JP2014534240A - フラタキシンレベルを増加させる方法および生成物ならびにその使用 - Google Patents

Abstract

細胞におけるフラタキシンの発現／発現量を増加させるための方法および生成物（例えば、組換えタンパク質）、ならびに、例えば、それを患う対象において、フリードライヒ失調症を治療するための、そのような方法および生成物の使用を記載する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年、１１月１８日に出願された米国特許仮出願番号第６１／５６１，４４０号の優先権を主張する。

配列表
本出願には、１４２キロバイトのサイズを有する、２０１２年、１１月１６日に作製された「11229_313_SeqList」と題する、コンピューターに読み込み可能な形式の配列表が含まれ、該配列表は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、例えばフリードライヒ失調症の治療のために、フラタキシンの発現および／または発現量を増加させること、ならびにその使用に関する。

フリードライヒ失調症
常染色体劣性遺伝の神経変性疾患および心疾患であるフリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）は、染色体９に位置するフラタキシン遺伝子（ＦＸＮ）の第１イントロンにおける、三塩基反復配列伸長変異により生じる。この変異は、フラタキシン遺伝子発現の減少をもたらす。フラタキシンはミトコンドリアが適切に機能する上で必須である。フラタキシンは鉄の除去に関連し、フラタキシンが減少すると、鉄が蓄積し、フリーラジカルによる損傷の原因となる。神経細胞および筋細胞は、有害作用に特に敏感である。ＦＲＤＡは、欧州の人口の５００００人に１人に発症するが、カナダのケベック州においては、創始者効果に因り、さらに頻度が高い。また、男性も女性も、同様に発症する。典型的な形態では、ＦＲＤＡの症状は、１０代またはそれ以前に現れる。ＦＲＤＡは、運動失調、反射消失、振動感覚および固有感覚の喪失、ならびに構音障害を特徴とする（Babady et al.2007, Cooper and Schapira 2003, Harding 1981, Lynch et al.2002, Pandolfo 1999）。さらに、ＦＲＤＡ患者は、心筋症、真性糖尿病および側弯症を伴う全身症状を有することが多い。心筋症またはそれに付随する不整脈に因り、早期に死亡することもあり得る（Harding 1981）。後根神経節細胞、それらの上行性脊柱および脊髄小脳路の変性が、進行性の感覚性運動失調をもたらす。多くの患者が、２０代には車椅子生活となる。付随する眼球運動の障害としては、視神経萎縮、矩形波眼球運動および固視困難が挙げられる。重要なことに、認知能力は比較的影響を受けない。しかしながら、多くの患者がうつ病を患う（Singh et al. 2001）。

遺伝的伝達
ＦＲＤＡの原因となる変異は、フラタキシン遺伝子の第１イントロンに位置するＧＡＡ三塩基反復の不安定な過伸長である（Campuzano et al. 1996）。正常な対象においては、反復は６〜３４であるが、患者においては１５０以上の反復がある。より短い反復（１５０〜２００）を有する患者は、より長い三重鎖（３５０〜６５０）を有する患者よりも、穏やかな症状を有する。一部の重症の患者においては、１７００の反復がある。フラタキシン遺伝子の変異はイントロンに位置するため、フラタキシンタンパク質のアミノ酸配列を変化させることは無い。ＦＲＤＡ患者のうちの２〜３％が、ミスセンスまたはノンセンスのいずれかの点変異を有する（Bidichandani, Ashizawa and Patel 1997, McCormack et al.2000, Cossee et al.1999）。ミスセンス変異を有する一部の患者は、変異タンパク質がまだ機能するため、症状の重症度はより低い。

病態機序
病態機序はＰａｎｄｏｌｆｏらにより概説されている（Pandolfo 2006)。ＧＡＡ三塩基の反復は、ＤＮＡにおける三重鎖の形成、すなわち、転写を減少させ、次いでコードされるタンパク質、フラタキシンのレベルを減少させる、異常な非Ｂ ＤＮＡ構造の形成をもたらす（発現量は正常なものの５〜３５％；Coppola et al. 2006, Coppola et al. 2009）。フラタキシンは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質であり、その減少は、ミトコンドリアにおける鉄蓄積を誘発する。この鉄蓄積は、患者の心細胞および脳の歯状核にみられる。これには酸化障害が伴う。フラタキシンの減少は、１８５の異なる遺伝子の遺伝子発現における変化をもたらす（Coppola et al.2006, Coppola et al.2009）。従ってフラタキシンの減少は、いくつかの代謝経路における重要な作用を有し、薬剤によりこれらの経路のうちの一つのみを修正することは、理想的でない場合が有る。

フラタキシンタンパク質
フラタキシンは、ヘムの生合成ならびに鉄−硫黄クラスターの構築および修復を、これらの経路に関連するタンパク質にＦｅ^２＋を送達することにより促進する、小さなタンパク質（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０００１４４．４、２１０個のアミノ酸のみ）である。また、Ｆｅ^２＋のＦｅ^３＋への酸化を触媒する能力、およびフェリハイドライトミネラルの形態で多量の金属を保管する能力を介して、酸化ストレスに対する保護においても重要な役割を果たす。フラタキシンは、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）により、２つのステップにおいて加工される。ＭＰＰはまず前駆体を切断して中間体を形成し、その後、中間体を成熟サイズのタンパク質に変換する。フラタキシン（５６〜２１０）、および成熟フラタキシンの主要な形態であるフラタキシン（８１〜２１０）の、２つの形態が存在する（Schoenfeld et al. 2005, Condo et al. 2006）。

フリードライヒ失調症の治療のために、いくつかの方策が開発されている。これらは一般的に以下の５つのカテゴリーに分類される：１）ミトコンドリアにおける鉄蓄積に起因する酸化ストレスを減少させるための抗酸化剤の使用；２）ミトコンドリアから鉄を除去するためのキレート剤の使用；３）ＤＮＡの凝縮を防止し、フラタキシンをより高発現させるための、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣＩ）の使用；４）フラタキシン発現を促進するためのシスプラチン、３−ニトロプロプリオン酸（３−ＮＰ）、ペンタミジンまたはエリスロポエチン（ＥＰＯ）等の分子の使用；および、５）遺伝子療法。しかしながら、今までのところ、これらの方策に関しては、限られた成功例しか報告されておらず、それらの多くは、ヒト臨床試験における試験および適用には、非特異的であるかまたは困難である。

従って、フリードライヒ失調症を治療するための新たな手段が、依然必要とされている。

本明細書はいくつかの文書を参照しており、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられている。

本発明は、細胞においてフラタキシンの発現／発現量を誘導するかまたは増加させること、およびその使用に関する。一態様においては、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（ＴＡＬＥとも呼ばれる）に由来する組換えタンパク質を、フラタキシンプロモーターを特異的に標的とし、フラタキシン発現を増加させるために、設計しかつ使用し得る。さらなる態様においては、（ａ）フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体；ならびに（ｂ）タンパク質形質導入ドメイン；を含む組換えタンパク質を、設計し、作製し、かつ細胞に導入して、細胞内のフラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体のレベルを増加させ得る。本発明はさらに、フリードライヒ失調症の治療のためなどの、そのような、細胞におけるフラタキシンの発現／発現量を誘導するかまたは増加させることの使用に関する。

従って、第一の態様において、本発明は、（ｉ）複数のタンデムリピートモノマーを含む反復可変領域（repeat variable domain）（ＲＶＤ）を含むＴＡＬエフェクタータンパク質由来のＴＡＬＥドメイン；（ｉｉ）核局在化シグナル；および（ｉｉ）転写活性化ドメイン；を含む、細胞におけるフラタキシンの発現を増加させるためのＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質であって、前記ＲＶＤがフラタキシンプロモーター配列と結合し、それにより前記細胞におけるフラタキシンの発現を可能にする、ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質に関する。

上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の一実施形態において、前記モノマーは３３または３４のアミノ酸残基からなる。一実施形態において、上述のＲＶＤは、６．５〜３３．５のモノマーからなる。一実施形態において、前記ＲＶＤは、１２．５、１３．５または１４．５のモノマーからなる。

一実施形態において、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、ＡｖｒＢｓ３、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４またはＡｖｒＸａ１０ ＴＡＬエフェクタータンパク質に由来するＴＡＬＥドメインを含む。一実施形態において、前記ＴＡＬＥドメインは、Ｈａｘ３ ＴＡＬエフェクタータンパク質に由来する。一実施形態において、前記Ｈａｘ３ ＴＡＬエフェクタータンパク質はXanthomonas campestris pv. Armoraciaeに由来する。

上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の一実施形態において、前記転写活性化ドメインは、ＶＰ６４合成転写活性化ドメインである。

一実施形態において、上述の核局在化シグナルは、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原に由来する哺乳類の核局在化シグナルである。

本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の一実施形態において、上述のＲＶＤは、以下：
ｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置５〜１８；
ｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置２１〜３４；
ｉｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置２４〜３７；
ｉｖ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置３７〜５０；
ｖ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置７３〜８６；
ｖｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置８１〜９４；
ｖｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置９２〜１０５；
ｖｉｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１０３〜１１６；
ｉｘ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１０６〜１１９；
ｘ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１２４〜１３７；
ｘｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１５５〜１６８；および／または
ｘｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１６８〜１８１；
と結合し、前記フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列（配列番号８８）は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００１４４．４の位置１〜２４０に示される。

一実施形態において、上述のＲＶＤは、以下：（ｉ）ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ（配列番号２）；（ｉｉ）ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ（配列番号４）；（ｉｉｉ）ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＤ ＨＤ ＮＮ ＮＧ（配列番号６）；（ｉｖ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＮ（配列番号８）；（ｖ）ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ（配列番号１０）；（ｖｉ）ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ（配列番号１２）；（ｖｉｉ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号１４）；（ｖｉｉｉ）ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ（配列番号１６）；（ｉｘ）ＮＮ ＮＩ ＮＮＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ（配列番号１８）；（ｘ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＩ（配列番号２０）；（ｘｉ）ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＧ（配列番号２２）；または（ｘｉｉ）ＨＤ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列または１つまたは複数のモノマーを含む。別の実施形態において、上述のＲＶＤは、配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含む、１つまたは複数の、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上のモノマーを含む。

一実施形態において、フラタキシン発現が増加した上述の細胞は、フラタキシン遺伝子のイントロン１に、異常な数の三塩基反復を有する。一実施形態において、前記細胞は３５以上の三塩基反復を含む。別の実施形態において、前記細胞は１５０以上の三塩基反復を含む。さらなる実施形態において、前記細胞は１５０超の三塩基反復を含む。さらなる実施形態において、前記細胞は２００以上の反復を含む。さらなる実施形態において、前記細胞は５００以上の反復を含む。さらなる実施形態において前記細胞は１０００以上の反復を含む。

本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質はまた、タンパク質形質導入ドメイン（または細胞透過性ペプチド）も含み得る。一実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴまたはＰｅｐ−１である。一実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＳＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（配列番号２５）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３２）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＰｅｐ−１であり、配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８７）を含む。上述のタンパク質形質導入ドメインに加えて、または代替として、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、リポソームと結合して、さらに細胞およびミトコンドリア中への移行を促進し得る。

本発明はまた、上で定義されるＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質および薬剤的に許容される担体を含む組成物も提供する。

一実施形態において、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質またはそれを含む組成物は、細胞におけるフラタキシン発現を増加させるためのものである。一実施形態において、それはフリードライヒ失調症の治療における使用のためのものである。

本発明はさらに、細胞におけるフラタキシン発現を増加させるための、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質またはそれを含む組成物の使用に関する。

別の態様において、本発明は、フリードライヒ失調症の治療のための、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質またはそれを含む組成物の使用を提供する。

本発明はまた、フリードライヒ失調症の治療のための薬物を調製するための、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の使用に関する。

関連する態様において、本発明は、細胞においてフラタキシン発現を増加させる方法であって、前記細胞に、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質またはそれを含む組成物を形質導入することを含む、方法を提供する。

本発明はまた、対象においてフリードライヒ失調症を治療する方法であって、前記対象に、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質またはそれを含む組成物を投与することを含む、方法に関する。

本発明はまた、上述される本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質をコードする単離された核酸、ならびにそれを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。

別の態様において、本発明は：ａ）フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体；ならびにｂ）タンパク質形質導入ドメインを含む、組換えタンパク質に関する。一実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインは、Ｐｅｐ−１またはＴａｔである。一実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＳＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（配列番号２５）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＴＡＴであり、配列ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３２）を含む。別の実施形態において、前記タンパク質形質導入ドメインはＰｅｐ−１であり、配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８７）を含む。

本発明はさらに、上述の組換えタンパク質を、医薬担体とともに含む組成物を提供する。

本発明はまた、フリードライヒ失調症の治療のための、またはフリードライヒ失調症の治療のための薬物を調製するための、上述の組換えタンパク質の使用に関する。

本発明はまた、対象においてフリードライヒ失調症を治療する方法であって、前記対象に、上述の組換えタンパク質またはそれを含む組成物を投与することを含む、方法に関する。

本発明はまた、上述の組換えタンパク質をコードする単離された核酸、それを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。

本発明の他の目的、優位性および特徴は、添付の図面への参照のみを例として示される、それらの特定の実施形態の、以下の非限定的な記載を読むことにより、さらに明白となるであろう。

Xanthomonas campestris pv. Armoraciae.由来の未変性ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ｈａｘ３の模式図であり、各反復モノマー内のタンデムリピートドメイン、および２つの反復可変性残基（repeat variable residue）（ＮＧ、下線で示す）を示す。これらの二残基が、塩基認識特異性を決定する。カスタマイズされた人工ＴＡＬエフェクターの構築に使用される、４つの最も一般的な天然に存在する二残基を、それらの提案される主要な塩基特異性とともに、記載する。ＮＬＳ：核局在化シグナル；ＡＤ：未変性ＴＡＬエフェクターの転写活性化ドメイン（Zhang et al., Nature Biotechnology, 2011）。 本明細書に記載の組換えタンパク質の蛍光レポーター構築物：ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥの模式図である。ＥＦ−１ａ：ＥＦ−１ａプロモーター配列；ＶＰ６４：合成の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）；ＮＬＳ：核局在化シグナル；２Ａ：２Ａ自己切断ペプチド；ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質；ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎転写後制御因子。 ＴＡＬＥ ＤＮＡ認識部位を含むフラタキシンプロモーターを含む、本明細書に記載のリポータープラスミド、ｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙの模式図である。ｍｉｎＣＭＶ：最小サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ｍＣｈｅｒｒｙ：蛍光リポーター遺伝子。 図３に示すリポーター構築物に含まれる、フラタキシンプロモーター核酸配列（配列番号８８）を示す図である。 ｐＣＲ３．１−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ＥＧＦＰ発現プラスミドを、２９３ＦＴ細胞に単独でトランスフェクトした場合、フローサイトメトリーにより、緑色の蛍光（Ｑ４、右下部四半部）のみが、細胞において検出されたことを示す図である。 ｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドを、２９３ＦＴ細胞に単独でトランスフェクトした場合、フローサイトメトリーにより、赤色の蛍光（Ｑ１、左上部四半部）が、わずかな細胞においてのみ検出されたことを示す図である。 ２９３ＦＴ細胞への、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥおよびｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙの同時導入が、緑色および赤色の蛍光の発光（Ｑ２、右上部四半部）をもたらしたことを示す図である。 フラタキシンプロモーター配列と結合するように設計された、本明細書に記載のＴＡＬＥの配列および活性を示す図である。Ｔａｌｅ１〜１２番のＲＶＤの核酸配列は、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３に対応する。Ｔａｌｅ１〜１２番のＲＶＤのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４に対応する。 本発明の実施形態のｐＣＲ３．１プラスミドにおける、ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}構築物をコードするプラスミドの図である。 ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番（表３を参照のこと）をコードするプラスミドによるフリードライヒ線維芽細胞のヌクレオフェクション（nucleofection）の６０時間後の、フラタキシンｍＲＮＡ発現の定量的なＰＣＲ解析を示す図である。３つの異なる内部対照（ＨＰＲＴ１、ＧＡＰＤＨおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）をトランスフェクトした細胞で、結果を正規化した。 ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番（表３を参照のこと）をコードするプラスミドによるフリードライヒ線維芽細胞のヌクレオフェクションの６０時間後の、フラタキシンタンパク質発現の、ウェスタンブロット（Ａ）の結果を示す図である。（Ｂ）では、フラタキシンの発現を定量化し、β−アクチンの発現（フラタキシン抗体は、ミトサイエンス社（Mitosciences）から、およびβ−アクチン抗体は、シグマアルドリッチ社（Sigma Aldreich）から購入した）で正規化した。 救出されたＹＧ８線維芽細胞中の、フラタキシンｍＲＮＡおよびタンパク質の増加した発現を示す図である。Ａ．ＧＦＰプラスミドによるＹＧ８Ｒ線維芽細胞のヌクレオフェクションは、細胞のうちの４０〜５０％がトランスフェクトされ、ＧＦＰ蛍光タンパク質を発現したことを示す。Ｂ．ｐＣＲ３．１ ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ｖｐ６４}８番のヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクトされていない対照細胞（ＣＯＮＡ）、単独でヌクレオフェクトされた対照細胞（ＣＯＮＢ）、またはＧＦＰをコードするプラスミドでヌクレオフェクトされた対照細胞と比較して、フラタキシンｍＲＮＡ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより検出された）を優位に増加させた。フラタキシンｍＲＮＡを、異なる内部対照（ＨＰＲＴ１、ＧＡＰＤＨおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）により正規化した。ＹＧ８Ｒ線維芽細胞をｐＣＲ３．１ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ｖｐ６４}８番でヌクレオフェクトした際、ウェスタンブロット解析（Ｃ）により、ヌクレオフェクトされていない細胞（ＣＯＮ）と比較して、フラタキシンタンパク質発現の１．４倍の増加が観察された。内部対照としてβ−アクチンを用いて、フラタキシンタンパク質の発現を正規化した（Ｄ）。この実験に使用した抗体は、図１１に示す実験のためのものと同じである。 融合タンパク質、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−Ｔａｌｅ_{ｆｒａｔ／ｖｐ６４}８番（Ａ、配列番号１０６）および６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ１−ｔ−Ｔａｌｅ_{ｆｒａｔ／ｖｐ６４}８番（Ｂ、配列番号８６）のアミノ酸配列を示す図である。ＨＨＨＨＨＨ：６Ｘヒスチジンタグ。ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）は、Ｔａｔモチーフに対応する。ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８７）は、Ｐｅｐ１モチーフに対応する。tａｌｅ８番の１２個のＲＶＤは網掛けおよび太字で示す。４個のＶＰ１６モチーフは下線で示す（４ＸＶＰ１６＝ＶＰ６４）。 本発明の構築物：６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−Ｔａｌｅ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}の、大腸菌（ＢＬ２１）における発現を示す図である。Ａ．クマシーブルー染色は、ＩＰＴＧによる誘導有りまたは無しの場合の、総タンパクを示す。Ｂ．本発明の６Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}構築物の、Ｎｉカラム上での精製。レーン１：分子量；レーン２：大腸菌抽出物、誘導無し；レーン３：大腸菌総抽出物；およびレーン４：２５０ｍＭ ＮＰＩによるＮｉカラムからの溶出。 抗６×Ｈｉｓ抗体（Ａ）またはＶＰ１６抗体（Ｂ）を使用した、ウェスタンブロットによる、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ１６}の検出を示す図である。Ａ．レーン１：ＩＰＴＧによる誘導後の、ＢＬ２１の可溶性抽出物；およびレーン２：２５０ｍＭ ＮＰＩによるＮｉカラムからの溶出。Ｂ．Ｍ：分子量マーカー；ＮＩ：ＢＬ２１細胞、誘導無し；およびＩ：３７℃で５時間、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１細胞。 Ｖ５タグのウェスタンブロット解析を示す図である。Ｖ５タグと融合したフラタキシン（ｐＣＲ３．１−フラタキシン−Ｖ５、列２および７）またはＶ５タグと融合した６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン（ｐＣＲ３．１−６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン−Ｖ５、列４、５、６および８）のいずれかをコードするプラスミドで、２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。３６時間後、タンパク質を細胞から抽出した。 Ｖ５モノクローナル抗体は、フラタキシンタンパク質の３つのアイソフォーム：ＰＰ：プロタンパク質、ＰＩ：中間タンパク質、ＰＭ：成熟タンパク質；を検出した。 ６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−フラタキシンの精製を示す図である。組換えタンパク質を、大腸菌中で作製し、ニッケル親和性カラムを通した。左側の列２および３は、カラムに吸着することなく、通過したタンパク質を表す。カラムをまず１０ｍＭのイミダゾールで洗浄した（洗浄の列１〜３）。次いでタンパク質を１００ｍＭのイミダゾールで溶出させた（右側の列１〜１０）。 コンディショナルノックアウト細胞中で発現した組換え型フラタキシンが、細胞死を防止することを示す図である。（Ａ）：Ｃｒｅ−リコンビナーゼでトランスフェクトされていない、コンディショナルノックアウトフラタキシン遺伝子を有する細胞。Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの細胞を、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ／ＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトし、緑色蛍光でＦＡＣＳにより選択し；フラタキシン補充無し（Ｂ）、６×Ｈｉｓ−フラタキシンを含むもの（Ｃ）、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−フラタキシンを含むもの（Ｄ）または６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシンを含むもの（Ｅ）のいずれかとともに再び培養した。６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−フラタキシンまたは６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシンとともに培養した細胞は生存したが、フラタキシン無しまたは６×Ｈｉｓ−フラタキシンとともに培養した細胞は死滅した。 Xanthomonas campestris pv. Armoraciae.（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＹＡ３３５９．１およびＧＩ ６６２７００５９、配列番号４０）由来のＨａｘ３のアミノ酸配列を示す図である。本発明のＴＡＬＥ構築物（ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１−α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ）に含まれるＨａｘ３のＮ末端およびＣ末端配列を、太字（Ｎ末端）および太字／下線（Ｃ末端）で示す。 本発明のＴＡＬＥ構築物（例えば、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１−α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥおよびｐｃｒ３．１−ＣＭＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４？）に含まれる、Xanthomonas campestris pv. Armoraciae.由来のＨａｘ３の、Ｎ末端（Ａ）（配列番号４１）およびＣ末端（Ｂ）（配列番号４２）ヌクレオチド配列を示す図である。 （ＡおよびＢ）ＰＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（配列番号４３）の完全配列を示す図である。 同上。 ＰＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドの制限酵素切断地図を示す図である（Ａ〜Ｌ）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＰＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドに含まれる、ヒトフラタキシンの近位のプロモーター（下線）の配列を、５’および３’における連結配列とともに示す図である（配列番号４４）。 ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す図である。 ｍＣｈｅｒｒｙリポーターのヌクレオチド配列（配列番号４６）およびアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。 ヒト伸長因子１αプロモーターヌクレオチド配列（Ａ）（配列番号４８）ならびにＶＰ６４の合成転写活性化ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）（Ｂ）を示す図である。 自己切断ペプチド２Ａのアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号５１および５２）（Ａ）、ならびに高感度緑色蛍光タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列（ＥＧＦＰ、配列番号５３および５４）（Ｂ）を示す図である。 （Ａ〜Ｋ）本発明のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥプラスミドの完全配列（配列番号５５）を示す図である。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 Ｚａｎｇの方法（Nature Biotechnology, 2011）に基づく、種々の構築モジュールの配列を示す図である（Ａ〜Ｅ）。Ａ．ＮＩモジュール（配列番号５６（ｎｔ）および５７（ａａ））；Ｂ．ＮＧモジュール（配列番号５８（ｎｔ）および５９（ａａ））；Ｃ．ＨＤモジュール（配列番号６０（ｎｔ）および６１（ａａ））；Ｄ．ＮＮモジュール（配列番号６２（ｎｔ）および６３（ａａ））；Ｅ．コンセンサスモジュール（配列番号６４（ｎｔ）および６５（ａａ））。 （ＡおよびＢ）ＮＬＳ（ＫＫＫＲＫ、太字（配列番号８９））、ＧＦＰと融合したペプチド２Ａ（下線）、および可変性二残基（ＮＮ；ＨＤ、ＮＧおよびＮＮ、太字／下線）を含む、本発明の４つの骨格構築物（ＮＮ、ＨＤ、ＮＧおよびＮＮ骨格）のアミノ酸配列間の配列比較を示す図である。コンセンサス配列を示す（配列番号６６）。 同上。 （Ａ〜Ｅ）ＮＬＳ（ＫＫＫＲＫ、太字（配列番号８９））、ＥＧＦＰと融合したペプチド２Ａ（下線）；ＴＡＬＥでカスタマイズされた反復領域をクローニングするためのＢｓｍＢＩクローニング部位（網掛け）、および可変性二残基（ＮＮ；ＨＤ、ＮＧおよびＮＮ、太字／下線）；を含む、本発明の４つの骨格構築物（ＮＮ、ＨＤ、ＮＧおよびＮＮ骨格）のヌクレオチド配列間の配列比較を示す図である。 同上。 同上。 同上。 同上。 例となる本発明のＴＡＬＥの可変部分（ＲＶＤ）の、タンパク質およびアミノ酸配列を示す図である（Ａ〜Ｅ）。Ａ．フラタキシンプロモーター中のｔｃｃｃｔｔｇｇｇｔｃａｇｇ（配列番号１）と結合する、ＴＡＬＥ１番（配列番号６７および６８）。ＴＡＬＥ１番の反復可変性二残基は、ベクターＮＮ中のＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧである（配列番号２）。Ｂ．フラタキシンプロモーター中のｔｃｃｔｇｇｔｔｇｃａｃｔｃ（配列番号３）と結合する、ＴＡＬＥ２番（配列番号６９および７０）。ＴＡＬＥ２番の反復可変性二残基は、ベクターＨＤ中のＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧである（配列番号４）。Ｃ．フラタキシンプロモーター中の配列：ｔｇｇｔｔｇｃａｃｔｃｃｇｔ（配列番号５）と結合する、ＴＡＬＥ３番（配列番号７１および７２）。ＴＡＬＥ３番の反復可変性二残基は、ベクターＮＧ中のＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＮ である（配列番号６）。Ｄ．フラタキシンプロモーター中の配列：ｔｇｃｔｔｔｇｃａｃａａａｇ（配列番号７）と反応する、ＴＡＬＥ４番（配列番号７３および７４）。ＴＡＬＥ４番の反復可変性二残基は、ベクターＮＮ中のＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩである（配列番号８）。Ｅ．フラタキシンプロモーター中の配列：ｔｇｃａｃｇａａｔａｇｔｇｃ（配列番号９）と反応する、ＴＡＬＥ５番（配列番号７５および７６）。ＴＡＬＥ５番の反復可変性二残基は、ベクターＨＤ中のＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮである（配列番号１０）。本発明の他のＴＡＬＥの詳細については表３および図８を参照のこと。 同上。 同上。 同上。 同上。 ベクターｐｅｔ−１６ｂ中のＨＩＳ−ＰＥＰ１−フラタキシン構築物の配列を示す図である。Ａ．ＨＩＳ−ＰＥＰ１−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列および対応する核酸配列（配列番号７７）。 Ｂ．ＨＩＳ−ＰＥＰ１−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号７８）。Ｃ．ベクターｐｅｔ１６Ｂ中の６×Ｈｉｓ−ＰＥＰ１−フラタキシンのクローニング部位を示す。Ｄ．ＨＩＳ−Ｔａｔ−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列および対応する核酸配列（配列番号７９）。 Ｅ．ＨＩＳ−ＴＡＴ−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８０）。Ｆ．ベクターｐｅｔ１６Ｂ中の６×Ｈｉｓ−ＴＡＴ−フラタキシンのクローニング部位を示す。 Ｇ．ＨＩＳ−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列および対応する核酸配列（配列番号８１）。Ｈ．ＨＩＳ−フラタキシン組換えタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８２）。Ｉ．ベクターｐｅｔ１６Ｂ中のＨＩＳ−フラタキシンのクローニング部位を示す。６Ｘ Ｈｉｓタグは下線で示す；ＰＴＤ（ＰＥＰ１（Ａ−Ｂ）またはＴＡＴ（Ｄ−Ｅ））は太字で、およびフラタキシン配列は網掛けで示す。 ＪおよびＫ．ｐｅｔ−１６Ｂベクターの核酸配列（配列番号８３）。 同上。

本発明は、細胞におけるフラタキシンの発現／発現量を誘導するかまたは増加させること、およびその使用に関する。一態様において、本発明は、フラタキシンの発現を誘導するためのＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質に関する。さらなる態様においては、（ａ）フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体；ならびに（ｂ）タンパク質形質導入ドメイン；を含む組換えタンパク質を、設計し、作製し、かつ細胞に導入して、それにより細胞内のフラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体のレベルを増加させ得る。本発明はさらに、例えばフリードライヒ失調症の治療のために、それを必要とする対象由来の細胞においてフラタキシンタンパク質の発現を促進／増加させるためなどの、細胞においてフラタキシンの発現／発現量を誘導するかまたは増加させることの使用に関する。

ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質（ＴＡＬエフェクターまたはＴＡＬＥタンパク質）は、植物病原体、Xanthomonas種により天然に産生される（Boch et al. 2009; Boch and Bonas; Moscou and Bogdanove 2009)。ＴＡＬＥは、タンパク質内中央に、３３または３４アミノ酸セグメントのタンデム反復からなる、高度に保存されたかつ反復性の領域を有する（図１）。これらの反復モノマーは、主にアミノ酸位置１２および１３において互いに異なり、このアミノ酸対およびＴＡＬＥ結合部位の対応するヌクレオチド間には、強い相関が存在する（例えば、ＮＩとＡ、ＨＤとＣ、ＮＧとＴ、およびＮＮとＧまたはＡ）。所望のＤＮＡ配列を標的とするＴＡＬＥを作製するための、詳細なＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＰＣＲアセンブリ法は、公表されており（Zhang et al.）試薬も、商業的に入手可能である（例えば、アドジーン社（Addgene Inc.））。

本出願において明確で一貫性のある理解を提供するために、以下の定義を提供する。

定義
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本明細書において、１つまたは２つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語を指すために、使用される。

本明細書および請求項（１つまたは複数）において使用される「含む（comprising）」（ならびに「含む（comprise）」および「含む（comprises）」）などの、含む（comprising）のいかなる形態、「有する（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの有する（having）のいかなる形態）、「含む（including）」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」）などの含む（including）のいかなる形態、または「含む（containing）」（ならびに含む（contains）」および「含む（contain）」などの含む（containing）のいかなる形態）は、包括的または制約のないものであり、および付加的な、記載されていない要素または方法のステップを除外せず、および「限定されないが、を含む（including but not limited to）」および「限定されないが、を含む（comprising but not limited to）」の表現と互換可能に使用される。

本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、天然に存在する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ、図１を参照のこと）に由来し、フラタキシン遺伝子の転写およびフラタキシンタンパク質の発現を誘導する。

ＴＡＬＥは、宿主植物における遺伝子発現を調節し、細菌のコロニー形成および生存を促進する、植物病原体Xanthomonasを含む多種の病原性微生物により分泌される天然エフェクタータンパク質である。ＴＡＬエフェクターの特異的活性は、一般的に３３または３４のアミノ酸がタンデムに配列されたほぼ同一の反復（反復可変性二残基、ＲＶＤドメイン）である、中央反復領域に基づく。

ＴＡＬエフェクターファミリーのメンバーは、主にそれらの反復の数および／順序において異なる。反復数は１．５〜３３．５の範囲であり、Ｃ末端反復は、通常長さがより短く（すなわち約２０アミノ酸）、一般的に「半反復（half-repeat）」と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターの各反復は、１つの反復と一塩基対の、異なる塩基対特異性を示す異なる反復型との相関を特徴とする（１つの反復が、標的遺伝子配列上の１塩基対を認識する）。一般的に、反復数が少ないほど、タンパク質とＤＮＡの相互作用は弱い。いくつかの６．５反復は、リポーター遺伝子の転写を活性化させるのに十分であることが示されている（Scholze et al., 2010）。

反復間の差異は、主にアミノ酸位置１２および１３において生じ、それらはそのために「超可変性」と呼ばれ、かつ標的ＤＮＡプロモーター配列との相互作用の特異性の原因でもある（図２９および配列番号６４および６５に定義されるコンセンサスモジュールを参照のこと）。従って、特定のＤＮＡ配列を標的とするように、ＴＡＬエフェクターの反復を調節することが可能である。反復可変性二残基（ＲＶＤ）配列および標的ＤＮＡ塩基間の実験的に確認されたコードは、ＮＩ＝Ａ（モジュールＮＩ、配列番号５６および５７）、ＨＤ＝Ｃ（モジュールＨＤ、配列番号６０および６１）、ＮＧ＝Ｔ（ＮＧモジュール、配列番号５８および５９）、ＮＮ＝ＧまたはＡ（ＮＮモジュール、配列番号６２および６３）、ＮＫ＝Ｇ、およびＮＳ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴとして表すことができる（配列番号６４および６５に定義されるコンセンサスモジュールも参照のこと）。さらなる研究により、ＲＶＤ ＮＫがＧを標的とし得ることが示されている。ＴＡＬエフェクターの標的部位はまた、最初の反復が標的とする５’塩基に隣接するＴを含む傾向があるが、この認識の正確な機序は知られていない。現在、１１３を超えるＴＡＬエフェクター配列が知られている。Xanthomonas由来のＴＡＬエフェクターの非限定的な例としては、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４、ＡｖｒＸａ７、ＡｖｒＸａ１０およびＡｖｒＢｓ３が挙げられる。

従って、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の「ＴＡＬドメイン」は、いかなる細菌種（例えば、Xanthomonas oryzae pv.Oryzaeのアフリカ株（Yu et al.2011）、Xanthomonas campestris pv.raphani株７５６Ｃ、およびXanthomonas oryzae pv.oryzicola株ＢＬＳ２５６（Bogdanove et al. 2011）などのXanthomonas種）からのＴＡＬエフェクターに由来し得る。本明細書において使用される場合、本発明の「ＴＡＬドメイン」は、天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の、ＲＶＤドメインならびに隣接する配列（１つまたは複数）（ＲＶＤドメインのＮ末端および／またはＣ末端側の配列（例えば、配列番号４１（Ｎ末端）および４２（Ｃ末端））も含む。それは、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤよりも、より多いかまたはより少ない反復を含み得る。本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質のＲＶＤドメインは、上述のコード（すなわちＮＩ＝Ａ（モジュールＮＩ、配列番号５６および５７）、ＨＤ＝Ｃ（モジュールＨＤ、配列番号６０および６１）、ＮＧ＝Ｔ（ＮＧモジュール（配列番号５８および５９）、ＮＮ＝ＧまたはＡ（ＮＮモジュール、配列番号６２および６３）、ＮＫ＝Ｇ、ならびにＮＳ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴコンセンサスモジュール：配列番号６４および６５）に基づいて、フラタキシンプロモーター上の所与のＤＮＡ配列を標的とするように設計される。反復数（モノマーまたはモジュール、コンセンサスモジュールについては、図２９ならびに配列番号６４および６５を参照のこと）およびそれらの特異的な配列は、フラタキシンプロモーター上の所望のＤＮＡ標的配列に基づいて選択される。例えば、フラタキシンプロモーター上の特定の標的配列に合うように、反復を除去または追加し得る。一実施形態において、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、６．５〜３３．５の反復を含む。一実施形態において、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、８〜３３．５の反復、好ましくは１０〜２５反復、およびより好ましくは１０〜１４の反復を含む。

完全な一致が好ましいが、反復およびフラタキシンプロモーター配列上の標的塩基対間のミスマッチも、フラタキシン発現の増加を可能にする限り、許容される。一般的に、ＴＡＬＥ活性は、ミスマッチの数と逆相関する。好ましくは、本発明の組換えタンパク質のＲＶＤドメインは、対応する標的フラタキシンプロモーター配列との、７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、より好ましくは２つのミスマッチ、またはそれ以下を含み、およびさらにより好ましくはミスマッチを含まない。当然、ＲＶＤドメインの反復数が少ないほど、許容されるミスマッチの数も少ない。結合親和性は、一致する反復−ＤＮＡの組み合わせの合計に依存すると考えられる。例えば、２５以上反復を有するＲＶＤドメインは、最大７つのミスマッチを許容し得る。

ＲＶＤドメインに加え、本発明の「ＴＡＬＥドメイン」は、ＲＶＤドメインの各側（すなわち、タンデム反復のＣ末端（例えば、配列番号４１）およびＮ末端（例えば、配列番号４２）側）に、天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の、追加の配列を含む（例えば、図１９および２０）。ＲＶＤドメインの各側に含まれるＣ末端および／またはＮ末端配列（１つまたは複数）の長さは異なり得、例えばＺｈａｎｇら（２０１１）による研究に基づいて、当業者により、選択され得る。Ｚｈａｎｇらは、Ｈａｘ３由来のＴＡＬエフェクターベースのタンパク質における、いくつかのＣ末端およびＮ末端切断変異体の特徴を明らかにしており、標的配列との最適な結合およびそれによる転写の活性化に寄与する、主要な要素を特定した。一般的に、転写活性は、Ｎ末端の長さと逆相関することが発見された。Ｃ末端に関しては、Ｈａｘ３配列の最初の６８アミノ酸内のＤＮＡ結合残基の重要な要素が特定された。従って、最高レベルのＴＡＬＥ活性を保存するために、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤドメインのＣ末端側の最初の６８アミノ酸が、本発明の組換えタンパク質の「ＴＡＬＥドメイン」に含まれることが好ましい。従って、一実施形態において、本発明の「ＴＡＬＥドメイン」は、例えば、１）天然に存在するＴＡＬエフェクター由来のＲＶＤドメイン；２）ＲＶＤドメインのＮ末端側の、天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の、少なくとも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０以上のアミノ酸（例えば、図１９および２０ならびに配列番号４０、４１）；および／または、３）ＲＶＤドメインのＣ末端側の、天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の、少なくとも６８、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０以上のアミノ酸（例えば、図１９および２０ならびに配列番号４０、４２）を含む。

本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、他のタンパク質（例えば、転写コレギュレーター）のための結合部位を含み、かつ標的フラタキシン遺伝子の転写およびフラタキシンタンパク質の発現を活性化するために必須である、１つまたは複数の（すなわち、少なくとも１つの）「転写活性化ドメイン」または「トランス活性化ドメイン」（ＴＡＤ）をさらに含む。

トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、それらのアミノ酸組成に因んで命名される。これらのアミノ酸は、該活性に必須であるか、または単にＴＡＤにおいて最も豊富であるかのいずれかである。Ｇａｌ４転写因子によるトランス活性化は、酸性アミノ酸により媒介されるが、Ｇｃｎ４中の疎水性残基は、同様の役割を果たす。従って、Ｇａｌ４およびＧｃｎ４のＴＡＤはそれぞれ、酸性または疎水性の活性化領域と呼ばれる。

９つのアミノ酸のトランス活性化ドメイン（９ａａＴＡＤ）は、酵母中のＧａｌ４、Ｏａｆ１、Ｌｅｕ３、Ｒｔｇ３、Ｐｈｏ４、Ｇｌｎ３、Ｇｃｎ４、および哺乳類のｐ５３、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢおよびＶＰ１６に代表される、真核生物転写因子の大きなスーパーファミリーに共通の新規なドメインを定義する。９ａａＴＡＤ（酸性および親水性トランス活性化ドメイン両方）に関する予測は、ＥｘＰＡＳｙ（商標）およびＥＭＢｎｅｔ（商標）Ｓｐａｉｎから、オンラインで入手可能である。

一般的なコアクチベーター、Ｍｅｄ１５（Ｇａｌ１１）のＫＩＸドメインは、９ａａＴＡＤ転写因子、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｏａｆ１、Ｇｃｎ４、ＶＰ１６、Ｐｈｏ４、Ｍｓｎ２、Ｉｎｏ２およびＰ２０１と相互作用する。Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１およびＧｃｎ４とＴａｆ９との相互作用が報告された。９ａａＴＡＤは、複数の一般的なコアクチベーター、ＴＡＦ９、ＭＥＤ１５、ＣＢＰ／ｐ３００およびＧＣＮ５を動員する、一般的なトランス活性化ドメインである。従って、本発明において使用し得るＴＡＤの非限定的な例としては、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｏａｆ１、Ｇｃｎ４、Ｐｈｏ４、Ｍｓｎ２、Ｉｎｏ２、Ｐ２０１、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、Ｅ２Ａ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１およびＮＦ−κＢ由来のＴＡＤが挙げられる。ＴＡＤの他の非限定的な例としては、それに対する標的配列がフラタキシンプロモーターにおいて特定されている、ＳＲＦ、ＴＦＡＰ２またはＳＰ１転写因子由来のＴＡＤが挙げられる。（Li et al.2010）。当然、ＴＡＤの選択は、遺伝子が発現する細胞の特定の種類および遺伝子の性質を含む、多数の要因に依存する。さらに、２つ以上のＴＡＤが本発明のＴＡＬＥ構築物に含まれ得るということを、理解することができる。一実施形態において、本発明の組換えタンパク質のＴＡＤは、ＶＰ１６ ＴＡＤの配列の４倍に相当するＶＰ６４である。一実施形態において、ＴＡＤは配列ＧＳＧＲＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＩＮＳＲ（配列番号２６）を有する。

上の表１の注釈つきの９ａａＴＡＤの配列は、記載される順に上から下へ、配列番号１０７〜１１９に対応する。上の表１の右側の列に記載されるペプチド−ＫＩＸ相互作用における配列は、記載される順に上から下へ、配列番号１２０〜１２６に対応する（それぞれｐ５３ ＴＡＤ１；ｐ５３ＴＡＤ２、ＭＬＬ、Ｅ２Ａ、ＣＲＥＢ、Ｏａｆ１およびＰｄｒ１）。

本発明のＴalエフェクターベースの組換えタンパク質はまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含む。従って、本明細書で使用される「核局在化シグナル」または「ＮＬＳ」という表現は、核輸送により、細胞核に輸送するために、タンパク質に「タグをつける」アミノ酸配列を指す。典型的に、このシグナルは、タンパク質表面に露出した、正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つまたは複数の短い配列からなる。異なる核局在化タンパク質が、同一のＮＬＳを共有することがある。ＮＬＳは、タンパク質を標的にして核の外に出す、核外輸送シグナルの逆の機能を有する。古典的なＮＬＳは、一分（monopartite）またはニ分（bipartite）のいずれかにさらに分類し得る。最初に発見されたＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（一分ＮＬＳ）における、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７）であった。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号２８）は、遍在するニ分シグナル（約１０アミノ酸のスペーサーにより分離された、２つの塩基性アミノ酸のクラスター）のプロトタイプである。

ｈｎＲＮＰ Ａ１の酸性のＭ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２における配列ＫＩＰＩＫ、Ｕ ｓｎＲＮＰの複合シグナル、ならびに近年特定されたＰＹ−ＮＬＳとして知られるＮＬＳのクラスなどの、「非古典的」とされる、多くの他の種類のＮＬＳが存在する。従って、目的のタンパク質を標的にして標的細胞の核中に運び入れる限り、いかなる種類のＮＬＳ（古典的または非古典的）も本発明において使用し得る。ＮＬＳは、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原由来であることが好ましい。一実施形態において、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質のＮＬＳは、以下のアミノ酸配列：ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号２９）を有する。一実施形態において、前記ＮＬＳは、配列ＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０）を有する。一実施形態において、前記ＮＬＳは、配列ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３１）を有する。別の実施形態において、前記ＮＬＳは、配列ＫＫＫＲＫ（配列番号８９）を有する。

本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、標的細胞中へのタンパク質の侵入を確実にするために、タンパク質形質導入ドメインと有利に結合し得る。

さらなる態様において、本発明は、（ａ）フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体；ならびに（ｂ）タンパク質形質導入ドメイン；を含む、組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質を提供する。

タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）には多様な起源のものがあり、細胞膜、小器官膜、または小胞膜内へのタンパク質／ポリペプチドの移行を促進することにより、所与の治療薬の細胞内送達を可能にする。ＰＴＤは、脂質二重膜、ミセル、細胞膜、小器官膜、または小胞膜の横断を促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指す。別の分子と結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間、またはサイトゾルからミトコンドリアを含む小器官内への、分子の膜の横断を促進する。一実施形態において、ＰＴＤは、本発明の組換えタンパク質のアミノ末端と、共有結合的に結合する。別の実施形態において、ＰＴＤは、本発明の組換えタンパク質のカルボキシル末端と、共有結合的に結合する。例示的なタンパク質形質導入ドメインとしては、限定されないが最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含む、ＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞中に直接侵入するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Zender et al., Cancer Gene Ther. 2002 June; 9(6):489-96）；ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Noguchi et al., Diabetes 2003; 52(7):1732-1737）；切断されたヒトカルシトニンペプチド（Trehin et al. Pharm. Research, 21:1248-1256, 2004）；ポリリジン（Wender et al., PNAS, Vol. 97:13003-13008）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３３）；トランスポーチン（Transportan）：ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３４）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３５）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３６）が挙げられる。さらなる、例となるＰＴＤとしては、限定されないが、ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３８）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基までのアルギニンホモポリマーが挙げられる。

ＴＡＬエフェクターベースのタンパク質または組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質をコードする遺伝子構築物を、従来の遺伝子合成またはモジュラーアセンブリのいずれかを使用して、作成することができる。特注のＴＡＬエフェクター構築物を組み立てるためのプラスミドキットは、アドジーン社（AddGene）による公共、非営利のレポジトリから入手可能である。ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ標的用途のための、公共ソフトウェア、プロトコル、および他の資源へのアクセスを提供しているウェブページとしては、「ＴＡＬエフェクター−ヌクレオチドターゲター（TAL Effector-Nucleotide Targeter）」（http://boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/）および「taleffectors.com」が挙げられる。一実施形態において、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、Ｚｈａｎｇら（2011）の構築プロトコルに従って作成される。

一態様においては、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を使用して、細胞におけるフラタキシン核酸およびフラタキシンタンパク質の発現を増加させる／誘導することができる。本明細書において使用される場合、「細胞においてフラタキシンの発現を増加させる」における「増加させる」という表現は、ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の不存在下で、フラタキシンタンパク質が前記細胞において全く発現していない場合、および細胞がすでにある量のフラタキシンタンパク質を発現している場合の状況を含むことを意図する。該表現は、フラタキシンを発現していない細胞、正常なレベル、または正常な状態と比較して異常な／より低いレベルのフラタキシンを発現している細胞において、フラタキシンの発現を増加させる／促進することを含む。

一実施形態においては、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を使用して、それを必要とする対象由来の細胞における、フラタキシンプロモーターの転写を増加させ得る。それを必要とする対象の非限定的な例としては、正常な対象由来の細胞と比較して、減少したレベルのフラタキシン発現または活性を示す細胞を有する対象が挙げられる。一実施形態において、それを必要とする対象は、フラタキシン遺伝子のイントロン１に、異常な数の三塩基反復を有する対象である。一実施形態において、前記三塩基反復の数は、３５以上、６５以上、７５以上、８５以上、１００以上、１１０以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、２２５以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、５００以上である。一実施形態において、それを必要とする前記対象は、フリードライヒ失調症を患う。一実施形態において、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。

さらなる実施形態においては、組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質を使用して、細胞、例えばそれを必要とする対象由来の細胞における、フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体のレベルを増加させ得る。

本明細書において使用される場合、「それを必要とする対象」は、フラタキシンタンパク質の発現の増加またはフラタキシンタンパク質レベルの増加により、恩恵を受け得る対象である。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において、フラタキシンの発現を増加させる方法であって、有効量の本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を投与することを含む、方法に関する。一実施形態において、前記組換えタンパク質は、細胞膜を横断し、核に到達するために、特別に組み立てられる。一実施形態において、本発明は、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を、薬剤的に許容される担体とともに含む、組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において、フラタキシン（またはその機能的誘導体および／もしくは断片）のレベルを増加させる方法であって、有効量の、本発明の組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質を投与することを含む、方法に関する。一実施形態において、本発明は、本発明の組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質を、薬剤的に許容される担体とともに含む、組成物を提供する。

コドン縮重の最適化
ＴＡＬエフェクターは植物に感染する病原性微生物から発現されるため、本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を設計および作製する際、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）における最適な発現のために、それらの核酸配列を調節することが有利である場合が有る。

従って、部位特異的な突然変異誘発スキームにおいて、以下のコドン表（表２）を使用して、所与の核酸と同一のまたはわずかに異なるアミノ酸配列をコードする核酸を作製し得る。

配列類似性
「相同性」および「相同」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整列させた配列におけるそれぞれの位置を比較することにより決定し得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列が共有する位置における、同一のまたは一致するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。該用語を本明細書で使用する場合、２つの配列が実質的に同一であり、かつ配列の機能活性が保存されている場合、核酸配列はもう１つの配列と「相同」である（本明細書で使用される、「相同」と言う用語は、進化的な関連性は推測しない）。２つの核酸配列は、最適に整列された（ギャップは許容して）場合に、それらが少なくとも約５０％の配列類似性または同一性を共有するか、または該配列が定義された機能的モチーフを共有する場合、実質的に同一であると考えられる。代替的な実施形態において、最適に整列された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であり得る。簡潔にするために、単位（例えば、６６、６７．．．８１、８２、 ．．．９１、９２％ ．．．など）は、体系的に記載されてはいないが、それにもかかわらず、本発明の範囲内であると考慮される。

実質的に相補的な核酸は、１つの分子の相補体が、もう１つの分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸またはタンパク質配列は、最適に配列された際に、少なくとも約７０％の配列同一性を有する場合、実質的に同一と考えられる。代替的な実施形態において、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。同一性比較のための、配列の最適なアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、1981, Adv.Appl.Math 2: 482、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、1970, J.Mol.Biol.48:443、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法、1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 2444などの多様なアルゴリズム、およびこれらのアルゴリズムのコンピューターへの実装（例えば、ジェネティックコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、米国、ワイオミング州、マジソンのウィスコンシンジェネティックソフトウェアパッケージ（Wisconsin Genetics Software Package）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）を使用して、実施することができる。配列同一性は、Altschul et al., 1990, J.Mol.Biol.215:403-10に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定することもできる（公開されている初期設定を使用して）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから入手し得る（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/にて、インターネットを介して）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた際、一致するか、またはいくつかの正の値の閾値Ｔを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、まず高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを発見する検索を開始するための種配列（seed）として働く。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向のワードヒットの延長は、以下のパラメータが満たされると停止する：累積アライメントスコアが、その最大達成値から、量Ｘ分だけ減少した場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積に因り、累積スコアがゼロまたはそれより下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）：１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）アライメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０（または１もしくは０．１もしくもしく０．００１もしく０．０００１）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用し得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する、２つの配列間の統計的類似性の１つの基準は、最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が、偶然に生じる確率の指標を提供する。本発明の代替的な実施形態において、試験配列の比較における最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一であると考えられる。

２つの核酸配列が実質的に相補的であるという、代替的な指標は、２つの配列が、中程度にストリンジェントな条件、または好ましくはストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズすることである。中程度にストリンジェントな条件下での、フィルター結合（filter-bound）配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃にて、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、および４２℃にて、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄により、実施し得る（Ausubel, et al.(eds), 2010, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., New York, at p.2.10.3を参照のこと）。あるいは、ストリンジェントな条件下での、フィルター結合（filter-bound）配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃にて、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中、および６８℃にて、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄により、実施し得る（上述のAusubel, et al. (eds), 2010を参照のこと）。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて、既知の方法に従って調節し得る（Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New Yorkを参照のこと）。一般的に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（thermal melting point）よりも、約５℃低くなるように選択される。

別の態様において、本発明はさらに、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質または組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、上述の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、前記ベクターは、上述の核酸に機能的に連結された、転写制御因子をさらに含む。第１の核酸配列が第２の核酸配列と、機能的関系にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と「機能的に連結され」ている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結された」ＤＮＡ配列は近接しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、リーディングフレーム中にある。しかしながら、例えば、エンハンサーは一般的に、プロモーターから数キロベース離れている場合に機能し、イントロン配列は多様な長さであり得るため、いくつかのポリヌクレオチド要素は機能的に連結されているが隣接していないこともある。「転写制御因子」は、例えば、それらと機能的に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御する、開始および終結シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどの、ＤＮＡ配列を指す総称である。

さらに別の態様において、本発明は、上述の核酸および／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。本発明はさらに、例えば当技術分野で公知の培地ならびに作製、単離および精製方法を使用する、組換えタンパク質の発現／作製のための、上述されるものなどの組換え発現系、ベクターおよび宿主細胞を提供する。

別の態様において、本発明は、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質または組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質を含む、組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一実施形態において、前記組成物は、１つまたは複数の薬剤的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む。

本明細書において使用される場合、「薬剤的に許容される」（または「生物学的に許容される」）は、in vivoにおける、毒性または有害な生物学的作用の不存在（または限定的な作用）を特徴とする、材料を指す。該用語は、過度な毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を有さず、合理的な利益／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内で対象（例えば、ヒト、動物）の生体液および／または組織および／または器官との接触における使用に好適な、化合物、組成物、および／または剤形を指す。

本発明はさらに、上述のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質または組換え型「フラタキシン−タンパク質形質導入ドメイン」タンパク質、または組成物を、細胞におけるフラタキシン発現もしくはフラタキシンレベルを増加させるため、または対象におけるフリードライヒ失調症の治療のための説明書とともに含む、キットまたはパッケージを提供する。

本発明を、以下の非限定的な例により、さらに詳細に例示する。

実施例１
ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質は、細胞におけるフラタキシン発現を効果的に促進する
リポータープラスミドを使用するＺｈａｎｇらの方法（2011）は、ヒトフラタキシンプロモーター配列の多様な部分に特異的な、いくつかのＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質を設計および生成するために使用されてきた。アドジーン社（AddGene（商標） inc.）が販売している、ｍＣｈｅｒｒｙリポータープラスミドは、機能的ではなかった。従って、出願者らは、独自のリポータープラスミド：ｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ（図２１および図２２、ならびに配列番号４３を参照のこと）を作成した。表３は、標的とされるヌクレオチド配列、および本発明の実施形態のＴＡＬエフェクターベースの組換え型タンパク質の、対応する反復可変性二残基（ＲＶＤ）（Cermak et al.）を要約したものである。

ＥＦ１−αプロモーター下で種々のＴＡＬエフェクターベースのタンパク質をコードする遺伝子を含む、ＰＣＲ３．１発現プラスミドを作製した（図２）。しかしながら、これらのプラスミドにおいて、ＴＡＬＥドメインはＶＰ６４（配列番号２６）配列と融合し（ＴＡＬＥ−ＶＰ６４）、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質の結合後、下流遺伝子の発現を誘導した。さらに、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４遺伝子はまた、ＥＧＦＰリポータータンパク質をコードする遺伝子とも融合した。２Ａペプチド（アミノ酸配列ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３９）をコードする配列を、ＶＰ６４（配列番号２６）およびＥＧＦＰ（配列番号５４）の間に挿入してベクターｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥを作製した。このプラスミドを細胞にトランスフェクションした後、転写により単一のｍＲＮＡが産生された。しかしながら、２Ａペプチドが存在したため、転写の間に、２つの分離したタンパク質（すなわちＴＡＬＥ−ＶＰ６４およびＥＧＦＰ）が産生された。

どのＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質がフラタキシン遺伝子の発現を誘導し得るかを判定するため、蛍光ベースのリポーター構築物を作製した。近位のフラタキシンプロモーター（配列番号８８、Lie et al., 2010）を、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターおよびｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子のリポータープラスミド３’に挿入した（ｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ、図３）。このプラスミド中に存在するフラタキシンプロモーター配列を図４に示す。

２９３ＦＴ細胞における発現
トランスフェクション：２９３ＦＴ細胞に、ＴＡＬＥを有するプラスミドおよびｍＣｈｅｒｒｙリポーターを有するプラスミドを同時導入することにより、ｍＣｈｅｒｒｙリポーターの活性化を試験した。トランスフェクションの前日に、２９３ＦＴ細胞を、０．８Ｘ１０^４細胞／ウェルの濃度で、２４個のプレートに播種した。初回播種の約２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（インビトロジェン社（Invitrogen））を使用して、細胞をトランスフェクトした。ウェルあたり、５００ｎｇのＴＡＬＥおよび３０ｎｇのリポータープラスミドを使用した。製造者の推奨プロトコルに従って、トランスフェクション実験を実施した。

フローサイトメトリー：ｍＣｈｅｒｒｙリポーター活性化を、フローサイトメトリーによりアッセイした。トランスフェクションの約１８時間後に、培養プレートから細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー解析のために２００μｌの培地中に再懸濁した。各トランスフェクション試料について、少なくとも１０，０００事象を解析した。ＴＡＬＥによるｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子の誘導倍率（fold induction）を、トランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現のフローサイトメトリー解析により判定し、特定のＴＡＬＥ有りまたは無しでのトランスフェクションからの細胞の、ｍＣｈｅｒｒｙの総蛍光強度の比率として算出した。すべての誘導倍率（fold induction）の値を、各トランスフェクションについてのＧＦＰ総蛍光により判定された、ＴＡＬＥの発現レベルに対して正規化した。

ヒト細胞を、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥでトランスフェクトした際には、緑色蛍光のみが検出された（図５）。緑色蛍光の存在により、ＥＧＦＰタンパク質の発現が確認され、これにより間接的に、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質の発現が確認された。さらに、ｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ構築物を最初に、ヒト細胞に、３０ｎｇ／ｍｌにて単独でトランスフェクトした際には、ごくわずかな細胞が赤色蛍光を発現した（図５）。しかしながら、ヒト細胞に、ベクター（ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥおよびｐＣＲ３．１−フラタキシン−プロモーター−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を同時導入した際には、緑色蛍光および種々の量の赤色蛍光両方が検出され、ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質の活性が確認された（図６および７）。これは、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４構築物が、ｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子の発現を誘導するフラタキシンプロモーター配列に結合していることを示した。結果を図８に要約する。より活性な本発明のＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質（６、７および８番）は、緑色蛍光の割合がより高い場合において、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）の発現を誘導している。

従って、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質はフラタキシンプロモーターに結合し、このプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を誘導し得る。これらのＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質を使用して、対象の細胞におけるフラタキシン遺伝子の発現を増加させ得る。フラタキシンの増加した発現は、フリードライヒ失調症に付随する症状の軽減または予防を可能にする。

実施例２
ＴＡＬＥ_{ＦＲＡＴ／ＶＰ１６}はヒトフラタキシン遺伝子の発現を有意に増加させる。
ＴＡＬＥ_{Ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番をコードするプラスミド（図９）を正常な線維芽細胞中にヌクレオフェクトした。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、出願者らは、ＥＧＦＰでトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞で結果を正規化した際、ヒト細胞におけるフラタキシンｍＲＮＡの発現（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対する）が、ＴＡＬＥ_{Ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番により２倍または３倍になったことを、３つの独立した実験において確認した（表４)。条件あたり、２〜３つの独立した実験を実施した。

出願者らはまた、ＴＡＬＥ８番が、フリードライヒ失調症を患う患者由来の線維芽細胞におけるフラタキシンｍＲＮＡをも、２倍に増加させることを示した。実際、ｐＣＲ３．１ ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番のヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクトされていない対照（ＣＯＮ）またはＧＦＰをコードするプラスミドでヌクレオフェクトされた対照と比較して、フラタキシンｍＲＮＡを有意に増加させた（図１０）。フラタキシンｍＲＮＡを、ＰＣＲ（配列番号９０および９１に定義されるプライマーを使用）により増幅し、３つの異なる内部対照（ＨＰＴＲ１（配列番号９２および９３）、ＧＡＰＤＨ（配列番号９４および９５）および１８Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号９６および９７）、以下の表５も参照のこと）で正規化した。本実験に使用したフリードライヒ線維芽細胞は、コリエル医学研究所（Coriell Institute for medical）から入手され（ＧＭ０４０７８）、遺伝子の各対立遺伝子のイントロン１に、それぞれ５４１および４２０の反復を有する。

１８ＳリボソームＲＮＡ（ＮＲ＿００３２８６）には、プライマー：ａｃｇｇａｃｃａｇａｇｃｇａａａｇｃａｔｔおよびｔｃｃｇｔｃａａｔｔｃｃｔｔｔａｇｔｔｔｃａｇｃｔ（配列番号９６および配列番号９７）を使用した。

ｍＲＮＡレベルで得られた結果は、タンパク質レベルにおいても確認された。ＴＡＬＥ８番は、同じフリードライヒ患者由来の線維芽細胞におけるフラタキシンタンパク質も、ほぼ２倍に増加させた（図１１）。ＰＣＲ３．１ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番のヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクトされていない対照（ＣＯＮ）またはｅＧＦＰをコードするｐＣＲ３．１プラスミドでヌクレオフェクトされた対照（ＧＦＰ）と比較して、フラタキシンタンパク質を有意に増加させた。フラタキシンタンパク質発現を、β−アクチンを内部標準として使用して、正規化した。フラタキシンを検出するために使用したモノクローナル抗体は、ミトサイエンス社（Mitosciences）製の１８Ａ５ＤＢ１番であった。このような増加は、多くの患者に対する治療域（すなわち、正常なフラタキシンレべルの５０％）であろう。

実施例３
救済されたＹＧ８線維芽細胞における、フラタキシンｍＲＮＡおよびタンパク質発現の増加
救済されたＹＧ８（ＹＧ８Ｒ）マウスモデルは、２つの無効なマウスフラタキシン遺伝子を有し得るが、ＦＲＤＡ患者から得た１つのヒトフラタキシン導入遺伝子（ヒトプロモーターを有する）を含む。このヒト導入遺伝子は、イントロン１に２３０のＧＡＡ反復を含み、これにより減少した量のヒトフラタキシンが産生され、このマウスモデルにおけるＦＲＤＡ症状の発症をもたらす。出願者らは、ＹＧ８Ｒ線維芽細胞におけるＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}８番プラスミドのトランスフェクションが、フラタキシンｍＲＮＡ（約１．４〜１．９倍）およびタンパク質（約１．５倍）をも増加させることを示した（図１２）。

図１２に示す通り、出願者らは、フラタキシンのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるＰＣＲ３．１ＴＡＬＥ８の作用を以下のように分析した：Ｔ−７５フラスコ中（培地：ＤＭＥＭ、高グルコース；可欠アミノ酸（１Ｘ）およびペンストレップ（pen-strep）（１Ｘ）を含む１０％ウシ血清）、ほぼ８０％の密集度でＹＧ８細胞を培養し、次いで細胞をトリプシン処理し、６個の管に（１５ｍｌサイズ）に均等に分割し、低速（１２００ｘｇ）にて、５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を各管中、５ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁し、次いで、前述と同様に遠心分離した。遠心分離が終了した際、ペレット（細胞）を室温に保持した。細胞ペレットのみを含む各管に、ヌクレオフェクション溶液の混合物（ＶＰＤ−１００１）／プラスミドＤＮＡ（１００μｌ／１０μｇ プラスミドｐＣＲ３．１ＴＡＬＥ８）を添加し、ピペット操作により細胞を再懸濁し、キュベットに移し、プログラムＰ−０２２に設定されたＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ ＩＩ（商標）装置（アマクサバイオシステムズ社（Amaxa biosystem））内に置き、次いでヌクレオフェクトした。次いでヌクレオフェクトされた細胞（各ヌクレオフェクションからの）を、６ウェルのプレートのウェルに播種し、細胞インキュベーター中、３７℃にて一晩培養した。培地を何度か交換し（上述と同じ培地で）、細胞壊死組織片を除去し、インキュベーター中、３７℃にて５０〜６０時間培養し、その後ｍＲＮＡまたはタンパク質を抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロットにより解析して、フラタキシン発現を評価した。以下の表６は、Ｙ８Ｇ細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲ解析に使用したプライマー配列を示す。

上述のように、ヒトフラタキシン遺伝子をマウスゲノムに導入したため、ウェスタンブロットによるフラタキシンタンパク質発現解析には、先に記載したものと同じヒト抗体を使用した。さらに、ヒトモノクローナルβ−アクチン抗体（シグマ社（Sigma））もまた、マウスβ−アクチンを認識することができた。

実施例４
６×Ｈｉｓ−ＣＰＰ−ＴＡＬＥ_{ＦＲＡＴ／ＶＰ６４}タンパク質の作製および精製
出願者らは、ｐＥＴ−１６Ｂ（ノバジェン社（Novagen inc.））中で、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、および６×Ｈｉｓフラッグと融合したＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}タンパク質をコードする、２つのプラスミド（６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ＴＡＬＥＦｒａｔ／ＶＰ６４および６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ１−ＴＡＬＥＦｒａｔ／ＶＰ６４）を構築し、大腸菌（ＢＬ２１）における、これらの組換えタンパク質の作製、およびニッケル親和性カラム上でのそれらの精製を可能にした。図１３は、これらのプラスミドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。

これらのプラスミドは、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後、大腸菌（ＢＬ２１）における組換えタンパク質の作製を可能にする（図１４Ａ）。ニッケル親和性カラム上で、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ＴＡＬＥ_{ｆｒａｔ／ＶＰ６４}を精製した（図１４Ｂ）。抗６×Ｈｉｓモノクローナル抗体（キアゲン社（Qiageｎ）、３４６６０番）（図１５Ａ）およびポリクローナル抗ＶＰ１６モノクローナル抗体（ａｂ４８０９、アブカム社（Abcam））（図１５Ｂ）を使用して、ウェスタンブロットにおいて、組換えタンパク質を検出した。

６×Ｈｉｓ−ＣＰＰ−ＴＡＬＥフラタキシン／ＶＰ６４タンパク質の作製および精製
原核生物発現ベクターｐｅｔ−１６ｂ（ノバジェン社（Novagen inc.））中の組換え型プラスミドＴＡＬＥ８番（６×Ｈｉｓ−ＴＡＴまたはＰＥＰ１）を、ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ中で形質転換し、アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む寒天プレート上、３７℃で一晩増殖させた。翌日、各組換えの３〜５個のコロニーを、アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む２５ｍｌのＬＢ中に個別に播種し、撹拌しながら３７℃にて増殖させた。翌日、一晩培養したもののうち１０ｍｌを、アンピシリンを１５０μｇ／ｍｌで含む２００ｍｌのＬＢ培地中に播種することにより、新たな培養を開始した。培養物の吸光度（Ａ６００ｎｍ）が０．５〜０．７近くに達した際、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を実施し、培養物を激しい撹拌条件下、３７℃にて４時間保持した。培養物（各組換えの）を４０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、溶解させるまで、ペレットを−８０℃で凍結保存した。溶解溶液（１０ｍｌ）ＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（商標）（シグマ社（Sigma）を使用して溶解を実施し、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール ｐＨ８．０中、１／１０に希釈した。好ましくはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２５Ｕ／ｍｌ）およびプロテアーゼ阻害剤を添加し、室温にて２０分間、可溶化液を激しく撹拌した。次いで、１６０００ｘｇで２０分間遠心分離を実施し、上清（１０ｍｌ）（可溶性の組換え型ＴＡＬＥ８を含む）を、カラム（ＮＩ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、サイズ２５ｍｌ）（キアゲン社（Qiagen））に通した。カラムを、３容量（３０ｍｌ）の洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール ｐＨ８．０）で洗浄し、１０ｍｌの：５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０で溶出を実施した。溶出画分（２ｍｌ）を、第１および第２の管に回収し、Ｌ−アルギニン５０ｍＭおよびＬ−グルタミン５０ｍＭを含むＰＢＳ中、Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラム（サーモフィッシャーピアース社（Thermo Fisher Pierce））を通して、イミダゾールを除去し、可溶性の組換えタンパク質を可溶性に保った。

実施例５
フリードライヒ失調症の細胞株および動物モデル

細胞株モデル
国立一般医科学研究所ヒト遺伝子細胞レポジトリ（National Institutes of General Medical Sciences Human Genetic Cell Repository）（コリエル研究所（Coriell Institute）、ニュージャージー州）（http://www.coriell.org/nigms）から入手可能な、フリードライヒ失調症の研究のための、ＦＲＤＡ患者、彼らの両親および兄弟由来のリンパ芽球細胞および線維芽細胞のコレクションが存在する。これらの細胞を使用して、ＴＡＬＥがフリードライヒ失調症患者の細胞におけるフラタキシンの発現を増加させ得ることを実証することができる。このコレクションには、異なる反復数を有するＦＸＮ対立遺伝子が存在する。

動物モデル
いくつかの動物モデルを作製した。最初の１つは、ヘテロ接合性のノックアウトマウス（ＫＯ／正常ＦＸＮ）である。このマウスは、減少した（５０％）フラタキシンレベルを示し、食事による鉄摂取の後、散在性の心臓における鉄沈着を示す（Santos et al. 2003）。ホモ接合のＫＯマウス（ＫＯ／ＫＯ）は生存可能ではなく、胚発生の間に死亡する。さらに、２３０のＧＡＡ反復を用いて、ＫＩ（ノックイン）マウスを開発した。ホモ接合のＫＩＫＩマウスは、野生型マウスの約７５％のフラタキシンタンパク質を有する（Miranda et al. 2002）。ＫＩおよびヘテロ接合性のＫＯマウスをともに繁殖させて、ヘテロ接合性のＫＩＫＯを得た。これらのマウスは、月齢１２才にて、野生型フラタキシンタンパク質の２５〜３６％のみを発現した（Miranda et al. 2002）。筋肉、心臓、脳または膵臓にフラタキシンが存在しない、コンディショナルＫＯ／ＫＯマウスモデルを作成した（Puccio et al. 2001）,（Ristow et al. 2003）。遺伝子をノックアウトした組織に応じて、これらのマウスは、反応性酸素種の増加、膵臓のベータ細胞の増殖停止およびアポトーシスに起因する、心肥大、大感覚神経の機能障害または糖尿病を発症した。ＭＣＫプロモーター下、Ｃｒｅを有するこれらのコンディショナルＫＯには、心臓において、２つの重要なミトコンドリアＡＴＰ依存性プロテアーゼ（ＬｏｎおよびＣｌｐＰ）の進行性の増加、ミトコンドリアＦｅ−Ｓタンパク質（アコニターゼおよびフェロケラーゼ）ならびにＳＤＨＡおよびＮＤ６呼吸鎖サブユニットの同時かつ有意な進行性の喪失（８０％の喪失）が存在する（Guillon et al. 2009）。これらの変化は３週目に検出可能であり、５週目には非常に顕著である。

他の研究者らは、それぞれＹＧ２２およびＹＧ８と呼ばれる、１９０または２８０のＧＡＡ反復のいずれかを有するヒトＦＸＮ遺伝子を含むＹＡＣを含む、遺伝子導入マウスを開発した。これらのマウスは、前記反復の、世代間に渡るかつ年齢関連性の体細胞における不安定性を示し、その最も顕著な伸長は特に小脳（ＦＲＤＡ患者に見られるように）および後根神経節において生じる（Al-Mahdawi et al. 2006, Clark et al. 2007）。ＦＸＮ ＹＡＣ遺伝子導入マウスを、Ｐｕｃｃｉｏらより得たヘテロ接合性のＦＸＮ ＫＯマウスと交雑育種することにより、Ｐｏｏｋ研究所はさらに、両導入遺伝子が、首尾よくホモ接合のＦＸＮノックアウト（ＫＯ／ＫＯ）の胚性致死を救済し得ること、および救済されたマウス（ＹＧ２２救済マウスおよびＹＧ８救済マウスと呼ばれる）がマウスフラタキシンを発現せず、低レベルのヒトフラタキシンのみを発現し（それらは１９０または２８０のＧＡＡ反復を有する、ただ１つのヒトＦＮＸ遺伝子しか有さないため）、従ってＦＲＤＡ様表現型（Al-Mahdawi et al. 2006）を表すことを示した。救済されたマウス（特にＹＧ８救済マウス）は、罹患した器官におけるフラタキシンｍＲＮＡおよびタンパク質の減少、強調能力の減少（ロータロッド試験による判定による）、アコニターゼ活性の減少、酸化ストレス（筋肉、小脳および心臓におけるＣｕＺｎＳＯＤおよびＭｎＳＯＤの減少）、ＤＲＧ大感覚神経における病理組織診断、心臓における鉄蓄積、月齢６才で始まる顕著な活性の減少、および体重増加を示した（Al-Mahdawi et al.2006, Clark et al.2007）。従って、これはＴＡＬＥを標的とするヒトフラタキシンプロモーターの、可能性のある治療効果を調査する、優れたＦＲＤＡマウスモデルある。

他の研究者らは、ＦＸＮ−ＥＧＦＰリポーターマウス、すなわちＥＧＦＰの発現を制御する天然ＦＸＮプロモーターを有するトランスジェニックマウスを作製した（Grant et al. 2006, Sarsero et al. 2003, Sarsero et al. 2005）。このトランスジェニックモデルは、ＦＸＮプロモーターの活性を増加させ得る化合物のスクリーニングのために有用である。

興味深いことに、フラタキシンを過剰発現しているトランスジェニックマウスが作成された（Miranda et al. 2004）。このトランスジェニックマウスは、いかなる病理も発症しない。これは、最終的な治療により、ＦＲＤＡ患者においてフラタキシンタンパク質が正常レベルを超えて増加したとしても、フラタキシンの過剰が有害な作用をもたらさないということを明確に示す、重要な結果である。

実施例６
タンパク質形質導入ドメインと融合した組換え型フラタキシンタンパク質は、フラタキシン遺伝子をノックアウトした線維芽細胞の死亡を妨げる。

フラタキシン発現ベクターの構築
細菌発現ベクターを作製した。ヒトフラタキシンｃＤＮＡを、オリジーン社（Origene inc.）（メリーランド州、ロックビル）から入手し、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、バイオベーシック社（BioBasic inc.）、ニューヨーク州、アムハースト）により誘導可能なラクトースオペロン下、ｐＥＴ−１６ｂ （（ノバジェン社（Novagen inc.））、メルク社（Merck inc.）、ドイツ、ダームシュタット）ベクター中でクローニングした。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、すなわち、ＴａｔまたはＰｅｐ−１のいずれかをコードする配列と、その５’末端にて融合したかまたは融合していないフラタキシンｃＤＮＡで、種々の種類の発現ベクターを構築した（Morris et al.2001, Vives et al.2003, Morris, Heitz and Divita 2002）。しかしながら、タンパク質の精製を促進するために、このＰＴＤは、６×Ｈｉｓタグをコードする配列に続いている。いくつかのベクター変異体はＶ５タグ（インビトロジェン社（Invitrogen inc.）、カリフォルニア州、カールスバッド）を、３’末端にも含んでいた。

組換え型フラタキシンの作製および精製
種々の組換え型フラタキシンタンパク質（６×Ｈｉｓ−フラタキシン、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−フラタキシン、６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン、６×Ｈｉｓ−フラタキシン−Ｖ５、６×Ｈｉｓ−Ｔａｔ−フラタキシン−Ｖ５、６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン−Ｖ５）を、ｐＥＴ−１６ｂベクターで形質転換した大腸菌中で作製した。このように、ニッケル親和性カラム上でのタンパク質の精製を可能にするために、すべての発現ベクターが、６×Ｈｉｓタグをコードする配列を含んでいた。ＤＯ_６００が０．５〜１．０になるまで、細菌をＬＢ培地中、３７℃にて増殖させた。最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質の産生を誘導した。Ｃｅｌｌｙｔｉｃ Ｂ（商標）（シグマ社（Sigma inc.）、ミズーリ州、セントルイス）を用いて、４時間後に細菌を溶解した。細菌を遠心分離し、ニッケル親和性カラム（キアゲン社（Qiagen inc.）、カリフォルニア州、バレンシア）に、上清を通した。カラムをまず、ＮＰＩ−１０緩衝液で洗浄した。フラタキシンタンパク質を、１００ｍＭのイミダゾールで溶出した。ゲル電気泳動とその後のクマシーブルー染色により（図１７）、またはフラタキシンに対するモノクローナル抗体（ミトサイエンス社（Mito Science inc.）、オレゴン州、ユージーン）を用いるウェスタンブロットにより、タンパク質の純度を確認した。

コンディショナルノックアウト線維芽細胞の培養
いくつかの我々の実験のために、ＦＲＤＡのためのマウス細胞モデルを使用した（Calmels et al. 2009）。この線維芽細胞株は、１つの無効なフラタキシン遺伝子を有し、および１つのコンディショナルフラタキシン対立遺伝子を有する。これらの線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州、セントルイス）中で増殖させた。これらの細胞を、ＣＭＶプロモーター（アドジーン社（AddGene inc.）、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）下、ＥＧＦＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子でトランスフェクトし、これにより内在性フラタキシンが枯渇した細胞モデルを得た。これらの線維芽細胞におけるマウスフラタキシンの完全な不存在は、細胞分裂を阻害し、細胞死をもたらす。

Ｖ５タグのウェスタンブロット
Ｖ５タグをウェスタンブロットにおいて検出するために、抗Ｖ５モノクローナル抗体（インビトロジェン社（Invitrogen inc.））とともに、膜をインキュベートした。モノクローナル抗体の存在を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗マウスを用いて、その後化学発光検出法によって検出した。

フラタキシン−Ｖ５または６×Ｈｉｓ−フラタキシン−Ｖ５をコードするプラスミドによる、２９３ＦＴ細胞のトランスフェクション

通常、フラタキシンタンパク質は、２１０のアミノ酸を含むプロフラタキシンとして、細胞質において産生される。このプロタンパク質を次いでミトコンドリアに移入し、ここでＮ末端を二度切断して、中間および成熟フラタキシンを作製する。組換え型フラタキシンにおける６×ＨｉｓタグおよびＰＴＤの存在が、その成熟を防止し得るどうかを検証するために、Ｖ５タグ（ｐＣＲ３．１−フラタキシン−Ｖ５）と融合したフラタキシンまたはＶ５タグ（ｐＣＲ３．１−６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン−Ｖ５）と融合した６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシンをコードするプラスミドで、２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。３６時間後、細胞からタンパク質を抽出した。ウェスタンブロットにおける、組換えタンパク質の検出のために、Ｖ５モノクローナル抗体を使用した。フラタキシンタンパク質の３つのアイソフォーム：ＰＰ：プロタンパク質、ＰＩ：中間タンパク質、ＰＭ：成熟タンパク質が検出された（図１６を参照のこと）。フラタキシン−Ｖ５をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした際、いくつかのプロタンパク質および中間タンパク質が検出されたが、ほとんどのタンパク質がすでに成熟していた。６×Ｈｉｓ−Ｐｅｐ−１−フラタキシン−Ｖ５をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした際、ほとんどのタンパク質はプロタンパク質アイソフォームであったが、いくつかの中間タンパク質および成熟タンパク質も検出された。これは、ＰＴＤの存在はフラタキシンの成熟を遅延させ得るが、それにもかかわらずタンパク質は成熟し得るということを示す。

これらの細胞をＣｒｅ−リコンビナーゼ−ＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトすることにより、コンディショナルノックアウト線維芽細胞中のフラタキシン遺伝子をノックアウトした。緑色蛍光細胞、すなわちトランスフェクトされた細胞を、ＦＡＣＳにより選択し、培養に再び戻した。これらの細胞は、フラタキシンを産生できなかった。いくつかの細胞を、いずれのフラタキシンも添加していない培地、または６×Ｈｉｓ−フラタキシンを添加した培地で培養した。これらの細胞はすべて一週未満に死亡した（図１８ＢおよびＣ）。しかしながら、Ｔａｔ−フラタキシンまたはＰｅｐ−１−フラタキシンを培地に添加した場合、フラタキシン−ＫＯ線維芽細胞は生存し、増殖した（図１８ＤおよびＥ）。これは、ＰＴＤと結合した組換えタンパク質が、線維芽細胞内に侵入し得るだけでなく、ミトコンドリアにも侵入し、かつ欠損したフラタキシンタンパク質を補充して、細胞を生存に導くことを示す。

本発明は、その特定の実施形態を例として、本明細書において先に記載されているが、添付される請求の範囲に定義される、本発明の精神および性質から逸脱することなく、本発明を改変することができる。

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配列番号２： 合成構築物
配列番号４： 合成構築物
配列番号６： 合成構築物
配列番号８： 合成構築物
配列番号１０： 合成構築物
配列番号１２： 合成構築物
配列番号１４： 合成構築物
配列番号１６： 合成構築物
配列番号１８： 合成構築物
配列番号２０： 合成構築物
配列番号２２： 合成構築物
配列番号２４： 合成構築物
配列番号２５： 合成構築物
配列番号２６： 合成構築物
配列番号２７： 合成構築物
配列番号２８： 合成構築物
配列番号２９： 合成構築物
配列番号３０： 合成構築物
配列番号３１： 合成構築物
配列番号３２： 合成構築物
配列番号３３： 合成構築物
配列番号３４： 合成構築物
配列番号３５： 合成構築物
配列番号３６： 合成構築物
配列番号３７： 合成構築物
配列番号３８： 合成構築物
配列番号３９： 合成構築物
配列番号４０： 合成構築物
配列番号４５： 合成構築物
配列番号４６： 合成構築物
配列番号４７： 合成構築物
配列番号４９： 合成構築物
配列番号５０： 合成構築物
配列番号５１： 合成構築物
配列番号５２： 合成構築物
配列番号５３： 合成構築物
配列番号５４： 合成構築物
配列番号５５： 合成構築物
配列番号５６： 合成構築物
配列番号５７： 合成構築物
配列番号５８： 合成構築物
配列番号５９： 合成構築物
配列番号６０： 合成構築物
配列番号６１： 合成構築物
配列番号６２： 合成構築物
配列番号６３： 合成構築物
配列番号６４： 合成構築物であり、３４位のｎはａまたはｃ、３６位のｎはｃまたはｔ、３７位のｎはａまたはｇ、３８位のｎはｔ、ｇまたはａ、３９位のｎはｔ、ａまたはｃ
配列番号６５： 合成構築物であり、１２位のＸはＮＩ、ＮＧ、ＮＮ、ＨＤ、ＮＫまたはＮＳ
配列番号６６： 合成構築物であり、２６６位のＸはＮＧ、ＮＩ、ＮＮまたはＨＤでもよい
配列番号６７： 合成構築物
配列番号６８： 合成構築物
配列番号６９： 合成構築物
配列番号７０： 合成構築物
配列番号７１： 合成構築物
配列番号７２： 合成構築物
配列番号７３： 合成構築物
配列番号７４： 合成構築物
配列番号７５： 合成構築物
配列番号７６： 合成構築物
配列番号７７： 合成構築物
配列番号７８： 合成構築物
配列番号７９： 合成構築物
配列番号８０： 合成構築物
配列番号８１： 合成構築物
配列番号８２： 合成構築物
配列番号８３： 合成構築物
配列番号８４： 合成構築物であり、２６６位のＸはＮＩ、ＮＧ、ＮＮまたはＨＤ
配列番号８５： 合成構築物であり、７９６位のｎはｃまたはａ、７９９位のｎはａまたはｇ、８００位のｎはａ、ｔまたはｇ
配列番号８６： 合成構築物
配列番号８７： 合成構築物
配列番号８９： 合成構築物
配列番号９０： 合成構築物
配列番号９１： 合成構築物
配列番号９２： 合成構築物
配列番号９３： 合成構築物
配列番号９４： 合成構築物
配列番号９５： 合成構築物
配列番号９６： 合成構築物
配列番号９７： 合成構築物
配列番号９８： 合成構築物
配列番号９９： 合成構築物
配列番号１００： 合成構築物
配列番号１０１： 合成構築物
配列番号１０２： 合成構築物
配列番号１０３： 合成構築物
配列番号１０４： 合成構築物
配列番号１０５： 合成構築物
配列番号１０６： 合成構築物
配列番号１０７： 合成構築物
配列番号１０８： 合成構築物
配列番号１０９： 合成構築物
配列番号１１０： 合成構築物
配列番号１１１： 合成構築物
配列番号１１２： 合成構築物
配列番号１１３： 合成構築物
配列番号１１４： 合成構築物
配列番号１１５： 合成構築物
配列番号１１６： 合成構築物
配列番号１１７： 合成構築物
配列番号１１８： 合成構築物
配列番号１１９： 合成構築物
配列番号１２０： 合成構築物
配列番号１２１： 合成構築物
配列番号１２２： 合成構築物
配列番号１２３： 合成構築物
配列番号１２４： 合成構築物
配列番号１２５： 合成構築物
配列番号１２６： 合成構築物

Claims (38)

1. ｉ）複数のタンデムリピートモノマーを含む反復可変領域（repeat variable domain）（ＲＶＤ）を含むＴＡＬエフェクタータンパク質由来のＴＡＬＥドメイン；
   ｉｉ）核局在化シグナル；および
   ｉｉｉ）転写活性化ドメイン；
   を含む、細胞におけるフラタキシンの発現を増加させるためのＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質であって、前記ＲＶＤがフラタキシンプロモーター配列と結合し、それにより前記細胞におけるフラタキシンの発現を可能にする、前記ＴＡＬエフェクターベースの組換えタンパク質。
2. 前記モノマーが、３３または３４アミノ酸残基からなる、請求項１に記載の組換えタンパク質。
3. 前記ＲＶＤが、６．５〜３３．５のモノマーからなる、請求項１または２に記載の組換えタンパク質。
4. 前記ＲＶＤが、１２．５、１３．５または１４．５のモノマーからなる請求項３に記載の組換えタンパク質。
5. 前記ＴＡＬＥドメインが、ＡｖｒＢｓ３、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４またはＡｖｒＸａ１０ ＴＡＬエフェクタータンパク質に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
6. 前記ＴＡＬＥドメインが、Ｈａｘ３ ＴＡＬエフェクタータンパク質に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
7. 前記Ｈａｘ３ ＴＡＬエフェクタータンパク質が、Xanthomonas campestris pv. Armoraciaeに由来する、請求項５または６に記載の組換えタンパク質。
8. 前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４合成転写活性化ドメインである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
9. 前記核局在化シグナルが、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原由来の哺乳類の核局在化シグナルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
10. 前記ＲＶＤが、以下：
    ｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置５〜１８；
    ｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置２１〜３４；
    ｉｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置２４〜３７；
    ｉｖ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置３７〜５０；
    ｖ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置７３〜８６；
    ｖｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置８１〜９４；
    ｖｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置９２〜１０５；
    ｖｉｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１０３〜１１６；
    ｉｘ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１０６〜１１９；
    ｘ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１２４〜１３７；
    ｘｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１５５〜１６８；および／または
    ｘｉｉ）フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列の位置１６８〜１８１；
    と結合し、前記フラタキシンプロモーターヌクレオチド配列が、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００１４４．４の位置１〜２２０に示される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
11. 前記ＲＶＤが、以下：
    ｉ）ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＮ；
    ｉｉ）ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＨＤ；
    ｉｉｉ）ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＤ ＨＤ ＮＮ ＮＧ；
    ｉｖ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＮ；
    ｖ）ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ；
    ｖｉ）ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＮ；
    ｖｉｉ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＩ；
    ｖｉｉｉ）ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ；
    ｉｘ）ＮＮ ＮＩ ＮＮＮＮ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
    ｘ）ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＩ；
    ｘｉ）ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＮ ＮＧ；または
    ｘｉｉ）ＨＤ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＨＤ；
    を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
12. 前記細胞が、フラタキシン遺伝子のイントロン１に、異常な数の三塩基反復を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
13. 前記細胞が、３５以上の三塩基反復を含む、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
14. 前記細胞が、１５０以上の三塩基反復を含む、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
15. タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
16. 前記タンパク質形質導入ドメインが、ＴＡＴまたはＰｅｐ−１である、請求項１５に記載の組換えタンパク質。
17. 前記タンパク質形質導入ドメインがＴＡＴであり、前記ＴＡＴが配列ＳＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣを有する、請求項１６に記載の組換えタンパク質。
18. 前記タンパク質がリポソームと結合している、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
19. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質および薬剤的に許容される担体を含む、組成物。
20. 細胞においてフラタキシン発現を増加させるための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物の使用。
21. フリードライヒ失調症の治療のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物の使用。
22. フリードライヒ失調症の治療のための薬物を調製するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の使用。
23. 細胞におけるフラタキシンの発現を増加させることに使用するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物。
24. フリードライヒ失調症治療における使用のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物。
25. 細胞においてフラタキシンの発現を増加させる方法であって、前記細胞に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物を形質導入することを含む、方法。
26. 対象においてフリードライヒ失調症を治療する方法であって、前記対象に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または請求項１９に記載の組成物を投与することを含む、方法。
27. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
28. 請求項２７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
29. 請求項２７に記載の単離された核酸または請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
30. ａ）フラタキシンタンパク質またはその機能性断片および／もしくは誘導体；ならびに
    ｂ）タンパク質形質導入ドメイン；
    を含む、組換えタンパク質。
31. 前記タンパク質形質導入ドメインが、Ｐｅｐ−１またはＴａｔである、請求項３０に記載の組換えタンパク質。
32. 請求項３０または３１に記載の組換えタンパク質を、医薬担体とともに含む、組成物。
33. フリードライヒ失調症の治療のための、請求項３０もしくは３１に記載の組換えタンパク質または請求項３２に記載の組成物の使用。
34. フリードライヒ失調症の治療のための薬物を調製するための、請求項３０または３１に記載の組換えタンパク質の使用。
35. 対象においてフリードライヒ失調症を治療する方法であって、前記対象に、請求項３０もしくは３１に記載の組換えタンパク質または請求項３２に記載の組成物を投与することを含む、方法。
36. 請求項３０または３１に記載の組換えタンパク質をコードする、単離された核酸。
37. 請求項３６に記載の単離された核酸を含むベクター。
38. 請求項３６に記載の単離された核酸または請求項３７に記載のベクターを含む、宿主細胞。

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