JP2014520769A - 皮膚科学的に活性の酵母抽出物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、新規の皮膚科学的に活性の薬剤、皮膚の老化等の作用を緩和する皮膚へのその適用、並びに上記薬剤を製造する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、酵母細胞の前培養を用意するステップと、ｐＨ１．８〜４で少なくとも１５分間細胞を培養するステップと、細胞を回収するステップと、細胞を溶解するステップとを含む、皮膚科学的に活性の酵母抽出物を製造する方法、並びにこれにより製造された酵母抽出物、及び酵母抽出物を含む製品を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚科学的に活性の酵母抽出物を製造する方法であって、酵母細胞の前培養を用意するステップと、ｐＨ１．８〜４で少なくとも１５分間細胞を培養するステップと、細胞を回収するステップと、細胞を溶解するステップとを含む方法、並びにそれによって得られる酵母抽出物、及び前記酵母抽出物を含む製品に関する。

皮膚は、ヒトの身体の最も大きな器官である。例えば、熱制御機能や、感覚器官としてのその多くの機能の中でも、皮膚の（従って、最終的に全身体の）乾燥を防止するそのバリア機能が間違いなく最も重要であろう。同時に、皮膚は、外部からの物質の浸透及び吸収からの防御装置として作用する。このバリア機能は、表皮によってもたらされるが、表皮は、最も外側の層として、環境に対する実際の保護被覆を形成する。合計厚さの約１／１０で、皮膚の最も薄い層でもある。表皮は、層状の組織であり、外側の層である、角質層（上皮角質層）は、バリア機能にとって重要な部分である。

美容スキンケアは、主に、環境因子（例えば、汚れ、化学薬品、微生物）からの、及び内生物質（例えば、水、天然脂肪、電解質）の喪失からのバリアとしての皮膚の天然の機能を補強若しくは修復するものとして理解すべきである。この機能が乱れると、毒性若しくはアレルギー性物質の吸収、又は微生物による攻撃が増加し、その結果、毒性若しくはアレルギー性の皮膚反応が起こりうる。

スキンケアの目的は、毎日の洗浄によって起こる皮膚からの脂肪及び水の喪失を補うことでもある。これは、自然の再生能力が不十分である場合、特に重要である。さらに、スキンケア製品は、環境因子、特に、日光及び風から保護すると共に、皮膚の老化を遅延させなければならない。

疲れた皮膚、特に老化した皮膚のケアのための製品はそれ自体で公知である。これらは、例えば、レチノイド（ビタミンＡ酸及び／若しくはその誘導体）又はビタミンＡ及び／若しくはその誘導体を含む。しかし、構造的損傷に対するそれらの作用は、その程度が限られている。さらに、製品開発において、酸化分解に対して、活性物質を安定化させることは、かなりの困難が生じる。さらに、ビタミンＡ酸を含有する製品の使用は、往々にして、重症の紅斑性皮膚刺激を引き起こす。疲れた皮膚はまた、往々にして、過体重になる傾向及び／又はいわゆるセルライトも伴い、これらと関連することが多い。消費者の身体意識は、近年確実に高まっている。洗浄及びケアの用途に加えて、体形を改善するための手段もますます講じられている。広範に見られる現象であるセルライトは、そこで中心的位置を占めている。目に見えるセルライトの状態は、皮下脂肪層の増大、結合組織の弱さ、並びに血液及びリンパ系における還流状態の低下によるものである。従って、その原因は、結合組織の部分的な体質的衰弱であり、これに伴い、過体重、栄養の偏り、及び運動不足の結果として、肥大した脂肪細胞コンパートメントが同時に発生する。また、セルライトの発生は、毛管壁の浸透性の増大に起因する可能性もあり、これによって、結合組織に水が浸透する。

こうした背景に対して、皮膚への使用が、前述した悪影響の緩和、又は少なくとも遅延をもたらす、すなわち、具体的には、皮膚に引き締め及び強化作用をもたらす薬剤に対する需要が高まっている。遺伝子工学技術に関して消費者が不安を抱いている背景に対して、純粋に生物学的で、特に、遺伝子工学技術及び／又は対応する生物を使用せずに製造することができるものとして、厳格な基準に従うとみなすことができる対応薬剤が特に求められている。

国際公開第２０１００８７５０３号は、コハク酸塩を製造するための、ヤロウィア（Yarrowia)の生物工学的使用を記載しているが、皮膚科学的に活性の薬剤のためのヤロウィア（Yarrowia)抽出物の使用については教示していない。

本発明が解決しようとする課題は、新規の皮膚科学的に活性の薬剤、前述の作用を緩和する皮膚へのその適用、並びに上記薬剤を製造する方法を提供することである。さらに、本発明が解決しようとする課題の１つは、厳格な基準に従って、純粋に生物学的である皮膚科学的に活性の薬剤、すなわち、具体的には、遺伝子工学技術又は遺伝子改変した生物を用いずに製造されるものを開発することである。本発明が解決しようとする別の問題は、再生可能な原料から製造することができる皮膚科学的に活性の薬剤を開発することである。

これらの及び別の課題は、本発明の目的、また、特に、添付の独立した請求項の目的によって解決される。尚、実施形態は、従属した請求項に従う。

本発明によれば、第１の態様において、ａ）酵母細胞の前培養を用意するステップと、ｃ）ｐＨ１．８〜４で少なくとも１５分間細胞を培養するステップと、ｄ）細胞を回収するステップと、ｅ）細胞を溶解するステップとを含む、皮膚科学的に活性の酵母抽出物を製造する方法によって、課題を解決する。

第１の態様の第１実施形態では、本方法は、ｂ）３４〜３９℃の温度及びｐＨ＞５で、少なくとも１時間細胞を培養するステップをさらに含む。

第１の態様の第２実施形態（第１実施形態の実施形態でもある）では、ステップｅ）は、水性溶解剤を用いて、実施する。

第１の態様の第３実施形態（第１及び第２実施形態の実施形態でもある）では、ステップｂ）を先に実施した後、ステップｃ）を実施する。

第１の態様の第４実施形態（第１〜第３実施形態の実施形態でもある）では、ステップｃ）は、３４〜３９℃の温度で実施する。

第１の態様の第５実施形態（第１〜第４実施形態の実施形態でもある）では、ステップｂ）を、３〜５時間継続する。

第１の態様の第６実施形態（第１〜第５実施形態の実施形態でもある）では、ステップｃ）を、４５〜７５分間継続する。

第１の態様の第７実施形態（第１〜第６実施形態の実施形態でもある）では、ステップｂ）及びｃ）は、３６〜３８℃の温度で実施する。

第１の態様の第８実施形態（第１〜第７実施形態の実施形態でもある）では、ステップｃ）は、ｐＨ１．９〜２．２で実施する。

第１の態様の第９実施形態（第１〜第８実施形態の実施形態でもある）では、酵母細胞は、ヤロウィア（Yarrowia)、サッカロミセス（Saccharomyces）及びピキア（Pichia）を含む属の群からの酵母細胞であり、好ましくはヤロウィア（Yarrowia)属である。

第１の態様の第１０実施形態（第１〜第９実施形態の実施形態でもある）では、ステップｂ）は、３６〜３８℃の温度で３〜５時間実施し、ステップｃ）は、ｐＨ１．９〜２．２、３６〜３８℃の温度で４５〜７５分間実施し、また、用いる酵母細胞は、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞である。

本発明によれば、第２の態様では、第１の態様、又は第１の態様の実施形態の１つに従って製造した酵母抽出物によって、課題を解決する。

本発明によれば、第３の態様では、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞由来の酵母抽出物、又は本発明の第２の態様の酵母抽出物を含む、皮膚科学的に活性の薬剤によって、課題を解決する。

第３の態様の第１実施形態では、皮膚科学的に活性の薬剤は、皮膚及び／又は組織引き締め作用を有する。

本発明によれば、第４の態様では、第２の態様の酵母抽出物を含む栄養補助食品によって、課題を解決する。

第３の態様の第２実施形態では、皮膚科学的に活性の薬剤は、第３の態様又はその実施形態の１つに従い、又は第４の態様の栄養補助食品を含み、酵母抽出物中のタンパク質の割合は、０．５〜５０ｍｇ／Ｌである。

本発明によれば、第５の態様では、第２の態様の酵母抽出物、又は第３の態様若しくは第３の態様の実施形態の１つの皮膚科学的に活性の薬剤の局所適用を含む、皮膚及び／又は髪の美容トリートメント方法によって、課題を解決する。

本発明によれば、第６の態様では、医薬品を製造するための本発明の第２の態様の酵母抽出物によって、課題を解決する。

本発明によれば、第７の態様では、脂肪蓄積、糖尿病、アテローム性動脈硬化、炎症性疾患、若しくは心臓血管病に対する医薬品又は創傷治療用の医薬品を製造するための本発明の第２の態様の酵母抽出物によって、課題を解決する。

本発明によれば、第８の態様では、角化細胞、線維芽細胞及び／又は脂肪細胞の増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激のために本発明の第２の態様の酵母抽出物を用いることによって、課題を解決する。

本発明は、別の酵母株及び条件を用いることにより、従来の製品に比べ、皮膚科学的に、より活性の製品の製造が可能になるという、本発明者らの意外な発見に基づく。特に、本発明者らは、ヤロウィア（Yarrowia)属の株に基づく酵母抽出物が、驚くことに、特に有効であると判明されることをみいだした。本発明者らは、さらに、酵母細胞全般、特にヤロウィア（Yarrowia)属の株の酵母細胞の低ｐＨの環境への暴露が、前記細胞から皮膚科学的に活性の薬剤を製造するための好適な処理であることもみいだした。またさらに、本発明者らは、驚くことに、こうした薬剤の皮膚科学的効果が、前記酵母細胞の低ｐＨの環境への暴露を、温度ストレスへの暴露と、好ましくは、温度ストレス、次にｐＨストレスの順で、組み合わせることによってさらに改善できることもみいだした。最後に、本発明者らは、皮膚モデルに前記酵母抽出物を適用すると、驚くことに、ｗｎｔシグナル伝達経路及びこれら細胞の細胞外マトリックスが調節されて、皮膚の生理に有利な様式で、これらの細胞に影響を与えることをみいだした。特定の理論に拘束される意図はないが、本発明者らは、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞は、疎水性で、高脂肪基質と特に良好に相互作用する細胞膜タンパク質を有し、及び／又はこれらの細胞は、皮膚細胞の代謝にプラスの影響をもたらす１つ以上のこれまで未確認の因子を含むことから、上記酵母細胞が、皮膚科学的に活性の抽出物を放出すると推定する。

本発明は、考えられるあらゆる方法で、特に温度、ｐＨ及び酸化ストレスにより、ストレスを受けたヤロウィア（Yarrowia)細胞由来の両抽出物を含む。本発明はさらに、極端なｐＨ、好ましくは低ｐＨによりストレスを受けたあらゆる属の酵母細胞も包含する。好ましい実施形態では、これらは、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）及びヤロウィア（Yarrowia)属の細胞であり、より好ましい実施形態では、これらは、ヤロウィア（Yarrowia)属、特にヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica)株の細胞である。

酵母細胞が、酸性環境、すなわち７未満のｐＨで増殖することは従来の技術から公知である。しかし、酵母細胞には限界もあり、ある特定のｐＨから、ストレス反応が発生するが、これは酸性培地と関連している。好ましい実施形態では、本明細書で用いる「ｐＨストレス」という用語は、酵母細胞が、その増殖に最適なｐＨを下回るｐＨに暴露されることを意味する。より好ましい実施形態では、このｐＨは、１．８〜４の範囲である。さらに好ましい実施形態では、ｐＨは、１．９〜２．２の範囲である。当業者には、ｐＨストレスをもたらすことができる方法及びプロトコルは周知であり、最も簡単な態様では、酸を添加することによって栄養培地を低下させるか、又は遠心分離により細胞を回収した後、対応するより酸性の培地に再懸濁させる。ｐＨストレス、特に、本発明の第１の態様に従うステップｃ）の形態でのストレスは、好ましい昇順に、少なくとも２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０若しくは１８０分継続するか、又は好ましい昇順に、２０〜１８０、３０〜９０、４５〜７５、若しくは５０〜７０分継続する。この間、ｐＨは、好ましい昇順に、５、４．５、４、３．５、３、２．５若しくは２．２未満であるか、又は好ましい順に、１．８〜５、１．８〜４、１．９〜３、１．９〜２．５、１．９〜２．２、１．９〜２．２、２〜２．８、２〜２．２であり、より好ましくは２である。

好ましい実施形態では、本明細書で用いる、細胞の「溶解」という用語は、細胞膜が透過性になり、通常は細胞内部に閉じ込められている因子が細胞から漏出することができるという意味で、細胞を破壊するのに好適な方法を意味する。当業者には、溶解の好適な方法は周知であり、例えば、超音波、又は市販の装置、又は低塩濃度緩衝の懸濁液若しくは蒸留水を用いる方法がある。

酵母細胞の溶解は、好ましくは、水性溶解剤を用いたｐＨストレス処理後に実施する。この用語は、本明細書で用いるように、好ましい実施形態では、溶解剤が、溶媒として主に水を含むことを意味する。以下に示すように、別の実施形態では、溶媒は、アルコール以外のものである。別の好ましい実施形態では、溶媒は、アルコール、特に好ましくは、プロパンジオールである。酵母抽出物は、それぞれ好ましい実施形態において、全溶解物又は溶媒抽出物である。

本発明者らは、驚くことに、温度ストレス及びｐＨストレスの組合せが、酵母抽出物の皮膚科学的作用に特に有利な影響をもたらすことをみいだした。特に好ましい実施形態では、本明細書で用いる「温度ストレス」という用語は、増殖に最適な温度を上回る温度での酵母細胞のインキュベーションを意味する。より好ましい実施形態において、この温度は、３３、３４、３５、３６、３７、３８若しくは３９℃超であるか、又は３４〜４２、３４〜３９、３５〜３８又は３６〜３８℃の範囲である。特に好ましい実施形態では、上記温度は、３７℃である。特に好ましい実施形態では、ｐＨストレス下の培地による酵母細胞の処理の直前に、温度ストレスによる処理を実施する。すなわち、酵母細胞に、温度ストレスから回復する機会を一切与えない。言い換えれば、本発明の第１の態様に従うステップｂ）の直後に、ステップｃ）を、例えば、ステップｂ）の培地に酸を添加することによって、実施する。特に好ましい実施形態では、ステップｃ）においてストレス発生温度を維持する。すなわち、ステップｃ）において、酵母細胞を温度及びｐＨストレスの組合せに暴露する。別の実施形態では、ステップｂ）及びｃ）はいずれの順で行ってもよい。別の好ましい実施形態では、ステップｂ）がまだ進行中に、ステップｃ）を実施する；任意選択で、ステップｂ）及びｃ）を一緒に開始する。

好ましい実施形態では、ステップｂ）を温度３７℃で３．５〜４．５時間実施して、ステップｃ）をｐＨ１．９〜２．１、温度３６〜３８℃で、４５〜７５分間実施し、その際、酵母細胞は、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞である。好ましい実施形態では、ステップｂ）を温度３５〜３９℃で２〜６時間実施して、ステップｃ）をｐＨ１．９〜２．１、温度３６〜３８℃で、４５〜７５分間実施し、その際、酵母細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica)属の酵母細胞である。

温度ストレスステップｂ）の継続時間は、細胞にとって不都合な改変された条件に、特にタンパク質（例えば、高温に対する耐性を改善する因子）の発現の改変によって、細胞を強制的に順応させるような長さでなければならない。特に好ましい実施形態では、本発明の第１の態様に従い、ステップｂ）は、好ましい昇順に、少なくとも０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３若しくは４時間かけるか、２〜１０、３〜６、３〜５、３．５〜４．５時間継続する。

本願に記載する酵母抽出物は、皮膚科学的に活性のケア製剤に処理することができ、この製剤は、同義で皮膚用薬とも称し、置換え可能に用いられる。好ましい実施形態では、酵母細胞は、ヤロウィア（Yarrowia)、サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、トルラスポラ（Torulaspora）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、デバロマイセス（Debaromyces)、カンジダ（Candida)、ピキア（Pichia）、アスペルギルス（Aspergillus)及びアオカビ（Penicillium)属を含む群からの酵母細胞、さらに好ましくはヤロウィア（Yarrowia)、サッカロミセス（Saccharomyces）及びピキア（Pichia）含む群からの酵母細胞である。特に好ましい実施形態では、酵母細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica)株の酵母細胞である。

本発明のケア製剤は、ケア製剤の総量に対して、０．００１重量％〜２０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％、特に好ましくは０．０５重量％〜３、さらに好ましくは２〜３重量％の抽出物を含有する。

本発明のケア製剤は、軟化剤、乳化剤及び界面活性剤、増粘剤／粘度制御剤／安定剤、紫外線保護フィルター、抗酸化剤及びビタミン、ヒドロトロープ（若しくはポリオール）、及び固体材料及びフィルター、塗膜形成剤、パール光沢添加剤、消臭及び発汗抑制活性物質、虫よけ剤、セルフタンニング剤、防腐剤、コンディショナー、香料、着色剤、生体活性成分、ケア用添加剤、過脂化剤及び溶媒を含む群から選択される少なくとも１つの別の成分を含有してもよい。

軟化剤としては、あらゆる美容オイル、特に、単素数２〜４４の直鎖状及び／又は分枝状モノ及び／又はジカルボン酸と、炭素数１〜２２の直鎖状及び／又は分枝状飽和若しくは不飽和アルコールのモノ−若しくはジエステルを用いることができる。また、炭素数１〜２２の一官能価脂肪族カルボン酸と、炭素数２〜３６を有する二官能価アルコールのエステル化生成物を用いることもできる。さらに、長鎖アリール酸エステル、例えば、安息香酸のエステル、例えば、炭素数１〜２２の直鎖状又は分枝状の、飽和若しくは不飽和アルコールの安息香酸エステル、又は安息香酸イソステアリルエステル、又は安息香酸オクチルドデシルエステルも好適である。軟化剤及びオイル成分として好適と考えられる他のモノエステルの例として、以下を挙げることができる：炭素数１２〜２２の脂肪酸のメチルエステル及びイソプロピルエステル、例えば、ラウリン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチル、エルカ酸メチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピルがある。他の好適なモノエステルとしては、例えば、ステアリン酸ｎ−ブチル、ラウリン酸ｎ−ヘキシル、オレイン酸ｎ−デシル、ステアリン酸イソオクチル、パルミチン酸イソノニル、イソノナン酸イソノニル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、ラウリン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、エルカ酸オレイル、オレイン酸エルシル、並びに工業グレード脂肪族アルコール画分及び工業グレード脂肪族カルボン酸混合物から得られるエステル、例えば、炭素数１２〜２２の不飽和脂肪アルコールと、動物及び植物脂肪から得られるような炭素数１２〜２２の飽和及び不飽和脂肪酸から得られるエステル。しかし、天然に存在するモノエステル又はワックスエステル混合物（例えば、ホホバ油若しくは鯨油に存在するもの）も好適である。好適なジカルボン酸エステルとしては、例えば、アジピン酸ジ−ｎ−ブチル、セバシン酸ジ−ｎ−ブチル、アジピン酸ジ（２−エチルヘキシル）、コハク酸ジ（２−ヘキシルデシル）、Ｄ−イソトリデシルアセラートがある。好適なジオールエステルとしては、例えば、ジオレイン酸エチレングリコール、エチレングリコール−ジイソトリデカノエート、プロピレングリコール−ジ−（２−エチルヘキサノエート）、ブタンジオール−ジイソステアリン酸、ブタンジオール−ジカプリル酸／カプリン酸、及びジカプリル酸ネオペンチルグリコールが挙げられる。軟化剤として用いることができるその他の脂肪酸エステルとしては、例えば、安息香酸アルキル（Ｃ_{１２〜１５}）、炭酸ジカプリリル、炭酸ジエチルヘキシルがある。より長鎖のトリグリセリド、すなわち３つの酸分子（そのうち少なくとも１つが長鎖である）を含むグリセロールの三重エステルも、軟化剤及び油成分として用いることができる。例えば、以下のような脂肪酸トリグリセリド；天然植物油、例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ピーナッツ油、ナタネ油、アーモンド油、ゴマ油、アボカド油、ヒマシ油、カカオ脂、パーム油、さらには、ヤシ油若しくはパーム核油の液体画分、並びに動物油、例えば、サメ肝油、タラ肝油、鯨油、牛脂及びバター脂、ワックス、例えば、蜜蝋、カルナウバ蝋、鯨蝋、ラノリン及びニーツフットオイル、牛脂の液体画分が挙げられ、あるいはまた、カプリル酸−カプリン酸混合物の合成トリグリセリド、工業グレードオレイン酸からのトリグリセリド、イソステアリン酸を含むトリグリセリド、又はパルミチン酸−オレイン酸混合物から得られるトリグリセリドを軟化剤及びオイル成分として用いることができる。さらに、炭化水素、特に、液体パラフィン及びイソパラフィンを用いることも可能である。用いることができる炭化水素の例としては、パラフィン油、イソヘキサデカン、ポリデセン、ワセリン、流動パラフィン、スクアラン、セリシンがある。さらに、直鎖状若しくは分枝状脂肪アルコール、例えば、オレイルアルコール又はオクチルデカノール、並びに脂肪アルコールエーテル、例えば、ジカプリリルエーテルなども同様に用いることができる。好適なシリコーンオイル及びシリコーンワックスとしては、例えば、ポリジメチルシロキサン、シクロメチルシロキサン、及びアリール−又はアルキル−又はアルコキシ−置換ポリメチルシロキサン若しくはシクロメチルシロキサンがある。考慮することができる他の油としては、例えば、以下のものが挙げられる：炭素数６〜１８個、好ましくは８〜１０の脂肪アルコールに基づくゲルベアルコール（Guerbet alcohols）、直鎖状Ｃ_６〜２２脂肪酸と直鎖状Ｃ_６〜２２脂肪アルコールとのエステル、分枝状Ｃ_６〜１３カルボン酸と直鎖状Ｃ_６〜２２脂肪アルコールとのエステル、直鎖状Ｃ_６〜２２脂肪酸と分枝状Ｃ_８〜１８アルコール、特に２−エチルヘキサノール若しくはイソノナノールとのエステル、分枝状Ｃ_６〜１３カルボン酸と分枝状アルコール、特に２−エチルヘキサノール若しくはイソノナノールとのエステル、直鎖状及び／又は分枝状脂肪酸と多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ダイマージオール若しくはトリマージオール）及び／又はゲルベアルコール、Ｃ_６〜１０脂肪酸に基づくトリグリセリド、Ｃ_６〜１８脂肪酸に基づく液体モノ／ジ／トリグリセリド混合物、Ｃ_６〜２２脂肪アルコール及び／又はゲルベアルコールと芳香族カルボン酸、特に安息香酸とのエステル、植物油、分枝状第１級アルコール、置換シクロヘキサン、直鎖状Ｃ_６〜２２脂肪アルコールカーボネート、ゲルベカーボネート、安息香酸と直鎖状及び／又は分枝状Ｃ_６〜２２脂肪アルコールとのエステル（例えば、Ｆｉｎｓｏｌｖ（商標）ＴＮ）、ジアルキルエーテル、エポキシ化脂肪酸エステルのポリオールによる開環生成物、シリコーンオイル及び／又は脂肪族若しくはナフテン炭化水素。

非イオン、陰イオン、陽イオン若しくは両性界面活性剤を乳化剤又は界面活性剤として用いることができる。以下の群のうち少なくとも１つからの化合物を非イオン化解離乳化剤又は界面活性剤として用いることができる：２〜１００モルのエチレンオキシド及び／又は０〜５モルのプロピレンオキシドの、炭素数８〜２２の直鎖状脂肪アルコールへの、炭素数１２〜２２の脂肪酸への、及び炭素数８〜１５のアルキル基を有するアルキルフェノールへの付加生成物、１〜１００モルのエチレンオキシドのグリセロールへの付加生成物のＣ_{１２／１８}脂肪酸モノ−及びジエステル、炭素数６〜２２の飽和及び不飽和脂肪酸のグリセロールモノ−及びジエステル並びにソルビタンモノ−及びジエステル、並びにそれらのエチレンオキシド付加生成物、炭素数８〜２２のアルキル残基を有するアルキルモノ−及びオリゴグリコシド並びにそれらのエチレンオキシド付加生成物、２〜２００モルのエチレンオキシドのヒマシ油及び／又は硬化ヒマシ油への付加生成物、直鎖状、分枝状、不飽和若しくは飽和Ｃ_６〜２２脂肪酸、リシノール酸及び１２−ヒドロキシステアリン酸及びグリセロール、ポリグリセロール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、糖アルコール（例：ソルビトール）、アルキルグルコシド（例：メチルグルコシド、ブチルグルコシド、ラウリルグルコシド）及びポリグルコシド（例：セルロース）に基づく部分的エステル、モノ−、ジ−及びトリアルキルリン酸並びにモノ−、ジ−及び／又はトリ−ＰＥＧ−アルキルリン酸及びその塩、ポリシロキサン−ポリエーテルコポリマー（ジメチコンコポリオール）、例えば、ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／６ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ＰＥＧ−１２若しくはＰＥＧ−１４ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／４若しくは４／１２若しくは２０／２０若しくは１８／１８若しくは１７／１８若しくは１５／１５、ポリシロキサン−ポリアルキルポリエーテルコポリマー若しくは対応する誘導体、例えば、ラウリル若しくはセチルジメチコンコポリオール、特にセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ABIL（登録商標）EM90（Evonik Goldschmidt GmbH）、独国特許第１１６５５７４号に記載のペンタエリスリトール、脂肪酸、クエン酸及び脂肪アルコールの混合エステル、並びに／又は炭素数６〜２２の脂肪酸、メチルグルコース及びポリオール、例えば、グリセロール若しくはポリグリセロール、クエン酸エステル、例えば、クエン酸ステアリン酸グリセリル、クエン酸オレイン酸グリセリル及びクエン酸ジラウリルの混合エステル。

陰イオン乳化剤若しくは界面活性剤は、水溶性陰イオン基、例えば、カルボン酸、硫酸、スルホン酸若しくはリン酸基と親油残基を含むものでよい。皮膚適合性陰イオン界面活性剤は、多数が当業者には周知であり、市販されている。これらは、それぞれのアルカリ、アンモニウム若しくはアルカノールアンモニウム塩の形態の硫酸アルキル若しくはリン酸アルキル、それぞれのアルカリ若しくはアンモニウム塩の形態の硫酸アルキルエーテル、カルボン酸アルキルエーテル、サルコシン酸アシル及びスルホコハク酸アシル並びにグルタミン酸アシルであってよい。

また、陽イオン乳化剤及び界面活性剤を添加してもよい。このようなものとして、特に、四級アンモニウム化合物、特に、炭素数８〜２２の少なくとも１つの直鎖及び／又は分枝状の、飽和若しくは不飽和アルキル鎖、例えば、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウム、例えば、塩化若しくは臭化セチルトリメチルアンモニウム又は塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、並びにハロゲン化ジアルキルジメチルアンモニウム、例えば、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムを用いることができる。

さらに、モノアルキルアミドクワット（ｑｕａｔｓ）、例えば、塩化パルミトアミドプロピル−トリメチルアンモニウム又は対応するジアルキルアミドクワット（ｑｕａｔｓ）を用いることができる。

さらに、優れた生分解性を有する第四エステル化合物を用いることもでき、例えば、モノ−、ジ−若しくはトリエタノールアミンに基づく四級化脂肪酸が挙げられる。さらに、陽イオン乳化剤として、アルキルグアニジニウム塩を添加することもできる。

マイルドな、すなわち特に皮膚適合性の界面活性剤の典型的例として、脂肪アルコール−ポリグリコールエーテル硫酸塩、モノグリセリド硫酸塩、モノ及び／又はジアルキルスルホコハク酸塩、脂肪酸イセチオン酸塩、脂肪酸サルコシン酸塩、脂肪酸タウリド、脂肪酸グルタミン酸塩、エーテルカルボン酸、アルキルオリゴグルコシド、脂肪酸グルカミド、アルキルアミドベタイン及び／又はタンパク質脂肪酸縮合物、コムギタンパク質に基づくタンパク質脂肪酸縮合物がある。

さらに、両性界面活性剤、例えば、ベタイン、アンホアセテート若しくはアンホプロピオネート、例えば、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシン酸塩、例えば、ヤシ油アルキルジメチルアンモニウムグリシネート、Ｎ−アシルアミノプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシン酸塩、例えば、ヤシ油アシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシン酸塩、並びに各々のケースで、炭素数８〜１８のアルキル若しくはアシル基を有する２−アルキル−３−カルボキシルメチル−３−ヒドロキシエチルイミダゾリン、及びヤシ油アシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシン酸塩を用いることができる

両性界面活性剤の中でも、分子中のＣ_８／１８アルキル若しくはアシル基以外に、少なくとも１個の遊離アミノ基及び少なくとも１個の−ＣＯＯＨ−若しくは−ＳＯ_３Ｈ−基を含み、分子内塩を形成することができる界面活性化合物を用いることができる。好適な両性界面活性剤の例としては、Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ−アルキルプロピオン酸、Ｎ−アルキルアミノ酪酸、Ｎ−アルキルイミノジプロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−アルキルアミドプロピルグリシン、Ｎ−アルキルタウリン、Ｎ−アルキルサルコシン、２−アルキルアミノプロピオン酸、並びに各々のケースで、炭素数８〜１８のアルキル基を有するアルキルアミノ酢酸が挙げられる。両性界面活性剤のさらに別の例としては、Ｎ−ヤシ油アルキルアミノプロピオン酸塩、ヤシ油アルキルアミノエチルアミノプロピオン酸塩及びＣ_{１２／１８}−アシルサルコシンがある。

好適な増粘剤は、例えば、多糖、特にキサンタンガム、グアーガム（guar-guar）、寒天（agar-agar）、アルギン酸塩及びチロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、さらに脂肪酸の高分子ポリエチレングリコールモノ−及びジエステル（例：Carbopole TM若しくはSynthalene TM）、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン、例えば、エトキシル化脂肪酸グリセリドなどの界面活性剤、例えば、ペンタエリスリトール若しくはトリメチロールプロパンなどの脂肪酸とポリオールのエステル、狭い相同体分布を有する脂肪アルコールエトキシレート、又はアルキルオリゴグルコシド、並びに一般の塩及び塩化アンモニウムなどの電解質が挙げられる。

油相を増粘するための増粘剤として、当業者には公知のあらゆる増粘剤を考慮に入れることができる。特に、硬化ヒマシ油、蜜蝋若しくは微晶蝋などのワックスを挙げるべきであろう。さらに、シリカ、アルミナ若しくは層状ケイ酸塩（例：ヘクトリト、Loponite、サポニト）などの無機増粘剤を用いることもできる。これらの無機油相増粘剤は、疎水性に改変することができる。増粘／安定化油中水系エマルションの場合には、特に、Aerosils、層状ケイ酸塩及び／又は脂肪酸の金属塩、例えば、ステアリン酸亜鉛を用いることができる。

水性界面活性系の粘度調整剤として、例えば、ＮａＣｌ、低分子非イオン界面活性剤、例えば、ココアミドＤＥＡ／ＭＥＡ及びラウレス−３、又はポリマー高分子会合性高度エトキシル化脂肪誘導体、例えば、ＰＥＧ−２００水素添加パルミチン酸グリセリルを含有させることができる。

ＵＶ保護フィルターとしては、例えば、紫外線を吸収して、吸収したエネルギーを、より長波の放射の形態、例えば、熱として再放出することができる、有機物質を用いることができる。ＵＶＢフィルターは、油溶性又は水溶性のいずれでもよい。油溶性ＵＶＢ保護フィルターの例としては、以下のものが挙げられる：３−ベンジリデンカンファー及びその誘導体、例えば、３−（４−メチルベンジリデン）カンファー、４−アミノ安息香酸誘導体、例えば、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−エチルヘキシルエステル及び４−（ジメチルアミノ）−安息香酸アミルエステル、桂皮酸のエステル、例えば、４−メトキシ桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル、４−メトキシ桂皮酸イソペンチルエステル、２−シアノ−３−フェニル−桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル（オクトクリレン）、サリチル酸のエステル、例えば、サリチル酸−２−エチルヘキシルエステル、サリチル酸−４−イソプロピルベンジルエステル、サリチル酸ホモメチルエステル、ベンゾフェノンの誘導体、例えば、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メトキシベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、ベンザルマロン酸のエステル、例えば、４−メトキシベンザルマロン酸ジ−２−エチルヘキシルエステル、トリアジン誘導体、例えば、２，４，６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２’−エチル−１’−ヘキシルオキシ）−１，３，５−トリアジン及びオクチルトリアゾン、プロパン−１，３−ジオン、例えば、１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン。

水溶性ＵＶＢ保護フィルターとしては、以下のものが挙げられる：２−フェニルベンジミダゾール−５−スルホン酸及びアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルカリアンモニウム、アルカノールアンモニウム及びそのグルコアンモニウム塩、ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、例えば、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸及びその塩、３−ベンジリデンカンファー、例えば、４−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）ベンゼンスルホン酸及び２−メチル−５−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）スルホン酸並びにその塩。

特にベンゾイルメタンの誘導体を典型的ＵＶＡ保護フィルターとして考慮することができ、例えば、１−（４’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン又は１−フェニル−３−（４’−イソプロピルフェニル）プロパン−１，３−ジオンがある。もちろん、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂフィルターを混合して用いてもよい。

上に挙げた可溶性物質以外にも、本発明の目的のために、不溶性顔料、すなわち、微粉砕された金属酸化物若しくはその塩、例えば、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸化ジルコニウム、ケイ酸塩（タルク）、硫酸バリウム及びステアリン酸亜鉛も考慮することができる。粒子は、１００ｎｍ未満の平均粒径、例えば、５〜５０ｎｍ、特に、１５〜３０ｎｍを有するべきである。これらは、球形をしていてよいが、楕円形のもの、又は球形から何らかの方法で変形した粒子を用いることもできる。比較的新しいクラスの光保護フィルターとして、超微粉砕有機顔料、例えば、粒度が＜２００ｎｍの２，２’−メチレン−ビス−｛６−（２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール｝があり、これは、例えば、５０％水性分散液として得ることができる。

さらに好適なＵＶ保護フィルターは、P．FinkelによるSOEFW-Journal 122, 543 (1996)の論文にみいだすことができる。前述した２つの群の主要ＵＶ保護フィルターに加えて、抗酸化タイプの二次サンスクリーン剤を用いることもでき、これは、紫外線が皮膚に浸透すると、誘発される光化学連鎖反応を阻止する。

用いることができる酸化防止剤及びビタミンとしては、例えば、以下のものが挙げられる：スーパーオキシドムスターゼ、トコフェロール（ビタミンＥ）、ソルビン酸トコフェロール、酢酸トコフェロール、トコフェロールの別のエステル、ジブチルヒドロキシトルエン及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）並びにそれらの塩及び誘導体（例：リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウム、ソルビン酸アスコルビル）、脂肪酸のアスコルビルエステル、ブチル化ヒドロキシ安息香酸及びその塩、過酸化物、例えば、過酸化水素、過ホウ酸塩、チオグリコレート、過流酸塩、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（TROLOX.RTM）、没食子酸及びそのアルキルエステル、尿酸並びにその塩及びアルキルエステル、ソルビン酸及びその塩、リポ酸、フェルラ酸、アミン（例：Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、アミノ−グアニジン）、スルフィドリル化合物（例えば、グルタチオン）、ジヒドロキシフマル酸及びその塩、ピドロ酸グリシン、アルギニンピロレート、ノルジヒドログアイアレチン酸、バイオフラボノイド、クルクミン、リジン、Ｌ−メチオニン、プロリン、スーパーオキシドムスターゼ、シリマリン、茶抽出物、グレープフルーツ皮／種子抽出物、メラニン、ローズマリー抽出物、チオククト酸、レスベラトロール、オキシレスベラトロールなど。

例えば、エタノール、イソプロピルアルコール又はポリオールを流動挙動及び適用特性を改善するためのヒドロトロープとして用いることができる。本発明で考慮することができるポリオールは、２〜１５個の炭素原子と、少なくとも２個のヒドロキシル基を有するものでよい。典型的例として以下のものがある：グリセロールアルキレングリコール、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール及びポリエチレングリコール（平均分子量が１００〜１０００ダルトン）、固有縮合度が１．５〜１０の工業グレードオリゴグリセロール混合物、例えば、ジグリセロール含量が４０〜５０重量％の工業グレードジグリセロール混合物、メチロール化合物、例えば、特にトリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、トリメチロールブタン、ペンタエリスリトール及びジペンタエリスリトール、低級アルキルグルコシド、特に、炭素数１〜４のアルキル残基を有するもの、例えば、メチル及びブチルグルコシド、炭素数５〜１２の糖アルコール、例えば、ソルビトール若しくはマンニトール、炭素数５〜１２の糖、例えば、グルコース若しくはスクロース、アミノ糖、例えば、グルコアミン。

用いることができる固体としては、例えば、酸化鉄顔料、二酸化チタン若しくは酸化亜鉛粒子、並びに「紫外線遮断剤」の項で追加して挙げたものがある。さらに、特定の感知作用を生み出す粒子、例えば、ナイロン−１２、窒化ホウ素、ポリマー粒子、例えば、ポリアクリレート若しくはポリメチルアクリレート又はシリコーンエラストマーを用いることもできる。用いることができるフィルターとしては、デンプン及びデンプン誘導体、例えば、タピオカデンプン、リン酸架橋デンプン、アルミニウム若しくはナトリウムデンプン、コハク酸オクテニル、並びに主として紫外線フィルタリング又は着色作用のいずれも含まない顔料、例えば、Aerosile（登録商標）（CAS No. 7631-86-9)がある。

例えば、耐水性を改善するための、塗膜形成剤としては、例えば、ポリウレタン、ジメチコン、コポリオール、ポリアクリレート又はＰＶＰ／ＶＡコポリマー（ＰＶＰ＝ポリビニルピロリドン、ＶＡ＝酢酸ビニル）を用いることができる。例えば、以下のものを脂溶性塗膜形成剤として用いることができる：ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を基材とするポリマー、ポリビニルピロリドンコポリマー、ＰＶＰ／ヘキサデセンコポリマー又はＰＶＰ／エイコセンコポリマー。

例えば、ジステアリン酸グリコール又はＰＥＧ−３ジステアリン酸塩をパール光沢添加剤として用いてもよい。

好適な消臭活性物質としては、例えば、不快臭のマスキング剤、例えば、通常の香料成分、異臭吸収剤、例えば、独国特許出願［未審査の出願の公開］第４００９３４７号に記載されている層状ケイ酸塩、中でも、特に、モンモリロナイト、カオリナイト、イライト、バイデライト、ノントロナイト、イレクトライト（ilectorite）、サポナイト、ベントナイト、スメクタイト、さらに、例えば、リシノール酸の亜鉛塩がある。また、発芽阻害物質を含有させることも好適である。発芽阻害物質としては、例えば、以下のものがある：２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル（Irgasan)、１，６−ジ−（４−クロロフェニルビグアニド）−ヘキサン（クロルヘキシジン）、３，４，４’−トリクロロカルボニリド、四級アンモニウム化合物、チョウジ油、ハッカ油、タイム油、トリエチルシトレート、ファルネソール（３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエン−１−オル）、エチルヘキシルグリセリルエーテル、ポリグリセリル−３カプリレート（TEGO（登録商標）Cosmo P813, Evonik Goldschmidt GmbH）、並びに未審査の特許出願：独国特許出願第１９８５５９３４号、独国特許出願第３７４０１８６号、独国特許出願第３９３８１４０号、独国特許出願第４２０４３２１号、独国特許出願第４２２９７０７号、独国特許出願第４２２９７３７号、独国特許出願第４２３８０８１号、独国特許出願第４３０９３７２号、独国特許出願第４３２４２１９号及び欧州特許第６６６７３２号に記載されている活性物質。

収斂剤、例えば、塩基性塩化アルミニウム、例えば、アルミニウムクロロヒドレート（「ＡＣＨ」）及びジルコニウム−アルミニウム−グリシン塩（「ＺＡＧ」）を制汗活性物質として用いることができる。

例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、１，２−ペンタンジオール又はInsect Repellent 3535を虫よけ剤として用いることができる。

例えば、ジヒドロキシアセトン及びエリスルロースをセルフタンニング剤として用いることができる。

例えば、フェノキシエタノールとの個別若しくは複数のアルキルパラベンエステルの混合物を防腐剤として用いることができる。アルキルパラベンエステルは、メチルパラペン、エチルパラベン、プロピルパラベン及び／又はブチルパラベンであってよい。フェノキシエタノールの代わりに、他のアルコール、例えば、ベンジルアルコール若しくはエタノールを用いてもよい。さらに、他の常用の防腐剤を用いてもよく、例えば、ソルビン酸若しくは安息香酸、サリチル酸、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、クロロアセトアミド、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカルバメート、ヒドロキシメチルグリシン酸ナトリウム、メチルイソチアゾリン、クロロメチルイソチアゾリン、エチルヘキシルグリセロール又はカプリルグリコールがある。

例えば、有機四級化合物、例えば、塩化セトリモニウム、塩化ジセチルジモニウム、塩化ベヘントリモニウム、塩化ジステアリルジモニウム、メソ硫酸ベヘントリモニウム、塩化ジステアロイルエチルアンモニウム、塩化パルミタミドプロピルトリモニウム、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリド、ヒドロキシプロピルグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリド、若しくはクオタニウム−８０又はアミン誘導体、例えば、アミノプロピルジメチコン若しくはステアラミドプロピルジメチルアミンをコンディショナーとして用いることができる。

天然若しくは合成芳香物質又はそれらの混合物を香料として用いることができる。天然芳香物質としては、以下のものがある：花（ユリ、ラベンダー、バラ、ジャスミン、ネロリ、イランイラン（ylang-ylang））、茎及び葉（ゼラニウム、パチョリ、ブチグレン）、果実（アニス、コリアンダー、キャラウェイ、セイヨウネズ）、果実の皮（ベルガモット、レモン、オレンジ）、根（メース、シシウド、セロリ、カルダモン、コスツス、アイリス、タイム）、針状葉及び枝（スプルス、ファー、マツ、モンタナマツ）、樹脂及びバルサム（ガルバヌム、エレミ、ベンゾイン、ミルラ、オリバヌム、オポポナックス）。さらに、動物原料を考慮してもよく、例えば、ジャコウ及びカストリウムがある。典型的な合成芳香化合物としては、エステル、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルコール及び炭化水素のタイプの生成物がある。エステルタイプの芳香化合物としては、例えば、酢酸ベンジル、フェノキシエチルイソブチレート、ｐ−ｔｅｒｔ．−ブチルシクロヘキシルアセテート、酢酸リナリル、酢酸ジメチルベンジルカルビニル、酢酸フェニルエチル、安息香酸リナリル、ギ酸ベンジル、グリシン酸エチルメチルフェニル、プロピオン酸アリルシクロヘキシル、プロピオン酸スチラリル及びサリチル酸ベンジルがある。エーテルとしては、例えば、ベンジルエチルエーテルがあり、アルデヒドとしては、例えば、炭素数８〜１８の直鎖状アルカナール、シトラール、シトロネラール、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラール、リリアール及びブルゲオナールが挙げられ、ケトンとしては、例えば、イオノン、α−イソメチルイオノン及びメチル−セドリルケトンがあり、アルコールとしては、アネトール、シトロネロール、オイゲノール、イソオイゲノール、ゲラニオール、リナロール、フェニルエチルアルコール及びテルピネオールがあり、炭化水素としては、主に、テルペンとバルサムがある。一緒に魅力的な芳香の特徴を生み出す、様々な芳香物質の混合物を用いることもできる。一般に香味料成分として用いられている低揮発性の精油もまた、香料として好適であり、例えば、セージ油、カモミール油、チョウジ油、メリッサ油、ハッカ油、シナモンリーフ油、ライムブロッサムオイル、ジェニパーベリー油、ベチバー油、オリバヌム油、ガルバヌム油、ラボラヌム油及びラバンジン油がある。ベルガモット油、ジヒドロミセノール、リリアール、リラール、シトロネロール、フェニルエチルアルコール、αヘキシルシンナムアルデヒド、ゲラニオール、ベンジルアセトン、シクラメンアルデヒド、リナロール、Boisambrene Forte、Ambroxan、インドール、ヘジオン、サンデリス、レモン油、マンダリンオレンジ油、オレンジ油、アリルアミルグリコレート、シクロベルタール、ラバンジン油、クラリーセージ油、βダマスコン、ゼラニウム・ブルボン油、サリチル酸シクロヘキシル、ベルトフィクス・クール、イソイースーパー（iso-E-super)、Fixolide、NP、エベルニル、イラルデインγ、フェニル酢酸、酢酸ゲラニル、酢酸ベンジル、ローズオキシド、ロミレート、イロチル及びフロラマト（floramat）を単独で、又は混合して用いることができる。

用いることができる色素は、例えば、文献：“Kosmetische Faerbemittel” [Cosmetic colourants] of the Dye Commission of the Deutsche Forschungsgemeinschaft [German Research Association], Verlag Chemie, Weinheim, 1984, p. 81〜106に記載されているように、美容用途に好適で、許容される物質である。これらの色素は、一般に、混合物総量に対して、０．００１〜０．１重量％の濃度で用いる。

生体活性物質としては、例えば、以下のものがある：トコフェロール、酢酸トコフェロール、パルミチン酸トコフェロール、アスコルビン酸、ポリフェノール、デオキシリボ核酸、補酵素Ｑ１０、レチノール、ＡＨＡ酸、アミノ酸、ヒアルロン酸、αヒドロキシ酸、イソフラボン、ポリグルタミン酸、クレアチン（及びクレアチン誘導体）、グアニジン（及びグアニジンの誘導体）、疑似セラミド、精油、ペプチド、タンパク質、タンパク質加水分解物、植物抽出物、ビサボロール、アラントイン、パンテノール、フィタントリオール、イデベノン、リコリス抽出物、グリシリシジン及びイデベノン、セクレログルカン、βグルカン、サンタルビン酸及びビタミン複合体。植物抽出物の例としては、以下のものがある：チェスナット抽出物、カモミール抽出物、ローズマリー抽出物、クロフサスグリ及びアカフサスグリ抽出物、カンバ抽出物、ローズヒップ抽出物、藻類抽出物、緑茶抽出物、アロエ抽出物、チョウセンニンジン抽出物、イチョウ抽出物、グレープフルーツ抽出物、キンセンカ抽出物、カンファー抽出物、タイム抽出物、マンゴスチン抽出物、シスタス抽出物、テルミナリア・アジュナ（Terminalia arjuna）抽出物、オーツ麦抽出物、オレガノ抽出物、ラズベリー抽出物、イチゴ抽出物など。

生体活性物質はまた、いわゆるバリア脂質を含んでもよく、このようなものとして、例えば、セラミド、フィトスフィンゴシン及び誘導体、スフィンゴシン及び誘導体、スフィガニン及び誘導体、疑似セラミド、リン脂質、リゾリン脂質、コレステロール及び誘導体、コレステリルエステル、遊離脂肪酸、ラノリン及び誘導体、スクアラン、スクアレン及び関連物質を挙げることができる。

生体活性物質はまた、本発明の意味で、抗ニキビ剤、例えば、過酸化ベンジル、フィトスフィンゴシン及び誘導体、ヒドロキシ安息香酸ニコチンアミド、ニコチンアルデヒド、レチノイン酸及び誘導体、サリチル酸及び誘導体、シトロネロール酸など、並びに抗セルライト剤、例えば、キサンチン化合物、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン及びアミノフィリン、カルニチン、カルノシン、サリチルオキシフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、サンタルビン酸など、並びにフケ防止剤、例えば、サリチル酸及び誘導体、亜鉛ピリチオン、硫化セレン、イオウ、シクロピロキソールアミン、ビフォナゾール、クリムバゾール、オクトピロクス及びアクチロクスなど、並びに収斂剤、例えば、アルコール、アルミニウム誘導体、没食子酸、サリチル酸ピリドキシン、亜鉛塩、例えば、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、乳酸亜鉛、塩酸ジルコニウムなどがある。コウジ酸、アルブチン、ビタミンＣ及び誘導体、ヒドロキノン、ウコン油、クレアチニン、スフィンゴ脂質、ニコチンアミドなども、生体活性物質に含まれる。

例えば、エトキシル化グリセロール脂肪酸、例えば、ＰＥＧ−７グリセロールココエート、又は陽イオンポリマー、例えば、ポリクオタニウム−７若しくはポリグリセロールエステルをケア製剤添加剤として含有させてもよい。

過脂化剤としては、例えば、ラノリン及びレシチン及びポリエトキシル化若しくはアクリル化ラノリン及びレシチン誘導体、ポリオール脂肪酸エステル、モノグリセリド及び脂肪酸アルカノールアミドなどの物質を用いることができるが、後者は、同時に泡安定剤としても作用する。

例えば、エタノール、プロパノール若しくは１，３−プロパンジオール、環状炭酸エステル、例えば、炭酸エチレン、炭酸プロピレン、炭酸グリセロール、モノ−若しくはポリカルボン酸のエステル、例えば、酢酸エチル、乳酸エチル、アジピン酸ジメチル及びアジピン酸ジエチル、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、炭酸グリセロール、又は水を溶媒として用いることができる。

本発明のケア製剤は、好ましくは、追加成分として、セラミド、コレステロール、脂肪酸を含む群から選択されるバリア脂質を有する。

さらには、本発明のケア製剤は、追加成分として、脂質モジュレータ、例えば、リノール酸、結合リノール酸、γリノール酸、フィトスフィンゴシン、サルチロイルフィトスフィンゴシン、短鎖及び中鎖セラミド（Ｃ_１〜Ｃ_１０）、ウロン酸、コレステロール硫酸、フィトステロール、ビタミンＤ、ロイコトリエン、ファルネソール、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２、９−ヒドロキシオクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ）、好ましくは、クレアチン、ニコチンアミド、レチノール、アルジュノール酸を含む群から選択される脂質モジュレータを含有するのが好ましい。

本発明のケア製剤は、スキンケア、フェイシャルケア、ヘッドケア、ボティケア、フェミニンケア、フットケア、ヘアケア、ネイルケア、歯科衛生、リップケア又は口腔歯科衛生製品として用いることができる。ヘアケア製品としては、毛髪洗浄剤、ヘアトリートメント、ヘアリンス、ヘアフルイド、ヘアジェル、ヘアトニック、ヘアワックス、ヘアラッカー、ヘアスプレー、ヘアクリーム、ヘアムース、ヘアバーム、フケ防止シャンプーがある。ボディケア製品の例としては、シャワージェル、クリームバス、クリームジェル、シャワーオイル、シャワージェル、洗浄ジェル、ピーリングウォッシュ、クレンジングローション、フェイスマスク、フェイスローション、フェイシャルピーリング、アイクリーム、ナイトクリーム、クレンジングマスク、ローションパッド、クレンジングワイプス、クレンジングローション、クレンジングミルク、クレンジングジェル、アフターシェーブジェル、アフターシェーブバーム、タンニングミルク、日焼け後ケア製品、セルフタンニング剤、フットローション、フットスプレー、ボディローション、ボディジェル、ボディスプレー、ボディミルク、ボディピーリング、ボディバターがある。

リップケア製品の例としては、リップバーム、リップクリーム、リップケアスティックがある。

本発明のケア製品は、水中油型（Ｏ／Ｗ）、油中水型（Ｗ／Ｏ）若しくはシリコーン中水型（Ｗ／Ｓ）エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ及びＯ／Ｗ／Ｏのような多重エマルションの形態で用いることができ、これらは、ヒドロディスパージョン（hydrodispersion）若しくはリポディスパージョン（lipodispersion）、懸濁液、溶液、クリーム、軟膏、ペースト、ジェル、エアロゾル、スプレー、洗浄剤、メークアップ若しくは日焼け止め製剤又はフェイスローション又はスティック、例えば、ファットスティック若しくは含水スティックとも呼ばれる。

本発明に従って製造される酵母抽出物は、また、動物及び／又はヒト用の栄養補助食品として用いることもできる。この抽出物は、食品と一緒に投与することができる。

皮膚科学的に活性の物質又は栄養補助食品は、酵母抽出物中に、規定最小量のタンパク質を含んでいなければならない。好ましい実施形態では、酵母抽出物は、好ましい昇順に、少なくとも０．５、１、２．５、１０若しくは２５ｍｇのタンパク質／ｍＬ又は０．０５〜１００、０．１〜８０、０．５〜５０若しくは１〜２５ｍｇのタンパク質／ｍＬを含有する。

本発明に従って製造される酵母抽出物は、ヘア及び／又はスキンの美容トリートメントに用いることができる。好ましい実施形態では、本明細書で用いる「ヘア及び／又はスキン」という用語は、皮膚用薬剤の外部使用が可能なヒト若しくは動物身体のいずれかの部分を意味する。好ましい実施形態では、本明細書で用いる「美容トリートメント」という用語は、ナノ病理学的発現の改善を意味し、これは、特に、あくまで審美的印象を改善する。このようなトリートメントによって、例えば、皮膚の引き締め、皮膚の水分の改善、場合によっては皮膚の状態の改善、又は発汗の改善を達成する。

本発明は、驚くことに、本発明に従って製造される酵母抽出物による皮膚のトリートメントが、疾患を治療するのに好適であることをみいだした。

以下の図面及び非制限的実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。これらの図面及び実施形態から、本発明のさらなる特徴、実施形態、態様及び利点を理解することができよう。

時間経過による、ｐＨ２でのヤロウィア（Yarrowia)、ピキア（Pichia）及びサッカロミセス（Saccharomyces）属の酵母細胞の増殖を示す。 記載したプロトコルを用いて得られたチップデータを含む典型的２組を示す。ここでのデータは、ｐＨ５．４で通常に培養したヤロウィア（Yarrowia)細胞からの抽出物で処理したヒト線維芽細胞のマーカの分析によって得られた。 記載したプロトコルを用いて得られたチップデータを含む典型的２組を示す。ここでのデータは、ｐＨ２のストレスに暴露したヤロウィア（Yarrowia)細胞からの抽出物で処理したヒト線維芽細胞のマーカの分析によって得られた。

実施例１：低ｐＨの培地への暴露によるストレス下の各種酵母株の増殖
低ｐＨの培地への暴露により、酵母株にストレスを与えることができるか否かを調べると共に、どの酵母株が、低ｐＨで好適な若しくは有利な増殖特性を呈示しうるかを調べるために、３つの酵母属、すなわち、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）及びヤロウィア（Yarrowia)の各々から１つの典型的なものの増殖をｐＨ２で調べた。

調べようとするそれぞれの酵母株の前培養物を標準培地（リットル当たり：３３ｇのグルコース一水和物、０．８８ｇの硫酸マグネシウムｘ７Ｈ_２Ｏ、０．２ｇの塩化カルシウムｘ２Ｈ_２Ｏ、４．８３塩化アンモニウム、０．０６ｇの塩化ナトリウム、１ｇのリン酸二水素カリウム、０．０５９ｇのミオイノシトール、２０ｇのＭＯＰＳ、０．３ｍＬの微量元素溶液（リットル当たり：１００ｇの８Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４、５０ｇのクエン酸一水和物、４８ｇのＦｅＳＯ_５ｘ７Ｈ_２Ｏ、１６．７ｇのＺｎＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ_４ｘ５Ｈ_２Ｏ、１．８８ｇのＭｎＳＯ_４ｘＨ_２Ｏ、２ｇのＨ_３ＢＯ_３、２ｇのＮａＭｏＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ、０．５ｇのＫＩ）並びに０．３ｍＬのビタミン溶液（リットル当たり：５ｇのニコチン酸、５ｇのカルシウム−Ｄ−パントテン酸、５ｇのチアミン、３．３３ｐ−アミノ安息香酸塩、０．５ｇのピリドキシン、０．０１６７ビオチン）において一晩培養し、そのｐＨは硫酸で２に調節した。分光光度測定により、光学密度を連続的にモニターする。

試験の結果を図１に示す。用いた全ての株が、上記の条件で検出可能な増殖を示すが、同じ条件下でｐＨ２でのヤロウィア（Yarrowia)属の代表株は、比較酵母属より速い増殖を示し、また、より高い光学密度にも達することがみとめられる。

実施例２：ヒト線維芽細胞上でのチップアレイを用いた、高温、過酸化水素による処理又は低ｐＨの培地への暴露のいずれかによりストレスを受けた酵母株の作用の比較特性決定
低ｐＨの培地への暴露によるストレスが、高温又は過酸化水素での処理によるストレスと同じ作用を酵母細胞に及ぼすか否か、また、各種のストレスを受けた酵母細胞若しくはそれらの抽出物が異なっているか否かを調べた。モデル生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を選択した。

酵母の製造
前培養物を前述のように準備し、ｐＨ５．４に調節した。消泡剤を添加しながら、そらせ板のない振盪フラスコ中で培地を接種した。温度は３０℃で、速度は１８０ｒｐｍ（振幅：２．５ｃｍ）である。事前に光学密度を決定し、連続的に測定し、ＯＤ＞３５で、例えば、温度を３７℃に上昇させる、所望のｐＨまで硫酸を添加する、又は過酸化水素を添加することによって、それぞれのストレス状態を形成する。

次に、遠心分離により細胞を回収して、凍結させるか、又は水性溶解により溶解させる。このために、抽出物を懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いて処理する。懸濁液を濾過して除去するか、又は遠心分離して、最終生成物として水溶液を取得する。

チップアレイを用いた実験の試験原理及び実施
これらの試験では、ヒト皮膚の認定モデルである、ヒト皮膚線維芽細胞の挙動に対する酵母抽出物の作用を調べる。このために、抽出物での処理後、細胞を溶解し、そのＲＮＡを単離した後、逆転写によって得られたＤＮＡを、皮膚科学的に関連するマーカの発現の調節について、チップを用いて調べる。上方制御又は下方制御が、皮膚の形態及び生理にプラスの作用を示すマーカ、特に、Ｗｎｔ−経路のマーカ及びＥＣＭのマーカだけを用いる。Ｗｎｔ遺伝子は、分泌されるタンパク質の大きなファミリーをコードする。現在までのところ、１９のＷｎｔタンパク質がヒトにおいて同定されている。個々の種におけるＷｎｔの様々な亜群と、異なる種同士で比較したＷｎｔはいずれも、非常に大きな相同性を呈示する。例えば、ヒトの場合、個別のＷｎｔタンパク質は、２７〜８３％の一致を示す（Miller, 2001）。規定Ｗｎｔシグナルカスケードの中央分子は、βカテイン（βＣａｔ）であり、その安定性は、Ｗｎｔタンパク質によって調節される。胎児及び新生児の皮膚の研究から、Ｗｎｔタンパク質が、毛包の発生に重要な役割を果たすことがわかっている。特に、タンパク質Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ及びＷｎｔ５ａは、毛包発生の早期に特異的に発現する（Reddy et al., 2001）。

既知伝達機構の大部分が皮膚に存在する。Ｗｎｔ経路によって、基底細胞は、優先的に、幹細胞特性を維持する。細胞が老化するにつれ、細胞及び分子損傷の蓄積が生じ、これによって、組成物及び器官の再生能力の低下が起こる。このように低下した再生能力は、部分的に、脂肪組織からの組織特異的成体幹細胞の自己再生能力及び分化能の変化に影響されている。多くの幹細胞の自己再生能力及び分化能を調節する既知シグナル経路である、ＷＮＴシグナル経路は、従って、幹細胞の増殖に影響を及ぼすことがわかっている。さらに、Ｗｎｔ及びβカテイン発現によって、上皮増殖、分化及び遊走が増大するため、創傷の治癒が加速される。

結合組織及び関連する皮膚引き締めの物理的特性は、とりわけ細胞外マトリックスによって決定されるため、細胞は、その分化、遊走及び増殖において影響を受ける。このマトリックスは、その内部に位置する細胞（線維芽細胞、筋線維芽細胞、脂肪形成細胞、骨芽細胞及び軟骨芽細胞）によって形成される。細胞外マトリックスは、高分子から構成され、これらの分子は、グリコサミノグリカン及び線維状タンパク質からなる。リンパ系、細胞外マトリックス及び過剰脂肪蓄積の相互作用は、皮膚引き締めに関与する。総体脂肪は、脂肪細胞の新たな（de-novo）分化、増殖及びアポトーシス（自己溶解）の間の均衡によって決定される。脂肪細胞分化は、誕生から開始し、一生を通して続く、複雑なプロセスである。

用いるマーカの完全リストを表１〜１４に示す。

ヒト初代細胞
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系の形態でヒト皮膚線維芽細胞又はヒト皮下脂肪前駆細胞を生物試験系として用いる。いずれの細胞型も、市販されている（Lifeline又はCellAplications）。

ヒト皮膚線維芽細胞は、規定通りに、新生児ドナーの真皮（包茎）又は成人ドナーの皮膚から得たものである。これらは、常に非感染性のドナー材料で、ｉｎ ｖｉｖｏ組織から、それぞれの供給業者によって単離され、対応する細胞培地で個々に増殖させたものである。低温保存したヒト皮膚線維芽細胞は、好適な細胞培地に接種した後、それらの典型的な生理及び形態を損なうことなく、１６倍加周期まで進行させることができる。ヒト皮膚線維芽細胞は、あらゆる結合組織構造に存在し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系で、十分に特性決定されている。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞外マトリックスタンパク質を放出するため、特に、線維芽細胞増殖の研究、線維芽細胞分化の研究、さらにまた、特に、創傷治癒に関するコラーゲン代謝を研究する上での、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に好適である。様々な方法で、ヒト皮膚線維芽細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再形成した、３次元真皮同等物及びｉｎ ｖｉｔｒｏで再形成したヒト皮膚モデルの集団に適していることが証明されている。

ヒト脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）は、通常、非感染性ドナーのヒト脂肪組織から得られる。ヒト脂肪細胞は、低温保存には不適であり、従って、ドナー組織からの細胞の抽出後の再接種にも向いていないが、同様の抽出後に、ヒト脂肪前駆細胞は、非常に良好に低温保存することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を実施することができる。しかし、これらを３回以上継代することはできない。その後、ヒト脂肪前駆細胞は、ヒト脂肪細胞に分化する。ヒト脂肪前駆細胞は、ヒト真皮線維芽細胞の形態と酷似する形態を特徴とする。ヒト脂肪前駆細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化によって得られたヒト脂肪細胞は、インスリン刺激グルコース輸送の研究、ホルモン制御脂肪分解の特性決定、及び脂肪組織における遺伝子発現の研究のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系として用いることができる。ＨＰＡｄ／ＨＡｄ系は、肥満症及びＩＩ型糖尿病の原因を研究するための、極めてよく特性決定されたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系である。

ヒト細胞の酵母抽出物との接触
ヒト初代線維芽細胞を培地１９９（Souto LR, Rehder J, Vassallo J, Cintra ML, Kraemer MH, Puzzi MB (2006) Sao Paulo Med J. 124(2), 71-6. Model for human skin reconstructed in vitro composed of associated dermis and epidermis; E. Pinney, K. Liu, B. Sheeman and J. Mansbridge (2001): Human three-dimensional fibroblast cultures express angiogenic activity. J Cell Physiol 183, 74-82）において、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び２％ペニシリン（Ｐｅｎ）／ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐ）と一緒に、７５％亜集密（subconfluence）まで増殖させた。細胞を回収した後、細胞を細胞外コラーゲンマトリックス（ＥＣＭ）に組み込み、Ｍ１９９培地の存在下で、５％ＦＣＳ及び２％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐと一緒に培養した。２４〜４８時間にわたるＥＣＭへの細胞の接種後、活性物質（酵母抽出物）への暴露を４〜５日行った。培養の間、標準ＭＴＴ試験（Mosmann, Tim “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”. Journal of Immunological Methods 65 (1-2): 55-63）を用いて、細胞生存性をモニターした。通常の細胞培養条件（５％ＣＯ_２；３７℃、最大湿度）を選択した。

通常の細胞培養条件で、特殊な増殖培地（供給業者：Cell Applications）を用いて、ヒト脂肪前駆細胞を６０〜７５％亜集密まで増殖させた。脂肪細胞への細胞の分化を阻害した。細胞を回収して、６ウェルプレートに再接種した（＞１０，０００細胞／ｃｍ^２）後、増殖培地の存在下で、細胞を２４〜４８時間培養し、次に、特殊な分化培地（供給業者：Cell Applications）を用いて分化させた。分化は、酵母抽出物の存在下で、１０〜１４日の期間にわたって実施した（５〜７日毎に連続的に「反復投与」した）。

共培養中の細胞は、各々のケースで、前述のように増殖させた。線維芽細胞のＥＣＭ（前述の通り）への組込みから４８時間後、ヒト脂肪前駆細胞をコラーゲンマトリックスにロードした。通常の培養条件で、脂肪（前駆）細胞増殖培地を用いて、全構築物をさらに４８時間にわたって培養した。次に、分化培地を用いて、活性物質の存在下で、脂肪前駆細胞の分化を実施した。標準ＭＴＴ試験を用いて、両細胞型の細胞生存性を再度モニターした。細胞内乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を決定して、細胞膜の統合性を定量的に評価した。

ヒト表皮角化細胞をCascade Biologics（Invitrogen Company）からのMedium 154において増殖させた。７０〜８０％亜集密に達した後、細胞を回収し、ポリカーボネート膜（＜０．４μＭ孔径）上で、前述の培地の存在下で、＞４８時間にわたり液内培養した。さらに、ＦＣＳ、並びにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）：脂肪酸複合体及びビタミンＥ；Ｌ−セリン及びＬ−カルニチンを培地に添加した。次に、空気／培地境界層への細胞のシフトが起こった後、ビタミンＣの添加と共に、Ｃａ^２＋イオン濃度を高めた無血清分化培地に移した。活性物質（毎日連続的に「反復投与」）の存在下、このエアリフト式培養の７日目から開始して、１４日目まで、細胞を培養した。この実施例では、正常細胞培養条件も選択した。

線維芽細胞からのＲＮＡの単離
RNeasy Mini Kitを用いて、線維芽細胞から全ＲＮＡを単離する。分析のために、凍結した線維芽細胞を、５ｍｍ鋼球、３００μＬのＲＬＴ、及びTissuelyser中の１０μＬ／ｍＬβメルカプトエタノールと一緒に３分間１６，０００Ｈｚで均質化する。サンプルを短時間遠心分離して、エッペンドルフ（Eppendorf）キャップ内の気泡を低減させる。RNaseを含まない５９０μＬの水と１０μＬのプロテアーゼＫを添加した後、サーモシェーカで、溶液を５５℃で１０分間消化させる。約９００μＬの上澄みを新しいエッペンドルフキャップに投入し、４５０μＬの９６％エタノールを添加する。７００μＬを取り出し、RNeasy Mini Spin Columnに移してから、室温にて、１０，０００回転／分で１５秒間遠心分離するが、液体は廃棄してよい。残っている液体を用いて、このステップを繰り返す。次に、７００μＬのバッファーＲＷ１をRNeasy Mini Spin Columnに投入し、室温にて、１０，０００回転／分で１５秒間遠心分離するが、液体は廃棄してよい。RNeasy Mini Spin Columnを新しい管（２．２ｍＬ）に配置し、５００μＬのバッファーＲＰＥを添加し、１０，０００回転／分で１５秒間再度遠心分離し、液体を廃棄する。今度は、５００μＬのバッファーＲＰＥを添加し、室温にて、１０，０００回転／分で２分間遠心分離し、液体を廃棄する。RNeasy Mini Spin Columnを新しい管（２．２ｍＬ）に配置し、室温にて、１３，０００回転／分で１分間、乾燥まで遠心分離する。RNeasy Mini Spin Columnをエッペンドルフキャップ（１．５ｍＬ）に配置し、RNaseを含まない３０μＬの水を膜の上に直接流す。次に、これを１０，０００回転／分で１分間遠心分離する。測定のために、３μＬのＲＮＡをバイオアナライザーで調べる。残った溶液を分割し（５μＬ部分）、−８０℃で冷凍庫内に保存する。

脂肪細胞からのＲＮＡの単離
RNeasy Mini Kitを用いて、脂肪細胞から全ＲＮＡを単離する。このために、デカントにより、脂肪細胞から分化／暴露培地を定量的に除去する。細胞の溶解及び細胞質ゾルＲＮＡの放出のために、塩酸グアニジニウム含有バッファー（Ｖ＝６００μＬ；Qiagen buffer RLT）の存在下、室温にて、脂肪細胞を６ウェル細胞培養プレートで２分間インキュベートする。細胞の完全な破壊のために、１ｍＬの使い捨て注射器及び使い捨て注射針（０．６０ｘ３０ｍｍ；２３Ｇｘ１^１／_４）を用いて、細胞懸濁液を切断する。無細胞抽出物を２ｍＬの反応容器に定量的に移す。１容量のエタノール（７０％）を添加することによって全ＲＮＡを沈殿させる。７００μＬの沈殿溶解物をRNeasy Mini Spin Columnに移して、≧８，０００ｘｇで１５秒間遠心分離する。全ＲＮＡがカラム材料と結合する。通過画分を廃棄する。残留量の溶解物を用いて、同じ手順を実施する。次に、７００μＬの洗浄バッファー（Qiagen buffer RW1）を添加し、≧８，０００ｘｇで１５秒間遠心分離する。再度、通過画分を廃棄する。次に、５００μＬのエタノール含有バッファー（Qiagen buffer RPE）でカラムを２回洗浄する。１回目の洗浄作業は、≧８，０００ｘｇで１５秒間の遠心分離（通過画分を廃棄する）によって実施し、２回目の洗浄作業は、≧８，０００ｘｇで２分間の遠心分離（通過画分を再度廃棄する）によって実施する。カラム材料の完全な乾燥のために、抽出カラムを新しい収集容器に移し、８，０００ｘｇで１分間遠心分離する。次に、抽出カラムを１．５ｍＬ反応容器に移し、５０μＬの水（RNaseを含まない）の添加により、カラムに結合した全ＲＮＡを再水和させる。次に、もう１回の遠心分離ステップ（≧８，０００ｘｇで１分）により、全ＲＮＡの最終溶出を実施する。測定のために、９０μＬの水を１０μＬのＲＮＡ溶液に添加し、２６０ｎｍの波長での吸収を測定する。１．００の吸収（Ａ２６０）は、５０μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ、３３μｇ／ｍＬの短い一本鎖ＤＮＡ又は４０μｇ／ｍＬのＲＮＡの濃度に相当する。残った４０μＬの溶液を分割し（１０μＬ部分）、−８０℃で冷凍庫内に保存する。

チップ技術
単離したｍＲＮＡをバイオチップにより調べる。このバイオチップのために、５００のバイオマーカ（表１〜１４を参照）を選択し、その特異的経路を調べた。バイオチップは、ハイデルベルクのFebit Biomed GmbHにより開発されたものである。各バイオマーカについて５つの異なるサンプルを製造し、各サンプルにつき６回の技術的反復を行うことから、各バイオマーカにつき３０回の反復を行う。Geniomバイオチップは、オリゴヌクレオチド合成用の標準キットを用いて、Geniom One Instrumentで合成した。光活性化ｉｎ ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成を、デジタルMicromirrorユニットで、ガラス−ケイ素−ガラスサンドイッチに載せた活性化３次元反応担体上のGeniom One Instrumentに接続する。RNA 6000 Nano Kitを用いたAgilent 2100バイオアナライザーで、ｍＲＮＡの質を調べる。

記載したプロトコルを用いて得られた、チップデータを含む２つの典型的組の例を図２ａ及び２ｂに示す。図に示すデータは、ｐＨ５．４で通常に培養した（図２ａ）、又はｐＨ２のストレスに暴露した（図２ｂ）ヤロウィア（Yarrowia)細胞からの抽出物で処理したヒト線維芽細胞のマーカの分析によって得られた。

試験の結果を表１５にまとめる。

様々なストレスを受けた酵母の抽出物で処理した細胞の異なる発現プロフィールから、酵母抽出物が、様々な特性を有しており、従って、これらが異なっており、識別可能な生成物であることがわかる。

実施例３：ヒト線維芽細胞に対する様々な酵母属のｐＨストレスを受けた細胞の抽出物の作用の比較研究
様々な酵母属の細胞が皮膚科学的に特に有効な抽出物を製造するのに好適である程度を調べた。

試験条件は、１つの株からだけではなく、ピキア（Pichia）CBS1991、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica)及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からの抽出物をヒト線維芽細胞と接触させて、それらの作用を比較したことを除けば、ｐＨストレスを受けた細胞の抽出物の製造のために実施例２に記載したものと同じである。

表１６にまとめた結果から、ｐＨストレスを受けたヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞が、ヒト線維芽細胞と接触すると、特に多数の皮膚マーカをプラスに調節する点で、皮膚に対し特に有利な作用をもたらすことが明らかである。

実施例４：抽出物への処理及びヒト線維芽細胞への適用後の皮膚科学的効果に関して、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞に対する様々なストレス条件の作用の比較
皮膚適用のための生物工学的かつ皮膚科学的に特に有利な酵母抽出物の供給源として、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞を決定した後、これら酵母抽出物の特に有利な製造方法をみいだすために、様々なストレス条件及びそれらの組合せを比較して、以下の結果を得た。

いずれのケースでも、抽出物は、水性及びアルコール性溶媒を用いて製造することによって、それぞれの作用を比較した。

表１７にまとめた結果から、まず、第１のケースにおいて、はるかに多数の皮膚科学関連の線維芽細胞マーカが、皮膚科学的に有利な方向に誘導又は抑制されていることから、水溶液を用いた細胞の溶解が、アルコール溶液を用いた溶解より好ましいことがわかる。

さらに、低ｐＨの培地への暴露後に温度上昇というストレス因子の組合せが、皮膚科学関連の線維芽細胞マーカの最も高いプラス調節をもたらしており、従って、他のストレス条件若しくはそれらの組合せより好ましいこともみとめることができる。

Claims (20)

1. 皮膚科学的に活性の酵母抽出物を製造する方法であって、
   ａ）前記酵母細胞の前培養を用意するステップと、
   ｃ）ｐＨ１．８〜４で少なくとも１５分間前記細胞を培養するステップと、
   ｄ）前記細胞を回収するステップと、
   ｅ）前記細胞を溶解するステップと
   を含む、方法。
2. ｂ）３４〜３９℃の温度及びｐＨ＞５で、少なくとも１時間前記細胞を培養するステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 水性溶解剤を用いて、ステップｅ）を実施する、請求項１又は２に記載の方法。
4. ステップｂ）を先に実施し、次にステップｃ）を実施する、請求項２又は３に記載の方法。
5. ３４〜３９℃の温度で、ステップｃ）を実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ステップｂ）を、３〜５時間継続する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップｃ）を、４５〜７５分間継続する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップｂ）及びｃ）を３６〜３８℃の温度で実施する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ステップｃ）をｐＨ１．９〜２．２で実施する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記酵母細胞はヤロウィア（Yarrowia)、サッカロミセス（Saccharomyces）及びピキア（Pichia）を含む属の群からの酵母細胞であり、好ましくはヤロウィア（Yarrowia)属である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ステップｂ）は、３６〜３８℃の温度で３〜５時間実施し、ステップｃ）は、ｐＨ１．９〜２．２、３６〜３８℃の温度で４５〜７５分間実施し、かつ、用いる前記酵母細胞が、ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法で取得することができる酵母抽出物。
13. ヤロウィア（Yarrowia)属の酵母細胞由来の酵母抽出物、又は請求項１２に記載の酵母抽出物を含む、皮膚科学的に活性の薬剤。
14. 前記薬剤が、皮膚及び／又は組織の引き締め作用を有する、請求項１３に記載の皮膚科学的に活性の薬剤。
15. 請求項１２に記載の酵母抽出物を含む栄養補助食品。
16. 前記酵母抽出物中のタンパク質の割合が、０．５〜５０ｍｇ／Ｌである、請求項１３又は１４に記載の皮膚科学的に活性の薬剤、又は請求項１５に記載の栄養補助食品。
17. 請求項１２に記載の酵母抽出物、又は請求項１３、１４若しくは１６のいずれか１項に記載の皮膚科学的に活性の薬剤の局所適用を含む、皮膚及び／又は髪の美容トリートメントの方法。
18. 医薬品を製造するための請求項１２に記載の酵母抽出物。
19. 脂肪蓄積、糖尿病、アテローム性動脈硬化、炎症性疾患、若しくは心臓血管病に対する医薬品、又は創傷治療用の医薬品を製造するための請求項１２に記載の酵母抽出物。
20. 角化細胞、線維芽細胞及び／又は脂肪細胞の増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を目的とする、請求項１２に記載の酵母抽出物の使用。

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