な表現型に戻す。
モジュレーターの同定と特徴付けのための増殖因子又は血清依存性の評価
形質転換細胞はその正常対照物よりも低い血清依存性を有する（参照例：Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle et al., J. Exp. Med 131:836-879 (1970); Freshney, supra）。これは一部分、形質転換細胞による様々な増殖因子の放出によるものである。形質転換宿主細胞の増殖因子又は血清依存性の度合いは、対照と比較することができる。例えば、細胞の増殖因子又は血清依存性は、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定・特徴付けする方法によりモニターする。
モジュレーターの同定と特徴付けのための腫瘍特異的マーカーレベルの使用
腫瘍細胞は対応する正常細胞よりも増加した量のある種因子（以下「腫瘍特異的マーカー」）を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）は、ヒトのグリオーマから、正常の脳細胞からよりも高いレベルで放出される（参照例：Guillino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth (脈管形成、腫瘍血管形成、及び腫瘍増殖の潜在的干渉), in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)。同様に、腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）は、腫瘍細胞において対応する正常細胞よりも高レベルで放出される。参照例：Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992); 一方、ｂＦＧＦは内皮腫瘍から放出される（Ensoli, B et al）。
これらの因子の放出を測定する種々の技法が文献（Freshney, 1994, supra）に記載されている。また、以下の文献も参照されたい：Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Research in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985)。例えば、腫瘍特異的マーカーレベルは、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定し、特徴付けする方法によりモニターする。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのマトリゲルへの侵入
マトリゲル又は細胞外マトリックス成分への侵入の度合いは、癌関連配列を調節する化合物を同定し特徴付けするアッセイとして使用し得る。腫瘍細胞は細胞の悪性度と、マトリゲル又はある種他の細胞外マトリックス成分への侵入との間に、正の相関を示す。このアッセイでは、一般に腫瘍化細胞を宿主細胞として使用する。これらの宿主細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現は、宿主細胞の侵入を低下させよう。文献（Freshney (1994), supra）記載の方法を使用し得る。簡単に説明すると、宿主細胞の侵入レベルは、マトリゲル又はある種細胞外マトリックス成分で被覆したフィルターを用いて測定する。ゲルへの浸透、又はフィルターの端部からの浸透は、侵入度として評価され、組織学的には細胞数と移動距離により、又は細胞の１２５Ｉによる事前標識とフィルター端部若しくはディッシュ底部の放射活性測定により評価する。文献（Freshney (1994), supra）参照。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのインビボ腫瘍増殖の評価
細胞増殖に対する癌関連配列の影響は、トランスジェニック生物又は免疫抑制生物で試験する。トランスジェニック生物は様々な技術的に受け容れられている方法で調製する。例えば、ノックアウトトランスジェニック生物、例えば、マウスなどの哺乳動物は、癌遺伝子が破壊されているか、又は癌遺伝子が挿入されている生物として創出する。ノックアウトトランスジェニックマウスは、マーカー遺伝子又は他の異種遺伝子を、相同組み換えを介してマウスゲノムの内在性癌遺伝子部位に挿入することにより創出する。かかるマウスはまた内在性癌遺伝子を癌遺伝子の突然変異体と置き換えることにより、又は内在性癌遺伝子を、例えば、発癌物質に接触させることによる突然変異により創出し得る。
トランスジェニック・キメラ動物、例えば、マウスを調製するためには、ＤＮＡ構築物を胚幹細胞の核に導入する。新たに設計作製された障害巣をもつ細胞を宿主マウス胚に注射し、それを受容メスに再移植する。これら胚のいくつかは、突然変異細胞株由来の生殖細胞をもつキメラマウスに成長する。それ故、このキメラマウスを飼育することにより、導入した遺伝的障害をもつマウスの新株を得ることが可能である（参照例：Capecchi et al., Science 244:1288 (1989)）。キメラマウスは以下の文献に従い、誘導し得る：米国特許６,３６５,７９７（２００２年４月２日発行）；ＵＳＰ６,１０７,５４０（２０００年８月２２日発行）；Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual（マウス胚の操作；実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 及び Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach（奇形癌腫及び胚幹細胞；実用方法）, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987)。
別法として、種々の免疫抑制又は免疫欠失宿主動物を使用し得る。例えば、遺伝的胸腺欠損「ヌード」マウス（参照例：Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:921 (1974)）、ＳＣＩＤマウス、胸腺切除マウス、又は放射線照射マウス（参照例：Bradley et al., Br. J. Cancer 38:263 (1978); Selby et al., Br. J. Cancer 41:52 (1980)）などが宿主として使用し得る。同質遺伝子的宿主に注射した移植可能な腫瘍細胞（典型的には凡そ１０６細胞）は、高比率の頻度で侵襲性腫瘍を生じるが、一方、同様の起源の正常細胞は生じない。侵襲性腫瘍を成長させた宿主に、癌関連配列を発現する細胞を皮下又は同所的に注射する。次いで、マウスを対照群と処置実験群（例えば、モジュレーターで処理）とを含むグループに分ける。適当な時間、好ましくは４〜８週間、置いた後、腫瘍増殖を測定し（例えば、容積によるか、又はその二次元最大値又は重量による）、対照と比較する。統計的に有意な減少（例えば、スチューデント‐Ｔ検定を使用）を示す腫瘍は、増殖が阻害されたと言われる。
モジュレーターの同定と特徴付けのためのインビトロアッセイ
調節活性を有する化合物の同定アッセイはインビトロで実施し得る。例えば、癌ポリペプチドは先ず可能性のあるモジュレーターと接触させ、適当な時間量、例えば、０.５〜４８時間インキュベートする。一態様において、癌ペプチドレベルはタンパク質又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定する。タンパク質レベルは、癌ポリペプチド又はそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用い、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイにより測定する。ｍＲＮＡの測定には、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲを用いる増幅、又は例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、ドットプロッティングなどのハイブリダイゼーションアッセイが好適である。タンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、直接的又は間接的に標識した検出試薬、例えば、本明細書に記載の蛍光又は放射活性標識した核酸、放射活性又は酵素で標識した抗体などを用いて検出する。
あるいは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、又はＰ‐ｇａｌなどのレポーター遺伝子に操作可能に結合した癌タンパク質プロモーターを用い、レポーター遺伝子系を案出することができる。レポーター構築物は、一般に細胞に形質移入する。可能性のあるモジュレーターで処理した後、レポーター遺伝子転写、翻訳、又は活性の量を、当業者既知の標準的技法に従って測定する（Davis GF, supra; Gonzalez, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechol. 1998: 9:624）。
上に概説したように、インビトロスクリーニングは、個々の遺伝子と遺伝子産物について実施する。すなわち、特定の状態で重要とされる特定の示差的に発現された遺伝子を同定し、該遺伝子の発現又はその遺伝子産物のモジュレーターそのもののスクリーニングを実施する。
一態様において、特別の遺伝子発現のモジュレーターのスクリーニングを実施する。一般に、単一の、又は２〜３の遺伝子の発現を評価する。もう一つの態様において、スクリーニングは示差的に発現されたタンパク質に結合する化合物を先ず見出すように設計する。次いで、これらの化合物について、示差的に発現された活性を調節する能力を評価する。さらに、当初の候補化合物を同定した後、構造活性の関連性をよりよく評価するために、変異体をさらにスクリーニングする。
モジュレーターの同定と特徴付けのための結合アッセイ
本発明による結合アッセイにおいては、本発明の精製又は単離した遺伝子産物を一般に使用する。例えば、抗体は本発明のタンパク質に対して生成させ、イムノアッセイはタンパク質の量及び／又は位置を決定するために実施する。あるいは、癌タンパク質を含んでなる細胞をアッセイで使用する。
従って、該方法は本発明の癌タンパク質とリガンドなどの候補化合物とを組み合わせ、本発明の癌タンパク質に対する化合物の結合を決定することからなる。好適な態様ではヒトの癌タンパク質を利用する；ヒト疾患の動物モデルも開発し、使用し得る。また、他の類似の哺乳動物タンパク質も、当業者が認識するように、使用し得る。さらに、一部態様においては、変異又は誘導癌タンパク質が使用される。
一般に、本発明の癌タンパク質又はリガンドは、不溶性支持体に拡散せずに結合する。該支持体は、例えば、単離したサンプル受容領域をもつものである（マイクロタイタープレート、アレイなど）。不溶性支持体は組成物が結合し得る何らかの構成物で作られたもので、可溶性物質から容易に分離し得るものであり、スクリーニング方法全般と他の面でも両立し得るものである。かかる支持体の表面は固体でも多孔性でもよく、またどのように簡便な形状でもよい。
適当な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズである。これらは代表的に、ガラス、プラスチック（例：ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、又はテフロン（登録商標）などで作製される。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬とサンプルを用いて、膨大な数のアッセイを同時に実施できるので、特に便利である。組成物が支持体に結合する特定の様式は、それが本発明の試薬及び方法全体と両立し、組成物の活性を維持し、拡散性でない限り、決定的なものではない。タンパク質を支持体に結合させる際に好適な結合方法は、リガンドの結合部位又は活性化配列の何れをも立体的に遮断しない抗体を使用すること、「粘着性」又はイオン性支持体に直接結合させること、化学的架橋、表面上でのタンパク質又は物質の合成などである。支持体にタンパク質又はリガンド／結合剤を結合させた後、過剰の未結合物質を洗浄により除去する。サンプル受容領域は、次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はその他の無害なタンパク質又はその他の成分と、インキュベーションすることにより遮断してもよい。
本発明の癌タンパク質を支持体に結合させた後、テスト化合物をアッセイ系に加える。あるいは、候補結合物質を支持体に結合させ、次いで本発明の癌タンパク質を加える。結合物質は特異的抗体、ケミカルライブラリのスクリーニングにおいて同定される非天然の結合物質、ペプチド類似体などである。
特に対象となるのはヒトの細胞に毒性の低い物質を同定するアッセイ法である。多様なアッセイ法がこの目的に使用し得る；例えば、増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、標識化インビトロタンパク質−タンパク質アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についてのイムノアッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などである。
本発明の癌タンパク質に対するテスト化合物（リガンド、結合物質、モジュレーターなど）の結合の決定は、多くの方法で実施し得る。テスト化合物は標識してもよく、結合は、例えば、本発明の癌タンパク質の全部又は一部を固体支持体に付着させ、標識した候補化合物（例えば、蛍光標識）を加え、過剰の試薬を洗い流し、次いで標識物が固体支持体上に存在するかを判定することにより直接決定する。適切な場合には、様々なブロッキングステップと洗浄ステップを利用し得る。
ある特定の態様では、１つの成分のみ、例えば、本発明のタンパク質又はリガンドのみを標識する。あるいは、１つを超える成分について異なる標識により、例えば、タンパク質についてはＩ１２５により、また、該化合物については蛍光体により標識する。近接試薬、例えば、クエンチング試薬又はエネルギー転移試薬も有用である。
モジュレーターの同定と特徴付けのための競合的アッセイ
一態様において、「テスト化合物」の結合は、「拮抗剤」との競合的結合アッセイにより判定する。拮抗剤は標的分子（例えば、本発明の癌タンパク質）に結合する結合残基である。拮抗剤は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどの化合物である。ある特定の条件下、テスト化合物と拮抗剤との間の競合的結合は、テスト化合物と置き換わる。一態様において、テスト化合物は標識される。テスト化合物、拮抗剤、又はその両方を、結合を可能とする十分な時間、タンパク質に加える。インキュベーションは最適な活性を促進する温度、一般に、４〜４０℃で実施する。インキュベーション時間は、一般に、例えば、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化する；例えば、０〜１時間で十分である。過剰の試薬は一般に除去又は洗い流す。次いで、第二成分を加え、標識化成分の存在又は不存在を追跡し、結合を示す。
一態様においては、先ず拮抗剤を加え、次いでテスト化合物を加える。拮抗剤の置き換えは、テスト化合物が癌タンパク質に結合していること、従って、癌タンパク質に結合可能であり、癌タンパク質の活性を調節する可能性のあることを示している。この態様においては、両成分を標識し得る。従って、例えば、もし拮抗剤が標識されているならば、テスト後化合物の洗浄液に標識が存在することは、テスト化合物に置き換わったことを示す。あるいは、もしテスト化合物が標識されているならば、支持体上に標識の存在することは、置換のあることを示す。
別の態様においては、先ずテスト化合物を加え、インキュベートし、洗浄した後に拮抗剤を加える。拮抗剤による結合がなければ、テスト化合物が拮抗剤よりも高い親和性で癌タンパク質に結合したことを示す。従って、もしテスト化合物が標識されているならば、支持体上の標識の存在は、拮抗剤の結合欠如と組み合わせて、テスト化合物が本発明の癌タンパク質に結合し、調節する可能性のあることを示している。
従って、競合的結合法は、本発明の癌タンパク質活性を調節し得る物質同定のための示差スクリーニングを包含する。この態様において、該方法は第一サンプルに癌タンパク質と拮抗剤を組み合わせることからなる。第二サンプルは、テスト化合物、癌タンパク質、及び拮抗剤からなる。拮抗剤の結合は両サンプルについて決定され、２つのサンプル間の結合の変化又は差は、物質が存在すること、その物質が癌タンパク質に結合可能であり、かつその活性を調節する可能性のあることを示している。すなわち、もし拮抗剤の結合が第一サンプルに比べて第二サンプルで異なっているならば、その物質は癌タンパク質に結合可能である。
あるいは、示差スクリーニングは未改変の癌タンパク質に結合するが、改変した癌タンパク質には結合し得ない薬物候補を同定するために使用する。例えば、癌タンパク質の構造をモデルとして理に適った薬物の設計に使用し、その部位と相互作用する作用因子、部位改変したタンパク質には一般的に結合しない作用因子を合成する。さらに、未改変癌タンパク質の活性に影響するかかる薬物候補はまた、かかるタンパク質の活性を上昇又は低下させる能力について薬物をスクリーニングすることによっても同定される。
陽性対照及び陰性対照はこのアッセイで使用し得る。好ましくは、対照とテストサンプルは統計的に有意な結果を得るために、少なくとも３組で実施する。すべてのサンプルのインキュベーションは、物質とタンパク質との結合が可能となる十分な時間行う。インキュベーションに続き、サンプルを洗浄して非特異的に結合した物質を除き、結合した量、通常は標識化物質を定量する。例えば、放射線標識を採用する場合、シンチレーション・カウンターによりサンプルを計測し、結合化合物量を定量することができる。
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに包含させ得る。これらは塩様試薬、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などであり、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、及び／又は非特異的若しくはバックグランドの相互作用を低下させるために使用する。また、その他の点でアッセイの効率を改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などを使用することもできる。成分の混合物は、必要な結合を提供する順序で加える。
本発明のタンパク質を下方制御又は阻害するポリヌクレオチドの使用
癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、リガンド結合分子との抱合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入し得る（国際特許出願ＷＯ９１／０４７５３の記載参照）。適切なリガンド結合分子は、限定されるものではないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合するその他のリガンドである。好ましくは、リガンド結合分子の抱合は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する能力に実質的に干渉せず、またセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその抱合体が細胞に入り込むのも遮断しない。あるいは、癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているように、例えば、ポリヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞に導入し得る。理解されることは、アンチセンス分子又はノックアウト及びノックインモデルが、治療方法に加えて、上に考察したようにスクリーニングアッセイにも使用し得ることである。
阻害性及びアンチセンスヌクレオチド
ある特定態様において、癌関連タンパク質の活性は、アンチセンスポリヌクレオチド又は抑制性の核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、すなわち、コーディングｍＲＮＡ核酸配列に相補性であり、また好ましくは特異的にハイブリダイズし得る核酸の使用により、下方制御されるか、又は全体として阻害される；例えば、本発明の癌タンパク質、ｍＲＮＡ、又はそのサブ配列である。アンチセンスポリヌクレオチドとｍＲＮＡとの結合は、そのｍＲＮＡの翻訳及び／又は安定性を低下させる。
本発明の状況下、アンチセンスポリヌクレオチドは天然のヌクレオチドからなるか、又は天然型のサブユニット若しくはその密接な相同体から形成される合成種を含み得る。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、改変した糖部分又は糖間結合を有し得る。これらの内の代表例はホスホロチオアート及び他のイオウ含有種であり、技術的に使用の知られたものである。類似体は本発明のヌクレオチドと有効にハイブリダイズするように機能する限り、本発明に包含される。参照例：Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc. Natick, MA。
かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、組み換え手法を用いて容易に合成可能であるか、又はインビトロで合成し得る。そのような合成に用いる器材は、アプライドバイオシステム社を含むいくつかのメーカーから販売されている。その他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体などの調製についても、当業者に周知である。
ここで使用するアンチセンス分子とは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドである。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖との結合によって、転写を遮断するために採用し得る。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは、癌分子の標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む。本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、一般には少なくとも凡そ１２個のヌクレオチド、好ましくは１２〜３０個のヌクレオチドを含んでなる。所定のタンパク質をコード化するｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力については、文献に記載がある：例：Stein & Cohen (Cancer Res. 48:2659 (1988)) 及び van der Krol et al., (Bio Techniques 6:058 (1988))。
リボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、癌関連ヌクレオチド配列の転写を標的とし、阻害するために、リボザイムを使用することができる。リボザイムは他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。異なる種類のリボザイム、例えば、グループＩリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、リボヌクレアーゼＰ、及び斧型ヘッドリボザイムなどが文献に記載されている（異なるリボザイムの性質についての一般的概説参照例：Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25:289-317 (1994)）。
ヘアピンリボザイムの一般的特徴については文献に記載がある；例：Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); 欧州特許公開Ｎｏ．０３６０２５７；米国特許５,２５４,６７８。その調製法については当業者に周知である（参照例：ＷＯ９４／２６８７７；Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703 (1995): Leavitt et al., Human Gene Therapy 5:1151-120 (1994); 及び Yamada et al., Virology 205: 121-126 (1994)）。
表現型スクリーニングにおけるモジュレーターの使用
一態様において、テスト化合物は、関連する癌の発現プロフィールをもつ一群の癌細胞に投与する。本明細書において、「投与」又は「接触」とは、モジュレーターを、細胞による取り込み作用及び細胞内作用によって又は細胞表面での作用により、細胞に作用するような方法で細胞に加えることを意味する。一部の態様において、タンパク質様物質（すなわち、ペプチド）をコード化する核酸を、アデノウイルス又はレトロウイルス構築物などのウイルス構築物に入れ、ペプチド物質の発現が遂行されるように、細胞に加える；例：国際特許ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９。制御可能な遺伝子療法システムも使用し得る。一旦細胞にモジュレーターを投与した後、所望により細胞を洗浄し、好ましい生理的条件下に、所要時間インキュベートする。次いで細胞を採取し、新たな遺伝子発現プロフィールを生成させる。このように、例えば、調節する物質について癌組織をスクリーニングし、例えば、癌表現型を誘発又は抑制する。少なくとも１つ、好ましくは多くの遺伝子における発現プロフィールの変化は、物質が癌の活性に対して作用をもつことを示している。同様に、生物学的機能の変化又はシグナル伝達の変化は、モジュレーター活性の証拠である。癌表現型のかかるサインを定義することによって、該表現型を変える新薬のスクリーニングが案出される。この方法により、薬物標的は既知であることを要せず、また当初の遺伝子／タンパク質発現スクリーニングプラットホームに提示される必要もなく、あるいは変化する必要のある標的タンパク質の転写物のレベルも必要ない。機能を阻害するモジュレーターは代用マーカーとして働く。
上に概説したように、スクリーニングは遺伝子又は遺伝子産物を評価するために行う。すなわち、特定の状態で、特定の示差的発現遺伝子を重要なものとして同定した後、遺伝子又は遺伝子産物自体の発現のモジュレーターのスクリーニングを実施する。
本発明ペプチドに影響するモジュレーターの使用
癌ポリペプチド活性の測定又は癌表現型の測定は、種々のアッセイ法を用いて実施する。例えば、癌ポリペプチドの機能に対するモジュレーターの作用は、上記のパラメーターを試験することにより測定する。活性に影響する生理的変化は、本発明のポリペプチドに対するテスト化合物の影響を評価するために使用する。機能的成果を未改変細胞又は動物により判定する場合、様々な作用について、固形腫瘍、腫瘍増殖、腫瘍転移、新生血管形成、ホルモン放出、既知及び未特徴付け遺伝子マーカー（例えば、ノーザンブロットによる）、細胞増殖若しくはｐＨ変化などの細胞メカニズムの変化、及びｃＧＮＩＰなどの細胞内セカンドメッセンジャーの変化、などと関連する癌の事例のように、評価し得る。
癌関連配列を同定・特徴付けする方法
種々の遺伝子配列の発現は、癌と相関する。従って、突然変異又は変異型癌遺伝子に基づく疾病が決定される。一態様において、本発明は変異型癌遺伝子を含む細胞を同定する方法、例えば、細胞中の少なくとも１種の内在性癌遺伝子の配列、その全部又は一部の存在を決定する方法を提供する。この方法はいくつかの配列決定技法を用いて実施する。本発明は個体の癌表現型を同定する方法、例えば、個体において本発明の少なくとも１種の遺伝子の配列の全部又は一部を決定する方法からなる。これは一般的に個体の少なくとも１種の組織、例えば、表１に示す組織で実施し、多数の組織についての、又は同じ組織の異なるサンプルについての評価を含み得る。この方法は配列決定した遺伝子の配列を既知の癌遺伝子、すなわち、野生型遺伝子と比較し、ファミリーメンバー、相同体、突然変異又は変異体の存在を決定することからなる。次いで、その遺伝子の全部又は一部の配列を既知癌遺伝子の配列に比較し、何らかの差異が存在するかを判定することができる。これはいくつかの既知相同性プログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｂｅｓｔｆｉｔなどを用いて行う。患者の癌遺伝子と既知癌遺伝子との間に、配列の差が存在する場合、本明細書に概説するように、それは病状と相関するか、又は病的傾向と相関する。
好適な態様において、癌遺伝子はゲノムの癌遺伝子のコピー数を決定するためにプローブとして使用する。癌遺伝子は癌遺伝子の染色体位置を決定するためのプローブとして使用する。染色体位置などの情報には、特に、トランスロケーションなどの染色体異常が癌遺伝子巣に同定される場合に、診断又は予測を提供するという用途がある。
ＸＩＶ．）ＲＮＡｉ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の治療的使用
本発明はまた、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを目的とするものであり、特に、１５８Ｐ１Ｄ７コーディング領域若しくは５”ＵＴＲ領域の少なくともフラグメント、又は相補性オリゴヌクレオチド若しくは１５８Ｐ１Ｄ７配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、を含む二本鎖ＲＮＡを目的とする。一態様において、かかるオリゴヌクレオチドは１５８Ｐ１Ｄ７の機能を解明するために使用するか、又は１５８Ｐ１Ｄ７の機能若しくは発現のモジュレーターをスクリーニング若しくは評価するために使用する。もう一つの態様において、１５８Ｐ１Ｄ７の遺伝子発現はｓｉＲＮＡの形質移入により減少し、その結果、抗原を内在的に発現する形質転換癌細胞の増殖能力が有意に減少する；特異的１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、例えば、細胞生存度の代謝リードアウトにより測定した生存率が減少を示し、減少した増殖能力と相関する。従って、１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡ組成物は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質又はそのサブ配列の核酸ＣＲＦ配列に相当するｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を含んでいる；これらのサブ配列はその長さが一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又はそれ以上の連続したＲＮＡヌクレオチドであり、ｍＲＮＡコーディング配列の少なくとも一部に相補性であるか、又は非相補性である配列を含む。好適な態様において、サブ配列は１９〜２５個のヌクレオチドの長さであり、最も好ましいのは、２１〜２３個のヌクレオチドの長さである。
ＲＮＡ干渉は、インビトロ及びインビボで遺伝子をサイレンシング（silencing）させる新しい方法であり、従って短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は価値ある治療剤である。特異的な遺伝子活性をサイレンシングさせるｓｉＲＮＡの能力は、現在、動物の疾患モデルに供し、また同様にヒトで使用されている。例えば、特定の標的に対するｓｉＲＮＡによる、マウスへのｓｉＲＮＡ溶液の水力学的注入は、治療的に有効であることが証明されている。
ソングら（Song et al.）による開拓的研究が示すところによると、全体が天然型である一つのタイプの核酸、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、さらに化学的改変を施さなくとも治療剤として作用する（Song, E., et al. “RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis (Ｆａｓを標的とするＲＮＡ干渉はマウスの劇症肝炎を予防する)” Nat. Med. 9(3): 347-51 (2003)）。この研究は、動物にｓｉＲＮＡを注入すると疾患を軽減するという最初のインビボの証拠を提供した。この事例で、著者らはＦＡＳタンパク質（炎症応答に際し活性化し過ぎた場合、肝細胞及びその他の細胞に死を誘発する細胞死レセプター）をサイレンシングさせるように設計したｓｉＲＮＡをマウスに注射した。翌日、動物にＦａｓに特異的な抗体を付与した。対照のマウスは急性肝不全のため二三日で死亡したが、ｓｉＲＮＡ処置マウスの８０％以上が重症疾患にかからず、生存した。マウス肝細胞の８０〜９０％が裸のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを取り込んだ。さらに、該ＲＮＡ分子は１０日間機能し、３週間後に作用を失った。
ヒトの治療に使用するためには、長時間持続するＲＮＡｉ活性を誘発する効率的なシステムにより、ｓｉＲＮＡを送達する。臨床使用のための主たる注意点は、適切な細胞にｓｉＲＮＡを送達することである。肝細胞は外来のＲＮＡに対し特に感受性が強いと思われる。今日、肝臓に位置する標的は、肝臓が核酸分子とウイルスベクターの標的と容易になり得る臓器であるため、興味の対象である。しかし、他の組織及び臓器標的も同様に好適である。
細胞膜の通過を促進する化合物によるｓｉＲＮＡ製剤を用い、治療におけるｓｉＲＮＡの投与効果を改善する。化学的に改変した合成ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼに抵抗性で、血清安定性を有し、随伴するＲＮＡｉ作用の持続性が延長されるため、さらなる態様となる。
従って、ｓｉＲＮＡ技法は、例えば、表１に掲載したような癌をもつ個体の１５８Ｐ１Ｄ７を標的とするｓｉＲＮＡ分子の送達によるヒト悪性腫瘍の治療法である。かかるｓｉＲＮＡの投与は、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌細胞の増殖を減少に導き、悪性腫瘍と関連する罹患率及び／又は死亡率を減少させる。
この遺伝子産物ノックダウン方式の有効性は、インビトロ又はインビボで測定した場合、有意である。インビトロ法を用い１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現低下を検出すると、（上記のように）培地の細胞又は癌患者の生検にｓｉＲＮＡを投与するので、インビトロでの有効性が容易に証明される。
ＸＶ．）キット／製造物
本明細書に記載の、実験室、予測、予防、診断及び治療適用で使用するキットは本発明の範囲内である。かかるキットは担体、包装、又はバイアル、チューブなどの１個以上の容器を受容するために区画分けした容器からなり、各容器は本方法に使用すべき個々の要素と、本明細書に記載した用途など、使用説明書を含むレーベル又は添付文書とを含んでなる。例えば、該容器は、検出可能に標識した又は標識し得るプローブを含み得る。かかるプローブは本発明のタンパク質又は遺伝子若しくはメッセージにそれぞれ特異的な抗体又はポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的の核酸を検出するために核酸のハイブリダイゼーションを利用する場合、キットもまた標的核酸配列増幅用のヌクレオチドを容れた容器を有する。キットはレポーターを含む容器を含み得る；例えば、酵素、蛍光体、又は放射性同位元素などのレポーター分子に結合したビオチン結合タンパク質、例えば、アビジン又はストレプトアビジンなどである：かかるレポーターは、例えば、核酸又は抗体とともに使用し得る。キットは図２又は図３のアミノ酸配列の全部若しくは一部又はその類似体、又はかかるアミノ酸配列をコード化する核酸分子を含み得る。
本発明のキットは、典型的には、上記の容器及びそれと関連する１個以上の容器からなり、該容器は商業的及びユーザーの観点から望まれる物質、例えば、バッファー、希釈剤、フィルター、針、注射筒など；担体、包装、容器、バイアル及び／又はチューブレーベル掲載内容及び／又は使用説明書、及び使用説明書付き添付文書などを含んでなる。
レーベルは、該組成物が予測、予防、診断又は実験室応用など、特異的な治療又は非治療応用に使用することを明記する容器上又は容器とともに存在し得るものであり、本明細書に記載するように、インビボ又はインビトロでの使用法を指示することもできる。説明書及び／又はその他の情報は、キットとともに、又はキット上に含める添付文書又はレーベルに含めることもできる。レーベルは容器上とするか、又は容器と関連付け得る。レーベルは文字、数字又はレーベルを形成するその他の特徴を容器自体に形作るか、又は彫り込む場合に、容器上に存在し得る；レーベルは、それが例えば添付文書のように、容器を保持する容器又は運搬用具内に在る場合、容器と関連付け得る。レーベルは、該組成物が表１に示す組織の異常増殖など、症状の診断、治療、予防又は予測に使用することを示し得る。
「キット」及び「製造物」という用語は、同義語として使用し得る。
本発明のもう一つの態様においては、アミノ酸配列（類）、小分子（類）、核酸配列（類）、及び／又は抗体（類）、例えば、表１に示したような組織の異常増殖の診断、予測、予防及び／又は治療に有用な物質などの組成物を含有してなる製造物が提供される。製造物は代表的には少なくとも１つの容器と少なくとも１つのレーベルからなる。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、注射筒、及び試験管である。容器は様々な材料、例えば、ガラス、金属又はプラスチックなどから形成し得る。容器はアミノ酸配列（類）、小分子（類）、核酸配列（類）、細胞集団（群）、及び／又は抗体（類）を収容し得る。一態様において、該容器は細胞のｍＲＮＡ発現プロフィールの試験に使用するポリヌクレオチドを、この目的に使用する試薬とともに収容する。もう一つの態様において、容器は細胞及び組織中の１５８Ｐ１Ｄ７のタンパク質発現を評価する際に使用する、又は関連する実験室、予測、予防及び治療を目的する、抗体、その結合フラグメント又は特異的結合タンパク質を含んでなる；かかる使用のための効能・効果及び／又は用法説明書も、これらの目的に使用する試薬及び他の組成分又は器具同様に、かかる容器に含めることができる。もう一つの態様において、容器は細胞性又は体液性免疫応答を引き出すための物質を、関連する効能・効果及び／又は用法説明書とともに含んでなる。もう一つの態様において、容器は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）などの養子免疫治療用の物質を、関連する効能・効果及び／又は用法説明書とともに含んでなる；かかる目的に使用する試薬及び他の組成分又は器具もまた含め得る。
該容器は、あるいは症状を治療、診断、予測又は予防するために有効な組成物を収容することが可能で、無菌の出入口を有し得る（例えば、容器は静注溶液用バッグ又はバイアルであり、皮下注射用針により穿孔し得る栓を有する）。該組成物中の活性剤は１５８Ｐ１Ｄ７に特異的に結合し、１５８Ｐ１Ｄ７の機能を調節し得る抗体であり得る。
該製造物はさらにリン酸緩衝塩溶液、リンゲル溶液及び／又はデキストロース溶液など、医薬的に許容し得るバッファーを収容する第二容器を含み得る。このものはさらに商業上及びユーザーの観点から望まれるその他の物質、例えば、他のバッファー、希釈剤、フィルター、スターラー、針、注射筒、及び／又は効能・効果及び／又は用法を記載する添付文書を含み得る。
下記各種実施例により本発明の各種形態を更に説明及び詳述するが、これらの実施例により本発明は何ら制限されるものではない。
［実施例１］ＳＳＨにより産生された１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子のｃＤＮＡ断片の単離
膀胱癌において過剰発現する遺伝子を単離するために、侵食移行上皮癌を含む膀胱癌組織由来のｃＤＮＡを用いる抑制差引ハイブリダイゼーション（Suppression Subtractive Hybridization(SSH)）法を行った。１５８Ｐ１Ｄ７ ＳＳＨ ｃＤＮＡ塩基配列は、膀胱癌プールから正常膀胱ｃＤＮＡを差し引いたサブトラクションに由来した。ドライバーには、９個の他の正常組織由来のｃＤＮＡも含めた。１５８Ｐ１Ｄ７ ｃＤＮＡは、膀胱癌組織プールにおいて高発現し、限定された正常組織セットではより低い発現が認められた。
２３１ｂｐのＳＳＨ ＤＮＡ塩基配列（図１）は、第１３番染色体のゲノミッククローン由来の仮想タンパク質ＦＬＪ２２７７４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＸＭ＿０３３１８３）との高いホモロジー（２３０／２３１同一性）を有する。８４１個のアミノ酸のＯＲＦが明らかとなった（図２及び図３）、２５５５ｂｐの１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡクローン（ターボスクリプト３ＰＸ（TurboScript3PX））を膀胱癌ｃＤＮＡから単離した。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、シグナル配列及び膜内外ドメインを有し、ＰＳＯＲＴ−Ｉプログラム（URL psort.nibb.ac.jp:8800/form.html）を用いると、細胞表面に局在していると予想される。１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸配列分析により、ヒト仮想タンパク質ＦＬＪ２２７７４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＸＭ＿０３３１８２）（図４）に対する７９８のアミノ酸領域にわたって１００％同一性が明らかにされる。
材料及び方法
ヒト組織：
膀胱癌患者の組織は、ＮＤＲＩ（フィラデルフィア、ペンシルヴァニア州）等のいくつかの出所から購入した。いくつかの正常組織のｍＲＮＡは、クロンテック（Clontech）（パロアルト、カリフォルニア州）から購入した。
ＲＮＡ単離：
全ＲＮＡを分離するために、組織を、１０ｍｌ／ｇ組織のトリゾール（Trizol）試薬（Life Technologies、Gibco BRL）中でホモジナイズした。全ＲＮＡからポリＡＲＮＡ（Poly A RNA）を、キアゲンのＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ小型兼中型キットを用いて精製した。全ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、分光光度分析（吸光度２６０／２８０ｎｍ）により定量化し、ゲル電気泳動により分析した。
オリゴヌクレオチド：
下記ＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドを使用した。
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）：
5'TTTTGATCAAGCTT303'（配列番号：２８）
アダプター１：
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3'（配列番号：２９）
3'GGCCCGTCCTAG5'（配列番号：３０）
アダプター２：
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3'（配列番号：３１）
3'CGGCTCCTAG5'（配列番号：３２）
PCRプライマー１：
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' （配列番号：３３）
ネステッドプライマー（ＮＰ）１：
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3'（配列番号：３４）
ネステッドプライマー（ＮＰ）２：
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3'（配列番号：３５）
抑制差引ハイブリダイゼーション：
抑制差引ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を用いて、膀胱癌内で差動的に発現されるであろう遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。ＳＳＨ反応は、膀胱癌及び正常組織からのｃＤＮＡが利用された。
遺伝子１５８Ｐ１Ｄ７塩基配列は、膀胱癌プールから正常膀胱ｃＤＮＡを差し引いたサブトラクションに由来した。ＳＳＨ ＤＮＡ塩基配列（図１）を同定した。
正常な膀胱組織のプール由来のｃＤＮＡを、「ドライバー（driver）」ｃＤＮＡのソースとして使用する一方、膀胱癌組織のプール由来のｃＤＮＡを「テスター（tester）」ｃＤＮＡのソースとして使用した。テスター及びドライバーｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡを、前記したように、１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮをプライマーとして用い、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクションキット（PCR-Select cDNA Subtraction Kit）を用いて、関連する異種移植片から単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一及び第二ストランドの合成を、キットの使用マニュアルのプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコル第ＰＴ１１１７−１号、カタログ第Ｋ１８０４−１号）に記載されているのと同様に、行った。生じたＤＮＡを、ＤｐｎＩＩを用いて３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿させた。
ドライバーｃＤＮＡは、関連する組織のソース（上記参照）からのＤｐｎＩＩ消化したｃＤＮＡと、９つの正常な組織：胃、骨格筋、肺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、小腸、及び心臓由来の消化したｃＤＮＡの混合物とを１：１の比で混合することにより生成させた。
テスターｃＤＮＡは、１μｌの関連する組織のソース（上記参照）からのＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を５μｌの水中で希釈することにより生成させた。その後、希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、別々の連結反応において、総容積１０μｌで、１６℃で一晩、４００ｕのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、２μｌのアダプター１及びアダプター２（１０μＭ）と、結合させた。結合反応は１μｌの０．２ＭのＥＤＴＡを用いて、７２℃で５分間加熱して終結させた。
１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１−及びアダプター２−結合テスターｃＤＮＡを含む二本の管のそれぞれに加えることによって、第一のハイブリダイゼーションを行った。最終容積４μｌで、サンプルをミネラルオイルで被覆し、９８℃で１．５分間、ＭＪリサーチサーマルサイクラー（MJ Research thermal cycler）中で変性させ、その後６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。その後、二つのハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成物）を、１μｌのさらに別の変性したドライバーｃＤＮＡと共に混合し、６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。その後、第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、−２０℃で保存した。
ＳＳＨから生成した遺伝子断片のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエンシング（配列決定）：
二つのＰＣＲ増幅を行って、ＳＳＨ反応から生ずる遺伝子断片を増幅した。一次ＰＣＲ反応において１μｌの希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物を１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌ １０×反応バッファ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及び０．５μｌ ５０倍アドバンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス（50×Advantage cDNA polymerase Mix）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に、最終容積２５μｌで、加えた。ＰＣＲ１を、下記条件により行った：７５℃５分間、９４℃２５秒間、その後９４℃１０秒間、６６℃３０秒間、７２℃１．５分間の２７サイクル。各実験として、５つの分離一次ＰＣＲ反応を行った。産物をプールし、水を用いて１：１０に希釈した。二次ＰＣＲ反応として、プールしかつ希釈した一次ＰＣＲ反応からの１μｌを、プライマーＮＰ１及びＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用することを除いて、ＰＣＲ１として使用した反応混合液と同一のものに加えた。ＰＣＲ２を、９４℃１０秒間、６８℃３０秒間、及び７２℃１．５分間の１０−１２サイクルで行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Invitrogen）を用いて、ｐＣＲ２．１中に挿入した。形質転換した大腸菌を、青色／白色及びアンピシリン選択に付した。白色コロニーを選び取り、９６ウェルプレート中に配列させ、一晩液体培養にて増殖させた。プライマーとしてＮＰ１及びＮＰ２を使用し、ＰＣＲ１の条件により１ｍｌの菌液についてＰＣＲ増幅を行って、複数の挿入断片を同定した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
菌液を、９６ウェルフォーマット内の２０％グリセロール中で保存した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ及びＮＣｌ−ＣＧＡＰデータベースの核酸ホモロジー検索に付した。
ＲＴ−ＰＣＲ発現分析：
第一ストランドｃＤＮＡを、ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）スーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステム（Superscript Preamprification sysem）を用いて、オリゴ（チミジン（ｄＴ））１２−１８初回免疫で、１μｇのｍＲＮＡから生成することができる。逆転写酵素を用いる４２℃で５０分間のインキュベーション、次いで３７℃で２０分間リボヌクレアーゼＨ処理をすることを含む製造プロトコルを用いた。反応を完了した後、標準化する前に容積を水で２００μｌまで増加することができる。１６の異なる正常（健常）ヒト組織からの第一ストランドｃＤＮＡについては、クロンテック社から得ることができる。
多様な組織からの第一ストランドｃＤＮＡの標準化を、プライマー5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3'（配列番号：３６）及び5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' （配列番号：３７）を用いて行って、β−アクチンを増幅した。第一ストランドｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１ＸＰＣＲバッファ（Clontech、１０ｍＭトリス塩酸、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）及び１×クレノウＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社）を含有させて全容積５０μｌで、増幅させた。５μｌのＰＣＲ反応物を、１８、２０及び２２サイクルで取り除くことができ、アガロースゲル電気泳動に使用することができる。ＰＣＲを、下記の条件下、ＭＪリサーチサーマルサイクラーを用いて行った：初期変性を９４℃で１５秒間とし、その後９４℃で１５、６５℃で２分間、７２℃で５秒間の１８、２０、及び２２サイクルにすることができる。７２℃での最終延長を、２分間実施した。アガロースゲル電気泳動後、多様な組織からの複数の２８３塩基対のβ−アクチンバンドの吸収帯強度を目視により比較した。第一ストランドｃＤＮＡの希釈倍率を計算して、ＰＣＲの２２サイクル後の全組織における相当するβ−アクチンの吸収帯強度を得た。２２サイクルのＰＣＲ後の全組織における相当するβ−アクチンの吸収帯強度を得るため、標準化の３つのラウンドが要求される。
５μｌの標準化した第一ストランドＤＮＡを２６、及び３０サイクルの増幅によるＰＣＲによって分析して、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子の発現レベルを測定した。光吸収帯強度（light band intensity）を与えるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することによって、半定量発現分析（Semi-quantitative expression analysis）を行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲとして使用したプライマーを、１５８Ｐ１Ｄ７ ＳＳＨ塩基配列を用いてデザインした。これを以下に列挙する：
１５８Ｐ１Ｄ７．１
5'ATAAGCTTTCAATGTTGCGCTCCT3'（配列番号：３８）
１５８Ｐ１Ｄ７．２
5'TGTCAACTAAGACCACGTCCATTC3'（配列番号：３９）
代表的なＲＴ−ＰＣＲ発現分析を図６に示す。生成した複数の第一ストランドｃＤＮＡについて、多様なサンプルからの組織のプールを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を、行った。ｃＤＮＡは、ベータアクチンＰＣＲを用いて標準化して表した。１５８Ｐ１Ｄ７の発現を、膀胱癌プールにおいて観察した。
［実施例２］１５８Ｐ１Ｄ７の完全長クローニング
１５８Ｐ１Ｄ７ ＳＳＨ ｃＤＮＡ塩基配列は、膀胱癌プールから正常膀胱ｃＤＮＡを差し引いたサブトラクションから由来した。ＳＳＨ ｃＤＮＡ塩基配列（図１）を、１５８Ｐ１Ｄ７とした。完全長ｃＤＮＡクローン１５８Ｐ１Ｄ７−クローン、ターボスクリプト３ＰＸ（TurboScript3PX）（図２）を膀胱癌プールｃＤＮＡからクローン化した。
１５８Ｐ１Ｄ７クローンｃＤＮＡを、２００１年８月２２日にブダペスト条約の約定の下、プラスミドｐ１５８Ｐ１Ｄ７−ターボ（Ｔｕｒｂｏ）／３ＰＸとして、アメリカタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ：１０８０１ ブルヴァール大学（University Blvd.）、マナッサス、ヴァージニア州２０１１０−２２０９ 米国））に寄託し、受託番号ＰＴＡ−３６６２に指定された。
［実施例３］１５８Ｐ１Ｄ７の染色体地図作成
染色体の局在性は、病気の発生と遺伝子を結びつけることができる。いくつかの染色体地図作成（位置付け）の方法があり、それらは、蛍光性インサイツハイブリダイゼーション（fluorescent in situ hybridization （ＦＩＳＨ））、ヒト／ハムスター放射線ハイブリッド（radiation hybrid（ＲＨ））パネル（Walter et al., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics，ハンツヴィル（Huntsville）アラバマ州（ＡＩ））、コリエルインスティチュート（Coriell Institute）（キャムデン、ニュージャージー州）から入手できるようなヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッド（雑種）パネル、及びＢＬＡＳＴを配列決定かつ地図作成したゲノミッククローンに利用するゲノムビューアー（ＮＣＢＩ、ベセズダ、メリーランド州）を含む。
１５８Ｐ１Ｄ７は、１５８Ｐ１Ｄ７塩基配列及びＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴツール：（www (world wide web) URL ncbi.nlm.nih.gov/genom.seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs））を用いて染色体１３に位置付けられる。これは、膀胱癌における高頻度増幅の領域（Prat et al.,Urology 2001 May;57(5):986-92; Muscheck et al., Carcinogenesis 2000 Sep;21(9):1721-26）であり、進行型膀胱癌における急速な腫瘍細胞の増殖と付随している（Tomovska et al. Int J Oncol 2001 Jun; 18(6):1239-44）。
［実施例４］正常組織及び患者標本における１５８Ｐ１Ｄ７の発現分析
ＲＴ−ＰＣＲによる１５８Ｐ１Ｄ７の分析を、図６に示す。１５８Ｐ１Ｄ７の強い発現が、膀胱癌プール及び乳癌プールにおいて観察される。より低いレベルの発現が、ＶＰ１、ＶＰ２、異種移植片プール、前立腺癌プール、結腸癌プール、肺癌プール、卵巣癌プール、及び転移プールにおいて、観察される。
１６のヒト正常組織における１５８Ｐ１Ｄ７の広域ノーザンブロット分析（extensive northern brot analysis）によって、ＲＴ−ＰＣＲにより観察される発現が裏づけられる（図７）。約４．６及び４．２ｋｂの二つの転写産物が前立腺において検出され、心臓、胎盤、肝臓、小腸及び結腸においてはより低いレベルで検出される。
患者腫瘍標本についてのノーザンブロット分析により、試験したほとんどの膀胱腫瘍組織において、及び膀胱癌株細胞ＳＣａＢＥＲにおいて、１５８Ｐ１Ｄ７の発現が確認される（図８Ａ及び８Ｂ）。正常な組織（健康なドナーから単離されたもの）ではなく、正常な隣接組織（患者から単離されたもの）において認められる発現によって、これらの組織が完全に正常でないこと、及び１５８Ｐ１Ｄ７が初期段階の腫瘍において発現される可能性があることが示されるかもしれない。１５８Ｐ１Ｄ７の発現が、４つのうち２つの肺癌株細胞、及び試験した全ての３つの肺癌組織においても認められる（図９）。乳癌サンプルに関し、１５８Ｐ１Ｄ７の発現が、ＭＣＦ７及びＣＡＭＡ−１乳癌株細胞、乳癌患者から単離された乳房腫瘍組織において観察されるが、正常な乳房組織においては観察されない（図１０）。１５８Ｐ１Ｄ７は、メラノーマ癌において発現をする。ＲＮＡを正常な皮膚株細胞、デトロイト−５５１（Ｄｅｔｒｏｉｔ−５５１）、及びメラノーマ癌株細胞Ａ３７５から抽出した。１０ｕｇの全ＲＮＡを用いるノーザンブロットは、１５８Ｐ１Ｄ７ ＤＮＡプローブでプローブされた。結果として、メラノーマ癌株細胞において１５８Ｐ１Ｄ７の発現が確認されるが、その正常な株細胞においては確認されない（図２０）。１５８Ｐ１Ｄ７は、頚部癌患者標本において発現をする。第一ストランドｃＤＮＡを、正常な頚部、頚部癌株細胞Ｈｅｌａ、及び頚部癌患者標本のパネルから調製した。アクチン及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いて、ＰＣＲによって、標準化を行った。１５８Ｐ１Ｄ７に対するプライマーを用いて、２６及び３０サイクルの増幅で、半定量ＰＣＲを行った。結果として、試験した腫瘍標本の１４個中３個において１５８Ｐ１Ｄ７の発現が確認されるが、正常な頚部においてもその株細胞においても確認されない（図２１）。
正常な組織における１５８Ｐ１Ｄ７の発現の制限、及び前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ癌、及び頚部癌において認められる発現は、１５８Ｐ１Ｄ７がヒト癌のための潜在的治療の標的（ターゲット）及び診断マーカーであることが示唆する。
［実施例５］原核系における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の製造
完全又は部分長１５８Ｐ１Ｄ７及び１５８Ｐ１Ｄ７変異体ｃＤＮＡ塩基配列を各種の公知の発現ベクターの何れかにクローン化して、原核細胞において組換え型１５８Ｐ１Ｄ７及び１５８Ｐ１Ｄ７変異体を発現させる。１又はそれ以上の下記領域の１５８Ｐ１Ｄ７変異体が発現される：図２及び３、又は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の何れかに示した完全長シーケンス、或いは、１５８Ｐ１Ｄ７、変異体、又はこれらの類似物からの、より近接するアミノ酸。
Ａ．インビトロ転写及び翻訳構築物：
ｐＣＲＩＩ：
ＲＮＡインサイツ解析用の１５８Ｐ１Ｄ７センス及びアンチセンスＲＮＡプローブを生成させるため、１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡの全部又は断片をコード化したｐＣＲＩＩ構築物（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）を作製した。ｐＣＲＩＩベクターには、ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するための１５８Ｐ１Ｄ７ＲＮＡの転写を推進するため挿入断片に隣接するＳｐ６及びＴ７プロモーターがある。これらのプローブは、ＲＮＡレベルでの１５８Ｐ１Ｄ７の細胞及び組織発現を分析するために使用される。１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す転写された１５８Ｐ１Ｄ７ＲＮＡが、TnTTMCoupled Reticulolysate System（Promega、Corp.、マディソン、ウィスコンシン州）等の生体外翻訳システムにおいて使用され、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質が合成される。
Ｂ．細菌用構築物：
ｐＧＥＸ構築物：
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質に融合する細菌における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を生成させるために、１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡのタンパク質コード配列の全部又は一部を、ｐＧＥＸファミリーのＧＳＴ融合ベクター（Amasham Pharmasia Biotech、ピスカタウェー、ニュージャージー州）にクローン化して。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴ及びカルボキシル末端での６つのヒスチジンエピトープ（６×Ｈｉｓ）を含む組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質シーケンスの発現の制御を可能にする。ＧＳＴ及び６×Ｈｉｓタグは、適当なアフィニティマトリックスを用いて誘導した細菌からの組換え型融合タンパク質の精製を可能にし、並びに抗ＧＳＴ及び抗６×Ｈｉｓ抗体を含む融合タンパク質の認識を可能にする。６×Ｈｉｓタグは、６ヒスチジンコドンを３’末端で、例えば、翻訳領域（ＯＲＦ）のクローニングプライマーに付加することによって生成される。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１におけるPreScissionTM認識部位等のタンパク質分解切断部位は、１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質からＧＳＴタグの切断を可能にするように用いてもよい。アンピシリン耐性遺伝子及びｐＢＲ３２２開始点は大腸菌におけるｐＧＥＸプラスミドの選択及び維持を可能にする。
ｐＭＡＬ構築物：
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子に融合させて、細菌においてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合する組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を生成するために、１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡタンパク質のコード配列の全部又は一部をｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＭＡＬ−ｐ２ＸベクターへのクローニングによってＭＢＰと融合させた。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰ及びカルボキシル末端での６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）エピトープタグを含む組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質シーケンスの発現の制御を可能にする。ＭＢＰ及び６Ｘ Ｈｉｓタグは、適当なアフィニティマトリックスを用いて誘導した細菌からの組換え型タンパク質の精製を可能にし、並びに抗ＭＢＰ及び抗６Ｘ Ｈｉｓ抗体を含む融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグは、６ヒスチジンコドンを３’末端のクローニングプライマーに付加することによって生成される。第Ｘａ因子認識部位は、１５８Ｐ１Ｄ７からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクターを最適化して、細胞質又はペリプラズムのそれぞれにおいて組換えタンパク質を発現させる。ペリプラズム発現は、ジスルフィド結合を含むタンパク質のフォールディングを高める。１５８Ｐ１Ｄ７変異体１のアミノ酸３５６−６０８は、ｐＭＡＬｃ２Ｘベクターにクローン化されている。
ｐＥＴ構築物：
１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全部又は一部を、ｐＥＴファミリー（ノバジェン、マディソン、ウィスコンシン州）のベクターにクローン化して、細菌細胞において１５８Ｐ１Ｄ７を発現させる。これらのベクターは、ＮｕｓＡ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）等の溶解性を高めるタンパク質、並びに組換えタンパク質の精製及び検出を助ける６×Ｈｉｓ及びＳ−ＴａｇＴＭ等のエピトープタグに対する融合の有無によらず細菌における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現の厳密な制御を可能にする。例えば、構築物は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の領域がＮｕｓＡに対するアミノ末端融合物として発現されるようにｐＥＴ ＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して、作成される。
Ｃ．酵母構築物：
ｐＥＳＣ構築物：
１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全部又は一部を、それぞれが４つの選択可能なマーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、及びＵＲＡ３（Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州）のうち１つを含むｐＥＳＣファミリーのベクターにクローン化して、組換えタンパク質の生成及び基礎研究のため酵母種Saccharomyces cerevisiaeにおいて１５８Ｐ１Ｄ７を発現させる。これらのベクターは、２つの異なる遺伝子まで同一のプラスミド、或いは同一の酵母細胞中のＦｌａｇＴＭ又はＭｙｃエピトープタグのどちらかを含むクローン化したシーケンスからの発現の制限を可能にする。この系は、１５８Ｐ１Ｄ７のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するのに有用である。さらに、酵母における発現は、真核細胞において発現したときに認められる糖鎖形成及びリン酸化等のより小さい翻訳後修飾（post-translational modification）を生ずる。
ｐＥＳＣ構築物：
１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全部又は一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローン化して、酵母種Saccharomyces pombeにおいて１５８Ｐ１Ｄ７を発現させる。これらのベクターは、組換えタンパク質の精製を助けるＧＳＴにアミノ末端又はカルボキシル末端のどちらかで融合する１５８Ｐ１Ｄ７のタンパク質シーケンスの高レベルの発現の制御を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を含む組換えタンパク質の検出を可能にする。
［実施例６］真核系における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の製造
Ａ．哺乳類構築物：
完全又は部分長１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡ塩基配列を各種の公知の発現ベクターの何れかにクローン化して、真核細胞において組換え型１５８Ｐ１Ｄ７を発現させた。１５８Ｐ１Ｄ７の下記領域の１又はそれ以上を、これらの構築物、アミノ酸１〜８４１、又は１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１からの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の何れか若しくはそれ以上の近接するアミノ酸；ｖ．３のアミノ酸１〜７３２；ｖ．４のアミノ酸１〜３９５；ｖ．６のアミノ酸１〜５２９；又は１５８Ｐ１Ｄ７変異体からの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の何れか若しくはそれ以上の近接するアミノ酸、或いはこれらの類似物において、発現させた。
構築物は、２９３Ｔ細胞等の広範な各種の哺乳類細胞の何れかに形質移入されうる。形質移入された２９３Ｔ細胞溶解産物は、本願において記載した、抗１５８Ｐ１Ｄ７ポリクローナル血清でプローブされうる。
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：
１５８Ｐ１Ｄ７の１５８Ｐ１Ｄ７ＯＲＦ、又はその部分をｐｃＤＮＡ／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）にクローン化して、哺乳類細胞において組換え型１５８Ｐ１Ｄ７を発現させる。タンパク質発現がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＳＰ１６翻訳エンハンサーにより推進される。組換えタンパク質には、ＸｐｒｅｓｓＴＭ、及びアミノ末端に融合する６ヒスチジン（６Ｘ Ｈｉｓ）エピトープがある。ｐｃＤＮＡ／ＨｉｓＭａｘベクターは、エピソームの複製のためのＳＶ４０開始点及びラージＴ抗原を発現する株細胞における単純ベクターレスキュー（simple vector rescue）と共に、ｍＲＮＡ安定性を高めるためウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結シーケンスも含む。ゼオシン（Zeocin）耐性遺伝子は、当該タンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子とコリシンＥ１オリジンは、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：
コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を含む１５８Ｐ１Ｄ７の１５８Ｐ１Ｄ７ ＯＲＦ、又はその部分をｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）にクローン化して、哺乳類細胞において１５８Ｐ１Ｄ７を発現させた。タンパク質発現がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより推進された。組換え型タンパク質には、ｍｙｃエピトープ、及びカルボキシル末端に融合する６Ｘ Ｈｉｓエピトープがある。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターは、エピソームの複製のためのＳＶ４０開始点及びラージＴ抗原を発現する株細胞における単純ベクターレスキュー（simple vector rescue）と共に、ｍＲＮＡ安定性を高めるためウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結シーケンスも含む。ネオマイシン耐性遺伝子は当該タンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子とコリシンＥ１オリジンは、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。
１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１の完全なＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物にクローン化して、１５８Ｐ１Ｄ７．ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓを生成した。図２３は、２９３Ｔ細胞への形質移入後の１５８Ｐ１Ｄ７．ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓの発現を示す。２９３Ｔ細胞を、１５８Ｐ１Ｄ７．ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター制御して形質移入した。４０時間後、細胞を採取し、抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。結果として、形質移入した細胞の表面上において１５８Ｐ１Ｄ７．ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物からの１５８Ｐ１Ｄ７の発現が確認される。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：
コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を含む１５８Ｐ１Ｄ７ ＯＲＦ、又はその部分をｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カリフォルニア州）にクローン化して、哺乳類細胞において１５８Ｐ１Ｄ７を発現させ、蛍光性を用いて組換えタンパク質の検出を可能にさせる。タンパク質発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより推進される。組換え型タンパク質には、非観血的な、生体外検出及び細胞生物学研究を促進するカルボキシル末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターは、エピソームの複製のためのＳＶ４０開始点及びラージＴ抗原を発現する株細胞における単純ベクターレスキュー（simple vector rescue）と共に、ｍＲＮＡ安定性を高めるためウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び転写終結シーケンスも含む。ネオマイシン耐性遺伝子は当該タンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子とコリシンＥ１オリジンは、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。アミノ末端ＧＦＰ融合をしたその他の構築物は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の全長に及ぶｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ中で作成される。
ＰＡＰｔａｇ：
１５８Ｐ１Ｄ７ ＯＲＦ、又はその部分をｐＡＰｔａｇ−５（GenHunter Corp.、ナッシュヴィル、テネシー州）にクローン化する。この構築物は、アミノ末端にＩｇＧＫシグナル配列を融合させている間、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のカルボキシル末端でアルカリホスファターゼ融合を生成する。アミノ末端ＩｇＧＫシグナル配列を含むアルカリホスファターゼが１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ末端に融合した構築物も生成される。生ずる組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、形質移入した哺乳類細胞の培養液中への分泌のため最適化され、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と相互に作用するリガンドやレセプター等のタンパク質を同定するために使用されうる。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターにより推進され、組換えタンパク質には、検出及び精製を促進するカルボキシル末端に融合したｍｙｃ及び６Ｘ Ｈｉｓも含まれる。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換え型タンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピリシン耐性遺伝子は、大腸菌におけるプラスミドの選択を可能にする。
ｐＴａｇ５：
１５８Ｐ１Ｄ７ ＯＲＦ、又はその部分をｐＴａｇ−５にクローン化する。この構築物は、ｐＡＰｔａｇ−５に類似するが、アルカリホスファターゼ融合をしない。この構築物は、検出及び親和性精製を促進するアミノ末端ＩｇＧＫシグナル配列並びにカルボキシル末端でのｍｙｃ及び６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグを含む１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を生成した。生ずる組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、形質移入した哺乳類細胞の培養液中への分泌のため最適化され、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と相互に作用するリガンドやレセプター等のタンパク質を同定するための免疫原又はリガンドとして使用された。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターにより推進される。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピリシン耐性遺伝子は、大腸菌におけるプラスミドの選択を可能にする。
１５８Ｐ１Ｄ７ｖ．１の細胞外ドメイン、アミノ酸１６−６０８、２７−３００、及び３０１−６０８をｐＴａｇ５構築物にクローン化して、１５８Ｐ１Ｄ７（１６−６０８）．ｐＴａｇ５、１５８Ｐ１Ｄ７（２７−３００）．ｐＴａｇ５、及び１５８Ｐ１Ｄ７（３０１−６０８）．ｐＴａｇ５のそれぞれを生成させた。２９３Ｔ細胞へのベクター移入後、１５８Ｐ１Ｄ７の細胞外ドメインの各種セグメントの発現及び分泌が確認された。
ＰｓｅｃＦｃ：
１５８Ｐ１Ｄ７ＯＲＦ、又はその部分もｐｓｅｃＦｃにクローン化した。ｐｓｅｃＦｃベクターを、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Invitrogen、カリフォルニア州）へクローニングすることによって、構築した。この構築物は、Ｎ末端にＩｇＧＫシグナル配列を融合させている間、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のカルボキシル末端でＩｇＧ１Ｆｃ融合を生成する。マウスのＩｇＧ１ Ｆｃ領域を利用する１５８Ｐ１Ｄ７融合も使用する。生ずる組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、形質移入した哺乳類細胞の培養液中への分泌のため最適化され、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質と相互に作用するリガンドやレセプター等のタンパク質を同定するため又は免疫原として使用されうる。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターにより推進される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子は、大腸菌におけるプラスミドの選択を可能にする。
１５８Ｐ１Ｄ７ｖ．１の細胞外ドメインアミノ酸１６−６０８をｐｓｅｃＦｃ構築物にクローン化して、１５８Ｐ１Ｄ７（１６−６０８）．ｐｓｅｃＦｃを生成させた。
ｐＳＲα構築物：
１５８Ｐ１Ｄ７ＯＲＦ、又はその部分をｐＳＲα構築物にクローン化して、恒常的に１５８Ｐ１Ｄ７を発現する哺乳類株細胞を生成させた。アンホトロピックなレトロウイルス及びエコトロピックなレトロウイルスを、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング系へのｐＳＲα構築物の形質移入又は２９３細胞へのｐＳＲα構築物及びヘルパープラスミド（除去されたパッケージングシークエンスを含む）の同時形質移入により、それぞれ生成させた。レトロウイルスは、クローン化した遺伝子、１５８Ｐ１Ｄ７の宿主細胞株への組込みをして、各種哺乳類株細胞を感染させるために使用される。タンパク質発現は、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ））により推進される。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳類細胞の選択を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子及びコリシンＥ１オリジンは、大腸菌におけるプラスミドの選択及び維持を可能にする。その後、レトロウイルスベクターは、例えば、ＰＣ３、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３又はｒａｔ−１細胞を用いて各種株細胞の感染及び生成をさせるために使用されうる。
完全な１５８Ｐ１Ｄ７ｖ．１のＯＲＦを、ｐＳＲα構築物にクローン化して、１５８Ｐ１Ｄ７．ｐＳＲαを生成させた。図２３は、ＵＭＵＣ３細胞への形質導入後の１５８Ｐ１Ｄ７．ｐＳＲαの発現を示す。ＵＭＵＣ−３細胞を、１５８Ｐ１Ｄ７．ｐＳＲα又はベクター制御により形質導入した。４０時間後、細胞を採取し、抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。結果として、細胞の表面上における１５８Ｐ１Ｄ７．ｐＳＲα構築物からの１５８Ｐ１Ｄ７の発現が確認される。
抗Ｆｌａｇ抗体を用いて検出を可能にするため、ＦＬＡＧＴＭタグ等のエピトープタグを１５８Ｐ１Ｄ７塩基配列のカルボキシル末端に融合するその他のｐＳＲα構築物を作成する。例えば、ＦＬＡＧＴＭシーケンス5’gat tac aag gat gac gac gat aag 3’（配列番号：４０）をＯＲＦの３’末端でクローニングプライマーに付加する。その他のｐＳＲα構築物を作成して、完全長１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端の両方のＧＦＰ及びｍｙｃ／６×Ｈｉｓ融合タンパク質を製造する。
その他のウイルスベクター：
ウイルス媒介送達（viral-mediated delivery）及び１５８Ｐ１Ｄ７の発現のため、その他の構築物を作成する。アデノウイルスベクター及びヘルペス単位複製配列ベクター等のウイルス送達系において、１５８Ｐ１Ｄ７の高レベルの発現を引き起こす高ウイルスタイターにする。１５８Ｐ１Ｄ７コード配列又はその断片をＰＣＲにより増幅し、ＡｓＥａｓｙシャトルベクター（Stratagene）にサブクローニングする。製造指示書に従って、組換え及びウイルスパッケージングをして、アデノウイルスベクターを生成する。一方、１５８Ｐ１Ｄ７コード配列又はその断片をＨＳＶ−１ベクター（Imgenex）にクローン化して、ヘルペスウイルスベクターを生成する。その後、ウイルスベクターは、ＰＣ３、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３又はｒａｔ−１細胞等の各種株細胞の感染のために使用される。
調節発現系：
１５８Ｐ１Ｄ７のコード配列、又はその部分をＴ−Ｒｅｘ系（T-Rex System）（Invitrogen）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系（GeneSwitch System）及び厳密制限したエクジソン系（Ecdysome System）（Stratagene）等の調節哺乳類発現系にクローン化して、哺乳類細胞における１５８Ｐ１Ｄ７の発現を制御する。これらの系は、一時的な及び濃度依存している組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＰＣ３、ＮＩＨ ３Ｔ３、２９３又はｒａｔ−１細胞等の各種株細胞における１５８Ｐ１Ｄ７の発現を制御するために使用される。
Ｂ．バキュロウイルス発現系
１５８Ｐ１Ｄ７ＯＲＦ、又はその部分を、Ｎ末端でＨｉｓ−タグを与えるバキュロウイルストランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Invitrogen）にクローン化して、バキュロウイルス発現系において組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を生成させる。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−１５８Ｐ１Ｄ７を、ＳＦ９（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞にヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Invitrogen）を用いて同時形質移入して、組換え型バクロウイルスを生成させる（詳細についてはInvitrogenの指示マニュアル参照）。その後、バキュロウイルスは、細胞上清から採取され、プラークアッセイ（試験）により精製される。
その後、組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を、ＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Invitrogen）を精製したバキュロウイルスに感染させることにより、生成させる。１５８Ｐ１Ｄ７に対して特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成するため、組換え型１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、精製されうるが、各種細胞ベースアッセイにおいて又は免疫原として使用されうる。
［実施例７］抗原性プロファイル及び二次構造
図１１（ａ）−（ｄ）、図１２（ａ）−（ｄ）、図１３（ａ）−（ｄ）、図１４（ａ）−（ｄ）、及び図１５（ａ）−（ｄ）は、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４、及び６のそれぞれの５つのアミノ酸プロファイル、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバー上のwww(.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)で検索されるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにアクセスして入手できる各評価を図示する。
これらのプロファイル：図１１、親水性、（Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828）；図１２、疎水性親水性指標（hydropathicity)、(Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J.Mol.Biol. 157: 105-132);図13、Percentage Accessible Residue(Janin J., 1979 Nature 277:491-492)；図１４、平均自由度(Average Flexibility)(Bhaskaran R., 及びPonnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255)；図１５、ベータターン(Beta-turn)(Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294)；及び任意にＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト等の技術として入手できるこれ以外もの、を使用して、１５８Ｐ１Ｄ７変異タンパク質のそれぞれの抗原領域を同定した。１５８Ｐ１Ｄ７変異体の上記アミノ酸プロファイルのそれぞれを、分析のため下記ＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメータを用いて生成した：１）９のウィンドサイズ；２）ウィンドセンターに比較して１００％重量のウィンドエッジ；並びに３）０と１の間になるよう標準化したアミノ酸プロファイル値。
親水性（図１１）、疎水性親水性指標（図１２）及びPercentage Accessible Residue（図１３）プロファイルを用いて、親水性アミノ酸のストレッチを決定した（すなわち、親水性及びPercentage Accessible Residueプロファイルにおいて０．５より大きい値、及び疎水性親水性指標プロファイルにおいて０．５より小さい値）。そのような領域は、水性環境にさらされ、タンパク質の表面上に存在する可能性があり、それゆえ抗体による等の、免疫認識に有用である。
平均自由度（図１４）及びベータターン（図１５）プロファイルはベータシート及びアルファヘリックス等の二次構造に限定されないアミノ酸（すなわち、ベータターンプロファイル及び平均自由度プロファイルにおいて０．５より大きい値）のストレッチを決定する。そのような領域も、タンパク質にさらされる可能性がよりあり、それゆえ抗体による等の免疫認識に有用である。
例えば図１１（ａ）−（ｄ）、図１２（ａ）−（ｄ）、図１３（ａ）−（ｄ）、図１４（ａ）−（ｄ）、及び図１５（ａ）−（ｄ）に示されるプロファイルにより表される１５８Ｐ１Ｄ７変異タンパク質の抗原シーケンスを用いて、免疫原、それらをコード化するペプチド又は核酸のどちらかを製造し、治療用及び診断用抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を生成させる。免疫原は、図２及び３に列挙された１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体からの、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０の何れか又は５０以上の連続するアミノ酸、或いはそれらをコード化する対応する核酸でありうる。特に、本発明のペプチド免疫原は、図１１の親水性プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含むように任意の整数で増加する図２及び３の少なくとの５つのアミノ酸のペプチド領域；図１２の疎水性親水性指標プロファイルにおいて０．５より小さい値を有するアミノ酸位置を含むように任意の整数で増加する図２及び３の少なくとの５つのアミノ酸のペプチド領域；図１３のパーセント接触可能残基プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含むように任意の整数で増加する図２及び３の少なくとの５つのアミノ酸のペプチド領域；図１４における平均自由度プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含むように任意の整数で増加する図２及び３の少なくとの５つのアミノ酸のペプチド領域；及び、図１５のベータターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含むように任意の整数で増加する図２及び３の少なくとの５つのアミノ酸のペプチド領域を含むことができる。本発明のペプチド免疫原は、前出のいくつかをコード化する核酸をも含むことができる。
本発明の全免疫原、ペプチド又は核酸を、ヒト単位の投与形態にすることができ、或いはヒトの生理機能に適合する製薬上の賦形剤を含む組成物で構成することができる。
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４、及び６の二次構造、すなわち、アルファヘリックスの予想される存在及び位置、伸長ストランド（extended strand）及びランダムコイルは、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバー（http://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされるＨＮＮ−階層ニューラルネットワーク法（HNN-Hierarchical Neural Network method)(NPS@:Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25, No 3[291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. 及びDeleage G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html）を用いて一次アミノ酸配列から予想される。分析から、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１が３５．３２％のアルファヘリックス、１５．９３％の伸長ストランド、及び４８．７５％のランダムコイルで構成されることが示される（図１６Ａ）。変異体３は、３４．９７％のアルファヘリックス、１６．９４％の伸長ストランド、及び４８．０９％のランダムコイルで構成される（図１６Ｂ）。変異体４は、２４．５６％のアルファヘリックス、２０．７６％の伸長ストランド、及び５４．６８％のランダムコイルで構成される（図１６Ｃ）。変異体６は、２８．９２％のアルファヘリックス、１７．９６％の伸長ストランド、及び５３．１２％のランダムコイルで構成される（図１６Ｄ）。
１５８Ｐ１Ｄ７変異タンパク質における膜内外に存在する電位差の分析を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバー（http://www.expasy.ch/tools/）からアクセスされる各種の膜内外予想アルゴリズム（transmembrane prediction algorithms）を用いて行った。ＴＭｐｒｅｄプログラムによる変異体１、３、４、及び６の分析結果を、それぞれ図１６Ｅ、１６Ｇ、１６Ｉ、１６Ｋに図示する。ＴＭＨＭＭプログラムによる変異体１、３、４、及び６の結果を、それぞれ図１６Ｆ、１６Ｈ、１６Ｉ、１６Ｌに図示する。ＴＭｐｒｅｄプログラム及びＴＭＨＭＭプログラムの両方が、変異体１及び３における１膜内外ドメインの存在を予想する。変異体４及び６は、膜内外ドメインを含むと予想されない。全ての変異体は、疎水性アミノ酸配列のストレッチ（配列）を、シグナルペプチドをコード化してもよいそれらのアミノ末端で、含む。他の構造予想プログラムによる１５８Ｐ１Ｄ７及び１５８Ｐ１Ｄ７変異体の分析については、表５６において概要を述べる。
［実施例８］１５８Ｐ１Ｄ７ポリクローナル抗体の生成
例えば、免疫化剤及び必要により、免疫賦活剤（アジュバント）の１又はそれ以上の注入によって、哺乳類において、ポリクローナル抗体が生じうる。一般的には、免疫化剤及び／又はアジュバントは、多様な皮下又は腹腔内注射により哺乳類に注射されるであろう。完全長の１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体で免疫化することに加えて、アミノ酸配列分析に基づき抗原性であり、免疫化した宿主の免疫系による認識に利用できるという特徴を含む免疫原のデザインに、コンピュータアルゴリズムが用いられる（「抗原性プロファイル及び二次構造」と題した実施例参照）。そのような領域は、親水性であり、自由（フレキシブル）であり、ベータターン高次構造にあると予想され、タンパク質の表面上に露出されると予想されるであろう（１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体１、３、４、及び６のそのような領域を示すアミノ酸プロファイルに関する図１１、図１２、図１３、図１４、又は図１５参照）。
例えば、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の親水性で、自由な、ベータターンの領域を含む組換え型の細菌性融合タンパク質又はペプチドを抗原として使用して、ニュージーランドホワイトウサギ（New Zealand White rabbit）のポリクローナル抗体又は実施例９において記載されたモノクローナル抗体が生成される。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１において、そのような領域は、アミノ酸２５−４５、アミノ酸２５０−３８５、及びアミノ酸６９４−７３０を含むが、これらに限定されない。それは、免疫化剤を、免疫化されている哺乳類において免疫原性であることが知られているタンパク質と結合させることに有用である。そのような抗原性タンパク質の例には、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれるが、これらに限定されない。一つの形態として、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１のアミノ酸２７４−２８５をコード化するペプチドを合成し、ＫＬＨと結合させた。このペプチドは、その後、免疫原として使用される。一方、免疫化剤は、１５８Ｐ１Ｄ７変異タンパク質の全部若しくは一部、その類似物又は融合タンパク質を含んでもよい。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１アミノ酸配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＨＩＳタグ融合タンパク質等の、技術としてよく知られている各種融合タンパク質のパートナーの何れかと融合されうる。別の形態として、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１のアミノ酸２７−３００は、組換え技術及びｐＧＥＸ発現ベクターを用いてＧＳＴと融合され、発現され、精製され、ウサギを免疫化するために使用される。そのような融合タンパク質は、適当なアフィニティーマトリックスを用いて誘導した細菌から精製される。
用いてもよい他の組換え型細菌性融合タンパク質には、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、又は免疫グロブリン定常領域が含まれる（「原核系における１５８Ｐ１Ｄ７の製造」と題したセクション及び分子生物学におけるカレントプロトコル（Current Protocols In Molecular Biology）、Volume 2、Unit 16、Frederick M. Ausubulら編、1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmair,L., Damle, N., Ledbetter, L. (1991) J.Exp. Med. 174,561-566参照）。
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳類発現タンパク質抗原も使用される。これらの抗原は、Ｔａｇ５及びＦｃ融合ベクター（「真核系における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の製造」と題したセクション参照）等の哺乳類発現ベクターから発現され、未変性タンパク質において認められる糖修飾等の翻訳後修飾を維持する。一つの形態として、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１のアミノ酸１６−６０８を、Ｔａｇ５哺乳類分泌ベクターにクローン化し、２９３Ｔ細胞において発現させた。組換えタンパク質を、組換えベクターを安定して発現する２９３Ｔの組織培養上清から、金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。精製したＴａｇ５１５８Ｐ１Ｄ７変異体１タンパク質は、その後免疫原として使用される。免疫化プロトコルを通じて、それは、抗原を、宿主動物の免疫応答を高めるアジュバントに混合又は乳化するのに有用である。アジュバントの例には、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ）、合成トレハロースジコリノミコレートが含まれるが、これらに限定されない。
一般的なプロトコルでは、ウサギが、２００μｇまで、典型的には１００−２００μｇの、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に混合したＫＬＨと結合した融合タンパク質又はペプチドで、先ず皮下免疫化される。ウサギは、その後、２週間毎に、２００μｇまで、典型的には１００−２００μｇの、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中の免疫原を皮下注射される。試験血（test bleed）は、各免疫化後、約７−１０日とられ、ＥｌＩＳＡにより抗血清のタイターをモニターするために使用される。
完全長１５８Ｐ１Ｄ７変異体１ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクター（Invitrogen、「真核系における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の製造」と題した実施例参照）にクローン化して、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１タンパク質のＧＳＴ融合での免疫化から誘導したウサギ血清等の免疫血清の反応性及び特異性を試験する。２９３Ｔへの構築物の形質移入後、細胞ライセートを、抗１５８Ｐ１Ｄ７血清及び抗Ｈｉｓ抗体（Santa Cruz Biotechnologies、サンタクルーズ、カリフォルニア州）でプローブして、変性１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質に対する特異的な反応性を、ウエスタンブロット技術を用いて測定する。さらに、免疫血清を、２９３Ｔ及び他の組換え型１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞に対する螢光顕微鏡検査、フローサイトメトリー並びにイムノプレシピテーションにより試験して、未変性タンパク質の特異的な認識を測定する。内在的に１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞を用いるウエスタンブロット、螢光顕微鏡検査、及びフローサイトメトリー技術も、反応性及び特異性を試験するために行われる。ＧＳＴ及びＭＢＰ融合タンパク質等の１５８Ｐ１Ｄ７変異融合タンパク質で免疫化したウサギからの抗血清は、融合パートナーを単独で又は無関係の融合タンパク質と関連して含むアフィニティーカラム中への通過による融合パートナーシーケンスに対する反応性の抗体の除去により精製される。例えば、ＧＳＴ−１５８Ｐ１Ｄ７変異体１融合タンパク質から誘導した抗血清は、ＡｆｆｉＧｅｌマトリックス（BioRad、Hercules、カリフォルニア）と共有結合したＧＳＴタンパク質のカラム中への通過により先ず精製される。抗血清は、その後、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックスと共有結合したＭＢＰ−１５８Ｐ１Ｄ７から構成されるカラム中への通過によりアフィニティー精製される。血清は、その後さらにタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーにより精製されて、ＩｇＧ画分が単離される。他のＨｉｓタグ抗原及びペプチド免疫化したウサギからの血清並びに融合パートナー除去血清は、原タンパク質免疫原又は遊離ペプチドから構成されるカラムマトリックス中への通過によりアフィニティー精製される。
［実施例９］１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の生成
一つの形態において、１５８Ｐ１Ｄ７変異体に対する治療ｍＡｂｓは、各変異タンパク質に対して特異的な、或いは１５８Ｐ１Ｄ７変異体の生物学的機能を結びつけ、インターナライズし、妨害し、又は調節するであろう変異体、例えば、リガンドとの相互作用を妨害するであろう変異体と、結合パートナーとの間に共通したシーケンスに対して特異的なエピトープと反応するｍＡｂｓを含む。そのようなｍＡｂｓの生成のための免疫原には、細胞外ドメイン若しくは全１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体シーケンス、機能的モチーフを含むと予想される領域、並びにアミノ酸配列のコンピュータ分析から抗原性であると予想される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質変異体の領域をコード化する又は含むデザインされた免疫原が含まれる（例えば、図１１、図１２、図１３、図１４、又は図１５、及び「抗原性プロファイル及び二次構造」と題した実施例参照）。免疫原には、ペプチド、組換え型細菌性タンパク質、及び哺乳類発現Ｔａｇ５タンパク質並びにヒト及びマウスＩｇＧ ＦＣ融合タンパク質が含まれる。さらに、ｐＴＡＧ５タンパク質、２９３Ｔ−１５８Ｐ１Ｄ７変異体１又は３Ｔ３、ＲＡＴ、又は３００．１９−１５８Ｐ１Ｄ７変異体１マウスＰｒｅ−Ｂ細胞等の各１５８Ｐ１Ｄ７変異体を高レベルで発現するよう操作されたｐＴＡＧ５細胞をコード化するＤＮＡベクターを使用して、マウスを免疫化する。
１５８Ｐ１Ｄ７変異体に対するｍＡｂｓを生成させるため、マウスは、先ず、一般的には１０−５０μｇのタンパク質免疫原又は完全フロインドアジュバント中に混合した１０７個の１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞で、腹腔内（ＩＰ）免疫化される。マウスは、その後、続いて２−４週間毎一般的には１０−５０μｇのタンパク質免疫原又は不完全フロインドアジュバント中に混合した１０７個の１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞で、ＩＰ免疫化される。一方、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントが、免疫化において使用される。上記タンパク質及び細胞ベース免疫化ストラテジーに加えて、１５８Ｐ１Ｄ７変異体シーケンスをコード化する哺乳類発現ベクターを使用して、プラスミドＤＮＡの直接注入によってマウスを免疫化する、ＤＮＡベース免疫化プロトコルが用いられる。例えば、変異体１の１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸１６−６０８をＴａｇ５哺乳類分泌ベクターにクローン化し、組換えベクターを免疫原として使用した。別の実施例として、同一のアミノ酸を、１５８Ｐ１Ｄ７変異体１シーケンスがアミノ末端でＩｇＫリーダー配列と、カルボキシル末端でヒト又はマウスＩｇＧ Ｆｃ領域のコード配列と融合されるＦＣ融合分泌ベクターにクローン化した。組換えベクターを、その後、免疫原として使用した。プラスミド免疫化プロトコルを、同一のベクターから発現した精製タンパク質と及び各１５８Ｐ１Ｄ７変異体を発現する細胞とを組み合わせて使用した。
免疫化プロトコルを通じて、試験血を、注射後、約７−１０日とって、免疫応答のタイター及び特異性をモニターする。適当な反応性及び特異性が、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、イムノプレシピテーション、螢光顕微鏡検査、及びフローサイトメトリー分析で測定して得られたら、その後、融合及びハイブリドーマ生成が、技術としてよく知られている確立した処理法で、行われる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８）。
１５８Ｐ１Ｄ７変異体１モノクローナル抗体を生成するための一つの形態として、アミノ酸２７４−２８５をコード化するペプチドを合成し、ＫＬＨと結合させ、免疫原として使用した。遊離ペプチドにおけるＥＬＳＡを使用して、免疫反応性クローンを同定した。完全長１５８Ｐ１Ｄ７変異体１タンパク質に対するモノクローナル抗体の反応性及び特異性を、組換え型かつ内在性発現１５８Ｐ１Ｄ７変異体１細胞を用いて、ウエスタンブロッティング、イムノプレシピテーション、及びフローサイトメトリーによりモニターした（図２２、２３、２４、２５、及び２８参照）。
１５８Ｐ１Ｄ７変異体１特異性モノクローナル抗体の結合親和力を、標準技術を用いて測定した。親和力測定は、結合しているエピトープに対する抗体の強度を数量化し、当業者において理解されているように、１５８Ｐ１Ｄ７変異体モノクローナル抗体が診断又は治療的使用に好ましいという規定を裏づけるために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Uppsal、Sweden）は、結合親和力を測定するために、好ましい方法である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは表面プラスモン共鳴（（ＳＰＲ），Welford K. 1991、 Opt. Quant, Elect. 23:1;Morton及びMyszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）は、リアルタイムで生体分子相互作用をモニターするために、使用する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析から簡便に結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、及びアフィニティ定数が得られる。１５８Ｐ１Ｄ７変異体１モノクローナル抗体のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を表５７に示す。
他の１５８Ｐ１Ｄ７変異体に特異的なモノクローナル抗体を生成させるため、変異体に特有のアミノ酸配列をコード化するように免疫原をデザインする。一つの形態として、変異体における選択的スプライシングにより生成する特有のシーケンスを含むペプチド又は細菌性融合タンパク質が、作成される。一つの例として、アミノ酸６７３−６９３等の、１５８Ｐ１Ｄ７変異体３におけるアミノ酸６８２及び６８３を含む連続したシーケンスをコード化するペプチドが使用される。別の形態として、アミノ酸３６９−３９１等の、１５８Ｐ１Ｄ７変異体６におけるアミノ酸３７９−３８１を含む連続したシーケンスをコード化するペプチドが使用される。抗体に特異的な各変異体を認識し、細胞において発現する完全長変異タンパク質をも認識するハイブリドーマが、その後選択される。そのような選択では、ウエスタンブロッティング、イムノプレシピテーション、及びフローサイトメトリー等の前記イムノアッセイが利用される。
下記プロトコルを用いて、１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体を生成させた。５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２μｇのＱｕｉａｇｅｎ ＩｍｍｕｍｅＥａｓｙＴＭアジュバント中にあるペプチドを用いて皮下免疫化した。免疫化は、２週間隔離して行った。使用したペプチドは、Ｃ’末端でＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）と結合するシーケンスＥＥＨＥＤＰＳＧＳＬＨＬ（配列番号：４１）を有するアミノ酸２７４−２８５からなる１２アミノ酸ペプチドであった。
免疫化したマウスの脾臓からのＢ細胞を、ポリエチレングリコールの影響下で、融合パートナーＳｐ２／０を用いて、融合した。ハイブリドーマを製造する抗体を、ペプチドに対して特異的な結合を示すペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートにおいてスクリーニングすることのよって、及びその後１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞についてのＦＡＣＳによって選択した。この製造及び同定した４つの１５８Ｐ１Ｄ７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）特異抗体を、Ｍ１５−６８（２）１８．１．１；Ｍ１５−６８（２）２２．１．１；Ｍ１５−６８（２）３１．１．１及びＭ１５−６８（２）１０２．１．１と命名した。
Ｍ１５−６８（２）１８．１．１と命名した抗体を、２００４年２月６日に、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、P.O.Box 1549、マナッサス、ヴァージニア州２０１１０−２２０９に送った。これは、受諾番号ＰＴＡ−５８０１に指定された。
これら４つの抗体の特徴を、表５７に示す。
下記プロトコルを用いて、Ｍ１５−６８（２）１８．１．１抗体をクローン化した。Ｍ１５−６８（２）１８．１．１ハイブリドーマ細胞を、トリゾール試薬（Life Technologies、Gibco BRL）を用いて溶解させた。全ＲＮＡを、精製し、定量した。第一ストランドｃＤＮＡを、ＧｉｂｃｏＢＲＬスーパースクリプトプレ増幅システム（Superscript Preamplification System）を用いて、オリゴ（チミジン）１２−１８初回免疫で全ＲＮＡから生成させた。第一ストランドｃＤＮＡを、マウスＩｇ可変重鎖プライマー、及びマウスＩｇ可変軽鎖プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクター（Stratagene、ラホーヤ）クローン化した。いくつかのクローンを、配列決定し、可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖領域を測定した。Ｍ１５−６８（２）１８．１．１可変重鎖及び可変軽鎖領域の核酸及びアミノ酸配列を、図３４Ａ及び３４Ｂ並びに図３５Ａ及び３５Ｂに示す。
［実施例１０］ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ結合アッセイ
開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２０１２７及びＷＯ９４／０３２０５；Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998);Sidney et al., J. Immunol. 154:247 (1995);Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813(1994)）に従って精製したＨＬＡ分子をを用いてＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ結合アッセイを行う。簡単には、精製したＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）が各種非標識ペプチドインヒビター及び前記１−１０ｎＭの１２５Ｉ−放射標識プローブペプチドとともにインキュベートされる。インキュベート後、ＭＨＣペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、ペプチド結合の分画を測定する。一般には、予備実験として、各ＭＨＣ調製物を固定量の放射標識ペプチドの存在下滴定して、全放射能の１０−２０％を結合するために必要なＨＬＡ分子の濃度を測定する。全後発阻害（all subsequent inhibition）及びダイレクト結合アッセイ（direct binding assay）を、これらのＨＬＡ濃度を用いて行う。
これらの条件［標識］＜［ＨＬＡ］及びＩＣ５０≧［ＨＬＡ］の下から、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の合理的な近似値である。ペプチドインヒビターは、一般には、１２０μｇ／ｍｌから１．２ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度で試験され、２〜４の完全に独立した実験で試験される。各試験したペプチド（典型的には放射標識プローブペプチドの非標識のもの）用のＩＣ５０の阻害のためのポジティブコントロールのＩＣ５０を動かすことにより各ペプチドについて相対結合数を計算して、異なる実験において得られたデータの比較を可能にする。データベースの目的、及び相互実験比較のため相対結合数を編集する。これらの値は、その後、対象となるペプチドの相対結合による阻害のためのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを動かすことによりＩＣ５０ｎＭ値に入れて変換されうる。データ編集の方法は、異なる日に、又は精製したＭＨＣの異なるロットについて試験したペプチドを比較することに対して、正確であり、一貫している
上記結合アッセイの概要を使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ及び／又はＨＬＡモチーフベアリングペプチドを分析してもよい。
［実施例１１］ＨＬＡスーパーモチーフ及び／又はモチーフベアリングＣＴＬ候補エピトープの同定
本発明のＨＬＡワクチン組成物は、多様なエピトープを含みうる。当該多様なエピトープは、多様なＨＬＡスーパーモチーフ又はモチーフを含むことで、個体群適用範囲（population coverage）を広範にしうる。この実験により、そのようなワクチン組成物中の含有物のためスーパーモチーフ及びモチーフベアリングエピトープの同定並びに確認が示される。個体群適用範囲の計算は、以下に記載のストラテジーを用いて行われる。
スーパーモチーフ及び／又はモチーフベアリングエピトープの同定のためのコンピュータサーチ及びアルゴリズム
サーチを行って、「抗原性プロファイル」と題した実施例におけるモチーフベアリングペプチドシーケンスを同定した。表５〜１８及び２２〜４９では、図２及び図３に示される１５８Ｐ１Ｄ７の遺伝子産物からのタンパク質シーケンスデータが使用される。
ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩスーパーモチーフ又はモチーフを有するエピトープに対するコンピュータサーチは、下記のようにして行った。全翻訳した１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質配列を、テキストストリングサーチプログラム（text string search program）を用いて分析して、適当なＨＬＡ結合モチーフを含むポテンシャルペプチドシーケンスを同定する；そのようなプログラムは、公知のモチーフ／スーパーモチーフの開示による技術情報に従って容易に作成される。さらに、そのような計算は、頭の中でなされうる。
同定したＡ２−、Ａ３−、及びＤＲ−スーパーモチーフシーケンスを、多項式アルゴリズムを用いて採点して、それらのＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合する能力を予想する。これらの多項式アルゴリズムは、異なる位置での異なるアミノ酸の影響の原因であり、本質的にペプチドＨＬＡ分子の全親和力（又はΔＧ）がそのタイプの一次多項式関数として近似されうるという前提に基づいている：
“ΔＧ”＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．．．．×ａｎｉ
但し、ａｊｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドのシーケンスに沿った生じた位置（ｉ）での生じたアミノ酸（ｊ）の存在の効果を表す係数である。この方法の重大な仮定は、各位置での効果が本質的に互いに独立している（例えば、個々の側鎖の独立結合）というものである。ペプチドにおける位置ｉで残基ｊが生ずるとき、ペプチドの残部のシーケンスに関係なくペプチド結合の自由エネルギーに一定量ｊｉを与えると考えられる。
特異的なアルゴリズム係数の導出の方法は、Gulukota et al., J. Mol. Biol. 267: 1258-126, 1997(Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93,1996;及びSouthwood et al., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998参照）に記載されている。簡単には、全ｉ位置に対して、アンカー及び非アンカー同様に、ｊを持つ全ペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾何的な手段が、基の残部を基準として計算され、ｊｉの概算として用いられる。クラスＩＩペプチドに対して、多様なアライメントが可能であれば、最も高い得点のアライメントのみが利用され、その後反復処理される。ペプチドのシーケンスに対応するＡＲＢ値を増加させて、試験のセットにおいて生じたペプチドのアルゴリズムスコアを計算する。この産物が選択した閾値を超える場合は、ペプチドは結合すると予想される。適当な閾値は選択される。目的とする予想の厳密性の度合いの関数として選択される。
ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交さ反応性ペプチドの選択
１５８Ｐ１Ｄ７からの完全なタンパク質シーケンスを、モチーフ同定ソフトウェアを利用してスキャンして、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主アンカー特異性を含む８−、９−、１０−、又は１１−マーシーケンスを同定する。一般に、これらのシーケンスは、その後前記記載のプロトコルを用いて採点され、ポジティブスコアリングシーケンスに対応するペプチドは合成され、生体外で精製したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を結合させる能力について試験される（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子と考えられる）。
これらのペプチドは、その後、別のＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、及びＡ＊６８０２）と結合する能力について試験される。試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも３つと結合するペプチドは、一般に、Ａ２スーパータイプ交さ反応性結合とみなされる。好ましいペプチドは、３又はそれ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子と、同等か又は５００ｎＭより小さい親和力で結合する。
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフベアリングエピトープの選択
上記スキャンした１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質シーケンスを、ＨＬＡ−Ａ３−スーパーモチーフ一次アンカーを有するペプチドの存在についても評価する。ＨＬＡ Ａ３スーパーモチーフベアリングシーケンスに対応するペプチドは、その後、合成され、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１及びＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子との結合について試験される。その分子は二つの最も普及しているＡ３スーパータイプ対立遺伝子によってコード化した。≦５００ｎＭ、多くの場合≦２００ｎＭ、結合親和力で二つの対立遺伝子のうち少なくとも１つを結合するペプチドを、その後、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、及びＡ＊６８０１）に対する結合交さ反応性について試験して、試験した５つのＨＬＡ−Ａ３−スーパータイプ分子のうち少なくとも３つを結合することができるペプチドを同定する。
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフベアリングエピトープの選択
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、ＨＬＡ−Ｂ７−スーパーモチーフを有する８−、９−、１０−、又は１１−マーペプチドの存在についても分析される。対応するペプチドは、合成され、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２との結合について試験される。その分子は最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、プロトタイプＢ７スーパータイプ対立遺伝子）によってコード化した。≦５００ｎＭのＩＣ５０を用いてＢ＊７０２を結合するペプチドは、標準的な方法を用いて同定される。これらのペプチドは、その後他の共通のＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１、及びＢ＊５４０１）との結合のため試験される。それにより、試験した５つのＢ７スーパタイプ対立遺伝子のうち３又はそれ以上と結合可能なペプチドが同定される。
Ａ１及びＡ２４モチーフベアリングエピトープの選択
ＨＬＡ−Ａ１−及び−Ａ２４エピトープワクチン組成物に混合させて、さらに個体群適用範囲をも向上させることができる。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の分析を行って、ＨＬＡ−Ａ１−及びＡ２４−モチーフ含有シーケンスをも同定することができる。
他のモチーフ及び／又はスーパーモチーフを有する高親和力及び／又は交さ反応性結合エピトープは、類似の方法論を用いて同定される。
［実施例１２］免疫原性の確認
本願において上記のように同定した交さ反応性候補ＣＴＬＡ２スーパーモチーフベアリングペプチドを選択して、生体外免疫原性を確認する。下記方法論を用いて確認を行う：
細胞スクリーニングの標的株細胞
ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子をＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ無発現変異ヒトＢ−リンパ芽球腫株細胞（null mutant human B-lymphoblastoid cell line）７２１：２２１に導入することにより製造した２２１Ａ２．１株細胞を、ペプチド充填標的（peptide-loaded target）として使用して、ＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴＬの活性を測定した。この株細胞を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液中で生長させる。対象となる抗原、又は対象となる抗原をコード化する遺伝子を含む形質移入体を発現する細胞を標的細胞として使用して、内在性抗原を認識するペプチド特異的ＣＴＬの能力を確認する。
一次ＣＴＬ誘導培養物：
樹状細胞（ＤＣ）の生成：ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を含むＲＰＭＩ中にて解凍し、２回洗浄し、完全培地（５％ＡＢヒト血清加ＲＰＭＩ−１６４０、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン）中に再懸濁させる。単球を、６ウェルプレートに、１０×１０６ ＰＢＭＣ／ウェルを蒔くことにより精製する。３７℃で２時間後、非接着細胞を、プレートを緩やかに振とうし、上清を吸引することにより、取り除く。ウェルを、３ｍｌ ＲＰＭＩで合計３回洗浄して、非接着細胞及び軽く接着した細胞の大部分を取り除く。５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完全培地を、その後、各ウェルに加える。ＴＮＦαを、７５ｎｇ／ｍｌで、６日目に、ＤＣに加え、その細胞を、７日目にＣＴＬ誘導培養物として使用する。
ＤＣ及びペプチドを含むＣＴＬの誘導：ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免疫磁気ビーズ（Dynabeads（登録商標） M-450）及びdetacha-bead（登録商標）試薬を用いてポジティブ選択により分離する。一般的に約２００−２５０×１０６個のＰＢＭＣを処理して、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を（４８ウェルプレート培養のために十分に）を得る。簡単には、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を含むＲＰＭＩ中にて解凍し、１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、２０×１０６セル／ｍｌの濃度でＰＢＳ／１％ＡＢ血清中に再懸濁させる。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清で３回洗浄し、細胞（１４０μｌビーズ／２０×１０６セル）に加え、連続混合しながら４℃で１時間インキュベートする。ビーズ及び細胞（セル）を、ＰＢＳ／ＡＢ血清で４回洗浄して、非接着細胞を取り除き、１００μｌ／ｍｌのdetacha-bead（登録商標）試薬及び３０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼを含むＰＢＳ／ＡＢ血清中に１００×１０６セル／ｍｌで（最初の細胞数に基づく）再懸濁させる。混合物を、連続混合しながら室温で１時間インキュベートする。ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／デオキシリボヌクレアーゼで再度洗浄して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を採取する。ＤＣを、採取し、１３００ｒｐｍで５−７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、計数し、２０℃で４時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下、１−２×１０６／ｍｌの細胞濃度で４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。その後、ＤＣに放射線（４２００ｒａｄ）を照射し、これを培地で１回洗浄し、再度計数する。
誘導培養物の準備：０．２５ｍｌサイトカイン生成したＤＣ（１×１０６セル／ｍｌで）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下、４８ウェルプレートの各ウェル中に０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞と共に共培養する。組換え型ヒトＩＬ−１０を、翌日、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、ヒトＩＬ−２を４８時間後１０ＩＵ／ｍｌで添加した。
ペプチドパルスした接着細胞誘導培養物の再刺激：一次導入後７及び１４日に、細胞を、ペプチドパルスした接着細胞（peptide-pulsed adherent cell）を用いて再刺激する。ＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ及びデオキシリボヌクレアーゼを用いて２回洗浄する。細胞を５×１０６セル／ｍｌで再懸濁させ、これに〜４２００ｒａｄで放射線を照射する。ＰＢＭＣを、ウェル当たり０．５ｍｌの完全培地中に２×１０６で蒔き、３７℃で２時間インキュベートする。プレートを、ＲＰＭＩを用いてこのプレートを軽くたたくことによって２回洗浄して、非接着細胞を取り除き、接着細胞は、３７℃で２時間、ウェル当たり０．２５ｍｌのＲＰＭ／５％ＡＢ中で、３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下、１０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。各ウェルからのペプチド溶液を吸引し、ウェルを、ＲＰＭＩを用いて１回洗浄する。培地の大部分を、誘導培養物（ＣＤ８＋細胞）から取り除き、新鮮な培地を用いて５ｍｌにする。細胞を、その後、ペプチドパルスした接着細胞を含むウェルに移す。２４時間後、組換え型ヒトＩＬ−１０を、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加え、組換え型ヒトＩＬ−２を翌日、２−３日後に再度５０ＩＵ／ｍｌで加える（Tsai et al., Critical Reviews in immunology 18(1-2):65-75,1998）。７日後、培養物を、５１Ｃｒ遊離試験でＣＴＬ活性測定のため検定する。いくつかの実験において、培養物を、二次刺激の際に、生体内原位置ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡでペプチド特異認識測定のため検定し、その７日後、内在性認識の検定をする。増殖後、活性を、並列比較の両アッセイ（both assays for a side-by-side comparison）で測定する。
５１ Ｃｒ遊離によるＣＴＬ溶解性活性の測定
二次再刺激後７日に、細胞障害性を、標準（５ｈｒ）５１Ｃｒ遊離試験で単一Ｅ：Ｔで個々のウェルを試験することによって、測定する。ペプチドパルスした標的（ターゲット）を、３７℃で一晩１０μｇ／ｍｌペプチドとともに細胞をインキュベートすることにより調製する。
接着標的細胞を、トリプシンＥＲＴＡを用いて培養フラスコから取り除く。標的細胞を、３７℃で１時間、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄｕｐｏｎｔ、ウィルミントン、デラウェア州）で標識化する。標識化した標的細胞を、ｍｌ当たり１０６で再懸濁させ、３．３×１０６／ｍｌ（ＮＫ感受性赤芽球腫株細胞を使用して非特異的溶解を減少させた）の濃度でＫ５６２細胞を用いて１：１０希釈する。標的細胞（１００μｌ）及びエフェクター（１００μｌ）を９６ウェル丸底プレート中に蒔き、３７℃で５時間インキュベートする。その時、１００μｌの上清を各ウェルから採取し、パーセントの溶解を、式に従って求める：
［（試験サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ遊離サンプルのｃｐｍ）／（最大５１Ｃｒ遊離サンプルのｃｐｍ−自発的な５１Ｃｒ遊離サンプルのｃｐｍ）］×１００
最大の及び自発的な遊離を、１％トリトンＸ−１００及び培地単独のそれぞれとともに、標識化した標的をインキュベートすることによって測定する。陽性培養物は、特異的溶解（サンプル−バックグラウンド）が個々のウェルの場合に１０％以上であり、かつ増殖した培養物を測定するとき２つの最も高いＥ：Ｔ比で１５％以上であるものと定義される。
ペプチド特異性及び内在性認識の指標としてのヒトＩＦＮγ産物の生体内原位置測定
Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、４℃で一晩、マウス抗−ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）で被覆する。プレートを、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋−遊離ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、２時間、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで遮断し、その後、ＣＴＬ（１００μｌ／ウェル）及び標的（１００μｌ／ウェル）を、標準物質及びブランク（培地のみを受け入れる）用の空のウェルを残して、各ウェルに添加する。標的細胞、ペプチドパルスした又は内在性のどちらかの標的を、１×１０６セル／ｍｌの濃度で使用する。プレートを、５％ＣＯ２を用いて３７℃で４８時間インキュベートする。
組換え型ヒトＩＮＦ−γを、４００ｐｇ又は１２００ｐｇ／１００μｌ／ウェルで開始して標準ウェルに添加する。プレートを、３７℃で２時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのビオチン化したマウス抗−ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中２μｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間、インキュベートする。再度の洗浄後、１００μｌのＨＲＰストレプトアビジン（１：４０００）を加える。プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをその後、洗浄バッファで６回洗浄し、１００μｌ／ウェル発育溶液（developing solution）（ＴＭＢ １：１）を加え、そのプレートを、５−１５分間発育させる。反応を、５０μｌ／ウェル １Ｍ Ｈ３ＰＯ４で用いて停止させ、ＯＤ４５０で判断する。培養物は、少なくとも５０ｐｇのＩＦＮ−γ／ウェルの上記バックグラウンドを測定し、２回とも発現のバックグラウンドレベルである場合には、陽性と考えられる。
ＣＴＬ増殖
ペプチドパルスした標的及び／又は腫瘍標的に対して特異的溶解性活性を示すそれらの培養物を、抗ＣＤ３で２週間にわたって増殖させる。簡単には、５×１０４個のＣＤ８＋細胞を下記のものを含むＴ２５フラスコに加える：ｍｌ当たり１×１０６放射線照射した（４２００ｒａｄ）ＰＢＭＣ（自家又は同種異系）、ｍｌ当たり２×１０５放射線照射した（８０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換した細胞、及び、１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中ｍｌ当たり３０ｎｇでのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。組換え型ヒトＩＬ２を、２４時間後、最終濃度２００ＩＵ／ｍｌで加え、その後３日ごとに５０ＩＵ／ｍｌで新鮮な培地と共に加える。細胞濃度が１×１０６／ｍｌを超える場合には、細胞を分割し、増殖前と同一の標的を用いて、５１Ｃｒ遊離試験で３０、１０、３、及び１：１のＥ：Ｔ比で又は生体内原位置ＩＦＮγ試験で１×１０６／ｍｌで、１３から１５日の間に、培養物を検定する。
培養物を、下記のように抗ＣＤ３＋の存在下、増殖させる。ペプチド及び内在性標的に対して特異的溶解性活性を示すそれらの培養物を選択し、５×１０４個のＣＤ８＋細胞を下記のものを含むＴ２５フラスコに加える：３７℃で２時間、１０μｇ／ｍｌペプチドを用いてペプチドパルス及び放射線照射しておいたｍｌ当たり１×１０６自家ＰＢＭＣ；ｍｌ当たり２×１０５放射線照射した（８０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換した細胞、１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸（amino acid(AA)）、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、Ｌ−グルタミン及びゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０。
Ａ２スーパーモチーフベアリングペプチドの免疫原性
Ａ２スーパーモチーフ交さ反応性結合ペプチドを、ペプチド特異的ＣＴＬを正常な固体において誘導する能力を測定するための細胞試験で試験する。この分析において、ペプチドは、ペプチド特異的ＣＴＬを少なくとも固体において誘導し、好ましくは、さらに発現したペプチドを内在的に認識する場合には、一般的には、エピトープであると考えられる。
免疫原性を、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する腫瘍を有する患者から分離したＰＢＭＣを用いて確認することもできる。簡単には、ＰＢＭＣが、患者から分離され、ペプチドパルスした単球で再刺激され、ペプチドパルスした標的細胞、並びに抗原を内在的に発現する形質移入細胞を認識する能力について検定される。
Ａ ＊ ０３／Ａ１１免疫原性の評価
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフベアリング交さ反応性結合ペプチドも、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用したものと類似の方法論を用いて、免疫原性について評価される。
Ｂ７免疫原性の評価
本願において示したように同定したＢ７スーパータイプ交さ反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングが、Ａ２−及びＡ３−スーパーモチーフベアリングペプチドの確認と類似の方法で確認される。
他のスーパーモチーフ／モチーフ、例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４等を有するペプチドも同様の方法論を用いて確認される。
［実施例１３］類似物の作成による未変性エピトープの結合能力を改善するための伸長スーパーモチーフ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）の実行
本願において示されるように、ＨＬＡモチーフ及びスーパーモチーフ（一次及び／又は二次残基を含む）は、高交さ反応未変性ペプチドの同定及び調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフ及びスーパーモチーフの決定は、誰にも、一定の特性、例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の基の範囲内での、より大きな交さ反応性、及び／又はそれらのＨＬＡ分子のいくつか又は全部に対する、より大きな結合親和力をペプチドに与えるようアナログされうる未変性ペプチドシーケンスの範囲内で残基を同定することによって交さ反応性エピトープを高度に設計することを可能にする。結合親和力において調節を示すようペプチドをアナロジングする例を、本実施例中に示す。
一次アンカー残基でのアナロジング
ペプチド設計ストラテジーを、エピトープの交さ反応性をさらに増強するため実行する。例えば、Ａ２スーパーモチーフベアリングペプチドの主アンカーを変化させて、例えば、好ましくはＬ、Ｉ、Ｖ、又はＭを２位に、Ｉ又はＶをＣ末端に導入する。
ペプチド類似物の交さ反応性を分析すべく、各設計した類似物は、プロトタイプＡ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ＊０２０１との結合について、その後Ａ＊０２０１結合能力が維持される場合には、Ａ２スーパータイプ交さ反応性について先ず試験される。
一方、ペプチドは、一つの又は全てのスーパータイプメンバーを結合すると確認され、その後、いくつか（又はそれ以上）のスーパータイプメンバーに対する結合親和力を調節して個体群適用範囲を追加するようアナログされる。
細胞スクリーニング分析における免疫原のための類似物の選択は、一般には、より多くのうち３つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する、すなわち５０００ｎｍ以下のＩＣ５０で結合する親（ｐａｒｅｎｔ）野生型（ＷＴ）ペプチドの能力により制限される。この規定の原理は、ＷＴペプチドは、生物学的に適切である十分な量で、内在的に存在しなければならないというものである。アナロジングしたペプチドでは、免疫原性、及び親エピトープに特異的なＴ細胞による交さ反応性が増強されることが示されている（例えば、Parkhurst et al., J.Immunol. 157:2539, 1996;及びPogue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8166, 1995参照）。
これらのペプチド類似物の細胞スクリーニングにおいて、類似特異的ＣＴＬも野生型ペプチド及び、可能な場合には、エピトープを内在的に発現する標的細胞を認識することができるということを確認することは重要である。
ＨＬＡ−Ａ３及びＢ７−スーパーモチーフベアリングペプチドのアナロジング
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフベアリングエピトープの類似物を、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフベアリングペプチドをアナロジングすることにおいて使用したものと同様のストラテジーを用いて、生成させる。例えば、３／５のＡ３スーパータイプ分子を、一次アンカー残基で設計して、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、Ｍ、又はＡ）を持たせる。
ペプチド類似物は、その後Ａ＊０３及びＡ＊１１（プロトタイプＡ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験される。≦５００ｎＭの結合能力を示すそれらのペプチドは、その後Ａ３スーパータイプ交さ反応性を有すると確認される。
Ａ２−及びＡ３−モチーフベアリングペプチドと同様、３又はそれ以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドは、改善されることが可能であり、可能な場合には、交さ反応性結合が増強され、結合親和力又は結合半減期が高まる。Ｂ７スーパーモチーフベアリングペプチドは、Ｓｉｄｎｅｙらによって立証されているように、例えば、Ｃ末端一次アンカー位置に好ましい残基（Ｖ、Ｉ、Ｌ、又はＦ）を持つように設計される（J.Immunol. 157:3480-3490, 1996）。
他のモチーフ及び／又はスーパーモチーフベアリングエピトープの一次アンカー残基でのアナロジングは、同様の方法で行われる。
ペプチド類似物は、その後、一般的には細胞スクリーニング試験で、免疫原について確認される。また、類似特異的ＣＴＬも野生型ペプチド及び、可能な場合には、エピトープを内在的に発現する標的を認識することもできるということを立証することは一般的に重要である。
二次アンカー残基でのアナロジング
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、交さ反応性ペプチド及び／又はそのような特性と付随した二次アンカー位置で特定の残基を同定することにより親和力を高めてＨＬＡ分子を結合するペプチドを高度に設計することにおいて有用性がある。例えば、１位にＦ残基を持つＢ７スーパーモチーフベアリングペプチドの結合能力が、分析される。ペプチドを、その後アナロジングして、１位で、ＦをＬで置換する。アナロジングしたペプチドは、結合親和力の増加、結合半減期及び／又は交さ反応性の増加について評価される。そのような方法により、特性が高められたアナロジングしたペプチドが同定される。
結合能力又は交さ反応性を十分に改善して設計された類似物も、例えば、ＩＦＡ免疫化又はリポペプチド免疫化の後、ＨＬＡ−Ｂ７−遺伝子組換えマウスにおける免疫原性について試験されうる。アナロジングしたペプチドは、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍を有する患者からのＰＢＭＣを用いてリコールレスポンス（recall response）を刺激する能力についてさらに試験される。
他のアナロジングストラテジー
ペプチドアナロジングの別の形態には、アンカーの位置とは関係なく、α−アミノ酪酸でのシステインの置換が含まれる。その化学的性質により、シルテインは、ジスルフィドブリッジを形成する傾向を有し、結合能力を減少させるようにペプチドを十分に構造変化させる。システインに対するα−アミノ酪酸の置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの場合において結合能力及び交叉結合（crossbinding）能力を改善することを示した（例えば、Persistent Viral Infections, Eds. R.Ahmed及びI.Chen, Johon Wiley & Sons, England, 1999におけるSette et al.によるレビュー参照）。
したがって、単一のアミノ酸置換体の使用により、ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合特性及び／又は交さ反応性は、調節されうる。
［実施例１４］ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフでの１５８Ｐ１Ｄ７誘導シーケンスの同定及び確認
クラスＩＩスーパーモチーフ又はモチーフを有するペプチドが、ＨＬＡクラスＩペプチドのために記載されたものと同様の方法論を用いて、以下に概説したように、同定及び確認される。
ＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフベアリングエピトープの選択
１５８Ｐ１Ｄ７抗原を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフ又はスーパーモチーフを有するシーケンスの存在について分析して、１５８Ｐ１Ｄ７誘導、ＨＬＡクラスＩＩのＨＴＬエピトープを同定する。具体的には、ＤＲ−スーパーモチーフを含み、９−マーコア、並びに３残基Ｎ−及びＣ−末端フランキング領域を含む（１５アミノ酸総量）１５−マーシーケンスを選択する。
ＤＲ分子に結合するのに適したペプチドを予想するためのプロトコルが開発されている（Southwood et al., J.Immunol. 160:3363-3373, 1998）。個々のＤＲ分子に対して特異的なこれらのプロトコルは、９−マーコア領域の得点付け及び順位付けを可能にする。各プロトコルにより、９−マーコアの範囲内でＤＲ−スーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、１位及び６位）の存在についてペプチドシーケンスに得点がつけられるだけでなく、さらに二次アンカーの存在についてシーケンスが評価される。対立遺伝子特異選択表（allele-specific selection table)(例えば、Southwood et al., ibid)を用いると、これらのプロトコルにより、特定のＤＲ分子を結合する確率の高いペプチドシーケンスが効果的に選択されるということが分かっている。さらに、タンデムにこれらのプロットコル、具体的にはＤＲ１、ＤＲ４ｗ４及びＤＲ７のためのプロトコル、を実行すると、ＤＲ交さ反応性ペプチドが効果的に選択されうる。
上記同定された１５８Ｐ１Ｄ７誘導ペプチドは、各種共通のＨＬＡ−ＤＲ分子に対する結合能力について試験される。全てのペプチドは、先ず、一次パネル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４及びＤＲ７におけるＤＲ分子に対する結合について試験される。これらの３つのＤＲ分子のうち少なくとも２つを結合するペプチドが、その後二次試験においてＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗ１９、及びＤＲ９分子に対する結合について試験される。最後に、４つの二次パネルＤＲ分子のうち少なくとも２つを結合するペプチド、及びこのように累積して７つの異なるＤＲ分子のうち少なくとも４つを結合するペプチドが三次試験においてＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、及びＤＲ８ｗ２分子に対する結合についてスクリーニングされる。一次、二次、及び三次スクリーニング試験を構成する１０のＤＲ分子のうち少なくとも７つを結合するペプチドは、交さ反応性ＤＲバインダーと考えられる。共通のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合すると見られる１５８Ｐ１Ｄ７誘導ペプチドは、特に重要である。
ＤＲ３モチーフペプチドの選択
ＨＬＡ−ＤＲ３は、白人系、黒人系、及びヒスパニック系の個体群に多い対立遺伝子であるため、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において適切な基準となる。したがって、候補であることを示すペプチドも、ＤＲ３結合能力について検定されてもよい。しかしながら、ＤＲ３モチーフの結合特異性の観点から、ＤＲ３のみに結合するペプチドもワクチン製剤への含有のための候補と考えられうる。
標的１５８Ｐ１Ｄ７抗原は、Ｇｅｌｕｋらによって報告された２つのＤＲ３−特異的結合モチーフ（J.Immunol. 152:5742-5748, 1994）のうち１つを保有するシーケンスについて分析されて、ＤＲ３を結合するペプチドを効果的に同定する。対応するペプチドが、その後合成され、１μＭ又はそれより良い、すなわち１μＭより小さい親和力でＤＲ３を結合する能力を有すると確認される。この結合基準を満たし、ＨＬＡ クラスＩＩの高親和力バインダーの資格があるペプチドが見出される。
この方法で同定されるＤＲ３結合エピトープは、ＤＲスーパーモチーフベアリングペプチドエピトープを有するワクチン組成物に含まれる。
ＨＬＡ クラスＩモチーフベアリングペプチドの場合と同様、クラスＩＩは、親和力又は交さ反応性を改善するようアナロジングされる。例えば、９−マーコアシーケンスの４位のアスパラギン酸は、ＤＲ３結合に最適な残基であり、その残基からの置換は、多くの場合ＤＲ３結合を改善する。
［実施例１５］１５８Ｐ１Ｄ７誘導ＨＴＬエピトープの免疫原性
この実施例では、本願において示した方法論を用いて、同定されたエピトープのうち免疫原性ＤＲスーパーモチーフベアリングエピトープ及びＤＲ３−モチーフが測定される。
ＨＴＬエピトープの免疫原性は、ＨＴＬレスポンスを刺激する能力を評価することにより、及び／又は適当な遺伝子組換えマウスモデルを用いることにより、ＣＴＬエピトープの免疫原性の測定に類似した方法で、確認される。免疫原性は、１．）正常ＰＢＭＣを用いる生体外一次誘導又は２．）１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍を有する患者からのリコールレスポンス：についてスクリーニングすることによって測定される。
［実施例１６］個体群範囲（個体群適用範囲）の呼吸を測定するための各種民族のバックグラウンドにおけるＨＬＡ−スーパータイプの表現型度数の計算
この実施例では、多様なスーパーモチーフ及び又はモチーフを含む多様なエピトープから構成されるワクチン組成物の個体群適用範囲（population coverage）の幅の評価について詳述する。
個体群適用範囲を分析するため、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子度数(gene frequency)が測定される。各ＨＬＡ対立遺伝子に対する遺伝子度数は、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ（１−ａｆ））（例えば、Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996参照）を利用して、抗原又は対立遺伝子度数から計算される。累積遺伝子度数（cumulative gene frequency)を計算し、累積抗原度数(cumulative antigen frequency)を逆算式[af=1-(1-Cgf)2]の使用により誘導して、総合的な表現型度数(phenotypic frequency)を得る。
度数データが、ＤＮＡ分類のレベルで利用できない場合には、血清学的に規定した抗原度数との一致が考えられる。全潜在的（ポテンシャル）スーパータイプ個体群適用範囲を得るため、結合不均衡（linkage disequilibrium）はないと考えられ、スーパータイプのそれぞれに属すると確認された対立遺伝子のみが、含まれる（最小評価）。遺伝子座間の組み合わせにより得られる全ポテンシャル範囲の評価は、Ａ範囲に、考えられるＢ対立遺伝子によって被覆されると期待されうる非Ａ被覆個体群の比率を加えることによってなされる（例えば、全数＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプのうち確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、及びＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、及びＡ＊７４０１を含む可能性があるが、これらの対立遺伝子は、総合的な度数計算に含まれなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリー（Ａ２−ｌｉｋｅ ｓｕｐｅｒｔｙｐｅ ｆａｍｉｌｙ）のうち確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、及びＡ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプファミリーの確認された対立遺伝子は：Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、及びＢ＊７８０１である（潜在的には、Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１及びＢ＊５６０２も同様）
Ａ２−、Ａ３−、及びＢ７−スーパータイプを組み合わせることによって得られる個体群適用範囲は、５つの主な民族群において約８６％である。適用範囲を、Ａ１及びＡ２４モチーフを有するペプチドを含めることによって広げてもよい。平均して、５つの異なる主な民族群（白人、北アメリカ黒人、中国人、日本人、及びヒスパニック）の全てにわたる個体群の１２％にＡ１が、２９％にＡ２４が存在している。全体として、これらの対立遺伝子は、これらの同一の民族個体群において３９％の平均度数で表される。Ａ１及びＡ２４がＡ２−、Ａ３−及びＢ７−スーパータイプ対立遺伝子と併用されるときの、主な民族性の全てにわたる全適用範囲は、＞９５％である。類似のアプローチを用いて、クラスＩＩモチーフベアリングエピトープの組み合わせで得られる個体群適用範囲を評価することができる。
ヒトにおける免疫原性研究により、高交さ反応性結合ペプチド（highly cross-reactive binding peptide）はほとんどいつでもエピトープとして認識されるということが示されている（例えば、Bertoni et al., J Clin. Invest. 100:503, 1997;Doolan et al., Immunity 7:97, 1997;及びThrelkeld et al., J. Immunol. 159:1648, 1997）。高交さ反応性結合ペプチドの使用は、多種多様な個体群において免疫原性であるワクチンに含有させるための候補エピトープを同定することにおいて重要な選択基準となる。
エピトープ（本願において開示されるもの及び技術から開示されるもの）の十分な数について、平均個体群適用範囲は、５つの主な民族個体群のそれぞれにおいて９５％より大きいと予想される。技術として公知のゲーム理論モンテカルロシミュレーション分析（例えば、Osborne, M.J. Rubinstein, A. 「ゲーム理論における過程（A course in game theory）」ＭＩＴ出版， １９９４参照）を用いて、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、及びヒスパニック民族群で構成される個体群において個体のどのくらいのパーセンテージが本願に記載したワクチンエピトープを認識するかを評価することができる。好ましいパーセンテージは、９０％である。より好ましいパーセンテージは９５％である。
［実施例１７］初回免疫後の内在的処理した抗原のＣＴＬ認識
この実施例では、本願において同定及び選択された未変性ペプチド又はペプチド類似のエピトープによって誘導したＣＴＬは内在的に合成された、すなわち未変性の抗原を認識するということが確認される。
例えば、ペプチドエピトープで免疫化した遺伝子組換えマウスから分離した効果細胞、例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフベアリングエピトープは、ペプチド被覆刺激要因細胞を用いて生体外で再刺激される。６日後、効果細胞は、細胞障害性について検定され、ペプチド特異的細胞障害活性を含む株細胞はさらに再刺激される。さらに６日後、これらの株細胞は、ペプチドの不存在又は存在下、５１Ｃｒ標識化したＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞における細胞障害活性について試験され、内在的に合成した抗原、すなわち１５８Ｐ１Ｄ７発現ベクター用いて安定的に形質移入された細胞を有する５１Ｃｒ標識化した標的細胞についても試験される。
その結果により、ペプチドエピトープで初回抗原刺激された動物から得られるＣＴＬ株細胞は、内在的に合成した１５８Ｐ１Ｄ７抗原を認識するということが立証される。そのような分析のために使用されるべき遺伝子組換えマウスモデルの選択は、評価されているエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスに加えて、Ａ３エピトープを評価するために使用されてもよい、ヒトＡ１及びＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他の遺伝子組換えマウスモデルが特徴付けられており、これ以外のもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ１及びＡ２４のための遺伝子組換えマウス）は、開発されている。ＨＴＬエピトープを評価するために使用される可能性のあるＨＬＡ−ＤＲ１及びＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルも開発されている。
［実施例１８］遺伝子組換えマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ複合エピトープの活性
この実施例では、１５８ＰＤ７誘導ＣＴＬ及びＨＴＬペプチドワクチン組成物の使用によって、遺伝子組換えマウスにおけるＣＴＬ及びＨＴＬの誘発について詳述する。本願において使用されるワクチン組成物には、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍を有する患者に投与されるべきペプチドが含まれる。ペプチド組成物には、多様なＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープが含まれる。エピトープは、本願において記載された方法論を用いて同定される。この実施例では、また、ＣＴＬワクチン組成物中への１又はそれ以上のＨＴＬエピトープの含有によって免疫原性を高めることができることも詳述する；そのようなペプチド組成物は、ＣＴＬエピトープと結合（複合）したＨＴＬエピトープを含むことができる。ＣＴＬエピトープは、５００ｎＭ以下の親和力で多様なＨＬＡファミリーメンバーに結合するエピトープ、又はそのエピトープの類似物でありうる。ペプチドは、必要により脂質処理され（ｌｉｐｉｄａｔｅ）てもよい。
免疫化処理：遺伝子組換えマウスの免疫化は、記載したように行われる（Alexander et al., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997）。例えば、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子に対してトランスジェニックであり、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフベアリングエピトープ又はＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフベアリングエピトープの免疫原性を確認するために使用されるＡ２／Ｋｂマウスを、不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント中にある、又はペプチド組成物が脂質化したＣＴＬ／ＨＴＬ複合物である場合にはＤＭＳＯ／生理食塩水中にある、又はペプチド組成物がポリペプチドである場合にはＰＢＳ又は不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント中にある０．１ｍｌのペプチドを用いて皮下（尾の付け根）初回抗原刺激する。初回抗原刺激後７日に、これらの動物から得られた脾細胞を、ペプチドで被覆した、同質遺伝子的な放射線照射したＬＰＳ活性化リンパ芽球を用いて再刺激する。
株細胞：ペプチド特異的細胞障害性試験用の標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子（例えば、Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:1007, 1991）を用いて形質移入したＪｕｒｋａｔ細胞である。
生体外ＣＴＬ活性化：初回抗原刺激後１週間に、脾臓細胞（３０×１０６セル／フラスコ）を、１０ｍｌの培地／Ｔ２５フラスコ中で、同系の、放射線照射した（３０００ｒａｄ）、ペプチド被覆リンパ芽球（１０×１０６セル／フラスコ）と共に３７℃で共培養する。６日後、効果細胞を収集し、細胞障害活性について検定した。
細胞障害活性の試験：標的細胞（１．０〜１．５×１０６セル／フラスコ）を、２００μｌの５１Ｃｒの存在下、３７℃でインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、Ｒ１０培地に再懸濁させる。必要な場合には、ペプチドを１μｇ／ｍｌで加える。試験のため、１０４の５１Ｃｒ標識化した標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の異なる濃度の効果細胞に加える（最終容積２００μｌ）。３７℃で６時間のインキュベート期間後、上清の０．１ｍｌのアリコート（一定分量）を、各ウェルから取り除き、Micromedic automatic gamma counterで、放射能を測定する。％特異的溶解（percent specific lysis)を、式により測定する:％特異的遊離(percent specific releace）＝１００×（実験的遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）。％５１Ｃｒ遊離データを、溶解単位／１０６セルとして表して、同一の条件下で行った分離ＣＴＬ試験間の比較を容易にする。一つの溶解単位は、６時間５１Ｃｒ遊離試験において１００００の標的細胞の３０％溶解とするために必要とされる効果細胞の数として、任意に、規定される。ペプチドの不存在下において得られる溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下において得られる溶解単位／１０６から引いて、特異的溶解単位／１０６を得る。例えば、３０％５１Ｃｒ遊離が、ペプチドの不存在下において５０：１（すなわち、１００００の標的に対して５×１０５効果細胞）及びペプチドの存在下において５：１（すなわち、１００００の標的に対して５×１０４効果細胞）のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比で得られる場合には、特異的溶解単位は：［（１／５００００）−（１／５０００００）］×１０６＝１８ＬＵとなるであろう。
結果を分析して、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ複合ワクチン製剤を注射された動物のＣＴＬ応答（レスポンス）の大きさを検定し、さらに、例えば「免疫原性の確認」と題した実施例において上記概説したＣＴＬエピトープを用いて得られたＣＴＬ応答の大きさと比較する。これに類似した分析を行って、多様なＣＴＬエピトープ及び／又は多様なＨＴＬエピトープを含むペプチド複合体の免疫原性を確認してもよい。これらの方法に従って、そのような組成物の投与においてＣＴＬ応答が誘発され、同時にＨＴＬ応答が誘発されることがわかる。
［実施例１９］１５８Ｐ１Ｄ７特異的ワクチン中に含有させるためのＣＴＬ及びＨＴＬの選択
この実施例では、本発明のワクチン組成物用のペプチドエピトープを選択する方法について詳述する。当該組成物中のペプチドは、核酸シーケンス（配列）の形態、ペプチド（又はその複数）をコード化する単一又は１若しくはそれ以上のシーケンス（すなわち、ミニ遺伝子）の形態とすることができ、或いは単一及び／又はポリエピトープのペプチドとすることができる。
下記原理は、ワクチン組成物中に含有させるためのエピトープの大多数を選択するときに利用される。下記原理のそれぞれは、選択をするために考量される。
投与において、１５８Ｐ１Ｄ７クリアランスと相関する模擬免疫応答をするエピトープを選択する。使用したエピトープの数は、自発的に１５８Ｐ１Ｄ７を除去する患者の所見に依存する。例えば、自発的に１５８Ｐ１Ｄ７を除去する患者が１５８Ｐ１Ｄ７抗原から少なくとも３に対する免疫応答を生ずると観察された場合には、その後３−４エピトープが、ＨＬＡ クラスＩに対して含まれるべきである。同様の原理を用いて、ＨＬＡ クラスＩＩエピトープが決定される。
ＨＬＡ クラスＩ分子に対して５００ｎＭ以下のＩＣ５０、又はクラスＩＩに対して１０００ｎＭ以下のＩＣ５０の結合親和力を有するエピトープが、多くの場合選択され；或いはURL bimas.dcrt.nih.gov/のＢＩＭＡＳウェブサイトから高い結合得点を持つＨＬＡクラスＩペプチドが選択される。
多種多様な個体群全体にわたってワクチンの適用範囲を広範にするため、十分なスーパーモチーフベアリングペプチド、又は対立遺伝子特異的モチーフベアリングペプチドの十分なアレイを選択して、個体群の適用範囲を広範にする。一つの形態において、少なくとも８０％の個体群の適用範囲を与えるようにエピトープを選択する。技術として公知の統計学的評価であるモンテカルロ分析を用いて、個体群の適用範囲の幅、又は重複性を検定することができる。
ポリエピトープ組成物又はこれをコード化するミニ遺伝子を作成するときには、対象となるエピトープを包含する可能性のある最小のペプチドを生成させることが一般的に望ましい。用いられる原理は、同一でなければ、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択するときに用いられる原理と同様である。例えば、ワクチン組成物用のタンパク質シーケンスは、そのシーケンスの範囲内に含まれるエピトープの最大数である、すなわち、高濃度のエピトープを有するため、そのようなシーケンスが選択される。エピトープは、ネステッド又はオーバーラップ（すなわち、互いに対してフレームシフトしたもの）でもよい。例えば、オーバーラップエピトープについては、１０アミノ酸ペプチド中に二つの９−マーエピトープ及び一つの１０−マーエピトープが存在しうる。多様なエピトープのペプチドは、合成して、組換えて、又は天然のソースからの分割によって生じうる。一方、類似物は、このような天然（未変性）のシーケンスで作られうるが、それによって、１又はそれ以上のエピトープには、ポリエピトープペプチドの交さ反応性及び／又は結合親和力特性を変化させる置換体が含まれる。そのようなワクチン組成物は、治療又は予防目的のため投与される。この形態は、免疫系処置のまだ発見されていない側面が未変性のネステッドシーケンスに適用され、それにより、治療又は予防免疫応答誘導ワクチン組成物の製造を促進するであろうという可能性に備える。さらに、そのような形態は、現に知られているＨＬＡ組成のモチーフベアリングエピトープの実現性に備える。なお、この形態（いくつかの類似物の作成がない）は、実際に１５８Ｐ１Ｄ７に存在している多様なペプチドシーケンスに対する免疫応答を誘導し、それゆえ、いくつかの結合エピトープを評価する必要性をなくす。最後に、その形態は、核酸ワクチン組成物を製造するときの規模について経済性を提供する。この形態に関して、従来技術における原理に従って、標的シーケンスを同定し、シーケンス長当たりのエピトープの最大数を同定するコンピュータプログラムを誘導することができる。
選択したペプチドで構成されるワクチン組成物は、投与したとき、安全で、有効で、１５８Ｐ１Ｄ７を有し又は過剰発現する細胞を制御或いは除去する免疫応答と大きさにおいて類似する免疫応答を誘発する。
［実施例２０］「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築
この実施例では、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドには、当然、本願において記載したＢ細胞、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープペプチド或いはエピトープ類似物の各種の形態が含まれる。
ミニ遺伝子発現プラスミドには、一般に、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬペプチドエピトープが含まれる。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ７スーパーモチーフベアリングエピトープ並びにＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４モチーフベアリングエピトープは、ＤＲスーパーモチーフベアリングエピトープ及び／又はＤＲ３エピトープと組み合わせて使用される。１５８Ｐ１Ｄ７から誘導されるＨＬＡクラスＩスーパーモチーフ又はモチーフベアリングエピトープが選択され、その結果、多様なスーパーモチーフ／モチーフは個体群の適用範囲を確実に広範にするよう表される。同様に、ＨＬＡ クラスＩＩエピトープを、１５８Ｐ１Ｄ７から選択して、個体群の適用範囲を広範にする、すなわち、ＨＬＡ−１−４−７スーパーモチーフベアリングエピトープかつＨＬＡ ＤＲ−３モチーフベアリングエピトープが、ミニ遺伝子構築物中への含有のために選択される。選択したＣＴＬ及びＨＴＬエピトープは、発現ベクターにおける発現のためミニ遺伝子中に組み込まれる。
そのような構築物は、さらに小胞体にエピトープを誘導するシーケンスを含んでもよい。例えば、liproteinを、従来技術に記載されている１又はそれ以上のＨＴＬエピトープと融合させてもよい。なお、liproteinのＣＬＩＰシーケンスは、ＨＬＡクラスＩＩエピトープシーケンスが小胞体に誘導されるように、除去され、かつＨＬＡクラスＩＩエピトープシーケンスと置換され、エピトープは、ＨＬＡ クラスＩＩ分子と結合する。
この実施例では、ミニ遺伝子ベアリング発現プラスミドの構築のために使用されるべき方法について詳述する。ミニ遺伝子組成物のために使用される他の発現ベクターは、入手可能であり、当業者において公知である。
この実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドには、コンセンサスＫｏｚａｋ配列及びコンセンサスマウスκ Ｉｇ軽鎖シグナル配列、続いて本願において開示した原理に従って選択されるＣＴＬ及び／又はＨＴＬが含まれる。そのシーケンス（配列）は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを通じてコードされるＭｙｃ及びＨｉｓ抗体エピトープタグと融合したＯＲＦをコード化する。
例えば、平均して、１５ヌクレオチドオーバーラップで長さにおいて約７０ヌクレオチドでありうるオーバーラップオリゴヌクレオチド（overlapping oligonucleotide）が、合成され、ＨＰＬＣ精製される。当該オリゴヌクレオチドは、選択したペプチドエピトープ並びに適当なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列及びシグナル配列をコード化する。マルチエピトープ（multiepitope）ミニ遺伝子は、ＰＣＲを用いて、反応の３セットでオーバーラップオリゴヌクレオチドを伸長させることによって構築される。Ｐｅｒｋｉｎ／ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ装置が用いられ、下記条件を用いて合計３０サイクル行われる：９５℃で１５分、アニーリング温度（各プライマー対の最も低く計算したＴｍ以下の５°）で３０秒、及び７２℃で１分。
例えば、ミニ遺伝子は、下記のように調製される。最初のＰＣＲ反応に関し、５μｇの各二つのオリゴヌクレオチドを、アニールし、伸長する：例として、８のオリゴヌクレオチド、すなわち４対のプライマーを用いて、オリゴヌクレオチド１＋２＋、３＋４、５＋６、及び７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼバッファ（１×＝１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリスクロライド（Tris-chloride）、ｐＨ８．７５、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ、及び２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌ反応液中で組み合わせる。完全長ダイマー産物を、ゲル精製し、１＋２及び３＋４の産物と、５＋６及び７＋８の産物とを含む二つの反応液を混合し、１０サイクル間アニールし、伸長する。二つの反応液の半分を、その後混合し、フランキングプライマーを加えて完全長産物を増幅させる前に５サイクルのアニーリング及び伸長を行う。完全長産物をゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローン化し、個々のクローンを、シークエンシングによりスクリーニングする。
［実施例２１］プラスミド構築物及びそれが免疫原を誘導する程度
プラスミド構築物、例えば、先の実施例に従って作成されたプラスミドが免疫原を誘導することを可能にする程度を、エピトープ発現核酸構築物でのＡＰＣの形質導入又は形質移入後、ＡＰＣによりエピトープの提示を測定することによって、生体外で確認する。そのような研究により、「抗原性」が測定され、ヒトＡＰＣの使用が可能となる。そのアッセイ（試験）により、細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量化することによりＴ細胞によって認識される状況において、ＡＰＣにより提示されるエピトープの能力が測定される。定量化については、ＡＰＣから溶出したペプチドの量を直接測定することにより行うことができる（例えば、Sijts et al., J. Immunol. 156:683-962, 1996;Demonz et al., Nature 342:682-684, 1989参照）；又は、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数については、患部の又は形質移入した標的細胞により誘発された溶解又はリンホカイン放出の量を測定し、その後同等レベルの溶解又はリンホカイン放出を得るために必要なペプチド濃度を決定することによって測定することができる（例えば、Kageyama et al.., J. Immunol. 154:567-576, 1995参照）。
一方、免疫原性は、例えば、Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994において詳述されているように、マウス中への生体内注射、並びにその後、細胞障害性及び増殖試験のそれぞれを用いて分析されるＣＴＬ及びＨＴＬ活性の生体外試験を通じて確認される。
例えば、生体内でＣＴＬを誘導するための少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを含むＤＮＡミニ遺伝子構築物の能力を確認すべく、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニック（遺伝子導入）マウスが、例えば、１００μｇの裸のｃＤＮＡで、筋肉内免疫化される。ｃＤＮＡ免疫化により誘導されるＣＴＬのレベルを比較する手段として、動物のコントロールグループ（対照群）も、単一のポリペプチドとして合成される多様なエピトープは、ミニ遺伝子によりコード化されうるので、多様なエピトープを含む実際のペプチド組成物で免疫化される。
免疫化した動物からの脾細胞は、それぞれの組成物（ミニ遺伝子又はポリエピトープペプチドにおいてコード化されたペプチドエピトープ）毎に２回刺激され、その後５１Ｃｒ遊離試験でペプチド特異的細胞障害活性について試験される。その結果から、Ａ２拘束性エピトープに対して誘発されるＣＴＬ応答の大きさが示され、それゆえ、ミニ遺伝子及びポリエピトープワクチンの細胞内免疫原性が示される。
したがって、ポリエピトープペプチドワクチンを常用すると、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して誘導されるミニ遺伝子が、免疫応答を誘発することがわかる。他のＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて同様の分析を行って、ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ｂ７モチーフ又はスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導も測定され、それによって、ミニ遺伝子が与えられたエピトープに対して誘導される適当な免疫応答を誘発することも分かる。
適当なマウスＭＨＣ分子と交さ反応させる生体内ＨＴＬ、ＤＲトランスジェニックマウスを誘導、又はそれらのエピトープのために誘導するクラスＩＩエピトープコード化ミニ遺伝子の能力を確認するため、１−Ａｂ拘束性マウスは、例えば、１００μｇのプラスミドＤＮＡで、筋肉内免疫化される。ＤＮＡ免疫化により誘導されるＨＴＬのレベルを比較する手段として、対照（コントロール）動物のグループ（群）も、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中で乳化される実際のペプチド組成物で免疫化される。ＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわちＨＴＬは、免疫化した動物の脾細胞から精製され、それぞれの組成物（ミニ遺伝子においてコード化されるペプチド）毎に刺激される。ＨＴＬ応答は、３Ｈ−チミジン取込み増殖反応測定法（3H-thymidine incorporation proliferation assay)(例えば、Alexander et al. Immunity 1:751-761. 1994参照）を用いて測定される。その結果から、ＨＴＬ応答の大きさが示され、それゆえ、ミニ遺伝子の細胞内免疫原性が示される。
先の実施例において記載したように構築されるＤＮＡミニ遺伝子も、初回抗原刺激追加免疫プロトコルを用いて追加免疫剤と組み合わせて確認される。追加免疫剤は、例えば、対象とする完全タンパク質をコード化するミニ遺伝子又はＤＮＡを発現する組換えタンパク質（例えば、Barnett et al. Aids Res. and Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998参照）或いは組換えワクシニア(例えば、Hank et al., Vaccine 16:439-445, 1998;Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998;hanke及びMcMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999;及びRobinson et al., Nature Med. 5:526-34, 1999参照）から構成されうる。
例えば、初回抗原刺激追加免疫プロトコルにおいて使用されるＤＮＡミニ遺伝子の有効性は、先ずトランスジェニックマウスで評価される。この実施例においてＡ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスは、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフベアリングペプチドを含む免疫原性ペプチドをコード化する１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子で免疫化したＩＭである。インキュベート期間後（３−９週間の範囲にわたる）、マウスは、ＤＮＡミニ遺伝子によりコード化される同一のシーケンスを発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組換えワクシニアウイルスで追加免疫したＩＰとなる。対照マウスは、ミニ遺伝子配列のない１００μｇのＤＮＡ又は組換えワクシニアで、或いはミニ遺伝子をコード化するＤＮＡで免疫化されるが、ワクシニア追加免疫はない。さらに２週間のインキュベート期間後、直ぐにマウスからの脾細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ試験でペプチド−比活性について、検定される。さらに、脾細胞は、ミニ遺伝子及び組換えワクシニアにおいてコード化されるＡ２拘束性ペプチドエピトープで生体外刺激され、その後α、β及び／又はγＩＦＮ ＥＬＩＳＡでペプチド−比活性について検定される。
初回抗原刺激追加免疫プロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対してＤＮＡ単独よりも大きな免疫応答を発現することが分かる。そのような分析を、ＨＬＡ−Ａ１１又はＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて行って、ＨＬＡ−Ａ３又はＨＬＡ−Ｂ７モチーフ又はスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導をも検定することができる。ヒトにおける初回抗原刺激追加免疫プロトコルの使用については、以下の「初回抗原刺激追加免疫プロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した実施例において記載する。
［実施例２２］予防的使用のためのペプチド組成物
本発明のワクチン組成物を、この抗原を有する腫瘍に対する危険にさらされている人において１５８Ｐ１Ｄ７発現を予防するために使用することができる。例えば、個体群の８０％より多い標的に対しても選択される、上記実施例において選択されるＣＴＬ及びＨＴＬエピトープ等の多様なＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチド組成物（又はこれを含む核酸）が、１５８Ｐ１Ｄ７付随性腫瘍に対する危険にさらされている個体に投与される。
例えば、ペプチドベース組成物は、多様なエピトープを包含する単一のポリペプチドとして与えられる。ワクチンは、一般に、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント等のアジュバントを含む生理溶液で投与される。初期免疫化のためのペプチドの投与量は、７０ｋｇの患者に対し、約１から約５００００μｇであり、一般には１００〜５０００μｇである。ワクチンの初期投与は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ個体群の存在を測定する技術による患者における免疫応答の大きさの評価４週間後の、追加免疫投与量を伴う。さらに追加免疫投与量が、必要により投与される。組成物は、１５８Ｐ１Ｄ７付随疾病に対する予防として安全かつ有効であることが分かる。
一方、形質移入剤を一般に含む組成物は、従来技術において知られ、本願において開示された方法論に従って、核酸ベースワクチンの投与のために使用される。
［実施例２３］未変性１５８Ｐ１Ｄ７から誘導されるポリエピトープワクチン組成物
未変性１５８Ｐ１Ｄ７ポリタンパク質シーケンスが、好ましくは、各クラスＩ及び／又はクラスＩＩスーパーモチーフ或いはモチーフのために規定されるコンピュータアルゴリズムを用いて、分析されて、多様なエピトープを含むポリタンパク質の「相対的に短い」領域が同定される。当該「相対的に短い」領域は、全体の未変性の抗原よりも長さにおいて少ないことが好ましい。多様な異なる又はオーバーラップする「ネステッド（nested）」エピトープを含むこの相対的に短いシーケンスが選択され；ミニ遺伝子構築物を精製させるために使用されうる。その構築物は、操作されて、未変性タンパク質シーケンスに対応するペプチドを発現する。当該「相対的に短い」ペプチドは、一般に長さにおいて２５０アミノ酸より少なく、多くの場合長さにおいて１００アミノ酸より少なく、好ましくは長さにおいて７５アミノ酸より少なく、より好ましくは長さにおいて５０アミノ酸より少ない。ワクチン組成物のタンパク質シーケンスは、そのシーケンスの範囲内に含まれるエピトープの最大数を有する、すなわち高濃度のエピトープを有するので、そのようなワクチン組成物のタンパク質シーケンスが選択される。本願において記述したように、エピトープモチーフは、ネステッド又はオーバーラップ（すなわち互いに関連したフレームシフト）であってもよい。例えば、オーバーラップエピトープについては、二つの９マー及び一つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在しうる。そのようなワクチン組成物は、治療用又は予防用目的として投与される。
ワクチン組成物は、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７抗原からの多様なＣＴＬエピトープ及び少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含むであろう。このポリエピトープ未変性シーケンスは、ペプチドとして、又はペプチドをコード化する核酸シーケンスとして投与される。一方、類似物は、この未変性シーケンスから作り出されうるが、それによって、１又はそれ以上のエピトープは、ポリエピトープペプチドの交さ反応性及び／又は結合親和力特性を変化させる置換体を含む。
この実施例の形態は、免疫系処置のまだ発見されていない側面が未変性のネステッドシーケンスに適用され、それにより、治療又は予防免疫応答誘導ワクチン組成物の製造を促進するであろうという可能性に備える。さらに、そのような形態は、現に知られているＨＬＡ組成のモチーフベアリングエピトープの実現性に備える。なお、この形態（いくつかの類似した形態を除く）は、実際に未変性の１５８Ｐ１Ｄ７に存在している多様なペプチドシーケンスに対する免疫応答を誘導し、それゆえ、いくつかの結合エピトープ（junctional epitope)を評価する必要性をなくす。最後に、その形態は、ペプチド又は核酸ワクチン組成物を製造するときの規模について経済性を提供する。
この形態に関して、標的シーケンスを同定し、シーケンス長当たりのエピトープの最大数を同定することができる技術としてコンピュータプログラムを利用できる。
［実施例２４］多様な抗原からのポリエピトープワクチン組成物
本発明の１５８Ｐ１Ｄ７ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原と併用して、１５８Ｐ１Ｄ７及びそのような抗原を発現する癌の予防又は治療に有用なワクチン組成物が作成される。例えば、ワクチン組成物は、１５８Ｐ１Ｄ７からの多様なエピトープ、並びに１５８９１Ｄ７発現と関連する標的癌について多くの場合発現される腫瘍関連抗原を取り込む単一のポリペプチドとして与えられ、或いは１又はそれ以上の分離エピトープ（discrete epitope)の反応混液を含む組成物として投与されうる。一方、ワクチンは、ミニ遺伝子構築物として、又は生体外でペプチドエピトープを添加された樹状細胞として投与されうる。
［実施例２５］免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドを使用して、特異抗体、１５８Ｐ１Ｄ７に誘導したＣＴＬ又はＨＴＬに対する免疫応答を分析してもよい。そのような分析は、Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1988によって記載された方法で行われうる。この実施例において、本発明に従ったペプチドは、免疫原としてではなく、診断又は予後徴候の目的の試薬として使用される。
この実施例において高感受性ヒト白血球抗原四量体複合体（highly sensitive human leukocyte antigen tetrameric complex）(「四量体(tetramer)」)は、例えば、疾病の異なる段階での又はＡ＊０２０１モチーフを含有する１５８Ｐ１Ｄ７ペプチドを含む免疫化後のＨＬＡ Ａ＊０２０１陽性個体からの１５８Ｐ１Ｄ７ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ度数(frequency)の横断面分析(cross-sectional analysis)のために使用される。四量体複合体は、記載されたように（Musey et al., N Engl. J. Med. 337:1267, 1997）合成される。簡単には、精製したＨＬＡ重鎖（この実施例においてＡ＊０２０１）及びβ２−ミクログロブリンが、原核発現系（prokaryotic expression system）によって合成される。重鎖は、BirA酵素ビオチン化部位(enzymatic biotinylation site）を含むシーケンスの膜内外細胞基質末端（transmembrane-cytosolic tail）及びＣＯＯＨ−末端付加の欠失によって修飾される。重鎖、β２−ミクログロブリン及びペプチドは、希釈によりリフォールディングされる。４５−ｋＤリフォールディングした産物は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（fast protein liquid chromatography）により分離され、その後ビオチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、アデノシン５’リン酸及びマグネシウムの存在下、ＢｉｒＡによりビオチン化される。ストレプトアビジンｓ−フィコエリトリン複合物が、１：４のモル比で加えられ、四量体産物が１ｍｇ／ｍｌまで濃縮される。結果として生じた産物を、四量体−フィコエリトリンと呼ぶ。
患者の血液サンプルの分析のため、約１００万のＰＢＭＣが３００ｇで５分間遠心分離され、５０μｌの低温リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁される。抗ＣＤ８−トリカラー、及び抗ＣＤ３８と共に四量体−フィコエリトリンを用いて、三色分析が行われる。ＰＢＭＣが、３０から６０分間氷上で四量体及び抗体とともにインキュベートされ、その後、ホルムアルデヒド固定前に２回洗浄される。＞９９．９８％の対照サンプルを含むようにゲートが利用される。四量体の対照は、Ａ＊０２０１陰性個体及びＡ＊０２０１陽性非疾的ドナーの両方を含む。四量体デ染色される細胞の割合は、その後フローサイトメトリーにより測定される。この結果により、エピトープ拘束性ＣＴＬを含むＰＢＭＣサンプルにおける細胞数が示され、それにより、１５８Ｐ１Ｄ７エピトープに対する免疫応答の範囲が容易に示され、それゆえ１５８Ｐ１Ｄ７に対する曝露又は予防的若しくは治療的応答を誘発するワクチンに対する曝露の状態が示される
［実施例２６］リコールレスポンスを評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明のペプチドエピトープを試薬として用いて、患者における急性又はリコールレスポンス（応答）等のＴ細胞応答が評価される。そのような分析を、１５８Ｐ１Ｄ７付随疾病から回復した又は１５８Ｐ１Ｄ７ワクチンを接種された患者について行ってもよい。
例えば、ワクチン接種されている人のクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答を分析してもよい。ワクチンは、いくつかの１５８Ｐ１Ｄ７ワクチンであってもよい。ＰＢＭＣは、ワクチン接種された個体及びＨＬＡ型のものから採取される。最適には、多様なＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーとの交さ反応性を与えるためスーパーモチーフを有する本発明の適当なペプチドエピトープが、その後、ＨＬＡ型を有する個体から誘導したサンプルの分析のため使用される。
ワクチン接種された個体からのＰＢＭＣは、フィコール−ヒストパック密度比重差（Ficoll-Histopaque density gradient）（Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州）で分離され、HBSS（GIBCO Laboratories）で３回洗浄され、L-グルタミン（2mM）、ペニシリン（50U/ml）、ストレプトマイシン（50μg/ml）、及び10％熱不活性化ヒトAB血清を含有するHepe（10mM）（完全RPMI）を追加したRPMI-1640（Gibco Laboratories）中に再懸濁され、ミクロ培養形式を用いて培養される。本発明のエピトープを含む合成ペプチドが、10μg/mlで各ウェルに添加され、HBVコア128-140エピトープが、1μg/mlで各ウェルに刺激の最初の１週間の間、T細胞援助のソースとして添加される。
ミクロ培養形式において、４×１０５のＰＢＭＣが、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ中、９６ウェル丸底プレートでの８の同型培養において、ペプチドで刺激される。１日に３、１０、１００ｕｌの完全ＲＰＭＩ及び２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２が各ウェルに添加される。７日に、培養物は、９６ウェル平底プレートに移され、ペプチド、ｒＩＬ−２及び１０５放射線照射した（３０００ｒａｄ）自家支持細胞で再刺激される。培養物は１４日に細胞障害活性について試験される。陽性CTL応答は、先に記載された非病的対照被検者との比較に基づいて、10％特異的51Cr遊離よりも大きく示すために、８の同型培養のうち２又はそれ以上を必要とする（Reherman, et al., Nature Med. 2:1104,1109, 1996；Reherman et al., J. Clin. Invest. 97:1655-1665, 1996；及びReherman et al., J. Clin. Invest. 98:1432-1440, 1996）。
標的株細胞は、米国組織適合性学会（American Society for Histocompatibility）及びImmunogenetics（ASHI、ボストン、マサチューセッツ州）から市販され、又は記載したように（Guilhot. Et al. J. Viol. 66:2670-2678, 1992）患者のプールから株化される自家及び同種異系EBV形質転換B-LCLである。
細胞障害性試験は、下記の方法で行われる。１０μＭの本発明の合成ペプチドエピトープを用いて一晩インキュベートし、ＨＢＳＳで４回洗浄した後１時間、１００μＣｉの５１Ｃｒ（Amersham Corp.、アーリントンハイツ、イリノイ州）で標識化した同種異系HLA対応又は自家EBV形質転換B-リンパ芽球腫株細胞（B-lymphoblastoid cell line）から、標的細胞は、構成される。
細胞溶解活性は、３０００標的／ウェルを含むＵ底９６ウェルプレートを用いて、標準４−ｈ、分割ウェル５１Ｃｒ遊離試験で測定される。シミュレートしたＰＢＭＣは、１４日に、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で試験される。％細胞障害性は、式：１００×［（実験的遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）］から求められる。最大遊離は、洗浄剤（２％トリトンＸ−１００；Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州）による標的の溶解によって測定される。自発的遊離は、全実験に対する最大遊離の＜２５％である。
そのような分析の結果から、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ個体群が１５８Ｐ１Ｄ７又は１５８Ｐ１Ｄ７ワクチンに対する先の曝露によって刺激されている範囲が示される。
同様に、クラスＩＩ拘束性ＨＴＬ応答も分析してもよい。精製したＰＢＭＣは、９６ウェル平底プレート中で１．５×１０５セル／ウェルの密度で培養され、１０μｇ／ｍｌの本発明の合成ペプチド、全１５８Ｐ１Ｄ７抗原、又はＰＨＡで刺激される。細胞は、各条件に対し４〜６ウェルの同型で慣行的に培養される。培養７日後、培地は取り除かれ、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地と交換される。２日後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンが各ウェルに添加され、インキュベーションが、さらに１８時間続けられる。細胞ＤＮＡは、その後ガラス繊維マット上に収集され、３Ｈ−チミジン取込みについて分析される。抗原特異的Ｔ細胞増殖が、抗原の不存在下における３Ｈ−チミジン取込みで割った抗原存在下における３Ｈ−チミジン取込みの比として計算される。
［実施例２７］ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導
本発明のＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを含有する免疫原性組成物に対するヒト臨床試験を、ＩＮＤ ＰｈａｓｅＩ、投与量の段階的増大試験（dose escalation study）として設定し、無作為化二重盲検プラセボ対照試験（randomized, double-blind, placebo-controlled trial）として行う。そのような試験は、例えば以下のようにデザインされる：
約２７の個体の全部を記録し、３つのグループに分ける：
グループＩ：３人の被検者がプラセボを注射され、６人の被検者が５μｇのペプチド組成物を注射される；
グループＩＩ：３人の被検者がプラセボを注射され、６人の被検者が５０μｇのペプチド組成物を注射される；
グループＩＩＩ：３人の被検者がプラセボを注射され、６人の被検者が５００μｇのペプチド組成物を注射される。
最初の注射後４週間の後、全患者に、同一の投与量で追加免疫接種を受けさせる。
この試験において測定された終点は、ペプチド組成物の安全性及び耐容性並びにその免疫原性に関係する。ペプチド組成物に対する細胞免疫応答は、このペプチド組成物の固有活性の指標であり、それゆえこれを生物学的有効性（効力）の測定とみなすことができる。安全性及び効力の終点に関係する臨床データ及び検査値について、以下に概要を述べる。
安全性：有害事象の発生率を、プラセボ及び薬剤治療グループにおいてモニターし、程度及び可逆性の観点で評価する。
ワクチンの効力の評価：ワクチンの効力評価のため、注射前後に患者から血を取る。末梢血単核細胞を、フィコール−ハイパック比重差遠心により新鮮なヘパリン添加血から分離し、凍結培地に分注し、凍結保存する。サンプルは、CTL及びHTL活性について試験される。
ワクチンは、安全かつ有効であることが分かる。
［実施例２８］１５８Ｐ１Ｄ７を発現している患者におけるフェーズＩＩ試験
フェーズＩＩ試験を行って、ＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物を、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌になっている患者に投与する効果を試験する。その試験の主な目的は、例えば、病変（lesion）の減少（reduction）及び／又は縮小（shrinking）によって、明らかにするように、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌患者においてＣＴＬを誘導するために効果的な投与量及び療法を決定すること、これらの患者においてＣＴＬ及びＨＴＬ応答を誘導する安全性を確立すること、並びにＣＴＬの活性がこれらの患者の病像（clinical picture）を改善する範囲について確認することである。そのような試験は、例えば、下記のようにデザイン（設計）される：
試験は、多数を中心に行う。試験デザインは、盲検解除で（open-labeled）、非対照で(uncontrolled)、ペプチド組成物が1回投与量として投与され次いで6週間後同一の投与量の1回の追加免疫注射により投与される投与量の段階的増大プロトコルである。投与量は、注射当たり50、500及び5000μgである。薬剤付随副作用(drug-associated adverse effect)（重症度及び可逆性）が記録される。
三つの患者群性体がある。第一群（グループ）は、５０μｇのペプチド組成物を注射され、第二及び第三群は、５００及び５０００μｇのペプチド組成物をそれぞれ注射される。各群内の患者は、２１−６０歳にそろえ、多種多様な民族バックグラウンドの標本を示す。それらの全てが、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する腫瘍を有する。
臨床上の徴候又は抗原特異性Ｔ細胞応答をモニターして、ペプチド組成物を投与する効果を評価する。ワクチン組成物は、１５８Ｐ１Ｄ７付随疾病の治療において安全かつ有効であることが分かる。
［実施例２９］初回抗原刺激追加免疫プロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導
前記「プラスミド構築物及びそれが免疫原を誘導する程度」と題した実施例において記載したようなトランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの効力を確認するために使用されるプロトコルと根底にある原理において類似する初回抗原刺激追加免疫プロトコルも、ヒトに対するワクチンの投与のために使用される。そのようなワクチン療法には、例えば、裸のＤＮＡの初期投与、これに続く、ワクチンをコード化する組換えウイルスを用いる追加免疫、或いは組換えタンパク質／ポリペプチド、又はアジュバント中に投与したペプチド混合物の初期投与が含まれる。
例えば、初期免疫化を、多様な部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（又はＳＣ若しくはＩＤ）投与した裸の核酸の形態にある『「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築』と題した実施例において構築した発現ベクター等の発現ベクターを用いて行ってもよい。核酸（０．１から１０００μｇ）も、遺伝子銃を用いて投与することができる。３〜４週間のインキュベーション期間後、追加免疫投与量の投与がなされる。追加免疫を、５×１０７から５×１０９ｐｆｕの投与量で投与される組換え鶏痘ウイルスとすることができる。ＭＶＡ、カナリア痘、アデノウイルス、又はアデノ関連性ウイルス等の別の組換えウイルスも、追加免疫として使用することができ、或いはポリエピトープタンパク質又はペプチドの混合物を投与することができる。ワクチン有効性の評価のため、患者血液サンプルを、免疫化前並びに初期のワクチン及び追加免疫投与量のワクチンの投与に続く間隔で得る。末梢血単核細胞が、フィコール−ハイパック密度比重差遠心（Ficoll-Hypaque density gradient contrifugation）により新鮮なヘパリン添加血から分離され、凍結培地に分注され、冷凍保存される。サンプルは、ＣＴＬ及びＨＴＬ活性について試験される。
それらの結果の分析から、１５８Ｐ１Ｄ７に対する治療的又は予防的免疫を得るために十分な応答の大きさを生ずることが示される。
［実施例３０］樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与
本発明のペプチドエピトープを含有するワクチンを、ＡＰＣ又はＤＣ等の「専門の」ＡＰＣを用いて投与することができる。この実施例において、ペプチドパルスしたＤＣを患者に投与して、生体内でＣＴＬ応答を刺激する。この方法では、樹状細胞が単離され、増殖され、本発明のペプチドＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスされる。樹状細胞を元の患者に注入して、生体内でＣＴＬ及びＨＴＬ応答を誘発させる。誘発したＣＴＬ及びＨＴＬは、それぞれワクチンにおけるエピトープが誘導される１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質を有する標的細胞の破壊をし又は破壊を容易にする。
エピトープ含有ペプチドの反応混液が、ＰＢＭＣに対し生体外投与され、それからＤＣが分離される。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｅｔｉｎＴＭ（モンサント、セントルイス、ミズーリ州）又はＣＳＦ／ＩＬ−４等のＤＣの収集を容易にする医薬を用いることができる。ペプチドでＤＣをパルスした後、及び患者に再注入する前に、ＤＣを洗浄して未結合のペプチドが取り除かれる。
臨床上認識され、臨床上の結果に基づき当業者により容易に測定されているように、患者に再注入したＤＣの数は変動しうる（例えば、Nature Med. 4:328, 1998;Nature Med. 2:52, 1996及びProstate 32:272, 1997参照）。患者当たり２〜５０×１０６個のＤＣが一般に投与されるが、１０７又は１０８のようにより大きい数のＤＣも与えられうる。そのような細胞個体群は一般に５０〜９０％ ＤＣの間で含む。
いくつかの形態において、ペプチド添加ＰＢＭＣが、ＤＣの精製をしないで、患者に注射される。例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ等の薬剤での治療後に生成されるＰＢＭＣが、ＤＣの精製をしないで、患者に注射される。投与されるＰＢＭＣの全数は、多くの場合、１０８から１０１０にわたる。一般に、患者に注射される細胞投与量は、例えば、免疫蛍光分析により特異的抗ＤＣ抗体を用いて測定されるように、各患者の血液中のＤＣの割合に基づく。したがって、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭが、投与された患者の末梢血中の２％ＤＣを動態化する場合には、その患者は５×１０６個のＤＣを受け取るようになり、その後患者は２．５×１０８ペプチド添加ＰＢＭＣの全部を注射されるであろう。ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ等の薬剤により動態化されるＤＣの割合は、一般に２〜１０％の間であると推定されるが、当業者において認識されているように変動しうる。
ＣＴＬ／ＨＴＬ応答の生体外活性化
一方、１５８Ｐ１Ｄ７抗原似に対する生体外ＣＴＬ又はＨＴＬ応答は、組織培養において、ＤＣ等のＡＰＣのソース及び免疫原性ペプチドと共に患者の若しくは遺伝的適合性の、ＣＴＬ又はＨＴＬ前駆細胞をインキュベートすることにより誘発されうる。前駆細胞が活性化され、効果細胞に拡がる適当なインキュベーション時間（一般には約７〜２８日）後、細胞は、患者に注入される。なお、それらの細胞は、それらの特異的な標的細胞、すなわち腫瘍細胞の破壊（ＣＴＬ）をし又は破壊（ＨＴＬ）を促進する。
［実施例３１］モチーフベアリングペプチドを同定及び確認する別の方法
モチーフベアリングペプチドを同定及び確認する別の方法は、それらを規定されたＭＨＣ分子を有する細胞から溶出することである。例えば、組織適合試験（tissue typing）のために使用されるＥＢＶ形質転換Ｂ株細胞は、それらがどちらのＨＬＡ分子を発現するか決定するため広範に特徴づけられている。一定の場合には、これらの細胞は、単一型のＨＬＡ分子のみを発現する。これらの細胞は、対象となる抗原、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する核酸で形質移入されうる。形質移入の結果として生成したペプチドの内在性抗原プロセッシングにより製造されたペプチドは、その後、細胞内でＨＬＡ分子と結合し、輸送され、細胞の表面上に示されるであろう。ペプチドは、その後穏和な酸性条件にさらされてＨＬＡ分子から溶出され、それらのアミノ酸配列が、例えば、質量分析（例えば、Kubo et al., J. Immunol. 152:3913, 1994)により決定される。特定のＨＬＡ分子を結合するペプチドの大多数は、モチーフベアリングであるため、これは、細胞において発現した特定のＨＬＡ分子と関連したモチーフベアリングペプチドを得るための代替モダリティー（modality）である。
一方、内在性ＨＬＡ分子を発現しない株細胞は、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコード化する発現構築物で形質移入されうる。これらの細胞は、その後記載されているように使用されうる、すなわちそれらは、その後、細胞表面上に存在していた１５８Ｐ１Ｄ７に対応するペプチドを分離するよう１５８Ｐ１Ｄ７をコード化する核酸で形質移入されうる。そのような分析から得られるペプチドは、細胞において発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子との結合に対応するモチーフ（又は複数のモチーフ）を有するであろう。
当業者により認識されているように、当業者は、１以上のＨＬＡ対立遺伝子を有する細胞について同様の分析を行うことができ、その後、発現した各ＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドを測定することができる。さらに、当業者は、タンパク質抗原を用いて付加すること等の形質移入以外の手段を用いて細胞に対する抗原のソースを与えることができるということも認識するであろう。
［実施例３２］相補ポリヌクレオチド
１５８Ｐ１Ｄ７コード化シーケンスに対して相補的なシーケンス、又はそのいくつかの部分を使用して、自然発生１５８Ｐ１Ｄ７の発現の検出、減少、又は阻害をする。約１５から３０までの塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、本質的に同一の方法が、より小さい又はより長いシーケンス断片について、使用される。適当なオリゴヌクレオチドが、例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（National Biosciences）及び１５８Ｐ１Ｄ７のコード配列を用いて、設計される。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドが、最もユニークな５’配列から設計され、コード配列と結合するプロモーターを妨げるために使用される。翻訳を阻害するため、相補オリゴヌクレオチドは、１５８Ｐ１Ｄ７コード化転写物とリボソーム結合することを妨げるよう設計される。
［実施例３３］１５８Ｐ１Ｄ７特異抗体を用いる天然の又は組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の精製
天然の又は組換え型１５８Ｐ１Ｄ７は、１５８Ｐ１Ｄ７に特異的な抗体を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより実質的に精製される。イムノアフィニティーカラムは、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を、ＣＮＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Amersham Pharmacia Biotech）等のクロマトグラフ樹脂と共有結合させることにより構築される。結合後、樹脂は、製造指示書に従って、ブロックされ、洗浄される。
１５８Ｐ１Ｄ７を含む培地を、イムノアフィニティーカラムに通じ、そのカラムを、優先的な光吸収を可能にする条件下（例えば、洗浄剤の存在下にある高イオンバッファ）、洗浄する。そのカラムは、抗体／１５８Ｐ１Ｄ７結合を分裂させる条件下（例えば、ｐＨ２からｐＨ３のバッファ、又は尿素若しくはチオシアネートイオン等の高濃度のカオトロープ（chaotrope))、溶出され、ＧＣＲ．Ｐが採取される。
［実施例３４］１５８Ｐ１Ｄ７と相互に作用する分子の同定
１５８Ｐ１Ｄ７、又はその生理活性断片は、１２１Ｉボルトン−ハンター試薬で標識化される（Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133:529参照）。マルチウェルプレートのウェル中に以前に配置した候補分子は、標識化した１５８Ｐ１Ｄ７とともにインキュベートされ、洗浄され、標識化した１５８Ｐ１Ｄ７を含むいくつかのウェルが、試験される。異なる濃度の１５８Ｐ１Ｄ７を用いて得られたデータを用いて、１５８Ｐ１Ｄ７の数、親和力、候補分子との会合の値を計算する。
［実施例３５］１５８Ｐ１Ｄ７腫瘍増殖促進の生体内試験
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の増殖した腫瘍細胞への効果を、膀胱癌細胞における遺伝子の過剰発現により生体内で確認することができる。例えば、ＳＣＩＤマウスは、ｔｋＮｅｏ空ベクター又は１５８Ｐ１Ｄ７を含む１×１０６膀胱癌細胞（ＳＣａＢＥＲ、ＵＭ−ＵＣ−３、ＨＴ１３７６、ＲＴ４、Ｔ２４、ＴＣＣ−ＳＵＰ、Ｊ８２及びＳＷ７８０細胞等）をそれぞれの脇腹にＳＱ注射されうる。
少なくとも２つのストラテジーを用いてよい：（１）プロモーターが宿主細胞系と適合されるように、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４号）、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、或いは例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター等の異種哺乳類のプロモーターから得られる構成プロモーター等、プロモーターの制御下の構成１５８Ｐ１Ｄ７発現が与えられる。（２）与えられるプロモーターが宿主細胞系と適合されるので、エクジソン（ecdysone）、ｔｅｔ等、誘導ベクター系の制御下の制限されている発現が使用されうる。その後、腫瘍体積が、明白な腫瘍の外観からモニターされ、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞がより速い速度で増殖するかどうか及び１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞により生じた腫瘍が病原力の変化（例えば、転移の亢進、血管新生化、化学療法剤に対する応答性の減少）の特徴を示すかどうか測定するための時間にわたって続けられる。さらに、マウスは、同一の細胞を同所移植されて、１５８Ｐ１Ｄ７が膀胱における局所増殖、或いは細胞の、特に肺又はリンパ節に、転移する能力に効果を及ぼすかどうか測定される（Fu, X., et al., Int. J. Cancer, 1991. 49:p.938-939;Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17:p.3239-3242;E. A., et al., J. Urol., 1999. 162:p.1806-1811）。さらに、この試験は、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７抗体又は細胞内抗体（intrabody）及び１５８Ｐ１Ｄ７アンチセンス分子又はリボザイム等の候補治療組成物の１５８Ｐ１Ｄ７阻害性効果を確認するのに有用である。
試験を、下記プロトコルを用いて行った。雄ＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス、５−６週齢（Charles River Laboratory、ウィルミントン、ＭＡ）を使用し、研究動物のケア及び使用のためのＮＩＨガイド（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従って厳重な管理環境下で管理した。１５８Ｐ１Ｄ７移入ＵＭ−ＵＣ−３細胞及び親細胞を、ＳＣＩＤマウスの皮下に注射した。各マウスに、５０％（ｖ／ｖ）のＭａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁した４×１０６の細胞を入れた。腫瘍の大きさを、２週間キャリパ（caliper）測定によりモニターした。最長寸法（Ｌ）及びそれに対して垂直の寸法（Ｗ）をとって、式Ｗ２×Ｌ／２により腫瘍体積を計算した。マン−ホイットニーＵ検定（Mann-Whitney U test）を用いて、腫瘍増殖の相違を評価した。全検定は、α＝０．０５での両側とした。これらの結果から、１５８Ｐ１Ｄ７はマウスにおける膀胱癌の増殖を亢進するということが示される（図２７）。
［実施例３６］生体内での膀胱及び前立腺腫瘍の１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体介在阻害
癌組織における１５８Ｐ１Ｄ７の著しい発現、並びに正常組織におけるその制限された発現は、１５８Ｐ１Ｄ７を、抗体治療として優れた標的にする。モノクローナル抗体標的が細胞表面タンパク質である場合では、抗体は、腫瘍増殖を阻害することについて有効であることが示されている（例えば、Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078又はURL:pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698参照）。前立腺癌におけるＰＳＡ及びＰＡＰ等、標的が細胞表面上にない場合では、抗体が、それらの抗体のタンパク質を発現する細胞の増殖を認識及び阻害することは今でも示されている（Saffran, D.C., et al., Cancer and Metastasis Reviews, 1999. 18: p.437-449）。制限された発現プロファイルを含むいくつかの細胞タンパク質では、１５８Ｐ１Ｄ７は、Ｔ細胞ベースの免疫療法のための標的となる。
したがって、ヒト膀胱癌マウスモデルにおける抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの治療の有効性は、実施例（１５８Ｐ１Ｄ７を発現するように設計されている「１５８Ｐ１Ｄ７腫瘍増殖促進の生体内試験」と題した実施例）において記載したように、１５８Ｐ１Ｄ７発現膀胱癌異種移植片又は膀胱癌株細胞でモデル化される。
腫瘍増殖及び転移形成についての抗体有効性が、例えば、マウス同所性膀胱癌異種移植モデルで、確認される。抗体は、この実施例において論じるように、未結合でありうるが、或いは従来技術において認識されるように、治療療法と複合化されうる。抗１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＡｂｓが、１５８Ｐ１Ｄ７発現膀胱及び前立腺腫瘍の形成を阻害するということが確認される（図３０及び３１）。抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓは、株化した同所性の腫瘍増殖の遅延及び腫瘍ベアリングマウスの生存の延長について試験される。これらの結果から、膀胱及び前立腺癌の局所及び進行段階の治療における抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの有用性が示される（例えば、Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078又はURL:pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698参照）。
抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの投与は、株化した同所性の腫瘍増殖を遅延させ、遠位の部位に対する転移を阻害し、腫瘍ベアリングマウスの生存の著しい延長をもたらす。これらの研究から、１５８Ｐ１Ｄ７が免疫療法のための誘引性の標的であり、局所性及び転移性膀胱癌の治療のための抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの治療可能性を示すということが示される。
この実施例では、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖したヒト膀胱腫瘍の増殖を効果的に阻害するために未結合の１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体；それに応じたそのような効果的なモノクローナル抗体の組み合わせも効果的である。
多様な未結合１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓを用いる腫瘍阻害
材料及び方法
１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体：
モノクローナル抗体は、「１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体の生成」と題した実施例において記載されるように、１５８Ｐ１Ｄ７に対して産生される。抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７を結合する能力について、従来技術として公知の技術に従って、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、及びイムノプレシピテーションによって特徴づけられる。ＥＬＩＳＡ及びウエスタン分析により測定されるように、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓのエピトープマッピングデータから、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質におけるエピトープが認識される。これらの抗体を含む膀胱癌組織及び細胞の免疫組織化学的分析が行われる。
モノクローナル抗体は、プロイテイン−Ｇセファロースクロマトグラフィーによって腹水又はハイブリドーマ腫瘍組織培養上清から精製され、ＰＢＳに対して透析され、フィルター無菌化され、−２０℃で保存される。タンパク質の定量は、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ（Hercules）、ＣＡ）により、行われる。治療用モノクローナル抗体又は個々のモノクローナル抗体の混合物を含む反応混液が、調製され、膀胱腫瘍異種移植片の皮下又は同所性の注射を受けるマウスの治療のために使用される。
膀胱癌株細胞
１５８Ｐ１Ｄ７を発現する膀胱癌株細胞（Ｓｃａｂｅｒ、Ｊ８２、ＵＭ−ＵＣ−３、ＨＴ１３７６、ＲＴ４、Ｔ２４、ＴＣＣ−ＳＵＰ、Ｉ８２及びＳＷ７８０）は、Hubert, R.S., et al., STEAP:ヒト前立腺腫瘍において高発現される前立腺特異細胞表面抗原(a prostate-specific cell-surface antigen highly expressed in human prostate tumors). Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25):14523-8において記載されるように、レトロウイルス遺伝子導入によって生成される。抗１５８Ｐ１Ｄ７染色は、ＦＩＴＣ接合ヒツジ抗マウス抗体を用いることによって検出され、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ−ＸＬフローサイトメトリーでの分析が続いて行われる。
生体内マウスモデル
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍は、雄ＳＣＩＤマウスの右脇腹において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(Collaborative Research)を含む１：１希釈で混合した１×１０６個の１５８Ｐ１Ｄ７発現膀胱癌細胞を注射することによって生成される。腫瘍形成についての抗体有効性を試験するため、ｉ．ｐ．抗体注射が腫瘍細胞注射と同日に開始される。対照として、マウスが、精製したマウスＩｇＧ（ＩＣＮ）又はＰＢＳのどちらか；或いはヒト細胞において発現されない無関連抗原（irrelevant antigen）を認識する精製したモノクローナル抗原を注射される。予備試験では、腫瘍増殖におけるマウスＩｇＧ又はＰＢＳ間で、違いは見出されない。腫瘍の大きさは、ノギス（vernier caliper）測定により測定され、腫瘍体積は、長さ×幅×高さとして計算される。直径１．５ｃｍより大きいｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスは、犠牲にされる。抗１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＡｂｓの循環レベルが、捕捉ＥＬＩＳＡキット（Bethy Laboratories, Montogomery, TX）により測定される（例えば、Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078参照）。
同所性の注射は、例えば、二つの別の形態で、例えば、ケタミン／キシラジンによる麻酔下、行われる。第一の形態では、膀胱癌細胞の膀胱内注射剤が、膀胱内に尿道を通じて直接投与される（Peralta, E. A., et al., J. Urol., 1999. 162:1806-1811）。第二の形態では、「オンプランテーション（onplantation）」（Fu, X., et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: 938-939;Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17:p.3239-3242）と名付けられるが、腹壁を切開して、膀胱を露出させ、ｓ．ｃ．腫瘍に由来する膀胱腫瘍組織片（大きさにおいて１−２ｍｍ）を、膀胱の外壁上に外科的に接着させる。抗体は、腫瘍の注射又はオンプランテーションの時、或いは腫瘍株化をさせるため１−２週間後にマウスのグループに投与されうる。
１５８Ｐ１Ｄ７発現膀胱癌腫瘍の増殖を阻害する抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓ
一つの形態として、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの腫瘍形成への効果が、膀胱オンプランテーション同所性モデルを使用することによって試験される。ｓ．ｃ．腫瘍モデルと比較して、膀胱上に腫瘍組織の直接の外科的な付着を必要とする同所性モデルでは、局所的な腫瘍増殖、遠位部位における転移の発生、及び引き続いて起こる死亡が、結果として起こる（Fu, X., et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: 938-939;Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17:p.3239-3242）。この特徴は、ヒト病気の進行のより典型的な同所性モデルを作り、臨床上適切な終点において、それをｍＡｂｓの治療効果、並びに他の治療様式に従わせる。
したがって、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍細胞は、同所性オンプラントされ、２日後、マウスは、二つのグループに分けられ、２から５週間、週に３回、ａ）５０−２０００μｇ、通常２００−５００μｇの抗１５８Ｐ１Ｄ７ Ａｂ、又はｂ）ＰＢＳで治療される。マウスは、腫瘍増殖の徴候について毎週モニターされる。
記載したように、同所性の膀胱癌モデルの主な利点は、転移の発生を研究する能力である。株化した同所性の腫瘍を有するマウスにおける転移の形成は、肺及びリンパ節を含む組織部分の組織学的分析により研究される（Fu, X., et al., Int. J. Cancer, 1991. 49: 938-939;Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17:p.3239-3242)。さらに、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を用いてＩＨＣ分析が、その組織において行われうる。
株化した同所性の１５８Ｐ１Ｄ７発現膀胱腫瘍を有するマウスは、４週間の期間にわたって抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓ又はＰＢＳの１０００μｇ注射を投与される。両方のグループのマウスでは、高い腫瘍負荷量を設定させておき、マウスの肺及びリンパ節における転移形成の度数が確実に高くされる。マウスはその後、犠牲にされ、それらの局所膀胱癌並びに肺及びリンパ節組織が、組織学及びＩＨＣ分析により、腫瘍細胞の存在について分析される。
別の形態として、抗１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＡｂｓの腫瘍増殖への効果を、下記プロトコルを用いて試験した。雄ＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス、５−６週齢（Charles River Laboratory、ウィルミントン、ＭＡ）を使用し、研究動物のケア及び使用のためのＮＩＨガイドに従って厳重な管理環境下で管理した。
ＵＧ−Ｂ１、患者膀胱癌を使用して、異種移植モデルを確立した。ＳＣＩＤマウスにおいて定期的に管理した保存腫瘍を、無菌切開し、細かに切り刻み、プロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて温浸した。生成させた細胞懸濁液を、３７℃で一晩インキュベートして、均一単細胞懸濁液を得た。各マウスにおいて、その脇腹の皮下部に２．５×１０６セルを入れた。１５８Ｐ１Ｄ７に対するマウスのモノクローナル抗体を、その研究において、５００μｇ／マウスの投与量で試験した。ＰＢＳを、対照として用いた。ＭＡＢｓを、合計１２投与量について週２回、腹膜内投与し、これを腫瘍細胞注射と同日に開始した。腫瘍の大きさを、週２回、キャリパ測定によりモニターした。最長寸法（Ｌ）及びそれに対して垂直の寸法（Ｗ）をとって、式Ｗ２×Ｌ／２により腫瘍体積を計算した。その結果から、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓはマウスにおけるヒト膀胱癌腫の増殖を阻害する能力があるということが示される（図３０）。
株化した１５８Ｐ１Ｄ７発現前立腺癌腫瘍の増殖を遅延させる抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓ
別の形態として、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓの腫瘍増殖への効果を、下記プロトコルを用いて試験した。雄ＩＣＲ−ＳＣＩＤマウス、５−６週齢（Charles River Laboratory、ウィルミントン、ＭＡ）を使用し、研究動物のケア及び使用のためのＮＩＨガイドに従って厳重な管理環境下で管理した。ＬＡＰＣ−９ＡＤ、アンドロゲン依存ヒト前立腺癌を使用して、異種移植モデルを確立した。保存腫瘍を、ＳＣＩＤマウスにおいて定期的に管理した。移植の日に、保存腫瘍を、収集し、壊死組織を取り除き、１ｍｍ３の小片まで細かに切り刻んだ。各マウスにおいて、右脇腹の皮下部に４つの小片の組織を入れた。１５８Ｐ１Ｄ７に対するマウスモノクローナル抗体を、それぞれ５００μｇ／マウス及び５００μｇ／マウスの投与量で試験した。ＰＢＳ及び抗ＫＬＨモノクローナル抗体を、コントロール（対照）として使用した。研究コホートを、各グループにおいて６マウスの４グループで構成した。Ｍａｂｓを、合計８回投与量で週２回腹膜内投与した。治療を、腫瘍体積が４５ｍｍ３に達したときに開始した。腫瘍の大きさを、週２回キャリパ測定によりモニターした。最長寸法（Ｌ）及び及びそれに対して垂直の寸法（Ｗ）をとって、式Ｗ２×Ｌ／２により腫瘍体積を計算した。適用可能な場合には、スチューデントのｔ検定及びマン−ホイットニーＵ検定を用いて、腫瘍増殖の相違を評価した。全検定は、α＝０．０５での両側とした。これらの結果から、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓはマウスにおいて株化したヒト膀胱癌腫の増殖を遅らせる能力があるとということが示される（図３１）。
これらの研究から、膀胱癌及び前立腺癌の惹起及び進行における抗１５８Ｐ１Ｄ７の抗腫瘍効果が広範となることが示され、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体がマウスモデルにおける１５８Ｐ１Ｄ７発現組織（表１）の増殖を阻害すること及び遅延させることにおいて効果的であることが示される。抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、腫瘍形成を阻害し、既に株化した腫瘍の増殖を遅らせ、治療したマウスの生存を延長させる。さらに、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓは、たとえ大きい腫瘍負荷量下であっても、局所性の膀胱癌の遠位部位への拡散に対して著しい阻害効果を示す。したがって、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂｓは、腫瘍増殖の減少、転移の減少、及び生存の延長を含む主な臨床上関連性のある終点において効果的である。
［実施例３７］公知のシーケンスに対する１５８Ｐ１Ｄ７のホモロジー比較
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、９５．１ｋＤａの計算された分子量及び６．０７のｐｌの８４１アミノ酸を有する。１５８Ｐ１Ｄ７は、原形質膜蛋白（0.46 PSORT http://psort.nibb.ac.jp/form.html）でありそれが拡散タンパク質である可能性を有する（ＰＳＯＲＴにより６５％ http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)と予想される。１５８Ｐ１Ｄ７は、ａａ６２６から６２７の間でポテンシャルな切断部位を有し、ａａ３−２５でポテンシャルシグナルを有する。
１５８Ｐ１Ｄ７は、アミノ末端が、タイプ１の膜内外タンパク質（www at.cbs.dtu.dk/services/TMHMMにある）のトポロジーと一致して、外側に存するということについて高い可能性を有するアミノ酸６１１−６３３からの単一の膜内外タンパク質領域を含む。可視化されるものはまた、アミノ末端シグナルペプチドの存在と一致して、アミノ酸３−２５からの短い疎水性の伸長となる。ＴＭＢＡＳＥ（K. Hofmann, W. Stoffel, ＴＭＢＡＳＥ−Ａ 膜内外タンパク質セグメントのデータベース（database of membrane spanning protein segments) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166, 1993）を利用するホフマン（Hofmann）及びストッフェル（Stoffel）のＴｍｐｒｅｄアルゴリズムに基づくと、１５８Ｐ１Ｄ７は、アミノ末端が内側に、カルボキシル末端が外側に存するという配位をもつアミノ酸６０９−６３３からの一次膜内外領域及びアミノ酸３−２５からの二次膜内外領域（プロット上で０より大きい値をもつ近接するアミノ酸は、膜内外領域であるという高い可能性を有する）を含む。別のモデルも、１５８Ｐ１Ｄ７は、アミノ末端が外側にありタンパク質がアミノ酸３−２５からの二次膜内外ドメインシグナルペプチド及びａａ６１５−６３３からの一次膜内外ドメインを含むタイプ１の膜内外タンパク質であると予想される。膜内外予想アルゴリズムは、（.expasy.ch/tools/）のｗｗｗで検出されるＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを通じて入手される。
(.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)のｗｗｗで検出されるＮ．Ｃ．Ｂ．Ｉ．のＰｕｂＭｅｄウェブサイトの使用により、１５８Ｐ１Ｄ７が、９７％同定及び９７％ホモロジー（図４及び図５Ａ）で、未知の機能の仮想タンパク質ＦＬＪ２２７７４（ＰｕｂＭｅｄ登録：ｇｉ１４１４９９３２）と最良のホモロジーを示すということがタンパク質レベルで発見された。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、３６％同定及び５２％ホモロジー（図５Ｂ）でＩＧＦＡＬＳ（インシュリン様成長因子結合タンパク質、酸不安定サブユニット（ＰｕｂＭｅｄ登録：ｇｉ６６９１９６２）と類似したヒトタンパク質と、２５％同定及び３９％ホモロジーでスリット（Ｓｌｉｔ）タンパク質と、並びに２６％同定及び４３％ホモロジーでＦＬＲＴ２、及び３４％同定及び５３％ホモロジーでＦＬＲＴ３を含むタンパク質ＦＬＲＴ（フィブロネクチン様ドメイン含有高ロイシン膜内外タンパク質のロイシンリッチ反復膜内外ファミリーとのホモロジーを示す。
インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）は前立腺、乳、脳及び卵巣の癌を含む腫瘍の増殖において重要な役割を果たすことが明らかにされている（O’Brian et al., Urology. 2001, 58:1;Wang J et al Oncogene. 2001, 20:3857;Helle S et al, Br J Cancer.2001, 85:74）。ＩＧＦは、特異細胞表面レセプターと結合することによって、並びに生存及びマイトジェン経路を活性化することによって発癌効果を生ずる（Babajko S et al, Med Pedoatr Oncol. 2001, 36:154;Scalia P et al, J Cell Biochem. 2001, 82:610)。インシュリン様成長因子の活性は、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）及びＩＧＦ−ＢＰの酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）により制御される（Zeslawski W et al, EMBO J. 2001, 20:3638;Jones JI及びClemmons DR. Endocr. Rev. 1995, 16:3）。プラズマ中に、最大量のＩＧＦが、ＩＧＦ−ＢＰ及びＡＬＳを含む三元複合体として存在する（Jones JI及びClemmons DR. Endocr. Rev. 1995, 16:3）。ＡＬＳとの会合は、脈管構造における三元複合体の保持を可能にし、その寿命を延ばす（Ueki et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:6868）。マウスにおける研究から、変異体ＡＬＳを保有するマウスが増殖不足を示すということを明らかにし、ＡＬＳが腫瘍細胞の増殖において決定的な役割を果たすということを示すことによって、細胞増殖に対するＡＬＳの貢献度が示される（Ueki et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:6868）。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、ＩＧＦ三元複合体の形成を促進することにおいて、ＩＧＦ−ＡＬＳ様タンパク質として貢献する。１５８Ｐ１Ｄ７誘導ＩＧＦ複合体形成は、生体内で悪性腫瘍の増殖を促進する１５８Ｐ１Ｄ７を発現する腫瘍細胞の増殖の増加を引き起こす。ＩＧＦ複合体の誘導は、誰にも阻害する中和能力、又は促進形態、三元相互作用を高める能力を有するモノクローナル抗体について測定することを可能にする。
スリットタンパク質を、軸索ガイダンス及びオリエンテーションを規定する分泌タンパク質としてショウジョウバエで先ず同定した（Rajagopalan S et al, Cell. 2000, 103:1033;Chen J et al, Neurosci. 2001, 21:1548）。哺乳類相同体を、マウス及びヒトにおいてクローン化した。ここでマウス及びヒトは、遊走及び走化性を制御することが示される（Wu J et al, Nature. 2001, 410:948;Brose K Tressier M, Curr Opin Neurobiol. 2001, 10:95）。スリットタンパク質は、二つの異なる細胞下部位（subcellular site）で、細胞段階次第で上皮細胞の内部に、主にミトコンドリア中に局在し及びより周密的な細胞における細胞表面を標的とするスリット３と共に、局在する（Little MH et al, Am J Physiol Cell Physiol. 2001. 281:C486）。示差スリット局在は、スリットが分泌され、細胞表面と会合され、又はミトコンドリア内で保持されるかどうか別々に作用する可能性があることを示唆する。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、細胞表面上でラウンドアバウトレセプター（roundabout receptors(Eobos)）と結合するという点で、スリット様タンパク質として作用する。１５８Ｐ１Ｄ７は、マウスＳｌｉｔｒｋ６遺伝子、ロイシンリッチレセプター（ＬＲＲｓ）の新ファミリーのメンバーとのホモロジー（全長に沿って８３％同一性）を有する。ＬＲＲｓのスリットファミリーは、神経突起増殖及び発生の間の軸索ガイダンスに含まれる。これらのタンパク質も、肺、腎臓及び他の器官における形態形成を枝分かれさせるための役割を与えることによって、器官発生において役割を果たす。いくつかのＬＲＲｓの結晶構造が決定されている。これらのタンパク質は、中心可動部の両側においてＬＲＲｓを有する蹄鉄様の形をとる。この蹄鉄形は、他のタンパク質（結合パートナー）が相互に作用する場合には、中央ポケットを形成する可能性がある。用語 結合パートナーには、リガンド、レセプター、基質、抗体、及び結合パートナーの特定の位置及び１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチド間での接触又は近接により１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドと相互に作用する他の分子が含まれる。１５８Ｐ１Ｄ７ポリペプチドの結合パートナーは、器官内で、上皮及び間葉細胞の両方において発現される。ＬＲＲｓのスリットファミリーの公知の結合パートナーには、遺伝子及びグリピカン（glypican）の両方のＲｏｂｏファミリーが含まれる。これらのポテンシャルタンパク質相互作用パートナーの両方は、ヒト癌において異常発現される。Ｒｏｂｏは、接着分子として働くＩｇ様タンパク質である。特異的Ｒｏｂｏ及びスリットタンパク質の相互作用により、細胞内シグナル伝達カスケード次第で、反発又は誘引の何れかである最終的な結果を伴って細胞遊走がもたらされる。スリットのＲｏｂｏとの相互作用を阻害する突然変異は、発現の間、ニューロンの遊走を防止することをできなくする原因となる。さらに、機能的な相互作用を阻害する突然変異は、発現している肺における器官不全及び過剰増殖を招く。変異分析により、さらにＬＲＲ領域がこれらのレセプターの生物活性のために必要とされるということが明らかにされている。１５８Ｐ１Ｄ７は、膀胱及び肺に由来する癌を含む各種のヒト癌において過剰発現される。このタンパク質の異常発現は、１５８Ｐ１Ｄ７と近接した細胞の表面上の特異結合パートナーとの間のタンパク質相互作用を阻害又は促進することより、細胞増殖の増強、生存、転移の増大及び血管形成を招く。１５８Ｐ１Ｄ７のＲｏｂｏレセプター（Ｒｏｂｏ−１、−２、−３及び−４）との結合は、生体外で、組換えタンパク質として、かつ細胞表面分子として観察される。生物学的効果は、Ｒｏｂｏ−１、−２、−３又は−４レセプター又はグリピカン結合パートナーが細胞表面上で１５８Ｐ１Ｄ７と結合するときに、誘発される。これらの活性は、細胞ベースの測定で、接着、遊走の増大又は反発により検出される。１５８Ｐ１Ｄ７及びＲｏｂｏレセプター間の相互作用は、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍細胞と内皮又はＲｏｂｏレセプターを発現する他の細胞型間の接着の増大を招き、腫瘍細胞の拡散及び転移並びに血管形成の増大を招く。さらに、１５８Ｐ１Ｄ７及びＲｏｂｏレセプター間の会合は、生体外測定において、相互作用を遮断する（又は高める）能力を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングすることを可能にする。そのような抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍の増殖への調節効果を有する。
膜内外タンパク質のＦＬＲＴ（フィブロネクチン様ドメイン含有高ロイシン膜内外タンパク質ファミリーは、高システインドメイン、フィブロネクチン／コラーゲン様モチーフ及び細胞内末端（intracellular tail）のそばに隣接した１０高ロイシン反復含む三つのメンバー、ＦＬＲＴ１、ＦＬＲＴ２及びＦＬＲＴ３を有する（Lacy SE et al, Genomics 1999, 62:417）。三つのタンパク質の全体構造に基づくと、細胞付着における役割及びレセプターシグナル伝達が予想される。ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子と共発現され、活性化後に誘導され、ＦＧＦによるシグナル伝達の阻害後に減数分裂される、ＦＬＲＴ３のアフリカツメガエルの相同分子種（ＸＦＬＲＴ３）を、同定した（Bottcher RT et al, Nature Cell Biol 2004, 6:38）。ＦＧＦＲ（ＦＧＦレセプター）とＸＦＬＲＴ３との間の相互作用は、ＸＦＬＲＴ３がＭＡＰキナーゼ経路によりＦＧＦ誘導シグナル伝達を調節することを示す。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質は、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２）経路によりＦＧＦ誘導シグナル伝達の調節を誘発するＦＧＦＲとの複合体を形成する。ＦＧＦ誘導シグナルは、細胞の増殖能力の増大を招く１５８Ｐ１Ｄ７の発現によって増強される。これは、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌細胞の制御不能の増殖を著しく促進し、生体外で優位な細胞増殖に貢献する。１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質とＦＧＦＲとの相互作用は、誰にもこれら二つの分子の会合を阻害する（又は高める）能力を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングすることを可能にする。そのような抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７発現腫瘍の増殖への調節効果を有する。
［実施例３８］シグナル伝達経路の同定及び確認
多くの哺乳類のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互に作用し、シグナル伝達経路を制御することに関与すると報告されている（J Neurochem. 2001; 76:217-223）。特に、ＩＧＦ及びＩＧＦ−ＢＰは、マイトジェン（分裂促進）及び生存経路を制御すると示されている（Babajko S et al., Med Pediatr Oncol. 2001, 36:154；Scalia P et al, J Cell Biochem. 2001, 82:610）。免疫沈降法及びウエスタンブロット技術を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７と相互作用し、シグナル伝達現象を媒介するタンパク質が同定される。ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−１等、並びにＥＲＫ、ｐ３８等のマイトジェン／生存カスケードを含む、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、等のリン脂質経路、接着及び遊走経路を含む、癌生物学において役割を果たすと知られているいくつかの経路は、１５８Ｐ１Ｄ７によって制御される（Cell Growth Differ. 2000, 11:279；J Biol Chem. 1999, 274:801；Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913）。生物情報学的分析から、１５８Ｐ１Ｄ７は、セリン／スレオニン並びにチロシンキナーゼによってリン酸化されうるということが明らかにされた。したがって、１５８Ｐ１Ｄ７のリン酸化が、本発明により与えられて、上記列挙された経路の活性化へ導く。
例えば、ウエスタンブロット技術を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７のこれらの経路を制御する能力が確認される。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する又は欠く細胞は、未処理の状態にされるか又はサイトカイン、ホルモン及び抗インテグリン抗体で刺激された状態にされる。
ＥＲＫ、ｐ３８、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣ及び他のシグナル伝達分子のリン酸化並びに制御を検出するため、抗リン酸特異抗体（Cell Signaling、Santa Cruz Biotechnology）を用いて、細胞ライセートが分析される。158P1D7がシグナル伝達経路の制御において役割を果たすとき、個別的であれ共同的であれ、それは診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
158P1D7が細胞において公知のシグナル伝達経路を直接的又は間接的に活性化することを確認するため、ルシフェラーゼベース転写レポーター測定（luciferase（luc） based transcriptional reporter assay）が、個々の遺伝子を発現する細胞について行われる。これらの転写レポーターは、よく特徴づけられたシグナル伝達経路の下流にある公知の転写因子（transcription factor）のためのコンセンサス結合部位を含む。そのレポーター及びこれらの会合（結合）した転写因子、シグナル伝達経路、及び活性化刺激の例を、下記に列挙する：
１．ＮＦｋＢ−ｌｕｋ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｋ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｋ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｋ、アンドロゲン；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．Ｐ５３−ｌｕｋ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｋ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
遺伝子媒介効果が、ｍＲＮＡ発現を示す細胞において測定される。ルシフェラーゼレポータープラスミドが、脂質媒介移入（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）により誘導される。ルシフェラーゼ活性、相対転写活性の指標、がルシフェリン基質を含む細胞抽出物のインキュベーションにより測定され、反応物の発光が、照度計によりモニターされる。
１５８Ｐ１Ｄ７により活性化したシグナル伝達経路は、遺伝子座が決定され、治療標的の同定及び確認のために使用される。１５８Ｐ１Ｄ７が、細胞シグナル伝達に関与するとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例３９］腫瘍進行における関与
１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子は、癌細胞の増殖に寄与しうる。腫瘍増殖における１５８Ｐ１Ｄ７の役割は、前立腺、大腸、膀胱及び腎臓の株細胞、並びに１５８Ｐ１Ｄ７を安定して発現させるべく設計されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む各種の一次の及び形質移入された株細胞において確認される。１５８Ｐ１Ｄ７を欠く親細胞及び１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞は、十分実証された増殖測定（例えば、Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61、Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288参照）を用いて細胞増殖について評価される。
形質移入プロセスにおける１５８Ｐ１Ｄ７の役割を確認するため、コロニー形成測定法においてその効果を検討する。１５８Ｐ１Ｄ７を欠く親ＮＩＨ３Ｔ３細胞が、厳密且つより任意の条件下で軟寒天を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７を発現するＮＨＩ−３Ｔ３細胞と比較される（Song Z/ et al. Cancer Res. 2000, 60:6730）。
癌細胞の侵入及び転移における１５８Ｐ１Ｄ７の役割を確認するため、十分確立された測定法、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ測定法（Becton Dickinson）が使用される（Cancer Res. 1999, 59:6010）。１５８Ｐ１Ｄ７を欠く前立腺、大腸、膀胱及び腎臓の株細胞を含む対照細胞は、それぞれ１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞と比較される。細胞は、蛍光色素、カルセインを負荷され、基底膜類似物で被覆されたＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートの上部ウェルに入れられる。侵入は、全細胞群の発光を基準とした、より低いチャンバーでの細胞の発光により測定される。
１５８Ｐ１Ｄ７も、細胞周期（分裂周期）及びアポトーシスにおいて役割を果たしうる。親細胞、及び１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞は、十分に確立されたＢｒｄＵ測定法（Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136:247）を用いて、細胞周期制御における相違について比較される。手短に言えば、細胞は、最適（完全血清及び制限（低血清）条件の両方の下、増殖され、ＢｒｄＵで標識化され、抗ＢｒｄＵ Ａｂ及びヨウ化プロピジウムで染色される。細胞は、細胞周期のＧ１、Ｓ、及びＧ２Ｍ段階に入ったことについて分析される。一方、ストレスのアポトーシスへの影響は、正常及び腫瘍膀胱細胞を含む、対照の親細胞及び１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞において評価される。設計された、かつ親の細胞は、パクリタクセル、ゲムシタビン等の各種の化学療法剤、及びシクロヘキシミド等のタンパク質合成阻害剤で治療される。細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色され、細胞死が、ＦＡＣＳ分析によって測定される。１５８Ｐ１Ｄ７による細胞死の調節は、腫瘍の進行及び腫瘍の負荷を制御することにおいて重大な役割を果たす。
１５８Ｐ１Ｄ７が、細胞増殖、形質移入、侵入又はアポトーシスにおいて役割を果たすとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４０］血管形成における関与
血管形成又は新たな毛細血管形成は、腫瘍増殖にとって必要である（Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353;Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441）。いくつかの測定法が、組織培養測定、内皮細胞管形成、及び内皮細胞増殖等、生体外及び生体内での血管形成を測定すべく開発されている。これらの測定法及び生体外新血管新生化を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７の血管新生への効果が、確認される。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現するよう設計された内皮細胞は、管形成及び増殖測定を用いて評価される。１５８Ｐ１Ｄ７の効果も、動物モデル生体内で確認される。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する又は欠く細胞は、免疫無防備状態マウスに皮下移植される。内皮細胞の遊走及び血管形成は、免疫組織化学的技術を用いて、５−１５日後に評価される。１５８Ｐ１Ｄ７が血管形成に影響を及ぼすとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４１］転写の制御
１５８Ｐ１Ｄ７の核への上記示した局在化、並びにシグナル伝達経路を活性化すること及び必須の細胞機能を制御することがわかっているそのＩＧＰ−ＢＰとの類似性により、その真核生物の遺伝子の転写制御における役割に基づく１５８Ｐ１Ｄ７の本発明の使用が裏づけられる。遺伝子発現の制御が、例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する又は欠く細胞における遺伝子発現を研究することによって確認される。この目的のため、二つのタイプの実験が行われる。
実験の第一のセットとして、親及び１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞からのＲＮＡが抽出され、市販されている遺伝子アレイ（クロンテック）とハイブリダイズされる（Smid-Koopman E et al. Br J Cancer. 2000. 83:246）。休止細胞並びにＦＢＳ又はアンドロゲンで処理した細胞が比較される。特異的に発現した遺伝子は、技術として公知の手法に従って同定される。その特異的に発現した遺伝子は、その後、生物学的経路に遺伝子座が決定される（Chen K et al., Thyroid. 2001. 11:41.）。
実験の第二のセットとして、特異的な転写経路活性化が、ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＥＬＫ１−ｌｕｃ、ＡＲＥ−ｌｕｃ、ｐ５３−ｌｕｃ、及びＣＲＥ−ｌｕｃ：を含む市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、評価される。これらの転写レポーターは、よく特徴づけられたシグナル伝達経路の下流にある公知の転写因子のためのコンセンサス結合部位を含み、経路活性化を確認し経路活性化の正及び負のモジュレーター（修飾物質）についてスクリーニングするための良好な手段である。
１５８Ｐ１Ｄ７が遺伝子制御において役割を果たすとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４２］１５８Ｐ１Ｄ７の細胞下局在化
１５８Ｐ１Ｄ７の細胞位置は、細胞生物学において広く用いられる細胞下分画技術を用いて評価される（Storrie B, et al. Methods Enzymol. 1990;182:203-25）。前立腺、腎臓及び膀胱株細胞を含む各種の株細胞並びに１５８Ｐ１Ｄ７を発現するよう設計された株細胞は、核、細胞基質及び膜の画分に分けられる。遺伝子発現並びに核、重膜(heavy membrane)（リソソーム、ペルオキシソーム、及びミトコンドリア）、軽膜(light membrane)（原形質膜及び内質膜）、及び可溶タンパク質画分における位置は、ウエスタンブロッティング技術を用いて、試験される。
一方、２９３Ｔ細胞は、個々の遺伝子をコード化する発現ベクターを形質移入され、ＨＩＳタグをつけられ（PCDNA 3.1 MYC/HIS, Invitrogen）、これらの遺伝子の細胞下局在化が前記のように測定される。手短に言えば、形質移入された細胞は、収集され、示差細胞成分分画法に付される（Pamberton, P.A. et al, 1997, J of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1697-1706）。ＨＩＳタグ遺伝子の位置は、ウエスタンブロッティングに従う。
１５８Ｐ１Ｄ７を用いて、蛍光抗体法及び免疫組織化学により細胞局在化を実証することができる。例えば、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する又は欠く細胞が、顕微鏡スライドに付着され、抗１５８Ｐ１Ｄ７特異的Ａｂで染色される。細胞は、ＦＩＴＣ結合された二次抗特異的Ａｂとともにインキュベートされ、螢光顕微鏡により分析される。一方、１５８Ｐ１Ｄ７を欠く又は発現する細胞及び組織は、本願において記載したようにＩＨＣにより分析される。
１５８Ｐ１Ｄ７が特異細胞区画に局在しているとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４３］タンパク質輸送における１５８Ｐ１Ｄ７の関与
スリットタンパク質との類似性のため、１５８Ｐ１Ｄ７は、細胞内輸送及びミトコンドリア及び／又は核の区画への保持を制御することができる。そのタンパク質の輸送における役割は、十分に確立された方法（Valetti C. et al. Mol Biol Cell. 1999, 10:4107）を用いて確認されうる。例えば、ＦＩＴＣ結合α２−マクログロブリンが、１５８Ｐ１Ｄ７発現及び１５８Ｐ１Ｄ７陰性細胞とともにインキュベートされる。ＦＩＴＣ−α２−マクログロブリンの位置及び取り込みは、螢光顕微鏡を用いて可視化される。別のアプローチとして、１５８Ｐ１Ｄ７の小胞タンパク質との共存が、共沈及びウエスタンブロッティング技術及び螢光顕微鏡によって確認される。
一方、１５８Ｐ１Ｄ７発現及び１５８Ｐ１Ｄ７欠除細胞は、ｂｏｄｉｐｙ−ｃｅｒａｍｉｄｅ標識ウシ血清アルブミンを用いて比較される（Huber L et al. Mol. Cell. Biol. 1995, 15:918）。簡単には、細胞が、標識ＢＳＡを吸収するようにさせられ、輸送を起こすように断続的に４℃又は１８℃の環境におかれる。細胞は、ゴルジ、小胞体等を含む特異的小胞区画中の標識ＢＳＡの存在について、異なる時点で、螢光顕微鏡下、調べられる。
別の形態として、１５８Ｐ１Ｄ７の膜輸送への影響が、ビオチン−アビジン複合体を用いて、調べられる。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する又は欠く細胞は、一時的にビオチンと共にインキュベートされる。その細胞は、各種の期間、４℃の環境におかれ、又は３７℃まで一時的に温められる。その細胞は、分画され、特異細胞区画中のアビジンの存在についてアビジン親和性沈降によって調べられる。そのような測定系を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７の小胞輸送への影響を変えるタンパク質、抗体及び小分子が同定される。１５８Ｐ１Ｄ７が細胞内輸送において役割を果たすとき、１５８Ｐ１Ｄ７は、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４４］タンパク質−タンパク質会合
ＩＧＦ及びＩＧＦ−ＢＰタンパク質は、他のタンパク質と相互に作用し、それによりタンパク質局在化、生物活性、遺伝子転写、及び細胞形質転換を制御しうるタンパク質複合体を形成することが明らかにされている（Zeslawski W et al, EMBO J. 2001, 20:3638;Yu H, Rohan T, J Natl Cancer Indt. 2000, 92:1472）。イムノプレシピテーション（免疫沈降）技術並びに二つの酵母ハイブリッド系を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７と会合するタンパク質が同定される。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞及び１５８Ｐ１Ｄ７を欠く細胞からの免疫沈降物は、特異的なタンパク質−タンパク質会合について比較される。
１５８Ｐ１Ｄ７の、ＥＧＦ及びＩＧＦレセプター等のレセプターとの会合、ＩＧＦ−ＢＰ、細胞骨格タンパク質等の細胞内タンパク質との会合の程度を測定するため、研究が行われる。１５８Ｐ１Ｄ７陽性細胞と１５８Ｐ１Ｄ７陰性細胞を比較する研究、並びに非刺激／休止細胞とサイトカイン、増殖因子及び抗インテグリンＡｂ等の上皮細胞活性化物質で処理された細胞を比較することにより、特有のタンパク質−タンパク質相互作用が明らかにされる。
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、二つの酵母ハイブリッド方法論を用いて確認される（Curr Opin Chem Biol. 1999, 3:64）。転写因子の活性化ドメインと融合されるタンパク質のライブラリを保有するベクターは、１５８Ｐ１Ｄ７−ＤＮＡ−結合ドメイン融合タンパク質及びレポーター構築物を発現する酵母に導入される。タンパク質−タンパク質相互作用は、比色レポーター活性によって検出される。表面レセプター及びエフェクター分子との特異的な会合から、熟練した者（当業者）は、１５８Ｐ１Ｄ７の作用様式を知り、それに従って、癌の治療、予後徴候、予防及び／又は診断の標的が同定される。この測定法及び類似の測定法を用いて、１５８Ｐ１Ｄ７と相互に作用する小分子についての同定及びスクリーニングもされる。
１５８Ｐ１Ｄ７がタンパク質、又は小分子と会合するとき、それは、診断、予後徴候、予防及び治療の目的のための標的として使用される。
［実施例４５］１５８Ｐ１Ｄ７の転写変異体
転写変異体（バリアント）は、選択的転写（alternative transcription）又は選択的スプライシングにより生ずる同一の遺伝子からの各種の成熟ｍＲＮＡである。選択的転写物は、同一遺伝子からの転写物であるが、種々の点で転写を開始する。スプライスバリアントは、同一転写物から別々にスプライスされたｍＲＮＡ変異体である。真核生物においては、マルチエクソン遺伝子がゲノムＤＮＡから転写されるとき、エクソンのみを有し、かつアミノ酸配列への翻訳のために使用される機能性ＲＮＡを生ずるよう最初のＲＮＡはスプライスされる。したがって、与えられる遺伝子は、ゼロから多くの選択的転写物を有しうるし、各転写物は、ゼロから多くのスプライスバリアントを有しうる。各転写変異体は、特有のエキソン構造を有し、元の転写物とは異なるコード（翻訳）及び／又は非コード（５’又は３’末端）部分を有しうる。転写変異体は、同一若しくは同様の機能をもつ同様の又は異なるタンパク質についてコードすることができ、或いは異なる機能をもつタンパク質をコード化することができ、同時に同一の組織において、又は同時に異なる組織において、又は異なる時点で同一の組織において、又は異なる時点で異なる組織において発現されうる。転写変異体によりコード化されたタンパク質は、例えば、分泌対細胞内の、同様の若しくは異なる細胞又は細胞外の局在化をしうる。
転写変異体は、各種の技術として一般に認容された方法により同定される。例えば、選択的転写物及びスプライスバリアントは、完全長クローニング実験により、又は完全長転写物及びＥＳＴシーケンスの使用により同定される。先ず、全てのヒトＥＳＴを、互いに直接型又は間接型同一性を示すクラスターに分類した。次いで、同一クラスター内のＥＳＴを、サブクラスターにさらに分類し、これらを集めてコンセンサス配列を構築させた。その元の遺伝子配列は、コンセンサス配列（又は複数のコンセンサス配列）又は他の完全長シーケンスと比較される。各コンセンサス配列は、その遺伝子についてポテンシャルなスプライスバリアントである（例えば、URL www.doubleteist.com/products/c11_agentsOverview,jhtml参照）。たとえ完全長クローンでない変異体が同定されるときでも、その変異体のその部分は、抗原生成にとって、公知技術を用いる完全長スプライスバリアントのさらなるクローニングにとって非常に有用である。
さらに、コンピュータプログラムが、ゲノムシーケンスに基づいて転写変異体を同定する技術において利用できる。ゲノムベースの転写変異体同定プログラムには、ＦｇｅｎｅｓＨ(A. Salamov及びV. Solovyev、「ショウジョウバエのゲノムＤＮＡにおける最初からの遺伝子発見（Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA）」、Genome Research. 2000 April ; 10 (4): 516-22;Grail (URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm)並びにGenScan(URL genes. mit.edulGENSCAN. html)が含まれる。スプライスバリアント同定の一般的な議論に関し、プロトコルについては、例えば、Southan,C., ヒトプロテアーゼにおけるゲノム展望（A genomic perspective on human proteases), FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498 (2-3): 214-8; de Souza, S. J., et al., ＯＲＦ発現シーケンスタグを含むヒト染色体２２転写シーケンスの同定（Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags), Proc. Natl Acad SciUSA. 2000 Nov 7; 97 (23): 12690-3が参照される。
転写変異体のパラメータをさらに確認するため、完全長クローニング、プロテオーム確認（proteomic validation）、ＰＣＲベース変異体、及び５’ＲＡＣＥ変異体等の各種の技術が、技術として利用できる（例えば、 プロテオームの確認（Proteomic Validation): Brennan, S. O.,et al., Albumin banks peninsula ： エレクトロスプレー質量分析により特徴付けられる新たな終結変異体（a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry), Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17; 1433 (1-2): 321-6; Ferrant P, et al., 成熟カプリンα（ｓ１）−カゼインの多形態を生ずるプレメッセンジャーＲＮＡの異なるスプライシング（Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein), Eur J Biochem. 1997 Oct 1; 249(1) : 1-7）． ＰＣＲベース確認について（For PCR-based Validation):Wellmann S, eta/., ライトサイクラー技術による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）スプライスバリアントの特異的逆転写ＰＣＲ定量化（Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology), Clin Chem. 2001 Apr; 47 (4): 654-60; Jia, H. P., et al., ゲノム科学ベースのアプローチを用いる新たなヒトβ−デフェンシンの発見（Discovery of new human beta- defensins using a genomics-based approach), Gene. 2001 Jan 24; 263 (1-2): 211-8. ＰＣＲベース及び５’ＲＡＣＥ確認について（For PCR-based and 5’RACE Validation): Brigle, K. E., etal., マウス還元葉酸塩担体遺伝子の組織化及びバリアントスプライス形態の同定（Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms), Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353 (2): 191-8)。
ゲノム領域が癌において調節されるということが技術として知られている。遺伝子が位置するゲノム領域が特定の癌において調節されるとき、その遺伝子の選択的転写物又はスプライスバリアントもまた調節される。本願において開示されたことは、１５８Ｐ１Ｄ７が癌に関係がある特定の発現プロファイルを有するということである。１５８Ｐ１Ｄ７の選択的転写及びスプライスバリアントもまた、同一の又は異なる組織において癌に関与し、したがって、腫瘍結合マーカー／抗原（tumor-associated markers/antigens）として役立つ可能性がある。
完全長遺伝子及びＥＳＴシーケンスを用いて、４つの転写変異体を同定し、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．３、ｖ．４、ｖ．５及びｖ．６としてデザインした。元の転写物、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１におけるエクソンの境界を表ＢＩＬＬ−１に示した。１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１と比較して、転写変異体１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．３は、図１２に示すように、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１から２０６９−２３９５外れて、スプライスしていた。変異体１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．４は、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１の１１６２−２０９６外で、スプライスした。変異体１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．５は、１つのエクソンを５’末端に加え、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１の５’末端まで２ｂｐ、３’末端まで２８８ｂｐ伸長した。理論的には、空間的なオーダーでのエクソン、例えば、ｖ．５のエクソン１並びにｖ．３又はｖ．４のエクソン１及び２のそれぞれ異なる組み合わせは、ポテンシャルなスプライスバリアントである。
１５８Ｐ１Ｄ７の変異体には、膜内外モチーフを欠く変異体が含まれるが、変異体が分泌タンパク質であることを示すシグナルペプチドが含まれる（ｖ．４及びｖ．６）。そのようなｖ．４及びｖ．６等の分泌タンパク質は、癌存在及び進行の生物マーカーとして役立つ。癌患者の血清中のそのような変異タンパク質のレベルは、癌、特に、表Ｉに列挙した癌等の癌の疾患又はその進行の予後徴候マーカーとして役立つ。さらに、そのような分泌タンパク質は、モノクローナル抗体及び関連している結合分子の標的である。したがって、これらのような分泌タンパク質は、ヒト悪性腫瘍に対する診断、予後徴候、予防及び治療のための標的として役立つ。１５８Ｐ１Ｄ７の分泌変異体のターゲッティングは、その分泌変異体が細胞／組織に病理関連或いは癌関連の効果を及ぼすときに、特に好ましい。
表ＬＩ（ａ）−（ｄ）からＬＩＶ（ａ）−（ｄ）は、変異体変異体ベースについて示される。表ＬＩ（ａ）−（ｄ）は、転写変異体のヌクレオチド配列を示す。表ＬＩＩ（ａ）−（ｄ）は、転写変異体の、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１の核酸配列との位置関係を示す。表ＬＩＩＩ（ａ）−（ｄ）は、同定した読み枠配向（reading frame orientation）として転写変異体のアミノ酸翻訳を示す。表ＬＩＶ（ａ）−（ｄ）は、スプライスバリアントによりコード化されたアミノ酸配列の、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１の配列との位置関係を示す。
［実施例４６］１５８Ｐ１Ｄ７の一塩基多型
一塩基多型（ＳＮＰ）は、特異的な位置でのヌクレオチド配列（核酸配列）における一塩基対変異である。ゲノムの任意の点で、４つの可能性のあるヌクレオチド塩基対：Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／Ｃ及びＴ／Ａがある。遺伝子型（genotype）は、個体のゲノムにおける１又はそれ以上の位置の特異的な塩基対シーケンスを意味する。ハプロタイプ（haplotype）は、多くの場合、１つの遺伝子と関連した、又はいくつかの緊密結合遺伝子と関連した、同一のＤＮＡ分子（或いは、より高度な生体において同一の染色体）における１を超える位置の塩基対シーケンスを意味する。ｃＤＮＡにおいて生ずるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。このｃＳＮＰは、遺子によりコード化されたタンパク質のアミノ酸を変化させ、それに従ってタンパク質の機能を変化させる可能性がある。いくつかのＳＮＰは、遺伝病を引き起こす；これ以外のものは、表現型における量的変異並びに食事制限及び個体間での薬物を含む環境への反応に寄与する。それゆえ、ＳＮＰ及び／又は対立遺伝子の組み合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、遺伝病の診断、薬物反応及び投与量の測定、疾患の原因である遺伝子の同定、並びに個体間の遺伝子関係の分析を含む多くの用途を有する（P. Nowotny, J. M. Kwon及びA. M. Goate, 「ヒトの体質を分析するＳＮＰ分析（SNP analysis to dissect human traits）」, Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct ; 11 (5): 637-641;M. Pirmohamed and B. K. Park, 「有害な薬物反応に対する遺伝子感受性（Genetic susceptibility to adverse drug reactions）」, Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22 (6): 298-305;J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai及びA. Roses, 「通常の病原遺伝子の同定における一塩基多型の使用（The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes）」, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1) : 39-47;R. Judson, J. C. Stephens及びA. Windemuth, 「臨床応答におけるハプロタイプの予測力（The predictive power of haplotypes in clinical response）」, Pharmacogenomics. 2000 feb;1(1) : 15-26)。
ＳＮＰは、各種の技術として一般に認容された方法により同定される（P. Bean, 「ＳＮＰ標的発見の有望な企て（The promising voyage of SNP target discovery）」, Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20 (9): 18-20;K.M. Weiss,「ヒト差異の調査について（In search of human variation）」, Genome Res. 1998 Jul ; 8 (7): 691- 697;M. M. She,「高処理能力変異検出及び遺伝形質を決める技術による大規模遺伝薬理学研究の可能化（Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies）」, Clin. Chem. 2001 Feb; 47 (2): 164-172）。例えば、ＳＮＰは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）等のゲルベースの方法により多型性を示すＤＮＡ断片を配列決定することによって同定されうる。それらは、異なる個体からプールしたＤＮＡサンプルの直接のシークエンシング（配列決定）によって又は異なるＤＮＡサンプルからのシーケンスを比較することによっても発見されうる。公共及び私用のデータベースにおけるシーケンスデータの急速な蓄積に伴って、誰でもコンピュータプログラムを用いてシーケンスを比較することによりＳＮＰを発見することができる（Z. Gu, L. Hillier及びP. Y. Kwok,「サイバスペースで探す一塩基多型（Single nucleotide polymorphism hunting incyberspace）」, Hum. Mutat. 1998; 12 (4):221-225）。ＳＮＰは検証されうるし、個体の遺伝子型又はハプロタイプは、直接のシークエンシング及び高処理能力マイクロアレイ（high throughput microarray）を含む各種の方法により決定されうる（P. Y. Kwok,「一塩基多型の遺伝形質を決める方法（Methods for genotyping singlenucleotide polymorphisms）」, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258;M.Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines及びA. Duesterhoeft,「マスコードシステムでの高処理能力ＳＮＰ遺伝形質決定（High-throughput SNP genotyping with the Masscode system), Mol. Diagn. 2000 Dec; 5 (4): 329-340）。
前記記載の方法を用いて、一つのＳＮＰを、位置１５４６（Ａ／Ｇ）で、元の転写物、１５８Ｐ１Ｄ７ ｖ．１において同定した。選択的対立遺伝子（alternative allele）を含む転写物又はタンパク質を、変異体１５８Ｐ１Ｄ７ｖ．２と名付けた。図１７は、ＳＮＰ変異体の模式的なアラインメントを示す。図１８は、ヌクレオチド変異体に対応する、タンパク質変異体の模式的なアラインメントを示す。同一のアミノ酸配列をｖ．１としてコードするヌクレオチド変異体は、図１８において示されていない。ＳＮＰのこれらの対立遺伝子は、ここに別途示されて、異なる組み合わせ（ハプロタイプ）において、及びそのＳＮＰの部位を含む転写変異体（１５８Ｐ１Ｄ７ｖ．５等）のうち何れかにおいて生じうる。
［実施例４７］ヒトにおける抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の治療及び診断的使用
抗１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体は、ヒトにおける診断、予防、予後徴候及び／又は治療の目的のため、安全かつ効果的に使用される。抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂを含む癌組織及び癌異種移植片のウエスタンブロット及び免疫組織化学分析は、癌腫において強い広域染色（extensive staining）を示すが、正常組織において著しく低い又は検出不可能なレベルのものを示す。癌腫における及び転移性疾患における１５８Ｐ１Ｄ７の検出は、ｍＡｂの診断及び／又は予後徴候の指標としての有用性を示す。抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、それゆえ、疑わしい患者からの癌を検出すべく、腎臓生検材料の免疫組織化学等の診断用途において使用される。
フローサイトメトリーにより測定すると、抗１５８Ｐ１Ｄ７ｍＡｂは、癌腫細胞と特異的に結合する。したがって、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７の発現を示す局在型及び転移性癌の検出のため、放射性免疫シンチグラフィー及び放射性免疫治療等の診断用の全身画像処理（diagnostic whole body imaging applications)において(例えば、Potamianos S. , et. al. Anticancer Res 20 (2A): 925-948 (2000)参照）使用される。アルカリホスファターゼＢ１０（Meerson, N. R.,Hepatology 27 : 563-568 (1998)）で確認されるような、細胞外環境への１５８Ｐ１Ｄ７の細胞外ドメインの排泄又は放出は、疑わしい患者からの血清及び尿サンプル中の抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体による１５８Ｐ１Ｄ７の診断上の検出を可能とする。
１５８Ｐ１Ｄ７と特異的に結合する抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌の治療のための治療用途において使用される。抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、非結合型モダリティーとして、及び抗体がプロドラッグ、酵素、又は放射性同位元素等、技術としてよく知られている各種の治療又は画像処理モダリティーの一つに付着される結合型形態として使用される。前臨床試験において、非結合型及び結合型抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、ＳＣＩＤマウス癌異種移植モデル、例えば、腎臓癌モデルＡＧＳ−Ｋ３及びＡＧＳ−Ｋ６（例えば、「生体内での膀胱及び肺腫瘍の１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体介在阻害」と題した実施例参照）における腫瘍予防及び増殖阻害の効力について試験される。非結合型抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体及び結合型抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体のどちらも、単独で又は下記実施例において記載した他の治療と組み合わせて、ヒト臨床試験における治療モダリティーとして使用される。
［実施例４８］生体内でのヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の使用によるヒト癌腫の治療及び診断のためのヒト臨床試験
１５８Ｐ１Ｄ７におけるエピトープを認識する抗体は、本発明に従って使用され、表Ｉに列挙された腫瘍等の所定の腫瘍の治療において使用される。１５８Ｐ１Ｄ７発現レベルを含む、多数の要因に基いて、表Ｉに列挙された腫瘍等の腫瘍は、現に好ましい徴候である。これらの徴候のそれぞれと関連して、三つの臨床的なアプローチが、うまく遂行される。
Ｉ）補助的療法（adjunctive therapy）；補助的療法において、患者は、化学療法剤若しくは抗腫瘍剤及び／又は放射線療法と組み合わせて抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体で治療される。表Ｉに列挙された癌標的等の一次癌標的（primary cancer target)は、標準第一及び第二次療法(standard first and second line therapy)に対する付加抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体よって標準プロトコルの下、治療される。プロトコルデザインは、腫瘍質量の減少並びに標準的な化学療法の常用量を減少させる能力により評価される有効性に対処する。これらの投与量の減少は、化学療法剤の用量関連毒性を減少させることによって追加及び／又は長期治療を可能にする。抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、化学療法剤又は抗腫瘍剤、アドリアマイシン（進行型の前立腺癌腫）、シスプラチン（進行型の頭部及び頚部及び肺癌腫）、タキソール（乳癌）、及びドキソルビシン（前臨床）と組み合わせて、いくつかの補助的臨床試験において利用される。
ＩＩ）単独療法：腫瘍の単独療法における抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の使用と関連して、その抗体は、化学療法剤又は抗腫瘍剤を使用しないで、患者に投与される。一つの形態として、単独療法は、広範な転移性疾患を有する末期癌患者において臨床的に行われる。患者は、いくつかの疾患安定化を示す。試験から、癌性腫瘍を有する難治患者における効果が示される。
ＩＩＩ）画像化（画像処理）剤：放射性核種（例えば、ヨード又はイットリウム（Ｉ１３１、Ｙ９０））を抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体に結合させることにより、放射標識抗体は、診断及び／又は画像化剤として利用される。そのような役割において、標識抗体は、固形腫瘍、並びに、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する細胞の転移性病変の両方に局在化する。画像化剤としての抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の使用と関連して、その抗体は、腫瘍が残る及び／又は回復することを測定すべく、固形腫瘍の外科的治療への補助として、前外科的スクリーン並びに手術後の経過観察の両方として使用される。一つの形態として、（１１１Ｉｎ）−１５８Ｐ１Ｄ７抗体が、１５８Ｐ１Ｄ７を発現する癌腫を有する患者の第一相（ＰｈａｓｅＩ）ヒト臨床試験における画像化剤として使用される（類推により、例えば、Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)参照）。患者は、標準前側及び後側ガンマカメラ（standard anterior and posterior gamma camera）で追跡される。その結果から、一次病変及び転移性病変が同定されることが示される。
投与量及び投与の経路
その技術において通常の知識を有する者（当業者）により理解されているように、投薬条件は、診療所にある類似製品との比較により決定されうる。したがって、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、５から４００ｍｇ／ｍ２の範囲内の投与量で、例えば、安全性試験と関連して使用される、より低い投与量で、投与されうる。標的のための公知の抗体の親和力と基準とした、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の親和力は、類似の投与療法を決定するためにその技術において通常の知識を有する者により使用される一つのパラメータである。さらに、完全ヒト抗体である抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、キメラ抗体と比較して、より鈍いクリアランスを有する；したがって、そのような完全ヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を含む患者における投薬は、より低く、おそらく５０から３００ｍｇ／ｍ２の範囲内にでき、引き続き効果を残しうる。ｍｇ／ｋｇでの投与量の慣習的な測定値に対して、ｍｇ／ｍ２での投薬は、表面積に基づく測定値であり、幼児から成人まで全ての大きさの患者を含むようにデザインされる簡便な投薬測定値である。
三つの異なる送達のアプローチは、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の送達にとって有用である。慣習的な静脈内送達は、多くの腫瘍のための１つの標準的な送達技術である。しかしながら、卵巣、胆管、その他の管等の腫瘍等の腹腔における腫瘍と関連して、腹腔内投与が、腫瘍での抗体の投与量を高くするため及び抗体のクリアランスを最小化するためにも好ましいと判明する可能性がある。同様の方法において、所定の固形腫瘍は、領域性の環流（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）に適している脈環構造を有する。領域性の環流は、腫瘍の部位での抗体の投与量を高くし、抗体の短期クリアランスを最小化する。
臨床上の発展計画（clinical development plan（ＣＤＰ））
ＣＤＰは、補助的療法、単独療法と関連して、及び画像化剤として抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の治療に従い、これを発展させる。試験は先ず安全性を立証し、その後繰り返し投与における有効性を確認する。試験は、標準的な化学療法と、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体を加えた標準的な療法とを比較した盲検解除である。理解されているであろうが、患者の記録と関連して利用されうる一つの判定基準は、生検により測定される患者の腫瘍における１５８Ｐ１Ｄ７発現レベルである。
いくつかのタンパク質又は抗体輸液ベース治療と同様、安全性の懸念は、（i）サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、発熱、震え、悪寒；（ii）材料への免疫原性応答の発生（すなわち、抗体治療又はＨＡＨＡ応答への患者によるヒト抗体の発生）；並びに、（iii）１５８Ｐ１Ｄ７を発現する正常細胞に対する毒性に、主として関連がある。標準試験及び経過観察は、これらの安全性の懸念のそれぞれをモニターするのに利用される。抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、ヒト投与において安全であることがわかる。
［実施例４９］ヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体及び化学療法剤でのヒト臨床試験補助的療法
第一相ヒト臨床試験を、固形腫瘍、例えば、表Ｉに列挙した組織の癌の治療と関連して、ヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の６つの静脈内投与量の安全性を評価すべく開始する。その試験において、補助的療法としてシスプラチン、トポテカン、ドキソルビジン、アドリアマイシン、又はタキソール等であって、これらに限定されることのない、本願において定義した抗腫瘍剤又は化学療法剤に利用したときの抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の一回投与量の安全性が評価される。試験デザインには、下記スケジュールに従って治療の経過を通して、約２５ｍｇ／ｍ２から約２７５ｍｇ／ｍ２で段階的に増大させる抗体の投与量での、抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の６つの一回投与量の送達が含まれる：

Figure 2015057068
患者は、抗体及び化学療法の各投与ないし処理後、一週間厳密に従う。特に、患者は、上述した安全性の懸念について評価される：（i）サイトカイン放出症候群（cytokine release syndrome）、すなわち低血圧、発熱、震え、悪寒；（ii）材料への免疫原性応答の発生（すなわち、抗体治療又はＨＡＨＡ応答への患者によるヒト抗体の発生）；並びに、（iii）１５８Ｐ１Ｄ７を発現する正常細胞に対する毒性。標準試験及び経過観察を利用して、これらの安全性の懸念のそれぞれをモニターする。患者は、臨床上の結果、及び特にＭＲＩ又は他の画像診断法により検出されるような腫瘍質量の減少についても評価される。
抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、安全かつ有効であると実証され、第二相試験からその有効性が確認され、最適であった投与がさらに正確にされる。
［実施例５０］ヒト臨床試験：ヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体での単独療法
抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体は、上記議論した補助的試験と関連して安全であり、第二相ヒト臨床試験から、単独療法における有効性及び最適な投薬が確認される。そのような試験は、成し遂げられ、患者が抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の投与量の受け入れと同時に化学療法を受け入れないことを除外して、必然的に上記記載した補助的試験に対する同様の安全性及び結果分析をもたらす。
［実施例５１］ヒト臨床試験：ヒト抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体での診断画像処理
もう一度、上記議論した補助的療法は、上記議論したように安全性の判断基準の範囲内で安全であるので、臨床試験は、診断画像処理（画像化）剤として抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体の使用に関して行われる。プロトコルは、Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991）等の従来技術に記載されているのと実質的に同様の方法でデザインされる。その抗体は、診断モダリティーとして使用したときに、安全かつ有効であることが分かる。
［実施例５２］ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術は、腫瘍学に関連した各種の細胞測定に対して実行される。ＲＮＡｉは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により活性化される転写後遺伝子サイレンシングメカニズムである。ＲＮＡｉは、タンパク質発現において変化を引き起こし、及び遺伝子機能において実質的に変化を引き起こす特異的なｍＲＮＡ分解を誘発する。哺乳類細胞において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこれらのｄｓＲＮＡは、分解のため標的にするＲＮＡｉ経路、特に特異的ないくつかのｍＲＮＡを活性化するのに妥当な組成を有する。Elbashir S. M., et aL, 培養哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉を介在する２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖（Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells), Nature411 (6836): 494-8 (2001)を参照すべきである。したがって、ＲＮＡｉ技術は、サイレンス標的遺伝子のため哺乳類細胞において、うまく用いられる。
細胞増殖制御の低下は、癌細胞の特徴である；したがって、細胞生存／増殖における１５８Ｐ１Ｄ７の役割を評価することが適切である。したがって、ＲＮＡｉを使用して、その１５８Ｐ１Ｄ７抗原の機能を研究した。重要な分子パラメータ（Ｇ：Ｃ含量、融解温度等）を示し且つ細胞に導入したときに１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現レベルを著しく減少させる能力を有するオリゴヌクレオチドを予測するアルゴリズムを用いて、１５８Ｐ１Ｄ７のｓｉＲＮＡを生成した。したがって、１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡの一つの標的シーケンスは：5’AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT3’（配列番号：４２）（オリゴ１５８Ｐ１Ｄ７．Ｂ）である。この実施例に従って、１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の核酸ＯＲＦ配列（シーケンス）又はその部分配列（サブシーケンス）に対応するｓｉＲＮＡ（二重鎖の低分子干渉ＲＮＡ）を含む１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡ組成が、使用される。したがって、ｓｉＲＮＡサブシーケンスは、この方法で使用され、一般に、長さにおいて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３５を超える近接したＲＮＡヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡシーケンスは、ｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部に対して相補的及び非相補的である。好ましい形態として、サブシーケンスは、長さにおいて１９−２５のヌクレオチドであるが、より好ましくは長さにおいて２１−２３のヌクレオチドである。好ましい形態として、これらのｓｉＲＮＡは、タンパク質を発現する細胞において１５８Ｐ１Ｄ７抗原のノックダウンをもたらし、以下に記載した機能効果を有する。
選択したｓｉＲＮＡ（１５８Ｐ１Ｄ７．Ｂオリゴ）を、生存／増殖ＭＴＳ試験（survival/proliferation MTS assay）（細胞代謝活性を測定する試験）で、多数の株細胞について試験した。生細胞は、代謝的に活性があり、それゆえテトラゾリウム塩を有色のホルマザン(formazan)化合物に還元することができるが；死細胞は、そうでないので、テトラゾリウムベース比色試験（Tetrazolium-based colorimetric assay)（すなわちＭＴＳ）は、生存可能な細胞のみを検出する。さらに、この１５８Ｐ１Ｄ７．Ｂオリゴは、タンパク質を発現する細胞において１５８Ｐ１Ｄ７抗原のノックダウンをもたらし、下記プロトコルを用いると以下に記載した機能効果を有した。
哺乳類ｓｉＲＮＡ移入：ｓｉＲＮＡ移入前の日、異なる株細胞を、生存／ＭＴＳ試験のため、８０μｌ（９６ウェルプレートフォーマット）中、２×１０３細胞／ウェルで、培地（抗生物質を含まない１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地）に蒔いて培養した。１５８Ｐ１Ｄ７特異ｓｉＲＮＡオリゴに平行して、下記シーケンスを、コントロールとして、全ての実験に含めた：ａ）リポフェクタミン２０００（Lipofectamine 2000）（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）及びアニーリングバッファ（ｓｉＲＮＡなし）を含むＭｏｃｋ移入細胞（Mock transfected cell）；ｂ）ルシフェラーゼ−４特異ｓｉＲＮＡ（標的シーケンス：5’-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3’（配列番号：４３））；並びにｃ）Ｅｇ５特異ｓｉＲＮＡ（標的シーケンス：5’-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3’（配列番号：４４）。ｓｉＲＮＡを、１０ｎＭ及び１μｇ／ｍｌリポフェクタミン２０００最終濃度で使用した。
その手順を、下記のようにした：ｓｉＲＮＡを、先ず０．１ｕＭμＭ（１０倍濃縮したもの）でＯＰＴＩＭＥＮ（無血清改質移入培地、Invitrogen）において希釈し、５−１０分ＲＴインキュベートした。リポフェクタミン２０００を、全数移入（total number transfections)のため１０μｇ／ｍｌ（１０倍濃縮したもの）で希釈し、室温（ＲＴ）で５−１０分インキュベートした。適量の希釈した１０倍濃縮のリポフェクタミン２０００を、希釈した１０倍濃縮のｓｉＲＮＡと１：１混合し、２０−３０秒間、ＲＴでインキュベートした（５倍濃縮した形質移入溶液）。５倍濃縮した形質移入溶液の２０μｌを、それぞれのサンプルに加え、分析前に３７℃で９６時間インキュベートした。
ＭＴＳ測定：ＭＴＳ測定は、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium、分子内錯塩（inner salt）；ＭＴＳ（ｂ）］及び電子結合試薬（フェナジンエトスルフェート（phenazine ethosulfate(PES))）に基づく増殖、細胞障害性又は化学受容性試験において生存可能な細胞の数を測定する比色法である。測定を、少量の溶液試薬を培養ウェルに直接加え、１−４時間インキュベートし、その後９６ウェルプレート読取り装置を用いて４９０ｎｍでの吸光度を記録することによって行った。４９０ｎｍの吸光度の量で測定した有色のホルマザン産物の量は、ミトコンドリア活性及び／又は培養物における生細胞の数と正比例する
細胞における１５８Ｐ１Ｄ７の機能を扱うため、１５８Ｐ１Ｄ７を、陰性ｓｉＲＮＡコントロール（Ｌｕｃ４、ヒトゲノムで表現されない標的シーケンス）及び陽性ｓｉＲＮＡコントロール（Ｅｇ５を標的にする）と共に１５８Ｐ１Ｄ７特異ｓｉＲＮＡ（１５８Ｐ１ Ｄ７．ｂ）を含む内在発現１５８Ｐ１Ｄ７株細胞（ＬＮＣａＰ及びＰＣ３）を形質移入することによってサイレンシングした（図２９）。その結果から、これらの細胞が１５８Ｐ１Ｄ７ ｍＲＮＡを特異的に標的にするｓｉＲＮＡで治療されるときには、この測定法により測定すると結果として生ずる「１５８Ｐ１Ｄ７欠除細胞」は細胞生存度又は増殖の減少を示すということが示された（オリゴ１５８Ｐ１Ｄ７．ｂ治療細胞参照）。この効果は、アポトーシスの積極的な誘発によって、引き起こされる可能性がある。その生存度の減少は、アポトーシス細胞において主に生ずるミトコンドリア酵素の放出（及び活性）の増加によって測定される。
コントロールとして、３Ｔ３細胞、１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡの検出不可能な発現を伴う株細胞、もｓｉＲＮＡ（オリゴ１５８Ｐ１Ｄ７． ｂを含む）のパネルで治療したが、表現型は観察されなかった。この結果は、３Ｔ３細胞は１５８Ｐ１Ｄ７．ｂに対して応答しなかったことからＬＮＣａＰ及びＰＣ３細胞における特定のタンパク質のノックダウンが一般的な毒性の機能ではないという事実を反映する。Ｅｇ５コントロールに対する三つの株細胞の異なる応答は、細胞移入のレベルの相違及びオリゴ治療に対する株細胞の応答性を反映するものである（図２９）。
共に、これらのデータは、１５８Ｐ１Ｄ７が癌細胞の増殖において重要な役割を果たすこと、並びに１５８Ｐ１Ｄ７の欠除がこれらの細胞の生存ポテンシャルを明らかに増大させることを示した。１５８Ｐ１Ｄ７が多くの腫瘍株細胞において恒常的に発現されるということに注目すべきである。１５８Ｐ１Ｄ７は、悪性度において役割を果たす；その発現は、疾患の一次指標であり、そのような疾患は、多くの場合、非制御細胞増殖及び減少した細胞の高い割合で特徴付けられる。ＲＮＡｉ治療後、細胞内表現型を遺伝子ノックダウンと対比することは、重要であり、誰にも妥当な結論を引き出させ、これらの試薬の毒性又は他の非特異的な効果を除外させる。このため、ＲＮＡｉ治療後の標的に対するタンパク質及びｍＲＮＡの両方の発現レベルを測定するための測定法は、ウエスタンプロッティング、抗体で染色するＦＡＣＳ、イムノプレシピテーション、ノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ又は標準法）を含めて重要である。これらの測定法におけるｓｉＲＮＡの発現型の効果は、同一株細胞におけるタンパク質及び／又はｍＲＮＡノックダウンレベルと関連があるはずである。１５８Ｐ１Ｄ７のノックダウンは、１５８Ｐ１Ｄ７． Ｂオリゴを用いてウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析により測定すると得られる。
１５８Ｐ１Ｄ７関連細胞増殖を分析する方法は、増殖のためのマーカーとしてのＤＮＡ合成の測定である。標識ＤＮＡ前駆物質（すなわち３Ｈ−チミジン）が、使用され、ＤＮＡに対するそれらの取り込みが定量化される。標識前駆物質のＤＮＡへの取り込みは、培養物において生ずる細胞分裂の量と正比例する。細胞増殖を測定するために使用される別の方法は、クローン原性測定（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙｓ）を行うことである。これらの測定法において、細胞の規定した数が、適当なマトリックス上に蒔いて培養され、ｓｉＲＮＡ治療後の増殖期間後形成されたコロニーの数が計数される。
１５８Ｐ１Ｄ７癌標的の確認において、アポトーシスを伴う細胞生存／増殖分析及び細胞周期プロファイリング研究を補完することが考えられる。アポトーシスプロセスの生化学的特徴は、ゲノムＤＮＡ断片化であり、細胞を死なせる不可逆的な現象である。細胞において断片化したＤＮＡを観察する方法は、アポトーシス細胞の細胞質におけるヒストン複合型ＤＮＡ断片（モノ−及びオリゴ−ヌクレオソーム）の濃縮を測定するイムノアッセイ（免疫測定法）（すなわち細胞死検出ＥＬＩＳＡ）によるヒストン複合型ＤＮＡ断片の免疫学的検出である。この測定は、細胞の前標識を必要とせず、生体外で増殖しない細胞（ずなわち新たに分離された腫瘍細胞）におけるＤＮＡ分解を検出することができる。
アポトーシス細胞死のきっかけとなる最も重要なエフェクター分子は、カスパーゼである。カスパーゼは、活性化したときに、多数の基質を活性化におけるアポトーシスに極めて早い段階で影響するアスパラギン酸残基のカルボキシ末端部位で切断するプロテアーゼである。全てのカスパーゼは、前酵素として合成され、活性化には、アスパラギン酸残基での切断が含まれる。特に、カスパーゼ３は、アポトーシスの細胞性の現象の開始において中心的な役割を果たすと思われる。カスパーゼ３の活性の測定するための試験では、アポトーシスの現象が早期に検出される。ＲＮＡｉ治療後、活性カスパーゼ３存在又はアポトーシス細胞において認められる産物（すなわちＰＡＲＰ）の蛋白分解性の切断のウエスタンブロット検出から、アポトーシスの活性誘導がさらに裏づけられる。アポトーシスをもたらす細胞メカニズムは複雑であるため、それぞれは、その利点と限界を有する。細胞形態、染色質凝縮、膜小疱形成（membrane blebbong）、アポトーシス体等の他の判定基準／終点の考察は、アポトーシスのような細胞死をさらに裏づけるのに役立つ。細胞増殖を制御する全て遺伝子標的が抗アポトーシスであるとは限らないので、透過化処理細胞のＤＮＡ構築物を測定して、ＤＮＡ構築物のプロファイル又は細胞周期プロファイルを得る。アポトーシス細胞の核は、細胞質（サブＧ１集団（sub-G1 population)）に漏出させるため、より小さいＤＮＡを含む。さらに、ＤＮＡ染色（すなわち、ヨウ化プロピジウム）の使用により、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／ＭにおけるＤＮＡ含量の相違のため、細胞集団における細胞周期の異なる相間も区別される。これらの研究において、分集団が定量化されうる。
１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子に関し、ＲＮＡｉ研究は、癌経路における遺伝子生成の寄与の理解を容易にする。そのような活性ＲＮＡｉ分子は、有効な抗腫瘍治療学であるｍＡｂｓについてスクリーニングする同定方法において有用である。さらに、ｓｉＲＮＡは、表Ｉに列挙した癌型を含むいくつかの癌型の悪性増殖を減少させるため癌患者に対する治療学として投与される。１５８Ｐ１Ｄ７が細胞生存、細胞増殖、腫瘍形成、又はアポトーシスにおいて役割を果たすとき、それは診断、予後徴候、予防及び／又は治療目的のための標的として用いられる。
［実施例５３］１５８Ｐ１Ｄ７機能測定
Ｉ．１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞における増殖の増大及び細胞周期調節
増殖の増大及び正常細胞に関連する腫瘍細胞のＳ相への移行は、癌細胞表現型の特徴である。正常細胞の増殖速度における１５８Ｐ１Ｄ７の発現の影響を扱うべく、二つのげっ歯類株細胞（３Ｔ３及びＲａｔ−１）を、１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子を含むウイルスに感染させ、１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現する安定な細胞、並びに選択マーカーネオマイシン（Ｎｅｏ）を発現する空ベクター制御細胞を誘導した。細胞を、０．５％ＦＢＳ中で一晩増殖させ、その後１０％ＦＢＳで処理した細胞と比較した。それらの細胞を、３Ｈ−チミジン取込み試験による１８−９６時間の後処理での増殖について、並びにＢｒｄＵ取込み／ヨウ化プロピジウム染色試験による細胞周期分析について評価した。図３２における結果から、１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現するＲａｔ−１細胞がＲａｔ−１−Ｎｅｏ細胞と比較して、低血清濃度（０．１％）で有効に増殖したことが示される。１５８Ｐ１Ｄ７を発現する３Ｔ３細胞対Ｎｅｏのみに関して、同様の結果が得られた。別の方法論により細胞増殖を評価すべく、細胞をＢｒｄＵ及びヨウ化プロピジウムで染色した。簡単に、細胞を１０ μＭで標識し、洗浄し、トリプシン処理し、０．４％パラホルムアルデヒド及び７０％エタノールに固定した。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を細胞に添加し、その細胞を洗浄し、その後洗浄及び４８８ｎｍでの蛍光分析より前に２０分間、１０ μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムと共にインキュベートした。図３３における結果から、制御細胞と関連した１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現した３Ｔ３細胞のＳ相（細胞周期のＤＮＡ合成相）において細胞の標識の増加があったことが示される。これらの結果から、３Ｈ−チミジン取込みにより測定した結果が確認され、１５８Ｐ１Ｄ７抗原を発現する細胞が高い増殖能力を有し、かつ低血清条件で生存することが示される。したがって、１５８Ｐ１Ｄ７発現細胞は、生体内での腫瘍細胞のような増殖の可能性を増大させた。
II．細胞表面と結合する組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
細胞−細胞相互作用は、組織／器官保全性及び恒常性（ホメオスタシス）を維持することにおいて必須であるが、それらの両方は腫瘍形成及び増殖の間、調節解除するようになる。さらに、細胞−細胞相互作用は、転移、及び血管形成の増大のための内皮活性化の間、腫瘍細胞付着を促進する。１５８Ｐ１Ｄ７の遺伝子生成と推定上のリガンド間の相互作用を扱うべく、測定法を確立して、１５８Ｐ１Ｄ７抗原の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（アミノ酸１６−６０８）と一次内皮（primary endothelium）間の相互作用を同定した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３時間、培地中０．１％ＦＢＳで増殖させた。細胞を、洗浄し、１０ｍＭ ＥＤＴＡで剥離し、１０％ＦＢＳに再懸濁させた。組換え型１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤ（「真核系における組換え型１５８Ｐ１Ｄ７の製造」と題した実施例において記載したもの）を細胞に添加し、それらの細胞を、１μｇ／ｍｌでＭａｂＭ１５／Ｘ６８．２．２２を添加するより前に、洗浄した。洗浄後、二次Ａｂ（抗マウス−ＰＥ、１：４００）を、氷上１時間の細胞に添加した。細胞を、洗浄し、氷上３時間の１％ホルマリンに固定し、その後ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。図２６Ａから、１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤが、１５８Ｐ１Ｄ７特異ＭＡｂにより検出されたＨＵＶＥＣ細胞の表面に直接結合したことが示される。同お湯の形態において、１５８Ｐ１Ｄ７の組換え型ＥＣＤを、iodogen（１，３，４，５−テトラクロロ−３ａ，６ａ−ジフェニルグリコルリル（１，３，４，５−tetrachloro-3a,6a-diphenylglycoluril））法を用いて、高比活性まで、ヨード化した。６ウェルプレート中９０％集密性のＨＵＶＥＣ細胞を、４℃又は３７℃の何れかで、２時間、５０倍過剰量非標識ＥＣＤの存在（非特異結合）又は不存在（全結合）下で、１ｎＭの１２５Ｉ−１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤと共にインキュベートした。図２５Ｂにおけるデータから、ＨＵＶＥＣ細胞における１５８Ｐ１Ｄ７レセプターの存在を裏づける１５８Ｐ１Ｄ７ ＥＣＤのＨＵＶＥＣ細胞への特異結合が示される。これらの結果から、１５８Ｐ１Ｄ７抗原は、腫瘍増殖、腫瘍血管新生に対する内皮の活性化又は腫瘍細胞転移を促進する細胞−細胞相互作用に関与することが示される。それらのデータから、発現細胞の細胞表面から脱落する１５８Ｐ１Ｄ７抗原は、細胞エフェクター機能を誘導すべく、オートクリン又はパラクリンの方法で細胞と結合する可能性があることも示される。
［実施例５４］免疫組織化学を用いる癌患者検体における１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の検出
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の発現を測定すべく、標本を、各種癌患者から得て、１５８Ｐ１Ｄ７のアミノ酸２７４−２８５をコード化するペプチドに対して産生されるアフィニティー精製モノクローナル抗体を用いて染色し（「１５８Ｐ１Ｄ７モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の生成」と題した実施例参照）、ホルマリン固定し、パラフィン内包し、組織を４ミクロン切片にカットし、ガラススライド上に固定した。その切片を、脱パラフィンし、再水和し、高温で抗原回収溶液（Antigen Retrieval Citra Solution;BioGenex、4600 Norris Canyon Road、San Ramon、CA、94583）で処理した。切片を、その後３時間、マウスモノクローナル抗１５８Ｐ１Ｄ７抗体、Ｍ１５−６８（２）２２中でインキュベートした。スライドを、バッファ中で３回洗浄し、さらに１時間、ＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＴＭペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリン二次抗体（DAKO EnVision+TM peroxidase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin secondary antibody）(DAKO Corporation、Carpenteria、CA）と共にインキュベートした。切片を、その後バッファ中で洗浄し、ＤＡＢキット（SIGMA Chemicals）を用いて発育させ、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、明視野顕微鏡により分析した。それらの結果から、癌患者の組織における１５８Ｐ１Ｄ７の発現が示された（図３６）。一般に、膀胱移行上皮癌において、１５８Ｐ１Ｄ７の発現は、主として、１５８Ｐ１Ｄ７がこれらの組織において会合した膜であることを示す細胞膜の周囲にあった。試験した膀胱移行上皮癌サンプルの４９．３％は、１５８Ｐ１Ｄ７に対して陽性であった（表５８）。
これらの結果から、１５８Ｐ１Ｄ７が癌における診断、予後徴候、予防及び治療の用途の標的であることが示される。
本発明は、本発明の個々の側面の一詳述のつもりで本願において開示された形態による範囲に制限されず、機能的に同等である、いかなるものも本発明の範囲内にある。本願において記載されたモデル及び方法に加え、本発明のモデル及び方法に対する各種の変更は、前述の記載及び教示から、その技術において熟練した者（当業者）に明らかであろうし、同様に本発明の範囲内に入ると意図される。そのような変更又は他の形態は、本発明の本来の範囲及び意図から離れることなく、実施されうる。
なお、本発明は、以下の好ましい実施形態も含む。
（形態１）
ａ）図２のタンパク質の８、９、１０又は１１個の連続するアミノ酸からなるペプチド；
ｂ）表５〜表１８のペプチド
ｃ）表２２〜表４５のペプチド；又は
ｄ）表４６〜表４９のペプチド
を含む、から実質的になる、又はからなる組成物。
（形態２）
免疫応答を誘発する形態１の組成物。
（形態３）
図２に示した全アミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％相同であるか、又は同一である形態２のタンパク質。
（形態４）
図２のタンパク質と特異的に結合する抗体によって結合される形態２のタンパク質。
（形態５）
図２のタンパク質のアミノ酸配列からの、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ポリペプチドエピトープ又はその類似体を含むことを特徴とする形態２の組成物。
（形態６）
前記エピトープは図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される形態５の組成物。
（形態７）
前記ポリペプチドは図２のタンパク質の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される形態２の組成物。
（形態８）
図２のアミノ酸配列からの抗体ポリペプチドエピトープを含む形態２の組成物。
（形態９）
前記エピトープは図２の全アミノ酸配列ではないという条件によってされに制限される形態８の組成物。
（形態１０）
前記抗体エピトープは、当該ペプチドの末端まで任意の整数で増加する図２の少なくとも５アミノ酸のペプチド領域を含み、
前記エピトープは、
ａ）図５の親水性プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
ｂ）図６の疎水性親水性プロファイルの０．５より小さい値を有するアミノ酸位置、
ｃ）図７のパーセント接触可能残基プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
ｄ）図８の平均可撓性プロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
ｅ）図９のベータ−ターンプロファイルの０．５より大きい値を有するアミノ酸位置、
ｆ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも２つの組合せ、
ｇ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも３つの組合せ、
ｈ）前記ａ）〜ｅ）の少なくとも４つの組合せ、
ｉ）前記ａ）〜ｅ）の５つの組合せ、
から選択されるアミノ酸位置を含むことを特徴とする形態８の組成物。
（形態１１）
形態１のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（形態１２）
図２に示された核酸分子を含む形態１１のポリヌクレオチド。
（形態１３）
前記コードされたタンパク質は図２の全アミノ酸配列ではないという条件によって更に制限される形態１２のポリヌクレオチド。
（形態１４）
形態１１のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチドを含む組成物。
（形態１５）
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の核酸ＯＲＦ配列又はその部分配列に対応するｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を含み、
前記部分配列は長さにおいて１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５連続ＲＮＡヌクレオチドでありかつｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部に相補的な配列と非相補的な配列を含むことを特徴とする１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡ組成物。
（形態１６）
形態１の付加的ペプチドをコードする付加的ヌクレオチド配列を更に含む形態１３のポリヌクレオチド。
（形態１７）
図２のタンパク質に向けられた哺乳類免疫応答を惹起する方法であって、
該方法は、前記哺乳類の免疫系の細胞を
ａ）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質及び／又は
ｂ）該１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列
の一部に接触させることにより、該１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に対する免疫応答が惹起されることを含む方法。
（形態１８）
形態１７の免疫応答惹起方法であって、
少なくとも１つのＴ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を用意すること、及び
前記エピトープを哺乳類免疫系Ｔ細胞又はＢ細胞に接触させることにより、Ｔ細胞又はＢ細胞が活性化されること
を含む方法。
（形態１９）
前記免疫系細胞はＢ細胞であり、そのため活性化されたＢ細胞は、前記１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生することを特徴とする形態１８の方法。
（形態２０）
前記免疫系細胞は細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、そのため活性化されたＣＴＬは、前記１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質を発現する自己細胞を死滅することを特徴とする形態１８の方法。
（形態２１）
前記免疫系細胞はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、そのため活性化されたＨＴＬは、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞障害活性又はＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌することを特徴とする形態１８の方法。
（形態２２）
サンプル中の図２のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を検出する方法であって、
前記サンプルを少なくとも１つの１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡプライマーを用いる逆転写にかけることにより、該サンプル中にｍＲＮＡが存在する場合ｃＤＮＡが産生されること；
産生されたｃＤＮＡを、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしての１５８Ｐ１Ｄ７ポリヌクレオチドを用いて増幅すること；及び
増幅された１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡの存在を検出すること、
この場合、増幅された１５８Ｐ１Ｄ７ｃＤＮＡの存在は、図２のタンパク質をコードするｍＲＮＡの前記サンプル中における存在の指標であること
を含むことを特徴とする方法。
（形態２３）
サンプル中における１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又は１５８Ｐ１Ｄ７関連ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質又は１５８Ｐ１Ｄ７関連ポリヌクレオチドに特異的に結合する物質と接触させて複合体を形成すること；及び、
前記サンプル中における前記複合体の存在又は量を求めること
を含むことを特徴とする方法。
（形態２４）
サンプル中の１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質の存在を検出するための、形態２３の方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを何れも１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントと接触させて、結合した場合複合体を形成すること；及び、
前記サンプル中における前記複合体の存在又は量を求めること
を含むことを特徴とする方法。
（形態２５）
生物学的サンプル中の１又は２以上の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物をモニターするための、形態２３の方法であって、
１つの個体からの組織サンプル中の細胞によって発現された１又は２以上の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態を検出すること；
前記検出された状態と、相応の標準サンプル中の１又は２以上の１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子産物の状態とを比較すること；及び
前記標準サンプルに対する前記組織サンプル中における１５８Ｐ１Ｄ７の異常発現状態の存在を同定すること
を含むことを特徴とする方法。
（形態２６）
１５８Ｐ１Ｄ７ｍＲＮＡ又は１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の１又は２以上の増加された遺伝子産物が存在するか否かを求めるステップを更に含み、前記標準組織サンプルに対する前記試験サンプル中における１又は２以上の増加された遺伝子産物の存在は癌の存在又は状態の指標であることを特徴とする形態２５の方法。
（形態２７）
前記組織は表１に示された組織のセットから選択されることを特徴とする形態２６の方法。
（形態２８）
図２のタンパク質を発現する細胞の状態を調節する組成物であって、
ａ）図２のタンパク質を発現する細胞の状態を調節する物質、又はｂ）図２のタンパク質によって制御又は生成される分子を含む組成物。
（形態２９）
１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の核酸ＯＲＦ配列又はその部分配列に対応するｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を含み、
前記部分配列は長さにおいて１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５連続ＲＮＡヌクレオチドでありかつｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部に相補的な配列と非相補的な配列を含むことを特徴とする形態２８の１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡ組成物。
（形態３０）
生理学的に許容可能な担体を更に含む形態２８の組成物。
（形態３１）
ヒト最小投薬単位形態の形態２８の組成物を含む医薬組成物。
（形態３２）
前記物質は、図２のタンパク質と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする形態２８の組成物。
（形態３３）
モノクローナルである形態３２の抗体又はそのフラグメント。
（形態３４）
ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である形態３２の抗体。
（形態３５）
形態３２の抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物。
（形態３６）
形態３３の抗体を産生するハイブリドーマ。
（形態３７）
前記物質は、図２のタンパク質を発現する細胞の生存能力、成長又は複製状態を減少又は阻害することを特徴とする形態２８の組成物。
（形態３８）
前記物質は、図２のタンパク質を発現する細胞の生存能力、成長又は複製状態を増加又は促進することを特徴とする形態２８の組成物。
（形態３９）
前記物質は、
ａ）何れも図２のタンパク質と免疫特異的に結合する抗体又はそのフラグメント；
ｂ）何れも図２のタンパク質と免疫特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）１５８Ｐ１Ｄ７コード配列を有するポリヌクレオチド切断するリボザイム、又は該リボザイムをコードする核酸分子；及び生理学的に許容可能な担体；
ｄ）特定のＨＬＡ分子と関連して１５８Ｐ１Ｄ７ペプチド部分配列を特異的に認識するヒトＴ細胞；
ｅ）図２のタンパク質、又は図２のタンパク質のフラグメント；
ｆ）図２のタンパク質をコードするヌクレオチド、又は図２のタンパク質のフラグメントをコードするヌクレオチド；
ｇ）図２のタンパク質の８、９、１０又は１１連続アミノ酸のペプチド；
ｈ）表５〜表１８のペプチド；
ｉ）表２２〜表４５のペプチド；
ｊ）表４６〜表４９のペプチド；
ｋ）図２のアミノ酸配列からの抗体ポリペプチドエピトープ；
ｌ）図２のアミノ酸配列からの抗体ポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド；又は
ｍ）１５８Ｐ１Ｄ７タンパク質の核酸ＯＲＦ配列又はその部分配列に対応するｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を含み、該部分配列が長さにおいて１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５連続ＲＮＡヌクレオチドでありかつｍＲＮＡコード配列の少なくとも一部に相補的な配列と非相補的な配列を含む１５８Ｐ１Ｄ７ｓｉＲＮＡ組成物
を含む群から選択されることを特徴とする形態２８の組成物。
（形態４０）
図２のタンパク質を発現する癌細胞の生存能力、成長又は複製状態を阻害する方法であって、
前記癌細胞に形態２８の組成物を投与して、該癌細胞の生存能力、成長又は複製状態を阻害すること
を含む方法。
（形態４１）
前記組成物は、何れも１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする形態４０の方法。
（形態４２）
前記組成物は、（ｉ）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質、又は（ｉｉ）１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチド若しくは１５８Ｐ１Ｄ７関連タンパク質のコード配列に相補的なポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形態４０の方法。
（形態４３）
前記組成物は、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを含むことを特徴とする形態４０の方法。
（形態４４）
前記組成物は前記癌細胞に対するヒトＴ細胞であり、該ヒトＴ細胞は図２のタンパク質のペプチド部分配列を特異的に認識し、該部分配列は前記特定のＨＬＡ分子に関連していることを特徴とする形態４０の方法。
（形態４５）
前記組成物は単鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを運搬するベクターを含み、該コードされた単鎖抗体は図２のタンパク質を発現する癌細胞の内部で細胞内発現されることを特徴とする形態４０の方法。
（形態４６）
図２のタンパク質を発現する細胞に剤を送達する方法であって、
形態３２の抗体又はそのフラグメントとコンジュゲートされた剤を与えること；及び
前記細胞と、前記抗体−剤コンジュゲート又はフラグメント−剤コンジュゲートを接触させること
を含む方法。
（形態４７）
図２のタンパク質を発現する癌細胞の生存能力、成長又は複製状態を阻害する方法であって、
前記癌細胞に形態２８の組成物を投与して、該癌細胞の生存能力、成長又は複製状態を阻害すること
を含む方法。
（形態４８）
表１に列挙した組織の癌を阻止又は治療するための情報を、当該阻止又は治療の必要な被検体に対しターゲティングする方法であって、
被検体からのサンプル中における、表１に列挙した組織の癌と関連するポリヌクレオチドの発現の有無を検出すること、但し、前記ポリヌクレオチドの発現は、
（ａ）図２のヌクレオチド配列；
（ｂ）図２のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）図２のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列と９０％以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
からなる群から選択される；及び
前記サンプル中における前記ポリヌクレオチドの発現の有無に基づいて、表１に列挙した組織の癌を阻止又は治療するための情報を、当該阻止又は治療の必要な被検体に向けること
を含む方法。
（形態４９）
前記情報は表１に列挙された組織の癌のための検出手順又は治療の記述を含むことを特徴とする形態４８の方法。
（形態５０）
細胞増殖を調節する候補分子を同定するための方法であって、
（ａ）試験分子を
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）図３に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）図３に示したアミノ酸配列と９０％以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｖ）前記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列のフラグメント
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に導入するか、又は
試験分子を前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に導入すること；及び
（ｂ）前記試験分子と前記ヌクレオチド配列又はタンパク質との間の相互作用の有無を決定し、該試験分子と該ヌクレオチド配列又はタンパク質との間の相互作用の存在により、該試験分子は、細胞増殖を調節する候補分子として同定されること、
を含む方法。
（形態５１）
前記系は動物であることを特徴とする形態５０の方法。
（形態５２）
前記系は細胞であることを特徴とする形態５０の方法。
（形態５３）
前記試験分子は、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含むことを特徴とする形態５０の方法。
（形態５４）
被検体において表１に列挙された組織の癌を治療するための方法であって、
形態５０の方法によって同定された候補分子を、治療の必要のある被検体に投与することにより、該候補分子が該被検体内の表１に列挙された組織の癌を治療することを特徴とする方法。
（形態５５）
表１に列挙された組織の癌を治療するための候補薬を同定するための方法であって、
（ａ）試験分子を
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）図３に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）図３に示したアミノ酸配列と９０％以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｖ）前記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列のフラグメント
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に導入するか、又は
試験分子を前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に導入すること；及び
（ｂ）前記試験分子と前記ヌクレオチド配列又はタンパク質との間の相互作用の有無を決定し、該試験分子と該ヌクレオチド配列又はタンパク質との間の相互作用の存在により、該試験分子は、表１に列挙された組織の癌を治療するための候補薬として同定されること、
を含む方法。
（形態５６）
前記系は動物であることを特徴とする形態５５の方法。
（形態５７）
前記系は細胞であることを特徴とする形態５５の方法。
（形態５８）
前記試験分子は、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含むことを特徴とする形態５５の方法。
表
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Claims (22)

  1. １５８Ｐ１Ｄ７遺伝子（配列番号２）の単離された転写変異体であって、
    前記転写変異体は１５８Ｐ１Ｄ７遺伝子から転写され、配列番号１４で示したアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むタンパク質をコード化する転写変異体。
  2. 前記変異体は配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示したアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する請求項１の転写変異体。
  3. 前記変異体は配列番号６、配列番号８又は配列番号１２で示したヌクレオチド配列を含み、ＴはＵであってもよい請求項１の転写変異体。
  4. 請求項１〜３の何れか一の転写変異体によってコードされる単離されたタンパク質。
  5. 前記タンパク質は配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項４のタンパク質。
  6. 請求項４又は５のタンパク質と特異的に結合する単離された抗体又はそのフラグメント。
  7. モノクローナル抗体である請求項６の抗体又はそのフラグメント。
  8. 前記モノクローナル抗体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され受諾番号ＰＴＡ−５８０１に指定されたハイブリドーマから得られるＭ１５−６８（２）１８．１．１である請求項７の抗体又はそのフラグメント。
  9. 前記抗体又はそのフラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である請求項６又は７の抗体又はそのフラグメント。
  10. 前記抗体又はそのフラグメントは薬剤で標識されている請求項６〜９の何れか一の抗体又はそのフラグメント。
  11. 前記薬剤は放射性同位元素、化学療法剤及び毒素からなる群から選択される請求項１０の抗体又はそのフラグメント。
  12. 前記放射性同位元素は２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ及びＬｕの放射性同位元素からなる群から選択される請求項１１の抗体又はそのフラグメント。
  13. 前記化学療法剤はタキソール、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、アクチノマイシン、ゲロニン、及びカリケアミシンからなる群から選択される請求項１１の抗体又はそのフラグメント。
  14. 前記毒素はジフテリアトキシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α‐サルシン、ミトゲリン、フェノマイシン、及びエノマイシンからなる群から選択される請求項１１の抗体又はそのフラグメント。
  15. 請求項６の抗体を産生するハイブリドーマ。
  16. 前記ハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され受諾番号ＰＴＡ−５８０１に指定されたものである請求項１５のハイブリドーマ。
  17. 哺乳類の免疫応答を惹起する医薬の製造のための請求項４又は５のタンパク質の使用であって、
    免疫原性を有する量のタンパク質を哺乳動物に与えること；及び
    哺乳類免疫応答を引き起こすこと
    を含む使用。
  18. 前記医薬はさらにアジュバントを含む請求項１７の使用。
  19. 生物学的サンプル及び正常サンプル中において１５８Ｐ１Ｄ７転写変異体遺伝子産物の発現レベルを検出するインビトロ方法であって、
    前記生物学的サンプル及び正常サンプルにおける１５８Ｐ１Ｄ７転写変異体遺伝子産物の発現レベルを決定すること；及び
    前記生物学的サンプル及び正常サンプルにおいて検出される１５８Ｐ１Ｄ７転写変異体遺伝子産物の発現レベルを比較すること
    を含み、
    前記１５８Ｐ１Ｄ７転写変異体遺伝子産物は請求項１〜３の何れか一の１５８Ｐ１Ｄ７転写変異体或いは請求項４又は５のタンパク質である方法。
  20. 請求項４又は５のタンパク質を発現する細胞の増殖又は生存を阻害するインビトロ方法であって、
    前記細胞に該タンパク質と特異的に結合する請求項６〜１３の何れか一の抗体又はそのフラグメントを含む組成物を与えることにより、前記細胞の増殖、生存、又は増殖及び生存を阻害すること
    を含む方法。
  21. 請求項４又は５のタンパク質を発現する細胞の増殖又は生存を阻害する医薬の製造のための請求項６〜１４の何れか一の抗体又はそのフラグメントの使用。
  22. 請求項４又は５のタンパク質を発現する細胞に剤を送達するインビトロ方法であって、
    請求項１０〜１４の何れか一の抗体又はそのフラグメントを与えること；及び
    前記細胞と、前記抗体−剤コンジュゲート又はフラグメント−剤コンジュゲートを接触させること
    を含む方法。
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