JP2014527038A - Ａｋｔ特異的捕捉剤、組成物ならびにその使用および製造方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、安定なペプチド系Ａｋｔ捕捉剤と、検出、診断および治療剤としてのその使用とを提供する。本出願は反復オンビーズｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリーを用いてＡｋｔ捕捉剤を含む安定なペプチド系捕捉剤を開発する新規の方法をさらに提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１１年７月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／５０６，５６０号明細書、２０１２年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／５９７，６２８号明細書および２０１２年２月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／５９８，６１４号明細書の優先権を主張し、当仮出願の内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられている。
政府の権利に関する陳述

本発明は、国立癌研究所によって授与された補助金交付番号５Ｕ５４ＣＡ１１９３４７の基に、政府の支援を受け、米国陸軍研究職局によって授与された補助金交付番号Ｗ９１１ＮＦ−０９−Ｄ−０００１および米国立衛生研究所政府によって授与された補助金交付番号ＣＡ１１９３４７の下に、政府の支援を受けた。米国政府は本発明について一定の権利を有する。

癌などの疾患を初期に検出するためには、生体試料中の主要タンパク質バイオマーカーを多重測定により検出することが要求される。複雑な生物学的混合液からバイオマーカーを認識することのできる高い親和性かつ高い選択性の分子部分の利用可能性が、疾患を示し得るタンパク質を正確に検出するための重要な要素である。

Ａｋｔは、プラズマ細胞膜（サイトカイン受容体、ＧＰＣＲ）から、細胞増殖、アポトーシス（ａｐｏｔｏｓｉｓ）および翻訳を制御する下流のエフェクター分子へと、シグナル伝達を仲介する（Ｖｉｖａｎｃｏ ２００２）。Ａｋｔはアポトーシスをブロックして細胞生存を促進する能力を有することで、Ａｋｔ過剰発現および／または過剰活性化が多くの型の癌に関与する（Ａｌｔｏｍａｒｅ ２００５）。それ故、Ａｋｔは、潜在的な治療薬としてばかりでなく、特定の型の癌のためのバイオマーカーとしても魅力的な標的となっている。現在のバイオマーカーアッセイ（ａｓｓａｙｓ）の大部分は、抗体を利用している。複雑な標的に対する安定な抗体を産生するのは困難である。

Ｖｉｖａｎｃｏ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２：４８９（２００２） Ａｌｔｏｍａｒｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：７４５５（２００５）

したがって、当技術分野で、バイオアッセイにおいてまた治療法として再生可能かつ効率的に使用できる安定な合成捕捉剤が求められている。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、Ａｋｔに特異的に結合する安定な合成Ａｋｔ捕捉剤である。ある実施形態では、これらのＡｋｔ捕捉剤は、アンカーリガンド、二次リガンドおよび三次リガンドを含むトリリガンドである。ある実施形態では、アンカーリガンドはペプチド配列Ａｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２を含む。ある実施形態では、二次リガンドは、ペプチド配列Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２を含む。ある実施形態では、三次リガンドは、ペプチド配列Ａｃ−Ｃ８−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２を含む。ある実施形態では、アンカーリガンド、二次リガンドおよび三次リガンドの１つ以上の間のリンケージは、１，４−置換１，２，３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を含む。ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤は、以下の構造を有する：

ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤は、広範囲の温度、ｐＨ、貯蔵時間、貯蔵条件および反応条件で安定であり、ある実施形態では、捕捉剤は同等な抗体または生物材料より安定である。ある実施形態では、捕捉剤は、凍結乾燥粉末としての貯蔵において安定である。ある実施形態では、捕捉剤は、約−８０℃〜約４０℃の温度での貯蔵において安定である。ある実施形態では、捕捉剤は室温での貯蔵において安定である。ある実施形態では、捕捉剤は、ヒト血清中で少なくとも２４時間安定である。ある実施形態では、捕捉剤は約３〜約８の範囲のｐＨで安定である。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤が、１つ以上の検出可能なラベル（ｌａｂｅｌｓ）を含む。これらのある実施形態では、ラベルは銅−ＤＯＴＡである。他の実施形態では検出可能なラベルは、^６４Ｃｕ ＤＯＴＡ、^６８Ｇａ ＤＯＴＡ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、^１２４Ｉ、^８６Ｙ、^９４ｍＴｃ、^１１０ｍＩｎ、^１１Ｃおよび^７６Ｂｒから選択される。他の実施形態では、検出可能なラベルは、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^６７Ｇａ、^１１１Ｉｎおよび^９９ｍＴｃから選択される。他の実施形態では、ラベルは蛍光ラベルである。

ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤は、Ａｋｔの非ＡＴＰおよび／または非ペプチド基質結合部位に結合する。これらのある実施形態では、Ａｋｔ捕捉剤は、Ａｋｔ活性のアロステリック阻害薬として機能する。

ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤の１つ以上を含むキットが提供される。これらのある実施形態では、キットは使用説明書を含む。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤を使用して生体試料中のＡｋｔを同定、検出、定量化または分離する方法が提供される。ある実施形態によると、これらの方法は、Ａｋｔ捕捉剤が抗体またはその同等物の置き換えとして使用されるイムノアッセイである。ある実施形態では、イムノアッセイはウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロットまたはＥＬＩＳＡである。

ある実施形態では、必要な対象者におけるＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を、本明細書で提供される捕捉剤を使用して診断または分類する方法を提供する。これらのある実施形態では、病態は癌であり、該方法は癌の診断および／またはステージ分類をするのに用いられる。

ある実施形態では、必要な対象者においてＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を治療する方法を提供する。ある実施形態では、これらの方法は、対象者に本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤の治療有効量を投与することを含む。ある実施形態では、治療する病態は癌である。ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤は免疫治療薬として機能する。

ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤を使用してＡｋｔ活性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて阻害する方法を提供する。これらのある実施形態では、Ａｋｔ捕捉剤はＡｋｔ活性をアロステリックに阻害する。ある実施形態では、Ａｋｔ活性を阻害することでＡｋｔレベルが有効に減少し、かつ／あるいはＡｋｔ立体構造が変化する。

ある実施形態では、１つ以上のＡｋｔ捕捉剤の使用は、必要な対象者においてＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を治療するための薬剤の調製における使用を提供する。

ある実施形態では、本明細書に開示されているＡｋｔ捕捉剤を合成する方法を提供する。

ある実施形態では、標的タンパク質に対する捕捉剤を生成する方法を提供する。ある実施形態では、標的タンパク質がキナーゼであり、これらのある実施形態では、キナーゼがＡｋｔである。ある実施形態では、これらの方法は以下の工程を含む：
（ａ）アンカーリガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）標的タンパク質を１つ以上の標的タンパク質阻害薬に接触させる工程；
（ｉｉ）標的タンパク質に対するアンカーリガンドを選択するために第１の複数の候補ペプチドを調製する工程；
（ｉｉｉ）標的タンパク質を前記第１の複数の候補ペプチドに接触させる工程；
（ｉｖ）標的タンパク質に対する親和性を有する候補ペプチドをアンカーリガンドとして選択する工程であって、候補ペプチドは標的タンパク質に活性部位外で結合する工程；および
（ｖ）アンカーリガンドの配列を決定する工程；
（ｂ）二次リガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）アンカーリガンドおよびアジド基またはアルキニル基を含むアンカーリガンド選択ブロックを調製する工程；
（ｉｉ）標的タンパク質に対する二次リガンドを選択するために第２の複数の候補ペプチドを調製する工程であって、アンカーリガンド選択ブロックがアルキニル基およびアジド基をそれぞれ含む場合、第２の複数のペプチドは、アジド基またはアルキニル基を含む工程；
（ｉｉｉ）アンカーリガンド選択ブロックおよび第２の複数のペプチドを標的タンパク質に接触させる工程；
（ｉｖ）アンカーリガンド選択ブロックと二次リガンドとの間に２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを形成することにより捕捉剤バイリガンドを提供する工程であって、アンカーリガンド選択ブロックのアジド基およびアルキニル基ならびに二次リガンドは標的タンパク質に結合することによって近接するようになる工程；
（ｖ）標的タンパク質と親和性を有する捕捉剤バイリガンドを選択する工程；および
（ｖｉ）二次リガンドの配列を決定する工程；
（ｃ）三次リガンドおよび選択的に追加のリガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）アジド基またはアルキニル基を含むバイリガンド選択ブロックを調製する工程；および
（ｉｉ）標的タンパク質に対する所望の結合親和性を有する捕捉剤が得られるまで工程（ｂ）（ｉｉ）から（ｂ）（ｖｉ）までを第３、第４などの複数の候補ペプチドを用いて反復する工程。

ある実施形態では、活性部位はＡＴＰまたは基質ペプチド結合部位である。

ある実施形態では、第１リガンドと第２のリガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率および／または選択性を、ＱＰＣＲを用いて評価する方法を提供する。ある実施形態では、第１のリガンドはアンカーリガンドであり、第２のリガンドは二次リガンドである。他の実施形態では、第１のリガンドはバイリガンドであり、第２のリガンドは三次リガンドである。ある実施形態では、これらの方法は以下の工程を含む：
（ａ）可溶性のビオチン化された第１のリガンドとオンビーズ第２のリガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応を実施する工程；
（ｂ）残り全ての第１のリガンドが前記第２のリガンドに結合してリガンド複合体を形成するように、非結合第１のリガンドを除去する工程；
（ｃ）リガンド複合体をストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドＱＰＣＲテンプレートに接触させる工程；
（ｄ）リガンド複合体−ＱＰＣＲテンプレートをＱＰＣＲに供する工程；および
（ｅ）ＱＰＣＲ反応のサイクル閾値を決定する工程。

ある実施形態では、捕捉剤は凍結乾燥粉末としての貯蔵において安定である。他の実施形態では、捕捉剤は約−８０℃〜約４０℃の温度での貯蔵において安定である。他の実施形態では、捕捉剤は室温での貯蔵において安定である。他の実施形態では、捕捉剤はヒト血清中で少なくとも２４時間安定である。他の実施形態では、捕捉剤は約３〜約８の範囲のｐＨで安定である。他には、捕捉剤は銅−ＤＯＴＡでラベリングされる。

アジドアミノ酸Ａｚ１、Ａｚ２、Ａｚ４およびＡｚ８の構造を示す図である。

アジドアミノ酸Ａｚ１およびＡｚ２の一般合成のための戦略を示す図である。

Ａｋｔ阻害薬Ａｃ７の構造を示す図である。この阻害薬は、Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８ＰをＡＴＰ競合的に阻害し、ＩＣ_５０が９０μＭであることがわかった。

最初のアンカーペプチドスクリーンから得られた配列を示す図である。抗体およびそれらの希釈体（Ｄｉｌuｔｉｏｎ）を示す（５Ｇ３＝キナーゼドメイン（ＣＳＴ）に対するｍＡｂ、Ｌ３２Ａ４＝リン酸化−Ｔ３０８（ＣＳＴ）に対するｍＡｂ、２Ｈ１０＝Ｃ末端ペプチド（ＣＳＴ）に対するｍＡｂ。強いコンセンサス残基を有する位置を影付きで表示する。

最初のアンカーペプチドスクリーニングで選択された２２個の配列に関するそれぞれの位置でのアミノ酸の頻度（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を示す、アジドアミノ酸頻度位置（Ａｚｉｄｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）グラフである。それぞれの位置におけるアミノ酸の頻度を表にし、これを用いて次の形式、ＮＨ_２−Ａｚ８−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−ＧＹＭ−ＴＧ（式中、Ｘ_１＝Ｈ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、Ｇ；Ｘ_２＝Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｔ；Ｘ_３＝Ｅ、Ｄ、Ｖ、Ｙ；Ｘ_４＝Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ；Ｘ_５＝Ｒ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｇ、Ｅ、Ｄ）の集中ライブラリを作成した。

集中ライブラリによるアンカーペプチドスクリーンから得られた配列を示す図である。それぞれの配列が出現する回数（Ｒｅｐｅａｔｓ）を右に示す。強いコンセンサス残基を有する位置を影付きで表示する。

アンカーペプチド（Ａｎｃｈｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ）選択スキームを示す図である。Ａｋｔ１（灰色）キナーゼドメインをＡＴＰ競合的小分子阻害薬Ａｃ７（１）とプレインキュベートする。その後、阻害されたキナーゼを、アジドアミノ酸をＮ末端に有する包括的な固相五量体ライブラリによってスクリーニング（ＯＢＯＣ Ｓｃｒｅｅｎ）する。得られた配列を用いて最適なアンカーペプチド配列を決定する。

ナイーブライブラリによるバイリガンドペプチドスクリーンから得られた配列を示す図である。強いコンセンサス残基を有する位置を影付きで表示する。

５ＨＡ−バイリガンド−ｂｉｏ。三次ペプチドスクリーンに用いるためのビオチン化アンカー（バイリガンド）の構造を示す図である。

ナイーブライブラリによる三次ペプチドスクリーンから得られた配列を示す図である。強いコンセンサス残基を有する位置を影付きで表示する。

集中ライブラリによる三次ペプチドスクリーンから得られた配列を示す図である。強いコンセンサス残基を有する位置を影付きで表示する。集中ライブラリは、以下の形態であった：ＮＨ_２−Ａｚ８−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−ＧＹＭ−ＴＧ（式中、Ｘ_１＝Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｒ；Ｘ_２＝Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｒ；Ｘ_３＝Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｅ；Ｘ_４＝Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ；Ｘ_５＝Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ）。

Ａｃ７、アンカーペプチドおよびＡｃ７−ペプチド結合体によるＡｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐの阻害を示すグラフである。それぞれの化合物１２０μＭで室温にて３０分間、キナーゼ反応を実施した。リン酸化基質の量を液体シンチレーションカウンティングにて定量し、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ活性率（Ａｃｔｉｖｉｔｙ）（％）を対照のキナーゼ反応で形成された生成物の量に基づいて決定した。示された値は、３つの実験の平均値であり、誤差バーは標準偏差である。

アンカーペプチドは、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐによりリン酸化されない。ビオチン化ペプチドを、標準キナーゼ反応混合液中で、室温にて３０分間、インキュベートした。反応物の一部をＳＡＭ２ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上にスポット、洗浄し、液体シンチレーションカウンティングにて分析した。アンカーペプチド（ＶＦＹＲＬ−Ｂｉｏ（１）およびＶＦＹＲＬ−Ｂｉｏ（２））ならびに標準基質ペプチド（Ｂｉｏ−Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ）に関して１分毎の総カウント数（ｃｐｍ）／反応（Ｔｏｔａｌ ｃｐｍ／Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣにおける保持時間に基づいて、括弧内の番号によってジアステレオマーを特定する。

バイリガンドスクリーンのための戦略を示す図である。包括的なペンタペプチドライブラリをＴｅｎｔａＧｅｌ（黄色○）で合成し、アセチレン含有アミノ酸を付加する。このライブラリをＡｋｔ１キナーゼドメイン（灰色）およびビオチン化アンカーペプチド（黒）とインキュベートする（ｉｎ ｓｉｔｕクリック反応（Ｃｌｉｃｋ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））。固相ライブラリを抗Ａｋｔ抗体により、次にアルカリホスファターゼ結合二次抗体（紫色）によりプローブする。ヒットしたビーズを抗体単独により、再プローブして抗体バインダーを除去する。ヒットしたビーズを洗浄、剥離し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ラベルストレプトアビジン（赤）により再プローブし蛍光画像化する。最も蛍光強度の高いビーズの配列を決定して、バイリガンド候補を得る。標的スクリーン（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃｒｅｅｎ）は、結果としてヒット頻度がナイーブライブラリではビーズの０．００１％〜０．０１％の間であり、一方生成物スクリーン（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｃｒｅｅｎ）は配列決定のためのこれらのビーズの２３％〜３７％の間で妥当性を確認した。

Ａｋｔトリリガンドの構造を示す図である。トリリガンド分岐（Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ Ｂｒａｎｃｈ）、アンカーペプチド（Ａｎｃｈｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ）およびバイリガンド分岐（Ｂｉｌｉｇａｎｄ Ｂｒａｎｃｈ）が示されている。

オンビーズｉｎ ｓｉｔｕクリック反応効率の決定を示す図である。Ａ．二次リガンドを、Ｎ末端プロパルギルグリシンを有するＴｅｎｔａＧｅｌ（赤字）上で合成し、可溶性アンカーリガンドにＣ末端ビオチン（黒）およびＮ末端アジドアミノ酸を付加する。これらを下記に述べる条件で一緒にインキュベートする。反応が終了後、ビーズを洗浄（Ｗａｓｈ）、剥離し、トリアゾールの形成を検出するために、ストレプトアビジン−ＤＮＡ結合体（赤）によりプローブする。その後、ビーズをオンビーズＱＰＣＲに供した。Ｂ．ＱＰＣＲの結果。反応条件は、１．Ａｋｔ１＋ビオチン化アンカーペプチド＋ビーズ、２．ビオチン化アンカーペプチド＋ビーズ、３．ビーズ、および４）ＣｕＩ／アスコルビン酸＋ビオチン化アンカーペプチド＋ビーズであった。赤色バーは（ａ）に記載の反応の立体配置を示し；黒色バーはアンカーペプチドがオンビーズ上で合成され、ビオチン化二次ペプチドが溶液中にある反応を示す（反転立体配置）。誤差バーは標準誤差を示す。本実験で、オンビーズｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率は、Ａｋｔ１標的の非存在下に比べ、存在下の方が約１０倍高い。比較のために、Ｃｕ（Ｉ）触媒クリック反応の効率はタンパク質をテンプレートとした反応より約４桁高い。Ｃ．対数［ＳＡ−テンプレート］の標準曲線。各ポイントは２つの実験の平均Ｃｔである。

蛍光色素−バイリガンドの構造を示す図である。

蛍光色素結合抗ＡＫＴ抗体または蛍光色素結合バイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）で染色された固定化ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＡｋｔの免疫蛍光像を示す図である。各造影剤は、未刺激（Ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）またはＥＧＦ処理細胞においてそれぞれ細胞質結合ＡＫＴまたは細胞膜結合ＡＫＴを区別する。

Ａｋｔトリリガンド相対的親和性およびその成分を示すグラフである。Ａｋｔ−Ｓ４７３ＥをＮｉ−ＮＴＡプレート上に固定化し、種々の濃度のビオチン化ペプチドとインキュベートした。全ての値は、飽和状態で観察された結合に正規化した。

表面プラズモン共鳴によるトリリガンドの絶対親和性を示すグラフである。この実験に関して、ビオチン化トリリガンドを、ストレプトアビジン誘導体化ビアコアチップ上に固定化し、９μＭ〜１ｎＭの範囲の濃度でＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅによりプローブした。センソグラムのフィットを実線として示す。また、動態パラメーターの決定により、ＫＤは２００ｎＭであることが見出された。

アンカー(Ａｎｃｈｏｒ)、バイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）およびトリリガンド（Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）の特異性を示すグラフである。ビオチン化リガンドをストレプトアビジンプレート上に固定化し、Ｈｉｓタグ化キナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）２５ｎＭにより、次に抗Ｈｉｓタグ化抗体−ＨＲＰ結合体によりプローブした。相対的結合（Ｒａｌａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ）の値は、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ結合に正規化した後、３つの実験から得られた平均Ａ_４５０を示す。誤差バーは標準誤差を表す。トリリガンドの親和性はバイリガンドよりわずかに改善するのみであるが、Ａｋｔ１に対する選択性は明らかに増加することに留意されたい。

Ａｋｔ１活性の阻害を示す図である。Ａ．速度対種々の濃度の阻害トリリガンドを有する［ペプチド基質］。Ｂ．速度対種々の濃度の阻害トリリガンドを有する［ＡＴＰ］。両実験において、Ａｋｔ１のＶｍａｘは［トリリガンド］が増加するにつれて減少しており、トリリガンドがいずれの基質とも競合していないことを証明している。以下に示す各グラフの図は、トリリガンドがペプチドまたはＡＴＰ結合部位のいずれに対しても競合しなかったという結論を説明するものである。

ペプチド基質に対するトリリガンドに関するＫ_ｉ’および阻害モードの決定を示す図である。Ａ．１／Ｋ_Ｍ（ａｐｐ）対［トリリガンド］のプロット。Ｋ_Ｍ（ａｐｐ）は、速度対種々の濃度のトリリガンドで得られた［ペプチド］曲線の非線形回帰分析から得られた（ＧｒａｐｈＰａｄ）。誤差バーは、非線形回帰によるＫ_Ｍ（ａｐｐ）の標準誤差を示す。９５％信頼区間を破線で表す。Ｘ切片（−Ｋ_ｉ’）は３６００ｎＭであることが見出された。Ｂ．１／Ｖ_ｍａｘ（ａｐｐ）対［トリリガンド］のプロット。Ｖ_ｍａｘ（ａｐｐ）の値および標準誤差は、非線形回帰より上述のとおりに得られた。Ｘ切片は１．７μＭであることが見出された。Ｃ．１／ｖ対種々の［ペプチド］における［トリリガンド］のディクソンプロット。基質の枯渇の可能性を考慮して、低ペプチド濃度からのデータは除去された。平行線はペプチドに対する非競合的阻害に特徴的なものである。Ｄ．［ペプチド］／ｖ対種々の［ペプチド］における［トリリガンド］のコーニッシュボーデンプロット。線の交差部分は−Ｋ_ｉ’を示す。このプロットの形は、ペプチドに対する非競合的阻害に特徴的なものである。

ＡＴＰに対するトリリガンドに関するＫ_ｉおよび阻害モードの決定を示す図である。Ａ．１／Ｋ_Ｍ（ａｐｐ）対［トリリガンド］のプロット。Ｋ_Ｍ（ａｐｐ）は、速度対種々の濃度のトリリガンドで得られた［ＡＴＰ］曲線の非線形回帰分析から得られた（ＧｒａｐｈＰａｄ）。誤差バーは、非線形回帰によるＫ_Ｍ（ａｐｐ）の標準誤差を示す。線の負勾配は、Ｋ_Ｍがトリリガンドによる阻害の間は変化がないことを示唆しているものと考えられた。Ｂ．１／Ｖ_ｍａｘ（ａｐｐ）対［トリリガンド］のプロット。上述するように、Ｖ_ｍａｘ（ａｐｐ）の値および標準誤差は非線形回帰により得られた。また、９５％信頼区間を破線で表す。Ｘ切片は、９５％ＣＩに基づく広い誤差範囲を伴う５．８μＭであることが見出された。Ｃ．１／ｖ対種々の［ＡＴＰ］における［トリリガンド］のディクソンプロット。１分毎の低カウント（ｃｐｍ）の結果によるカウンティングの誤差が大きいことから、低ＡＴＰ濃度からのデータは除去された。線は、Ｋ_ｉを決定するために用いた通常のＸ切片に集中した。プロットの形は、ＡＴＰに対する非競合的阻害の形と一致する。

免疫沈降実験からのクマシー染色ゲルを示す、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡＲ３（＋インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、＋ＥＧＦ）の図である。Ａはクマシーで染色され画像化された１２％ゲルを示す。レーン１：溶解物、レーン２：アンカー樹脂、レーン３：バイリガンド樹脂、レーン４：トリリガンド樹脂、レーン５：５Ｇ３ｍＡｂ樹脂。

ビオチン化リガンドをストレプトアビジンアガロース上に固定し、ＥＧＦおよびインスリンで処理された（誘導（Ｉｎｄｕｃｅｄ））ＯＶＣＡＲ３細胞株または未処理の細胞株（対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ））からの溶解物とインキュベートした。４℃にて１８時間後、樹脂を徹底的に洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料緩衝液で溶出し、ウェスタンブロッティングにより分析した。１．ブランク樹脂、２．アンカー、３．バイリガンド、４．トリリガンド、５．［５Ｇ３］ｍＡｂ、Ｌ．溶解物。

アンカーペプチドとトリアゾールとの間の１個、４個および８個の炭素リンカーでバイリガンドを合成した。

バイリガンドリンカー長さ変異体を活性化Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐに対して滴定し、活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ）をイムノブロッティングにより測定し、デンシトメトリーにて定量した。ｎ＝８リンカーで、最高の阻害力を有するバイリガンドが明らかに得られる。

単一ＴｅｎｔａＧｅｌビーズのＰＣＲサイクル（Ｃｙｃｌｅｓ）を示す図である。単一ビーズ上でＰＣＲを実施した。アガロースゲル電気泳動により分析したところ、約１００ｂｐに単一バンドがみられた。

トリリガンド親和性の抗体阻害を示すグラフである。固定化されたアンカー（Ａｎｃｈｏｒ）、バイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）およびトリリガンド（Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）を種々の濃度のＡｋｔ−Ｓ７３Ｅによりプローブした。結合は、抗Ａｋｔ１モノクローナル抗体（［２Ｈ１０］）、続いて抗マウス二次抗体−ＨＲＰ結合体で処理することにより検出された。結合した分画（Ａｋｔ結合率（％Ａｋｔ Ｂｏｕｎｄ））を正規化し、Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅの濃度に対して対数尺度でプロットした。データは、マルチリガンドのサイズが増大すると、［２Ｈ１０］抗体結合が減少することを示しており、トリリガンドの結合面の一部がＡｋｔ１のＣ末端での抗体結合と重複している可能性を示唆している。

ヒトＡｋｔ１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ５５７３２）の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）を示す図である。

エピトープターゲティングの１つの実施形態を説明する模式図である。

標的とするエピトープに結合する分子に関するスクリーニングの１つの実施形態を説明する模式図である。

タンパク質、ペプチド、ポリペプチドのリン酸化アミノ酸残基上のリン酸基に結合する有機金属リガンドの合成を示す模式図である。アジド基およびビオチン基をビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌの構造上に示す。

リン酸化セリン４７４に関連するＡｋｔキナーゼドメインのエピトープに対する捕捉剤を開発するためのスクリーニング戦略を示す模式図である。Ａ．有機金属でラベリングされたｐＳ４７４基の相対的サイズを３２量体断片の残りと比較して示す空間充填モデル。Ｂ．Ａｋｔ２のアミノ酸４５０〜４８１に相当し化学修飾されたｐ−Ｓ４７４基を有する３２量体ポリペプチド断片。この場合、図１の（２）および（４）は同じであり、単一のアミノ酸（リン酸化−Ｓ４７４）であり、図１のラベル（７）はリン酸化−キレート有機金属リガンドの一部であるビオチン基（「Ｂ」として示す）として含まれる。スクリーンに関して、この修飾されたポリペプチド断片を５量体ペプチドのビーズベースライブラリとインキュベートする。これらのペプチドは、人工および非天然のアミノ酸からなり、１８個のアミノ酸の基礎セットに基づいて、包括的である。したがって、ペプチドライブラリは、約２百万の異なる分子を含有する。インキュベーション後、ビーズベースライブラリを徹底的に洗浄し遊離ポリペプチド材料を除去する。ヒットしたビーズのみにポリペプチドが結合している。ヒットしたビーズはビオチンラベルを用いてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼユニットに結合させることで同定できる。アルカリホスファターゼ酵素をその基質に曝すことで析出物が産生され、ヒットしたビーズの色がターコイズブルーに変化する。ヒットしたビーズをその後分離し、これらのヒットしたビーズ上の５量体ペプチド配列を標準の配列決定法にて同定する。最初のアンカーを同じＺｎキレート剤／ｐ−Ｓｅｒ４７４ポリペプチド複合体を用いて、バイリガンドに伸長した。一旦、コンセンサスバイリガンドを同定した後は、２つの独立した手法を用いてトリリガンドを構築した：第１の手法に関しては、ｎ末端トリリガンド（ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）を、ｎ末端のバイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）をアジドで修飾することにより調製し、その後、標的／触媒として全Ａｋｔ２タンパク質を用いてｉｎ ｓｉｔｕクリックヒット（アセチレン提示ＯＢＯＣライブラリを用いた）に関してスクリーニングした；第２の手法に関しては、ｃ末端トリリガンド（ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）を、ｃ末端のバイリガンドをアジドで修飾することにより調製し、その後、標的／触媒として全Ａｋｔ２タンパク質を用いてｉｎ ｓｉｔｕクリックヒット（アセチレン提示ＯＢＯＣライブラリを用いた）に関するスクリーニングを実施した。

Ａｋｔ２のＳｅｒ４７４を標的とした４つの捕捉剤の構造を示す図である。Ａ．基本的なエピトープ標的スクリーンから同定されたアンカー（Ａｎｃｈｏｒ）リガンド。Ｂ．はバイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）を示す、Ｃ．は、ｎ末端トリリガンド（ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）を、Ｄ．はｃ末端トリリガンド（ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）（ＴＲＩ ＧＦ）を示す。Ｅ．二量化されたｎ末端トリリガンド。注記：これらの捕捉剤は、ｐ−Ｓｅｒ４７４近傍であるがｐ−Ｓｅｒ４７４を含まない領域を指向する。したがって、Ｓｅｒ４７４のリン酸化状態は捕捉剤（ＰＣＣ）結合と関係していない。

抗Ｓｅｒ４７４ Ａｋｔ２ ＰＣＣ組成物のいくつかに関する選択性および親和性アッセイを示す図である。全てのトリリガンドのデータは、ｎ末端トリリガンドを参照する。Ａ．抗Ｓｅｒ４７４ Ａｋｔ２ ＰＣＣバイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）およびトリリガンド（Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）に対するエピトープ（Ｅｐｉｔｏｐｅ）選択性を示すバーグラフ。標的ペプチド（Ｔａｒｇｅｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ｐ−Ｓｅｒ４７４領域を含有するｋｔ２のｃ末端３２量体断片である。標的外ペプチド（Ｏｆｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、タンパク質の異なる部分から選ばれた３２量体断片である。標的ペプチドに関して、高レベルの結合画分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｂｏｕｎｄ）がバイリガンドおよびトリリガンドの両方について記録されている。この画分は、標的外ペプチドに関して観察されるものの５〜１０倍高い濃度である。Ｂ．単一成分ＥＬＩＳＡアッセイからの結果を示す線グラフ。Ｃ．モノリガンド（Ｍｏｎｏｌｉｇａｎｄ）、バイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）およびトリリガンド（Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）が結合したＡｋｔ２のｃ末端３２量体断片のウェスタンブロット。

Ａｋｔのキナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する、抗ｐ−Ｓｅｒ４７４ Ａｋｔ２ＰＣＣ組成物ならびに同じ部位を標的とした市販抗体の影響を試験する標準阻害アッセイ（Ａｓｓａｙ）の模式図（図左）である。エピトープターゲティング戦略を用いて開発されたＰＣＣ組成物は、従来とは異なる酵素阻害薬を作製する。Ａｋｔ２がＳｅｒ４７４のリン酸化によって活性化される場合は、その状況で、それはＧＳＫ−３ａ／ｂをリン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏ）化する。それが立体効果を介してさらに活性化される場合は、それはｐ−ＧＳＫ−３ａ／ｂをさらに産生する。同じＡｋｔ２が阻害される場合は、それはｐ−ＧＳＫ−３ａ／ｂを少なく産生する。したがって、Ａｋｔ阻害（または活性化）のサインは、ＤＭＳＯ対照と比較して多量にｐ−ＧＳＫ−３ａ／ｂが存在すると特徴づけられる。ウェスタンブロットの形態で右にアッセイを示す。ＤＭＳＯのカラムは、ベースラインレベルを示す。ｎ末端トリリガンド（ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）、バイリガンド（Ｂｉｌｉｇａｎｄ）、ｎ末端トリリガンドの二量体（ｄｉｍｅｒ）および市販のモノクローナル抗体はいずれもＤＭＳＯと比較してＡｋｔを活性化する。ｃ末端トリリガンド（ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）はＡｋｔを阻害する。「ｈｉ」および「ｌｏｗ」ブロットはそれぞれ「長い」および「短い」展開時間に相当する。阻害アッセイに用いられたＡｋｔ２タンパク質は、ｐＳｅｒ４７４に対する抗体がｐＳｅｒ４７４を検出することから、Ｔｈｒ３０８でリン酸化され、Ｓｅｒ４７４で少なくとも部分的にリン酸化されている活性Ａｋｔ２である。

Ａｋｔ１プレックストリン相同性ドメインからの３３量体標的断片のデザインを示す図である。（ａ）Ｅ１７Ｋ突然変異のその封じ込めならびにその折り畳み構造のために選択された３３量体断片（ピンク色）を強調表示するプレックストリン相同性ドメインの３Ｄ画像（Ａｋｔ１配列の最初の１２４個のアミノ酸）。Ｅ１７Ｋ変異を青色で強調してあり、Ｉ１９［Ｐｒａ］ｉｎ ｖｉｔｒｏクリックハンドル置換は黄色で強調してある。（ｂ）ＯＢＯＣスクリーニングにおいてエピトープターゲティングに用いられた３３量体断片。（ｃ）（ｂ）に示す３３量体断片のＭＡＬＤＩスペクトル。

アンカーリガンドを決定するためのスクリーニング戦略を示す図である。（ａ）プレクリア（Ｐｒｅｃｌｅａｒ）：ライブラリビーズをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ − ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とインキュベートして、これに結合するまたはＢＣＩＰ試薬に結合するライブラリビーズを全て除去する。（ｂ）スクリーン：プレクリアされたライブラリビーズをアジドｉｎ ｓｉｔｕクリックハンドルを含有する３３量体標的ペプチド（３３−ｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）とインキュベートする。断片は、３３量体断片上のアルキンと、銅なしにクリック反応が起こるほどにアルキン置換に十分に近接して３３量体に特異的に結合するペプチド配列を含有するビーズ上のアジドとの間のトリアゾール形成を触媒する。クリックしていないペプチドをその後ビーズから剥離し、残りの共有結合で結合している３３量体を、ＢＣＩＰ展開を用いてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ − ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）により検出する。

無作為化（Ｒａｎｄｏｍ）および３３量体スクリーン（３３ｍｅｒ Ｓｃｒｅｅｎ）の場合のアミノ酸類似性による配列リガンドの教師なしクラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示す図である：アンカースクリーンからのヒットした配列をＣｌｕｓｔｅｒＬｉｇａｎｄ ｖ１．０により分析した。丸で囲んだクラスターは、ペプチドを可能なアンカー配列として選択しスケールアップした領域を示している。試験した潜在的なアンカー配列は：ｄｑｎｔｒ、ｙｐｗｖｅ、ｅｅｆｅｆ、ｙｌｅａｆおよびｅｌｎｈｙであった。

アンカーリガンド結合親和性に関するストレプトアビジン−アガロースのプルダウンアッセイを示す図である：ストレプトアビジン−アガロースをビオチンタグで合成された潜在的なアンカー配列のパネルとインキュベートした。これらの樹脂をその後、（ａ）Ｅ１７に対する特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｅ１７）（野生型（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ））ＷＴまたは（ｂ）Ｋ１７に対する特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｋ１７）（突然変異体（Ｍｕｔａｎｔ））（Ｅ１７Ｋ突然変異ＰＨＤ)のいずれかとインキュベートして、それぞれの潜在的なアンカーリガンドに関してプルダウンの量を測定した。

本発明の以下の説明は、単に本発明の種々の実施形態を説明するだけのものである。このように、説明された具体的な改変形態は、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきでない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなしに種々の均等物、変更および改変がなされてもよいことは明白であり、そのように均等な実施形態は本明細書に含まれると理解される。

定義：
用語「アロステリック」とは、その活性部位以外の領域上で分子と結合したときのタンパク質（例えば、酵素）の形および活性の変化を意味する。結合は直接機能に関与していない生物学的機能（アロステリックエフェクター）、または複数の結合部位（アロステリック部位）間で協働的に関与する酵素の制御を行うことがある。「アロステリック制御」とは、タンパク質の活性部位以外のタンパク質の部位でエフェクター分子と結合することにより、酵素または他のタンパク質を制御することである。

用語「アロステリック部位」とは、非基質分子と結合して立体構造変化を誘導し、この結果、基質に対する酵素の親和性の変化をもたらす酵素分子上の部位を意味する。

本明細書で用いられる用語「捕捉剤」とは、１つ以上の標的結合部分を含み、これらの標的結合部分を介して標的タンパク質に特異的に結合する組成物を意味する。それぞれの標的結合部分は標的タンパク質に対する結合親和性を、個別にまたは他の標的結合部分と組み合わせて提示する。ある実施形態では、それぞれの標的結合部位は、例えば、水素結合、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用などを含む１つ以上の非共有結合相互作用を介して標的タンパク質に結合する。捕捉剤は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチドおよび他の非ポリマー分子を含む１つ以上の有機分子を含んでよい。いくつかの態様では、捕捉剤はタンパク質触媒捕捉剤（ＰＣＣ）である。

本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、分子構築ブロックのライブラリからのＰＣＣの集合体を触媒できる標的タンパク質の異なる分子表面を意味する。通常、エピトープはポリペプチドであり、２０〜４０個のアミノ酸の限られた配列として、それ自体で作用することができる。

本明細書で用いられる用語「エピトープターゲティング」とは、エピトープ触媒過程によりアンカーリガンドを選択する過程を意味し、ここで第１の官能基を提示する合成ポリペプチドエピトープが第２の官能基を提示する可能なアンカーリガンドのライブラリと相互作用して、この結果、ポリペプチドとアンカーリガンドとの間に共有結合のリンケージを形成する。選択されたアンカーリガンドは、ポリペプチドエピトープおよび完全長（天然）標的タンパク質の両方に対して親和性を示す。ポリペプチドエピトープにより、アンカーリガンドの配列および結合部位、最終的に捕捉剤またはＰＣＣが決まる。

より大きいタンパク質の一部として存在する同じエピトープは、タンパク質触媒過程において、以前に選択されたアンカーリガンド（第２の官能基で修飾された）および分子構築ブロックのライブラリ（第１の官能基で修飾された）からのＰＣＣバイリガンドの集合体の触媒に関与することができる。このタンパク質触媒過程は、その後反復して、以前に選択されたバイリガンド（第３の官能基で修飾された）および分子構築ブロック（第４の官能基で修飾された）のライブラリから、ＰＣＣトリリガンドを集合させることができる。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で交互に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを含むアミノ酸配列を意味する。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。

用語「アミノ酸」とは、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸およびその異性体と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝情報によってコード化されているもの、ならびにその後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリンおよびそれらの異性体である。用語「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、水素に結合している炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。用語「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。本明細書においてアミノ酸は、一般に知られている３文字シンボルまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨する１文字シンボルのどちらかで表記されることがある。

本明細書で用いられる用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープに結合する抗体を意味する。通常は、抗体は約１０^−７Ｍ未満、例えば約１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で結合する。

本明細書で用いられる用語「Ｋ_Ｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。通常は、本発明の抗体は、例えば、抗原をリガンドとして、抗体を被検体として用いるＢｉａｃｏｒｅ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定すると、約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ、例えば約１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ＡＬＫに結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性より少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫ_Ｄに相当する親和性で所定の抗原に結合する。）親和性がより低い量は抗体のＫ_Ｄに依存しているため、抗体のＫ_Ｄが非常に低い場合には（すなわち、抗体の特異性が高い）、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性より低い量は、少なくとも１０，０００倍でもよい。

本明細書で用いられる用語「ｋ_ｄ」（ｓｅｃ^−１）は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。前記値はｋ_ｏｆｆ値とも称される。

本明細書で用いられる用語「ｋ_ａ」（Ｍ^−１×ｓｅｃ^−１）は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を意味する。

本明細書で用いられる用語「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。

本明細書で用いられる用語「Ｋ_Ａ」（Ｍ^−１）は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡結合定数を意味し、ｋ_ａをｋ_ｄで割ることにより得られる。

本明細書で用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、一般に病態またはイベントの予防すること、病態の発病または進展の程度を遅くさせること、あるいはイベントの出現を遅延させること、病態が進展するリスクまたはイベントを経験するリスクを減少させること、病態またはイベントに関連する徴候の進展を予防しまたは遅延させること、病態またはイベントに関連する徴候を減少または終了させること、病態を完全にまたは部分的に退行させること、病態もしくはイベントまたはそれらのある組合せの重症度を低下させることを意味する。

本明細書で用いられる「治療有効量」とは、投与量でかつ必要な期間にて所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。抗体の治療有効量は、個人の病状、年齢、性別および体重、ならびに個人において所望の応答を導き出すための捕捉剤の能力などの要因に準じて変化してよい。

本明細書で用いられる用語「Ａｋｔ」とは、Ａｋｔ（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３）の３つのアイソフォームのいずれか、当技術分野においてタンパク質キナーゼＢとしても知られているセリン／トレオニンキナーゼを意味する。本明細書で開示されている典型的なＡｋｔトリリガンド捕捉剤は、Ａｋｔ１に対してデザインされた。それ故、ある実施形態では、本明細書で用いられる「Ａｋｔ」は、配列番号：１に記載のＡｋｔ１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（図３１）あるいはその部分、例えばキナーゼドメイン、活性部位、またはエピトープを意味する。

本明細書で用いられる用語「キナーゼ」とは、ポリペプチドまたは酵素を意味し、そのナチュラル活性は、ＡＴＰなどの高エネルギードナー分子から特異的基質へリン酸基を移行させることである。

本明細書で用いられる用語「抗体」とは、抗原による刺激後、活性化Ｂ細胞により産生され、生体系における免疫応答を促進する抗原に特異的に結合することのできる種類のタンパク質を意味する。完全抗体は通常は、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む４つのサブユニットから構成される。用語、抗体は天然および合成の抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはその断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。典型的な抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。典型的な断片には、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２などが含まれる。モノクローナル抗体は、特異的に結合する抗体であり、それ故、「エピトープ」と呼ばれる他の生体分子の単一の特定の空間的および極性機構に補完的であるとして定義される。いくつかの形態では、モノクローナル抗体も同じ構造を有することができる。ポリクローナル抗体は、異なるモノクローナル抗体の混合液を意味する。いくつかの形態では、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体の少なくとも２つが異なる抗原エピトープに結合しているモノクローナル抗体の混合液であってもよい。異なる抗原エピトープは、同じ標的、異なる標的、または組合せ上にあってもよい。抗体は、宿主の免疫および血清の収集などの当技術分野においてよく知られている技術（ポリクローナル）より、または連続ハイブリドーマ細胞株を調製し、分泌されたタンパク質を収集すること（モノクローナル）により調製することができる。

捕捉剤、タンパク質触媒捕捉剤またはその製剤に関して本明細書で用いられる用語「安定な」とは、本明細書に記載の方法において利用するのに十分な時間の間、構造的および機能的完全性を保持する剤または製剤を意味する。

タンパク質触媒捕捉剤または捕捉剤に関して本明細書で用いられる用語「合成」とは、捕捉剤が生物学的手段よりむしろ、化学的手段によって生成されていることを意味する。

Ａｋｔ捕捉剤の開発：
抗体は現在、診断プラットフォームで用いられているデフォルトの検出剤である。しかし、抗体には、高額、安定性に欠けるなどのいくつかの欠点があり、多くの場合、適切な特徴づけがされておらず、高い特異性に欠ける。診断アッセイで用いる理想的な置き換えは、合成であり、一連の熱的および化学的条件まで安定であり、目的とする標的に対して高い親和性および特異性を示すものであるべきである。

高品質のモノクローナル抗体は、低いナノモルの親和性と高い標的特異性を有する。興味深いことに、抗原認識表面の構造的および遺伝的分析により、可変ループの分子多様性のほとんどが可変の高い単一ループ（ＣＤＲ−Ｈ３）（Ｘｕ ２０００）に含有されていることが示されている。ヒトでは、このループのサイズは、１〜３５残基（平均で１５）（Ｚｅｍｌｉｎ ２００３）の範囲であり、広い範囲の立体構造をとることができ（Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９）、抗原との相互作用のほとんどに関与している。他の５つのループは、多様性が相当低くなっており、ほんのわずかの立体構造をとる。このことは、注意深く選択された「アンカー」ペプチドが、捕捉剤とその標的タンパク質との間の相互作用のモードおよび強さを支配することができることを示唆している。それはまた、他のペプチド成分が、総相互作用エネルギーに軽度に寄与しているのみであるものの、重要な足場としての特性および特異性要素を提供することもできることを示唆している。

Ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリー（Ｍａｎｅｔｓｃｈ ２００４；Ｍｏｃｈａｒｌａ ２００４；Ｗｈｉｔｉｎｇ ２００６）は、小分子の酵素阻害薬を２つの部分に分離し、これらの各々をその後小さいライブラリに進展させる（一方はアセチレン機能性を含有し、他方はアジド基を含有する）技術である。酵素そのものはその後、アセチレン基とアジド基との間の１，３−双極性付加環化を選択的に促進してトリアゾールリンケージを形成（「クリック」反応）することによって、これらのライブラリ成分から「最適に適合する」阻害薬を集合させる。酵素は、正しい配向性でタンパク質に結合するこれらのライブラリ成分の間でのみクリック反応を促進する。結果として得られた阻害薬は、２つのライブラリの基礎を形成した最初の阻害薬に比べて、はるかに優れた親和性を提示することができる（Ｊｅｎｃｋｓ １９８１；Ｍｕｒｒａｙ ２００２）。

連続ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリーを実施することで、ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリーの概念を広げて、マルチリガンド捕捉剤の発見が可能になる（ＵＳＳＮ ２０１００００９８９６参照、参考により本明細書に組み入れられている）。この過程はモデルタンパク質炭酸脱水素酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）に対するトリリガンド捕捉剤を生成するのに以前に用いられた（Ａｇｎｅｗ ２００９）。連続ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリーはいくつかの利点がある。第１に、タンパク質標的に関する構造情報を非常に大きな化学的空間をサンプリングする能力に置き換えて、捕捉剤のリガンド成分を同定することができる。例えば、最初のリガンドは、大きな（＞１０^６要素）１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）（Ｌａｍ １９９１）ペプチドライブラリに対してタンパク質をスクリーニングすることによって同定されてもよく、ここでペプチド自体は天然、非天然および／または人工のアミノ酸からなってもよい。結果として得られたアンカーリガンドはその後、大きなＯＢＯＣライブラリを再度用いてｉｎ ｓｉｔｕクリックスクリーンに利用されて、バイリガンドバインダーを同定する。第２の利点は、過程を反復することができるため、トリリガンドなどを同定するためにバイリガンドをアンカーとして用いることができることである。最終の捕捉剤はその後、比較的単純で大規模な自動ケミストリーを用いてスケールアップすることができ、その構造の固有な部分としてビオチン基などでラベリングすることができる。この手法によって、分岐、環状および直鎖の捕捉剤の構造を探索することができるようになる。タンパク質指向のマルチリガンド集合体のための多数の戦略が記述されているが（Ｓｈｕｋｅｒ １９９６；Ｅｒｌａｎｓｏｎ ２０００）、ほとんどが、スクリーニング戦略を導くために、標的に関する詳細な構造情報を必要とし、ほとんどが（例えば、オリジナルｉｎ ｓｉｔｕクリック手法）、低多様性小分子ライブラリ用に最適化される。

本明細書で開示されているように、反復ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリー手法は、Ａｋｔに特異的に結合する高い特異性の分岐したトリリガンド捕捉剤を合成するために利用された。このｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリー手法は、２つの新規のスクリーニング戦略を利用した。第１に、Ａｋｔのプレ阻害された形態をスクリーニング標的として用いて、アロステリック部位阻害薬を開発する手段を提供した。第２に、選択過程は、アンカーリガンドおよびタンパク質標的が大きなＯＢＯＣライブラリに対してスクリーニングされるｉｎ ｓｉｔｕクリックスクリーンが、ヒットしたビーズ上のマルチリガンド生成物を選択的に生成するという事実を活用した。この過程の効率は、オンビーズ生成物の量を定量するために新規の定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）アッセイを用いて特徴づけされた。この概念は、オンビーズクリック生成物の存在がヒットしたビーズのサインとして捉えられる「生成物スクリーン」の形態で広げられた。本明細書で示すように、このような生成物スクリーンは、最終のマルチリガンド捕捉剤の親和性および／または選択性の両方を増加させるのに利用することができる。

本明細書で開示されている方法によって生成されたトリリガンドＡｋｔ捕捉剤は、中〜低ナノモルの結合親和性、優れた特異性および低μＭレベルのＡｋｔに対する阻害能を示すことが見出された。捕捉剤はまた、標的タンパク質のプレ阻害をアンカーリガンドの選択過程に組み込んだ結果である、活性部位外でのＡｋｔへの結合と一致する阻害動態を示した。捕捉剤は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて捕捉剤および検出剤の両方として機能し、細胞溶解物からＡｋｔを効率的に免疫沈降し、固定した癌細胞株においてＡｋｔをラベリングすることがわかった。

本明細書で開示されている結果に基づいて、本出願は、３つのＡｋｔ結合部分を含むＡｋｔ捕捉剤を提供するとともに、これらの捕捉剤を使用してＡｋｔを同定、検出、定量化および分離し、Ａｋｔ発現および／または活性の増加に関連する種々の病態の診断、分類および治療する方法を提供する。本出願はまた、高い親和性および特異性を有するキナーゼのような標的タンパク質の活性部位外で結合する捕捉剤を生成するための新規のｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリー方法を提供するとともに、新規のＱＰＣＲ手法を用いてマルチリガンド合成の効率を評価する方法を提供する。

Ａｋｔ捕捉剤：
本明細書において、ある実施形態では、３つの標的結合部分を含むトリリガンドＡｋｔ捕捉剤を提供する。第１の標的結合部分をアンカーリガンドと呼び、第２の標的結合部分を二次リガンドと呼び、第３の標的結合部分を三次リガンドと呼ぶ。本明細書で提供されるトリリガンドＡｋｔ捕捉剤は、ＡＴＰの非ＡＴＰ結合部位とのアロステリック相互作用を介してＡｋｔ活性を阻害する。

ある実施形態では、標的結合部分は、１つ以上のポリペプチドまたはペプチドを含む。これらのある実施形態では、標的結合部分は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、および／または、置換および非置換のアルキル、置換および非置換のアジド、置換および非置換のアルキニル、置換および非置換のビオチニル、置換および非置換のアジド基、アルキル基、置換および非置換のポリエチレングリコリル、ならびに置換および非置換の１，２，３−トリアゾールのみからなる群から選択される官能基で置換されたアミノ酸を含む１つ以上のペプチドを含む。

ある実施形態では、アンカーリガンドおよび二次リガンドは、共有結合のリンケージを介して互いにリンクして捕捉剤バイリガンドを形成する。これらのある実施形態では、下記に示すように、アンカーリガンドおよび二次リガンドは、アミド結合または１，４−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを介して互いにリンクしている：

１，４−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージ。

アンカーおよび二次リガンドが、１，４−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを介して互いにリンクしているこれらの実施形態では、１，４−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージをＣｕ触媒アジド／アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）によって形成してもよい。

ある実施形態では、アンカーおよび二次リガンドは、下記の構造を有するＴｚ４リンケージによって互いにリンクしている：

ある実施形態では、捕捉剤は、アンカーリガンドとトリアゾールとの間に８個の炭素リンカーを含む。同様に、ある実施形態では、捕捉剤は、三次リガンドとトリアゾールとの間に８個の炭素リンカーを含む。

ある実施形態では、三次リガンドは共有結合のリンケージにより、好ましくはバイリガンド中の二次リガンドを介して捕捉剤バイリガンドにリンクしている。これらのある実施形態では、三次リガンドおよびバイリガンドは、Ｔｚ４リンケージによって互いにリンクしている。

アンカー、二次および三次リガンドの１つ以上がアミド結合を介して互いにリンクしているこれらの実施形態では、アミド結合は、カルボン酸基とアミン基とをカップリング剤（例えば、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＤＭＦ中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ））の存在下にカップリングすることにより形成されてもよい。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤はアンカーリガンドＡｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２を含む。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は二次リガンドＰｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２を含む。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は三次リガンドＡｃ−Ｃ８−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２を含む。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は図１５に記載の構造を有する。

ある実施形態では、本明細書で提供されるＡｋｔ捕捉剤はタンパク質の活性部位外でＡｋｔに、例えば、非ＡＴＰおよび非ペプチド基質結合部位に結合する。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、一連の反応条件および／または貯蔵時間にわたって安定である。本明細書で用いられる「安定な」捕捉剤とは、標的タンパク質に特異的に結合する能力を維持する。ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、１つ以上の反応および／または貯蔵条件の下で、同じ標的タンパク質に結合する抗体より安定である。例えば、ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、同じ標的タンパク質に結合する抗体より、タンパク質分解に対して抵抗性である。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、貯蔵寿命が６ヵ月を超え、これは捕捉剤が６ヵ月を超える貯蔵において安定であることを意味する。これらのある実施形態では、捕捉剤の貯蔵寿命が１年以上、２年以上、または３年超である。これらのある実施形態では、捕捉剤は、凍結乾燥粉末として貯蔵される。ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、同じ標的タンパク質に結合する抗体より長い貯蔵寿命を有する。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、約−８０°〜約１２０℃の範囲の温度で安定である。これらのある実施形態では、捕捉剤は、−８０°〜−４０℃、−４０°〜−２０℃、−２０°〜０℃、０°〜２０℃、２０°〜４０℃、４０°〜６０℃、６０°〜８０℃および／または８０°〜１２０℃の温度範囲内で安定である。ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、同じ標的タンパク質に結合する抗体より広い範囲の温度にわたって安定であり、かつ／あるいは同じ標的タンパク質に結合する抗体より、特定の温度でより長い期間安定し続ける。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、約３．０〜約８．０のｐＨの範囲で安定である。ある実施形態では、ｐＨの範囲は約４．０〜約７．０である。ある実施形態では、ｐＨの範囲は約７．０〜約８．０である。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、ヒト血清中で１２時間より長い時間安定である。これらのある実施形態では、捕捉剤は、ヒト血清中で１８時間より長い時間、２４時間より長い時間、３６時間より長い時間、または４８時間より長い時間安定である。ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、同じ標的タンパク質に結合する抗体より、ヒト血清中で長い期間安定である。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、１つ以上の検出ラベルを含んでもよく、検出ラベルには例えば、ビオチン、銅−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（銅−ＤＯＴＡ）、^６４Ｃｕ ＤＯＴＡ、^６８Ｇａ ＤＯＴＡ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、^１２４Ｉ、^８６Ｙ、^９４ｍＴｃ、^１１０ｍＩｎ、^１１Ｃ、^７６Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^６７Ｇａ、^１１１Ｉｎおよび^９９ｍＴｃ、またはガンマ放射体、陽子放射核、陽電子放射体、トリチウムを含み得る他の放射線ラベル製品、または他の方法により検出可能な遮蔽タグ（すなわち、ガドリニウム）などが含まれる。ある実施形態では、捕捉剤は、造影剤として使用されるように改変されてもよい。造影剤は診断剤として用いてもよい。

ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤は、所望の化学的または生物学的活性を得るように改変されてもよい。所望の化学的または生物学的活性の例として、それらに限らないが、改良された溶解性、安定性、バイオアベイラビリティ、検出能、または反応性が含まれる。捕捉剤に導入されてもよい具体的な改変の例として、それらに限らないが、ジスルフィド結合の形成による捕捉剤の環化；他の官能基または分子による捕捉剤の修飾が挙げられる。同様に、捕捉剤は、タンパク質上の非標準または非生物学的エピトープに結合し、それによってそれらの多様性を増加させるように合成されてもよい。ある実施形態では、捕捉剤は、カップリング反応の前に標的結合部分の合成ブロックを修飾することによって改変されてもよい。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、本明細書で提供される捕捉剤の１つ以上を含む製剤である。ある実施形態では、これらの製剤は、１つ以上の医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む。これらの担体、賦形剤または希釈剤は、製剤の意図する使用および／または投与経路に基づいて選択してよい。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、本明細書で開示されている捕捉剤の１つ以上を含むキットである。ある実施形態では、これらのキットは、Ａｋｔを同定、検出、定量化および／または分離するために使用されてもよく、これらのある実施形態では、キットは、Ａｋｔ発現および／または活性の増加に関連する癌の診断および／またはステージ分類において使用されてもよい。ある実施形態では、本明細書で提供されるキットは：（ａ）吸着剤をその上に含む基質であって、吸着剤はＡｋｔへの結合に適している基質および（ｂ）洗浄液または洗浄液を作るための使用説明書であって、吸着剤および洗浄液の組合せがＡｋｔの検出を許す洗浄液または洗浄液を作るための使用説明書を含む。他の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、Ａｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態の治療において使用されてもよい。

ある実施形態では、本明細書で提供されるキットは、ラベルまたは別個のインサートの形態で、適合する操作パラメーターのための使用説明書をさらに含んでもよい。例えば、キットは、血清の試料または他の組織試料がプローブ上で接触された後にプローブを洗浄する方法を消費者／キットユーザーに示す標準使用説明書を有してもよい。

ある実施形態では、本明細書で提供されるキットは、（ａ）Ａｋｔに特異的に結合する１つ以上のＡｋｔ捕捉剤および（ｂ）検出試薬を含む。このようなキットは、本明細書で記述されている材料から調製することができる。

本明細書で提供されるキットは選択的に、標準もしくは対照情報および／または材料の対照量を含んでもよく、それによって、試料中に検出されたＡｋｔの試験量が特定の病態の診断と一致する量であるかどうかを決定するために、試験用試料を対照情報標準および／または対照量と比較することができる。

Ａｋｔ捕捉剤を使用する方法：
本明細書で提供されるのは、ある実施形態では本明細書で開示されているＡｋｔ捕捉剤を使用して生体試料中のＡｋｔを同定、検出、定量化および／または分離する方法である。ある実施形態では、これらの方法は、捕捉剤が抗体またはその同等物の置き換えであるイムノアッセイを利用する。ある実施形態では、イムノアッセイはウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロットまたはＥＬＩＳＡであってよい。

本明細書で提供される方法で用いられる生体試料は、臓器、組織、体液および細胞のみからなる群から選択されてよい。ここで、生体試料は体液であり、液体は、血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、便、髄液、脳脊髄液、リンパ液、皮膚からの分泌液、気道分泌液、腸の分泌液、尿生殖路の分泌液、涙および乳汁のみからなる群から選択されてよい。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、本明細書で開示されているＡｋｔ捕捉剤を使用して、例えば種々の癌を含むＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を診断および／または分類（例えば、ステージ分類）する方法である。これらのある実施形態では、方法は、（ａ）対象者から生体試料を取得すること、（ｂ）Ａｋｔ捕捉剤で試料中のＡｋｔの存在または非存在を測定すること、（ｃ）Ａｋｔに対する所定の対照範囲とＡｋｔのレベルを比較すること、および（ｄ）Ａｋｔ発現の増加に関連する病態を、生体試料および所定の対照におけるＡｋｔレベル間の差に基づいて診断することを含む。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、本明細書で開示されている捕捉剤または製剤の１つ以上の治療有効量を投与することにより、必要な対象者におけるＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を治療する方法である。これらのある実施形態では、（複数の）捕捉剤は、例えば化学療法薬を含む１つ以上の追加の治療薬にリンクしていてもよい。好ましい実施形態では、捕捉剤は医薬組成物として投与される。

捕捉剤または製剤は、治療を必要とする患者に任意の適する経路を介して投与されてもよい。投与経路としては、例えば、非経口投与（例えば点滴用パッチによる皮下、筋肉内、静脈内を含む）を含んでもよい。さらに適する投与経路として、（但しそれらに限定されない）経口、直腸、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、点滴、膣、皮内、腹腔内、頭蓋内、くも膜下および硬膜外投与、あるいは例えばネブライザーもしくは吸入器による、またはインプラントによる経口または経鼻吸入を介する投与が挙げられる。

捕捉剤または製剤は、血液を含む特定の組織に留置されたミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子デリバリーシステムまたは除放製剤を介して投与されてもよい。除放性の担体の適する例として、一般品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、坐剤またはマイクロカプセルが挙げられる。上述した技術およびプロトコール、ならびに本発明に従って用いてもよい他の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃ．１５、２０００）ＩＳＢＮ ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ ０−６８３３０５−７２−７に見出すことができ、それらの全ての開示は参照により本明細書に組み入れられている。

明細書で提供されるのは、ある実施形態では、Ａｋｔの発現および／または活性の増加に関連する病態を治療するための薬剤の調製における、本明細書で開示されている捕捉剤の使用である。

捕捉剤を製造／スクリーニングする方法：
本明細書で提供されるのは、ある実施形態では、標的結合部位をスクリーニングする方法および／またはこれらの標的結合部位を含む捕捉剤を製造する方法である。これらのある実施形態では、結果として得られた捕捉剤はキナーゼ捕捉剤であり、これらのある実施形態では、キナーゼ捕捉剤はＡｋｔ捕捉剤である。

本明細書で開示されている捕捉剤の生成方法は、短鎖状アンカーペプチドの同定から始まり、次いで標的タンパク質により促進される過程を介して追加の共有結合カップリングしたペプチド分岐を付加することが続く。最終的に得られるマルチリガンド捕捉剤の特異性および阻害能は、周辺のペプチド分岐により増加する。生成方法は、標的タンパク質のプレ阻害された形態をスクリーニング工程の少なくとも１つに利用し、その結果アロステリック部位阻害薬として機能する捕捉剤が生成される。

ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、以下の工程を含む：
（ａ）アンカーリガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）標的タンパク質を１つ以上の標的タンパク質阻害薬に接触させる工程；
（ｉｉ）標的タンパク質に対するアンカーリガンドを選択するために第１の複数の候補ペプチドを調製する工程；
（ｉｉｉ）標的タンパク質を第１の複数の候補ペプチドに接触させる工程；
（ｉｖ）標的タンパク質に対する親和性を有する候補ペプチドをアンカーリガンドとして選択する工程であって、候補ペプチドは標的タンパク質に活性部位外で結合する工程；および
（ｖ）アンカーリガンドの配列を決定する工程；
（ｂ）二次リガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）アンカーリガンドおよびアジド基またはアルキニル基を含むアンカーリガンド選択ブロックを調製する工程；
（ｉｉ）標的タンパク質に対する二次リガンドを選択するために第２の複数の候補ペプチドを調製する工程であって、アンカーリガンド選択ブロックがアルキニル基およびアジド基をそれぞれ含む場合、第２の複数のペプチドは、アジド基またはアルキニル基を含む工程；
（ｉｉｉ）アンカーリガンド選択ブロックおよび第２の複数のペプチドを標的タンパク質に接触させる工程；
（ｉｖ）アンカーリガンド選択ブロックと二次リガンドとの間に２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを形成することにより捕捉剤バイリガンドを提供する工程であって、標的タンパク質と結合することでアンカーリガンド選択ブロックのアジド基およびアルキニル基ならびに二次リガンドは標的タンパク質に結合することによって近接するようになる工程；
（ｖ）標的タンパク質と親和性のある捕捉剤バイリガンドを選択する工程；および
（ｖｉ）二次リガンドの配列を決定する工程；
（ｃ）三次リガンドおよび選択的に追加のリガンドを以下の工程により同定する工程：
（ｉ）アジド基またはアルキニル基を含むバイリガンド選択ブロックを調製する工程；および
（ｉｉ）標的タンパク質に対する所望の親和性を有する捕捉剤が得られるまで工程（ｂ）（ｉｉ）から（ｂ）（ｖｉ）までを第３、第４などの複数の候補ペプチドを用いて反復する工程を含む。

ある実施形態では、１つ以上の上記の工程を省略してもよい。例えば、ある実施形態では、既知のアンカーリガンドが用いられる。これらの実施形態では、工程（ａ）は省略され、既知のアンカーリガンドは、工程（ｂ）において二次リガンドを同定するために用いられる。これらの実施形態では、標的タンパク質はＡｋｔであり、アンカーリガンドはＡｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２であってもよい。ある実施形態では、このアンカーリガンドを工程（ｂ）に先立ち、Ｃ末端ビオチンで修飾してもよい。

ある実施形態では、工程（ｂ）（ｉｉ）から（ｂ）（ｖｉ）を１回繰り返し、それによって捕捉剤トリリガンドが生成される。

ある実施形態では、第１、第２および追加の複数の候補ペプチドは「１ビーズ１化合物」（ＯＢＯＣ）ペプチドライブラリ含み、ここでペプチドは５〜７個のＤ−アミノ酸残基を含み、Ｎ末端でＤ−プロパルギルグリシンとカップリングしている。ある実施形態では、複数の候補ペプチドは異なってもよい。他の実施形態では、複数のペプチドの１つ以上が同じペプチドプールを含有してもよい。

上記で概略を説明したプロトコールでは、アンカーリガンド選択工程において１つ以上の標的タンパク質阻害薬を利用する。ある実施形態では、標的タンパク質阻害薬はＡＴＰ競合的小分子である。ここでは、標的タンパク質はキナーゼであり、標的タンパク質阻害薬は小分子のキナーゼ阻害剤であってよい。標的タンパク質はＡｋｔであるこれらの実施形態では、標的タンパク質阻害薬はＡｃ７であってよい。標的タンパク質を１つ以上の標的タンパク質阻害薬に接触させることで、標的タンパク質上の触媒残基がブロックされる。このことにより、活性部位の形成が妨げられ、したがってペプチド結合において熱力学的に最低エネルギー状態として除去され、候補ペプチドが不活性状態の新規の阻害部位にアクセスすることが可能になる。アンカーリガンドは標的に対して低い親和性を有することができるが、アンカーリガンドが標的に結合する仕方の性質が、残りのマルチリガンドの開発過程に最も影響する要因である可能性が高い。以下の実験結果に記載するように、プレ阻害は、新規のＡｋｔ捕捉剤の開発に利用され、結果として得られた捕捉剤が活性化に対してキナーゼを安定化させることが見出された。キナーゼ全般にわたるＡＴＰ結合ポケットの構造保存およびそれ故にしばしば観察されるこのような部位を標的とする阻害薬の低い特異性を考慮すると、本明細書で提供されるオフサイト阻害薬を開発するための手法はいくつかの独特の利点を提供する。

ある実施形態では、本明細書で提供される方法は既知のアンカーリガンドを利用する。これらのある実施形態では、アンカーリガンドはＡｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２である。

ある実施形態では、スクリーニング過程に用いられるアンカーリガンドをビオチンで修飾されてもよい。例えば、スクリーニング過程に用いられるアンカーリガンドはＡｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ビオチンであってよく、ここで「ビオチン」はＣ末端ラベルである。これらの実施形態では、スクリーニング／調製過程は以下の工程を含む：
ａ）ＡｋｔをＡｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ビオチン（「アジド修飾されたＡｋｔ捕捉剤アンカーリガンド選択ブロック（Ｉ）」）に接触させてＡｋｔ−アンカー複合体を提供する工程；
ｂ）Ａｋｔ−アンカー複合体を第１の複数の候補ペプチドに接触させて二次リガンド、Ｎ末端でＬ−プロパルギルグリシンとカップリングしたペプチドを選択する工程；
ｃ）アンカーリガンド選択ブロックおよび二次リガンド間に２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを形成することによってＡｋｔ捕捉剤バイリガンドを提供する工程であって、アンカーリガンド選択ブロックのアジド基およびアルキニル基ならびに二次リガンドは標的タンパク質に結合することによって近接するようになって、Ａｋｔ捕捉剤バイリガンドで修飾されたビーズを提供する工程；
ｄ）Ａｋｔ捕捉剤バイリガンドで修飾されたビーズを選択する工程；
ｅ）Ａｋｔ捕捉剤バイリガンドをＡｋｔ捕捉剤バイリガンドで修飾されたビーズから除去する工程；
ｆ）Ａｋｔ捕捉剤バイリガンドのＡｋｔ捕捉剤二次リガンドの配列を決定する工程；
ｇ）Ｃ末端ビオチンおよび５−ヘキシン酸キャップ（「アジド修飾された捕捉剤バイリガンド選択ブロック（Ｉ）」）を有するＡｋｔ捕捉剤バイリガンドを調製する工程；および
ｈ）所望の特性を有するＡｋｔ捕捉剤が同定されるまで上記工程を繰り返す工程。

ある実施形態では、本明細書で提供されるように捕捉剤を合成するための方法が提供される。ある実施形態では、これらの方法は：
ａ）標的結合部分および他の合成ブロックと所望のリンケージを形成することのできる少なくとも１つの活性基を含む、標的結合部分の合成ブロックを調製することであって：
ｉ）リンケージは、アミドリンケージ、１，４−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージおよび１，５−２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージのみからなる群から選択され；
ｉｉ）標的結合部分の他の全ての官能基は、好ましくない反応を避けるために保護されていること；および
ｂ）標的結合部分の合成ブロックをカップリングして捕捉剤を提供することを含む。

ｉｎ ｓｉｔｕクリック効率を評価する方法：
ＱＰＣＲは、標的ＤＮＡ分子を同時に増幅し定量化するのに用いられるＰＣＲに基づいた技術である。ＱＰＣＲによりＤＮＡ試料中の１つ以上の特異的配列を検出および定量化することが可能となる。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ反応の各サイクルにおいてリアルタイムで測定される。二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素を用いて、またはプローブがその相補的ＤＮＡ標的とハイブリダイズした後のみで検出できる蛍光リポーターでラベリングされたオリゴヌクレオチドで構成される配列特異的ＤＮＡプローブを用いて生成物を検出することができる。ＤＮＡが増幅の対数線形フェーズにある場合、蛍光量はバックグラウンドより増大する。蛍光が測定可能になる点はサイクル閾値（Ｃ_ｔ）である。増幅されたＤＮＡの量は、コピーの絶対数あるいはＤＮＡインプットまたは追加の正規化遺伝子に正規化したときの相対量であることができる。

以下の実施例に記載されているように、新規のＱＰＣＲアッセイを、アンカーリガンドとＡｋｔ捕捉剤の二次リガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率および選択性を評価するために用いた。これらの結果に基づき、本明細書において、ｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率および選択性を評価するための方法が提供される。ｉｎ ｓｉｔｕスクリーン（真のヒット／偽陽性）の信号対雑音比は、標的仲介反応およびバックグラウンド反応の相対的比率に依存していることから、スクリーニング条件のＱＰＣＲ誘導による最適化によって、連続ｉｎ ｓｉｔｕクリック手法の強固性が有意に増強し得る。

本明細書で提供されるのは、ある実施形態ではＱＰＣＲアッセイを用いて第１および第２のリガンドのｉｎ ｓｉｔｕクリック効率および／または選択性を評価する方法である。ある実施形態では、第１のリガンドはアンカーリガンドであり、第２のリガンドは二次リガンドである。他の実施形態では、第１のリガンドはバイリガンドであり、第２のリガンドは三次リガンドであり。第１のリガンドは可溶性ビオチン化リガンドであり、第２のリガンドはオンビーズリガンドである。ｉｎ ｓｉｔｕクリック反応を実施すると、結果として第１リガンドと第２のリガンドとの間にリガンド複合体が形成される。非複合体第１のリガンドを除去し、リガンド複合体をストレプトアビジン（ＳＡ）−オリゴヌクレオチドＱＰＣＲテンプレートに接触させる。このテンプレートは、複合体中のビオチン化された第１のリガンドに結合し、その結果、リガンド複合体を含有するビーズが選択される。選択されたビーズはＱＰＣＲおよびサイクル閾値の決定に供される。ある実施形態では、各反応条件に関して、ビーズ上に存在するリガンド複合体の量を計算するために標準曲線を作成する。ある実施形態では、これらの方法をクリック反応条件の変形を評価するために用いてよい。

特異的エピトープをターゲティングするための方法

タンパク質のような大きい生体分子は、分子の異なる部分にわたってかなり多種多様である化学的特性の多様なランドスケープにより特徴づけすることができる。生体分子表面の特異的領域はエピトープと呼ばれる。このことは、タンパク質上の１つのエピトープに特異的に結合するが、そのタンパク質上の他のエピトープまたは他のタンパク質に結合しない分子を開発することが望ましい場合が多い。生物学的産生物であるモノクローナル抗体は、特異的タンパク質上の特異的エピトープに結合するように開発されている。しかし、化学的合成手法を用いてタンパク質上の特定のエピトープを標的とする良い方法は、エピトープがやはり非常に特別な評価基準に適合しない限り−すなわちエピトープが小分子結合ポケットを含有することで残りのタンパク質に比べて小分子バインダーを十分に惹きつける独自のエネルギーを提供しない限り、存在しない。大部分のタンパク質エピトープは、これらの特別な評価基準に適合しない。本発明は、一般的分類のタンパク質エピトープに対して高度に特異的な分子バインダーの開発を誘導することができる手法について説明する。

大きいタンパク質生体分子の特異的部分（エピトープ）に結合する分子を合成するための手法について説明し、それを実証する。本発明は、最初に特異的タンパク質のペプチドまたはポリペプチド断片を調製することを含む。このポリペプチドは、天然アミノ酸の１つを人工アミノ酸で置換すること、または合成後にポリペプチド断片を化学的に変更した特異アミノ酸によって修飾することのいずれかにより、目的とするエピトープの領域の近傍で部位特異的に修飾され得る。両方の場合において、修飾によって、部位特異的修飾の近傍にアセチレンまたはアジド化学基のいずれかが提示される。断片を含有するそのアジド（アセチレン）を次に、非常に大きな分子ライブラリとインキュベートする。このライブラリは、通常は化学的に多様性を示すのに対し、各要素がアセチレン（または、代わりに各要素がアジドを含有する）基を含有するという事実により特徴づけされる。インキュベーションは、修飾されたポリペプチド断片が、選択されたライブラリ要素とポリペプチド断片との間の共有結合カップリングを促進するための触媒足場を提供できる条件下で実施することができる。この実施形態では、それは、アセチレンおよびアジド基の反応生成物であるトリアゾールリンケージの形成を触媒することによりこのカップリングを促進する。いくつかの実施形態によると、この触媒過程の選択性は非常に高い。このことは、分子ライブラリ中の要素の極小画分のみがカップリングすることを意味する。これらの要素は、分析技術によって同定され、その後ポリペプチド断片への結合またはポリペプチド断片を抽出した全タンパク質生体分子への結合について試験される。この手法は、タンパク質標的の意図するエピトープに選択的に結合する分子を同定する経路を提供する。次いで、当技術分野で知られている手法を、同定されたバインダーの選択性および親和性を増加するために、エピトープ選択的結合特性を犠牲にすることなく利用してもよい。

図３２は、エピトープターゲティング過程の１つの実施形態を示す。タンパク質標的（１）を選択する。タンパク質標的（１）は特異的エピトープ（２）を有し、特異的エピトープ（２）は、その場所に結合する捕捉剤分子を開発するための目的となる。このエピトープは、全タンパク質（１）の特定のペプチドまたはポリペプチド断片（３）に関連する特異的アミノ酸残基（２）であってよく、あるいはいくつかのアミノ酸を含有するタンパク質（１）のさらに大きな領域であってもよい。エピトープは、アミノ酸の既知の配列により特徴づけされるタンパク質の領域内に位置する（３）。エピトープの近傍（または内部）のアミノ酸（４）が、人工アミノ酸による置換、あるいはアジド基またはアセチレン基をその部位に導入する他の特異的化学修飾に関して同定される。標的としたエピトープを含有するタンパク質のポリペプチド断片（５）を合成するが、２種の修飾で合成する。第１に、（４）を置換または化学修飾してアジド基またはアセチレン基を得る。第２に、ポリペプチド上の部位を、スクリーニング工程中に用いるためにラベル（例えば、蛍光団またはビオチン基）で修飾（７）する。このラベルを導入する多数の方法が存在する。

図３３は、標的とするエピトープに結合する分子に関するスクリーニングの１つの実施形態を示す。図３３の一部に、エピトープ（２）を含有するポリペプチド断片（５）、置換または変更されたアミノ酸（６）、およびラベル（７）を示し、これらは大きなライブラリ（１１）とインキュベートされる。この場合には、ライブラリがアジド基を提示することを示しており、このことは、ポリペプチド断片が（６）でアセチレン基を提示する可能性のあることを示唆している。この場合には、アジド基は分子のｎ末端にあるが、これは要件ではない。この場合には、分子ライブラリはビーズベースライブラリとして示されているが、これも要件ではない。図３３の一部は、インキュベーション工程中、ポリペプチド断片が、アジド基およびアセチレン基の共有結合カップリングを促進して、トリアゾールリンケージ（１２）を形成するための触媒足場を提供し、そのためポリペプチド断片が分子ライブラリの非常に特異的な要素に今や共有結合していることを示す。この時点で、分子ライブラリにおいて、標準洗浄工程を介して３つの遊離ポリペプチド全てをクリアにする。図３３の一部は、ポリペプチド断片に共有結合でカップリングしている分子ライブラリの要素をカップリングしていない分子ライブラリ要素から識別するシグナル（１３）を発生させるのに、ポリペプチド断片上のラベルを利用できることを示す。図３３の一部は、ペプチドに共有結合でカップリングしている分子ライブラリ要素（１４）をカップリングしていないライブラリ成分（１５）から分離し、ライブラリ要素（１４）を分析して、どの分子が潜在的バインダーであるかを同定できることを示す。

図３２および３３に示した工程の結果は、潜在的に目的とするエピトープに対する選択的バインダーである少数の分子の同定を示している。それらは、本明細書で「ヒット」と呼ぶ。これらのヒット、またはこれらのヒットの典型的なセットは、次いで免疫沈降アッセイなどの標準バイオロジカルアッセイで、目的とするタンパク質標的への結合について試験することができる。バインダーが同定されない場合には、いくつかの選択肢があり、選択肢は別個にまたは組み合わせて試験できる。これらの選択肢として、以下のものが挙げられる。図３３で説明した過程を、インキュベーション工程中に存在する、より高濃度の修飾されたポリペプチド断片（５）とともに繰り返してもよい。図３３に説明した過程を、より大きな（化学的により多様性である）分子ライブラリ（１１）を用いて繰り返してよい。ポリペプチド断片（５）は、スクリーンの調製において異なる方法で修飾されてもよく（図２）、その後図３３の工程を繰り返してもよい。

広範囲の化学的空間をわたるようにデザインされた１００万個の分子の分子ライブラリを、修飾されたポリペプチド断片（５）の約５０〜１００ｎＭ濃度の溶液と、非選択的結合を防ぐ標準のブロッキング条件下にてインキュベートした場合、そのスクリーンは約２０〜１００個のヒットした分子をもたらす。これらのヒットした分子のうち少数（１〜１０）が、目的とするエピトープに特異的に結合する分子となる。次いで、上記に参照した２つの発明で説明した手法を、これらのエピトープ特異的バインダーの親和性および特異性を増加させるために利用することができる。

以下に示す実施例は、特許請求されている発明をよりよく説明するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。具体的な材料を示す程度まで、説明のみを目的としたものであり本発明を限定するものではない。当業者であれば、均等な手段または反応物を発明能力なしにかつ本発明の範囲から逸脱することなしに開発し得る。

［実施例１］
Ａｋｔ捕捉剤の同定および調製：
Ａｋｔ捕捉剤の開発において、３つの異なる型のスクリーンを利用した：標的スクリーン、阻害標的スクリーンおよび生成物スクリーン。標的スクリーンにおいて、ヒットしたビーズを、標的タンパク質が結合しているビーズを選択することにより同定する。阻害標的スクリーンは、ヒットしたビーズを標的タンパク質が結合しているビーズを選択することにより同定する点で、標的スクリーンと類似している。しかし、阻害標的スクリーンは小分子阻害薬の存在下に実施される。生成物スクリーンにおいて、ヒットしたビーズをオンビーズ生成物の存在により同定した。３つのスクリーン全てが、ＯＢＯＣペプチドライブラリを利用した。

ペプチドライブラリの構築：標準ＳＰＰＳプロトコールを用いて、手動またはＴｉｔａｎ３５７自動ペプチド合成装置（Ａａｐｐｔｅｃ）で、無作為化されたペプチドを合成した。ライブラリをＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ（ＮＨ_２）（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）で合成した。ビオチン化ペプチドをＢｉｏｔｉｎ ＮｏｖａＴａｇ ｒｅｓｉｎ（ＥＭＤ）で合成した。側鎖保護ペプチドをＳｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（Ａｎａｓｐｅｃ）で合成した一方、Ｃ末端アミドペプチドをＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ａｎａｓｐｅｃ）で合成した。天然Ｆｍｏｃ−Ｌアミノ酸をＡａｐｐｔｅｃから購入し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンは（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）から購入した。

樹脂をＮＭＰで膨潤させ、２０％ピペリジンにて脱保護した。４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸（天然Ｌ−アミノ酸およびＬ−プロパルギルグリシン）、３．９当量のＨＡＴＵおよび１２当量のＤＩＥＡを加えた（樹脂の負荷容量に対する当量）。カップリングは３０〜４５分間、進行した。アジドアミノ酸を樹脂の負荷容量に対して２当量で加えた。Ｎ末端を、２０当量の無水酢酸および１０当量のＤＩＥＡでアセチル化した。アジドアミノ酸を用いて２つのジアステレオマーの混合液が生成された場合、特に記載がない限り、ジアステレオマーを単一の生成物として精製した。

アジドアミノ酸：アジドアミノ酸Ａｚ１、Ａｚ２、Ａｚ４およびＡｚ８の構造を図１に示す。

Ａｚ４およびＡｚ８を、上述したように合成した（Ａｇｎｅｗ ２００９）。Ａｚ１およびＡｚ２のための一般的な合成戦略を図２に要約する。

Ａｚ１を、上述したように（Ｓｕｎ ２００７）修飾で合成した。具体的には、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ_２Ｏ；３．００ｍｌ、１７．８ｍｍｏｌ）を、０℃にて１５ｍＬのＨ_２Ｏおよび３０ｍＬのＤＣＭ中の激しく撹拌したＮａＮ_３混合液（５．７６ｇ、８８．６ｍｍｏｌ）に滴下した。結果として得られた混合液を周囲温度まで温めさせ、２時間、撹拌した。水層をＤＣＭ（２×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。８０％の酢酸水溶液（２６．６ｍＬ）中に溶解したＦｍｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨ（ｎ＝１、２．８９ｇ、８．８６ｍｍｏｌ）および３ｍＬ Ｈ_２Ｏ中のＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．０４４ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液のｐＨを飽和Ｋ_２ＣＯ_３溶液で９〜１０に調整した。ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＴｆＮ_３（６ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ（４５ｍＬ）およびメタノール（９５ｍＬ）混合液に加え、ｐＨを、飽和Ｋ_２ＣＯ_３溶液を滴下して９〜１０に再調整した。二相系を２０時間、激しく撹拌した。ＤＣＭを加えて層を二相に分離し、有機層を水（２×４０ｍＬ）にて洗浄し、その後合わせた水相を３Ｍ ＨＣｌにて酸性化してｐＨ２とした。水相をＤＣＭ（４×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａ_２ＳＯ_４にて乾燥し、濾過後、真空にて濃縮して、白色固体としてＦｍｏｃ−Ａｚ１を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ３．６０−３．６３（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．２７（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．３５（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．４２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ），１２．６４（ｓ，１Ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ４６．８，５１．０，５４．０，６６．３，１２０．５，１２５．７，１２７．２，１２８．５，１４０．８，１４４．６，１５６．４，１７１．８．

Ａｚ２をＦｍｏｃ−Ｄａｂ−ＯＨ（ｎ＝２）を出発材料として用いた以外はＡｚ１と同様に合成した。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ １．８０−１．８８（ｍ，１Ｈ），１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ），３．３１−３．３８（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．４７（ｍ，１Ｈ），４．００−４．０６（ｍ，１Ｈ），４．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８ Ｈｚ），４．２８−４．３２（ｍ，３Ｈ），７．３２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ）．１２．６５（ｓ，１Ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ３１．１，４７．１，４８．０，５１．６，６６．６，１２０．６，１２５．７，１２７．５，１２８．１，１４１．２，１４４．２，１５６．６，１７３．８．

Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ標的タンパク質の発現および精製：Ａｋｔ捕捉剤の開発に関するスクリーニング標的はＡｋｔ１−Ｓ４７３ＥおよびＡｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐであった。Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅは、重要なＳ４７３残基でリン酸化を擬似するＳ４７３Ｅ突然変異を有する部分的に活性なＡｋｔ１キナーゼドメインである（Ｋｌｅｉｎ ２００５）。Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐは、Ｔ３０８残基で完全にリン酸化された完全に活性なキナーゼである。これらのスクリーニング標的は、陰イオン交換クロマトグラフィーにて直ちに分離される。両方ともに活性を示した。

ｐＥＴ２８ａ−ＰＫＢ発現プラスミドのＮ末端Ｈｉｓ６タグからＣ末端ＦＬＡＧタグまでをコード化する配列（Ｈｉｓ−ΔＰＨ−ＰＫＢ−ＥＥＥ−ＦＬＡＧ、Ｋｌｅｉｎ ２００５）をＰＣＲにて増幅した。ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１部位を増幅された断片の５’および３’末端に、増幅プライマーＡｋｔｐＶＬ−ＦＰ（フォワード、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴ−３’）およびＡｋｔｐＶＬ−ＲＰ（リバース、５’−ＴＧＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣ−３’）を用いて組み込んだ。増幅された断片をＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１でダイジェストし、アガロースゲル電気泳動にて精製し、先にＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１でダイジェストされ脱リン酸化されたｐＶｌ１３９３昆虫細胞発現ベクターに加えた。形質転換およびコロニースクリーニングの後、成功したライゲーション生成物を単離し、標準ｐｈＦおよびｍＲシークエンシングプライマーを用いて配列を決定した。発現を増強するために、ＢａｍＨ１部位を楕円形とし、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（フォワードプライマー ５’−ＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴ−３’、リバースプライマー ５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＧＴ−３’）を用いてコザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）で置き換えた。最終のコンストラクトｐＶＬＡＫＴ．２を、上述したプロトコール（Ｋｕｍａｎ ２００１；Ｇａｏ ２００５）に準じてウイルス発現ベクターおよびＨｉ５昆虫細胞において発現を構築するために、カリフォルニア工科大学タンパク質発現センターに供与した。

細胞ペレットは、ＭＰＥＲ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で４℃にて１５分間、溶解し、１４，０００×ｇで２回遠心分離して細胞残渣を除去した。結果として得られた溶解物を１ｍＬのＨｉｓ Ｔｒａｐ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに通し、２００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液１０ｍＬで溶出した。最高濃度のタンパク質を含有する画分を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心式フィルターデバイス（１００００ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩した。結果として得られた溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーにて、上述したように精製した（Ｋｌｅｉｎ ２００５）。

主要生成物がＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅであることを、（２Ｈ１０）抗Ａｋｔ１抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって確認した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。期待する生成物に相当する（予測ＭＷ＝４５８６０）単一バンドが４５ｋＤａに観察された。ＥＳＩ−ＭＳによって分析すると、未修飾のＡｋｔ（Ｓ４７３Ｅ）（予測［Ｍ＋Ｈ］^＋ _{Ｍｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ}＝４５８３２．０）および脱リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３Ｅ）（予測［Ｍ＋Ｈ］^＋ _{Ｍｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ}＝４５９９２．０）にそれぞれ相当する［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４５８３５．０（副ピーク）および［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４５９９２．０（主要ピーク）でピークが示された。ＡｋｔＳ４７３Ｅの全収率は約２０ｍｇ／ｍＬであった。

陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた副生成物を、（Ｌ３２Ａ４）リン酸化−Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにて分析したところ、Ｔｈｒ３０８でリン酸化（Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ）されていることが見出された。

Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐの活性は、ビオチン化クロスチドペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ）への^３２Ｐの組み込みを測定する［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰキナーゼ活性アッセイによって特徴づけされた。簡単に説明すると、８０ｎｇのＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ、５０μＭのＢｉｏ−クロスチドおよび種々の濃度のＡＴＰ／［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（比活性＝１．５ｍＣｉ／ｍＬ）を含有する反応物。Ｋ_Ｍが１２０μＭであることが見出され、Ｖ_Ｍａｘが２×１０^５ｐｍｏｌリン酸塩／ｍｉｎ／ｍｇであることが見出され、この酵素について先に決定された値と十分に一致していた（Ｋｌｅｉｎ ２００５）。

アンカーリガンド選択：Ａｋｔに対する最初のアンカーリガンドを、２部式阻害標的スクリーンを用いて同定した。アンカーリガンド選択過程を図７に要約する。

ＯＢＯＣライブラリは手動にて合成され、ＮＨ_２−ＡｚＸ−ＸＸＸＸＸ−ＧＹＭ−ＴＧの形態であった。ここで、ＴＧはＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂であり、Ｘは１８個の天然Ｌ−アミノ酸（−Ｃｙｓ、−Ｍｅｔ）のうちの１つであり、ＡｚＸは３個のアジドアミノ酸Ａｚ２、Ａｚ４およびＡｚ８のうちの１つである。

最初のスクリーンをＮＨ_２−ＡｚＸ−ＸＸＸＸＸ−ＧＹＭ−ＴＧの形態を有するナイーブペプチドライブラリを用いて実施した。ここで、ＴＧはＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂であり、Ｘは１８個の天然Ｌ−アミノ酸（−Ｃｙｓ、−Ｍｅｔ）のうちの１つであり、ＡｚＸは３個のアジドアミノ酸Ａｚ２、Ａｚ４およびＡｚ８のうちの１つである。ペプチドライブラリを脱保護し、水にて洗浄し、Ａｋｔブロッキング緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで一晩ブロックした。ナイーブライブラリでの最初のスクリーンに関して、４０ｍｇのプレブロックされたライブラリ（約１．１４×１０^５配列）をＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐと最終濃度２１ｎＭで１ｍＬのＡｋｔブロッキング緩衝液中でインキュベートした。Ａｃ７（図３）を最終濃度５００μＭで含めた。混合液を室温にて７５分間、インキュベートし、この時点で混合液をＡｋｔブロッキング緩衝液にて洗浄し、リン酸化Ｔ３０８に対して特異的なマウスモノクローナル抗体（［Ｌ３２Ａ４］、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と室温にて６０分間、インキュベートした。ビーズを洗浄し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合したウサギ抗マウス二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）と室温にて６０分間、インキュベートした。ビーズをＡｋｔブロッキング緩衝液、Ａｋｔ Ｗａｓｈ １緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、７５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）およびＡｋｔ Ｗａｓｈ ２緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）にて洗浄した。ビーズをＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｕｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて展開した。紫色の「ヒットした」ビーズ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質の存在下における色変化にて定義された）を水にて洗浄し、７．５ＭのＧｕａｄ−Ｃｌ（ｐＨ＝２）にて剥離し、エドマン分解にて配列を決定した（図４）。

最初のヒットした配列により集中ライブラリを定義し、集中ライブラリを、５００μＭのＡｃ７および６０ｎＭのＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐの存在下に、２４ｍｇの集中ライブラリと共に上述のとおり阻害標的スクリーンに供した。混合液をＡｋｔブロッキング緩衝液中にて７５分間、インキュベートし、続いてＡｋｔブロッキング緩衝液にて十分に洗浄した。Ｌ３２Ａ４抗リン酸化Ｔ３０８抗体を加え、室温にて１時間、結合させた。洗浄後、Ａｋｔ結合緩衝液、Ａｋｔ Ｗａｓｈ １緩衝液およびＡｋｔ Ｗａｓｈ ２緩衝液にて十分に洗浄しながら、ビーズを抗ウサギＡＰ二次抗体とインキュベートし、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ存在下に展開した。暗紫色ビーズの配列を前述したとおりに決定した（図５および６）。

候補配列をスケールアップし、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ活性の阻害能について試験した。候補ペプチド配列の１つ（Ａｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２）は、結合した小分子阻害薬の非存在および存在下、Ａｋｔ１のほぼ９５％阻害を示した（図１２）。このペプチドは如何なる既知のＡｋｔ１ペプチド基質（Ｊｅｎｃｋｓ １９８１）（例えば、ＲＰＲＡＡＴＦ）とも類似せず、Ａｋｔによってｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化されていなかった（図１３）。このペプチドをＣ末端ビオチン化ペプチドとして再合成し、バイリガンドスクリーンにおいてアンカーとして用いた。

バイリガンド分岐選択：バイリガンド分岐を、二工程スクリーニング過程により同定した。バイリガンド分岐選択過程を図１４に要約する。

最初の標的スクリーンにより、潜在的なヒットを同定した。このスクリーンに関して、ＮＨ_２−Ｐｒａ−ＸＸＸＸＸ−ＧＭ−ＴＧ（ここで、ＴＧはＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂であり、Ｘは１８個の天然Ｌ−アミノ酸（−Ｃｙｓ、−Ｍｅｔ）のうちの１つであり、Ｐｒａはプロパルギルグリシンである）の形態のナイーブライブラリを標準スプリットミックスプロトコールによりＴｉｔａｎ ３５７自動ペプチド合成装置（Ａａｐｐｔｅｃ）にて合成した。アンカーリガンドをＣ末端ビオチンで修飾し、ペプチドライブラリをこのビオチン化アンカーペプチド（９０μＭ）およびＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ（９ｎＭ）またはＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ（３７ｎＭ）のいずれかとブロッキング条件下で室温にて９０分または２４時間、インキュベートした。Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅを用いたスクリーンを２Ｈ１０ ｍＡｂ（ＣＳＴ）によりプローブし、Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ／Ｔ３０８Ｐを用いたスクリーンをＬ３２Ａ４によりプローブした。アルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体と引き続きインキュベートし、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで展開し、紫色のヒットしたビーズを一晩かけて剥離し、ＤＭＦにて脱色し、標的タンパク質の非存在下で一次および二次抗体により再プローブした。生成物スクリーンに先立ち、クリアなままのビーズを洗浄、剥離した。最初の標的スクリーンは、結果として、ヒット頻度が、ビーズの０．００１％〜０．０１％の間であった。

標的スクリーンに続いて、生成物スクリーンを、真のヒットを同定するために実施した。ビーズをＡｋｔブロッキング緩衝液で再度ブロックし、ストレプトアビジン−Ｃｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と濃度０．４μｇ／ｍＬで、室温にて３０分間、インキュベートした。ビーズをＡｋｔブロッキング緩衝液、Ａｋｔ Ｗａｓｈ １緩衝液およびｄＨ_２Ｏにて完全に洗浄し、Ａｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４４００Ａスキャナー（ＭＤＳ）にて画像化した。生成物スクリーンが標的スクリーンにおいて同定されたビーズの２３〜３７％の間で妥当であることを確認した。生成物スクリーンにおいて飽和した蛍光シグナルを表示したビーズの配列をエドマン分解にて決定した（図８）。結果として得られた配列では、最初の３つの位置における芳香族アミノ酸が優先されることが示された。３つの候補ペプチドをさらなる分析のために選択し、相当するバイリガンドを１，４−トリアゾールでＣｕ（Ｉ）触媒アジド−アルキン付加環化を用いて合成した（Ｔｏｒｎｏｅ ２００２）。結果として得られた３つの捕捉剤のうちの２つは、免疫沈降実験においてＡｋｔ１への結合の増加を示した。二次リガンドＰｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２を含む最も有望な候補を、追加の特徴づけのためにおよびトリリガンドを開発するためにスケールアップした。

トリリガンド分岐選択：トリリガンド分岐を、生成物スクリーンにより同定した。

ＡｋｔバイリガンドをＣ末端ビオチンおよびＮ末端の５−ヘキサン酸で合成し、三次リガンドスクリーンのためのアンカー化合物として使用した（５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏ、図９）。アンカーリガンドＶＦＹＲＬＧＹ−Ｂｉｏを標準プロトコールに準じて合成した。Ｃ_８Ｎ_３残基を加えたのに続き、樹脂をＮＭＰで洗浄し放置した（Ｆｍｏｃ−Ｃ_８Ｎ_３−ＶＦＹＲＬＧＹ−ビオチン）。並行して、二次リガンド（Ａｃ−Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２）をＳｉｅｂｅｒ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ上で合成し、側鎖の保護基がインタクトであるまま樹脂から切断した（上記参照）。ペプチドを、０．１％ＴＦＡを有するｄＨ_２Ｏ：ＣＨ_３ＣＮ勾配を使ってＲＰ−ＨＰＬＣにて精製した。生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにて確認した。バイリガンドを樹脂上で下記の手順に準じて集合させ：３０ｍｇの樹脂結合Ｆｍｏｃ−Ｃ８Ｎ_３−ＶＦＹＲＬＧＹ−ビオチン（１４μｍｏｌ）を洗浄し４７μｍｏｌの保護二次ペプチド（Ａｃ−Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２）に４７ｍＭのＣｕ（Ｉ）、７１ｍＭのＬ−アスコルビン酸および２０％ピペリジンの存在下に加えた。反応は室温にて１８時間、進行し続いてＮＭＰおよび銅キレート化溶液にて洗浄した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン中にて除去した。１１０μｍｏｌの５−ヘキシン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００μｍｏｌのＨＡＴＵおよび３４２μｍｏｌのＤＩＥＡをＮＭＰ中で加え、反応を室温にて２時間進行させた。ＮＭＰで洗浄後、５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏを樹脂から９５：５：５のＴＦＡ：ｄＨ_２Ｏ：ＴＥＳ中にて切断し、ジエチルエーテルにて沈殿させた。生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣにてジアステレオマーの混合液として精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて分析した（予想［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２４５０．３０、観察［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２４４９．１２）。

最初のナイーブライブラリは、最初のアンカースクリーンにおいてと同一であった。ナイーブライブラリ（１００ｍｇ）をＳＡ−ＡＰに対してプレクリアし、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで展開し、プールから紫色ビーズを除去した。残存するライブラリを一晩かけて剥離し、ＮＭＰで脱色し、Ａｋｔブロッキング緩衝液にて再度ブロックした。

５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏ（３０μＭ）およびＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ（１１０ｎＭ）をペプチドライブラリの存在下に室温にて９０分間、インキュベートした。ビーズを前述同様に洗浄し、ＳＡ−ＡＰによりプローブし、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで展開し、紫色ビーズの配列をエドマン分解にて決定した（図１０）。ナイーブライブラリからの結果によって、三次ペプチドに関して弱いコンセンサスがあることが判明したが、Ａｚ８は１位で優先のアミノ酸であり、２位、３位および４位では、正電荷のアミノ酸の傾向が示された。

最初のスクリーンにおけるアミノ酸頻度に基づいた集中ライブラリ（３０ｍｇ）をＳＡ−ＡＰに対してプレクリアし、ブロッキング条件下において５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏ（１５μＭ）およびＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ（２１ｎＭ）での２回目の生成物スクリーニングに供した。室温にて６０分間後、ビーズを洗浄し、ＳＤＳ洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、２％ＳＤＳ）で剥離し、ｄＨ_２Ｏにて洗浄し、Ａｋｔブロッキング緩衝液でブロックし、前述したとおり、ＳＡ−ＡＰによりプローブした。ビーズをＢＣＩＰ／ＮＢＴの存在下で展開し、紫色ビーズの配列をエドマン分解にて決定した（図１１）。三次リガンドコンセンサス配列は、２位および４位での正電荷のアミノ酸、３位での負電荷のアミノ酸および５位での疎水性アミノ酸で同定された。このプールから、三次リガンドＡｃ−Ｃ８−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２を選択し、バイリガンドに結合させて、分岐したトリリガンドを形成した（図１５）。
［実施例２］

ｉｎ ｓｉｔｕクリック効率の定量化：
先行研究によると、ｉｎ ｓｉｔｕ反応はＣｕ（Ｉ）触媒過程に比べると低収率であるが示唆されている。それ故、実施例１におけるオンビーズ二次リガンドと可溶性アンカーリガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率および選択性を評価するために、イムノ−ＰＣＲ（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ２００５）に基づいた分析アッセイを開発した。この新規の方法は、ＱＰＣＲの優れた感度および大きなダイナミックレンジを活用している。簡単には、ビオチン化アンカーリガンドと樹脂結合二次リガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の変形を実施し、ビオチンラベルを用いてストレプトアビジン（ＳＡ）−オリゴヌクレオチド（ＳＡ−ＱＰＣＲテンプレート）を、バイリガンド生成物を含有するこれらのビーズのみに結合させた。５個のビーズを個々に拾い出し（可変のビーズサイズに対する管理のために）、それぞれのＱＰＣＲ反応に加えた。各反応条件についてサイクル閾値（Ｃ_ｔ）を決定し、標準曲線を用いて各反応条件についてビーズ上に存在するバイリガンドの量を計算した（図１６）。

ＳＡ−オリゴヌクレオチド調製：ストレプトアビジン発現を先に公開されたプロトコール（Ｓａｎｏ １９９０）に準じて実施した。簡単に、ｐＥＴ−３ａプラスミドにクローンニングされたストレプトアビジン−システイン（ＳＡＣ）遺伝子は、Ｄｒ．Ｔａｋｅｓｈｉ Ｓａｎｏ（ハーバード医科大学）から供与された。形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＥ細胞を、ＬＢ培地ならびに選択抗生物質アンピシリンおよびクロラムフェニコール中で、３７℃で振盪しながら増殖させた。細胞をＩＰＴＧにてＯＤ６００＝０．６で誘導し、さらに４時間、回転し続けた。次いで培養液を１６００ｇで１０分間遠心分離し、溶解緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．０）で溶解させた。次いで不溶の封入体を溶解物から３９，０００ｇ、１５分間遠心分離することで分離し、６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ１．５に溶解させて元の培養液の量に合わせた。カラム精製のための調製において、５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−ＭＥ、ｐＨ１１に対して透析する前に、ＳＡＣ溶解物を次いで０．２Ｍの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールβ−ＭＥ）ｐＨ６．０で一晩透析することで再度、折り畳んだ。ＳＡＣを再度折り畳んだ量を１：１で結合緩衝液（５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−ＭＥ、ｐＨ１１）と混合した。１．５ｍｌのイミノビオチンアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）を充填した自然落下式カラムを１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄した。その後、再度折り畳んだ混合液をカラムに適用し、溶出画分を収集し、ＳＡＣ回収率を最大とするためにカラムに再度、適用した。カラムを２０ｍｌの結合緩衝液で洗浄した後、ＳＡＣをｐＨ４の溶出緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのβ−ＭＥ）で溶離した。ＳＡＣを含有する画分をＯＤ_２８０でモニターしながら収集し、緩衝液を１０ｍＭのβ−ＭＥを含有するＰＢＳと交換し、１０Ｋ ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、最終濃度１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

使用に先立ち、ストックＳＡＣ（ストレプトアビジン−システイン）を、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＣＥＰ）への緩衝液交換に供した。ＤＭＦ中でＭＨＰＨ（３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を３００：１のモル過剰でＳＡＣに加えた。並行して、ＤＭＦ中のＳＦＢ（スクシンイミジル４−フォルムベンゾエート、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を、５’アミノ化オリゴヌクレオチド（５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−ＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’）に４０：１のモル過剰で加えた。混合液を室温にて３〜４時間、反応させた。過剰のＭＨＰＨおよびＳＦＢを除去し、試料を、ゼバ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、クエン酸塩緩衝液（５０ｍＭナトリウムクエン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）への緩衝液交換に供した。ＳＦＢラベルオリゴヌクレオチドをその後誘導体化ＳＡＣと２０：１のモル過剰で合わせ、室温にて２〜３時間、反応させた後、移して４℃で一晩インキュベートした。未反応オリゴヌクレオチドをＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラムを用いて等張ＰＢＳにて０．５ｍｌ／分の流速で除去した。ＳＡ−オリゴヌクレオチド結合体を含有する画分を１０Ｋ ｍｗｃｏ濃縮フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。ＳＡ−オリゴヌクレオチドコンストラクトの合成は、非還元８％トリスＨＣｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、１モノマー当たり１〜２つの結合したオリゴヌクレオチドを含有することが見出された。

ＱＰＣＲに先立ち、ＳＡ−オリゴヌクレオチドをビオチン化ＴｅｎｔａＧｅｌビーズで従来のＰＣＲ反応によって妥当性を確認した。ＴｅｎｔａＧｅｌビーズをグリシンジペプチド（ＴＧ−ＧＧ）またはＮ末端ビオチンを有するグリシンジペプチド（ＴＧ−ＧＧ−Ｂｉｏ）のいずれかで合成した。ビーズをＡｋｔブロッキング緩衝液、続いてＱＰＣＲブロッキング緩衝液（０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、リン酸緩衡生理食塩水中の１５０μｇ／ｍＬの断片化処理したサケ精子ＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ））でブロックした。３０分間後、ビーズを洗浄し、ＳＡ−オリゴヌクレオチド（０．１７μｇ／ｍＬ）により室温にて６０分間、プローブした。ＱＰＣＲブロッキング緩衝液、ＰＢＳにて洗浄したのち、単一ビーズを薄肉のＰＣＲチューブに入れた。ＰＣＲを、Ｔａｑポリメラーゼを用いて両方とも１００ｎＭのフォワードプライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＧＡＡＣＴＣＧ−３’）で標準条件下にて実施した。５サイクル毎に少量の試料を除去し、アガロースゲル電気泳動（４％ゲル）にて、生成物の形成について分析した（図２９）。

リガンドの調製：二次ペプチド（ＮＨ２−Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ）およびアンカーペプチド（Ａｃ−Ｃ８Ｎ３−ＶＦＹＲＬＧＹ）をＴｅｎｔａＧｅｌ上で合成した。各々０．４５ｍｇ（約１，０００ビーズ）をＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ（２２μＭ）および相当するビオチン化ペプチド（２００μＭ）、ビオチン化ペプチド単独（２００μＭ）、またはＤＭＳＯと合わせた。Ｃｕ^＋触媒クリック反応物は、０．４５ｍｇの固定化ペプチド、ビオチン化ペプチド（２００μＭ）、Ｃｕ（Ｉ）（９ｍＭ）、Ｌ−アスコルビン酸（３０ｍＭ）およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ、４ｍＭ）を最終容量５０μＬ、４：１のＮＭＰ：ｄＨ２Ｏで含有した。固定化二次ペプチドに関して、相当する可溶性ビオチン化ペプチドはＡｃ−Ｃ８Ｎ３−ＶＦＹＲＬＧＹ−ビオチンであった。固定化アンカーペプチドに関して、相当する可溶性ビオチン化ペプチドはＡｃ−Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ビオチンであった。

ｉｎ ｓｉｔｕクリック反応物を２５℃にて１８時間、強く撹拌してインキュベートした後、ビーズを除去しＡｋｔブロッキング緩衝液にて完全に洗浄した。Ｃｕ^＋反応物をＮＭＰにて３回、銅キレート化溶液にて１０回、ＮＭＰで３回、水にて３回、そしてＡｋｔブロッキング緩衝液にて１回、洗浄した。ビーズを次いでグアニジンＨＣｌ（ｐＨ＝２）中にて剥離、ｄＨ２Ｏにて洗浄し、ＱＰＣＲブロッキング緩衝液にて２時間（０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、リン酸緩衡生理食塩水中の１５０μｇ／ｍＬの断片化処理したサケ精子ＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ））ブロックした。

ＱＰＣＲアッセイ：ビーズを０．５μｇ／ｍＬのＳＡ−オリゴヌクレオチドにより室温にて１時間、プローブした。ビーズをＱＰＣＲブロッキング緩衝液にて５回、ＰＢＳにて３回、洗浄した。各反応条件についての３セットの５個のビーズを、ＰＣＲチューブに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００でのＱＰＣＲに供した。

ＱＰＣＲに関して、１００ｎＭの各プライマー（上述）をそれぞれの反応物に１Ｘ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＲＯＸ（Ｒｏｃｈｅ）と共に加えた。各サイクルは、変性工程（９４℃にて３０秒間）、アニーリング工程（５０℃にて４５秒間）および伸長工程（７２℃にて６０秒間）からなった。ＰＣＲを３０サイクルで実施し、各反応物についてＣｔ値を決定した。同じ実験で、ＳＡ−オリゴの滴定系列も実施し（二重試料）、標準曲線を作成するのに用いた。標準曲線の直線フィットを用いて、観察されたＣｔをＰＣＲチューブ内に存在するＳＡ−オリゴヌクレオチドの量に関係づけた。下記の式を、ＱＰＣＲ反応で観察されたＣｔから各ビーズ上に存在するａｍｏｌ ＳＡ−オリゴヌクレオチドを得るのに用いた：

各ビーズ上に形成されたバイリガンドのバイリガンドの量（ａｍｏｌ）を存在するＳＡ−オリゴの量と同じであるとみなした。

２つのペプチド間のクリック反応は、Ａｋｔ１の存在下の方がその非存在下に比べ約１０倍効率的であり、これにより、標的タンパク質がクリック反応を触媒する必要があることが確認された。アンカーリガンドが固定化され、ビオチン化二次リガンドが溶液中にある場合、ｉｎ ｓｉｔｕクリック過程の効率は、４倍（依然としてバックグラウンドレベルより高いが）減少し、これは、スクリーンで観察されたｉｎ ｓｉｔｕクリック反応がオンビーズペプチドの素性およびそれが表示される様式（例えば、オンビーズまたは溶液中）に依存していることを示唆した。銅触媒クリック反応では、配向依存性はみられず、これは、スクリーニング過程で観察されたクリック反応では高い標的依存性があるというさらなる証拠を提供した。
［実施例３］

バイリガンド成分間のリンカーの長さの役割：
酵素的研究を、バイリガンド成分間のリンカーの長さの役割を評価するために実施した。この分析に関して、３つのバイリガンド変異体をアンカーペプチドとトリアゾールとの間の１個、４個および８個の炭素リンカーで合成した（図２７）。

アンカーペプチドを１５０ｍｇスケールでＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上にて合成し、Ｃα炭素と側鎖アジド（Ａｚ１、Ａｚ４およびＡｚ８；図１）との間に、１、４、または８個のメチレンユニットを有する３個のアジドアミノ酸のうち１個に付加した。無水酢酸によるＮ末端のアシル化に続いて、樹脂をＮＭＰ中に再懸濁した。二次リガンド（Ａｃ−Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２）を３００ｍｇスケールでＳｉｅｂｅｒ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ上にて合成した。ＣＨ_２Ｃｌ_２中の４．５ｍＬの２％ＴＦＡを加え、５分間インキュベートすることによってペプチドを切断した。ＴＦＡを２２５μＬのＤＩＥＡに濾過することによってクエンチした。切断を５回繰り返し、濾液を合わせ、溶媒を回転蒸発により除去した。保護二次ペプチドをＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣにて、ｄＨ_２Ｏ：ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）勾配を使って精製した。

バイリガンド変異体を、Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡ樹脂上（約８μｍｏｌのアジド）の１２ｍｇのアンカーペプチドと２４μｍｏｌの側鎖保護二次ペプチドとを４０ｍＭのＣｕＩ、６０ｍＭのＬ−アスコルビン酸および２０％ピペリジン存在下に合わせることによって合成した。反応を室温にて６時間、撹拌しながら進行した。銅キレート化溶液（２２ｍＭのナトリウムジチルチオカルバメート（三水和物）、２９ｍＭのＤＩＥＡ、ＤＭＦ中）、続いてＮＭＰで完全に洗浄することによって、銅を除去した。バイリガンドを樹脂から９５：５：５のＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＥＳ中で切断し、ジエチルエーテルにて沈殿させ、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣにてｄＨ_２Ｏ：ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）勾配を使って精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：Ｂｉ−Ｃ（Ｎ＝１）：予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２０３１．０４、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２０２９．６６。Ｂｉ−（Ｎ＝４）：予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２０７３．０９、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２０７０．０５。Ｂｉ−（Ｎ＝８）：予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２１２９．１５、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２１２５．７３。

バイリガンドリンカー長さ変異体を、Ａｋｔを阻害する能力について評価した。ＤＭＳＯ中の０．５μＬのバイリガンド希釈液またはＤＭＳＯ単独を、４００ｎｇのＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐ、２００ｎｇのＧＳＴ−ＧＳＫ−３α／βクロスチド融合タンパク質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５００μＭのＡＴＰ、２５μＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１Ｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害薬（−ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ）、１Ｘ ＰｈｏｓＳｔｏｐホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を含有する反応物２０μＬに加えた。反応を３０℃にて３０分間、進行させ、キナーゼクエンチング緩衝液（２０％ＳＤＳ中の５００ｍＭのＤＴＴ）でクエンチした。２μＬの各クエンチされた反応物をニトロセルロース上にスポットし、ドットブロットを５％無脂肪ミルクで１時間、ブロックした。ブロットを、１：１０００の希釈でのウサギ抗リン酸化ＧＳＫ−３α／β（Ｓｅｒ２１／９）ｍＡｂ（３７Ｆ１１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により４℃にて一晩、プローブした。ブロットを洗浄し、１：５００の希釈での抗ウサギ−ＨＲＰ二次抗体によりプローブした。ブロットをＰｉｃｏ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ）にて展開し、フィルム上に画像化した。画像をスキャンし、各スポットを、ＩｍａｇｅＪを用いたデンシトメトリーにて定量した。阻害薬を加えなかったスポットの密度に全密度を正規化して、％ｐＡｋｔ活性値を得てその値を対数［化合物］に対してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。ｎ＝４およびｎ＝８の場合、プロットされた活性は、２つのジアステレオマーについて観察された活性の平均値である。

Ａｋｔ阻害の分析結果は、元々バイリガンドの開発に用いられた８個の炭素リンカーが非常に優先されることを示した（図２８）。これは、バイリガンドスクリーンから生じた「ヒットした」配列が、標的タンパク質および可溶性アンカーペプチドによってのみならず、各成分中のアジド機能性とアセチレン機能性との間の相対的間隔から決定されたことを示唆する。
［実施例４］

Ａｋｔ捕捉剤の特徴づけ：
結合親和性：実施例１において開発されたアンカーリガンド、バイリガンドおよびトリリガンドの親和性を固定化Ａｋｔ−Ｓ４７３ＥでＥＬＩＳＡによって決定した。

５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏを集合させ、上述のとおり精製した。三次リガンド（Ａｃ−Ｃ８Ｎ_３−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２）をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上にて、上述のとおり合成した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製することで、所望の生成物（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝９６１．５７、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝９６１．４３）を得た。５４４ｎｍｏｌの５ＨＡ−バイリガンド−Ｂｉｏと１．０９μｍｏｌのＡｃ−Ｃ８Ｎ_３−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２とを４：１のＮＭＰ：ｄＨ_２Ｏ中の６００ｎｍｏｌのＴＢＴＡ、１０ｍＭのＣｕＩおよび３０ｍＭのＬ−アスコルビン酸の存在下に合わせることによってトリリガンドを集合させた。反応を室温にて１８時間、撹拌しながら進行させた。所望の生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによってジアステレオマーの混合液として精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて分析した（予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３４１０．８８、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３４０８．９６。

ＨｉｓＳｏｒｂ Ｎｉ−ＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）の各ウェルに３μｇのＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅを、５０μＬのＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で加えた。５０μＬのイミダゾールブロッキング緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭのイミダゾールおよび４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）を対照ウェルに加えた。４℃にて１８時間後、ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液で洗浄し、５０μＬの各リガンド希釈液をＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液に加えた。リガンドを４℃にて１２０分間、結合させ、その後、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて３回洗浄した。５０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ）を加え（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液にて１：５０００希釈）、４℃にて７０分間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）にて３回、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）にて１回洗浄した。５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を加えて最終シグナルを発生させ、シグナルを１ＭのＨ_２ＳＯ_４でクエンチし、９６ウェルプレートリーダーにてλ＝４５０ｎｍで定量した。実験ウェルのＡ４５０から各ブランクウェル（Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅなし）のＡ４５０を差し引くことによって、正味のＡ４５０を計算した。データを非線形回帰にてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてフィットさせた。

Ａｋｔ（＞２５μＭ）に対するアンカーリガンドの結合親和性のため、Ａｋｔは高感度にＡｋｔを捕捉するための独立型の剤としては適さない。バイリガンドは、Ａｋｔに対する親和性において、アンカーペプチドに比べて＞１００倍の改善を示したが、トリリガンドは軽度の親和性（２〜３倍）しか得ることができないことを示した（図１９）。

トリリガンド結合親和性をさらに、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用いてＳＰＲにより分析した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｈｉｐ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ、Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造業者の推薦に従って調整した。ビオチン化リガンドをＨＢＳＰ＋緩衝液（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で希釈して、最終濃度を１００ｎＭにし、チップ上に１３７ ＲＵを固定化した。Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅを上述したように調製し、Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＨＢＳＰ＋への緩衝液交換供した。酵素をＨＢＳＰ＋緩衝液（９０００ｎＭ〜１ｎＭ）で段階希釈し、チップの上を５０μＬ／分で流した。結合および解離を１０℃にて、接触時間を３６０秒、解離時間を４００秒、安定化時間を２００秒として実施した。未修飾参照フロー細胞を用いて、応答を補正した。速度定数をセンソグラムから得、これを用いて解離定数を計算した。分析によって、トリリガンドがＡｋｔ１−Ｓ４７３Ｅに対して中〜低ナノモルの親和性を持つことを確認した（Ｋ_Ｄ＝２００ｎＭ、図２０）。

結合特異性：実施例１で開発されたアンカーリガンド、バイリガンドおよびトリリガンドの特異性を一連のタンパク質キナーゼを用いて分析した。これらのアッセイに関して、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ、ならびにＡＧＣファミリー（Ａｋｔ１、ＰＤＫ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｐ７０ｓ６キナーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））、ＳＴＥファミリー（ＭＥＫ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびＧＭＧＣファミリー（ＧＳＫ３β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））からのＨｉｓタグ化活性タンパク質キナーゼドメインのセットに対する固定化捕捉剤としてマルチリガンドを用いた。β−アクチン（Ａｂｃａｍ）を対照として用いた。Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅを発現させ上述のとおり精製した。

各キナーゼの相対的親和性を、抗Ｈｉｓ６抗体によりプローブしＡｋｔ１−Ｓ４７３Ｅに対する応答を正規化することにより決定した。全てのタンパク質をＡｋｔブロッキング緩衝液にて希釈して、使用前に最終濃度を２４ｎＭとした。リガンドをＡｋｔブロッキング緩衝液にて希釈して、最終濃度を使用前に２．５μＭとした。１００μＬの各リガンド（２５０ｐｍｏｌ）をＨＢＣストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。リガンドを４℃にて１時間、結合させ、引き続きＤ−ビオチンを加えて、最終濃度を５００μＭとした。４℃にて１０分間後、ウェルをＡｋｔブロッキング緩衝液にて３回洗浄し、５％無脂肪ミルクにて、一晩ブロックした。

ウェルをＡｋｔブロッキング緩衝液にて３回洗浄し、５０μＬの活性タンパク質を各ウェルに適用した。４℃にて１２０分間、結合させた後、ウェルをＡｋｔブロッキング緩衝液にて３回洗浄して非結合タンパク質を除去した。１：１００の希釈での５０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗Ｈｉｓ６抗体を加えた（Ｈｉｓプローブ（Ｈ−３）ＨＲＰ結合体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。抗体−ＨＲＰ結合体を６０分間、インキュベートし、ウェルをＴＢＳＴにて３回、ＴＢＳにて１回洗浄した。５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を加え、結果として得られた色変化を５０μＬの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４にてクエンチした。９６ウェルプレートリーダーにてＡ_４５０を測定した。正味のＡ_４５０を、各タンパク質のブランク値を（リガンドなし）リガンド−タンパク質相互作用について得られた３つの値のそれぞれから差し引いくことによって得た。各正味のＡ_４５０の値をＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅ試料からの正味のＡ_４５０に正規化して、正規化相対的結合値を得た。３つの値の平均値を計算しプロットし、誤差バーは平均値の標準誤差から作成された（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。

結果を図２１に示す。アンカーリガンドは、Ａｋｔ１タンパク質に対して非常に特異的あり、ＧＳＫ３βへの軽度の結合のみを伴った。非常に高い親和性を有するバイリガンドは、選択性が減少し、ＧＳＫ３βに対して有意な交差反応性を示した。しかし、トリリガンドについては、ＧＳＫ３βへの結合は有意に減少し、アンカーペプチドについて観察されたレベルに近づけた。さらに、ＭＥＫ１への標的外結合がトリリガンド段階で完全に除去された。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕクリック生成物スクリーンを捕捉剤の選択性を増加するために用いることができることを示唆する。

Ａｋｔ阻害：トリリガンドによるＡｋｔ１阻害のモードを決定するために２つの標準酵素動態アッセイを実施した（Ｓｅｇｅｌ １９７５）。これらのアッセイに関して、キナーゼ活性を種々の基質およびトリリガンド濃度で測定した。結果として得られたデータを解釈することができるので、関連するキナーゼ結合部位におけるトリリガンドと基質との間の競合の性質を決定する。例えば、トリリガンドおよびＡＴＰが同じ結合ポケットにおいて競合する場合、キナーゼの最大速度（Ｖ_ｍａｘ）は変化しないことになり、ミカエリス定数（Ｋ_Ｍ）は増加することになる。プロットはまたトリリガンド阻害定数（Ｋ_ｉ）を決定する手段として用いることができる。

Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐは、７５μｇのＡｋｔ−Ｓ４７３Ｅを１μｇのＰＤＫ１（Ｓｉｇｍａ）と、１Ｘ反応緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）中のＡＴＰ５００μＭ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＤＴＴ、１Ｘプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）、１Ｘホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ））の存在下にインキュベートすることによって調製された。リン酸化反応を室温にて４０分間進行させ、引き続き２５ｍＭのＥＤＴＡを加えた。クエンチされた反応物を４０μＬの抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ）に加え、４℃にて２時間、結合させた。樹脂をＦＬＡＧ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１Ｘプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）、１Ｘホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ））にて洗浄し、Ａｋｔ１−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８ＰをＦＬＡＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＬＡＧ洗浄緩衝液＋０．１５ｍｇ／ｍＬの３Ｘ ＦＬＡＧペプチド）で室温にて３０分間、溶出した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイにて決定した。

基質ペプチドに対するトリリガンドの阻害モードを決定するために、ペプチド基質（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ、Ａｎａｓｐｅｃ）の濃度の増加を伴うキナーゼ反応を築いた。ペプチド基質の濃度範囲は、３７５ｎＭ〜２５μＭ（７倍濃度）であり、トリリガンドの濃度範囲は、０〜２５μＭ（０．２００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、２５μＭ）であった。非放射性ＡＴＰの濃度を２５μＭで一定に保ち、［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μＬ）を加えて、最終濃度を８３ｎＭとした。Ａｋｔ−Ｓ４７３Ｅ−Ｔ３０８Ｐを加えて、最終濃度を１２ｎｇ／μＬとした。反応は、室温にて３０分間、１Ｘ反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１Ｘプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）、１Ｘホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ））中で進行した。反応をグアニジンＨＣｌでクエンチして、最終濃度を３．５Ｍとした。

生成物の形成を、ＳＡＭ２ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上に５μＬのクエンチされた反応物をスポットし、その膜を製造業者の使用説明書に従って洗浄し、液体シンチレーションカウンティングにて分析することによって決定した。観察された１分毎のカウント数を、カウンター効率が５０％と仮定して、［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰの活性および濃度に基づいて、形成された生成物のｐｍｏｌに変換した。速度を各［トリリガンド］で［ペプチド］に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄで直線回帰および非線形回帰により分析した。

ＡＴＰに対するトリリガンドの阻害モードを決定するために、ＡＴＰの濃度の増加を伴うキナーゼ反応を築いた。反応を上述のものと同様に築いた。Ｂｉｏｔｉｎ−Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅの濃度を２５μＭで一定に保ち、酵素の濃度は１３ｎｇ／μＬで保った。ＡＴＰの濃度は１２５μＭ〜４μＭ（１２５μＭ、６３μＭ、３２μＭ、１６μＭ、８μＭ、４μＭ）の範囲であり、トリリガンド濃度は０〜１０μＭ（０．１μＭ、５μＭ、１０μＭ）で変わった。［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μＬ）を冷ＡＴＰストックに加えて、［ＡＴＰ］_{ｔｏｔａｌ}／［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰの比率を１６６７に維持した。上述のとおり反応物をインキュベートし、クエンチし、分析した。

動態アッセイの結果を表１に要約する。Ａｋｔ１−Ｓ４７３ＥＴ３０８ＰのＫ_ＭおよびＶ_ｍａｘ値を阻害実験の結果から非線形回帰により得た（ＧｒａｐｈＰａｄ）。ＡＴＰおよび基質ペプチドのミカエリス定数の文献値としてＫｌｅｉｎ ２００５のデータを参考とした。トリリガンドＫ_ｉ（非競合的阻害）は１／ｖ対種々の［ＡＴＰ］を有する［トリリガンド］のディクソンプロットの負のＸ切片から得た。Ｋ_ｉは観察されたＸ切片の平均値であり、誤差範囲は標準偏差である。トリリガンドＫ_ｉ’（不競合的阻害）は１／ｖ対種々の［ペプチド］を有する［トリリガンド］のディクソンプロットの切片から得た。Ｋ_ｉ’は、切片の平均値であり、誤差範囲は標準偏差である。これらのプロットを追加の動態分析と共に図２３および２４に示す。

結果は、トリリガンド濃度の増加に応じて、両方の基質について酵素Ｖ_ｍａｘの減少を示す（図２２）。このことは、トリリガンドが直接、どちらの基質ともそれぞれの活性部位において競合しないことを示す（すなわち、トリリガンドは、ＡＴＰまたはペプチド基質結合部位とははっきりと異なる部位に結合する）。ＡＴＰが種々の基質である場合、トリリガンドを加えてもＫ_Ｍに及ぼす効果はほとんどないように思われ、非競合的阻害と一致している。ペプチド濃度が種々である場合、Ｋ_Ｍは不競合的阻害に一致する様式で減少する。Ｋ_ｉおよびＫ_ｉ’を１／ｖ対［トリリガンド］のディクソンプロットから決定した場合、両方の値は類似している（それぞれ４μＭ対２．６μＭ）。

競合的ＥＬＩＳＡ実験は、Ａｋｔ上のトリリガンド結合部位がＣ末端を指向する抗Ａｋｔ１抗体のものと部分的に重複している可能性があることを示唆した（図３０）。Ｃ末端は、活性部位の反対側に位置するキナーゼドメインの「背面」上で効果的である。
［実施例５］

Ａｋｔ捕捉剤の診断有効性：
実施例１で生成されたＡｋｔ捕捉剤の癌株からの完全長Ａｋｔ認識能について評価した。先の試験では、Ａｋｔ２がＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞株で過剰発現していることが示されている。それ故、この細胞株を免疫沈降（ＩＰ）および免疫組織化学実験（ＩＨＣ）ための実験プラットフォームとして利用した（Ｙａｎｇ ２００４）。

ＩＰ実験に関して、アンカー、バイリガンドおよびトリリガンドをストレプトアビジン−アガロース上に固定化し、各樹脂を未処理細胞または上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびインスリンの組合せで刺激された細胞から得られたＯＶＣＡＲ３細胞溶解物で拾い出した。

ＯＶＣＡＲ３細胞を１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０倍地中にて増殖させた。４継代細胞を約６０％コンフルエンスまで増殖させ、インスリンおよびＥＧＦにてそれぞれ１０μｇ／ｍＬおよび２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で処理（誘導）し、または模擬処理（対照）した。細胞をさらに２４時間増殖させ、次いで溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、０．５％デオキシコール酸塩、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１Ｘ ＰｈｏｓＳｔｏｐホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）、１Ｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）で溶解させた。細胞溶解物のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにて決定した。

リガンドをストレプトアビジン−アガロース上に、９μＬの４ｍＭのリガンドストック（ＤＭＳＯ）を５０μＬのＡｋｔブロッキング緩衝液でプレブロックされたストレプトアビジン−アガロース樹脂（ＥＭＤ）に加えることによって固定化した。ｍＡｂ樹脂は、２５μｇの５Ｇ３抗Ａｋｔ１抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＡｋｔブロッキング緩衝液中の１００μＬのストレプトアビジン樹脂に加えることによって調製された。４℃にて１時間、結合させた後、樹脂に５０μＭのＤ−ビオチンを加えて残っている部位を全てブロックした。

１０μＬの樹脂結合リガンドをスピン−Ｘフィルターユニット（Ｓｉｇｍａ）に加え、濾過した。これに、ＯＶＣＡＲ３細胞溶解物（ブラッドフォードによる８０μｇのタンパク質）およびＡｋｔブロッキング緩衝液を加えて、最終容量を５０μＬとした。結合は４℃にて２０時間、撹拌しながら起こった。樹脂をＡｋｔブロッキング緩衝液にて３回、Ａｋｔ Ｗａｓｈ １緩衝液にて３回、Ａｋｔ Ｗａｓｈ ２緩衝液にて３回、洗浄した。結合した材料を、４０μＬの２Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（バイオラッドＢｉｏＲａｄ）を加え９４℃にて１０分間、加熱することによって溶出した。各溶出液の一部を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上に２回流した。一方のゲルはクマシーで染色され、他方はニトロセルロースに移され、５％無脂肪ミルクでブロックされ、ウサギｐａｎ−Ａｋｔモノクローナル抗体（Ｃ６７Ｅ７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、引き続き抗ウサギ−ＨＲＰ二次抗体により一晩プローブされた。一次抗体は１：１０００の希釈で用いられ、二次抗体は１：１００００の希釈で用いられた。ブロットをＰｉｃｏ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ）で展開しフィルム上に画像化した。

溶出物をＡｋｔの３つのアイソフォーム全てを検出するｐａｎ−Ａｋｔ抗体によりプローブしたところ、誘導および非誘導の細胞の両方からの溶解物中のアンカーペプチドに対するバイリガンドの親和性が増加していることが確認された（図２６）。トリリガンドは、誘導細胞の溶解物においてバイリガンドに比べてＡｋｔの免疫沈降がやや増加したが、非誘導の対照細胞溶解物においては増加しなかったことを示す。この効果はやはり、免疫沈降がＡｋｔリン酸化Ｓｅｒ４７３（Ａｋｔ２中のＳｅｒ４７４）に対して特異的な抗体によりプローブされた場合にも観察される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、全ての免疫沈降したタンパク質を分析したところ、どのリガンド（図２５）間のバックグラウンド（非選択的）結合における有意な差は示されなかった。興味あることに、Ａｋｔ１のキナーゼドメインに対して作られた市販の抗Ａｋｔ１抗体では、Ａｋｔの免疫沈降がほとんど示されなかった。この抗体の低い性能は、多数のアッセイおよび抗体の複数のバッチにわたって観察された。同等の性能を有する抗体であるとしても、モノクローナル抗体に比べて、トリリガンドを大量に比較的安価な費用で利用できることは大きな利点である。

さらにマルチリガンド捕捉剤と完全長Ａｋｔとの間の相互作用を探索する目的で、蛍光色素ラベルバイリガンドを（図１７）固定化ＯＶＣＡＲ３細胞でＩＨＣ造影剤として用いるために合成した。アンカーペプチドＣ_８Ｎ３−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂上で、上述したように合成した。二次ペプチドＰｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２をＳｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ樹脂上で、上述のとおり合成した。Ｆｍｏｃ脱保護の後、蛍光色素誘導体６−［蛍光色素−５（６）−カルボキサミド］ヘキサン酸（Ｓｉｇｍａ）を二次ペプチドのアミノ末端に、１．２当量の蛍光色素、１．１当量のＨＡＴＵおよび３当量のＤＩＥＡを用いて、結合させ、その後室温にて３０分間インキュベートした。樹脂からの切断に続いて、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる生成物の確認後、二次ペプチドを、１当量のアンカーペプチドを２当量の蛍光二次ペプチド、４当量のＣｕＩおよび６当量のアスコルビン酸と加えることにより、銅触媒アジド−アルキン付加環化を介してアンカーペプチドにカップリングする。Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、最終生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで確認した。ＭＳ：予測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２６１２．００、観測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２６１２．７８にて確認した。蛍光バイリガンドをその後、それに続く画像化実験に用いた。

ＯＶＣＡＲ３細胞を、ポリリジン被覆カバースリップ上で増殖させ、５００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）またはビヒクル対照のいずれかで１０分間、処理した。次いで細胞を１０％ホルムアルデヒドで３７℃にて１５分間固定し、ＰＢＳにて洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温にて１０分間インキュベートすることによって透過処理し、５％ヤギ血清にてブロックした。透過処理された細胞を蛍光色素結合Ｐａｎ Ａｋｔ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＣ２０５５Ｆ、１０μｇ／ｍＬ）で一晩または１μＭの蛍光色素結合バイリガンドで１時間、染色した。画像を、Ｚｅｉｓｓ Ｐａｓｃａｌ ５ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（カリフォルニア工科大学バイオイメージセンター）を用いて取得し、表面プロットをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）にて作成した。このアッセイに関して、Ａｋｔは、そのリガンド（ＥＧＦ）による上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）受容体などの受容体チロシンキナーゼの刺激の後に細胞膜に位置すると期待された。未刺激および刺激処理した細胞の画像は、このことが当てはまったことを明確に示している（図１８）。
［実施例５−２］

タンパク質Ａｋｔのキナーゼドメイン（タンパク質キナーゼＢ）上のセリン４７４のリン酸化部位（Ｓ４７４）の標的化
これを証明するために、捕捉剤をタンパク質キナーゼＢの重要な活性化リン酸化部位（Ａｋｔ２）に選択的に結合するようにデザインした。総合的戦略は次のとおりであった。

３２量体標的ペプチド配列を、Ａｋｔ２の４５０〜４８１アミノ酸を含んで構築した。この配列は、標的とするリン酸化部位（Ｓ４７４）を含有した。Ｓ４７４をリン酸化した。

３２量体ポリペプチドのｐ−Ｓ４７４部位上のリン酸基に選択的に結合する有機金属分子（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ）を利用した。ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌもアジド基をｐ−Ｓ４７４部位の近傍に提示ようにデザインした。ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌを図３５に示す。

ｉｎ ｓｉｔｕクリックスクリーンを、（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ）（３２量体）複合体を大きな１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）ペプチドライブラリとインキュベートすることによって実施した。ライブラリ中の各ペプチドはアセチレン基を含有し、ライブラリは約２百万の異なる分子を含有する。このスクリーンの基本的戦略を図３５に示す。

配列を同定し、最良の結合特性を示すこれらのヒットした分子の妥当性を確認した。このスクリーンからのヒットを表３に記載する。このスクリーンから同定された捕捉剤の構造を図３６ａに示す。この捕捉剤によって、Ａｋｔが過剰発現している卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３を用いて細胞溶解物からＡｋｔを検出することができた。

この最良のリガンドの特性を、Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＣＩＴ ５１６４−Ｐ；およびＡｋｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｋｉｎｇ．ＣＩＴ ５９１７−Ｐ，Ａｇｎｅｗ、ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１２１，ｐ ５０４４〜５０４８（２００９）およびＭｉｌｌｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，１８２０（２０１１）に記述されているような連続ｉｎ ｓｉｔｕクリックケミストリーの使用によって改善した、それらの全ての内容は参照により本明細書に組み入れられている）。これらの工程に関して、工程（１）〜（４）で同定された捕捉剤をバイリガンド（図３６ｂ）、次いでトリリガンド（図３６ｃ）へと改善した。捕捉剤は、Ｓ４７４を含有するポリペプチド断片に選択的に結合するが、同じタンパク質からの他の３２量体断片には結合しなかったことが示された（図３７）。それは、他の類似のキナーゼに比較して、Ａｋｔに対して強い親和性（Ｋ_Ｄ約１０ナノモル）および高い選択性を示し、免疫沈降アッセイにおいて、細胞溶解物からのＡｋｔタンパク質を選択的に検出するのに用いることができるものと思われた。この捕捉剤の性能を図３８に示す。

実験の詳細
材料。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸をＡｎａｓｐｅｃ（サンホセ、カリフォルニア州）およびＡＡＰＰＴｅｃ（ルイビル、ケンタッキー州）から購入し、受け取ったまま使用した。ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ_２樹脂（９０μｍ、０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）をＡｎａｓｐｅｃ（サンホセ、カリフォルニア州）から入手し、ＯＢＯＣライブラリ構築に利用した。Ｂｉｏｔｉｎ ＮｏｖａＴａｇ（商標）樹脂、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ ＮｏｖａＴａｇ（商標）樹脂、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）_２−ＣＯＯＨ（１３個の原子）をＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ギブスタウン、ニュージャージー州）から入手し、ビオチン化ペプチドの合成に用いた。ペプチドおよびＯＢＯＣペプチドライブラリをＴｉｔａｎ ３５７ペプチド合成装置（ＡＡＰＰＴｅｃ、ルイビル、ケンタッキー州）上にて合成した。アミノ酸カップリング反応を１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、９９％）中で、ＨＡＴＵ（２−（７−Ａｚａ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣｈｅｍＰｅｐ、マイアミ、フロリダ州）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）で実施した。Ｎ^α−Ｆｍｏｃ保護基の除去には、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を用いた。ペプチドの最終脱保護には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、９８％ ｍｉｎ．希釈）およびトリエチルシラン（ＴＥＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を用いた。

活性Ａｋｔ２（Ｎ末端Ｈｉｓタグを有する）をＡｂｃａｍ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から購入した。

ペプチドライブラリ合成：無作為化されたヘキサペプチドの無作為化されたＯＢＯＣライブラリを、Ｔｉｔａｎ３５７ペプチド合成装置を用いて９０μｍポリエチレングリコールグラフト化ポリスチレンビーズ（ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ_２、０．３１ｍｍｏｌ／ｇ、２．８６×１０^６ビーズ／ｇ）上で合成した。Ｄアミノ酸をライブラリの合成に用いた。この試験に用いられたライブラリを表２に記載する。

３，５−ビス（（ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシ安息香酸（ＨＬ）の調製：エタノール／水／ＨＣｌ（２Ｍの３０ｍＬ／９０ｍＬ／０．６ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジ（２−ピコリル）アミン（２．５０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）にパラベン（８３０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（４７５ｍｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を３日間、加熱還流し、次に室温まで冷却させた。次に、２００ｍＬのジクロロメタン（３００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を反応混合液に加え、有機相をさらに水３００ｍＬにて洗浄後、分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の蒸発後、帯黄色のゴム状半固体を得た。ジクロロメタン／メタノール／アンモニウム水酸化物を溶離液としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、淡黄色半固体を得た。ＨＬの構造については図３４を参照されたい。

次に、精製された半固体を水／エタノール（１：１）混合液中の２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解させ、６０℃にて２日間、撹拌した。次に、溶液を濃縮塩酸にて中和した。化合物をメタノールにて抽出した。

計算質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋５６１．３、［Ｍ−Ｈ］⁻５５９．３。観測質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋５６１．３、［Ｍ−Ｈ］⁻５５９．４

ビオチン−ＰＥＧ２−アジドリジン−ＨＬ（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−ＨＬ）の調製：ＤＬ Ｆｍｏｃ−アジドリジンをＢｉｏｔｉｎ ＰＥＧ Ｎｏｖａｔａｇ樹脂（カップリング効率０．０００４８ｍｍｏｌｅ／ｇ）に標準Ｆｍｏｃ固相合成法プロトコールに従ってカップリングした。Ｎ^α−Ｆｍｏｃ保護基をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理することによって除去した。次に、３，５−ビス（（ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシ安息香酸（Ｌ）を樹脂に一晩、カップリングした。分子をＴＦＡ、ＴＥＳおよび再蒸留水（９５：２．５：２．５）のカクテルを用いて樹脂から切断し、冷エーテルで沈殿させ、凍結乾燥した。粗固体をさらなる合成に用いた。ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−ＨＬの構造については図３４を参照されたい。

ビオチン−ＰＥＧ２−アジドリジン−ＬＺｎ_２（ＯＡｃ）（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ）の調製（図３４の構造３）：亜鉛酢酸塩２当量をメタノールに溶解させ、１当量のビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−ＨＬに加え、室温にて一晩、撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、固体を水およびアセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの勾配を使ってＣ_１８逆相半分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μｍ、２５０×１０ｍｍ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ １２６ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅおよび１６８ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）にて精製した。ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌの構造については、図３４を参照されたい。

計算質量：［Ｍ］．２Ｈ_２Ｏ １３６９．５ 観測質量：［Ｍ］．２Ｈ_２Ｏ １３６９．４

標的ペプチド配列（ｐ３２量体）の合成：３２量体標的ペプチド配列、Ａｋｔの２アミノ酸４５０〜４８１をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上で、Ｔｉｔａｎ ３５７ペプチド合成装置を用いて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＰＯ_３Ｂｚｌ）−ＯＨ（Ａａｐｐｔｅｃ）をホスホセリンの固相合成に用いた。これをＴＦＡにて切断し、冷エーテルにて沈殿させ、水およびアセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの勾配を使ってＲＰ−ＨＰＬＣにて精製した。

計算質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋３８３２。観測質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋３８３１．０

モノリガンドの合成：Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ２−ＣＯＯＨ（ＥＭＤ）を、標準Ｆｍｏｃプロトコールを用いてＢｉｏｔｉｎ Ｎｏｖａｔａｇ樹脂上でカップリングした。１．５当量のＤＬ Ｆｍｏｃ−アジドリジンを樹脂上でカップリングし、引き続き、無水酢酸およびＤＭＦ中の２，６−ルチジン溶液を用いてアシル化した。オンビーズクリック反応を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中の２当量のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯｔＢｕ、０．９当量ＣｕＩおよび１．２当量のアスコルビン酸を用いて、一晩実施する。銅キレート溶液（ＤＭＦ中の５％ナトリウムジエチルジチオカルバメート、５％ＤＩＥＡ）で洗浄した後、ペプチドをアシル化した。結果として得られた分子Ａｃ２−Ｔｚ４−ＰＥＧ２−ビオチンを、ＴＦＡ切断カクテルを用いて樹脂から切断した。粗固体をさらなる合成に用いた。

ペプチドｗｋｖｋｌ（配列番号：４）をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（Ａｎａｓｐｅｃ）上にて標準Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ合成プロトコールに従い作製した。次に、１当量のＡｃ２−Ｔｚ４−ＰＥＧ２−ビオチンをペプチドにカップリングした。

ＴＦＡ切断の後、モノリガンドを水およびアセトニトリルおよび０．１５ＴＦＡの勾配を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにて精製した。

計算質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋１４９５．８５。観測質量：［Ｍ＋Ｈ］^＋１４９６．０

モノリガンド（エピトープ標的スクリーン）検出のためのスクリーニング手順：ｐ３２量体の１０ｎＭおよび５０ｎＭ溶液を、０．５ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯストック ２５ｍＭのトリス塩酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ中、ｐＨ８）（ＴＢＳ）溶液で希釈することによって作製した。金属キレートされたアンカー（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ）の２０μＭおよび１００μＭの溶液をｐ３２量体の１０ｎＭおよび５０ｎＭ溶液にそれぞれ加え、室温にて一晩振盪した。ＯＢＯＣライブラリに加える前に、ＢＳＡおよびツイーン２０を溶液に加えて、緩衝液中の最終濃度を０．１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０とした。

アンカーペプチドスクリーンを、ライブラリＡを用いて実施した。２５０ｍｇのビーズを１つのスクリーンにつきスクリーニングした。ビーズを０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＴＢＳ（結合緩衝液）で１０時間、振盪することで平衡化した。

プレインキュベートされたｐ３２量体−ビオチン−ＰＥＧ_２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ混合液を前もって膨潤したビーズに加え、室温にて一晩、振盪した。ビーズを緩衝液にて３回洗浄した。緩衝液で１：１０，０００に希釈されたマウス抗ビオチンモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）をビーズに加えた。その後、ビーズを結合緩衝液、０．０５％ツイーン２０／ＴＢＳおよびＴＢＳにて十分に洗浄した。

ビーズをその後、ＢＣＩＰ溶液（製造業者のプロトコールに準じて作製）にて処理した。ヒットしたビーズは、アルカリホスファターゼとＢＣＩＰとの比色反応により青色に変化した。反応を１時間後に０．１ＮのＨＣｌ溶液にてクエンチした。ヒットしたビーズをピペットチップで拾い上げスピンネックス（ｓｐｉｎｎｅｘ）チューブに移した。

ヒットしたビーズの色をＤＭＦにて洗浄することで除去した。ビーズ上のタンパク質を７．５Ｍグアジニニウム（ｇｕａｄｉｎｉｎｉｕｍ）塩酸塩（ｐＨ２）で２時間、処理し、その後水にて十分に洗浄することにより剥離した。

ヒットしたビーズを結合緩衝液にて再平衡化した。ここでは２．５ｍＭのビオチンおよび１：１０，０００の希釈でのマウス抗ビオチンモノクローナル−アルカリホスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）のプレインキュベートされた混合液を二次抗体として用いて、全く同様のスクリーンプロトコールを繰り返した。ＢＣＩＰに加え、真のヒットは、ビオチンとの競合に起因してクリアのままであった。クリアビーズを手動で拾い上げ、７．５Ｍグアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ）塩酸塩（ｐＨ２）および水にて洗浄し、Ｅｄｍａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて配列を決定した。

ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌのリン酸化アミノ酸およびリン酸化ペプチドへの結合の検証：４２２μＭのビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ溶液を、ＨＰＬＣで精製された固体を１０ｍＭトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて作製した。

純ホスホセリンおよびｐＳｒｃ基質Ａｃ−Ｉ−ｐＹ−ＧＥＦ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）の飽和溶液を１０ｍＭトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中で作製した。ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌをいずれかの飽和溶液中に１：１の比率で加えた。

新鮮なマトリックスを、５０％アセトニトリル（２０ｍｇ／ｍｌ）を有する２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンを１０ｍＭトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させることによって調製した。マトリックスとの混合溶液は、陽性モードでＭａｌｄｉ ＴＯＦスペクトルにおいて（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ−ｐＳｅｒ）および（ビオチン−ＰＥＧ２−Ａｚ４−Ｚｎ_２Ｌ−Ａｃ−Ｉ−ｐＹ−ＧＥＦ）に相当するピークを示した。

バイリガンドに対するエピトープ標的アッセイ：１．２５μＭビオチン化バイリガンドを緩衝液（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１ｍＭストックを希釈することにより調製した。調製されたリガンド溶液またはＤＭＳＯ緩衝液（緩衝液対照）をＳＡプレート上に固定化した。過剰なリガンドを洗い流した後、Ｈｉｓタグ化されたリン酸化ペプチドエピトープＡｋｔ２アミノ酸４５０〜４８１またはＨｉｓタグ化された対照ペプチドＡｋｔ２アミノ酸３４６〜３７８の２．５μＭ溶液を各ウェルに加えた。緩衝液で３回洗浄した後、プレートを１：１０００の希釈での抗Ｈｉｓ６マウスモノクローナル抗体で１時間、処理した。結合緩衝液で１：１０，０００に希釈されたヤギ抗マウス抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ａｂｃａｍ）をウェルに加えた。各ウェルにＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を加えることによって発色させた。反応を０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４にてクエンチした。Ａ４５０を９６ウェルプレートリーダーで測定した。正味のＡ４５０は、リガンド−エピトープ相互作用について得られた３つの値のそれぞれから非固定化リガンドの吸光度値を差し引いくことによって得た。
［実施例６］

Ａｋｔのプレックストリン相同ドメイン上の単一（癌原因）アミノ酸置換のターゲティング。

Ａｋｔ１は、細胞膜へのその局在が細胞における重要な下流のシグナル伝達経路を開始させることから、癌に関連して一般的に研究されているタンパク質である。Ａｋｔ１タンパク質は、細胞膜に結合する多数のタンパク質にうち、高度に構造的に保存されているドメイン−プレックストリン相同ドメイン（ＰＨＤ）−を通して、細胞膜にドッキングする。

ある特定のヒト卵巣癌、結腸直腸癌および乳癌において見出される、このＡｋｔ１ ＰＨＤの結合ポケット中の単一アミノ酸の点突然変異は、マウスにおいて癌を引き起こすのに十分であることが最近発見された。Ｅ１７Ｋ突然変異により、負電荷のグルタミン酸が正電荷のリジンで変換される。この変化によって、第１に、ドッキングしなかったＡｋｔ１ ＰＨＤの結合ポケット内のＧｌｕ−Ｌｙｓ水素結合が除去される；Ｅ１７Ｋリジンは第２の水素結合に反発し、タンパク質における構造変化の原因となる。第２に、このＥ１７Ｋ残基が、細胞膜上のＰＩＰ３脂質と、水分子と、Ａｋｔ１ ＰＨＤとの間に追加の水素結合を形成する−ＰＩＰ３に対するＰＨＤの親和性を増加させるか、またはＰＩＰ３に対するオフレートを減少させる。いずれの場合でも、この単一点突然変異は、Ｅ１７Ｋ Ａｋｔ１が細胞膜に４倍の強さで結合するのに十分であり、Ａｋｔ１／ＰＩＰ３シグナル伝達経路のこの上方制御は、マウスにおいて癌を引き起こすのに十分である。

治療の観点からみると、癌においてこのＰＩＰ３／Ａｋｔ１結合をブロックすることは、ヒトにおけるこれらの癌細胞の増殖を遅延または停止させるのを助ける可能性があり、潜在的な化学療法の役割を果たす。特異的Ｅ１７Ｋ点突然変異をターゲティングすることで、副作用および毒性を最小限にする可能性がある。診断の観点からは、Ａｋｔ１のＥ１７Ｋ ＰＨＤを選択的に認識することのできる捕捉剤は有用であると思われる。

従って、本発明者らは、本発明を実施化のために、野生型には結合せずに、Ａｋｔ１のＥ１７Ｋ ＰＨＤに選択的に結合することのできる捕捉剤の開発を目的とする。

実験手順
ペプチドライブラリ構築：ペプチドライブラリを９０ｕＭ ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ_２ビーズ（０．２９ｍｍｏｌ／ｇ、２．８６×１０^６ビーズ／ｇ）を用いてＴｉｔａｎ ３５７ ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｍｉｘ自動ペプチド合成装置（Ａａｐｐｔｅｃ）上で標準ＦＭＯＣ ＳＰＰＳカップリングケミストリー［１］を介して合成した。ライブラリは、ｉｎ ｓｉｔｕクリックハンドル中の５つの無作為化された位置およびアジドのそれぞれで、システインおよびメチオニンを除いて１８個の天然アミノ酸のＤ−立体異性体を含有する。ライブラリを合成する際には、各配列のオーバーサンプリングを確実にするために、少なくとも５倍過剰なビーズを用いる。アミノ酸側鎖をＴＦＡに不安定な保護基で保護し、保護基をライブラリ合成の後に全て一度に除去する。

バルクペプチドの合成：ポリペプチド配列のバルク合成を、標準ＦＭＯＣ ＳＰＰＳペプチドケミストリーを用いて、手動で、またはＴｉｔａｎ ３５７自動ペプチド合成装置（ＡＡＰＰＴＥＣ）で、またはＬｉｂｅｒｔｙ １マイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。典型的なスケールとして、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎビーズ（Ａｎａｓｐｅｃ）上で、３００ｍｇで実施した。ペプチドを９５：５：５の比率のＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＥＳを用いて、脱保護された側鎖を有するビーズから切断した。ペプチドを逆相Ｃ１８カラム付きのプレップ−スケールＤｉｏｎｅｘ Ｕ３０００ ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製した。

Ａｋｔ１野生型およびＥ１７Ｋ突然変異プレックストリン相同ドメインの発現：Ａｋｔ１プレックストリン相同ドメインＤＮＡをＤＮＡ２．０から購入した。完全長Ａｋｔ１からの最初の１２４Ｎ末端アミノ酸をＰＨドメインＤＮＡとして用い（図３９ａ）、トロンビン切断部位によって分離された６−ｈｉｓタグをタンパク質のＣ末端に精製のために加えた。ＰＨドメインのＥ１７Ｋ突然変異体を作製するために、１７位のグルタミン酸を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅを介してリジンに突然変異させた。ＤＮＡを、ａｍｐ耐性遺伝子を含有するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ ４１４ベクターで合成して、ｅ ｃｏｌｉ細胞中で発現させた。タンパク質発現は標準バクテリア発現プロトコールを用いて、カリフォルニア工科大学タンパク質発現センターで実施され、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを介して精製した。

エピトープターゲティングアンカー／標的配列のデザイン：Ａｋｔ１のＰＨドメインの点突然変異に対するエピトープターゲティングを、図３９ａに強調表示されているＰＨドメインのＮ末端由来の３３量体ペプチド断片に対してスクリーニングすることで完遂した。ここで３３量体ペプチド断片は、Ｅ１７Ｋ点突然変異、ならびに突然変異部位の近傍にｉｎ−ｓｉｔｕクリック反応を導くためのプロパルギルグリシン（Ｐｒａ）クリック−ハンドル置換（Ｉ１９［Ｐｒａ］）を含有した。３３量体断片を、スクリーンにおいて検出するために、Ｎ末端ビオチンラベルでキャッピングし（図３９ｂ）、逆相Ｃ４カラム付きのプレップ−スケールＤｉｏｎｅｘ Ｕ３０００ ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製した。

エピトープを標的とした捕捉剤のためのスクリーン（図４０）：スクリーンは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ配列決定のために、Ｃ末端において１００％Ｍｅｔでカップリングしたライブラリ上でなされた。ライブラリは、安定性の理由からＭｅｔおよびＣｙｓを除いた１８個の非天然Ｄ−アミノ酸を含有する包括的５量体であった。標的３３量体上のＰｒａとのｉｎ ｖｉｖｏクリックのためにＮ末端は種々の炭素鎖長を有するアジドクリックハンドルを含有した−２個の炭素、４個の炭素および８個の炭素−。スクリーンは、少なくとも６時間、１ｘ ＴＢＳ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ＝７．５）緩衝液中で膨潤した３００ｍｇの乾燥ライブラリビーズでなされた。

プレクリア（図４０ａ）：膨潤したライブラリビーズを１ｘ ＴＢＳ中の５％ｗ／ｖ乾燥無脂肪ミルクでブロックし、次に１ｘ ＴＢＳにて３回洗浄した。ＴＢＳ中の０．５％ミルクで１：１０，０００に希釈された５ミリリットルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体をビーズに加え、室温にて１時間、振盪しながらインキュベートした。ビーズを高塩濃度ＴＢＳ緩衝液（７５０ｍＭのＮａＣｌを有する１ｘ ＴＢＳ）にて３回洗浄し、次に、高塩濃度緩衝液中で１時間、振盪した。ビーズを次に、ＢＣＩＰ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ＝９．０）にて３回洗浄し、１５ｍＬのＢＣＩＰ緩衝液、１３ｕＬのＢＣＩＰおよび２６ｕＬのＮＢＴを加えることによって展開した。１時間後、紫色ビーズをピペットで除去し廃棄した。残りのビーズをＮＭＰにて４時間インキュベートして、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応物から微量の紫色析出物を除去し、その後、メタノールにて５回、水にて５回、ＴＢＳにて５回洗浄し、５％ミルクで一晩、再ブロックした。

生成物スクリーン（図４０ｂ）：プレクリアから残っているビーズを１ｘ ＴＢＳにて３回洗浄し、その後、０．５％ミルクで１００ｎＭに希釈された３３量体標的５ｍＬと５時間または１２時間、インキュベートして、ｉｎ ｓｉｔｕクリック反応を起こした。ビーズをその後、１ｘ ＴＢＳにて３回洗浄し、７Ｍグアナジン（Ｇｕａｎａｄｉｎｅ）ＨＣｌ緩衝液と、ｐＨ＝２．０にて１時間インキュベートして、ビーズに共有結合で結合していない全ての３３量体標的を除去した。これらのビーズをその後、１ｘ ＴＢＳにて１０回洗浄し、５％ミルクで２時間、再ブロックし、その後、ビーズにクリックした３３量体標的の存在を検出するために、ＴＢＳ中の０．５％ミルクで１：１０，０００に希釈されたストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体と１時間インキュベートした。ビーズを高塩濃度ＴＢＳ緩衝液にて３回洗浄し、次に、高塩濃度緩衝液中にて１時間、振盪した。その後、ビーズを再度、ＢＣＩＰ緩衝液にて３回洗浄し、プレクリア毎に展開した。紫色ビーズをヒットしたビーズとしてピペットを介してスクリーンから除去する。これらのヒットをグアニジンＨＣｌ緩衝液でインキュベートして、結合しているストレプトアビジンを除去し、水にて１０回洗浄し、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｏｃｉｓｅ ＣＬＣシステム上にてエドマン分解を介して配列を決定した。５時間スクリーンからの配列については表１を、１６時間スクリーンからの配列については表２を参照されたい。

配列の分析：ヒットした配列を、ペプチド分析アルゴリズムである、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、シアトル、ワシントン州により開発されたＣｌｕｓｔｅｒ Ｌｉｇａｎｄ ｖ１．０、を介して分析した。アルゴリズムを用いて、疎水性および配列相同性を介して一連のペプチドを分析し、２Ｄ配列マップでそれらをグラフにする。ヒットのクラスターは丸で囲み（図４１）、各クラスターからの１つのペプチドをスケールアップし、野生型および突然変異ＰＨドメインの両方への結合について試験した。スケールアップのために選ばれたリガンドは：ｄｑｎｔｒ、ｙｐｗｖｅ、ｅｅｆｅｆ、ｙｌｅａｆおよびｅｌｎｈｙであった。これらの配列を既知のＡｋｔ ＰＨドメイン結合ペプチド、ＡＶＴＤＨＰＤＲＷＡＷＥＫＦ［２］と比較した。

ストレプトアビジン−結合選択性についてのアガロースプルダウンアッセイ：プルダウンアッセイをＮｏｖａｃｈｅｍのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ樹脂上で実施した。樹脂を、ＣｌｕｓｔｅｒＬｉｇａｎｄ配列分析を介して同定されたＮ末端ビオチン化アンカーペプチド候補とインキュベートした。アンカー候補で被覆されたビーズをその後、リガンドの選択性ならびに結合能を比較するために野生型および突然変異タンパク質の両方とインキュベートした。

アッセイは、Ｓｐｉｎ−Ｘチューブ内で５０ｕＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅスラリー（２５ｕＬ樹脂）にてなされた。樹脂を１４本のチューブに分注し−２つの異なるタンパク質に対して試験された６つのリガンドおよび１つのブランク、その後、０．２５％ＩＰＥＧＡＬ界面活性剤を加えた１ｘ ＴＢＳにて３回洗浄した。チューブの各セットを２００ｕＬの１ｘ ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のＩＰＥＧＡＬ、５ｍＭのＥＤＴＡ）またはブランクとしてプレーンな緩衝液中の１７０ｎｍｏｌの適切なビオチン化リガンドとインキュベートした。リガンド結合は、室温にて１時間、なされ、その後、樹脂を１ｘ ＨＥＰＥＳにて３回洗浄した。樹脂を、５％ＢＳＡを有する１ｘ ＨＥＰＥＳにて２時間、ブロックした。アンカー被覆樹脂をその後、野生型または突然変異体が発現されたＰＨドメインタンパク質のいずれかと冷所（４℃）にて一晩（約１６時間）インキュベートした。タンパク質をチューブからスピンアウトし、樹脂を高塩濃度ＴＢＳにて３回洗浄し、その後、高塩濃度緩衝液中で５分間インキュベートした。樹脂をその後、１ｘ ＴＢＳ緩衝液にて３回洗浄し、スピンアウトして完全に乾燥させた。１０％Ｂ−メルカプトエタノールを有する５０ｕＬの変性ＳＤＳゲル剤ローディング緩衝液を試料に加え、試料を９５℃にて１０分間インキュベートして変性させた。ゲルローディング緩衝液をＳｐｉｎ−Ｘチューブからスピンアウトし、試料を変性条件で、Ａｎｙ ＫＤ ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｍａｄｅ Ｇｅｌ上に流した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、ウェスタンブロットを行った［３］。タンパク質をウサギポリクローナル抗Ａｋｔ１抗体（ａｂ６４１４８、Ａｂｃａｍ）および抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体を用いて検出し、次いでＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で展開した。

相対的タンパク質バンドサイズを分析して、アンカー候補間の結合を比較し、野生型または突然変異ＰＨドメインに対する選択性を決定するために用いた（図４２）。これらのアッセイから、ｅｅｆｅｆは野生型タンパク質のプルダウンのみを示し、突然変異タンパク質に関して最も少ないプルダウンを示したことから、ｅｅｆｅｆが野生型ＰＨドメイン対する選択性を有する捕捉剤として同定された。突然変異タンパク質に関しては、ｙｌｅａｆは突然変異体への最高結合を示し、野生型への最も少ない結合を示したことから、ｙｌｅａｆが選ばれた。これらのリガンドは、先行技術で既知の手順を用いた手順を用いてさらに改善することができる。

［実施例７］

マイクロＰＥＴ／ＣＴ画像化および生体内分布分析：
ＤＯＴＡラベルＡＫＴを^６４Ｃｕでラベリングし、１００μｇＩ．Ｖ．尾静脈注射またはＩＰ注射により投与する。全身の画像化をマイクロＰＥＴスキャナーで２時間の動的走査、引き続きマイクロＣＴ画像化により実施する。１０分の静的マイクロＰＥＴスキャンもまた、４時間目および６時間目に実施する。種々の臓器におけるラベル捕捉剤の生体内分布（例えば、膀胱、腎臓、胆嚢、肝臓、脳および血液）を分析して、クリアランスおよび蓄積を評価する。他のラベル（１８−Ｆ、６８−Ｇａ、８９−Ｚｒ、１２４−Ｉ、８６−Ｙ、９４ｍ−Ｔｃ、１１０ｍ−Ｉｎ、１１−Ｃ、７６−Ｂｒ）も企図される。

上述のとおり、上記は、本発明の種々の実施形態を単に解説しようと意図するものに過ぎない。そのようなものとして、上記の具体的な改変形態は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。当業者には本発明の範囲から逸脱することなしに種々の均等物、変更および改変を行うことができることは明白であり、そのような均等の実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用されている全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されたものとして参照により組み入れられている。
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Claims (28)

1. Ａｋｔに特異的に結合する安定な合成トリリガンド捕捉剤であって、前記捕捉剤はアンカーリガンド、二次リガンドおよび三次リガンドを含み、前記捕捉剤はＡｋｔの非ＡＴＰおよび非ペプチド基質結合部位に結合し、前記捕捉剤の前記結合部位への結合はＡｋｔ活性をアロステリックに阻害する捕捉剤。
2. 前記アンカーリガンドがペプチド配列Ａｚ８−ＶＦＹＲＬＧＹ−ＣＯＮＨ_２を含む請求項１に記載の捕捉剤。
3. 前記二次リガンドがペプチド配列Ｐｒａ−ＦＷＦＬＲＧ−ＣＯＮＨ_２を含む請求項１に記載の捕捉剤。
4. 前記三次リガンドがペプチド配列Ａｃ−Ｃ８−ＲＨＥＲＩ−ＣＯＮＨ_２を含む請求項１に記載の捕捉剤。
5. 構造：
   

   

   を有する請求項１に記載の捕捉剤。
6. アンカーリガンド、二次リガンドおよび三次リガンドの１つ以上の間のリンケージが１，４−置換１，２，３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を含む請求項１に記載の捕捉剤。
7. 生体試料中のＡｋｔを検出するための検出剤としての請求項１に記載の捕捉剤の使用。
8. イムノアッセイを用いて生体試料中のＡｋｔを検出する方法であって、前記イムノアッセイは請求項１に記載の捕捉剤を利用し、前記イムノアッセイにおいて前記捕捉剤は抗体またはその同等物の置き換えである方法。
9. 前記イムノアッセイがウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロットおよびＥＬＩＳＡの群から選択される請求項８に記載の方法。
10. 必要な対象者においてＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する癌を治療する方法であって、請求項１に記載の捕捉剤の治療有効量を投与することを含む方法。
11. 対象者においてＡｋｔ活性を阻害する方法であって、請求項１に記載の捕捉剤を前記対象者に投与することを含む方法。
12. 前記捕捉剤の投与がＡｋｔ活性を阻害する請求項１１に記載の方法。
13. 前記捕捉剤の投与が活性Ａｋｔのレベルを減少させる請求項１２に記載の方法。
14. 必要な対象者においてＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する癌を画像化する方法であって、請求項１に記載の捕捉剤の有効量を投与することを含む方法。
15. 必要な対象者においてＡｋｔ発現および／または活性の増加に関連する病態を治療する方法であって、請求項１に記載のＡｋｔ捕捉剤を前記対象者に投与することを含む方法。
16. 標的タンパク質に対する捕捉剤を生成する方法であって：
    （ａ）アンカーリガンドを以下の工程により同定すること：
    （ｉ）前記標的タンパク質を１つ以上の標的タンパク質阻害薬に接触させる工程；
    （ｉｉ）前記標的タンパク質に対するアンカーリガンドを選択するために第１の複数の候補ペプチドを調製する工程；
    （ｉｉｉ）前記標的タンパク質を前記第１の複数の候補ペプチドに接触させる工程；
    （ｉｖ）前記標的タンパク質に対する親和性を有する候補ペプチドを前記アンカーリガンドとして選択する工程であって、前記候補ペプチドは前記標的タンパク質に活性部位外で結合する工程；および
    （ｖ）前記アンカーリガンドの配列を決定する工程；
    （ｂ）二次リガンドを以下の工程により同定すること：
    （ｉ）アンカーリガンドおよびアジド基またはアルキニル基を含むアンカーリガンド選択ブロックを調製する工程；
    （ｉｉ）前記標的タンパク質に対する二次リガンドを選択するために第２の複数の候補ペプチドを調製する工程であって、前記アンカーリガンド選択ブロックがアルキニル基およびアジド基をそれぞれ含む場合、前記第２の複数のペプチドは、アジド基またはアルキニル基を含む工程；
    （ｉｉｉ）前記アンカーリガンド選択ブロックおよび前記第２の複数のペプチドを前記標的タンパク質に接触させる工程；
    （ｉｖ）前記アンカーリガンド選択ブロックと前記二次リガンドとの間に２基置換１，２，３−トリアゾールリンケージを形成することにより捕捉剤バイリガンドを提供する工程であって、前記アンカーリガンド選択ブロックの前記アジド基およびアルキニル基ならびに前記二次リガンドは前記標的タンパク質に結合することによって近接状態にされる、工程；
    （ｖ）前記標的タンパク質と親和性を有する前記捕捉剤バイリガンドを選択する工程；および
    （ｖｉ）前記二次リガンドの配列を決定する工程；
    （ｃ）三次リガンドおよび選択的に追加のリガンドを以下の工程により同定すること：
    （ｉ）アジド基またはアルキニル基を含むバイリガンド選択ブロックを調製する工程；および
    （ｉｉ）前記標的タンパク質に対する所望の結合親和性を有する捕捉剤が得られるまで工程（ｂ）（ｉｉ）から（ｂ）（ｖｉ）までを第３、第４などの複数の候補ペプチドを用いて反復する工程
    を含む方法。
17. 前記標的タンパク質がキナーゼである請求項１６に記載の方法。
18. 前記キナーゼがＡｋｔである請求項１７に記載の方法。
19. 前記活性部位がＡＴＰまたは基質ペプチド結合部位である請求項１６に記載の方法。
20. 第１のリガンドと第２のリガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応の効率および選択性を評価する方法であって：
    （ａ）可溶性のビオチン化された第１のリガンドとオンビーズ第２のリガンドとの間のｉｎ ｓｉｔｕクリック反応を実施すること；
    （ｂ）残り全ての第１のリガンドが前記第２のリガンドに結合してリガンド複合体を形成するように、非結合第１のリガンドを除去すること；
    （ｃ）前記リガンド複合体をストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドＱＰＣＲテンプレートに接触させること；
    （ｄ）前記リガンド複合体−ＱＰＣＲテンプレートをＱＰＣＲに供すること；および
    （ｅ）前記ＱＰＣＲ反応のサイクル閾値を決定すること
    を含む方法。
21. 前記第１のリガンドがアンカーリガンドであり、前記第２のリガンドが二次リガンドである請求項２０に記載の方法。
22. 前記第１のリガンドがバイリガンドであり、前記第２のリガンドが三次リガンドである請求項２０に記載の方法。
23. 凍結乾燥粉末としての貯蔵において安定である請求項１に記載の捕捉剤。
24. 約−８０℃〜約４０℃の温度での貯蔵において安定である請求項１に記載の捕捉剤。
25. 室温での貯蔵において安定である請求項１に記載の捕捉剤。
26. 血清中で少なくとも２４時間安定である請求項１に記載の捕捉剤。
27. 約３〜約８の範囲のｐＨで安定である請求項１に記載の捕捉剤。
28. ^６４Ｃｕ ＤＯＴＡ、^６８Ｇａ ＤＯＴＡ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、^１２４Ｉ、^８６Ｙ、^９４ｍＴｃ、^１１０ｍＩｎ、^１１Ｃまたは^７６Ｂｒでラベリングされる請求項１に記載の捕捉剤。
    

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