JP2014515265A - 第一胃内発酵由来のメタン放出を低減するカプセル化硝酸塩及び硫酸塩の使用 - Google Patents

Abstract

メタン放出の低減に使用される、第一胃における緩徐放出を可能にするために植物性脂肪でカプセル化された、硝酸塩及び硫酸塩を含有する、反芻動物用の顆粒形状栄養添加剤及び補給剤。
【選択図】 なし

Description

発明の分野

本発明は、家畜の生産の分野、詳細には動物の栄養の分野、より詳細には反芻動物への栄養補給剤及び添加剤の使用、正確には、第一胃における活性化合物の緩徐放出（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）を可能にし、活性化合物の完全な代謝を最大限にし、動物の中毒の危険性を低減するために、第一胃内メタン放出を低減することに使用される、水素化脂肪でカプセル化された硝酸塩及び硫酸塩の使用に関する。

発明の背景

大部分が二酸化炭素（ＣＯ_２）、メタン（ＣＨ_４）及び亜酸化窒素（Ｎ_２Ｏ）である温室効果ガス（ＧＨＧ）は、地表から放出される赤外線を部分的に吸収し、このことは赤外線の宇宙への消散を妨げる。しかしこのプロセスは、過剰な熱損失を遅らせ、地球を保温するので、地球上の生命維持にとって必須である。

それにもかかわらず、ＧＨＧ濃度の増加はこの自然現象を強化し、それによって、地球温暖化と呼ばれるプロセスである地球の平均温度の上昇をもたらす。

工業化のプロセス及び世界人口が次の数年間に増加する傾向を示していることを考慮すると、農業部門は、ＧＨＧ放出に関してより効率的になるよう圧力を受けている。

メタンは、二酸化炭素（１５０年）及び亜酸化窒素（１５０年）と比較すると短い半減期（１０年）を有するため、メタンの軽減は、ＧＨＧの軽減から得られる正の短期的気候効果を達成するのに主要な役割を果たす。

ブラジルでは、腸内発酵により生成されるメタンが、人間の活動により放出される総ＣＯ_２等価物（二酸化炭素等価物）のおよそ１２％を示す。この量において、９０％が腸内発酵のものである。農業部門のみを考慮すると、腸内発酵は、ブラジル農業のＣＯ_２等価物放出の５３％に相当する。地球規模では、反芻動物により生産されるメタンは、人間の活動により生産される総メタンのほぼ２２％を示す。

メタンは、第一胃において微生物発酵により自然に生産される。第一胃は反芻動物の一番目の胃であり、例えば細菌、原生動物、真菌、バクテリオファージなどの異なる種類の微生物が内部に共存している嫌気的発酵室である。メタン生成は、微生物プロセスの維持にとって必須であるが、メタン生産は、動物にとってエネルギー損失であると常に言われ、総エネルギー摂取量の５〜１２％の範囲である。

メタンは、ＣＯ_２及びＨ_２をエネルギー生産の基質として消費し、且つメタンを最終産物として排出する個体群であるメタン生成アーキア（Ａｒｃｈａｅａ）により生産される。第一胃において、メタン生産は水素圧力を低く保持するために必要であり、そのことは、基本的にセルロース、ヘミセルロース、デンプン、糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸などである飼料の分解の動因である微生物発酵のプロセスに必要である。

第一胃内での種間（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ）水素転移は、アーキアが他の第一胃内微生物の代謝活動によりもたらされた水素を消費する時のプロセスと定義される。水素が第一胃からメタンとして排出されない場合、水素圧力の増加が生じ、そのことは微生物発酵の全体的な抑制をもたらす。

例えば、乳牛は、約５００Ｌ／日のＣＨ_４を生産し、これは、およそ３５７ｇ／日に相当する。ブラジルの研究によって、牧草で飼育された乳牛がほぼ３７８〜４０３ｇ／日のメタンを生産することが確定された。

基本的にメタン軽減には２つの方法がある：
ａ）メタン生成と競合することができる代謝経路を刺激することであり、例としては、酢酸生成微生物、有機酸（リンゴ酸、フマル酸など）、及び水素受容体（過酸化水素、硝酸塩、硫酸塩など）の利用であり；
ｂ）第一胃内水素生産を低減することであり、例としては、イオン透過担体（例えば、モネンシンナトリウム）、精油及び植物第二級化合物の使用である。

記述された技術以外に、第一胃内メタン生産を低減する可能性のある他の戦略は、動物相除去（ｄｅｆａｕｎａｔｉｏｎ）（原生動物の排除又は低減）、生酵母の接種、免疫化又はワクチン接種によるアーキア個体群の制御、並びに脂肪補給及び食餌中の濃厚飼料（例えば、穀類）の増加などの栄養戦略である。

今までのところ、メタンを軽減する全ての技術は限界を示している。これらのうちの幾つかは、経時的に消滅する一過性の効果（例えば、精油、タンニン、モネンシン、ワクチンなど）のみを示すが、他は多様な結果を示す（例えば、精油、タンニン、サポニン、ワクチンなど）。更に、幾つかの物質は、動物に対して毒性であり（例えば、原生動物を排除するのに使用される幾つかの薬品、クロロホルム、及び高用量の無保護で容易に入手可能な硝酸塩）、高い費用のため（例えば、有機酸）又は使用が禁止されているので（例えば、ヨーロッパにおけるモネンシンナトリウム、サリノマイシン及びラサロシドナトリウムなどのイオン透過担体）、実現性がないことがある。最後に、幾つかの技術は初期的すぎており、例としては、ワクチン接種、免疫化、及び酢酸生成微生物の含有である。

硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）はＣＯ_２と比較してＨ_２に高い親和性を有し、硝酸塩還元微生物が基質をメタン生成アーキアと競合することを可能にする。硝酸塩から亜硝酸塩への還元（反応式１）及び亜硝酸塩からアンモニアへの更なる還元（反応式２）は、ＣＯ_２からメタンへの還元（反応式３）よりも多くのエネルギーを生ずる。このより大きなエネルギー生産は、メタン生成アーキアと比較して、硝酸塩利用微生物に競合的優位性をもたらす。

ＮＯ_３ ⁻＋２Ｈ^＋→Ｈ_２Ｏ＋ＮＯ_２ ⁻ （反応式１：(ΔＧ_０＝−１３０ｋＪ／水素１ｍｏｌ）
ＮＯ_２ ⁻＋４Ｈ_２→ＮＨ_４ ^＋＋２Ｈ_２Ｏ （反応式２：(ΔＧ_０＝−１２４ｋＪ／水素１ｍｏｌ）
ＣＯ_２＋４Ｈ_２→ＣＨ_４＋２Ｈ_２Ｏ （反応式３：(ΔＧ_０＝−１６．９ｋＪ／水素１ｍｏｌ）

反応式１及び２によると、アンモニアに還元された硝酸塩の各ｍｏｌは、１ｍｏｌメタンの生産を防ぐ。加えて、尿素と同様に、硝酸塩代謝に由来するアンモニアは、微生物タンパク質合成においてＮの供給源として役立つ。したがって、硝酸塩を非タンパク質窒素（ＮＰＮ）として、同時に抗メタン生成剤として使用できる可能性がある。その結果、反芻動物の食餌配合物のＮＰＮ供給源として通常使用される尿素又は真のタンパク質供給源（大豆かす、綿実かすなど）を、食餌への栄養上及び抗メタン生成の可能性を兼ねて、硝酸塩に代えることができる。

研究者は、第一胃内発酵により生産されるメタンが、硝酸塩の無保護（非被覆）供給源を使用した時に４６．６％低減したことを示した。

予め順応させることなく、突然含有させることにより給餌された硝酸塩は、反芻動物を含む動物に対して毒性であり、メトヘモグロビン血症と呼ばれる疾患を引き起こす。この疾患は、この分野において良く認識されており、例としては、動物が高硝酸塩濃度の水を飲んで摂取した時又は主に温暖気候によって高レベルの硝酸塩の蓄積した飼い葉を給餌した時に観察される。

いったん摂取されると、硝酸塩は、第一胃内微生物により中間体化合物である亜硝酸塩に代謝される（反応式１）。第二反応により、亜硝酸塩は、順次アンモニウムに還元される（反応式２）。亜硝酸塩形成をもたらす最初の還元反応は、亜硝酸塩を消費する反応よりもかなり速い速度で生じる。その結果、第一胃内での亜硝酸塩の蓄積がある。亜硝酸塩は動物にとって毒性の化合物である。亜硝酸塩は、消化管の壁に容易に吸収され、血液循環へと通過し、ヘモグロビンの第一鉄形態（Ｆｅ^２＋）を、第二鉄形態（Ｆｅ^３＋）に変換する。第二鉄形態は酸素を組織に輸送することができず、Ｏ_２の欠乏である無酸素症により引き起こされる死をもたらす。一般に、症状は高い脈拍数及び呼吸数の増加、続く筋攣縮及び全身の脱力である。目、口及び鼻の膜は、酸素不足により暗色になり、血液は茶色がかった又は「チョコレート色」の変色を示す。死は極限状態で生じる。慢性状態では、疾患は能力の損失をもたらす（乳汁生産、体重増加及び羊毛生産の低下）。

反芻動物の硝酸塩へのゆるやかな順応は、硝酸塩還元微生物、主にセレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）亜種ラクチリチカ（ｌａｃｔｉｌｙｔｉｃａ）、ベイヨネラ・パーブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）及びメガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）の繁殖及び活性の増加を可能にし、それによって亜硝酸塩蓄積の危険性を低減することが立証されている。しかし、動物の硝酸塩への順応は、反芻動物生産系において幾つかの実際的及び操作的な問題をもたらす。食餌の変化は動物にストレスを与え、この期間に動物の生産可能性を低下させる。更に、順応段階は、飼料（ｒａｔｉｏｎ）の調製及び動物への飼料の供給の際に取扱者により起こされる間違い及び誤りに起因する潜在的な危険性がある。

硝酸塩と同様に、硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）から硫化水素（Ｈ_２Ｓ）への還元も、水素を減らし、メタンの第一胃内生産を最小限にする代替的経路である（反応式４）。第一胃において、メタン生成アーキアと同様に、硫酸塩還元細菌は増殖のために水素を利用する。その結果、硫酸塩還元微生物の増殖を刺激することは、メタンを低減する戦略であり、したがって水素消費の代替的経路を増強する。

硫酸塩還元により得られるエネルギー生産（(ΔＧ_０＝−１５２ｋＪ）は、メタン生産によりもたらされるエネルギー（(ΔＧ_０＝−１３１ｋＪ）よりも高く、この代替的代謝経路がメタン生成と競合することを可能にする。
ＳＯ_４ ^２−＋４Ｈ_２＋２Ｈ^＋→Ｈ_２Ｓ＋４Ｈ_２Ｏ （反応式４）

硫黄供給源の使用は、硝酸塩による中毒の危険性を最小限にするためにとりわけ重要である。硫黄はＨ_２Ｓに還元され、Ｈ_２Ｓは亜硝酸塩からアンモニウムへの還元において水素供与体として作用する。したがって、少ない亜硝酸塩の蓄積は中毒の危険性の低下を意味する。硫黄化合物は硝酸塩中毒の危険性を低減できることが、科学界に広く知られている。

したがって、動物に有害でなく、例えば中毒の危険性がなくメタン放出を低減する、又は多額の投資若しくは加えて複雑なプロセスを要しないで適用及び使用に好都合である製品についての、動物の栄養に関する当該技術における隔たりが理解される。

このことに基づき、製品のとぎれない開発を考慮して、以下に公表するように、新規性及び発明的活動により保護の特権を本明細書により請求する革新が提案される。したがって、顆粒形態のカプセル化栄養添加剤が提案され、それによって硝酸塩及び硫酸塩の緩徐放出、並びにその組成物の変形を可能にする。

そのような顆粒又はその変形物は、動物の中毒を回避し、且つ第一胃における硝酸塩及び硫酸塩の完全な代謝を促進することを目的として、メタン軽減の動因となる硝酸塩及び硫酸塩、並びに添加剤によって、又は第一胃環境における硝酸塩及び硫酸塩の放出速度及び可溶化の低下の動因となる植物性脂肪で被覆／カプセル化された同様の組成物によっても製造される。

同様の方法において、植物性脂肪による被覆に対する代替案として、物質の制御放出を促進することに関して脂肪で示されるものと等しい又は同様の特性を示す、動物栄養と適合する任意の他の材料を使用することが可能である。セルロース及びカルボキシセルロースを主成分とする乳剤（例えば炭酸カルシウム、ショ糖、植物油及びキサンタンガムと共に添加される）、ポリビニルアルコールと混合したデンプン及び他の多糖類を含有する被覆、並びにリグニン／リグノスルホネート又はキトサンバイオポリマーを主成分とする被覆などの、第一胃において分解性又は非分解性である天然材料が、本明細書において特徴付けられる。あるいは、被覆は、カルボキシビニル；ポリアクリル酸（アクリル樹脂、ポリエチレンなど）；アルギン酸；ポリヒドロキシアルカノエート；ポリヒドロキシオクタノエート；ポリヒドロキシブチレート（バイオポール（Ｂｉｏｐｏｌｓ））；ポリカプロラクトン；ポリ乳酸；ビウレットとウレタン及びキリ油との溶液；イソシアネートとアルキド樹脂、ヒマシ油及び過酸化物の混合物；ステアルアミドとパラフィンの混合物、ステアリン酸マグネシウム；他の樹脂（ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｈｅｒｓ）、ポリエポキシド、シリコーン、ポリビニリデンクロリドなど、並びにこれらの混合物）；アルキル及びシクロアルキルアミン；石油から誘導されるパラフィン及びロウなどの、第一胃において分解性又は非分解性である合成ポリマーから構成することもできる。

カプセル化に使用される脂肪のうち、ダイズ油、ヒマシ油、パーム油、カシューナッツシェル油又はカシューナッツシェル液、綿実油、アマニ油、ピーナッツ油、ババス油、ヒマワリ油、ヤシ油、カノーラ油、コムギ油、コメ油、トウモロコシ油、ココア油、ベニバナ油、並びに（植物又は動物供給源由来の）ロウ、例えばカルナウバロウ、トウモロコシロウ、カスターワックス及びミツロウが、本明細書において記述される。本明細書において、脂肪供給源１つだけの独立した使用だけでなく、融点、可塑性、ロウ特性、並びに耐衝撃性及び耐摩耗性の観点から、機能性脂肪酸の供給などの利点をもたらすことを目指した、２つ以上の脂肪供給源の組み合わせの使用も除外されない。

関連技術の分析

国際公開第０１０９２１号の保護は、摂取された飼料の通常の発酵の際に水素原子によってメタン生成と競合することができる作用物質の利用によって、反芻動物における胃腸内メタン生成の低減を意図する。硝酸塩を主成分とする１つの化合物と硫酸塩を主成分とする１つ化合物の組み合わせを多量に包含する製品、または、亜硝酸塩を還元するプロバイオティック微生物、並びにそのような組成物を使用して反芻動物における胃腸内メタン生成を低減する方法が提供される。そのような方法は、第一胃内緩徐放出のための硝酸塩及び硫酸塩の保護、被覆及びカプセル化を意図せず、提案されている目的の特徴から離れている。

米国特許第６２３１８９５号明細書の発明では、第一胃内インキュベーションの条件下でアンモニアの制御された安全な放出をもたらすレベルの非タンパク質窒素（ＮＰＮ）を有する、反芻動物用の栄養補給剤の提供することが記載されている。別の形態では、この発明は、第一胃内分解性ポリマーで作製された被覆でカプセル化された尿素粒子を包含する非タンパク質窒素の制御放出を有する、反芻動物用の栄養補給剤を提供する。この発明は、硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする補給剤を扱わないので、本明細書において提案されている目的から離れている。

国際公開第０３０６８２５６号の文献は、食餌デンプン利用の効率を高める、乳酸の第一胃内濃度の有害な増加／又は第一胃内ｐＨの低下を回避する、並びに第一胃内微生物の有益な増殖を促進する、第一胃内発酵効率の改善のための方法及び組成物を扱っている。この発明の方法及び組成物は、増殖及び生産性を刺激する酵母菌、緩衝剤、イオン透過担体又は他の作用物質の補給も含みうるが、脂肪を主成分とするあらゆる被覆に言及していないので、本明細書において提案されている目的の特徴から離れている。

ＰＩ０６０８９１９の特許は、鉄、銅及びグラファイトの総重量に対して、グラファイトが２〜７重量％の量、銅が０〜５重量％の量、鉄が８８〜９８重量％の量で混合物に存在する、鉄、グラファイト及び任意の粉末銅の混合物を包含する、反芻動物における小型材料から構成される第一胃内活性剤の投与用放出装置の製造のための使用に適した構造要素を開示する。放出装置の構造一体性を達成するために、多様な構造要素を組み合わせることができる。この特許では、組成物の第一胃内緩徐放出用装置が記載され、組成物における硝酸塩の使用又はカプセル化のプロセスも言及しておらず、したがって本明細書において提案されている革新の特徴から離れている。

ＰＩ０３０５０４７の保護では、尿素、硫黄、ババスデンプン、ババス荒粉がそれぞれ３０％〜６０％、１．５％〜３．０％、２０％〜３０％及び２０％〜３０％の割合の混合物を組成物に収容する、ババス殻果のデンプン質材料から主に構成される、反芻動物用飼料が検討されている。化合物調製の方法は、ババス殻果の選択、殻果の殻むき、デンプン質材料の洗浄、デンプン材料の粉砕、製品配合及び熱処理の段階を包含する。この化合物では、ＮＰＮは、ゼラチン状形態で被覆されてババスデンプンにより保護され、これにより水中での可溶化が妨げられる。このことは、第一胃内のアンモニア緩徐放出ももたらし、したがって、微生物タンパク質合成の際に第一胃内微生物によるＮＰＮの利用を増加させる。化合物は、実際、Ｎ：Ｓ比の１０：１に対応する製品であり、反芻動物にタンパク質を提供することの他に、デンプン由来のエネルギーも提供する。この製品の使用は、中毒の危険性が低く、少量を、餌付け給餌系（ｃｒｅｅｐ−ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）で子牛に給餌することが可能である。この文献は、デンプン及び非硝酸塩物質を主成分とする組成物に関し、本明細書において提案されている本発明の特徴から離れている。

ＰＩ９２０１２１７の文献は、食道から動物の第一胃に導入されるように適合され、カプセルに保持された生物学的活性組成物の長時間の連続遊離のために、第一胃内に保持される緩徐放出カプセルを示す。長い管状の本体、管、及び生物学的活性組成物を内部に保持するために管の端部に取り付けられた端末蓋、並びに他方の端部がディスペンサーである、カプセルである。ディスペンサーの端部は、組成物を第一胃に放出するために開口部を示す。この発明は、生物学的活性組成物の緩徐及び漸進放出（ｇｒａｄｕａｌ ｒｅｌｅａｓｅ）用カプセルを扱っており、硝酸塩に全く言及しておらず、したがって本明細書に示されている発明において提案されている要件と衝突しない。

ＣＡ２７２５３８０の特許は、反芻動物給餌用ディスペンサーと１つ以上の栄養補給剤とを含む方法を記載し、ここでディスペンサーには、動物が頭部を導入する位置に近接して置かれたガス分析機が取り付けられている。この方法は、ＲＦＩＤ耳標の識別を読み取ることによって、飼料供給台（ｆｅｅｄｂｕｎｋ）（ディスペンサー）を利用する特定の反芻動物を決定し、メタンを低減するために栄養補給剤も放出する。この方法は、二酸化炭素及びメタンのレベルを決定するガス分析機を含み、メタンの生産を制御し動物の所望の能力を達成するために、次の給餌に提供される飼料の種類及び量を変更するデータプロセッサーも含む。この保護は、給餌機器に関し、本明細書において提案されている発明の特徴から離れている。

国際公開第２０１００７１２２２号の文献は、反芻動物における第一胃内メタン放出の阻害剤を報告している。正確には、活性化合物としての過酸化水素により特徴付けられる、反芻動物によるメタン放出の阻害剤である。この革新は、過酸化物によるメタン生産の軽減についてであり、本明細書において提案されている発明の特徴から離れている。

国際公開第２００６０４０５３７号の特許は、反芻動物におけるメタン生産の抑制、並びに／又は食肉及び／若しくは乳汁の生産及び品質の改善に関する。特にこの発明は、カプセル化有機酸、とりわけフマル酸の使用について言及している。反芻動物によるメタン生産の低減への利用のためにカプセル化脂肪酸、とりわけフマル酸の使用により反芻動物を給餌することを包含する組成物も意図する。そのような使用及び組成物は、代替的に、体重増加の増大及び／又は乳汁生産をもたらすこともできる。この保護は、硝酸塩を記述することなくカプセル化有機酸を記載しており、本明細書において提案されている発明の特徴から離れている。

特開２００３０８８３０１号公報の特許は、自然発酵したヒツジ乳汁誘導生成物から得たラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の選択された菌株、酵母菌及びオリゴ糖（ｏｌｉｇｏｓｓａｃｈａｒｉｄｅ）の少なくとも１つを経口投与により反芻動物に提供することによって、第一胃環境を悪化させることなくメタンの生成を抑制する組成物を示している。メタンに対する抑制効果は、硝酸塩添加により改善することができ、ラクトバチルス及び酵母菌は、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物、特にオリゴ糖、好ましくはガラクトオリゴ糖の少なくとも１つの種類を含む。そのような発明は、カプセル化硝酸塩を記述することなく、メタン生産を抑制する乳汁誘導生成物を扱い、本明細書において提案されている発明の特徴から離れている。

ＧＢ１４４５５６０の保護は、第一胃においてメタンの生産を抑制するために、複合飼料（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｆｅｅｄ）、補給ブロック（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｂｌｏｃｋ）、液体飼料補給剤、緩徐放出ペレット、サイロ貯蔵飼い葉、イソブチルアルデヒドと、アジピン酸、グルタル酸及びコハク酸の混合物、酢酸、ホルミル、硫酸又はトリオキサンとを含有する乾草又は穀物を示す。このペレット化食餌の使用は、オオムギ、コムギ、ピーナッツ、糖蜜、塩、石灰石、リン酸水素カルシウムを含有することができる。この特許は、動物の食餌のみを記載し、本明細書において提案されている革新の特徴から離れている。

発明の詳細な説明

当該技術において示されている欠陥に鑑みて、硝酸塩及び硫酸塩、並びにその組成物から構成される顆粒形態のカプセル化栄養添加剤が革新として提案される。

そのような顆粒又はそれらの変形物は、動物の中毒を回避し、且つ第一胃内環境における硝酸塩及び硫酸塩の完全な代謝を促進することを目的として、第一胃内環境における硝酸塩及び硫酸塩の緩徐及び漸進放出／可溶化の動因となる水素化植物性脂肪で再被覆／カプセル化されている、添加剤又は同様の組成物とも組み合わされた、メタン生産の軽減の動因となる硝酸塩及び硫酸塩により製造される。

同様の方法において、植物性脂肪による被覆に対する代替案として、物質の制御放出をもたらすことに関して脂肪で示されるものと等しい又は同様の特性を示す、動物栄養と適合する任意の他の材料を使用することが可能である。セルロース及びカルボキシセルロースを主成分とする乳剤（例えば炭酸カルシウム、ショ糖、植物油及びキサンタンガムと共に添加される）、ポリビニルアルコールと混合したデンプン及び他の多糖類を含有する被覆、並びにリグニン／リグノスルホネート又はキトサンバイオポリマーを主成分とする被覆などの、第一胃において分解性又は非分解性である天然材料が、本明細書において特徴付けられる。

または、被覆は、カルボキシビニル；ポリアクリル酸（アクリル樹脂、ポリエチレンなど）；アルギン酸；ポリヒドロキシアルカノエート；ポリヒドロキシオクタノエート；ポリヒドロキシブチレート（バイオポール（Ｂｉｏｐｏｌ））；ポリカプロラクトン；ポリ乳酸；ビウレットとウレタン及びキリ油との溶液；イソシアネートとアルキド樹脂、ヒマシ油及び過酸化物の混合物；ステアルアミドとパラフィンの混合物、ステアリン酸マグネシウム；他の樹脂（ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｈｅｒｓ）、ポリエポキシド、シリコーン、ポリビニリデンクロリドなど、並びにこれらの混合物）；アルキル及びシクロアルキルアミン；石油から誘導されるパラフィン及びロウなどの、第一胃において分解性又は非分解性である合成ポリマーから構成することもできる。硝酸塩及び硫酸塩により促進される抗メタン生成特性の他に、カプセル化は、硝酸塩中毒の危険性を劇的に低減し、動物の福祉及び健康を保護し、したがって中毒による損失の危険性を最小限にする。非カプセル化硝酸塩を使用すると、中毒のシナリオが実際に起こる可能性が非常に高い。

加えて、カプセル化プロセスは、活性化合物の硝酸塩及び硫酸塩を第一胃液滞留時間（およそ６〜２４時間）に適合した時間間隔で放出することができ、したがって、第一胃におけるこれらの塩の完全な可溶化を可能にすることが強調される。

実際には、カプセル化が利点をもたらす幾つかの状況がある。動物の取扱者又は動物の給餌に関与する人々により引き起こされる管理の誤りは、非常に頻繁である。多量の硝酸塩が、注意不足によって動物に摂取されうる。飼料の不十分な調製、成分計量の際の間違い及び成分の不適切な混合は、この分野における一般的な状況であり、動物による高レベルの硝酸塩の摂取をもたらしうる。そのため、硝酸塩及び硫酸塩のカプセル化は、多量の硝酸塩が非順応動物により摂取されたときに動物を保護する。要約すると、カプセル化は、硝酸塩の過剰服用の場合に動物の安全性を確保する。

被覆された硝酸塩及び硫酸塩の追加の利点は、「飼料供給台での安全性」又は「飼料供給台での保護」であり、これらは家畜部門で通常に使用される用語である。雨が降り、非被覆硝酸塩が屋根のない飼料供給台で供給される場合、この塩が、水中で高度に可溶性があるため、硝酸塩の急速な可溶化が生じる。この高硝酸塩濃度を有する水は、一度摂取すると動物の中毒及び死亡をもたらしうるため、中毒の危険性を増加させる。したがって、被覆プロセスは、硝酸塩及び硫酸塩の可溶化を劇的に遅延し、上述の状況において動物の安全性をもたらす。

被覆プロセスは、適切なメタン軽減に必要な用量を達成するために実際の条件ではほぼ４週間続く、動物の漸進的で連続的な硝酸塩への順応の必要性も排除する。硝酸塩への順応段階は、飼料調製及び動物への給餌に費やされる時間を増加し、またプロセスを更に複雑にし、次いで操作の誤りの機会を増やすという、管理上の問題ももたらす。そのためカプセル化は、動物への給餌を簡素化し、動物に対する危険性を有することなく、推奨される用量で硝酸塩及び硫酸塩を直接提供するという、明確な利点をもたらす。

被覆により促進された硝酸塩及び硫酸塩の第一胃内緩徐及び漸進放出は、第一胃内環境における硝酸塩及び硫酸塩の完全な代謝も確実にする。このことは、第一胃壁による硝酸塩及びこの中間体化合物である亜硝酸塩の吸収を回避し、したがって血液循環中の硝酸塩及び亜硝酸塩の濃度を低減する。

したがって、カプセル化は、硝酸塩からアンモニアへの完全な還元を可能にし、メタン軽減の効率を高める。硝酸塩及び／又は亜硝酸塩は、第一胃壁に吸収されると水素を抜き取らず、したがってメタン軽減の効率を低減することが強調される。

更に、カプセル化は、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩の血液中への循環を低減又は排除し、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩の尿又は乳汁への排出を回避する。多量では、硝酸塩は地表水及び地下水の汚染源である。乳汁において自然に見出されるが、高濃度の硝酸塩は、とりわけ新生児及び子供により摂取された場合に潜在的に危険であり、メトヘモグロビン血症と呼ばれる疾患も引き起こしうる。

硝酸塩及び硫酸塩被覆により促進される別の追加的な利点は、第一胃におけるＮＰＮの緩徐放出である。窒素の漸進遊離は、炭水化物分解と微生物タンパク質合成の同期化を可能にし、ＮＰＮの適切で完全なアミノ化を可能にする。それに伴い、より伝統的な供給源（例えば、尿素）に代わる窒素供給源としての硝酸塩の使用は、硝酸塩還元から誘導される微生物増殖のエネルギーがメタン生成よりも大きいので、利点として微生物タンパク質合成の最大化を示す。微生物タンパク質合成の最大化は、微生物タンパク質が、反芻動物の栄養にとって最も重要であり、且つ最良のタンパク質供給源であるので、動物能力の改善にとって重大である。窒素に加えて、被覆された硝酸塩及び硫酸塩を含有する組成物は、動物に硫黄、カルシウム及びマグネシウムを提供する。

製品は、好ましくは４０％〜９７％、より好ましくは６０％〜８５％の硝酸塩；好ましくは１％〜４０％、より好ましくは３％〜２０％の被覆用油脂；好ましくは５０％まで、より好ましくは５％〜４０％の硫酸塩；及び好ましくは２０％まで、より好ましくは０．１〜１０％の他の添加剤から構成される。

好ましくは硝酸カルシウム及び硫酸マグネシウムが使用される。または、同様の塩によって、又は異なる硝酸塩と硫酸塩の組み合わせによってこれらの塩を交換することも容認される。

使用される硝酸塩と硫酸塩は、動物に許容され、したがって生理学的に適するように、第一胃液において十分に可溶性でなければならない。塩は、潜在的に毒性の量で重金属又は他の鉱物を担持することができず、また、動物の給餌に使用される製品に対する規制当局の要件に対応している。一般的に言えば、硝酸塩及び硫酸塩は無機塩として提供される。

硝酸カルシウムは、好ましくは、硝酸アンモニウムカルシウム十水和物［５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ］という複塩であるが、硝酸カルシウム四水和物［Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏ］、硝酸カルシウム無水物［Ｃａ（ＮＯ_３）_２］、硝酸マグネシウム［Ｍｇ（ＮＯ_３）_２．６Ｈ_２Ｏ］、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_３）、硝酸カリウム（ＫＮＯ_３）、硝酸アンモニウム（ＮＨ_４ＮＯ_３）、硝酸カルウレア［Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４ＣＯ（ＮＨ_２）_２］、硫酸及び硝酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４．３（ＮＨ_４ＮＯ_３）又は（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４．２（ＮＨ_４ＮＯ_３）］という複塩などの他の塩の利用、並びに上記に引用された塩の、結晶水の数又は結晶水の欠失に起因する可能な変形は除外されない。非被覆／無保護の硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム及び硝酸アンモニウムが反芻動物においてメタン放出を低減したことは、既に示されている。

同様に、最終製品に新たな特性を加える又は軽減効果を改善さえするために、硝酸塩の混合物を利用することは、本明細書において除外されない。

硫酸マグネシウムは、好ましくは、一水和物又は無水物（ＭｇＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ又はＭｇＳＯ_４）であるが、硫酸マグネシウム七水和物［ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ］、硫酸ナトリウム［Ｎａ_２ＳＯ_４無水物、Ｎａ_２ＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ及びＮａ_２ＳＯ_４．１０Ｈ_２Ｏ）、硫酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４］、硫酸カリウム（Ｋ_２ＳＯ_４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ_４又は２ＣａＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４無水物又はＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ又はＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４無水物又はＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ_４無水物又はＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ）、並びに上記塩の、結晶水の数又は結晶水の欠失に起因する記述されなかった変形の使用は除外されない。亜硝酸塩の第一胃内蓄積の低減及び中毒の危険性の最小化における、硫酸ナトリウム及び硫酸銅、並びに硫酸マグネシウムの効果は、既に示されている。

同様に、最終製品に他の特性を加える又は軽減効果を改善さえするために、硝酸塩又は可能な代替物の混合物を利用することは、本明細書において除外されない。

同様に、硫酸塩の置換では、硫黄単体、並びに硫化物（例としては、Ｎａ_２Ｓ．９Ｈ_２Ｏ、ＣａＳ、ＺｎＳ、Ｋ_２Ｓ）及び亜硫酸塩（例としては、Ｎａ_２ＳＯ_３、Ｋ_２ＳＯ_３、ＣａＳＯ_３、ＭｇＳＯ_３）の使用も、本明細書において除外されない。

インビトロとインビボの両方において、亜硝酸塩の第一胃内蓄積の低減及び中毒の危険性の最小化における硫酸塩及び亜硫酸塩の特性は、既に示されている。最後に、過硫酸塩（ＳＯ_２ ^−５）、チオ硫酸塩（Ｓ_２Ｏ_２ ^−３）及び次亜硫酸塩（ＳＯ_２ ^−２）の使用も、本明細書において考慮される。Ｌ−システイン（無水、一水和物及び塩酸塩（ｃｈｌｏｒｉｄｒａｔｅ））も含めることができ、第一胃内亜硝酸塩蓄積の低減、したがって反芻動物における硝酸塩及び／又は亜硝酸塩中毒の最小化において周知の特性を有する硫黄含有アミノ酸の１つである。本明細書において、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＷＯ_４）で示されているように、硝酸レダクターゼを抑制する特性を含有する金属の使用は、除外されない。

配合物に好ましく含めることができる添加剤に関連して、天然又は合成の芳香剤及び香味剤であるが、動物に有害ではないもの（例えば、グルタミン酸一ナトリウム、サッカリン、スクロース、デキストロース、グルコース、グアバエキス、バニラなど）、酸化防止剤（例えば、ビタミンＣ、ベータカロテン、ＢＨＴ−ブチルヒドロキシトルエン、ＢＨＡ−ブチルヒドロキシアニソール）、酸化剤（クエン酸、酢酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸）、乳化剤／安定剤（例えば、レシチン、キサンタン、ガム、ポリソルベート、プロピレングリコール、モノステアレート、モノ−ジ−グリセリドなど）及び味覚向上剤など、最終製品に特性を統合できるものが記載される。

例えば炭酸カルシウム、デンプン、微晶質セルロース、リン酸三カルシウム、シリカ／ケイ酸塩、タルカムパウダー、カオリン、ステアリン酸カルシウムなどの、保存の際に顆粒の流動性を最終的に維持することができる湿潤防止及び固化防止剤の含有を考慮することが、本質的に重要である。

同時に、多量ミネラル、微量ミネラル、ビタミン（例えば、Ａ、Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_９、Ｂ_１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ）、精油（カルバクロール、オイゲノール、チモール、シンナムアルデヒド、カプサイシン、リモネンなど）、有機酸（乳酸、リンゴ酸、フマル酸、アスパラギン酸など）、脂肪酸（例えば、ＣＬＡ−共役リノール酸；ミリスチン酸；アナカルジン酸；中鎖脂肪酸−カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、ラウリン酸；並びにアルファ−リノレン酸−ＡＬＡ；エイコサペンタエン酸−ＥＰＡ；ドコサヘキサエン酸−ＤＨＡなどのオメガ−６及びオメガ−３脂肪酸など）、アミノ酸（主に、システイン及びメチオニンなどの硫黄含有アミノ酸であるが、ヒスチジン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、グリシンなども考慮される）、酵素（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、キシラーゼ、β−グルカナーゼ、フィターゼ、他のグルカナーゼなど）、緩衝剤及びアルカリ化剤（重炭酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムなど）、酵母菌（トリコスポロン種、カンジダ種、ロイコノストック種、ラクトコッカス種、カンジダ・ケフィール（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、真菌（例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｅａｅ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））、プロバイオティクス及び他の生微生物（ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種及びセレノモナス・ルミナンチウム、ベイヨネラ・パーブラ、ウォリネラ・スクシノゲネス、メガスファエラ・エルスデニイ、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０などの主に硝酸塩／亜硝酸塩還元活性を有するもの；並びに腸内細菌、コリネ型細菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）種及びアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種）などの他の栄養添加剤を、最終組成物に新規特性をもたらすことを目指して含むこともできる。

亜硝酸塩蓄積及び硝酸塩毒中毒の危険性を低減する特性が知られている物質であるガラクトオリゴ糖及び／又はナイシンを含めることもできる。最後に、潜在的に使用可能な他の添加剤は、反芻動物の栄養に通常利用される抗生物質（イオン透過担体−モネンシンナトリウム、サリノマイシン、ラサロシド、ナラシン−他の抗生物質、例えばバージニアマイシン、アビラマイシン、バシトラシン、フラボマイシン、チロシン）、抗微生物特性を有する天然物質（プロポリス、ベータ酸、アルファ酸、他のホップ由来酸、カルダノール、カルドール、タンニン、サポニン）、駆虫剤及び抗コクシジウム剤／コクシジウム抑制剤（ａｎｔｉｃｃｏｃｉｄｉａｌｓ／ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔｓ）である。

顆粒は、動物中毒を回避し、且つ第一胃における硝酸塩及び硫酸塩の完全な代謝を最大化する意味において、好ましくは、第一胃内環境における硝酸塩及び硫酸塩の緩徐及び漸進放出／可溶化の動因となる植物性脂肪により被覆されている。

被覆は、それ自体、疎水性であり、硝酸塩／硫酸塩の緩徐及び漸進可溶化を可能にする。顆粒の被覆は、硝酸塩／亜硝酸塩の第一胃内蓄積を回避し、そして動物毒中毒の危険性を低減するように、硝酸塩／硫酸塩の放出と還元反応の同期化を可能にする。硝酸塩の漸進放出は、硝酸塩から亜硝酸塩への還元と同じ速度で生じる、亜硝酸塩からアンモニウムへの還元を可能にし、したがって亜硝酸塩の第一胃内蓄積を回避する。追加の利点として、脂肪によるカプセル化は生分解性である。脂質は、小腸で消化され、補給脂肪としても役立ち、したがって追加的なエネルギーを提供する。

被覆された時、最終製品の顆粒は、１．５ｍｍ〜１２ｍｍの直径を有する。硝酸塩／硫酸塩の遊離速度は、１時間あたり１％〜３０％、より好ましくは１時間あたり５％〜２５％の範囲である。最終製品の密度を考慮すると、０．８５ｇ／ｃｍ^３〜１．１５ｇ／ｃｍ^３、より好ましくは０．９０ｇ／ｃｍ^３〜１．１０ｃｍ^３の範囲である。

製品は、家畜化種又は野生種の全ての反芻動物向けである。例えば、本明細書には、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、シカ科、ラクダ科、キリン科、アンテロープ、バイソン及びヤクが含まれる。しかし、便宜上及び重要性により、本明細書に記載されている技術は、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びハーテビーストなどの主に家畜化種向けである。

これらの動物では機能性第一胃が必要であり、反芻発達前動物（ｐｒｅ−ｒｕｍｉｎａｎｔ ａｎｉｍａｌｓ）、例えば新生子ウシ及び子ヒツジにおける利用は除外される。加えて製品は、補給を受けている牧草飼育の動物だけでなく、飼育場動物向けでもある。

給餌の期間は不確定であり、動物が機能性第一胃を有した時から屠殺される時まで連続して供給される。製品は、長期利用に起因して効率を失うことなく、メタン軽減の長期効果を有する。

製品は、飼料に提供され（自発的な動物摂取）、完全混合飼料（ｔｏｔａｌ ｍｉｘｅｄ ｒａｔｉｏｎ）（ＴＭＲ；粗飼料／飼い葉、濃縮飼料／穀物、ミネラル補給剤、ビタミン補給剤及び添加剤などの動物に必要な全ての成分の混合物）、タンパク質補給剤、エネルギー補給剤、タンパク質／エネルギー補給剤又はミネラル補給剤である。そのような補給剤は、高摂取量又は低摂取量補給剤のいずれでもあり、好ましくは高摂取量補給剤であり、一般的に牧草で飼育されたまま反芻動物に給餌される。高摂取量及び低摂取量補給剤は、それぞれ多量（体重１ｋｇあたり２ｇ〜４ｇ）及び少量（体重１ｋｇあたり１ｇまで）量で摂取された飼料の混合物を称するために、専門家に一般的に使用される用語である。

飼料又は補給剤に混合するには、硝酸塩及び硫酸塩の組成物の顆粒を上から供給することもでき、すなわち、顆粒を、飼料供給台に入れた飼料の上にまくことができる。動物が自発的な選択を示す限り、製品の単独供給も考慮される。

製品を、動物に給餌している時に飼料又は補給剤に混合することができる。同様に、製品を飼料会社及び飼料工場により生産された飼料及び補給剤と混合することができ、そのようにして長期間保存することができる。良好な耐摩耗性により、混合時にはそのようなプロセスを手作業及び／又は混合ワゴン（ｍｉｘｉｎｇ ｗａｇｏｎ）の使用の両方により実施することができる。

被覆は、硝酸塩が本来示す高い吸湿性に対する保護を促進する。空気及び熱に曝露されると、非カプセル化硝酸塩は空気中の湿気を吸収して、急速に液化する。したがって、カプセル化は製品と飼料又は補給剤との予備混合を可能にし、最終製品の品質の損失を伴うことなく長期の保存を可能にする。

加えて、硝酸塩及び硫酸塩を含有するカプセル化製品は、より均質な混合を可能にする。硝酸塩は一般に顆粒状形態で見出されるが、硫酸塩は粉末塩である。この粒度分析の差及び密度の差は、適切な均質化、並びに輸送及び保存中の粒子の偏析に関する問題をもたらす。硝酸塩及び硫酸塩を含有する単一顆粒として示されるカプセル化製品は、これらの問題を最小化する利点を有する。

実施例１
本革新の効果を証明するために、非カプセル化硝酸塩と比較した時の、脂肪を用いた２つのカプセル化法の効力を実証することを目指して、カプセル化及び非カプセル化硝酸塩の放出を測定するインビトロ試験を実施した。使用される材料は、硝酸アンモニウムカルシウム十水和物であった。

この試験では、以下のような３つの処理を使用した：
ｉ．対照：非カプセル化硝酸カルシウム；
ｉｉ．プロトタイプ１：カプセル化硝酸カルシウム；
ｉｉｉ．プロトタイプ２：カプセル化硝酸カルシウム。

１つの処理に３つの複製物を使用した。それぞれ１Ｌのフラスコに、５００ｍＬの蒸留水を２．４８２ｇの硝酸アンモニウムカルシウム十水和物と共に加えた。プロトタイプは、２．４８２ｇの純粋な硝酸アンモニウムカルシウムに相当する量を含んだ。

インキュベーションを強制循環インキュベーターにより３９℃及び１００ｒｐｍで実施した。試料を、処理を加えた後、０分、５分、１０分、１５分及び３０分；１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間及び４８時間で採取した。それぞれの試料採取時間に、５ｍＬを採取した。

水に溶解した硝酸塩を、フェノールジスルホン酸と、続く水酸化ナトリウムによるアルカリ化（ａｌｃａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いた比色法によって分析した。

試験結果を図１（添付１）に示し、カプセル化硝酸供給源が非カプセル化供給源と比較した時、より緩徐な可溶化を示すことを実証している。このことは、脂肪によるカプセル化が効果的であり、水性溶媒において緩徐及び漸進硝酸塩放出をもたらすことを支持している。したがって硝酸塩顆粒の被覆は、利点として、動物の中毒の危険性の低減をもたらす。

実施例２
この実験の目的は、動物の成長、メタン生産、第一胃及び血液の構成成分、消化率、Ｎ平衡、微生物のＮ生成、並びに屠体枝肉及び食肉の特性に対する、２種類のカプセル化（緩徐放出）硝酸塩の効果を評価することであった。

この実験は、サンパウロ大学（ブラジル、サンパウロ州ピラシカバ）の動物栄養学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｎｅｒｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにおいて実施した。全ての動物使用手順は、同じ施設内の環境倫理及び動物実験の内部委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｎｉｍａｌｓ）により推奨された指針に従った。

材料及び方法
実験は、８５日間からなり、うち２１日間が食餌順応（２０１１年４月２７日〜２０１１年５月１７日）であり、６４日間（２０１１年５月１８日〜２０１１年７月２０日）が成長評価であった。成長評価期間の後、消化率試験を５日間実施し、これは最後のメタン測定とともに行った。

実験設計及び処理
１８匹のサンタイネス雄子ヒツジ（初期ＢＷ２７．０６ｋｇ）を、６ブロック３処理の無作為化完備ブロック計画に指定した。ブロックを、実験の開始時の体重（ＢＷ）及び年齢によって設計した。動物を、以下のように３つの食餌処理に割り当てた。：
対照−非タンパク質Ｎ（ＮＰＮ）の供給源として食餌乾物（ＤＭ）に１．５％の尿素；
ＮＯ_３ｅｎｃ−尿素の代替品として食餌ＤＭに４．５１％のカプセル化硝酸塩；
ＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃ−尿素の代替品として食餌ＤＭに４．５１％のカプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液。

収容及び給餌
子ヒツジを、コンクリート床、飼料供給台及び給水器を有する個別の室内追込畜舎に収容した。実験の開始時に、動物は駆虫され、ワクチン接種をされ、ビタミンＡ、Ｄ及びＥの補給注射を受けた。

動物には、ＮＲＣ（２００７）推奨を満たすように配合された、６０：４０の濃縮飼料：飼い葉食餌（完全混合飼料）を適宜給餌した。実験食餌の組成及び化学分析を表１に示す。動物は、１日２回給餌（朝及び夕方の給餌）を受け、新鮮な水を自由に利用した。

ここで、
−硝酸アンモニウムカルシウム十水和物（５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ）−８３．３３％のＤＭ；ＤＭ基準で１１６．６３％のＣＰ；ＤＭ基準で７５．７７％のＮＯ_３ ⁻（イオン）。
−硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）−４８．７８％のＤＭ；ＤＭ基準で２０％のＭｇ；ＤＭ基準で２６．６７％のＳ；ＤＭ基準で８０％のＳＯ_４ ^２−。
−カプセル化製品：８６．１７％のＤＭ；ＤＭ基準で９３．６３％のＣＰ；ＤＭ基準で１７．８４％のＣａ；ＤＭ基準で６１．１５％のＮＯ_３ ⁻（イオン）。ＤＭ基準で２．９６％のＣＮＳＬを含有するＣＮＳＬのカプセル化製品。
−尿素−ＤＭ基準で２８１．２５％のＣＰ。
−ＣＮＳＬ−カシューナッツシェル液。

動物に供給された飼料の量を、それまでの乾物摂取量（ＤＭＩ）によって計算し、調整を必要に応じて行い、それによって廃棄飼料は１日摂取量の１０％を超えなかった。残飯は、１日のＤＭＩを決定するために毎日記録され、動物に再び供給されることはなかった。動物を、２週間毎に１６時間の絶食の後で計量した。

データ収集及び分析
メタン生産を６つの開回路呼吸チャンバー（Ａｂｄａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）の使用により評価した。１８匹の動物（６ブロック）をそれぞれ６匹の動物の３群（２ブロック）に分け、それぞれの群をチャンバーに連続して２日間入れた。メタン測定を、メタン放出に対する効果の一貫性を評価するため、３回（実験期間の初期、中間及び終了時）繰り返した。

消化率については、成長期間の終了時に、最後のメタン測定と同時に５日間実施した。動物を、糞便と尿の分離及び収集を可能にするように設計された代謝枠箱（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｃｒａｔｅ）に入れた。枠箱は、給餌機及び給水器を備え、遮陽の側面開放納屋の中に留め置かれた。

消化率期間の終了時に、全ての動物を屠殺した。評価した屠体枝肉特性は、屠殺時に得た温屠体枝肉重量（ＨＣＷ）及び温屠体枝肉歩留まり、２℃で２４時間冷却した後に得た冷屠体枝肉重量、冷屠体枝肉歩留まり、冷却後収縮、１２番目の肋骨での皮下脂肪厚及びロース芯（ｒｉｂ−ｅｙｅ）面積であった。計量した後、かつデータ収集の直前に、冷屠体枝肉を２つの対称的な部分に分け、１２番目と１３番目の肋骨の間を開胸（ｒｉｂｂｅｄ）して、最長筋（ＬＭ）を露出した。１２番目の肋骨脂肪厚を、ミリメートルの目盛を付けた外径カリパスを用いて測定した。露出したロース芯面積を酢酸紙で敷き写し、面積を、平方センチメートルの目盛を付けた面積計を用いて決定した。子ヒツジ肉（背最長筋）における硝酸塩及び亜硝酸塩の存在は、“Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ ｄｅ Ａｌｉｍｅｎｔｏｓ”（ＩＴＡＬ），Ｃａｍｐｉｎａｓ，Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ（Ｂｒａｓｉｌ，２００５ａ，ｂ）の“Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ ｄｅ Ｃａｒｎｅ”によって決定した。

メタン濃度は、Ｓｈｉｎｃａｒｂｏｎ ＳＴ１００／１２０マイクロ充填カラム（１．５８７５ｍｍのＯＤ、１．０ｍｍのＩＤ、１ｍの長さ；Ｒｅｆ．ｎｏ．１９８０９；Ｒｅｓｔｅｃｋ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ Ｓｈｉｍａｄｚｕ２０１４，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して決定した。カラム、インジェクター及び水素炎イオン化検出器の温度は、それぞれ６０、２００及び２４０℃であった。１０ｍｌ／分のヘリウムが担体ガスであった。メタン濃度は、純粋なＣＨ_４（Ｗｈｉｔｅ Ｍａｒｔｉｎｓ ＰＲＡＸＡＩＲ Ｇａｓｅｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｉｓ Ｉｎｃ．，Ｏｓａｓｃｏ，ＳＰ，Ｂｒａｚｉｌ；純度９９５ｍＬ／Ｌ）により調製された検量線を使用する外部校正により決定した。

第一胃液を、２週間に１回、朝の給餌の３時間後に採取した。採取は、経口プローブを使用して実施し、アリコートを、防腐剤を使用することなく−２０℃で保存した。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、キャピラリーカラムＨＰ−ＦＦＡＰ（１９０９１Ｆ−１１２；０．３２０ｍｍのＯＤ、０．５０μｍのＩＤ、２５ｍの長さ、Ｊ＆Ｗ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＥＵＡ）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ ＨＰ ７８９０Ａ，Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｉｎｊｅｔｏｒ ＨＰ ７６８３Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造会社の条件（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，１９９８）をいくらか変更して決定した。１μＬのアリコートを、３１．３５ｍＬ／分のＨ_２流量（９．２０ｐｓｉ）により２０：１のスプリット比を使用して注入した。インジェクター及びＦＩＤの温度を２６０℃に保持した。オーブンの加熱勾配は、８０℃（１分間）、１２０℃（２０℃／分；３分間）、２０５℃（１０℃／分；２分間）であり、合計分析時間は１６．５分間であった。１．３５ｍＬ／分の水素を担体ガスとして使用した。検出器水素、合成空気及び窒素流量（補給）を、それぞれ４０、４００及び４０ｍＬ／分に保持した。血液試料を、２週間に１回、朝の給餌の６時間後に４ｍＬのＢＤバキュテナーチューブ（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅ）（Ｋ_２−ＥＤＴＡ，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に採取した。血液を、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）に従って、血液採取後３０分以内にメトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）について分析した。

結果及び考察
表２は、ＤＭＩ、成長及びメタン生産データを示す。最終ＢＷ、ＤＭＩ、平均１日体重増（ＡＤＧ）及び飼料効率は、硝酸塩のカプセル化のタイプによっては影響を受けなかった。成長能力の差も、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（近刊）（ｖａｎ Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及びＨｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）により観察されなかった。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差
−Ｔｒｅａｔ．＝処理
−ＢＷ＝体重
−ＢＷ０．７５＝代謝量
−ＤＭＩ＝乾物摂取量

メタン生産（Ｌ／日、Ｌ／ｋｇ ＢＷ^０．７５及びＬ／ｋｇ ＤＭＩで表される）は、尿素がカプセル化硝酸塩又はカプセル化硝酸塩＋ＣＮＳＬと置き代えられると低減された。ＣＮＳＬの添加は、カプセル化硝酸塩に添加された時にメタン生産に関して何も利益を示さなかった。平均して、ＮＯ_３ｅｎｃ及びＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃのメタン放出は、対照と比較すると、３２．３％（Ｌ／ｋｇ ＤＭＩで表される）低減された。同様の結果が他から得られ、４５％（ｖａｎ Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄら，２０１０）、２３％（Ｎｏｌａｎら，２０１０）、３５％（Ｌｉら，近刊）、２７％（Ｈｕｌｓｈｏｆら，近刊）の低減であった。

表３は、第一胃構成成分のデータを示す。総ＳＣＦＡ濃度及び酢酸塩濃度は、対照と比較して、硝酸塩給餌処理によって増加した。ＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃは、ＮＯ_３ｅｎｃと比較すると、高い総ＳＣＦＡ濃度及び酢酸塩濃度を示した。ＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃは、対照よりも高いプロピオン酸塩及び酪酸塩濃度を示し、ＮＯ_３ｅｎｃは、中間的な結果を示した。

これらの結果は、第一胃における硝酸塩の還元により提供される、微生物増殖に利用可能なエネルギーがより多いことと一致し、より高い微生物活性を維持することができる。本発明者たちの知る限りでは、この仮説はインビボで証明されたことがないが、インビトロ条件では既に実証されている（Ｇｕｏら，２００９）。異なる結果が他者により得られているが、おそらく給餌後の第一胃採取時間における相違がこの理由である。Ｌｉら（近刊）及び（ｖａｎ Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄら，２０１０）によれば、ＳＣＦＡ濃度に差が観察されなかったが、第一胃液の採取は、給餌前及び最後の給餌のおよそ２４時間後にそれぞれ実施された。一般に、インビトロ研究では、硝酸塩がＮＰＮ供給源として使用される時、酢酸塩は増加し、酪酸塩は減少するという、ある程度一貫した効果が示されている（Ｇｕｏら，２００９；Ｚｈｏｕら，近刊）。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差
−Ｔｒｅａｔ．＝処理
−第一胃試料は、朝の給餌の３時間後に採取された

硝酸塩給餌動物は、対照よりも低いアンモニア濃度を有した。この結果は、尿素が第一胃において急速に加水分解されアンモニアを生産することによって説明される。しかし、第一胃において硝酸塩は亜硝酸塩に還元され、続いてアンモニアに還元される。第一胃液は給餌の３時間後に採取されるので、硝酸塩給餌子ヒツジの第一胃において低いアンモニア濃度がこの時点で観察されることは、妥当である。したがって、亜硝酸塩濃度は、対照と比較して、Ｎｉｔｒａｔｅ_ｅｎｃ及びＮｉｔｒａｔｅ＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃでは大きかった。しかし、硝酸塩濃度は複数の処理の間で差異がない。このことは、第一胃内環境に最初に到達した時に硝酸塩から亜硝酸塩へ非常に素早く還元されることによって説明される。これにもかかわらず、硝酸塩給餌動物における亜硝酸塩の濃度は、対照と比較してあまり高くないことを記述することが重要である。このことは、カプセル化硝酸塩が、第一胃において硝酸塩の緩徐放出に効果的であり、同時に、順応した第一胃が硝酸塩を効果的に代謝できることを示す。原生動物数も、硝酸塩を含めることによって低減され、このことは、メタン生成と同様に第一胃内アンモニア濃度が低いことと一致する。

表４は、血液構成成分のデータを示す。赤血球濃度は、ＮＯ_３ｅｎｃ及びＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃで増加した。このことは、おそらく、硝酸塩給餌により促進された酸素輸送不足に起因する動物代謝順応であった。しかし、メトヘモグロビンは、両方の種類のカプセル化硝酸塩により影響を受けなかった。このことは、カプセル化が第一胃内の硝酸塩放出を遅延するのに効果的であること、及び順応した第一胃が硝酸塩からアンモニアへの総還元を促進することを示した。この概念は、対照と比較した時のＮＯ_３ｅｎｃ及びＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃで観察された同様のＡＤＧ及び飼料効率によって支持される。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差
−Ｔｒｅａｔ．＝処理
−充填細胞体積＝ヘマトクリット
−血液試料は、朝の給餌の６時間後に収集された

血中硝酸塩は、食餌により影響されなかったが、亜硝酸塩濃度は、硝酸塩が給餌された時に増加した。このことは、亜硝酸塩が、吸収されたＮ−オキシドの主な形態であるために生じた。より高い亜硝酸塩血中濃度でも、血中メトヘモグロビンが増加しなかったことに留意することが重要である。血漿中の総タンパク質、アルブミン及び尿素は、処理により影響を受けなかった。

表５及び６は、消化率及びＮ平衡のデータを示す。消化率又はＮ平衡のあらゆる変数は、硝酸塩による尿素の置換によって影響されなかった。これらの結果は、硝酸塩が、尿素と比べて同様の成長率を促進できることを示し、このことは、本実験において測定されたＡＤＧ及び飼料効率と合致している。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差
−ＤＭ＝乾物
−ＯＭ＝有機物
−ＣＰ＝粗タンパク質
−ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維
−ＡＤＦ＝酸性デタージェント繊維
−ＥＥ＝エーテル抽出物

尿素中の硝酸塩は、ＮＯ_３ｅｎｃ及びＮＯ_３＋ＣＮＳＬ_ｅｎｃにより影響を受けなかったが、硝酸塩給餌処理における亜硝酸塩濃度が増加した。この結果は、硝酸塩が給餌された時により多くの血中亜硝酸塩が観察されたことと合致している。一方、尿中尿素は、硝酸塩をＮＰＮ供給源として給餌した時に低減した。したがって、尿素の形態でのＮ排出は、亜硝酸塩の形態での排出の増加と連動して低減した。これにもかかわらず、Ｎ使用の効率は複数の処理の間で異ならなかった。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差

表７は、微生物生成のデータを示す。微生物のＮ供給及び微生物生成の効率は、複数の処理の間で異ならなかった。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＭＮ＝微生物窒素
−ＤＯＭＩ＝消化可能な有機物摂取量
−ＤＯＭＲ＝第一胃内で発酵した消化可能な有機物
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差

最後に、全ての屠体枝肉特性、屠体枝肉成分、並びに食肉特性は、硝酸塩給餌により影響を受けなかった（表８及び９）。特に、子ヒツジ肉中の硝酸ナトリウムは、全ての処理において検出限界を下回り、一方、亜硝酸ナトリウムの残留物はいずれの処理においても観察されなかった。したがって、カプセル化硝酸塩を子ヒツジに給餌した時、食肉中での硝酸塩又は亜硝酸塩の蓄積は起こらなかった。

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ロース芯面積＝ＬＭ面積（最長筋面積）＝ロース筋（ｅｙｅ ｍｕｓｃｌｅ）領域
−冷（温）屠体枝肉歩留まり＝冷（温）枝肉解体（ｃａｒｃａｓｓ ｄｒｅｓｓｉｎｇ）
−食肉中の硝酸塩及び亜硝酸塩は、硝酸ナトリウム及び亜硝酸ナトリウムとして表される。硝酸ナトリウムの分析方法の検出限界は、＜６．１５５ｍｇ／新鮮な食肉１ｋｇである。
−ＳＥＭ＝平均値の標準偏差

ここで、
−ＮＯ_３ｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩
−ＮＯ_３＋ＣＮＳＬｅｎｃ＝カプセル化硝酸塩＋カシューナッツシェル液
−ＳＥＭ＝ 平均値の標準偏差

参考文献
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実施例３
この実験の目的は、肉用ネロール種雄子ウシ（ｂｅｅｆ ｓｔｅｅｒ）の急性中毒（メトヘモグロビン血症）に対する非カプセル化及びカプセル化（緩徐放出）型の硝酸塩及び硫酸塩の効果を評価することであった。

この実験は、ゴイアス連邦大学（ブラジル、ゴイアス州ゴイアニア）の獣医動物科学部動物生産学専攻（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の飼養実験施設で行った。全ての動物使用手順は、同じ施設内の内部倫理委員会により推奨された指針に従った。

材料及び方法
実験設計及び処理。第一胃カニューレを取り付けた５頭のネロール種去勢雄子ウシ（５歳及び平均４５０ｋｇのＢＷ）を、５×５ラテン方格法に指定した。実験期間は７０日間に及び、それぞれ１４日間の５期間に分けた。

動物を、以下のように５つの食餌処理に割り当てた：
対照−硝酸塩又は硫酸塩の添加なし；
ＮＥ１２３（非カプセル化）−１９５ｇ／日の硝酸アンモニウムカルシウム十水和物及び２４ｇ／日の硫酸マグネシウム一水和物に相当する、１２３ｇ／日の硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）＋１６．５ｇ／日の硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）の接種。食餌乾物（ＤＭ）中の１．８２％の硝酸アンモニウムカルシウム及び０．２３％の硫酸マグネシウムと同等であった；
ＮＥ２４６（非カプセル化）−３９０ｇ／日の硝酸アンモニウムカルシウム十水和物及び４８ｇ／日の硫酸マグネシウム一水和物に相当する、２４６ｇ／日の硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）＋３３ｇ／日の硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）の接種。食餌乾物（ＤＭ）中の３．６４％の硝酸アンモニウムカルシウム及び０．４７％の硫酸マグネシウムと同等であった；
Ｅ１２３（カプセル化）−２６６ｇ／日の最終製品に相当する、１２３ｇ／日の硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）＋１６．５ｇ／日の硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）の単一カプセル化製品としての接種。食餌ＤＭ中の２．５８％の最終カプセル化製品と同等であった；
Ｅ２４６（カプセル化）−５３２ｇ／日の最終製品に相当する、２４６ｇ／日の硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）＋３３ｇ／日の酸塩（ＳＯ_４ ^２−）の単一カプセル化製品としての接種。食餌ＤＭ中の５．１６％の最終カプセル化製品と同等であった。

収容及び給餌
雄子ウシを、覆いを付けた飼料供給台及び自動給水器を有する野外追込畜舎に個別に保持した。実験の開始時に、動物は駆虫され、ワクチンを接種され、ビタミンＡ、Ｄ及びＥの補給注射も受けた。

動物には、ＮＲＣ（１９９６）推奨を満たすために、飼料原料の近似化学組成（Ｖａｌａｄａｒｅｓ Ｆｉｌｈｏら，２０１０）に従って配合された５０：５０の濃縮飼料：飼い葉食餌（完全混合飼料）を適宜給餌した。実験食餌の組成及び化学分析算出値を表１に示す。動物は、１日に１回、朝に給餌を受け、新鮮な水を自由に利用した。

データ収集及び分析
それぞれの期間では、動物は、１２日間、対照食餌が午前８時に自由に給餌された。１３日目に、動物には、第一胃カニューレを介して、非カプセル化硝酸塩／硫酸塩又はカプセル化硝酸塩／硫酸塩を処理に従って接種した。

接種は、表２及び３に記載されているように、朝の給餌の０、３、６、９及び１２時間後に実施した。給餌後の時間に応じた接種用量は、実験開始前の動物の平均総飼料摂取量及び飼料摂取パターン（時間間隔あたりの摂取率）を推定してから確定した。平均飼料摂取量は１６ｋｇ／日（給餌時）であり、推定飼料摂取率は、０〜３時間で３１．３％、３〜６時間で２１％、６〜９時間で２１％、９〜１２時間で１３．３％、１２〜２４時間で１３．３％であった。

メトヘモグロビン決定に使用した血液試料を、１３日目の朝の給餌の０時間後、３時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後及び３０時間後に頸静脈から採取した。メトヘモグロビン分析は、Ｈｅｇｅｓｈら（１９７０）に従って、分光高度計を使用して実施した。

血液像、生化学分析（肝臓酵素、グルコース、尿素及びビリルビン）並びに血液ガス定量（ｈｅｍｏｇａｓｏｍｅｔｒｙ）（酸塩基平衡）についての血液試料を、１３日目の朝の給餌の０、６、１２、１８、２４及び３０時間後に頸静脈から採取した。血液像は、血液採取にＥＤＴＡを用いるバキュテナーチューブを使用して、ミクロヘマトクリット法により実施した。生化学分析用の血液試料は、添加剤なしでバキュテナーチューブを使用して得た。

身体検査（心拍数、呼吸数及び体温）、並びに第一胃のｐＨを、１３日目の朝の給餌の０、３、６、９、１２、１８、２４及び３０時間後に実施した。身体検査は、Ｒａｄｏｓｔｉｔｓら（２００７）に従って実施した。動物を、２人の経験豊かな獣医により接種期間にわたって注意深く監視した。危険な状態の動物は、明らかに茶色がかった粘膜という中毒の視覚的徴候を示す場合、直前の血液分析に基づいて、４％のメチレンブルーの１００ｍＬの静脈内注射により手当てされた。

ここで、
−窒素供給源：硝酸アンモニウムカルシウム十水和物（５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ）；８３．３３％のＤＭ、１１６．６３％のＣＰ、ＤＭ基準で７５．７７％のＮＯ_３ ⁻。
−硫酸塩供給源：硫酸マグネシウム一水和物（ＭｇＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ）；８６．９６％のＤＭ、ＤＭ基準で８０％のＳＯ_４ ^２−。
−硝酸アンモニウムカルシウム十水和物及び硫酸マグネシウム一水和物を含有するカプセル化製品；８６．７０％のＤＭ、８１．５６％のＣＰ、ＤＭ基準で５２．９７％のＮＯ_３ ⁻、ＤＭ基準で７．２９６％のＳＯ_４ ^２−。
−ＮＤＦ：中性デタージェント繊維
−ＴＤＮ：総可消化養分

ここで、
−硝酸塩：硝酸アンモニウムカルシウム十水和物（５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ）；８３．３３％のＤＭ、１１６．６３％のＣＰ、ＤＭ基準で７５．７７％のＮＯ_３ ⁻。
−硫酸塩：硫酸マグネシウム一水和物（ＭｇＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ）；８６．９６％のＤＭ、ＤＭ基準で８０％のＳＯ_４ ^２。
−硝酸アンモニウムカルシウム十水和物及び硫酸マグネシウム一水和物を含有するカプセル化製品；８６．７０％のＤＭ、８１．５６％のＣＰ、ＤＭ基準で５２．９７％のＮＯ_３ ⁻、ＤＭ基準で７．２９６％のＳＯ_４ ^２−。

ここで、
−硝酸塩：硝酸アンモニウムカルシウム十水和物（５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ）；８３．３３％のＤＭ、１１６．６３％のＣＰ、ＤＭ基準で７５．７７％のＮＯ_３ ⁻。
−硫酸塩：硫酸マグネシウム一水和物（ＭｇＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ）；８６．９６％のＤＭ、ＤＭ基準で８０％のＳＯ_４ ^２−。
−硝酸アンモニウムカルシウム十水和物及び硫酸マグネシウム一水和物を含有するカプセル化製品；８６．７０％のＤＭ、８１．５６％のＣＰ、ＤＭ基準で５２．９７％のＮＯ_３ ⁻、ＤＭ基準で７．２９６％のＳＯ_４ ^２−。

結果及び考察
血液像及びメトヘモグロビンデータを表４に示す。短期間では（接種開始の３０時間後まで）、２４６ｇの非カプセル化又はカプセル化硝酸塩は、血中メトヘモグロビン濃度を増加させた。しかし、カプセル化はメトヘモグロビン濃度が許容レベル（３０％まで）に留まったので、メトヘモグロビン血症の危険性の低減に効率的であった。一方、非カプセル化硝酸塩は、５０％までのピークを有した。

ここで、充填細胞体積＝ヘマトクリット

ＮＥ２４６及びＥ２４６の両方において、メトヘモグロビンのピークは接種開始の１８時間後又は最終用量の硝酸塩接種の６時間後に生じた。メトヘモグロビンの経時的な濃度は、ＮＥ２４６とＥ２４６では非常に類似していたが、より高いレベルがＮＥ２４６で観察された。このことは、硝酸塩カプセル化が第一胃における硝酸塩放出の低減に効果的であり、したがって急性中毒の危険性を低減したことを強調している（図２添付ＩＩ）。

５つの細分期間のうちの２つにおいて、接種開始の９時間後に一匹の動物及び１８時間後もう一匹において明らかな中毒の視覚的徴候があったので、２４６ｇ／日の純粋な硝酸塩が接種された動物を解毒剤により（４５０ｋｇのＢＷあたり１００ｍＬのメチレンブルーを４％で）処理しなければならなかった。これらの２頭の処理動物のデータが統計的分析（１番目の動物では２４及び３０時間、２番目の動物では１２、１８、２４及び３０時間）から除外されたことを考慮することは、非常に重要である。このため、メトヘモグロビン濃度は、動物が解毒剤で処理されなかったら、ＮＥ２４６では更に高くなっているであろう。しかし、この決定は、動物にとって非常に危険な可能性があり、内部倫理委員会によって許可されていない。対照的に、５つの細分期間において、２４６ｇのカプセル化硝酸塩を受けていた動物で、処理されなければならないものはいなかった。

メトヘモグロビンは、第一胃壁からの高い亜硝酸塩吸収に起因して、反芻動物において短期間に生じる。非順応第一胃内微生物が硝酸塩をアンモニアに完全に還元できないので、第一胃内に亜硝酸が蓄積する。血液中では、亜硝酸塩がヘモグロビンの第一鉄（Ｆｅ^２＋）を第二鉄（Ｆｅ^３＋）に変換する。このことが生じると、ヘモグロビン（ここでメトヘモグロビンと呼ばれる）は、酸素を組織に輸送することができない（Ｃｏｃｋｂｕｒｎら，２０１０）。これが、亜硝酸塩中毒の一般的な無酸素症の症状の原因であり、重篤な場合では、死に至る。

カプセル化及び非カプセル化硝酸塩／硫酸塩の両方を１２３／１６ｇで受けている動物は、対照と比較した時、メトヘモグロビン濃度の増加を示さなかった。これらの結果は、このレベルまでの硝酸塩を含めると、第一胃内の硝酸塩からアンモニアへの還元及び／又は血中メトヘモグロビンレダクターゼ（血中メトヘモグロビンをヘモグロビンに変換し戻す）が中毒の問題を回避できることを示している。しかし、この実験において、硝酸塩接種は１日の硝酸塩摂食のみをシミュレートしたものであって、翌日に続く硝酸塩接種により引き起こされる累積効果について推測することは可能ではないことを記述することが重要である。ヘモグロビン濃度は、ＮＥ２４６において最大であった。高いＭｅｔａＨｇ濃度を有する動物では、Ｈｂ濃度が増加したことが報告されており、これは、酸素を輸送する血液の能力の減少を補う生理学的反応である（Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｋａｎｓｏｎ，１９６４）。また、ＮＥ２３６において赤血球の数が多いことは、この観察結果と一致している。

グルコース、肝臓酵素及びビリルビンレベルを表５に示す。ＡＳＴと同様に、グルコース濃度は、ＮＥ２４６において最大であった。ＡＳＴは、肝臓、心臓及び腎臓における急性炎症を示す酵素であり、したがって、純粋な硝酸塩／硫酸塩の接種により引き起こされる中毒症状も示す酵素である。

ＧＧＴ、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、クレアチニンキナーゼ及びビリルビンは、処理によって影響を受けなかった。

ここで、
−ＧＧＴ：ガンマグルタミルトランスフェラーゼ
−ＡＳＴ：アスパラギン酸トランスアミナーゼ

心拍数、呼吸数及び血液温度は、硝酸塩接種により影響されなかった（表６）。第一胃のｐＨは、全ての硝酸塩処理において増加した。これは硝酸塩カルシウム緩衝能力が理由である。

ここで、
−ｐＯ_２：Ｏ_２の分圧
−ｐＣＯ_２：ＣＯ_２の分圧
−ｉＣａ：イオン化カルシウム

参考文献
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この革新は本明細書に記述された又は例示された代表に限定されず、広い範囲で理解されなければならない。上記記載及び添付図面に示された教示の助けを借りて、この革新に属する当業者は、この革新の多くの変更及び他の表現を思いつく。その他に、この革新は、明らかにされた特定の形態に限定されないことが理解されなければならず、変更及び他の形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると理解される。特定の用語が本明細書において使用されたが、これらは一般的で記載的な形態でのみ用いられ、限定の目的では用いられていない。

Claims (9)

1. 硝酸塩と硫酸塩を主成分とし、メタン放出を低減するための反芻動物の栄養に利用され、以下の好ましい組成を示すことを特徴とする組成物。
   ｉ．４０〜９７重量％の硝酸カルシウム、好ましくは硝酸アンモニウムカルシウム十水和物［５Ｃａ（ＮＯ_３）_２．ＮＨ_４ＮＯ_３．１０Ｈ_２Ｏ］という複塩であり、より好ましくは６０〜８５重量％である；
   ｉｉ．５０重量％までの硫酸マグネシウム、好ましくは一水和物又は無水物（ＭｇＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ又はＭｇＳＯ_４）であり、好ましくは３〜２０重量％である；
   ｉｉｉ．１〜４０重量％の被覆、好ましくは水素化植物性脂肪であり、好ましくは３〜２０重量％である；及び
   ｉｖ．被覆された顆粒として与えられた２０重量％までの添加剤、好ましくは０．１〜１０重量％であり、好ましくは植物性脂肪、なかでもダイズ油、ヒマシ油、パーム油、ババス油、カシューナッツシェル液又は油、またはヤシ油、アマニ油及びカノーラ油で被覆されている。
2. 硝酸カルシウム四水和物［Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏ］、硝酸カルシウム無水物［Ｃａ（ＮＯ_３）_２］、硝酸マグネシウム［Ｍｇ（ＮＯ_３）_２．６Ｈ_２Ｏ］、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_３）、硝酸カリウム（ＫＮＯ_３）、硝酸アンモニウム（ＮＨ_４ＮＯ_３）、硝酸カルウレア［Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４ＣＯ（ＮＨ_２）_２］、硫酸及び硝酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４．３（ＮＨ_４ＮＯ_３）又は（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４．２（ＮＨ_４ＮＯ_３）］という複塩、並びに上記塩の結晶水の数又は結晶水の欠失に起因する可能な変形及び、他の適合可能な硝酸塩などの、他の硝酸塩又は硝酸塩の混合物の利用を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
3. 硫酸マグネシウム七水和物［ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ］、硫酸ナトリウム［Ｎａ_２ＳＯ_４無水物、Ｎａ_２ＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ及びＮａ_２ＳＯ_４．１０Ｈ_２Ｏ）、硫酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４］、硫酸カリウム（Ｋ_２ＳＯ_４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ_４又は２ＣａＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４無水物又はＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４．１Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ又はＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４無水物又はＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ_４無水物又はＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ）、他の適合可能な硫酸塩、また、システイン、硫化物、亜硫酸塩、硫黄単体及びタングステン酸ナトリウムなどの、他の硫酸塩又は硫酸塩の混合物の利用を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
4. ダイズ油、ヒマシ油、パーム油、カシューナッツシェル液又は油、綿実油、アマニ油、ピーナッツ油、ババス油、ヒマワリ油、ヤシ油、カノーラ油、コムギ油、コメ油、トウモロコシ油、ココア油、ベニバナ油、並びにカルナウバロウ、トウモロコシロウ、カスターワックス及びミツロウなどの植物及び動物ロウからなる群に由来する少なくとも１つの脂肪による被覆を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
5. 炭酸カルシウム、ショ糖、植物油及びキサンタンガムと共に添加されるセルロース及びカルボキシセルロースを主成分とする乳剤；ポリビニルアルコールと混合したデンプン及び他の多糖類を含有する被覆；並びにリグニン／リグノスルホネート又はキトサンバイオポリマーを主成分とする被覆などの、第一胃において分解性又は非分解性である天然材料など、物質の制御放出を促進することに関して脂肪で示されるものと等しい又は同様の特性を示す、動物栄養と適合する任意の他の材料による被覆を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
6. カルボキシビニル；ポリアクリル酸（アクリル樹脂、ポリエチレンなど）；アルギン酸；ポリヒドロキシアルカノエート；ポリヒドロキシオクタノエート；ポリヒドロキシブチレート（バイオポール）；ポリカプロラクトン；ポリ乳酸；ビウレットとウレタン及びキリ油との溶液；イソシアネートとアルキド樹脂、ヒマシ油及び過酸化物の混合物；ステアルアミドとパラフィンの混合物、ステアリン酸マグネシウム；他の樹脂（ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリエポキシド、シリコーン、ポリビニリデンクロリドなど、並びにこれらの混合物）；アルキル及びシクロアルキルアミン；石油から誘導されるパラフィン及びロウなどの、第一胃において分解性又は非分解性である合成ポリマーの被覆を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
7. 天然又は合成の芳香剤、香味剤及び味覚向上剤（グルタミン酸一ナトリウム、サッカリン、スクロース、デキストロース、グルコース、グアバエキス、バニラなど）；ビタミンＣ、ベータ−カロテン、ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）などの酸化防止剤、クエン酸、酢酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸化剤；レシチン、キサンタン、ガム、ポリソルベート、プロピレングリコール及びモノステアレートなどの乳化剤／安定剤；炭酸カルシウム、デンプン、微晶質セルロース、リン酸三カルシウム、シリカ／ケイ酸塩、タルカムパウダー、カオリン、ステアリン酸カルシウムなどの湿潤防止及び固化防止剤；多量ミネラル、微量ミネラル及びビタミン、例えば、Ａ、Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_７、Ｂ_９、Ｂ_１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫなどの他の栄養添加剤；カルバクロール、オイゲノール、チモール、シンナムアルデヒド、カプサイシン、リモネンなどの精油；乳酸、リンゴ酸、フマル酸、アスパラギン酸などの有機酸；ＣＬＡ−共役リノール酸、ミリスチン酸、アナカルジン酸、中鎖脂肪酸（カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、ラウリン酸）、並びにアルファ−リノレン酸−ＡＬＡ；エイコサペンタエン酸−ＥＰＡ；ドコサヘキサエン酸−ＤＨＡなどのオメガ−６及びオメガ−３脂肪酸などの脂肪酸；主にシステイン及びメチオニンなどの硫黄含有アミノ酸であるが、ヒスチジン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、グリシンなども考慮されるアミノ酸；セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、キシラーゼ、β−グルカナーゼ、フィターゼ及び他のグルカナーゼなどの酵素；重炭酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムなどの緩衝剤及びアルカリ化剤；トリコスポロン種、カンジダ種、ロイコノストック種、ラクトコッカス種、カンジダ・ケフィール、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母菌；アスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ニガーなどの真菌；ラクトバチルス種、及び主に硝酸塩／亜硝酸塩還元活性を有する、例えば、セレノモナス・ルミナンチウム、ベイヨネラ・パーブラ、ウォリネラ・スクシノゲネス、メガスファエラ・エルスデニイ、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ、エシェリキア・コリＷ３１１０などのプロバイオティクス及び他の生微生物；腸内細菌、コリネ型細菌、バチルス・スブチリス、メチロフィルス種及びアクチノミセス種；ガラクトオリゴ糖及び／又はナイシン；モネンシンナトリウム、サリノマイシン、ラサロシド、ナラシンなどのイオン透過担体抗生物質；バージニアマイシン、アビラマイシン、バシトラシン、フラボマイシン、チロシンなどの他の抗生物質；プロポリス、ベータ酸、アルファ酸、他のホップ由来酸、カルダノール、カルドール、タンニン、サポニンなどの抗微生物特性を有する天然物質；駆虫剤、及び抗コクシジウム剤／コクシジウム抑制剤を代替的に示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
8. 直径が１．５ｍｍ〜１２ｍｍ、より好ましくは３〜７ｍｍの範囲であり、
   密度が０．８５ｇ／ｃｍ^３〜１．１５ｇ／ｃｍ^３、より好ましくは０．９０ｇ／ｃｍ^３〜１．１０ｇ／ｃｍ^３の範囲であり、
   ほぼ球状の形状を示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
9. １時間あたり１％〜３０％、より好ましくは１時間あたり５％〜２５％の範囲である硝酸塩／硫酸塩の遊離速度を示すことを特徴とする、請求項１に記載の硝酸塩及び硫酸塩を主成分とする組成物。
   

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