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JP2014515264A - マルチプレックス核酸同定のための製品およびプロセス - Google Patents

マルチプレックス核酸同定のための製品およびプロセス Download PDF

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JP2014515264A JP2014511601A JP2014511601A JP2014515264A JP 2014515264 A JP2014515264 A JP 2014515264A JP 2014511601 A JP2014511601 A JP 2014511601A JP 2014511601 A JP2014511601 A JP 2014511601A JP 2014515264 A JP2014515264 A JP 2014515264A
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Abstract

複数の標的核酸の存在または非存在を検出するための産物およびプロセスが、本明細書において提供される。ある方法は、標的核酸またはその一部分を増幅するステップ、アンプリコンに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを伸長させるステップであって、伸長オリゴヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ、捕捉剤を介して、固相に伸長オリゴヌクレオチドを捕捉するステップ、競合因子との競合によって伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、伸長オリゴヌクレオチドを検出し、それによって、伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって、それぞれの標的核酸の存在または非存在を決定するステップを含む。

Description

関連特許出願
本特許出願は、２０１１年５月１９日出願で「ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」とのタイトルで、発明者がホーニッシュ，クリスティアーネ、ファン デン ボーム，ディルク ヨハネスおよびモスコ，マイケルの名義で、代理人文書番号ＳＥＱ−６０２０−ＰＶ２と命名された米国仮特許出願第６１／４８８，０８２号の利益を主張する。そしてこの特許出願は、２００９年１０月２７日に出願され、「ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」とのタイトルで、発明者がファン デン ボーム，ディルク ヨハネス、ホーニッシュ，クリスティアーネ、アンドリュー，ティムスおよびキトニス，スミタの名義で、代理人文書番号ＳＥＱ−６０２０−ＵＳと命名された米国特許出願第１３／１２６，６８４号に関連する。米国特許出願第１３／１２６，６８４号は、２００９年１０月２７日に出願され、「ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」とのタイトルで、出願人および発明者がファン デン ボーム，ディルク ヨハネス、ホーニッシュ，クリスティアーネ、アンドリュー，ティムスおよびキトニス，スミタの名義で、代理人文書番号ＳＥＱ−６０２０−ＰＣと命名された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６２２３９号の国内出願である。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６２２３９号は、２００８年１０月３０日に出願され、「ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」とのタイトルで、発明者がファン デン ボーム，ディルク ヨハネス、ホーニッシュ，クリスティアーネ、アンドリュー，ティムスおよびキトニス，スミタの名義で、代理人文書番号ＳＥＱ−６０２０−ＰＶと命名された米国仮特許出願第６１／１０９，８８５号の利益を主張する。上記特許出願の内容全体は、文章、表および図面の全てを含め、本明細書に参考として援用される。
分野
本技術は、複数の標的核酸を１つの手順において検出することができる核酸同定手順に部分的に関する。本技術はまた、核酸修飾の同定にも部分的に関する。
背景
特異的な核酸の検出は、診断医学および分子生物学の研究のための重要なツールである。核酸アッセイは、現在、たとえば、細菌およびウイルスなどのような感染生物を同定する際に、正常遺伝子の発現をプローブする際に、癌遺伝子などのような変異体遺伝子を同定する際に、組織移植に先行して適合性について組織タイピングをする際に、法医学用に組織または血液サンプルをマッチングする際に、ならびに異なる種由来の遺伝子の間の相同性を探索するために、役割を果たしている。
概要
いくつかの実施形態において、組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は（ａ）増幅条件下で、標的核酸またはその一部分を増幅することによって、標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中のアンプリコンを接触させるステップであって、セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含むステップ、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに付加された、１つ以上のヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ、（ｄ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、（ｅ）競合因子との競合によって、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに（ｆ）（ｅ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される、方法が提供される。ある実施形態において、（ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する。いくつかの実施形態において、（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、（ｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉｉ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応し、質量による識別が可能なタグの質量が、質量分析法によって検出され、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドを検出する。ある実施形態において、（ｅ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドまたは放出された伸長オリゴヌクレオチドに結合したもしくはそれから切断された、質量による識別が可能なタグが、質量分析法によって検出される。
ある実施形態において、組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は（ａ）増幅条件下で、標的核酸またはその一部分を増幅することによって、標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中のアンプリコンを接触させるステップであって、（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含み、（ｉｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、（ｉｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、かつ（ｉｖ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応するステップ、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに付加された、１つ以上のヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ、（ｄ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、（ｅ）競合因子との競合によって、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに（ｆ）（ｅ）において放出された、質量による識別が可能なタグを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される、方法が提供される。ある実施形態において、（ｅ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドまたは放出された伸長オリゴヌクレオチドに結合したもしくはそれから切断された、質量による識別が可能なタグが、質量分析法によって検出される。
いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグが、伸長オリゴヌクレオチドから切断されず、放出されず、ある実施形態において、質量による識別が可能なタグが、伸長オリゴヌクレオチドから切断され、放出される。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグが、伸長オリゴヌクレオチドである。ある実施形態において、（ｃ）における伸長が、１回、実行され、一伸長オリゴヌクレオチドが産出される。いくつかの実施形態において、（ｃ）における伸長が、複数回、実行され（たとえば増幅条件下で）、複数のコピーの伸長オリゴヌクレオチドが産出される。ある実施形態において、アンプリコン（たとえば（ａ）において産生されたアンプリコン）を含有する溶液が、アンプリコンの中に組み込まれないあらゆるヌクレオチドから末端のリン酸を除去する作用物質により処理される。末端のリン酸は、ホスファターゼとアンプリコンを接触させることによって時に除去され、ある実施形態において、ホスファターゼが、アルカリホスファターゼ（たとえばシュリンプアルカリホスファターゼ）である。
いくつかの実施形態において、組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が（ａ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中の標的核酸を接触させるステップであって、（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、標的核酸種が溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つの標的核酸種に特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含み、（ｂ）増幅条件下で、１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに付加された、１つ以上のヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ、（ｃ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、（ｄ）競合因子との競合によって、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに（ｅ）（ｄ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される、方法もまた提供される。ある実施形態において、（ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する。いくつかの実施形態において、（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、（ｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉｉ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応し、質量による識別が可能なタグの質量が、質量分析法によって検出され、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドを検出する。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドを検出する。ある実施形態において、（ｄ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドまたは放出された伸長オリゴヌクレオチドに結合したもしくはそれから切断された、質量による識別が可能なタグが、質量分析法によって検出される。
任意の適した増幅手順は、本明細書において記載されるマルチプレックス検出アッセイにおいて利用することができ、時に、以下の手順は、いくつかの実施形態において利用され、（ａ）第１のポリヌクレオチドのセットと標的核酸を接触させるステップであって、それぞれの第１のポリヌクレオチドが、（１）標的核酸にハイブリダイズする第１の相補的配列および（２）相補的配列の５’に位置する第１のタグを含む、ステップ、（ｂ）第１のポリヌクレオチドを伸長させることによって第１の伸長ポリヌクレオチドを調製するステップ、（ｃ）第１の伸長ポリヌクレオチドの３’末端に第２のポリヌクレオチドをつなぐステップであって、第２のポリヌクレオチドが、第２のタグを含む、ステップ、（ｄ）プライマーと（ｃ）の産物を接触させ、プライマーを伸長させるステップであって、プライマーが、第１のタグまたは第２のタグにハイブリダイズするステップ、および（ｅ）増幅条件下でプライマーのセットにより（ｃ）の産物を増幅させるステップであって、セットにおける一方のプライマーが、タグのうちの１つにハイブリダイズし、セットにおける他方のプライマーが、他方のタグの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするステップを含む。ある実施形態において、線形増幅が、プライマーの１つのセットにより実行される。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドが、標的核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。第１のタグのヌクレオチド配列および第２のタグのヌクレオチド配列が、いくつかの実施形態において異なり、他の実施形態において同一であるかまたは互いに相補的である。ある実施形態において、第１のタグおよび第２のタグが、（ｅ）において産生される増幅産物のそれぞれに含まれる。そのような増幅プロセスは、（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中のアンプリコンを接触させるステップであって、セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含む、ステップ、（ｇ）１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに付加された、１つ以上のヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ、（ｈ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、（ｉ）競合因子との競合によって、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに（ｊ）（ｉ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップをさらに含むことができ、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される。ある実施形態において、（ｇ）における伸長が、１回、実行され、一伸長オリゴヌクレオチドが産出される。いくつかの実施形態において、（ｇ）における伸長が、複数回、実行され（たとえば増幅条件下で）、複数のコピーの伸長オリゴヌクレオチドが産出される。ある実施形態において、（ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する。いくつかの実施形態において、（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、（ｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉｉ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応し、質量による識別が可能なタグの質量が、質量分析法によって検出され、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドを検出する。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドを検出する。
いくつかの実施形態において、競合因子との競合が、競合因子と固相を接触させることを含む。ある実施形態において、捕捉剤を含むヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸にコンジュゲートされた捕捉剤である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド三リン酸が、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である。
ある実施形態において、捕捉剤が、結合ペアのメンバーを含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体を含み、ある実施形態においては、固相が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤が、アビジンまたはストレプトアビジンを含み、ある実施形態において、固相が、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、競合因子との競合による、質量による識別が可能なタグの放出が、上昇した温度条件下で実行される。ある実施形態において、上昇した温度条件が、約１分間〜約１０分間（たとえば約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、または約１０分間）の、摂氏約８０度〜摂氏約１００度の温度（たとえば摂氏約８０度（℃）、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、または１００℃）での処理を含む。いくつかの実施形態において、上昇した温度条件が、約５分間の、摂氏約９０度での処理を含む。ある実施形態において、（ｃ）（たとえば、１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに付加された、１つ以上のヌクレオチドが、捕捉剤を含むステップ）が、１つの容器において実行され、方法が、放出された、質量による識別が可能なタグを、（ｅ）および（ｆ）の間に、他の容器に移動させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、（ａ）において産生されたアンプリコンを含有する溶液が、アンプリコンの中に組み込まれないあらゆるヌクレオチドから末端のリン酸を除去する作用物質により処理される。ある実施形態において、末端のリン酸が、ホスファターゼと溶液を接触させることによって除去される。いくつかの実施形態において、ホスファターゼが、アルカリホスファターゼであり、ある実施形態において、アルカリホスファターゼが、シュリンプアルカリホスファターゼである。
いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドにおける末端のヌクレオチドが、捕捉剤を含む。ある実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドにおける１つ以上の非末端ヌクレオチドが、捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション配列が、約５〜約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、それぞれのオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイゼーション配列が、約５〜約５０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドにおける末端のヌクレオチドが、捕捉剤を含み、時に、伸長オリゴヌクレオチドにおける１つ以上の非末端ヌクレオチドが、捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、それぞれ、捕捉剤が、ビオチンまたはその代わりにアビジンもしくはストレプトアビジンを含み、その場合には、固相が、アビジンもしくはストレプトアビジンまたはビオチンをそれぞれ含む。
識別が可能なタグは、ある実施形態において、質量（すなわち、識別する特徴が質量である、質量による識別が可能なタグ）によって部分的に識別される。いくつかの実施形態における識別が可能なタグは、ヌクレオチドからなり、時に、タグが、約５ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長である。ある実施形態における識別が可能なタグは、ヌクレオチドコンポマーであり、これは、時に、約５ヌクレオチド長〜約３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、識別が可能なタグが、ペプチドであり、これは、時に、約５アミノ酸〜約１００アミノ酸長である。ある実施形態における識別が可能なタグは、有機分子単位のコンカテマーである。いくつかの実施形態において、タグが、トリチル分子コンカテマーである。
ある実施形態において、固相が、平らな表面、シリコンチップ、ビーズ、球体、または前述のものの組み合わせから選択される。固相は、時に、常磁性である。いくつかの実施形態において、固相が、常磁性ビーズであり、ある実施形態において、固相が、捕捉剤を含む。
ある実施形態において、約５０以上の標的核酸種の存在または非存在が、本明細書において記載される方法によって検出される。いくつかの実施形態において、約１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３２５以上、３５０以上、３７５以上、４００以上、４２５以上、４５０以上、４７５以上、または５００以上の標的核酸が、検出される。いくつかの実施形態において、約２〜５００の標的核酸種の存在、非存在、または量が、本明細書において記載される方法によって検出される（たとえば約５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０の標的核酸種）。ある実施形態における標的核酸は、ゲノムＤＮＡ（たとえばヒト、微生物、ウイルス、真菌、または植物ゲノムＤＮＡ；任意の真核生物または原核生物核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ））である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析法である。ある実施形態において、質量分析法が、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法である。いくつかの実施形態において、約１〜約５０以上の標的核酸の存在または非存在が、検出される。ある実施形態において、質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドコンポマーである。ある実施形態において、ヌクレオチドコンポマーが、約５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、標的核酸が、ゲノムＤＮＡであり、ある実施形態において、ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、放出が、競合因子との競合を含む場合、検出が、競合因子との競合を含まない放出と比較して、信号対雑音比の増加を含む。いくつかの実施形態において、検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音比よりも大きな信号対雑音比によるものである。いくつかの実施形態において、変異体バリアントのみの伸長についての信号対雑音比が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についての信号対雑音比よりも大きい。いくつかの実施形態において、変異体対立遺伝子を検出する感度が、野生型対立遺伝子および変異体対立遺伝子の伸長についてよりも、変異体対立遺伝子のみの伸長について、大きい。いくつかの実施形態において、検出が、放出が競合因子との競合を含まない方法についての信号対雑音比よりも大きい信号対雑音比を含む。
いくつかの実施形態において、組成物における複数の遺伝的バリアントの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、該方法が（ａ）複数の標的核酸種またはその一部分に由来する複数のアンプリコンを調製するステップであって、それぞれの標的核酸種が、第１のバリアントおよび第２のバリアントを含むステップ、（ｂ）オリゴヌクレオチド種にアンプリコンをハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種に由来するアンプリコンにハイブリダイズし、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を生成するステップ、ならびに（ｃ）伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップであって、（ｉ）１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、（ｉｉ）第１のバリアントにハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、第２のバリアントにハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成するステップ、（ｄ）捕捉剤を捕捉する固相に伸長オリゴヌクレオチド種を捕捉するステップ、（ｅ）固相から、（ｄ）において固相に結合した伸長オリゴヌクレオチド種を放出させるステップ、ならびに（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において固相から放出されたそれぞれの伸長オリゴヌクレオチド種の質量を検出するステップを含み、それによって、遺伝的バリアントの存在、非存在、または量が、検出される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、第２のバリアントの伸長オリゴヌクレオチド種が、検出されない。いくつかの実施形態において、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含む。いくつかの実施形態において、方法が、第１のバリアントが、より低度の存在量のバリエーションであり、第２のバリアントが、より高度な存在量のバリエーションである第１のバリアントおよび第２のバリアントを含む。いくつかの実施形態において、遺伝的バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアントであり、第１のバリアントが、より低度の存在量の対立遺伝子であり、第２のバリアントが、より高度な存在量の対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、１つ以上の終結ヌクレオチドが、１つの終結ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、１つ以上の終結ヌクレオチドが、２つの終結ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、１つ以上の終結ヌクレオチドが、３つの終結ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、１つ以上の終結ヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから独立して選択される。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、非終結ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、１つ以上の伸長ヌクレオチドを含み、この伸長ヌクレオチドが、捕捉剤を含まない。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、放出剤との固相の接触を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体を含み、固相が、ストレプトアビジンを含み、かつ放出剤が、遊離したビオチンまたはビオチン類似体を含む。いくつかの実施形態において、遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、放出剤である。いくつかの実施形態において、遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、放出剤が、固相に対して捕捉剤よりも高い親和性を有する。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約３０℃〜約１００℃の加熱を含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約６０℃〜約１００℃の加熱を含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、８９℃〜約１００℃の加熱を含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約９０℃までの加熱を含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが捕捉された後に、固相が、洗浄される。いくつかの実施形態において、洗浄により、質量分析法分析において妨害付加生成物を産生する塩を除去する。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、樹脂（たとえばイオン交換樹脂）と接触されない。
いくつかの実施形態において、複数の標的核酸種が、２０以上の標的核酸種である。いくつかの実施形態において、複数の標的核酸種が、２００以上の標的核酸種である。いくつかの実施形態において、複数の標的核酸種が、２００〜３００の標的核酸種である。
いくつかの実施形態において、伸長条件が、２０〜３００回のサイクリングを含む。いくつかの実施形態において、伸長条件が、２００〜３００回のサイクリングを含む。
いくつかの実施形態において、複数の遺伝的バリアントを含む組成物が、合成鋳型を含む。いくつかの実施形態において、複数の遺伝的バリアントを含む組成物が、合成鋳型を含み、組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが、決定され、合成鋳型が、第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、複数のアンプリコンが、合成鋳型を含み、組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが、決定され、合成鋳型が、第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする。
ある実施形態が、以下の説明、請求項、および図面においてさらに説明される。
図面は、本技術の、ある非限定的な実施形態を示し、必ずしも縮尺に合わせて描かれたものではない。
図１は、ユニバーサルＰＣＲタグを有する遺伝子特異的プライマーの伸長および第２のユニバーサルタグへの続く一本鎖ライゲーション、その後に続くエキソヌクレアーゼによるクリーンアップならびにタグ１および２を利用する増幅を使用する、関心のある遺伝子の増幅を示す（アプローチ１）。 図２は、鋳型上で伸長し、その後、同じ鎖上の遺伝子特異的リン酸化オリゴヌクレオチドタグ４に下流でライゲーションされる、ユニバーサルタグ３を有する遺伝子特異的ビオチン化プライマーを使用する、関心のある遺伝子の増幅を示す。この産物は、続いて、タグ３および４を利用して増幅される（コンセプト２）。 図３は、ポストＰＣＲ反応（ｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して同定することができる、図１および２のアプローチ１および２の両方による手順からのユニバーサルＰＣＲ産物を示す。 図４は、アプローチ１プロトコールを使用する、一塩基多型（ｄｂＳＮＰ＃ ｒｓ１００６３２３７）の遺伝子型同定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図５Ａは、アプローチ２プロトコールを使用する、ｒｓ１０１５７３１の遺伝子型同定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図５Ｂは、アプローチ２プロトコールを使用する、１２の標的（たとえば１２プレックス反応液）の遺伝子型を同定するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図５Ｃは、アプローチ２プロトコールを使用する、１９プレックス反応液の遺伝子型を同定するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図５Ｄは、アプローチ２プロトコールを使用する、３５プレックス反応液の遺伝子型を同定するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図５Ｅは、図５Ｃ（１９プレックス）および図５Ｄ（３５プレックス）からのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルから獲得した遺伝子型を示す。 図６は、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長を示す。 読み取りとして対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長を使用する、３５プレックス遺伝子型同定についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図８は、ｒｓ１０００５８６およびｒｓ１０１３１８９４の遺伝子型同定についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図９は、７０プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチド質量タグを示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、３８４ウェルチップ上に配置した。面積、ピークの高さ、および信号対雑音比についての値を、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。 図１０は、ヌクレオチド組成によってソートした、７０プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチド質量タグについてのピーク面積を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、３８４ウェルチップ上に配置した。面積値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１１Ａは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。図１１Ｂは、１００プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドタグの信号対雑音比を示す。オリゴヌクレオチドはすべて、１０、５、２．５、または１ｐｍｏｌの最終総濃度まで希釈し、８回の反復実験をして３８４ウェルチップ上に配置した。信号対雑音比についての値は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）から収集した。図１１Ｃは、ＰＣＲ増幅および対立遺伝子特異的質量タグを含有する対立遺伝子特異的伸長プライマーによるポストＰＣＲプライマー伸長の後の１００プレックスアッセイのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトル（ズーム画像）を示す。 図１２は、５プレックス反応についての伸長率を示す。デオキシイノシンありまたはなしの伸長オリゴヌクレオチドおよび標準的なｄｄＮＴＰまたはビオチン成分を含有するヌクレオチドいずれかの比較。伸長率は、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）において、ピークの総面積（伸長産物および非伸長オリゴヌクレオチド）で伸長産物の面積を割ることによって計算した。すべての実験において、６つのＤＮＡを比較する。 図１３は、２つのＤＮＡに対する７プレックスおよび５プレックス反応についての伸長率を示す。結果より、単一のビオチン化ｄｄＮＴＰによるかまたはビオチン化ｄＮＴＰおよび未修飾ｄｄＮＴＰによって終結させる伸長ならびに反応に添加した２１０または４２０ｐｍｏｌのビオチン化ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの最終量を比較する。伸長率は、Ｔｙｐｅｒ ３．４において、総面積（伸長産物および非伸長オリゴヌクレオチド）で伸長産物の面積を割ることによって計算した。実験はすべて、２つのＣｅｎｔｒｅ ｄｅ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ） ＤＮＡ、ＮＡ０７０１９およびＮＡ１１０３６の２回の反復実験を含む。 図１４は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、ｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄ酵素濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用したｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄ酵素の量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図１５は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、ｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄバッファー濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用したｇｏｌｄＰＬＥＸバッファーの量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図１６は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、伸長オリゴヌクレオチド濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用した伸長オリゴヌクレオチドの量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図１７は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、伸長オリゴヌクレオチド濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用した伸長オリゴヌクレオチドの量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図１８は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、伸長オリゴヌクレオチド濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用した伸長オリゴヌクレオチドの量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図１９は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、伸長オリゴヌクレオチド濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用した伸長オリゴヌクレオチドの量を除いて、同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図２０は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、ビオチン化ｄｄＮＴＰ濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用したビオチン化ｄｄＮＴＰの量を除いて、同じプロトコールに従った（値は、それぞれのビオチン化ヌクレオチドの最終量を示す）。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図２１は、７０プレックスアッセイを使用する、伸長反応における、ビオチン化ｄｄＮＴＰ濃度の比較を示す。アッセイはすべて、使用したビオチン化ｄｄＮＴＰの量を除いて、同じプロトコールに従った（値は、それぞれのビオチン化ヌクレオチドの最終量を示す）。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの伸長産物の信号対雑音比を比較する。 図２２は、伸長産物を捕捉するためのＳｏｌｕｌｉｎｋおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ストレプトアビジンビーズの比較を示す。アッセイｒｓ１０００５８６についての２つの可能性のある対立遺伝子に対応するそれぞれのオリゴヌクレオチドの１０ｐｍｏｌの総量が、水または様々な量のビオチン化ｄＮＴＰ（合計１０、１００、もしくは５００ｐｍｏｌ）のいずれかの存在下において磁気ストレプトアビジンビーズに結合した。その後、質量タグは、１０ＵのエンドヌクレアーゼＶにより結合オリゴヌクレオチドから切断させた。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からの質量タグピークの面積を比較し、同様の質量を有する１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドと比較して列挙する。 図２３は、様々な位置にデオキシイノシンヌクレオチドを含有する伸長産物を切断するエンドヌクレアーゼＶの能力の分析を示す。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端から１０、１５、２０、または２５塩基のところにあるデオキシイノシンを除いて同一とした。オリゴヌクレオチドを磁気ストレプトアビジンビーズに結合させた後、上清を、収集し、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってきれいにし、その後、エンドヌクレアーゼＶによる処理によって切断した（非結合オリゴヌクレオチドと名付けた）。ビーズは、洗浄し、プロトコールセクションにおいて概説されるように、エンドヌクレアーゼＶにより切断した（捕捉／切断と名付けた）。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）からのピークの面積を比較し、磁気ストレプトアビジンビーズに結合することなくエンドヌクレアーゼＶによって切断されたオリゴヌクレオチドのうちのパーセンテージとして列挙する。 図２４は、７０プレックスアッセイを使用する磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶ濃度の比較を示す。アッセイはすべて、磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶの量を除いて同じ条件を使用して行った。実験はすべて、ＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ１１０３６の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４からの信号対雑音比を比較する。 図２５は、７０プレックスアッセイを使用する磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶ濃度の比較を示す。アッセイはすべて、磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶの量を除いて同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４からの信号対雑音比を比較する。 図２６は、７０プレックスアッセイを使用する磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶ濃度の比較を示す。アッセイはすべて、磁気ストレプトアビジンビーズおよびエンドヌクレアーゼＶの量を除いて同じプロトコールに従った。実験はすべて、２つのＣＥＰＨ ＤＮＡ ＮＡ０６９９１およびＮＡ０７０１９の４回の反復実験を含む。結果より、Ｔｙｐｅｒ ３．４からの信号対雑音比を比較する。 図２７Ａ〜Ｇは、ストレプトアビジンコーティング磁気または常磁性ビーズから、関心のあるビオチン化増幅産物を放出させるビオチン競合方法の略図を示す。パネルＡにおいて、関心のある領域が、ＰＣＲ増幅され（たとえば、ユニプレックスまたはマルチプレックス方法を使用して）、増幅された産物を、シュリンプアルカリホスファターゼにより続いて脱リン酸化する（図中に示さず）。パネルＢは、パネルＡにおいて増幅された産物における、関心のある残基に対する、ビオチン化ジデオキシヌクレオチドの一塩基伸長を示す。パネルＣは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズによるビオチン化伸長産物の捕捉を示す。パネルＤは、未使用の反応成分を除去するための洗浄ステップ、その後に続く、ビオチン化伸長産物が結合しているストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを捕捉するための捕捉ステップを示す。パネルＥは、遊離ビオチンとの競合による、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズからのビオチン化伸長産物の放出を示す。パネルＦは、マトリックス支援レーザー脱離／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）を含む、様々な方法を使用してさらに分析することができる、精製されたビオチン化伸長産物を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法における使用のために、単離された伸長産物は、たとえば、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に分注することができる。パネルＧは、本明細書において記載されるように生成されたビオチン化伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析由来の代表的な質量スペクトルを示す。実験の詳細および結果については、実施例１２を参照されたい。 図２７Ａ〜Ｇは、ストレプトアビジンコーティング磁気または常磁性ビーズから、関心のあるビオチン化増幅産物を放出させるビオチン競合方法の略図を示す。パネルＡにおいて、関心のある領域が、ＰＣＲ増幅され（たとえば、ユニプレックスまたはマルチプレックス方法を使用して）、増幅された産物を、シュリンプアルカリホスファターゼにより続いて脱リン酸化する（図中に示さず）。パネルＢは、パネルＡにおいて増幅された産物における、関心のある残基に対する、ビオチン化ジデオキシヌクレオチドの一塩基伸長を示す。パネルＣは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズによるビオチン化伸長産物の捕捉を示す。パネルＤは、未使用の反応成分を除去するための洗浄ステップ、その後に続く、ビオチン化伸長産物が結合しているストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを捕捉するための捕捉ステップを示す。パネルＥは、遊離ビオチンとの競合による、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズからのビオチン化伸長産物の放出を示す。パネルＦは、マトリックス支援レーザー脱離／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）を含む、様々な方法を使用してさらに分析することができる、精製されたビオチン化伸長産物を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法における使用のために、単離された伸長産物は、たとえば、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に分注することができる。パネルＧは、本明細書において記載されるように生成されたビオチン化伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析由来の代表的な質量スペクトルを示す。実験の詳細および結果については、実施例１２を参照されたい。 図２８は、本明細書において記載され、図２７Ａ〜Ｇにおいて示されるように、ビオチン化ジデオキシヌクレオチドターミネーターを使用して生成され、ビオチン競合によって固体表面から放出された一塩基伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によって測定される、様々な対立遺伝子バリアント（たとえば多型）の質量差の代表的な質量スペクトルである。実験の詳細および結果については、実施例１２を参照されたい。 図２９Ａ〜Ｇは、ビオチン競合放出ステップのメカニズムを示すフローチャートを示す。 図３０。図３０Ａは、イノシン切断放出ステップのメカニズムを示すフローチャートを示す。ステップは、伸長オリゴヌクレオチドがイノシン残基によって隔てられる５’質量タグを有するということを除いて、洗浄ステップを通してのビオチン捕捉方法と同じである。質量タグは、イノシン残基に特異的なエンドヌクレアーゼＶ切断を通して捕捉産物から切断する。図３０Ｂは、ＭＡＬＤＩでの、切断された質量タグの検出を示す。質量は、遺伝的バリアントに相当する。 図３１は、様々な濃度の３’ビオチン化オリゴヌクレオチドおよび様々な捕捉ビーズを使用する、ビオチン競合対イノシン切断の比較の結果を示す。 図３２は、Ｄｙｎａｌ Ｃｌビーズを使用する、ビオチン競合対イノシン切断の比較の結果を示す。検出された捕捉オリゴヌクレオチドおよび検出された定量オリゴヌクレオチドを表す質量スペクトルピークを、下向き矢印によって示す。図３２Ａは、Ｄｙｎａｌ Ｃ１ストレプトアビジンビーズを捕捉のためにおよび遊離ビオチンを競合のために使用する、ビオチン競合の結果を示す。試験したビオチン化オリゴヌクレオチドおよび参照オリゴヌクレオチド（すなわち定量オリゴヌクレオチド）の濃度は、０．０３１ｕＭであった。図３２Ｂは、Ｄｙｎａｌ Ｃ１ストレプトアビジンビーズを捕捉のためにおよびエンドヌクレアーゼＶを放出のために使用する、イノシン切断放出の結果を示す。試験したビオチン化オリゴヌクレオチドおよび参照オリゴヌクレオチド（すなわち定量オリゴヌクレオチド）の濃度は、０．０３１ｕＭであった。 図３３は、競合因子鋳型を使用する、様々な捕捉ビーズの評価を示す。 図３４は、試験したそれぞれのビーズタイプについて非常に低度の競合因子鋳型（約３０分子）を使用するアッセイからの質量分析法結果を示す。検出された捕捉オリゴヌクレオチドおよび検出された定量オリゴヌクレオチドを表す質量スペクトルピークを、下向き矢印によって示す。図３４Ａは、Ｄｙｎａｌ Ｃ１ビーズを使用した結果を示す。図３４Ｂは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋビーズを使用した結果を示す。図３４Ｃは、Ｄｙｎａｌ Ｍ２７０ビーズを使用した結果を示す。 図３５は、異なる伸長組成物を使用するＢＲＡＦ−２およびＢＲＡＦ−１５変異体の検出を示し、野生型（たとえばより豊富なバリアント）に対応するｄｄＮＴＰが伸長組成物から排除される場合の、信号対雑音比の増加を実証する。 図３６は、１％のまれな対立遺伝子による競合アッセイの結果を示す。 図３７は、ＥｃｏＲＩ制限消化酵素により切断して、領域を分離することができ、より十分にゲノムの状況を反映することができるモデルプラスミドを示す。
詳細な説明
本明細書において記載される、組成物における複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法には、当技術分野における当業者（以下、本明細書において「当業者」と呼ばれる）によって複数の使用が見出される。そのような方法は、たとえば、（ａ）特定の標的配列（たとえば、遺伝的変異を含む標的配列）がサンプル中に存在するかどうかを速やかに決定するために；（ｂ）混合物の分析を実行するために、たとえば、混合物および／もしくはその組成を同定するためにまたは混合物（たとえば混生群落、疑似種）における標的配列の頻度を決定するために；（ｃ）サンプルにおける配列バリエーション（たとえば変異体、一塩基多型）を検出するために；（ｄ）ハプロタイプ決定を実行するために；（ｅ）微生物（たとえば病原体）タイピングを実行するために；（ｆ）サンプルにおける微生物標的配列の存在または非存在を検出するために；（ｇ）疾患マーカーを同定するために；（ｈ）マイクロサテライトを検出するために；（ｉ）ショートタンデムリピートを同定するために；（ｊ）生物（複数可）を同定するために；（ｋ）対立遺伝子バリエーションを検出するために；（ｌ）対立遺伝子頻度を決定するために；（ｍ）メチル化パターンを決定するために；（ｎ）エピジェネティックな決定を実行するために；（ｏ）生体分子の領域をリシーケンスする（ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ために；（ｐ）ヒト臨床研究および医学における分析を実行するために（たとえば癌マーカー検出、配列バリエーション検出；特定の薬物投与に好都合なまたは不都合な配列の特色の検出）、（ｑ）ＨＬＡタイピングを実行するために；（ｒ）法医学（ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ）の分析を実行するために；（ｓ）ワクチンの品質管理分析を実行するために；（ｔ）処置をモニターするために；（ｕ）ベクターのアイデンティティについての分析を実行するために；（ｖ）ワクチンまたは産生株の品質管理を実行するために、ならびに（ｗ）菌株のアイデンティティを試験するために、（ｘ）植物に利用することができる。そのような方法はまた、たとえば、限定を伴うことなく、商業、教育、医学、農業、環境、疾患モニタリング、軍事防衛、および法医学の分野を含む、様々な分野において利用されてもよい。
標的核酸
本明細書において使用されるように、用語「核酸」は、限定を伴うことなく、天然核酸（たとえばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ））、合成核酸、非天然核酸（たとえばペプチド核酸（ＰＮＡ））、未修飾核酸、修飾核酸（たとえばメチル化ＤＮＡまたはＲＮＡ、標識ＤＮＡまたはＲＮＡ、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としての核酸に対する言及は、共有結合によって連結された２つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを指す。核酸は、本明細書において記載されるプロセスによる使用に適した任意のタイプの核酸であってもよい。ある実施形態における核酸は、ＤＮＡ（たとえば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、プラスミド、およびベクターＤＮＡなど）、ＲＮＡ（たとえばウイルスＲＮＡ、メッセージＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ ＲＮＡ）（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、など）、ならびに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ（たとえば、塩基アナログ、糖アナログ、および／もしくは非ネイティブな主鎖などを含有する）とすることができる。核酸は、本明細書においてプロセスを行うのに有用な任意の形態（たとえば、直鎖、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）とすることができる。核酸は、ある実施形態において、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、細胞、細胞の細胞核、または細胞質由来のものであってもよい。いくつかの実施形態における核酸は、単一染色体由来のものである（たとえば、核酸サンプルは、二倍体生物から得られたサンプルの１つの染色体由来のものであってもよい）。胎児の核酸の場合には、核酸は、父方の対立遺伝子、母方の対立遺伝子、または母方および父方の対立遺伝子由来のものであってもよい。
標的核酸、アンプリコン、プライマー、配列タグ、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに関して本明細書において使用される用語「種」は、ヌクレオチド配列がアライメントされた場合に、他の核酸のヌクレオチド配列と、１つ以上のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を有する１つの核酸を指す。したがって、第１の核酸種は、２つの種の配列が、アライメントされた場合に、１つ以上のヌクレオチドが異なる場合、第２の核酸種と異なる（たとえば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または１００を超えるヌクレオチドの差）。ある実施形態において、標的核酸種、アンプリコン種、または伸長オリゴヌクレオチド種などのような核酸種の数は、約２〜約１００００の核酸種、約２〜約１０００の核酸種、約２〜約５００の核酸種、または時に、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の核酸種を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド種が、核酸鋳型（たとえばアンプリコン）にハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸を形成し、鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種と本明細書において呼ばれる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、鋳型にハイブリダイズしない１つ以上のヌクレオチドを含むことができる。たとえば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種は、１つ以上のミスマッチヌクレオチド（たとえば非相補的ヌクレオチド）ならびに時に、ハイブリダイズしない、ヌクレオチドの５’および／または３’領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、タグ（たとえば、質量による識別が可能なタグ、配列タグ、発光タグ、または放射性タグ）を含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、捕捉剤（たとえば、ビオチンまたは結合ペアの任意のメンバー）を含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドを含む。
本明細書において使用されるように、用語「ヌクレオチド」は、天然および非天然ヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド一、二、および三リン酸：デオキシアデノシン一、二、および三リン酸；デオキシグアノシン一、二、および三リン酸；デオキシチミジン一、二、および三リン酸；デオキシシチジン一、二、および三リン酸；デオキシウリジン一、二、および三リン酸；ならびにデオキシイノシン一、二、および三リン酸（それぞれ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＵ、およびｄＩまたはＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、およびＩと本明細書において呼ばれる）を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドはまた、修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むが、これらに限定されない。修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、限定を伴うことなく、デアザプリンヌクレオチド、たとえば７−デアザ−デオキシグアノシン（７−デアザ−ｄＧ）ならびに７−デアザ−デオキシアデノシン（７−デアザ−ｄＡ）一、二、および三リン酸、ジュウテロ（ｄｅｕｔｅｒｏ）−デオキシチミジン（ジュウテロ−ｄＴ）一、二、および三リン酸、メチル化ヌクレオチド、たとえば５−メチルデオキシシチジン三リン酸、１３Ｃ／１５Ｎ標識ヌクレオチド、ならびにデオキシイノシン一、二、および三リン酸を含む。修飾ヌクレオチド、同位体が豊富なヌクレオチド、劣化ヌクレオチド（ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、タグ付きおよび標識ヌクレオチド、ならびにヌクレオチドアナログは、官能性および付加位置の様々な組み合わせを使用して得ることができる。
核酸に関して本明細書において使用される用語「組成物」は、１つ以上の核酸を含む有形物を指す。組成物は、時に、供給源から抽出されたサンプルであるが、また、供給源のすべてのサンプルの組成物でもあり、時として、１つ以上の核酸の供給源である。組成物は、核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物が、ゲノムＤＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物が、母方のＤＮＡ、胎児のＤＮＡ、または母方および胎児のＤＮＡの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物が、ゲノムＤＮＡの断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、またはその混合物に由来する核酸を含むことができる。
核酸サンプルは、１つ以上の供給源に由来してもよい。サンプルは、たとえば、生物、鉱質もしくは地質サイト（たとえば土、岩、鉱床、化石）、または法医学サイト（たとえば犯罪現場、密輸品、もしくは密輸品であることが疑われる密輸品）から収集されてもよい。したがって、供給源は、たとえば、地質、農業、戦域、または土の供給源などのような、環境的なものであってもよい。供給源はまた、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類動物、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄ウシ、雌ウシ、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラ、およびサメを含むが、これらに限定されない、任意の植物、真菌、原生生物、モネラ界の生物、ウイルス、もしくは動物などのような任意のタイプの生物または検出可能な核酸を有し得る任意の動物もしくは生物由来のものであってもよい。供給源はまた、内部、外部、生存または非生存細胞、組織、体液などのような、生物の異なる部分を指すことができる。そのため、サンプルは、生存する供給源または以前生存していた（ｆｏｒｍｅｒｌｙ−ｌｉｖｉｎｇ）供給源、たとえばヒトまたは他の哺乳動物、植物、細菌、真菌、原生生物、もしくはウイルスなどのような動物から得られる任意の材料を指す「生物学的サンプル」であってもよい。供給源は、限定を伴うことなく、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、もしくは生検材料などのような固形材料または尿、血液、唾液、羊水、感染もしくは炎症の領域由来の滲出液、または頬の細胞を含有するうがい薬などのような生体液、毛、脳脊髄液、および滑液、ならびに器官を含む、任意の形態とすることができる。サンプルはまた、他のサンプルと比較して、異なる時点で単離されてもよく、ここで、それぞれのサンプルは、同じまたは異なる供給源由来のものである。核酸は、たとえば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡライブラリなどのような核酸ライブラリ由来のものであってもよい。核酸は、サンプル由来の核酸分子の核酸精製または単離および／または増幅の結果であってもよい。本明細書において記載される配列分析プロセスのために提供される核酸は、１つのサンプル由来のまたは２つ以上のサンプル由来の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００、またはそれ以上のサンプル由来の）核酸を含有してもよい。
核酸は、様々な様式で処理されてもよい。たとえば、核酸は、サイズを低下させてもよく（たとえば、煎断、ヌクレアーゼまたは制限酵素による消化、脱リン酸化、脱メチル化）、サイズを増加させてもよく（たとえば、リン酸化、メチル化特異的試薬との反応、検出可能な標識への付加）、核酸切断の阻害剤などにより処理されてもよい。
核酸は、ある実施形態において、プロセシングを伴わないで、本明細書において記載される方法を行うために提供されてもよい。いくつかの実施形態において、核酸が、プロセシングの後に、本明細書において記載される方法を行うために提供される。たとえば、核酸は、サンプルから抽出、単離、精製、または増幅されてもよい。本明細書において使用される用語「単離された」は、そのもとの環境（たとえば、それが天然に存在する場合、自然環境または外因的に発現される場合、宿主細胞）から除去された核酸を指し、したがって、そのもとの環境から「人の手によって」改変されている。単離核酸は、一般に、供給源サンプル中に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（たとえばタンパク質、脂質）と共に提供される。単離核酸を含む組成物は、実質的に単離することができる（たとえば、非核酸成分が約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて、ない）。本明細書において使用される用語「精製された」は、核酸が由来するサンプル供給源よりも少ない核酸種を含有する、提供される核酸を指す。核酸を含む組成物は、実質的に精製されてもよい（たとえば、他の核酸種が約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて、ない）。
核酸は、本明細書において記載されるプロセスのための核酸を提供する前に、ある実施形態において、核酸断片を生成する方法によってプロセシングされてもよい。いくつかの実施形態において、断片化または切断に供される核酸が、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００塩基対の公称、平均、または中間の長さを有していてもよい。断片は、当技術分野において公知の任意の適した方法によって生成することができ、核酸断片の平均、中間、公称の長さは、適切な断片生成手順を選択することによって制御することができる。ある実施形態において、比較的長さが短い核酸を利用して、配列バリエーションをほとんど含有しないおよび／または比較的多量の公知のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析することができる。いくつかの実施形態において、比較的長さが長い核酸を利用して、より多数の配列バリエーションを含有するおよび／または比較的少量の公知のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析することができる。
本明細書において使用されるように、用語「標的核酸」または「標的核酸種」は、サンプル中の関心のある任意の核酸種を指す。標的核酸は、限定を伴うことなく、（ｉ）２つ以上の可能性のある対立遺伝子の中の特定の対立遺伝子および（ｉｉ）特定の変異体、ヌクレオチド置換、配列バリエーション、リピート配列、マーカー、または識別配列（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するかまたは有しない核酸を含む。本明細書において使用されるように、用語「異なる標的核酸」は、１つ以上の特徴によって異なる核酸種を指す。本明細書において使用されるように、用語「遺伝的バリエーション」は、１つ以上の特徴によって異なる核酸種を指す。本明細書において使用されるように、用語「バリアント」は、１つ以上の特徴によって異なる核酸種を指す。特徴は、限定を伴うことなく、１つ以上のメチル基またはメチル化状態、１つ以上のリン酸、１つ以上のアセチル基、および１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の欠失、付加、または置換を含む。１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の欠失、付加、または置換の例は、限定を伴うことなく、特定の変異体の存在または非存在、ヌクレオチド置換（たとえば一塩基多型（ＳＮＰ））の存在または非存在、リピート配列（たとえば、ジ、トリ、テトラ、ペンタヌクレオチドリピート）の存在または非存在、マーカー（たとえばマイクロサテライト）の存在または非存在、および識別配列の存在または非存在（たとえば、１つの生物を他の生物と識別する配列（たとえば、１つのウイルス株を他のウイルス株と識別する配列））を含む。異なる標的核酸は、本明細書において記載されるように、任意の公知の方法によって、たとえば質量、結合、識別が可能なタグなどによって識別されてもよい。
本明細書において使用されるように、用語「複数の標的核酸」または「複数の標的核酸種」は、１つを超える標的核酸種を指す。複数の標的核酸は、ある実施形態において、約２〜約１００００の核酸種、約２〜約１０００の核酸種、約２〜約５００の核酸種、または時に、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の核酸種とすることができる。核酸の検出または同定は、標的の検出をもたらし、特定の変異体、配列バリエーション（変異体もしくは多型）、または遺伝的バリエーション（たとえば配列バリエーション、配列差、もしくは多型）の存在または非存在を示すことができる。複数の標的核酸内で、同じかまたは異なる標的核酸が検出されてもよい。複数の標的核酸はまた、同定の点から定量的におよび定性的に同定されてもよい。下記のマルチプレックス化もまた、参照されたい。
増幅および伸長
核酸（たとえば標的核酸）は、ある実施形態において、増幅することができる。本明細書において使用されるように、用語「増幅する」およびその文法的な変形は、鋳型核酸のコピーを生成するプロセスを指す。たとえば、核酸鋳型は、鋳型のヌクレオチド配列または鋳型の一部分と同じかまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する、２つ以上の核酸アンプリコン（コピー）を線形的にまたは指数関数的に生成するプロセスに供されてもよい。核酸増幅は、多くの場合、特異的であり（たとえば、アンプリコンは、同じかまたは実質的に同じ配列を有する）、ある実施形態において、非特異的とすることができる（たとえば、アンプリコンは、異なる配列を有する）。サンプル中に存在する標的配列の量が低度の場合、核酸増幅は、時に有益となる。標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによって、標的核酸の検出のためのアッセイの初めに、より少ない標的配列しか必要とされないので、アッセイの感度を改善することができる。標的核酸は、ある実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズに先立って、時に増幅されない。
増幅条件は公知であり、増幅される特定の核酸に対して選択することができる。増幅条件は、ある種の試薬を含み、これらのうちのいくつかは、限定を伴うことなく、ヌクレオチド（たとえばヌクレオチド三リン酸）、修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（たとえば、ポリメラーゼベースの増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドおよびリガーゼベースの増幅のためのオリゴヌクレオチド基本単位）、１つ以上の塩（たとえばマグネシウムを含有する塩）、１つ以上のバッファー、１つ以上の重合剤（たとえばリガーゼ酵素、ポリメラーゼ酵素）、１つ以上のニッキング酵素（たとえば、二本鎖核酸の一方の鎖を切断する酵素）、ならびに１つ以上のヌクレアーゼ（たとえばエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ）を含むことができる。たとえば、エキソヌクレアーゼ活性を有するかまたは有さないポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、これらの酵素の変異体形態などのような、増幅に適した任意のポリメラーゼが、利用されてもよい。他方のオリゴヌクレオチドの３’末端に、１つのオリゴヌクレオチドの５’をつなぐのに適した任意のリガーゼを利用することができる。増幅条件はまた、等温条件または温度サイクル条件などのようなある反応条件を含むことができる。サーモサイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ）デバイスを使用することによってなどのように、増幅プロセスにおいて温度をサイクリングするための方法が、知られている。用語「サイクリング」は、温度サイクリングが使用される場合に、単一のプライマーまたは複数のプライマーを利用する増幅（たとえば増幅反応または伸長反応）を指す。増幅条件はまた、いくつかの実施形態において、内部で単一の核酸分子種を増幅することができる複数の反応コンパートメント（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を形成するために利用することができる乳剤（たとえば油）を含むこともできる。増幅は、時に、指数関数的産物生成プロセスであり、時に、線形産物生成プロセスである。
一本鎖核酸標的の１つの鎖を、増幅することができ、また、二本鎖核酸標的の１つまたは２つの鎖を増幅することができる。増幅産物（アンプリコン）は、いくつかの実施形態において、約１０ヌクレオチド長〜約１０，０００ヌクレオチド長、約１０〜約１０００ヌクレオチド長、約１０〜約５００ヌクレオチド長、１０〜約１００ヌクレオチド長、時に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド長である。
任意の適した増幅技術および増幅条件はまた、増幅のための特定の核酸に対して選択することもできる。公知の増幅プロセスは、限定を伴うことなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、伸長およびライゲーション、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、ならびにＱ−ベータレプリカーゼまたは鋳型依存性ポリメラーゼの使用に基づく増幅方法（米国特許出願公開第２００５０２８７５９２号明細書を参照されたい）を含む。鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）、および転写関連性の増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＡ）もまた、有用である。増幅プロセスを行うための試薬、装置、およびハードウェアは、市販で入手可能であり、増幅条件は、公知であり、目下の標的核酸に対して選択することができる。
ポリメラーゼベースの増幅は、ユニバーサルプライマーを用いることによって、ある実施形態において達成することができる。そのようなプロセスにおいて、１つ以上のユニバーサルプライマーにハイブリダイズするハイブリダイゼーション領域が、鋳型核酸の中に組み込まれる。そのようなハイブリダイゼーション領域は、（ｉ）標的核酸にハイブリダイズし、伸長するプライマーおよび／または（ｉｉ）たとえば、標的核酸もしくは（ｉ）の産物につながれた（たとえば、リガーゼ酵素を使用してライゲーションされた）オリゴヌクレオチドの中に組み込むことができる。ユニバーサルプライマーを伴う増幅プロセスは、たとえば、わずか１つまたは２つの増幅プライマーしか使用せずに、複数の標的核酸を増幅するという利点を提供することができる。
図１は、増幅プロセスのある実施形態を示す。ある実施形態において、１つのプライマーのみが、増幅のために利用される（たとえば図１Ａ）。ある実施形態において、２つのプライマーが、利用される。増幅条件下で、少なくとも１つのプライマーが、相補的な、識別が可能なタグを有する。遺伝子特異的伸長プライマーは、５’ユニバーサルＰＣＲＴａｇ１Ｒを有する（たとえば図１Ａ）。それは、任意の核酸、たとえばゲノムＤＮＡ上で伸長され得る。ＤＮＡまたはＰＣＲ Ｔａｇ１Ｒ遺伝子特異的伸長プライマーは、反応のクリーンアップを促進するために、ビオチン化されてもよい。その後、伸長鎖は、Ｔａｇ２Ｆの逆相補体である配列を有するユニバーサルリン酸化オリゴヌクレオチドに、一本鎖リガーゼによってライゲーションされる（ユニバーサルＰＣＲプライマー；図１Ｂ）。次のステップにおいてクリーンアップを促進するために、リン酸化オリゴヌクレオチドは、その３’末端にエキソヌクレアーゼ抵抗性のヌクレオチドを含むことができる。エキソヌクレアーゼ処理の間に、ライゲーションされていない伸長鎖はすべて、分解されるのに対して、ライゲーションされた産物は、保護され、反応液中に残る（たとえば図１Ｃ）。その後、ユニバーサルＰＣＲは、複数の標的を増幅するためにＴａｇ１ＲおよびＴａｇ２Ｆプライマーを使用して実行される（たとえば図１Ｄ）。
図２もまた、増幅プロセスのある実施形態を示す。いくつかの実施形態において、プライマー伸長およびライゲーションを伴う方法は、同じ反応において行われる（たとえば図２Ａ）。ビオチン化ＰＣＲＴａｇ３Ｒ遺伝子特異的プライマーは、伸長プライマーである。リン酸化オリゴヌクレオチドは、遺伝子特異的配列を有し、プライマー伸長部位から約４０塩基（たとえば４〜１００以上）離れたところでＤＮＡの同じ鎖に結合する。したがって、ＳｔｏｆｆｅｌポリメラーゼなどのようなＤＮＡポリメラーゼは、それがリン酸化オリゴヌクレオチドに到達するまで、鎖を伸長させる。リガーゼ酵素は、リン酸化オリゴヌクレオチドの遺伝子特異的配列を伸長鎖にライゲーションする。リン酸化オリゴヌクレオチドの３’末端は、そのユニバーサルタグとしてＰＣＲＴａｇ４（ＲＣ）Ｆを有する。その後、ビオチン化伸長鎖は、ストレプトアビジンビーズに結合する。このアプローチは、反応のクリーンアップを促進する（たとえば図２Ｂ）。ゲノムＤＮＡなどのようなＤＮＡおよび遺伝子特異的リン酸化オリゴヌクレオチドは、洗い流される。その後、ユニバーサルＰＣＲは、プライマーとしてＴａｇ３ＲおよびＴａｇ４Ｆを使用して実行され、関心のある様々な遺伝子が増幅される（たとえば図２Ｃ）。
ある核酸は、ある実施形態において、伸長させることができる。本明細書において使用される用語「伸長」およびその文法的な変形は、核酸の一方の鎖を伸ばすことを指す。たとえば、標的核酸または標的核酸から生成されるアンプリコンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、ある実施形態において、伸長させることができる。伸長反応は、伸長条件下で行われ、様々なそのような条件は、公知であり、特定の適用に対して選択される。伸長条件は、限定を伴うことなく、１つ以上のオリゴヌクレオチド、伸長ヌクレオチド（たとえばヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、終結ヌクレオチド（たとえば１つ以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ））、１つ以上の塩（たとえばマグネシウムを含有する塩）、１つ以上のバッファー（たとえばベータ−ＮＡＤ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００とともに）、および１つ以上の重合剤（たとえばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）を含むある種の試薬を含む。伸長は、ある実施形態において、等温条件下でまたは非等温条件（たとえばサーモサイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）条件）下で行うことができる。１つ以上の核酸種は、伸長反応において伸長させることができ、それぞれの核酸種の１つ以上の分子を、伸長させることができる。核酸は、１つ以上のヌクレオチドによって伸長させることができ、いくつかの実施形態において、伸長産物が、約１０ヌクレオチド長〜約１０，０００ヌクレオチド長、約１０〜約１０００ヌクレオチド長、約１０〜約５００ヌクレオチド長、１０〜約１００ヌクレオチド長、時に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド長である。終結ヌクレオチド（たとえばｄｄＮＴＰ）の組み込み、ハイブリダイゼーション位置、または他の因子によって、オリゴヌクレオチドが伸長する長さを決定することができる。ある実施形態において、増幅および伸長のプロセスが、同じ検出手順において実行される。
いくつかの実施形態において、伸長反応が、反応において伸長産物の量を増幅するために繰り返される複数の温度サイクルを含む。いくつかの実施形態において、伸長反応が、２回以上、サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、１０回以上、サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、約１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００回以上サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、２０〜５０回、サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、２０〜１００回、サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、２０〜３００回、サイクリングされる。いくつかの実施形態において、伸長反応が、２００〜３００回、サイクリングされる。
いくつかの実施形態において、標的核酸（たとえば標的核酸種、オリゴヌクレオチド種、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種、またはアンプリコン）が、標的核酸が１つのヌクレオチドによって伸長する伸長組成物の存在下において、伸長する。伸長組成物は、当技術分野において使用される１つ以上のバッファー、塩、酵素（たとえばポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗなど）、水、鋳型（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、アンプリコンなど）、プライマー（たとえばオリゴヌクレオチド）、ヌクレオチド三リン酸、グリセロール、高分子排除分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、および任意の他の添加剤を含むことができる。伸長組成物は、終結ヌクレオチド（たとえばジデオキシヌクレオチド（たとえばｄｄＮＴＰ））、非終結ヌクレオチドもしくは伸長ヌクレオチド（たとえばｄＮＴＰ）、または終結ヌクレオチドおよび非終結ヌクレオチドの混合物を含むことができる。特定の終結ヌクレオチド（複数可）から本質的になる伸長組成物は、伸長組成物の任意の他の成分（たとえばバッファー、塩、鋳型、プライマーなど）を含有することができるが、指定されるもの以外のあらゆる他の終結ヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸（たとえばｄＮＴＰ）を含有しない。たとえば、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰから本質的になる伸長組成物は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはあらゆる他のｄＮＴＰを含有しない。いくつかの実施形態において、伸長組成物中のヌクレオチドが、終結ヌクレオチドのみであり、標的核酸が、１つのヌクレオチドによって伸長する（すなわち、時に、伸長組成物中に伸長ヌクレオチドがない）。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、終結ヌクレオチド（たとえばｄｄＮＴＰ）から本質的になる。いくつかの実施形態において、終結ヌクレオチドが、１つ以上の（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０以上の）捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、終結ヌクレオチドが、１つ以上の（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０以上の）様々な捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、終結ヌクレオチドが、１つ以上の（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０以上の）捕捉剤分子を含む（たとえば捕捉剤分子に共有結合される）。いくつかの実施形態において、終結ヌクレオチドが、１つの捕捉剤分子を含む。いくつかの実施形態において、第１の終結ヌクレオチドが、捕捉剤を含み、第２の終結ヌクレオチドが、異なる捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、それぞれの終結ヌクレオチドが異なる捕捉剤を含む、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、それぞれの終結ヌクレオチドが捕捉剤を含み、該捕捉剤が同じである、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、終結ヌクレオチドおよび伸長ヌクレオチドを含み、１つ以上のヌクレオチド（たとえば終結ヌクレオチドおよび／または伸長ヌクレオチド）が、捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、終結ヌクレオチドが、捕捉剤を含み、捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体である。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、１つ以上の捕捉剤に結合した終結ヌクレオチドから本質的になる。いくつかの実施形態において、捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体である。ビオチン類似体は、アビジンまたはストレプトアビジンに対するビオチンの結合特性をもたらす任意の修飾ビオチンとすることができる（たとえば、Ｌａｉ−Ｑｉａｎｇら（Ｌａｉ−Ｑｉａｎｇ ＹｉｎｇおよびＢｒｕｃｅ Ｐ． Ｂｒａｎｃｈａｕｄ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２０１１， ４７、８５９３−８５９５）において開示されるすべてのビオチン類似体を含めて、９−メチルビオチン、ビオチンメチルエステル（ＭＥＢｉｏ）、デスチオビオチン（ＤＥＢｉｏ）、２’−イミノビオチン（ＩＭＢｉｏ）、ｅ−Ｎ−ビオチニル−Ｌ−リシン、ジアミノビオチン（ＤＡＢｉｏ））。いくつかの実施形態において、捕捉剤が、アビジン、ストレプトアビジン、またはアビジンもしくはストレプトアビジンの修飾形態（たとえばニトロアビジン（ｎｉｔｒｏａｖｉｄｉｎ）、ニトロストレプトアビジン（ｎｉｔｒｏｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ、およびその誘導体）である。
任意の適した伸長反応を、選択し、利用することができる。伸長反応を利用して、たとえば、標的核酸におけるＳＮＰ部位に隣接する領域にハイブリダイズする伸長オリゴヌクレオチドへのデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの組み込みによる、ＳＮＰ対立遺伝子を判別することができる。プライマーは、多くの場合、ポリメラーゼにより伸長する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ＳＮＰ部位に対して相補的なわずか１つのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドによって伸長する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｄＮＴＰの組み込みによって伸長し、ｄｄＮＴＰによって終結し得るか、またはある実施形態において、ｄＮＴＰによる伸長を伴うことなく、ｄｄＮＴＰの組み込みによって終結し得る。伸長反応の間に使用される１つ以上のｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰは、いくつかの実施形態において、ビオチンなどのような固体支持体への固定を可能にする部分により標識される。伸長は、いくつかの実施形態において、未修飾伸長オリゴヌクレオチドおよび未修飾ジデオキシヌクレオチド、未修飾伸長オリゴヌクレオチドおよびビオチン化ジデオキシヌクレオチド、デオキシイノシンを含有する伸長オリゴヌクレオチドおよび未修飾ジデオキシヌクレオチド、デオキシイノシンを含有する伸長オリゴヌクレオチドおよびビオチン化ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ジデオキシヌクレオチドによる伸長、またはビオチン化デオキシヌクレオチドおよび／もしくは未修飾ジデオキシヌクレオチドによる伸長を使用して実行されてもよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド種が、遺伝的バリエーションまたはバリアントに隣接する鋳型（たとえば標的核酸種）に、ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる（たとえば、オリゴヌクレオチド種の３’末端が、遺伝的バリエーション部位の５’に位置してもよく、遺伝的変異部位の５’末端から０〜１０ヌクレオチド離れていてもよい）。いくつかのバリアントは、標的核酸における遺伝的バリエーションの部位に存在し得る。遺伝的バリアントは、時に、一塩基多型（ＳＮＰ）または一塩基バリアント（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔ）である。いくつかの一塩基バリアントは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’に位置する鋳型標的上の一塩基の位置に存在し得る。いくつかの一塩基バリアントは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種の３’にある鋳型標的上の位置に位置する一塩基によって異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド種が、バリアントの位置で１つのヌクレオチドによって伸長する。オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、存在するバリアントの数に依存して、５つの終結ヌクレオチド（たとえばｄｄＡＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ）のうちのいずれか１つによって伸長させることができる。標的核酸種およびそのバリアントまたは対応するアンプリコンは、鋳型として働くことができ、部分的に、どの終結ヌクレオチドが伸長反応においてオリゴヌクレオチドに付加されるかを決定することができる。標的核酸種は、２つ以上のバリアントを有し得る。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、２つのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、３つのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、４つのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、バリアントを含まない。
いくつかの実施形態において、野生型（たとえば高度な存在量の種）伸長産物が生成されないアッセイにおいて存在する標的変異体バリアント（たとえば低度な存在量のバリアント）の分子の量が、伸長反応において含まれる合成鋳型の使用によって決定される。いくつかの実施形態において、サンプルにおける標的変異体バリアント（すなわち変異体伸長産物）の量（たとえばコピー数、濃度、パーセンテージ）および／または標的変異体バリアントのパーセンテージが、伸長反応における合成鋳型の既知量を含めることによって定量化される。いくつかの実施形態において、合成鋳型が、オリゴヌクレオチド種にハイブリダイズすることができ、伸長されることとなるオリゴヌクレオチド種の３’のすぐのところに位置する変異体位置に塩基置換を含有することができる。いくつかの実施形態において、塩基置換が、野生型または標的変異体バリアント（たとえば第１のバリアント、低度な存在量のバリアント、ＳＮＰ）と異なる。いくつかの実施形態において、鋳型中に存在する塩基置換が、鋳型の導入前にサンプル中に存在しない。いくつかの実施形態において、合成鋳型における塩基置換に相補的なｄｄＮＴＰ（たとえばビオチン−ｄｄＮＴＰ）もまた、反応の中に導入される。いくつかの実施形態において、標的変異体バリアントにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種が、合成鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種と同時に増幅される（たとえば、同時に伸長する）。いくつかの実施形態において、合成鋳型の段階希釈溶液を含む複数の反応を実行して、標的変異体バリアントの量および／またはパーセンテージを決定する。いくつかの実施形態において、標的変異体バリアントの量および／またはパーセンテージが、標的変異体バリアントと等しい伸長産物を産出する合成鋳型の量によって決定される。
いくつかの実施形態において、あるバリアントが、他のバリアントよりも存在量が大きくてもよい。いくつかの実施形態において、最も大きな存在量のバリアントが、野生型バリアントと呼ばれる。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、第１および第２のバリアントを含み、第２のバリアントが、より大きな存在量で示される（すなわち、より多くの鋳型が存在する）。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、第１、第２、および第３のバリアントを含み、第２のバリアントが、第１および第３のバリアントに対して、より大きな存在量で示される。いくつかの実施形態において、標的核酸種が、第１、第２、第３、および第４のバリアントを含み、第２のバリアントが、第１、第３、および第４のバリアントに対して、より大きな存在量で示される。より大きな存在量で示されるバリアントは、一般に、他のバリアントと比較した場合に、より高度な濃度で存在するかまたはより大きな数（たとえばコピー）の分子によって示される。より高度な濃度は、２倍以上とすることができる。いくつかの実施形態において、より高度な濃度が、１０倍以上とすることができる。いくつかの実施形態において、より高度な濃度が、１００倍、１０００倍、または１００００倍以上である。いくつかの実施形態において、第２のバリアントが、野生型配列を示し、第１のバリアントよりも１００倍以上高度な濃度で存在する。いくつかの実施形態において、第１のバリアントが、第２のバリアント（たとえば野生型）よりも著しく低度の濃度で示され、第１のバリアントが、より少量の標的核酸種を示す。いくつかの実施形態において、第１のバリアントが、標的核酸種の３０％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％、１％、０．８％、０．７５％、０．５％、０．１％、．０５％、．０１％、またはそれ以下を示す。いくつかの実施形態において、第１のバリアントが、標的核酸種の約５％〜約０．７５％を示す。いくつかの実施形態において、第１のバリアントが、組成物中の核酸の全体の３０％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％、１％、０．８％、０．７５％、０．５％、０．１％、．０５％、．０１％、またはそれ以下を示す。
いくつかの実施形態において、伸長組成物中に存在する（またはいくつかの実施形態において存在しない）終結ヌクレオチドによって、どの終結ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに付加されるかを決定する。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、１つ以上の終結ヌクレオチド（たとえばｄｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、１つ以上の終結ヌクレオチドおよび１つ以上の非終結ヌクレオチド（たとえばｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、特異的なバリアント（たとえば第１のバリアントまたはそれほど豊富でないバリアント）に対応する終結ヌクレオチドのみを含み、そのため、その特異的なバリアントの伸長のみを可能にする。いくつかの実施形態において、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）の伸長を可能にする終結ヌクレオチドが、伸長組成物から排除され、それによって、第２のバリアントの伸長を妨げることができる。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、第１および第３のバリアントに対応する終結ヌクレオチドのみを含み、そのため、それらの特異的なバリアントの伸長のみを可能にする。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、第１、第３、および第４のバリアントに対応する終結ヌクレオチドのみを含み、そのため、第１、第３、および第４のバリアントの伸長のみを可能にする。いくつかの実施形態において、伸長組成物が、第１のバリアントに対応する終結ヌクレオチドから本質的になる。いくつかの実施形態において、方法が、伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップを含み、（ｉ）１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、（ｉｉ）第１のバリアント（たとえばそれほど豊富でないバリアント（たとえばそれほど豊富でないＳＮＰバリアント））にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成する。いくつかの実施形態において、第２のバリアントの伸長オリゴヌクレオチド種が、検出されない。
本明細書において使用される用語「信号対雑音比」は、検出プロセス（たとえば質量分析法）を使用する場合に雑音に対する信号の強度の比を定量化することによる、信号の品質についての定量的測定値を指す。いくつかの実施形態において、１つのスペクトル上の強いピークが、他のスペクトル上の、同じ分析物（たとえば伸長オリゴヌクレオチド種）によって生成される低強度のピークよりも、大きな信号対雑音比を有する。いくつかの実施形態において、雑音が、豊富なバリアント（たとえば野生型対立遺伝子、第２のバリアント、野生型バリアント）に由来する伸長オリゴヌクレオチド種によって生成される。いくつかの実施形態において、それほど豊富でないバリアント（たとえば第１のバリアント、第３のバリアント、第４のバリアント、変異体バリアント、変異体対立遺伝子、ＳＮＰ）に由来する伸長オリゴヌクレオチド種から生成される信号が、質量分析法を使用する場合に、より豊富な伸長オリゴヌクレオチド種（たとえば第２のバリアント、野生型バリアント、野生型対立遺伝子）によって生成される雑音によって不明瞭になる。本明細書における語句「信号対雑音比」にて使用される用語「信号」は、伸長オリゴヌクレオチド種の信号ピークの強度を指す。いくつかの実施形態において、本明細書における語句「信号対雑音比」にて一般に使用される用語「信号」が、それほど豊富でないバリアント（たとえば第１のバリアント、変異体バリアント、変異体対立遺伝子、ＳＮＰ）に由来する伸長オリゴヌクレオチド種の信号ピークの強度を指す。いくつかの実施形態において、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）の伸長を可能にする終結ヌクレオチドが、伸長組成物から排除され、それによって、第２のバリアントの伸長を妨げ、それほど豊富でないバリアント（たとえば第１のバリアント、変異体バリアント、変異体対立遺伝子、ＳＮＰ）についての信号対雑音比を増加させる。いくつかの実施形態において、方法が、伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップを含み、（ｉ）１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、（ｉｉ）第１のバリアント（たとえばそれほど豊富でないバリアント（たとえばそれほど豊富でないＳＮＰバリアント））にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成し、第１および第２のバリアントの両方が伸長する条件と比較して、信号対雑音比を増加させる。いくつかの実施形態において、（ｆ）における検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音比よりも大きな信号対雑音比によるものである。いくつかの実施形態において、（ｆ）における検出が、放出ステップ（ｅ）が、競合因子との競合を含む場合、競合因子との競合を含まない放出ステップと比較して、信号対雑音比における増加を含む。いくつかの実施形態において、変異体対立遺伝子のみの伸長についての信号対雑音比が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についての信号対雑音比よりも大きい。
本明細書において使用される用語「感度」は、検出プロセス（たとえば質量分析法）を使用する場合に、所定の信号対雑音比で検出することができる分析物の量を指す。いくつかの実施形態において、感度が、バックグラウンドまたは雑音レベルを減少させることによって改善することができる。いくつかの実施形態において、雑音が、豊富なバリアント（たとえば野生型対立遺伝子、第２のバリアント、野生型バリアント）に由来する伸長オリゴヌクレオチド種によって生成される。いくつかの実施形態において、より豊富な伸長オリゴヌクレオチド種（たとえば第２のバリアント、野生型バリアント、野生型対立遺伝子）に由来する伸長オリゴヌクレオチド種から生成される信号が低下するかまたは排除される場合、感度が増加する。いくつかの実施形態において、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）の伸長を可能にする終結ヌクレオチドが、伸長組成物から排除され、それによって、第２のバリアントの伸長を妨げ、それほど豊富でないバリアント（たとえば第１のバリアント、変異体バリアント、変異体対立遺伝子、ＳＮＰ）についての検出の感度を増加させる。いくつかの実施形態において、方法が、伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップを含み、（ｉ）１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、（ｉｉ）第１のバリアント（たとえばそれほど豊富でないバリアント（たとえばそれほど豊富でないＳＮＰバリアント））にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、第２のバリアント（たとえば野生型またはより豊富なバリアント）にハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成し、第１および第２のバリアントの両方が伸長する条件と比較して、第１のバリアントについての検出の感度を増加させる。いくつかの実施形態において、（ｆ）において変異体対立遺伝子を検出する感度が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についてよりも、変異体対立遺伝子のみの伸長について、大きい。
任意の適したタイプのヌクレオチドを、増幅産物または伸長産物の中に組み込むことができる。ヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、天然に存在するヌクレオチド、終結ヌクレオチド、または天然に存在しないヌクレオチド（たとえばヌクレオチドアナログもしくは誘導体）であってもよい。あるヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、検出可能な標識および／または結合ペアのメンバー（たとえば、結合ペアの他方のメンバーは固相に連結されてもよい）を含むことができる。
増幅プロセスによって産生されるアンプリコンを含有する溶液または伸長プロセスによって産生される伸長産物を含有する溶液は、さらなるプロセシングに供することができる。たとえば、溶液は、アンプリコンまたは伸長産物の中に組み込まれなかった、遊離ヌクレオチドからリン酸部分を除去する作用物質と接触させることができる。そのような作用物質の例は、ホスファターゼ（たとえばアルカリホスファターゼ）である。アンプリコンおよび伸長産物はまた、固相に結合させてもよく、洗浄されてもよく、末端のリン酸を除去する作用物質と接触させてもよく（たとえばホスファターゼへの曝露）、末端のヌクレオチドを除去する作用物質（たとえばエキソヌクレアーゼ）と接触させてもよく、切断する作用物質（たとえばエンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ）と接触させてもよく、などであってもよい。
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、共有結合によって連結された２つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを指す。オリゴヌクレオチドは、任意の便利な長さをしており、いくつかの実施形態において、約５〜約２００ヌクレオチド長、約５〜約１５０ヌクレオチド長、約５〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約７５ヌクレオチド長、または約５〜約５０ヌクレオチド長であり、時に、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド、またはその組み合わせならびにその任意の化学的または酵素的修飾体（たとえばメチル化ＤＮＡ、修飾ヌクレオチドのＤＮＡ）を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドの長さは、アンプリコンまたは標的核酸の長さよりも時に短いが、増幅に使用されるプライマーまたはポリヌクレオチドよりも必ずしも短くない。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、アンプリコン、標的核酸、またはその相補体に対して相補的なまたは実質的に相補的なヌクレオチドサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはハイブリダイゼーション配列を含む（アライメントした場合に、アンプリコンまたは標的核酸相補体と、たとえば約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて同一）。オリゴヌクレオチドは、アンプリコン、標的核酸、またはその相補体に対して相補的でないかまたは実質的に相補的でないヌクレオチドサブ配列を含有してもよい（たとえば、アンプリコンに相補的なまたは実質的に相補的なプライマーにおけるヌクレオチドサブ配列の３’または５’末端に）。ある実施形態におけるオリゴヌクレオチドは、検出可能な分子（たとえばタグ、蛍光団、放射性同位体、比色分析剤（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ａｇｅｎｔ）、粒子、酵素など）ならびに／またはある実施形態において、結合ペアのメンバー（たとえばビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン）を含有してもよい。
本明細書において使用される用語「溶液中の」は、たとえば、１つ以上の核酸を含有する液体などのような液体を指す。溶液中の核酸および他の成分は、全体にわたって分散していてもよく、溶液は、多くの場合、水（たとえば水溶液）を含む。溶液は、任意の便利な数のオリゴヌクレオチド種を含有してもよく、多くの場合、検出されることとなるアンプリコン種または標的核酸種と少なくとも同数のオリゴヌクレオチド種がある。
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション配列」は、アンプリコン、標的核酸、またはその相補体に特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列を指す。ハイブリダイゼーション配列は、本明細書において記載されるように、容易に設計され、選択され、溶液中でアンプリコン、標的配列、またはその相補体にハイブリダイズするのに適した長さとすることができる。いくつかの実施形態において、それぞれのオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイゼーション配列が、約５〜約２００ヌクレオチド長（たとえば約５〜１０、約１０〜１５、約１５〜２０、約２０〜２５、約２５〜３０、約３０〜３５、約３５〜４０、約４０〜４５、または約４５〜５０、約５０〜７０、約８０〜９０、約９０〜１１０、約１００〜１２０、約１１０〜１３０、約１２０〜１４０、約１３０〜１５０、約１４０〜１６０、約１５０〜１７０、約１６０〜１８０、約１７０〜１９０、約１８０〜２００ヌクレオチド長）である。
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション条件」は、相補的なヌクレオチド配列を有する２つの核酸が互いに相互作用することができる条件を指す。ハイブリダイゼーション条件は、高度なストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または低度のストリンジェンシーとすることができ、ストリンジェンシーのこれらの様々な程度についての条件が、公知である。増幅および／または伸長を可能にするハイブリダイゼーション条件は、多くの場合、関心のある適用に依存して選択される。
本明細書において使用される用語「１つのアンプリコンまたは標的核酸に特異的にハイブリダイズする」は、溶液中で、１つのアンプリコン種または標的核酸種に実質的にハイブリダイズし、他のアンプリコン種または標的核酸種に実質的にハイブリダイズしないことを指す。特異的なハイブリダイゼーションは、ミスマッチを除外し、そのため、たとえば、オリゴヌクレオチドが、ある対立遺伝子に、そしてその対立遺伝子にのみ特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。対立遺伝子に相同的に（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）一致するかまたは相補的なオリゴヌクレオチドは、その対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするだろう。それに対して、１つ以上の塩基ミスマッチがある場合、ハイブリダイゼーションは起こらなくてもよい。
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション位置」は、他の核酸がハイブリダイズするアンプリコンまたは標的核酸上の特異的な位置を指す。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの末端が、他のアンプリコン種または標的核酸種とは異なる配列を有する、アンプリコン種または標的核酸種上の部位に隣接しているかまたは実質的に隣接している。部位およびオリゴヌクレオチド末端の間にヌクレオチドがない場合、オリゴヌクレオチドの末端は、その部位に「隣接している」。ある実施形態において、部位およびオリゴヌクレオチド末端の間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドがある場合、オリゴヌクレオチドの末端は、その部位に「実質的に隣接している」。
捕捉剤および固相
１つ以上の捕捉剤が、本明細書において記載される方法に利用され得る。たとえば、限定を伴うことなく、結合ペアのメンバーを含めて、本明細書において記載されるプロセスに利用可能ないくつかの様々なタイプの捕捉剤がある。結合ペアの例は、限定を伴うことなく、（ａ）非共有結合ペア（たとえば抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡまたはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、受容体／リガンドまたはその結合部分、およびビタミンＢ１２／内因子）；ならびに（ｂ）共有結合ペア（たとえばスルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／イソチオシアネート（ｉｓｏｔｒｉｏｃｙａｎａｔｅ）、アミン／スクシンイミジルエステル、およびアミン／スルホニルハロゲン化物）などを含む。いくつかの実施形態において、結合ペアの一方のメンバーが、伸長オリゴヌクレオチドまたは増幅産物と関連し、他のメンバーが、固相と関連する。本明細書において使用される用語「と関連する」は、少なくとも２つの単位の間の相互作用を指し、たとえば、２つの単位は、互いに結合しているかまたは連結している。
本明細書において使用される用語「競合因子」は、固相との相互作用（たとえば結合）について、捕捉剤と競合する任意の分子を指す。競合因子の非限定的な例は、遊離捕捉剤（たとえば結合ペアの一方のもしくは他方のメンバー、遊離ビオチン、遊離アビジン／ストレプトアビジン）、捕捉剤の競合断片（たとえばビオチンもしくはアビジン／ストレプトアビジンの競合断片）、捕捉剤の競合多量体（たとえばビオチン多量体）、他の競合分子またはその断片もしくは多量体、固相への結合について特異的に競合する分子、高塩条件、上昇した温度条件、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤の多量体が、約２〜約５０の単量体を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤の多量体が、約２〜約１０の単量体を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤の多量体が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の単量体を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤の多量体を含む捕捉剤が、共有結合で互いに結合した単量体を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤の多量体を含む捕捉剤が、共有結合で互いに結合していない単量体を含む。本明細書において使用される用語「遊離捕捉剤」は、固相または伸長オリゴヌクレオチドと会合していない捕捉剤を指す。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤が、ビオチンまたはその競合部分もしくは断片とすることができる。ある実施形態において、遊離捕捉剤が、アビジン、ストレプトアビジン、またはその競合部分もしくは断片とすることができる。用語「競合部分または断片」は、通常のサイズ未満であるが、結合ペアの他方のメンバーとの相互作用に関して、インタクトな捕捉剤の機能性（たとえば、ほぼ同じ、固体支持体との捕捉剤相互作用活性）をなお保持する捕捉剤を指す（たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンになお結合することができるビオチンの断片または一部分、ビオチンになお結合することができるアビジンまたはストレプトアビジンの断片または一部分）。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤の断片（たとえばビオチンの断片）が、インタクトな捕捉剤の機能性をなお保持する任意のサイズをしている。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえばビオチンの断片）が、インタクトな捕捉剤の機能性のいくつかをなお保持する任意のサイズをしている。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえばビオチンの断片）が、インタクトな捕捉剤の機能性の約３０％〜約１００％を保持するサイズをしている。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえばビオチンの断片）が、インタクトな捕捉剤の機能性の約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を保持するサイズをしている。
いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）が、約０．１〜約５０００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）が、約０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、４００、８００、１０００、２０００、４０００、５０００ｕｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度で添加される。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）が、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）が、約１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）が、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で伸長オリゴヌクレオチド種を含む組成物に添加される。
本明細書において使用される用語「固体支持体」または「固相」は、核酸が関連することができる不溶性物質を指す。本明細書において記載されるプロセスによる使用のための固体支持体の例は、限定を伴うことなく、アレイ、ビーズ（たとえば常磁性ビーズ、磁気ビーズ、マイクロビーズ、ナノビーズ）、および粒子（たとえば微粒子、ナノ粒子）を含む。たとえば、約１０ナノメートル〜約１００マイクロメートル；約１００ナノメートル〜約１００マイクロメートル；約１マイクロメートル〜約１００マイクロメートル；約１０マイクロメートル〜約５０マイクロメートル；約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ナノメートル；または約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００マイクロメートルの公称、中間、または平均の直径を有するものなどのような、約１ナノメートル〜約５００マイクロメートルの公称、平均、中間の直径を有する粒子またはビーズを利用することができる。本明細書において使用される用語「常磁性」は、外部的にかけられる磁場の存在下においてのみ一般に起こる磁性を指す。したがって、常磁性ビーズは、外部的にかけられる磁気供給源に誘引され得るが、典型的に、外部的にかけられる磁場の非存在下においてそれ自体の磁場を出さない。鉄芯材を含む磁気ビーズは、一般に、それら自体の磁場を出す。
固体支持体は、任意の不溶性または固形物質を事実上、含むことができ、多くの場合、水中で不溶性の固体支持体組成物が、選択される。たとえば、固体支持体は、シリカゲル、ガラス（たとえば多孔性（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ）ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、セルロース、金属表面（たとえば鋼、金、銀、アルミニウム、シリコン、および銅）、磁性材料、塑性材料（たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ））などを含むことができるかまたは本質的にそれからなり得る。ビーズまたは粒子は、膨潤性（たとえばＷａｎｇ樹脂などのような重合体ビーズ）または非膨潤性（たとえばＣＰＧ）であってもよい。ビーズの市販で入手可能な例は、限定を伴うことなく、Ｗａｎｇ樹脂、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ならびにＳｏｌｕＬｉｎｋを含む。固相（たとえばビーズ）は、結合ペアのメンバー（たとえばアビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体）を含むことができる。いくつかの実施形態において、固相が、実質的に親水性である。いくつかの実施形態において、固相（たとえばビーズ）が、実質的に疎水性である。いくつかの実施形態において、固相が、結合ペアのメンバー（たとえばアビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体）を含み、実質的に疎水性であるかまたは実質的に親水性である。いくつかの実施形態において、固相が、結合ペアのメンバー（たとえばアビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体）を含み、固体支持体１ｍｇ当たり約１３５０ｐｍｏｌｅの遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）を超える結合能力を有する。いくつかの実施形態において、結合ペアのメンバーを含む固相の結合能力が、固体支持体１ｍｇ当たり８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１８００、２０００ｐｍｏｌｅの遊離捕捉剤を超える。
固体支持体は、固体支持体の集合体で提供されてもよい。固体支持体集合体は、２つ以上の様々な固体支持体種を含む。本明細書において使用される用語「固体支持体種」は、１つの特定の固相核酸種または様々な固相核酸種の特定の組み合わせと関連する固体支持体を指す。ある実施形態において、固体支持体集合体が、２〜１０，０００の固体支持体種、１０〜１，０００の固体支持体種、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００の特有の固体支持体種を含む。固体支持体の集合体における固体支持体（たとえばビーズ）は、均一（たとえば、すべてが、Ｗａｎｇ樹脂ビーズである）または不均一（たとえば、いくつかはＷａｎｇ樹脂ビーズであり、いくつかは磁気ビーズである）であってもよい。固体支持体の集合体におけるそれぞれの固体支持体種は、特異的な同定タグにより時に標識される。特定の固体支持体種についての同定タグは、時に、ある実施形態において、特有の配列を有する核酸（たとえば「固相核酸」）である。同定タグは、検出可能であり、かつ他の固体支持体種上の同定タグと識別が可能な任意の分子とすることができる。
固相核酸は、多くの場合、一本鎖であり、核酸にハイブリダイズするのに適した任意のタイプのものである（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、そのアナログ（たとえばペプチド核酸（ＰＮＡ））、そのキメラ（たとえば、一本鎖がＲＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基を含む）など）。固相核酸は、当業者によって公知の任意の様式において固体支持体と関連させられ、核酸への固相核酸のハイブリダイゼーションに適している。固相核酸は、共有結合または非共有結合相互作用によって固体支持体と関連してもよい。非共有結合相互作用の非限定的な例は、疎水性相互作用（たとえば、Ｃ１８コーティング固体支持体およびトリチル化（ｔｒｉｔｙｌａｔｅｄ）核酸）、極性相互作用などを含む。固相核酸は、当業者に公知の様々な方法論によって固体支持体と関連させてもよく、これらは、限定を伴うことなく、（ｉ）固体支持体上に直接、核酸を順次、合成することおよび（ｉｉ）核酸を合成し、溶相中に核酸を提供し、核酸を固体支持体に連結することを含む。固相核酸は、たとえば、（ｉ）糖部分の１’、２’、３’、４’、もしくは５’位でまたは（ｉｉ）核酸の末端もしくは非末端ヌクレオチドのピリミジンもしくはプリン塩基部分などのように、核酸における様々な部位で固体支持体に共有結合されてもよい。固相核酸の５’末端ヌクレオチドは、ある実施形態において、固体支持体に連結される。
伸長オリゴヌクレオチドを固相と関連させた後（すなわち捕捉後）、非伸長オリゴヌクレオチドおよび／または結合しない不要な反応成分は、多くの場合、洗い流されるかまたは分解される。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後に、固相が、洗浄される。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後、伸長オリゴヌクレオチド種を放出する前に、固相が、洗浄される。いくつかの実施形態において、固相の洗浄により塩を除去する。いくつかの実施形態において、固相の洗浄により、質量分析法において妨害付加生成物を産生する塩を除去する。いくつかの実施形態において、固相の洗浄により、質量分析法に干渉する塩を除去する。いくつかの実施形態において、固相を洗浄した後に、伸長オリゴヌクレオチド種を陰イオン交換樹脂と接触させる。いくつかの実施形態において、固相を洗浄した後に、伸長オリゴヌクレオチド種を陰イオン交換樹脂と接触させない。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド種が、固相上に捕捉され、１回以上洗浄され、固相から放出され、陰イオン交換樹脂と接触させない。伸長オリゴヌクレオチドは、検出前に１つ以上の手順によって処理されてもよい。たとえば、伸長オリゴヌクレオチドは、検出前に調整されてもよい（たとえば、イオン交換によって、捕捉された核酸と関連するカチオンおよび／またはアニオンのタイプをホモジナイズする）。伸長オリゴヌクレオチドは、ある実施形態において、検出前に固相から放出させてもよい。
いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチド（たとえば伸長オリゴヌクレオチド種）が結合ペアの一方のメンバー（たとえばビオチンまたはアビジン／ストレプトアビジン）を含む捕捉剤と関連する。ある実施形態において、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドが、結合ペアの他方のメンバー（たとえばアビジン／ストレプトアビジンまたはビオチン）を含む固相と結合ペアメンバーを接触させることによって捕捉される。ある実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、ビオチン化され、伸長オリゴヌクレオチド産物を有するビオチン部分が、アビジンまたはストレプトアビジンコーティング固相とビオチン部分を接触させることによって捕捉される。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、質量による識別が可能なタグを含み、ある実施形態において、質量による識別が可能なタグの検出が、伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在を検出することを含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、１、２、または３ヌクレオチド以上、伸長する。いくつかの実施形態において、固相に結合した伸長オリゴヌクレオチドが、競合因子との競合によって固相から放出され、伸長オリゴヌクレオチドが、検出される。いくつかの実施形態において、固相に結合した伸長オリゴヌクレオチドが、競合因子との競合によって固相から放出され、伸長オリゴヌクレオチド中またはそれと関連した、識別が可能な標識が、検出される。いくつかの実施形態において、固相に結合した伸長オリゴヌクレオチドが、競合因子との競合によって固相から放出され、識別が可能な標識が、伸長オリゴヌクレオチドから放出され、放出された識別が可能な標識が、検出される。
識別が可能な標識および放出
本明細書において使用されるように、用語「識別が可能な標識」および「識別が可能なタグ」は、互いに識別することができ、タグが付加されている核酸を同定するために使用される標識またはタグのタイプを指す。様々なタイプの標識およびタグは、選択され、本明細書において提供されるマルチプレックス方法に使用されてもよい。たとえば、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、小有機分子、発光分子、光吸収分子、光散乱分子、発光性分子、同位体、酵素などは、識別が可能な標識またはタグとして使用されてもよい。ある実施形態において、様々な長さ、様々な質量電荷比、様々な電気泳動度（たとえばキャピラリー電気泳動移動度）、および／または様々な質量のオリゴヌクレオチド、アミノ酸、および／または小分子有機分子もまた、識別が可能な標識またはタグとして使用することができる。したがって、蛍光団、放射性同位体、比色分析剤、発光剤、化学発光剤、光散乱剤などが、標識として使用されてもよい。標識の選択は、必要とされる感度、核酸とのコンジュゲーションの容易さ、安定性についての要件、および利用可能な機器に依存し得る。識別が可能な標識およびタグに関して本明細書において使用される用語「識別が可能な特徴」は、他の標識またはタグから識別することができる、一方の標識またはタグの任意の特徴（たとえば、質量および本明細書において記載される他のもの）を指す。いくつかの実施形態において、識別が可能な標識およびタグの標識組成が、質量分析器において最適な飛行活動をもたらし、標識およびタグが高度なマルチプレックス化レベルで識別されるのを可能にするように、選択および／または設計することができる。
本明細書において使用される方法については、特定の標的核酸種、アンプリコン種、および／または伸長オリゴヌクレオチド種は、多くの場合、識別が可能で、検出可能な標識種とペアになり、その結果、特定の標識またはタグ種の検出により、特定の組成物における特定の標的核酸種、アンプリコン種、および／または伸長オリゴヌクレオチド種の存在を直接、同定する。したがって、特定の識別が可能な特徴が、特定の標的核酸に対応するので、標識種のある識別が可能な特徴を使用して、たとえば、組成物における、１つの標的核酸種を同定することができる。標識およびタグは、任意の公知の方法によってかつ任意の位置で（たとえばオリゴヌクレオチドの５’に）、核酸（たとえばオリゴヌクレオチド）に対して付加されてもよい。したがって、本明細書において使用される、それぞれの特定の標的核酸種に「特異的に対応する」というそれぞれの特定の標識種への言及は、１つの標的種とペアになる１つの標識種を指す。標識種の存在が検出された場合、ある実施形態において、その標識種と関連する標的核酸種の存在が、それによって検出される。
識別が可能なタグまたは標識（総合的に「標識」）に関して本明細書において使用される用語「種」は、他の標識から検出可能な程度に識別が可能な１つの標識を指す。ある実施形態において、標識種の数が、約２〜約１００００の標識種、約２〜約５００，０００の標識種、約２〜約１００，０００、約２〜約５００００、約２〜約１００００、および約２〜約５００の標識種または時に、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、もしくは５０００００標識種を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「質量による識別が可能な標識」は、特徴として質量によって識別される標識を指す。たとえばコンポマー、アミノ酸、および／またはコンカテマーなどのような、様々な質量による識別が可能な標識を、選択し、使用することができる。様々な長さおよび／または組成のヌクレオチドストリング（ｓｔｒｉｎｇ）（たとえば核酸；コンポマー）、アミノ酸ストリング（たとえばペプチド；ポリペプチド；コンポマー）、および／またはコンカテマーを、質量によって識別し、標識として使用することができる。任意の数の単位を、質量による識別が可能な標識において利用することができ、そのような単位の上限および下限値は、そのような標識を検出し、識別するために使用されるシステムの質量ウィンドウおよび分解能に部分的に依存する。したがって、質量による識別が可能な標識の長さおよび組成は、標識を検出し、識別するために使用される検出装置の質量ウィンドウおよび分解能に部分的に基づいて選択することができる。
本明細書において使用される用語「コンポマー」は、単量体単位の特定の配列ではなく単量体単位のセットの組成物を指す。核酸については、用語「コンポマー」は、塩基である単量体単位を有する核酸の塩基組成物を指す。それぞれのタイプの塩基の数は、Ｂｎによって示すことができる（すなわち：ＡａＣｃＧｇＴｔ、Ａ０Ｃ０Ｇ０Ｔ０は、「空の」コンポマーまたは塩基を含有しないコンポマーを示す）。天然コンポマーは、すべての成分単量体単位（たとえば、核酸については塩基およびポリペプチドについてはアミノ酸）が０以上であるコンポマーである。ある実施形態において、ａ、ｃ、ｇ、またはｔの少なくとも１つが、１以上である（たとえばＡ０Ｃ０Ｇ１Ｔ０、Ａ１Ｃ０Ｇ１Ｔ０、Ａ２Ｃ１Ｇ１Ｔ２、Ａ３Ｃ２Ｇ１Ｔ５）。本明細書において提供される方法において、配列バリエーションを決定するために配列を比較する目的のために、負の数の単量体単位を含有する「非天然」コンポマーが、データをプロセシングするために利用されるアルゴリズムによって生成することができる。ポリペプチドについては、コンポマーは、ポリペプチド断片のアミノ酸組成物を指し、それぞれのタイプのアミノ酸の数は、同様に示される。コンポマー種は、複数の配列に対応することができる。たとえば、コンポマーＡ２Ｇ３は、配列ＡＧＧＡＧ、ＧＧＧＡＡ、ＡＡＧＧＧ、ＧＧＡＧＡ、および他に対応する。一般に、配列に対応する特有のコンポマーがあるが、１つを超える配列が、同じコンポマーに対応し得る。ある実施形態において、１つのコンポマー種が、１つの標的核酸種、アンプリコン種、および／またはオリゴヌクレオチド種とペアになる（たとえばそれに対応する）。様々なコンポマー種は、本明細書における実施形態において、様々な塩基組成および識別が可能な質量を有する（たとえば、Ａ０Ｃ０Ｇ５Ｔ０およびＡ０Ｃ５Ｇ０Ｔ０は、異なる、かつ質量による識別が可能なコンポマー種である）。いくつかの実施形態において、コンポマー種のセットが、塩基組成において異なり、同じ長さを有する。ある実施形態において、コンポマー種のセットが、塩基組成および長さにおいて異なる。
質量による識別が可能な標識として使用されるヌクレオチドコンポマーは、すべてのコンポマー種が、検出可能な程度に識別することができる任意の長さとすることができ、たとえば約１〜１５、５〜２０、１〜３０、５〜３５、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３５、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、もしくは２５〜５０または時に、約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、８５、もしくは１００ヌクレオチド長とすることができる。質量による識別が可能な標識として使用されるペプチドまたはポリペプチドコンポマーは、すべてのコンポマー種が、検出可能な程度に識別することができる任意の長さとすることができ、たとえば、約１〜２０、１０〜３０、２０〜４０、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、もしくは８０〜１００アミノ酸長とすることができる。上記に述べられるように、コンポマーにおける単位の数の限界は、多くの場合、コンポマー種を識別するために使用される検出方法の質量ウィンドウおよび分解能によって制限される。
用語「コンカテマー」および「コンカテマー」は、本明細書において同義的に使用され（総合的に「コンカテマー」）、互いに連結された（たとえば、多くの場合、直列に連結された；時に、ある実施形態において分岐した）２つ以上の単位を含有する分子を指す。コンカテマーは、時に、いくつかの実施形態において、核酸および／または人工ポリマーである。コンカテマーは、いくつかの実施形態において、同じタイプの単位を含むことができ（たとえばホモコンカテマー）、時に、コンカテマーは、様々なタイプの単位を含有することができる（たとえばヘテロコンカテマー）。コンカテマーは、ヌクレオチド単位、アミノ酸単位、小有機分子単位（たとえばトリチル）、特定のヌクレオチド配列単位、特定のアミノ酸配列単位などを含む任意のタイプの単位（複数可）を含有することができる。３つの特定の配列単位ＡＢＣのホモコンカテマーは、一実施形態において、ＡＢＣＡＢＣＡＢＣである。他の種から検出可能な程度にそれぞれのコンカテマー種を識別することができる限り、コンカテマーは、任意の数の単位を含有することができる。たとえば、トリチルコンカテマー種は、いくつかの実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００トリチル単位を含有することができる。
識別が可能な標識は、ある実施形態において、核酸産物（たとえば伸長オリゴヌクレオチド）から放出させることができる。識別が可能な標識および核酸の間の連結は、転写し、かつ切断することができ、切断し、かつ放出された標識（複数可）の検出を可能にする、任意のタイプのものとすることができる（たとえば、Ｅｈｒｉｃｈらの「Ｔａｒｇｅｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ」と題する米国特許出願公開第２００５０２８７５３３Ａ１号明細書）。そのような連結および連結を切断するための方法（「切断条件」）が、公知である。ある実施形態において、標識が、それが付加されている分子の他の部分から分離することができる。いくつかの実施形態において、標識（たとえばコンポマー）が、ヌクレオチドのより大きなストリング（たとえば伸長オリゴヌクレオチド）から切断される。連結の非限定的な例は、ヌクレアーゼ（たとえばリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ）によって切断することができる連結；化学物質によって切断することができる連結；物理的処理によって切断することができる連結；および光によって切断することができる光開裂性（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカー（たとえばｏ−ニトロベンジル、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、２−ニトロベンジル基）を含む。光開裂性リンカーは、光を放射する検出系を使用する場合、切断および検出が組み合わせられ、一つのステップで行われるので、利点を提供する（たとえば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析法は、光のレーザー放射を伴う）。
ある実施形態において、標識が、より大きな単位の一部とすることができ、検出前にその単位から分離させることができる。たとえば、ある実施形態において、標識が、より大きなヌクレオチド配列中の、隣接ヌクレオチドのセットであり、該標識が、より大きなヌクレオチド配列から切断される。そのような実施形態において、標識が、多くの場合、それが存在するヌクレオチド配列または核酸の一方の末端に位置する。いくつかの実施形態において、標識またはその前駆体が、標識をコードする前駆体配列と適切に作用するように連結されたプロモーター配列を含む転写カセット中に存在する。後者の実施形態において、プロモーターが、時に、標識を含むかまたはそれからなるＲＮＡを生成する、ＲＮＡポリメラーゼ動員プロモーターである。標識を含むＲＮＡは、検出前に、切断されて標識を放出することができる（たとえばＲＮアーゼにより）。
ある実施形態において、識別が可能な標識またはタグが、伸長オリゴヌクレオチドから切断されず、いくつかの実施形態において、識別が可能な標識またはタグが、捕捉剤を含む。ある実施形態において、識別が可能な特徴の検出が、伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在を検出することを含み、いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、捕捉剤を含む。いくつかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドが、競合因子との競合によって固相から放出され、ある実施形態において、競合因子との競合が、競合因子と固相を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、固相からの伸長オリゴヌクレオチドを放出させることが、上昇した温度条件下で実行される。ある実施形態において、上昇した温度条件が、摂氏約８０度〜摂氏約１００度である。いくつかの実施形態において、捕捉剤から伸長オリゴヌクレオチドを放出させることが、約１分間〜約１０分間、上昇した温度条件下で行われる。ある実施形態において、固相から伸長オリゴヌクレオチドを放出させることが、摂氏約９０度での約５分間の競合因子（たとえば遊離捕捉剤、遊離捕捉剤の競合断片、遊離捕捉剤の多量体、固相への結合について特異的に競合する分子、その他、およびその組み合わせ）による処理を含む。いくつかの実施形態において、競合因子が、ビオチンであり、固相が、アビジン／ストレプトアビジンを含み、ある実施形態において、競合因子が、アビジン／ストレプトアビジンであり、固相が、ビオチンを含む。
ある実施形態において、マルチプレックスアッセイが、伸長後に、伸長したいくつかのオリゴヌクレオチドおよび伸長していないいくつかのオリゴヌクレオチドを含む。そのような実施形態において、伸長していないオリゴヌクレオチドが、多くの場合、固相に結合せず、いくつかの実施形態において、伸長していないオリゴヌクレオチドが、固相と相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、競合因子対ヌクレオチドまたは核酸に付加された捕捉剤の比が（たとえば、組み込まれた捕捉剤（たとえばビオチン）を有する伸長オリゴヌクレオチド）、１：１とすることができる。ある実施形態において、競合因子が、オリゴヌクレオチドと会合した捕捉剤に対して過剰量で使用されてもよく、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドと会合した捕捉剤が、競合因子に対して過剰量であってもよい。そのような実施形態において、過剰量が、時に、約５倍の過剰量〜約５０，０００倍の過剰量である（たとえば約１０倍の過剰量、約１００倍の過剰量、約１，０００倍の過剰量、または約１０，０００倍の過剰量）。
マルチプレックス化の検出および程度
本明細書において使用される標識の「検出」という用語は、標識種の同定を指す。任意の適した検出デバイスが、サンプルにおいて標識種を識別するために使用することができる。質量による識別が可能な標識を検出するのに適した検出デバイスは、限定を伴うことなく、ある種の質量分析器およびゲル電気泳動デバイスを含む。質量分析法の構成の例は、限定を伴うことなく、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ直交ＴＯＦ ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ＴＯＦ ＭＳ）（ＯＴＯＦ ＭＳ；２次元）、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）ＭＳ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）ＭＳ、およびフーリエ変換ＭＳを含む。本明細書において記載される方法は、分析物が、揮発し、イオン化される質量分析法の構成に容易に適用可能である（「イオン化ＭＳ」、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＬＤＭＳ、ＥＳＭＳ、直線ＴＯＦ（ｌｉｎｅａｒ ＴＯＦ）、ＯＴＯＦ）。直交イオン抽出ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および軸方向ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ａｘｉａｌ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、比較的高解像度、それによって比較的高度なレベルのマルチプレックス化をもたらすことができる。発光、光吸収、および／または光散乱標識を検出するのに適した検出デバイスは、限定を伴うことなく、ある光検出装置および光検出器（たとえば蛍光、化学発光、吸収、および／または光散乱標識についての）を含む。
本明細書において提供される方法は、複数の標的核酸における標的核酸種のハイスループット検出または発見を可能にする。マルチプレックス化とは、１つを超える標的核酸種の同時の検出を指す。質量分析法と共にマルチプレックス反応を実行する一般的な方法が、公知である（たとえば、米国特許第６，０４３，０３１号明細書、米国特許第５，５４７，８３５号明細書、および国際公開第９７／３７０４１号パンフレットを参照されたい）。マルチプレックス化は、それぞれ個々の標的核酸種について別々の質量分析法による分析を実行することを行うことと比較して、複数の標的核酸種（たとえば、様々な配列バリエーションを有するいくつかのもの）を、わずか一つの質量スペクトルで同定することができるという利点を提供する。本明細書において提供される方法は、いくつかの実施形態において、高速かつ高正確性で配列バリエーションを分析するための高度にハイスループットで、高度に自動化されたプロセスに適している。いくつかの実施形態において、本明細書における方法が、一つの反応において高レベルでマルチプレックス化されてもよい。マルチプレックス化は、多型遺伝子座での遺伝子型が知られていない、またいくつかの実施形態において、遺伝子座での遺伝子型が公知の場合に、適用可能である。
ある実施形態において、マルチプレックス化した標的核酸種の数は、限定を伴うことなく、約２〜１，０００種、および時に、約１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１１、１１〜１３、１３〜１５、１５〜１７、１７〜１９、１９〜２１、２１〜２３、２３〜２５、２５〜２７、２７〜２９、２９〜３１、３１〜３３、３３〜３５、３５〜３７、３７〜３９、３９〜４１、４１〜４３、４３〜４５、４５〜４７、４７〜４９、４９〜５１、５１〜５３、５３〜５５、５５〜５７、５７〜５９、５９〜６１、６１〜６３、６３〜６５、６５〜６７、６７〜６９、６９〜７１、７１〜７３、７３〜７５、７５〜７７、７７〜７９、７９〜８１、８１〜８３、８３〜８５、８５〜８７、８７〜８９、８９〜９１、９１〜９３、９３〜９５、９５〜９７、９７〜１０１、１０１〜１０３、１０３〜１０５、１０５〜１０７、１０７〜１０９、１０９〜１１１、１１１〜１１３、１１３〜１１５、１１５〜１１７、１１７〜１１９、１２１〜１２３、１２３〜１２５、１２５〜１２７、１２７〜１２９、１２９〜１３１、１３１〜１３３、１３３〜１３５、１３５〜１３７、１３７〜１３９、１３９〜１４１、１４１〜１４３、１４３〜１４５、１４５〜１４７、１４７〜１４９、１４９〜１５１、１５１〜１５３、１５３〜１５５、１５５〜１５７、１５７〜１５９、１５９〜１６１、１６１〜１６３、１６３〜１６５、１６５〜１６７、１６７〜１６９、１６９〜１７１、１７１〜１７３、１７３〜１７５、１７５〜１７７、１７７〜１７９、１７９〜１８１、１８１〜１８３、１８３〜１８５、１８５〜１８７、１８７〜１８９、１８９〜１９１、１９１〜１９３、１９３〜１９５、１９５〜１９７、１９７〜１９９、１９９〜２０１、２０１〜２０３、２０３〜２０５、２０５〜２０７、２０７〜２０９、２０９〜２１１、２１１〜２１３、２１３〜２１５、２１５〜２１７、２１７〜２１９、２１９〜２２１、２２１〜２２３、２２３〜２２５、２２５〜２２７、２２７〜２２９、２２９〜２３１、２３１〜２３３、２３３〜２３５、２３５〜２３７、２３７〜２３９、２３９〜２４１、２４１〜２４３、２４３〜２４５、２４５〜２４７、２４７〜２４９、２４９〜２５１、２５１〜２５３、２５３〜２５５、２５５〜２５７、２５７〜２５９、２５９〜２６１、２６１〜２６３、２６３〜２６５、２６５〜２６７、２６７〜２６９、２６９〜２７１、２７１〜２７３、２７３〜２７５、２７５〜２７７、２７７〜２７９、２７９〜２８１、２８１〜２８３、２８３〜２８５、２８５〜２８７、２８７〜２８９、２８９〜２９１、２９１〜２９３、２９３〜２９５、２９５〜２９７、２９７〜２９９、２９９〜３０１、３０１〜３０３、３０３〜３０５、３０５〜３０７、３０７〜３０９、３０９〜３１１、３１１〜３１３、３１３〜３１５、３１５〜３１７、３１７〜３１９、３１９〜３２１、３２１〜３２３、３２３〜３２５、３２５〜３２７、３２７〜３２９、３２９〜３３１、３３１〜３３３、３３３〜３３５、３３５〜３３７、３３７〜３３９、３３９〜３４１、３４１〜３４３、３４３〜３４５、３４５〜３４７、３４７〜３４９、３４９〜３５１、３５１〜３５３、３５３〜３５５、３５５〜３５７、３５７〜３５９、３５９〜３６１、３６１〜３６３、３６３〜３６５、３６５〜３６７、３６７〜３６９、３６９〜３７１、３７１〜３７３、３７３〜３７５、３７５〜３７７、３７７〜３７９、３７９〜３８１、３８１〜３８３、３８３〜３８５、３８５〜３８７、３８７〜３８９、３８９〜３９１、３９１〜３９３、３９３〜３９５、３９５〜３９７、３９７〜４０１、４０１〜４０３、４０３〜４０５、４０５〜４０７、４０７〜４０９、４０９〜４１１、４１１〜４１３、４１３〜４１５、４１５〜４１７、４１７〜４１９、４１９〜４２１、４２１〜４２３、４２３〜４２５、４２５〜４２７、４２７〜４２９、４２９〜４３１、４３１〜４３３、４３３〜４３５、４３５〜４３７、４３７〜４３９、４３９〜４４１、４４１〜４４３、４４３〜４４５、４４５〜４４７、４４７〜４４９、４４９〜４５１、４５１〜４５３、４５３〜４５５、４５５〜４５７、４５７〜４５９、４５９〜４６１、４６１〜４６３、４６３〜４６５、４６５〜４６７、４６７〜４６９、４６９〜４７１、４７１〜４７３、４７３〜４７５、４７５〜４７７、４７７〜４７９、４７９〜４８１、４８１〜４８３、４８３〜４８５、４８５〜４８７、４８７〜４８９、４８９〜４９１、４９１〜４９３、４９３〜４９５、４９５〜４９７、４９７〜５０１種、またはそれ以上を含む。
マルチプレックスアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｓｓａｙ）による質量スペクトルの分解を実現するための設計法は、プライマーおよびオリゴヌクレオチド設計法ならびに反応設計法を含むことができる。マルチプレックスアッセイにおけるプライマーおよびオリゴヌクレオチド設計については、プライマー設計のための同様の一般的なガイドラインが、間違ったプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）およびプライマー二量体を回避するなどのように、ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘｅｄ）反応に適合しており、多くのプライマーのみがマルチプレックス反応に含まれる。さらに、１つのアッセイについての質量スペクトルにおける分析物ピークは、休止ピーク（ｐａｕｓｉｎｇ ｐｅａｋ）およびあらゆる他の副産物ピークを含めて、そのアッセイがマルチプレックス化されるあらゆるアッセイの産物から十分に分解される。また、分析物ピークは、最適には、ユーザによって指定される質量ウィンドウ内、たとえば５，０００〜８，５００Ｄａ内にある。伸長オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、所定のＳＮＰ鎖の標的配列に関して設計することができる。そのような実施形態において、長さが、多くの場合、たとえば、ユーザによって指定することができる限界の間にあり（たとえば１７〜２４塩基または１７〜２６塩基）、多くの場合、標的配列において不確かな塩基を含有しない。ハイブリダイゼーションの強度は、時に、配列依存性の融解（またはハイブリダイゼーション／解離）温度、Ｔｍの計算によって測られる。特定のプライマー選択は、そのヘアピンの可能性、間違ったプライミングの可能性、プライマー二量体の可能性、複雑性が低度の領域、およびＧＧＧＧなどのような問題になるサブ配列のために、却下されてもよいかまたはプライマーの他の選択と比べてペナルティーを科されてもよい。伸長オリゴヌクレオチドを設計するための方法およびソフトウェア（たとえばこれらの基準に従って）が、公知であり、たとえばＳｐｅｃｔｒｏＤＥＳＩＧＮＥＲ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を含む。
本明細書において使用されるように、用語「コールレート（ｃａｌｌ ｒａｔｅ）」または「コーリングレート（ｃａｌｌｉｎｇ ｒａｔｅ）」は、得られるように試みられたコールの数に対する、得られたコール（たとえば、決定された遺伝子型）の数を指す。言いかえれば、１２プレックス（ｐｌｅｘ）反応について、１０の遺伝子型が、本明細書において提供される方法を行うことから最終的に決定される場合、１０のコールが、１０／１２のコールレートで得られる。様々な事象が、特定の試みられたアッセイの失敗につながり、１００％未満のコールレートにつながり得る。時々、ｄＮＴＰおよび終結のためのｄｄＮＴＰのミックスの場合には、不適切な伸長産物が、１つの非終結ヌクレオチド（すなわちｄＮＴＰ）の組み込みの後にポリメラーゼの休止によって生じ、たとえば、時期尚早に、伸長プライマーの終結がもたらされ得る。多型部位での、この間違って終結したおよび正確に終結したプライマー質量伸長反応の質量差は、時に、一貫して分解するには小さくなりすぎてしまい、不適切な終結ミックスが使用される場合、ミスコール（ｍｉｓｃａｌｌ）につながり得る。正確な終結および間違った終結（すなわち休止によって引き起こされたもの）の間の質量差は、正確な終結および塩付加生成物ならびに正確な終結および非特異的な組み込みの間と同様に、多くの場合、ミスコールの数を低下させるように最大限にされる。
マルチプレックスアッセイの正確性は、１つ以上のアッセイにおいて、得られた（たとえば、正確にもしくは的確に評価された）コールの数ならびに／または偽陽性および／もしくは偽陰性の事象の数を評価することによって決定され得る。正確性はまた、マルチプレックスアッセイにおいて評価された標的のそれぞれについて、対応するユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）アッセイの正確性と比較して評価され得る。ある実施形態において、１つ以上の方法を使用して、コールレートを決定し得る。たとえば、手動の方法は、コールを生成するために、自動化またはコンピュータ方法と共に利用されてもよく、いくつかの実施形態において、それぞれの方法についてのレートを合計して、全体的なコールレートを計算してもよい。ある実施態様において、２つ以上の標的核酸（たとえば５０以上の標的核酸）をマルチプレックス化する場合の正確性またはコールレートが、たとえば約９９％以上、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８７〜８８％、８５〜８６％、８３〜８４％、８１〜８２％、８０％、７８〜７９％、または７６〜７７％となり得る。いくつかの実施形態において、約２〜２００の標的種を含むマルチプレックスアッセイにおけるそれぞれの標的種についてのコールレートが、８０％以上である（たとえば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）。
ある実施形態において、エラーレートが、コールレートまたは正確性についてのレートに基づいて決定され得る。たとえば、エラーレートは、エラーで生成されたコールの数であってもよい。いくつかの実施形態において、たとえば、エラーレートが、１００％未満のコールレートまたは正確性についてのレートであってもよい。エラーレートはまた、「フェール（ｆａｉｌ）レート」と呼ばれ得る。偽陽性および／または偽陰性の同定によって、コールおよびエラーレートの両方を再調整することができる。ある実施形態において、より多くのアッセイの実行がまた、偽陽性および／または偽陰性を同定するのに役立ち、それによって、コールおよび／またはエラーレートを調整し得る。ある実施形態において、２つ以上の標的核酸（たとえば５０以上の標的核酸）をマルチプレックス化する場合のエラーレートが、たとえば、約１％以下、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％となり得る。
適用
以下は、本明細書において記載されるマルチプレックス技術の非限定的な適用の例である。
１． 配列バリエーション（たとえば遺伝的バリアント）の検出
疾患のゲノムの根拠およびそのマーカーを同定するための、改善された方法が、提供される。本明細書において提供される方法によって同定することができる配列バリエーション（たとえば遺伝的バリアント）候補は、多型である配列バリエーションを含有する配列を含む。多型は、天然に存在する体細胞配列バリエーションおよび変異体から生じる配列バリエーションを含む。多型は、局所的な領域における１つ以上のヌクレオチドが個体によって異なる配列マイクロバリアント、１ヌクレオチド〜何百万の塩基までサイズが異なり得る挿入および欠失、ならびに多くのリピートによって異なるマイクロサテライトまたはヌクレオチドリピートを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドリピートは、同じ配列が複数回繰り返される、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはより大きなリピートなどのような均一なリピート、および配列モチーフが繰り返されていることが分かるヘテロヌクレオチドリピートをも含む。所定の遺伝子座について、ヌクレオチドリピートの数は、個体に依存して異なり得る。
多型マーカーまたは部位は、多様性が生じる遺伝子座である。そのような部位は、一塩基対（ＳＮＰ）ほどの小さなものとなり得る。多型マーカーは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート数（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、および他の繰り返しパターン、単純配列リピート、ならびにＡｌｕなどのような挿入エレメントを含むが、これらに限定されない。多型形態はまた、遺伝子についての様々なメンデルの法則に従った対立遺伝子として現われる。多型は、タンパク質、タンパク質修飾、ＲＮＡ発現修飾、ＤＮＡおよびＲＮＡメチル化、遺伝子発現およびＤＮＡ複製を改変する調節因子、ならびにゲノム核酸または細胞小器官核酸における改変のあらゆる他の徴候における差によって観察することができる。
さらに、多数の遺伝子が、多型領域を有する。個体が多型領域のいくつかの対立遺伝子バリアントのうちのいずれか１つを有するので、個体は、遺伝子の多型領域の対立遺伝子バリアントのタイプに基づいて同定することができる。これは、たとえば法医学の目的のために使用することができる。他の状況において、個体が有する対立遺伝子バリアントのアイデンティティを知ることは重大である。たとえば、ある遺伝子、たとえば主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子における対立遺伝子差は、骨髄移植において、移植片拒絶または移植片対宿主疾患に関与する。したがって、遺伝子または遺伝的な病変の多型領域の対立遺伝子バリアントのアイデンティティを決定する迅速で、高感度で、正確な方法を開発することは非常に望ましい。本明細書において提供される方法またはキットは、対象の１つ以上の遺伝子または染色体における１つ以上の多型領域の１つ以上の対立遺伝子バリアントのアイデンティティを決定することによって、対象の遺伝子型を同定するために使用することができる。本明細書において提供される方法を使用して対象の遺伝子型を同定することは、法医学の目的またはアイデンティティについて試験する目的のために使用することができ、多型領域は、ミトコンドリア遺伝子中に存在し得るかまたはショートタンデムリピートであり得る。
一塩基多型（ＳＮＰ）は、一般に、２対立遺伝子系である。すなわち、個体が任意の特定のマーカーについて有し得る２つの対立遺伝子がある。これは、１０以上の対立遺伝子を有し得るマイクロサテライトマーカーと比較した場合に、ＳＮＰマーカー当たりの情報内容が比較的低度であることを意味する。ＳＮＰはまた、非常に集団特異的である傾向があり、１つの集団において多型であるマーカーは、他の集団においてあまり多型になり得ない。およそ１キロベース毎に発見されるＳＮＰ（Ｗａｎｇら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０７７−１０８２を参照されたい）は、非常に高密度の遺伝子地図を生成する可能性を提供し、これは、関心のある遺伝子または領域についてのハプロタイプ系を開発するのに非常に有用であろう。また、ＳＮＰの性質のために、それらは、実際、研究下の疾患表現型と関連する多型となり得る。ＳＮＰの低度の変異体率はまた、それらを、複雑な遺伝形質を研究するための優れたマーカーにもする。
ゲノム科学の焦点の多くは、様々な理由で重要であるＳＮＰの同定に基づいてきた。それらは、間接的な試験（ハプロタイプの関連性）および直接的な試験（機能的なバリアント）を可能にする。それらは、最も豊富で、安定した遺伝子マーカーである。通常疾患は、一般的な遺伝子変異によって最もよく説明され、ヒト集団における自然バリエーション異は、疾患、療法、および環境的相互作用を理解するのに役立つ。
体細胞変異体の高感度の検出は、関心が、腫瘍の開始および増殖についての遺伝的決定因子の同定にある癌研究コミュニティにとってとりわけ有益である。高感度アプローチから得られた情報はまた、変異体をプロファイリングするために使用して、患者の転帰を予測し、かつ適切な処理の選択肢を通知することもできる。いくつかの実施形態において、その対応物である野生型配列の５％以下を示す遺伝的バリアントを検出することができる高感度検出方法が、必要とされる。いくつかの実施形態において、野生型の１％以下を検出することができる検出方法が、実施される。いくつかの実施形態において、野生型の５％、４％、３％、２％、１％、０．８％、０．７５％、０．５％、０．１％、．０５％、または．０１％以下を検出することができる検出方法が、実施される。さらに、出生前診断内では、このタイプの方法は、父方に由来する変異体を子宮中で解明することができる。
いくつかの実施形態において、対立遺伝子分析が、関心のある１つ以上の体細胞変異体（たとえばＳＮＰ、疾患マーカーなど、およびその組み合わせ）を持つ核酸標的から伸長オリゴヌクレオチドを生成することによって実行することができる。体細胞変異体を持つ対立遺伝子に相当する、放出された伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在の検出は、いくつかの実施形態において、標的集団における特定の変異体の存在または非存在をスクリーニングするための迅速な方法として利用することができる。変異体対立遺伝子からの伸長オリゴヌクレオチドの生成を伴うある実施形態において、適切な変異体対立遺伝子が伸長オリゴヌクレオチド産物をもたらすので、伸長オリゴヌクレオチドを検出することができる。
２． 疾患マーカーの同定
疾患の予後を診断するかまたは決定するために使用することができる、疾患の遺伝子マーカーである配列バリエーションの迅速で正確な同定のための方法が、本明細書において提供される。遺伝子マーカーによって特徴付けられる疾患は、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、自己免疫性障害、および癌を含むが、これらに限定されない。遺伝性であるかまたはウイルスおよび毒素などのような環境ストレスに対する身体の応答から生じるかにかかわらず、すべての生物における疾患は、遺伝成分を有する。進行中のゲノム研究の最終の目的は、この情報を使用して、これらの疾患を同定し、処置し、かつ可能性として治癒するための新しい方法を開発することである。第１のステップは、疾患組織をスクリーニングし、個々のサンプルのレベルでゲノムの変化を同定することであった。これらの「疾患」マーカーの同定は、誤った遺伝子または配列バリアントを同定するためにゲノムマーカーにおける変化を検出するための能力に依存的である。ゲノムマーカー（一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、および他の非コードゲノム領域、タンデムリピート、イントロン、ならびにエクソンを含むすべての遺伝子の遺伝子座）は、ヒトを含むすべての生物の同定のために使用することができる。これらのマーカーは、集団を同定するだけではなく、疾患、薬物処置、環境要因に対する抵抗性、および他の因子に対するそれらの応答に従って集団の層別化をも可能にする方法を提供する。疾患マーカーは、時に、変異体であり、いくつかの実施形態において、たとえば、野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する体細胞変異体などのような比較的まれな対立遺伝子となり得る（たとえば、癌組織対正常組織、変異体ウイルスタイプ対通常のウイルスタイプ（たとえばＨＩＶ））。いくつかの実施形態において、まれな対立遺伝子または変異体が、野生型の５％、４％、３％、２％、１％、０．８％、０．７５％、０．５％、０．１％、．０５％、または．０１％未満に相当する。いくつかの実施形態において、まれな対立遺伝子または変異体が、野生型の１％未満に相当し得る。
３． 微生物同定
微生物およびウイルスの属、種、株、クローン、またはサブタイプを同定するためのプロセスまたは方法が、本明細書において提供される。微生物（複数可）およびウイルスは、細菌、真菌、原生動物、繊毛虫、およびウイルスを含むが、これらに限定されない様々な生物から選択される。微生物は、特定の属、種、株、サブタイプ、もしくは血清型または任意の他の分類に限定されない。微生物およびウイルスは、１つ以上の参照配列またはサンプルに対する、標的微生物配列における配列バリエーションを決定することによって同定することができる。参照配列（複数可）は、たとえば、同じかまたは異なる属、種、株、もしくは血清型または任意の他の分類由来の他の微生物から、または宿主原核生物もしくは真核生物または任意の混合集団から得ることができる。
病原体（たとえば細菌またはウイルス）の同定およびタイピングは、伝染病の臨床上の管理において重要である。微生物の正確なアイデンティティは、健康な状態から疾患状態を区別するために使用されるだけではなく、感染症の源およびその伝播ならびに抗生物質または他の抗菌療法が処置に最も適しているかかどうかおよびどの抗生物質または他の抗菌療法が処置に最も適しているかを決定するのに重要でもある。さらに、処置をモニターすることができる。病原体をタイピングする従来の方法は、成長の特徴、色、細胞またはコロニー形態、抗生物質感受性、染色、匂い、血清型別、生化学的タイピング、および微生物（たとえば細菌）を同定するための特異的な抗体との反応性を含む様々な表現型の特徴を使用している。これらの方法はすべて、疑われている病原体の培養を必要とし、これは、高い材料および労働費用、労働者が曝露する危険性、取り扱いミスによる偽陽性、および生細胞が少数であることによるかまたは多くの病原体の偏好性の培養要件による偽陰性を含む多くの深刻な欠点を持つ。さらに、培養方法は、診断を実現するために比較的長い時間を必要とし、そのような感染症の、可能性として生命を脅かす性質のために、抗菌療法は、多くの場合、結果を得ることができる前に、始められる。いくつかの生物は、培養中に維持することができず、極めて低い成長率を示す（たとえばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについては６〜８週間まで）。
多くの場合において、病原体は、わずかな量で存在しおよび／または常在細菌叢を構成する生物に非常に類似し、上記に引用される方法によって無害の株から識別不可能になり得る。これらの場合において、病原性の株の存在の決定は、本明細書において提供される分子タイピング方法によってもたらされる、より高い解像度を必要とし得る。
４． 感染症を示すウイルスまたは細菌核酸配列の存在の検出
本明細書において提供される方法を使用して、１つ以上の参照配列に対して、ウイルスまたは細菌核酸配列中に存在する配列バリエーションを同定することによって、感染症を示すウイルスまたは細菌核酸配列の存在を決定することができる。参照配列（複数可）は、感染生物、関連する非感染生物から得られる配列、または宿主生物由来の配列を含むが、これらに限定されない。
ウイルス、細菌、真菌、および他の感染生物は、宿主細胞中に含有される配列とは異なる、配列バリアントを含む別個の核酸配列を含有する。標的ＤＮＡ配列は、たとえば、細菌およびそれらのファージ、ウイルス、真菌、原生動物などを含む侵入微生物のゲノムなどのような外来遺伝子配列の一部とすることができる。本明細書において提供されるプロセスは、たとえば、適切な治療的介入を選ぶために、微生物の様々なバリアントまたは株を識別するのに特に適用可能である（たとえば、病原性、それほど病原性でない、抵抗性対非抵抗性など）。ヒトおよび動物に感染し、開示されるプロセスによって検出することができる、疾患を引き起こすウイルスの例は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、またはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる；Ｒａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：２２７−２８４（１９８５）；Ｗａｉｎ Ｈｏｂｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，４０：９−１７（１９８５）、ＨＩＶ−２（Ｇｕｙａｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：６６２−６６９（１９８７）；欧州特許出願公開第０ ２６９ ５２０号明細書；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：５４３−５４７（１９８７）；欧州特許出願第０ ６５５ ５０１号明細書）、およびＨＩＶ−ＬＰなどのような他の分離株（国際公開第９４／００５６２号パンフレット）などのようなヒト免疫不全ウイルス）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（Ｇｕｓｔら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０：１−７（１９８３））；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｄａｅ（たとえば胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（たとえばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえばコロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえばエボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえばインフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえばハンタウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえばレオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）およびＨＳＶ−２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウィルス、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類ウイルス（たとえば海綿状脳症の原因菌、デルタ型肝炎の病原微生物（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全なサテライトであると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原微生物（クラス１＝内部的に（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ）伝染；クラス２＝非経口的に伝染、すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連するウイルス、ならびにアストロウイルスを含むが、これらに限定されない。
感染細菌の例は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（たとえばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉならびに抗生物質抵抗性バリアントを含む任意のバリアントを含むが、これらに限定されない。
感染真菌の例は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを含むが、これらに限定されない。他の感染生物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉなどのような原生生物を含む。
５． 抗生物質プロファイリング
本明細書において提供される方法は、抗生物質抵抗性を含む薬剤抵抗性に関与するヌクレオチド変化の検出の速度および正確性を改善することができる。イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、フルオロキノロン、およびエチオナミドに対する抵抗性に関与する遺伝子の遺伝子座が同定されている［Ｈｅｙｍら、Ｌａｎｃｅｔ３４４：２９３（１９９４）およびＭｏｒｒｉｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：９５４（１９９５）］。ピラジンアミドおよびエタンブトールまたはストレプトマイシンと共にイソニアジド（ｉｎｈ）およびリファンピン（ｒｉｆ）の組み合わせは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの確認された症例に対する第一線の攻撃としてルーチン的に使用されてきた［Ｂａｎｅｒｊｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：２２７（１９９４）］。そのような抵抗性の株の発生の増加により、それらを検出し、かつそれによって、効果的でなく、おそらく不利益な処置を続行する費用および地域医療の障害を低下させるための、迅速なアッセイの開発が必要とされる。薬物抵抗性に関与する遺伝子の遺伝子座のうちのいくつかの同定により、薬物抵抗性をもたらすヌクレオチド変化の迅速なスクリーニングのための変異体検出技術の採用が促進している。さらに、その技術により、微生物集団構造の（ｏｒ）処置モニタリングおよび処置追跡ならびに処置の間のサーベイランスモニタリングが促進する。さらに、混合集団の相関性およびサーベイランスモニタリングを実行することができる。
６． ハプロタイピング
本明細書において提供される方法を使用して、ハプロタイプを検出することができる。任意の二倍体細胞において、少なくとも１つの識別となる多様性を含有する任意の遺伝子または他の染色体セグメントに２つのハプロタイプがある。多くの十分に研究された遺伝子系において、ハプロタイプは、一つのヌクレオチドバリエーションよりも表現型と強力に相関する。したがって、ハプロタイプの決定は、疾患の素因または感受性、治療的介入に対する応答、ならびに医学、畜産、および農業において関心のある他の表現型を含む、様々な表現型の遺伝的根拠を理解するのに有益である。
本明細書において提供されるハプロタイピング手順により、個体の２つの相同染色体のうちの一方に由来する配列の一部分の選択および配列のその一部分の上で連鎖するＳＮＰの遺伝子型の同定を可能にする。ハプロタイプの直接的な分析は、情報内容の増加をもたらし、任意の連鎖疾患遺伝子の診断を改善し、それらの疾患と関連する連鎖を同定することができる。
７． マイクロサテライト
本明細書において提供される方法は、マイクロサテライト配列バリエーションの迅速で明白な検出を可能にする。マイクロサテライト（時に、タンデムリピート数またはＶＮＴＲと呼ばれる）は、１〜７塩基以上のショートタンデムリピートヌクレオチド単位であり、それらの中で最も有力なのは、ジ、トリ、およびテトラヌクレオチドリピートである。マイクロサテライトは、ゲノムＤＮＡにおいて１００，０００ｂｐ毎に存在する（Ｊ．Ｌ．ＷｅｂｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｃａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４４，３８８（１９８９）；Ｊ．Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３５９、７９４（１９９２））。ＣＡジヌクレオチドリピートは、たとえば、ヒトのミトコンドリア外のゲノムの約０．５％を構成し、ＣＴおよびＡＧリピートは、ともに、約０．２％を構成する。ＣＧリピートは、最も高い確実性で、ＣｐＧ島の調節性の機能により、まれである。マイクロサテライトは、長さに関して非常に多型であり、全ゲノムにわたって広範囲に分布し、主に非コード配列において豊富であり、ゲノム内のそれらの機能は、知られていない。集団が、その集団に特徴的であり、異種交配しない他の集団とは異なる様々なマイクロサテライトを維持するので、マイクロサテライトは、法医学の適用において重要になり得る。
マイクロサテライト内の多くの変化は、サイレントになり得るが、いくつかは、遺伝子産物または発現レベルにおける有意な改変につながり得る。たとえば、遺伝子のコード領域において見つけられるトリヌクレオチドリピートは、いくつかの腫瘍において影響を及ぼされており（Ｃ．Ｔ．Ｃａｓｋｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，７８４（１９９２）、マイクロサテライトの改変は、癌に対する素因をもたらす遺伝的不安定性をもたらし得る（Ｐ．Ｊ．ＭｃＫｉｎｎｅｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１ ７５、１９７（１９８７）；Ｊ．Ｇｅｒｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．３５、５７（１９８９））。
８． ショートタンデムリピート
本明細書において提供される方法を使用して、たとえばＳＴＲ領域を含有しないヒトゲノムにおける参照配列に対して、ヒトゲノムのいくつかの標的配列における縦ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）領域を同定することができる。ＳＴＲ領域は、あらゆる疾患または状態に関連しない多型領域である。ヒトゲノムにおける多くの遺伝子座は、多型ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）領域を含有する。ＳＴＲ遺伝子座は、長さが３〜７塩基対の短い反復配列エレメントを含有する。２００，０００の予想される三量体および四量体のＳＴＲがあると推測され、これらは、ヒトゲノムにおいて１５ｋｂ毎に１回の頻度で存在する（たとえば国際公開第９２１３９６９Ａ１号パンフレット、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４７９１（１９９１）；Ｂｅｃｋｍａｎｎら（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１２：６２７−６３１を参照されたい）。これらのＳＴＲ遺伝子座のほぼ半分は、多型であり、遺伝子マーカーの豊富な供給源を提供する。特定の遺伝子座でのリピート単位の数におけるバリエーションは、より長いリピート単位を含有する多様なヌクレオチドタンデムリピート（ＶＮＴＲ）遺伝子座（Ｎａｋａｍｕｒａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：１６１６−１６２２）；およびミニサテライト遺伝子座（Ｊｅｆｆｒｅｙｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：６７−７３）ならびにマイクロサテライトまたはジヌクレオチドリピート遺伝子座（Ｌｕｔｙら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４３０８；Ｌｉｔｔら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４３０１；Ｌｉｔｔら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５９２１；Ｌｕｔｙら（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４６：７７６−７８３；Ｔａｕｔｚ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６４６３−６４７１；Ｗｅｂｅｒら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４４：３８８−３９６；Ｂｅｃｋｍａｎｎら（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１２：６２７−６３１）を暗示する、観察される配列バリエーションの原因となる。ＶＮＴＲタイピングは、微生物タイピング、たとえばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＩＲＵタイピング）において非常に確立されたツールである。
ＳＴＲ遺伝子座の例は、ヒトＣＤ４遺伝子座におけるペンタヌクレオチドリピート（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４７９１（１９９１））；ヒトアロマターゼシトクロムＰ−４５０遺伝子におけるテトラヌクレオチドリピート（ＣＹＰ１９；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１９５（１９９１））；ヒト凝固第ＸＩＩＩ因子Ａサブユニット遺伝子におけるテトラヌクレオチドリピート（Ｆ１３Ａ１；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４３０６（１９９１））；Ｆ１３Ｂ遺伝子座におけるテトラヌクレオチドリピート（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１１６７（１９９２））；ヒトｃ−ｌｅｓ／ｆｐｓ癌原遺伝子におけるテトラヌクレオチドリピート（ＦＥＳ；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０１８（１９９１））；ＬＦＬ遺伝子におけるテトラヌクレオチドリピート（Ｚｕｌｉａｎｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４９５８（１９９０））；ヒト膵臓ホスホリパーゼＡ−２遺伝子でのトリヌクレオチドリピート配列バリエーション（ＰＬＡ２；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７４６８（１９９０））；ＶＷＦ遺伝子におけるテトラヌクレオチドリピート配列バリエーション（Ｐｌｏｏｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４９５７（１９９０））；およびヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）遺伝子座におけるテトラヌクレオチドリピート（Ａｎｋｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：１３７（１９９２））を含むが、これらに限定されない。
９． 生物同定
多型ＳＴＲ遺伝子座および遺伝子の他の多型領域は、ヒト同定、父系および母系試験、遺伝子地図作成、移住および遺伝の論争、双子における接合性試験、ヒトにおける近親交配についての試験、ヒト培養細胞の品質管理、ヒト遺体の同定、ならびに法医学における精液サンプル、血痕、微生物、および他の材料の試験に非常に有用なマーカーとなる配列バリエーションである。そのような遺伝子座はまた、商業上の動物育種および家系分析においてならびに商業上の植物育種において有用なマーカーである。植物作物および動物において経済的に重要な形質は、多型ＤＮＡマーカーを使用して、連鎖分析を通して同定することができる。そのような遺伝子座のアイデンティティを決定する効率的で正確な方法が、本明細書において提供される。
１０． 対立遺伝子バリエーションの検出
本明細書において提供される方法は、対立遺伝子バリアントのハイスループットで、高速で、正確な検出を可能にする。対立遺伝子バリエーションの研究は、複雑なバックグラウンドにおける特異的な配列の検出だけではなく、少数のまたは単一のヌクレオチド差を有する配列の間の判別もまた、含む。ＰＣＲによる対立遺伝子特異的バリアントの検出のための１つの方法は、鋳型鎖およびプライマーの３’末端の間にミスマッチがある場合に、ＴａｑポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成するのが困難であるという事実に基づく。対立遺伝子特異的バリアントは、可能性のある対立遺伝子のうちの一方とのみ完全に一致するプライマーの使用によって検出することができ、他方の対立遺伝子へのミスマッチは、プライマーの伸長を妨げるように働き、それによって、その配列の増幅を妨げる。本明細書における方法はまた、関連研究、コピー数バリエーション（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、タイピングのための疾患マーカーおよびＳＮＰセットの検出などにも適用可能である。
１１． 対立遺伝子頻度の決定
本明細書において記載される方法は、頻度が、年齢、人種、性別、または他のいくつかの基準に応じて集団内で変化する１つ以上の遺伝子マーカーを同定するのに有益である。たとえば、ＡｐｏＥ遺伝子型の年齢依存性の分布が、当技術分野において公知である（たとえばＳｃｈｅｃｈｔｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６：２９−３２を参照されたい）。疾患とあるレベルで関連することが公知な配列バリエーションの頻度をまた使用して、疾患状態を検出するかまたはその進行をモニターすることができる。たとえば、リポタンパク質リパーゼ遺伝子のＮ２９１Ｓ多型（Ｎ２９１Ｓ）は、アミノ酸コドン２９１でアスパラギンに対するセリンの置換をもたらすが、動脈硬化症、特に心筋梗塞に対する男性の危険性の増加と関連する、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）のレベルの低下につながる（Ｒｅｙｍｅｒら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１０：２８−３４を参照されたい）。さらに、対立遺伝子頻度における変化の決定は、以前に知られていなかった配列バリエーションならびに最終的に、疾患の発病および進行に関与する遺伝子または経路の同定を可能にし得る。
１２． エピジェネティクス
本明細書において提供される方法を使用して、配列、たとえば、核酸またはタンパク質の天然に存在する単量体単位である塩基またはアミノ酸の同一性に基づかない、参照核酸またはタンパク質に対する、標的核酸またはタンパク質におけるバリエーションを研究することができる。たとえば、本明細書において提供される方法を使用して、メチル化パターン、修飾塩基もしくはアミノ酸の存在、または配列非依存性の部位で切断される断片を生成する、標的分子および参照分子の間の高次構造における差などのような、配列非依存性の特徴における差を認識することができる。エピジェネティクスは、遺伝子配列における差ではなく、遺伝子発現における差に基づく情報の遺伝についての研究である。エピジェネティックな変化は、遺伝子機能における有糸分裂的および／もしくは減数分裂的に遺伝可能な変化または核酸配列における変化によって説明することができない、より高次の核酸構造における変化を指す。エピジェネティックなバリエーションまたは変化を受ける特徴の例は、動物におけるＤＮＡメチル化パターン、ヒストン修飾、およびポリコーム−トリソラックス群（Ｐｃ−Ｇ／ｔｘ）タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない（たとえばＢｉｒｄ，Ａ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１６：６−２１（２００２）を参照されたい）。
エピジェネティックな変化は、通常、必ずしもではないが、遺伝可能である遺伝子発現における変化に、通常、必ずしもではないが、つながる。たとえば、下記にさらに論じられるように、メチル化パターンにおける変化は、癌および他の疾患の発生および進行における初期事象である。多くの癌において、ある遺伝子は、異常なメチル化により、不適切にスイッチオフになるかまたはスイッチオンになる。メチル化パターンが転写を抑制するかまたは活性化する能力は、遺伝し得る。Ｐｃ−Ｇ／ｔｒｘタンパク質複合体は、メチル化のように、遺伝可能な様式で転写を抑制することができる。Ｐｃ−Ｇ／ｔｒｘマルチタンパク質アセンブリは、ゲノムの特異的な領域を標的にし、ここで、それは、遺伝子が活性であれ不活性であれ、遺伝子の胚遺伝子発現ステータスを有効に凍結し、発生を通してその状態を安定して伝える。ゲノムを標的にし、それに結合するタンパク質のＰｃ−Ｇ／ｔｒｘ群の能力は、遺伝子産物の特性ではなく、ゲノム中に含有される遺伝子の発現のレベルのみに影響を及ぼす。本明細書において提供される方法は、エピジェネティックな変化などのような配列非依存性の変化に基づく、参照配列に対して標的配列におけるバリエーションを同定する特異的な切断試薬または特異的な伸長反応と共に使用することができる。
１３． メチル化パターン
本明細書において提供される方法を使用して、標的配列におけるメチル化パターンにおける変化などのような、標的配列におけるエピジェネティックな変化である配列バリエーションを検出することができる。細胞のメチル化の分析は、新生の研究学問分野である。シトシンへのメチル基の共有結合的付加は、ＣｐＧジヌクレオチド（マイクロサテライト）に主として存在する。プロモーター領域に位置しないＣｐＧ島の機能は、これから探索されなければならないことであるが、プロモーター領域におけるＣｐＧ島は、それらのメチル化ステータスが、関連する遺伝子の転写および発現を調節するので、特に関心がある。プロモーター領域のメチル化は、遺伝子発現のサイレンシングにつながる。このサイレンシングは、永久的であり、有糸分裂のプロセスを通して継続する。遺伝子発現におけるその有意な役割により、ＤＮＡメチル化は、発生プロセス、刷り込み、およびＸ染色体不活性化ならびに腫瘍形成、老化、およびさらに寄生虫のＤＮＡの抑制に影響を及ぼす。メチル化は、肺癌、乳癌、および結腸癌などのような多くの広範囲の腫瘍の発癌ならびに白血病に関与すると考えられる。メチル化およびタンパク質の機能不全（Ｑ−Ｔ延長症候群）または代謝性疾患（一時的な新生児の糖尿病、２型糖尿病）の間にも関係がある。
ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を利用して、ＤＮＡ内のメチル化シトシン残基の位置を分析することができる。亜硫酸水素塩による核酸の処理は、シトシン残基を脱アミノして、ウラシル残基にし、メチル化シトシンは、未修飾のまま残る。したがって、亜硫酸水素塩により処理されなかった標的核酸の配列を、本明細書において提供される方法において亜硫酸水素塩により処理された核酸の配列と比較することによって、核酸におけるメチル化の程度およびシトシンがメチル化された位置を推定することができる。
制限エンドヌクレアーゼ反応を介してのメチル化分析は、ＨｐａＩＩおよびＭＳＰＩなどのようなメチル化特異的認識部位を有する制限酵素を使用することによって可能になる。基本原理は、ある酵素が認識配列においてメチル化シトシンによってブロックされるということである。一旦、この区別が達成されたら、結果として生じる断片の続く分析は、本明細書において提供される方法を使用して実行することができる。
これらの方法は、複合亜硫酸水素塩制限分析（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＣＯＢＲＡ）においてともに使用することができる。亜硫酸水素塩による処理は、増幅ＰＣＲ産物におけるＢｓｔＵＩ認識部位の消失を引き起こし、これは、未処理サンプルと比較して、分析の結果、新しい検出可能な断片を出現させる。本明細書において提供される方法は、メチル化部位の特異的な切断と共に使用して、標的核酸配列におけるメチル化パターンについての迅速で信頼できる情報を提供することができる。
１４． リシーケンス
様々な生物由来の、劇的に量が増大している利用可能なゲノム配列情報により、機能、表現型、またはアイデンティティに配列情報を相関させるために大規模比較配列分析を可能にする技術に対する必要性が増している。比較配列分析に対するそのような技術の適用は、ＳＮＰ発見および病原体の配列特異的同定を含めて、広範囲なものとすることができる。そのため、リシーケンスおよびハイスループット変異体スクリーニング技術は、疾患の根底にある変異体ならびに特異な薬物応答の根底にある遺伝的変異性の同定にとって重要である。
いくつかのアプローチが、これらの必要性を満たすために開発されている。ハイスループットＤＮＡシーケンスについての最新の技術は、電気泳動およびレーザー誘起蛍光検出を使用するＤＮＡシークエンサーを含む。電気泳動ベースのシーケンス法は、ヘテロ接合体を検出するための固有の限界を有し、ＧＣコンプレッション（ＧＣ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって欠陥が生じる。したがって、電気泳動を使用せずにデジタルデータをもたらすＤＮＡシーケエンスプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）は、これらの課題を克服することができる。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によって、デジタルデータ出力により核酸断片を測定する。本明細書において提供される方法は、参照配列に対して、配列同一性および配列バリエーションの検出におけるハイスループット、高速、および高精度を可能にする。このアプローチは、乳癌の発生に関連づけられるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２における創始者変異（ｆｏｕｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）のスクリーニングなどのような、正確な変異体検出のためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳシーケンスをルーチン的に使用することを可能にする。
１５． 疾患発生モニタリング
グローバルな交通および旅行の時代において、病原性の流行病の発生は、それらの世界的な伝播を妨ぎ、かつ制御を可能にするために綿密なモニタリングを必要とする。ハイスループット技術によるＤＮＡベースのタイピングは、発生状況において必要とされるように、比較的短時間で迅速なサンプルスループットを可能にする（たとえば、病院環境、早期警報システムにおけるモニタリング）。モニタリングは、使用される微生物マーカー領域に依存性であるが、属、種、株、またはサブタイプ特異的なレベルまで、モニタリングすることを促進することができる。そのようなアプローチは、生物テロ防御（ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ）において、臨床上および医薬のモニタリングにおいて、ならびにメタゲノミクスの適用（たとえば腸管内菌叢の分析）において有用になり得る。処置進行または失敗のそのようなモニタリングは、本明細書において参照によって組み込まれる米国特許第７，２５５，９９２号明細書、米国特許第７，２１７，５１０号明細書、米国特許第７，２２６，７３９号明細書、および米国特許第７，１０８，９７４号明細書において記載される。
１６． ワクチン品質管理および産生クローン品質管理
本明細書において提供される方法を使用して、ワクチンまたはたとえばインスリンまたは任意の他の産生クローンとなり得る組換え産生クローン（ワクチンに限定されない）の同一性または生物学的もしくは医用産物を管理することができる。
１７． 生産管理および品質のための薬理学における微生物のモニタリング
本明細書において提供される方法を使用して、たとえば、薬理学的産物におけるある微生物標的核酸の存在または非存在を検出することによって、そのような産物の品質を管理することができる。
キット
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法を実行するためのキットが、提供される。キットは、多くの場合、本明細書において記載される１つ以上の成分を含有する、１つ以上の容器を含む。キットは、任意の数の別々の容器、小包、チューブ、バイアル、マルチウェルプレートなどおいて１つ以上の成分を含むか、または成分は、そのような容器において様々な組み合わせで組み合わせられてもよい。１つ以上の下記の成分は、たとえば、キットに含まれていてもよい：（ｉ）１つ以上のヌクレオチド（たとえば、終結ヌクレオチドおよび／または非終結ヌクレオチド）；（ｉｉ）捕捉剤を含む１つ以上のヌクレオチド；（ｉｉｉ）１つ以上のオリゴヌクレオチド（たとえばオリゴヌクレオチドプライマー、１つ以上の伸長オリゴヌクレオチド、タグを含むオリゴヌクレオチド、捕捉剤を含むオリゴヌクレオチド）；（ｉｖ）遊離捕捉剤（たとえば遊離ビオチン）；（ｖ）結合ペア（ｖｉｉｉ）のメンバーを含む固相（たとえばビーズ）；（ｉｘ）１つ以上の酵素（たとえばポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素など）；（ｘ）コントロール成分（たとえばコントロールゲノムＤＮＡ、プライマー、合成鋳型、標的核酸など）（ｘｉ）１つ以上のバッファー、ならびに（ｘｉｉ）印刷物（たとえば使用法、標識など）。
キットは、プロセスと共に時に利用され、１つ以上のプロセスを実行するための指示および／または１つ以上の組成物の説明を含むことができる。キットを利用して、本明細書において記載されるプロセス（たとえば、固相を使用）を実行してもよい。指示および／または説明は、有形の形態（たとえば紙など）または電子的形態（たとえば、有形のメディア（たとえばコンパクトディスク）上のコンピュータ読み取り可能なファイルなど）であってもよく、キット挿入物中に含まれていてもよい。キットはまた、そのような指示または説明を提供するインターネットの場所についての書面の説明を含んでいてもよい。
下記に記載される実施例は、本技術を例証するものであり、本技術を限定するものではない。
実施例１：プレＰＣＲ反応
提供されるプロセスは、同じ標的を増幅する２つの遺伝子特異的プライマーを通常有する、通常のＰＣＲに対して代わりとなる生化学を提供する。このプロセスは、たとえばＳＮＰを含有する標的領域の増幅に適している。
アプローチ１：この方法は、伸長させるための１つのプライマーのみを使用する。図１を参照されたい。遺伝子特異的伸長プライマーは、５’ユニバーサルＰＣＲＴａｇ１Ｒを有する。それは、ゲノムＤＮＡ上で伸長する。ＤＮＡまたはＰＣＲ Ｔａｇ１Ｒ遺伝子特異的伸長プライマーは、反応のクリーンアップを促進するために、ビオチン化されてもよい。その後、伸長鎖は、Ｔａｇ２Ｆ（ユニバーサルＰＣＲプライマー）の逆相補体である配列を有するユニバーサルリン酸化オリゴヌクレオチドにライゲーションされる。次のステップにおいてクリーンアップを促進するために、リン酸化オリゴヌクレオチドは、その３’末端にエキソヌクレアーゼ抵抗性のヌクレオチドを有する。エキソヌクレアーゼ処理の間に、ライゲーションされていない伸長鎖はすべて、消化されるのに対して、ライゲーションされた産物は、保護され、反応液中に残る。その後、ユニバーサルＰＣＲは、複数の標的を増幅するためにＴａｇ１ＲおよびＴａｇ２Ｆプライマーを使用して実行される。コンセプト−１の概要を、図１において概説する。
アプローチ２：この方法において、プライマー伸長およびライゲーションは、同じ反応において行われる。図２は、伸長プライマーとしてのビオチン化ＰＣＲＴａｇ３Ｒ遺伝子特異的プライマーの使用を示す。リン酸化オリゴヌクレオチドは、遺伝子特異的配列を有し、プライマー伸長部位から約４０塩基離れたところでＤＮＡの同じ鎖に結合する。したがって、Ｓｔｏｆｆｅｌ ＤＮＡポリメラーゼは、それがリン酸化オリゴヌクレオチドに到達するまで、鎖を伸長させる。Ａｍｐリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）は、リン酸化オリゴヌクレオチドの遺伝子特異的配列を伸長鎖にライゲーションする。ホスホオリゴヌクレオチドの３’末端は、そのユニバーサルタグとしてＰＣＲＴａｇ４（ＲＣ）Ｆを有する。その後、ビオチン化伸長鎖は、ストレプトアビジンビーズに結合する。これは、反応のクリーンアップを促進する。ゲノムＤＮＡおよび遺伝子特異的リン酸化オリゴヌクレオチドは、洗い流される。その後、ユニバーサルＰＣＲは、プライマーとしてＴａｇ３ＲおよびＴａｇ４Ｆを使用して実行され、関心のある様々な遺伝子が増幅される。コンセプト−２の概要は、図２において示されるとおりである。
アプローチ１および２の両方からのユニバーサルＰＣＲ産物は、図３において示されるように、ポストＰＣＲ反応を使用して同定することができる。ＳＡＰを使用して、ＰＣＲ反応をクリーンアップした。ポストＰＣＲ反応は、ＳＮＰの直前に結合する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用して実行し、一塩基伸長産物を、チップアレイ上に配置し、質量分析法で分析した。あるいは、本明細書において提供される方法を、ポストＰＣＲ読み取りのために使用することができる。
実施例２：実施例１からのプレＰＣＲ反応材料
アプローチ１：
１ａ）伸長：９０ｕｌ反応は、１８ｎｇプラスミド挿入物、Ｍｇありの１×Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲバッファー、２．８２ｍＭの総ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、５０ｕＭ ｄＮＴＰ、０．５ｕＭ ５’ＰＣＲ ｔａｇ１Ｒ遺伝子特異的伸長プライマー、５．７６Ｕ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅにより実行した。使用したサーモサイクリング条件は、９４℃で２分間、その後に続く、９４℃での１０秒間の変性；５６℃での１０秒間のアニーリング；７２℃での２０秒間の伸長の４５サイクルとした。
１ｂ）ライゲーション：５ｕｌの伸長産物を、その３’末端がエキソヌクレアーゼ抵抗性である、５００ｐｍｏｌのホスホオリゴヌクレオチド（Ｔａｇ２Ｆプライマーの逆相補体）とライゲーションした。伸長産物およびホスホオリゴヌクレオチドは、６５℃／１０分間で変性させ、冷却し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、および５０Ｕ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ１により容量を５０ｕｌとした。インキュベーションは、３７℃／４時間、６５℃／２０分間で実行した。
１ｃ）エキソヌクレアーゼ処理：１０ｕｌのライゲーション産物は、９５℃／５分間で変性させ、冷却し、２０ｕｌの全容量中２０ＵエキソヌクレアーゼＩおよび１００ＵエキソヌクレアーゼＩＩＩを含有する０．５×エキソヌクレアーゼＩＩＩバッファーにより希釈した。反応は、３７℃／４時間、８０℃／２０分間でインキュベートした。
１ｄ）ユニバーサルＰＣＲ：２ｕｌのエキソヌクレアーゼ処理産物は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｕＭ ｄＮＴＰ、および０．６２５Ｕ Ｈｏｔ ｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼを含有する１×Ｑｉａｇｅｎバッファーを含有する２５ｕｌ反応液中で、０．４ ｕＭのそれぞれのＭ１３フォワードおよびリバースプライマーにより増幅した。使用したサーモサイクリング条件は、９４℃で１５分間、その後に続く、９４℃で３０秒間の変性；５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長の４５サイクルとした。
使用したプライマーおよびＰＣＲタグ配列は、
ユニバーサルＴａｇ １Ｒ（ｒｓ１００６３２３７）＝５’ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−（ＧＴＡＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣ）遺伝子特異的配列３’、
ユニバーサルＴａｇ２（ＲＣ）Ｆ＝５’Ｐ−ＣＡＴＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧ＊Ｔ＊Ｇ＊ｄｄＣ３’
（＊は、ヌクレオチドの間のエキソヌクレアーゼ抵抗性の連結を示す）
Ｔａｇ１Ｒ（Ｍ１３Ｒ）＝５’ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３’
Ｔａｇ２Ｆ（Ｍ１３Ｆ）＝５’ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ３’
ｒｓ１００６３２３７＿Ｅ１（ポストＰＣＲ反応用）：５’ＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧ３’
とした。
アプローチ１からの結果は、図４において知ることができる。
アプローチ２：
２ａ）伸長およびライゲーション：２０ｕｌの反応は、１６〜３５ｎｇゲノムＤＮＡ、１×Ａｍｐリガーゼバッファー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、２００ｕＭ ｄＮＴＰ、１０ｎＭビオチン化伸長プライマー、５０ｎＭ遺伝子特異的ホスホオリゴヌクレオチド、１Ｕ Ｓｔｏｆｆｅｌ断片ＤＮＡポリメラーゼ、および４Ｕ Ａｍｐリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）により実行した。使用したサーモサイクリング条件は、９４℃で５分間、その後に続く、９４℃で３０秒間の変性；すべてのサイクルで０．２℃ずつ温度を減少させながら５８．５℃で１５０秒間のアニーリング；７２℃での４５秒間の伸長の１９サイクルとした。伸長およびライゲーション反応は、２０分間、６０℃で、４０ｕｇのプロテイナーゼＫにより処理した。
２ｂ）ビーズクリーンアップ：１５ｕｌのＤｙｎａビーズＭ−２８０ストレプトアビジンビーズを、１×結合バッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）により３回洗浄した。すべての洗浄の間に、ビーズは磁石に結合させ、その後、上清を廃棄した。２つの伸長反応液をプールし、希釈して、１×結合バッファー濃度を得、その後、ビーズと混合した。ビーズは、緩やかな撹拌と共に、２０分間、室温でインキュベートした。その後、ビーズは、１×洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８ １ｍＭ ＥＤＴＡ）により３回および水により２回、洗浄した。その後、ビーズは、１０分間、室温で、０．１Ｎ ＮａＯＨにより処理した。その後、ビーズは、１×洗浄バッファーにより２回および水により２回、洗浄した。ビーズは、１５ｕｌ水中に最終的に懸濁した。
２ｃ）ユニバーサルＰＣＲ：２ｕｌビーズは、１×ＰＣＲ Ｇｏｌｄバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２５０ｕＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ならびに０．４ｕＭのそれぞれのＴａｇ４ＦおよびＴａｇ３Ｒプライマー、１．２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する２５ｕｌ ＰＣＲ反応液に添加した。使用したサーモサイクリング条件は、９４℃で１２分間、その後に続く、９４℃で３０秒間の変性；６８℃で３０秒間のアニーリング；７２℃で４５秒間の伸長の６０サイクル、２分間、７２℃の最終の伸長とした。使用したプライマーおよびタグ配列は、
ユニバーサルＴａｇ３Ｒ＝５’ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣ−遺伝子特異的配列３’、
ユニバーサルＴａｇ４（ＲＣ）Ｆ＝５’Ｐ−遺伝子特異的配列−ＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＡＴＧＧ３’
Ｔａｇ３Ｒ＝５’ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣ３’
Ｔａｇ４Ｆ＝５’ＣＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣ３’
とした。
アプローチ２遺伝子特異的伸長プライマー、ホスホオリゴヌクレオチド、およびポストＰＣＲ反応伸長プライマーを、表１、２、および３にそれぞれ列挙する。表１について、ＰＣＲタグ領域に下線を引く。アプローチ２において、５’ビオチン化ＰＣＲタグ付き遺伝子特異的プライマーは、Ｓｔｏｆｆｅｌ ＤＮＡポリメラーゼによってゲノムＤＮＡ上で伸長させ、同時に、Ａｍｐリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって、同じ鎖上に結合した下流の遺伝子特異的ＰＣＲタグ付きホスホオリゴヌクレオチドにライゲーションした。アプローチ２の結果を図５Ａ−５に示す。
Figure 2014515264
Figure 2014515264
Figure 2014515264
Figure 2014515264
Figure 2014515264
実施例３：実施例１および２の後のポストＰＣＲ反応
ＳＡＰ／ポストＰＣＲ反応：５ｕｌ Ｕｎｉｖ ＰＣＲを、３８４ウェルプレート中に分注し、０．６Ｕ ＳＡＰ（シュリンプアルカリホスファターゼ）を含有する２ｕｌ ＳＡＰ反応液を添加し、４０分間、３７℃でインキュベーションし、最終的に、５分間、８５℃で酵素を不活性化した。伸長試薬は、０．９ｍＭ非環式ターミネーターおよび１．３５３ＵポストＰＣＲ酵素を含有する２ｕｌ量で添加した。伸長オリゴヌクレオチド混合物は、その質量に従って濃度が異なった：０．５ｕＭの低度の質量：４０００〜５８７０ダルトン、１．０ｕＭの中程度の質量：６０００〜７３５０ダルトン、および１．５ｕＭの高度な質量：７４００〜８７００ダルトンを、９ｕｌの最終容量で添加した。ポストＰＣＲ反応のために使用したサイクリング条件は、９４℃／３０秒間ならびに１１の温度サイクル（９４℃／５秒間ならびに（５２℃／５秒間および８０℃／５秒間）の５回の内部サイクル）の４０サイクルならびに７２℃／３分間の最終の伸長とした。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：伸長反応液は、１６ｕｌ水により希釈し、６ｍｇ ＣＬＥＡＮ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を添加して、反応液を脱塩した。それを室温で２時間、回転させた。１５ｎｌのポストＰＣＲ反応液は、マトリックス（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）をあらかじめロードしたシリコンチップ上にロボットで分注した。質量スペクトルは、Ｍａｓｓ ＡＲＲＡＹ Ｃｏｍｐａｃｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して獲得した。
実施例４：ＳＮＰ遺伝子型同定においてマルチプレックス化および柔軟性を増加させるためのポストＰＣＲ反応
示すプロセスは、ＳＮＰ遺伝子型同定のマルチプレックス化および柔軟性を増加させるための、代わりとなるｇｏｌｄＰＬＥＸプライマー伸長ポストＰＣＲ構成についてのコンセプトを提供する。それは、対立遺伝子特異的伸長プライマーを利用し、ＳＮＰ当たり２つの伸長プライマーが、ＳＮＰ部位上にハイブリダイズするように設計される。それぞれのプライマーは、関心のあるＳＮＰ部位への特異的なハイブリダイゼーションのための遺伝子および対立遺伝子特異的３’ヌクレオチドならびに質量タグに対応する様々な定められた５’ヌクレオチド配列を含有する。アッセイの特異性は、特異的なＳＮＰに対応する場合にのみＤＮＡポリメラーゼによって伸長するであろう、鋳型に対するプライマーの３’末端の一致によって決定される。プロセスの概要を、図６において概説する。
伸長プライマーは、ｄＮＴＰ組み込みによって伸長させ、ｄｄＮＴＰによって終結させるか、またはその代わりに、ｄＮＴＰによる伸長を伴うことなくｄｄＮＴＰ組み込みによって終結させる。伸長反応の間に使用される１つ以上のｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰは、ビオチンなどのような固体支持体への固定を可能にする部分により標識される。
伸長産物は、続いて、伸長または終結産物のみが結合するであろう、ストレプトアビジンコーティングビーズなどのような固体支持体上に固定される。非伸長プライマーおよび不要な反応成分は、結合せず、洗い流される。
質量タグに対応する５’ヌクレオチド配列または代わりとなる基は、固体支持体に結合した伸長産物の３’セクションを残して、伸長産物から切断される。切断は、酵素的、化学的、および物理的な処理を含む様々な方法により実現することができる。本実施例において概説される、可能なものとして、プライマー内のデオキシイノシンを切断するためのエンドヌクレアーゼＶを利用するものがある。反応により、デオキシイノシンの３’で第２のホスホジエステル結合が切断され、オリゴヌクレオチド質量タグが放出される。
その後、５’ヌクレオチド配列（質量タグ）は、チップアレイに移動させ、質量分析法（たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によって分析される。タグの質量に一致する質量信号の存在は、対立遺伝子特異的プライマーが伸長し、そのため、その特異的な対立遺伝子が存在したことを示す。
実施例５：デオキシイノシンのエンドヌクレアーゼＶ切断
伸長反応前に、３５プレックス ＰＣＲは、以下の試薬を使用して、５μｌ反応容量中で実行した；５ｎｇ ＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー、５００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１００ｎＭのそれぞれのＰＣＲプライマー（表４に列挙される）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１５Ｕ Ｔａｑ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）。サーモサイクリングは、以下の条件を使用して実行した：９５℃で７分間；その後に続く、９５℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間の４５サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了。
ＰＣＲ反応物は、ＳＡＰ（シュリンプアルカリホスファターゼ）により処理して、取り込まれなかったｄＮＴＰを脱リン酸化した。０．６Ｕ ＳＡＰを含有する２μｌ混合物をＰＣＲ産物に添加し、その後、３７℃、４０分間および８５℃、５分間に供した。
伸長反応試薬は、３μｌ容量で組み合わせ、これを、ＳＡＰ処理ＰＣＲ産物に添加した。総伸長反応液は、以下の試薬を含有した；１×ｇｏｌｄＰＬＥＸバッファー、１７μＭのそれぞれのビオチンｄｄＮＴＰ、０．８μＭのそれぞれの伸長プライマー（表５に列挙される）、および１×ｐｏｓｔ−ｇｏｌｄＰＬＥＸ酵素。
サーモサイクリングは、９４℃で２分間；その後に続く、９４℃で５秒間、その後に続く、５２℃で５秒間および７２℃で５秒間の５サイクルの４０サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了からなる２００サイクルプログラムを使用して実行した。質量タグを含有する伸長プライマー配列および特異的な対立遺伝子に対応する切断産物の結果として生じる質量を表５に列挙する。
Ｓｏｌｕｌｉｎｋ磁気ストレプトアビジンビーズは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５により３回洗浄することによって調整した。その後、伸長反応液を、３００μｇ調整ビーズと組み合わせた。ビーズは、緩やかな撹拌と共に、３０分間、室温でインキュベートし、その後、磁気ラックを使用してペレットにした。上清を除去した。続いて、ビーズは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５により３回および水により３回洗浄した。それぞれの洗浄ステップについて、ビーズをペレットにし、上清は除去した。質量タグは、３０ＵエンドヌクレアーゼＶおよび０．４×バッファー４（ＮＥＢ）を含有する溶液の添加および１時間３７℃でのインキュベーションによって伸長産物から切断した。インキュベーションの後に、磁気ビーズは、磁気ラックを使用してペレットにし、質量タグ産物を含有する上清を除去した。
脱塩は、６ｍｇ ＣＬＥＡＮ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）の添加によって達成した。１５ｎｌの切断反応液は、マトリックス（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）をあらかじめロードしたシリコンチップ上にロボットで分注した。質量スペクトルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｃｏｍｐａｃｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して獲得した。図７は、本明細書において示されるように、ポストＰＣＲ読み取りを使用する、３５プレックス遺伝子型同定についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。
Figure 2014515264
Figure 2014515264
Figure 2014515264
Figure 2014515264
実施例６：リボヌクレオチドのＲＮアーゼＡ切断
材料および方法
伸長反応前に、２プレックスＰＣＲは、以下の試薬を使用して、５μｌ反応容量中で実行した；２ｎｇ ＤＮＡ、１．２５×ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑバッファー、５００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１００ｎＭのそれぞれのＰＣＲプライマー（表１において列挙される）、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１５Ｕ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）。サーモサイクリングは、以下の条件を使用して実行した：９５℃で１５分間；その後に続く、９５℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間の４５サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了。ＰＣＲ反応物は、ＳＡＰ（シュリンプアルカリホスファターゼ）により処理して、取り込まれなかったｄＮＴＰを脱リン酸化した。０．３Ｕ ＳＡＰを含有する２μｌ混合物をＰＣＲ産物に添加し、その後、３７℃、４０分間および８５℃、５分間に供した。
Figure 2014515264
伸長反応試薬は、２μｌ容量で組み合わせ、これを、ＳＡＰ処理ＰＣＲ産物に添加した。伸長反応液は、以下の試薬を含有した；２１μＭのそれぞれのビオチンｄｄＮＴＰ、続くＲＮアーゼＡ切断のためのリボヌクレオチドを含む１μＭのそれぞれの伸長プライマー（表７において列挙される）、および１．２５Ｕ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ。サーモサイクリングは、以下のサイクリング条件を使用して実行した：９４℃で２分間；その後に続く、９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、および７２℃で５秒間の１００サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了。非結合ヌクレオチドの除去は、メーカーによって推奨されるように、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した。
その後、溶出した伸長反応液は、３０μｇ調製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）と組み合わせた（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡにより３回洗浄）。ビーズは、緩やかな撹拌と共に、１５分間、室温でインキュベートし、その後、磁気ラックを使用してペレットにした。上清を除去した。続いて、ビーズは、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡにより６回洗浄した。それぞれの洗浄ステップについて、ビーズをペレットにし、上清は除去した。
質量タグは、ＲＮアーゼＡの添加および１時間３７℃でのインキュベーションによって伸長産物から切断した。インキュベーションの後に、磁気ビーズは、磁気ラックを使用してペレットにし、質量タグ産物を含有する上清を除去した。脱塩は、６ｍｇ ＣＬＥＡＮ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）の添加によって達成した。
１５ｎｌの切断反応液は、マトリックス（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）をあらかじめロードしたシリコンチップ上にロボットで分注した。質量スペクトルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｃｏｍｐａｃｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を使用して獲得した。
質量タグを含有する伸長プライマー配列および特異的な対立遺伝子に対応する切断産物の結果として生じる質量を表７に列挙する。スペクトルの例を図８に示す。２つのＳＮＰのそれぞれについて、ホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの両方が、示され、対応する質量タグの明確な区別を示す。
Figure 2014515264
表７において、リボヌクレオチドは、太字で強調し、ＳＮＰ特異的ヌクレオチドに下線を引き、また、質量タグに下線を引く。図８において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、ｒｓ１０００５８６およびｒｓ１０１３１８９４の遺伝子型同定について示す。
実施例７：質量タグ設計
質量タグは、可能性のある塩付加生成物によるあらゆるオーバーラップを回避するために、少なくとも１６ダルトン離して設計し、したがって、あらゆる質量信号の二重のチャージ（ｃｈａｒｇｅ）が、質量タグ信号に干渉することはないであろう。質量タグの計算は、デオキシイノシンおよびデオキシイノシンに対して３’のヌクレオチドを考慮に入れなければならない。
ヌクレオチド質量タグ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ飛行活動を、７０プレックス（図９および１０）ならびに１００プレックスアッセイ（図１１ＡおよびＢ）において使用した質量タグに対応するオリゴヌクレオチドについて検査した。
７０プレックスアッセイに対応するオリゴヌクレオチドはすべて、同等のレベルで、３つのパラメータ；面積、ピークの高さ、および信号対雑音比を使用して、標準的なＳｅｑｕｅｎｏｍ Ｔｙｐｅｒ ３．４ソフトウェアによってコールされた（図９）。７０プレックスアッセイに相当するオリゴヌクレオチドを使用すると、それぞれのピークの面積値は、そのオリゴヌクレオチドの配列組成に相関する。グアニジンおよびシトシンヌクレオチドのより高度なパーセンテージは、より大きな面積値をもたらすのに対して、アデノシンのパーセンテージは、より低度の面積値と対応する（図１０）。１００プレックスアッセイに相当するオリゴヌクレオチドを使用して、発明者らは、信号対雑音比に対するオリゴヌクレオチド濃度の効果を検査した（オリゴヌクレオチド当たり１０、５、２．５、および１ｐｍｏｌ最終濃度）（図１１Ｂ）。２．５および１ｐｍｏｌのより低度のオリゴヌクレオチド濃度は、１０および５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド濃度よりも一貫して高度な信号対雑音比値を示した。この観察は、Ｔｙｐｅｒ ３．４において見られたピークの手動の観察によって確認された。しかしながら、４つのオリゴヌクレオチド濃度は、同等の面積値を示した（データ示さず）。
実施例８：伸長プライマー設計およびｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ組み込み
伸長プライマーは、以下のパラメータ、ＳＢＥ Ｍａｓｓ Ｅｘｔｅｎｄ／ｇｏｌｄＰＬＥＸ伸長、２０〜３５塩基のプライマー長（および対応する質量ウィンドウ）、ならびに分析物について１０ダルトン（可能な最小値）および質量伸長プライマーについて０ダルトンの最小ピーク分離を利用して、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ’ｓ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアを使用して設計した。
伸長反応液における、伸長オリゴヌクレオチドおよびｄｄＮＴＰの役割：プライマー伸長に対する伸長オリゴヌクレオチド（デオキシイノシンヌクレオチドあり／なし）およびｄｄＮＴＰ組成（ビオチン部分あり／なし）の効果を調査するために、発明者らは、５プレックスの伸長率を調査した（図１２）。アッセイは、一般に、未修飾伸長オリゴヌクレオチドおよびｄｄＮＴＰを使用すると、最良の伸長率を示す。デオキシイノシンを含有する伸長オリゴヌクレオチドは、伸長率における有意な低下を示さなかった。しかしながら、ビオチン部分を含むｄｄＮＴＰを使用した場合に、いずれのタイプの伸長オリゴヌクレオチドを使用した場合も、伸長率における低下が、すべてのアッセイにおいて見られた。
ビオチン化ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ伸長：単一のビオチン化ｄｄＮＴＰによって伸長させるかまたはビオチン化ｄＮＴＰによって伸長させ、未修飾ｄｄＮＴＰによって終結させる効果を比較するために、発明者らは、７プレックスおよび５プレックスにおける伸長率を比較した。７プレックスは、ビオチン化ｄｄＣＴＰまたはビオチン化ｄＣＴＰおよびｄｄＡＴＰ、ｄｄＵＴＰ、もしくはｄｄＧＴＰによって伸長させた。５プレックスは、ビオチン化ｄｄＵＴＰまたはビオチン化ｄＵＴＰおよびｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、もしくはｄｄＧＴＰによって伸長させた。また実験により、２１０または４２０ｐｍｏｌいずれかのビオチン化ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰの２つの濃度を比較した。
両方のプレックスにおいて、また、すべての個々のアッセイにおいて、ビオチン化ｄＮＴＰによって伸長させ、未修飾ｄｄＮＴＰによって終結させた場合の伸長率は、単一のビオチン化ｄｄＮＴＰによる伸長と比較した場合、著しく減少した（図１３）。
これらの結果は、単一のビオチン化ｄｄＮＴＰによる伸長が、より大きな伸長効率をもたらすことを示す。
ＰＣＲ増幅
伸長反応前に、ＰＣＲは、以下の試薬を使用して、５μｌ反応容量中で実行した；５ｎｇ ＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー、５００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１００ｎＭのそれぞれのＰＣＲプライマー、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１５Ｕ Ｔａｑ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）。
サーモサイクリングは、以下の条件を使用して実行した：９５℃で７分間；その後に続く、９５℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間の４５サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了。
ＳＡＰ処理
ＰＣＲ反応物は、ＳＡＰ（シュリンプアルカリホスファターゼ）により処理して、取り込まれなかったｄＮＴＰを脱リン酸化した。０．６Ｕ ＳＡＰを含有する２μｌ混合物をＰＣＲ産物に添加し、その後、サーモサイクラーにおいて３７℃、４０分間および８５℃、５分間に供した。
伸長反応
伸長反応試薬は、３μｌ容量で組み合わせ、これを、ＳＡＰ処理ＰＣＲ産物に添加した。総伸長反応液は、以下の試薬を含有した；１×ｇｏｌｄＰＬＥＸバッファー、０．２μｌの２５０μＭストックのそれぞれのビオチン化ｄｄＮＴＰ（５０ｐｍｏｌ最終）、０．８μｌの２．５μＭ溶液のそれぞれの伸長プライマー（２ｐｍｏｌ最終）（ＩＤＴ）、および０．０５μｌ ｇｏｌｄＰＬＥＸ酵素（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）。
サーモサイクリングは、９４℃で２分間；その後に続く、９４℃で５秒間、その後に続く、５２℃で５秒間および８０℃で５秒間の５サイクルの６０サイクル；ならびに７２℃、３分間で終了からなる３００サイクルプログラムを使用して実行した。
捕捉
調整のために、磁気ストレプトアビジンビーズを、１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５により２回、洗浄した。伸長反応液を、５０μｇ（５μｌ）調整ビーズと組み合わせた。ビーズは、緩やかな撹拌と共に、１時間、室温でインキュベートし、その後、磁気ラックを使用してペレットにした。上清を除去した。続いて、ビーズは、１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５により３回および１００μｌの水により３回洗浄した。それぞれの洗浄ステップについて、ビーズをペレットにし、上清は除去した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
脱塩は、６ｍｇ ＣＬＥＡＮ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）の添加によって達成した。１５ｎｌの切断反応液は、マトリックス（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）をあらかじめロードしたシリコンチップ上にロボットで分注した。質量スペクトルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｃｏｍｐａｃｔ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器）を使用して獲得した。
実施例９：酵素、バッファー、オリゴヌクレオチド、およびビオチンｄｄＮＴＰの滴定
酵素滴定：伸長反応において使用するポストＰＣＲ酵素の量を検査した。標準的なＰＣＲ、伸長、および固定／切断条件（実施例８におけるプロトコールにおいて概説される）を、酵素を除いて使用した。使用した酵素の量は、個々のアッセイについて、手動コールまたは信号対雑音比の値のいずれにも差をもたらさなかった（図１４）。
バッファー滴定：伸長反応において使用するｇｏｌｄＰＬＥＸバッファーの量を検査した。標準的なＰＣＲ、伸長、および固定／切断条件（実施例８におけるプロトコールにおいて概説される）を、バッファーの量の調整を除いて使用した。使用したバッファーの量は、個々のアッセイについて、手動コールまたは信号対雑音比の値のいずれにも差をもたらさなかった（図１５）。
オリゴヌクレオチド滴定：伸長反応において使用するオリゴヌクレオチドの量を検査した。標準的なＰＣＲ、伸長、および固定／切断条件（プロトコールセクションにおいて概説される）を、オリゴヌクレオチドの量の調整を除いて使用した。
最初の実験（図１６）において、それぞれのオリゴヌクレオチドの１５ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、および５ｐｍｏｌの最終量を試験した。１０および１５ｐｍｏｌ量は、同様の結果を示したが、５ｐｍｏｌは、有意により多くの手動およびソフトウェア遺伝子型コールを示した。これは、信号対雑音比の値を観察することによって見ることができ（図９）、性能が低いアッセイは、より低度の量のオリゴヌクレオチドを使用した場合に、信号対雑音比の増加を示す。
追跡調査実験において、それぞれのオリゴヌクレオチドの５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、および１ｐｍｏｌの最終量を試験した（図１７）。３つの量すべてについての結果は、信号対雑音比および手動遺伝子型コールによって評価されるように、同様の結果を示した。しかしながら、２．５または１ｐｍｏｌの濃度を使用した場合にピークがはっきりと見られた３つの個々のアッセイは、５ｐｍｏｌの最終濃度を使用した場合、低度の強度によりコールするのが困難であった。それぞれのオリゴヌクレオチドの２ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、および０．５ｐｍｏｌの最終量を比較する２つの７０プレックスアッセイを使用した場合、同じ量の手動コールが、すべての濃度について見られた。しかしながら、より多くのオリゴヌクレオチドを使用した場合、より大きな信号対雑音比が、見られた（図１８および１９）。
これらの結果は、７０プレックスアッセイを使用する場合、それぞれのオリゴヌクレオチドの最適な量が、２ｐｍｏｌであることを示す。しかしながら、同様の結果が、０．５〜５ｐｍｏｌの範囲のそれぞれのオリゴヌクレオチドの最終量で見られた。
ビオチン化ｄｄＮＴＰ濃度：伸長反応において使用するビオチン化ｄｄＮＴＰの量を検査した。標準的なＰＣＲ、伸長、および固定／切断条件（実施例８におけるプロトコールにおいて概説される）を、ビオチン化ｄｄＮＴＰの量の調整を除いて使用した。
最初の実験において、それぞれの伸長反応におけるそれぞれのビオチン化ｄｄＮＴＰの１００、２００、３００、および４００ｐｍｏｌの最終量を試験した。手動コールおよび信号対雑音比（図２０）は、同様の結果が、ビオチン化ｄｄＮＴＰのすべての試験量で見られたことを示す。
それぞれの伸長反応において必要とされるビオチン化ｄｄＮＴＰの量をさらに調査するために、実験により、代わりとなる７０プレックスアッセイにおいてそれぞれのビオチン化ｄｄＮＴＰの５０および１００ｐｍｏｌを比較した。これらのアッセイもまた、手動コールまたは信号対雑音比における差を示さない（図２１）。これは、それぞれのビオチン化ｄｄＮＴＰの５０ｐｍｏｌが、７０プレックスアッセイを使用する場合、最適な伸長反応を得るのに十分であることを示す。
実施例１０：捕捉および切断の最適化
固定およびオリゴヌクレオチド切断：磁気ストレプトアビジンビーズの結合能力。ビオチン化オリゴヌクレオチドを捕捉するためのＳｏｌｕｌｉｎｋおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ストレプトアビジンビーズの比較は、実施例８において記載される捕捉プロトコールに従った。実験は、ＳＮＰ ｒｓ１０００５８６のために設計したアッセイについての２つの可能性のある対立遺伝子に対する伸長産物に対応する２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、デオキシイノシンヌクレオチドおよび３’ビオチン化ヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは、水または様々な量のビオチン化ｄＮＴＰのいずれかの存在下において磁気ストレプトアビジンに結合し、エンドヌクレアーゼＶによる処理によって切断させる。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ストレプトアビジンビーズは、１０または１００ｐｍｏｌビオチン化ｄｄＮＴＰの存在下において面積の低下を示さない。しかしながら、信号における大きな減少が、５００ｐｍｏｌビオチン化ｄｄＮＴＰの添加で見られる。
Ｓｏｌｕｌｉｎｋ磁気ビーズは、５００ｐｍｏｌ以下のビオチン化ｄＮＴＰの存在下において信号の低下を示さない。これは、ビオチン化ｄｄＮＴＰの合計が５００ｐｍｏｌを超えない場合、伸長反応の取り込まれなかったビオチン化ｄｄＮＴＰが、最終信号における減少を引き起こさないであろうということを示す。
これらの結果は、この報告において概説されない実験と組み合わせて、Ｓｏｌｕｌｉｎｋビーズが、ビオチン化伸長産物の結合を阻害するビオチン化小分子に対してより大きな耐性を有することを示す。これは、おそらく、２５００対５００ｐｍｏｌビオチンオリゴヌクレオチド／ｍｇであることが報告されている、ビーズのより大きな結合能力によるものである（図２２）。
切断
質量タグは、１２ＵエンドヌクレアーゼＶ（ＮＥＢ）および１０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液の添加ならびに１５００ｒｐｍでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において振盪させながらの４時間、３７℃でのインキュベーションによって、伸長産物から切断した。インキュベーションの後に、磁気ビーズは、磁気ラックを使用してペレットにし、上清を除去した。
切断特性に対するデオキシイノシン位置の効果：この実験は、様々な位置にデオキシイノシンヌクレオチドを含有する伸長産物を切断するエンドヌクレアーゼＶの能力を分析するために設計した。デオキシイノシンヌクレオチドの位置においてのみ異なる４つのオリゴヌクレオチドを、伸長産物をシミュレートするために設計した（３’ビオチンおよびデオキシイノシンヌクレオチドを含有）。デオキシイノシンは、ビオチン部分を含有する３’ヌクレオチドから１０、１５、２０、および２５塩基対のところに位置した。
結合ステップ由来の上清（非結合オリゴヌクレオチド）の切断の後に見られる質量タグ信号は、同様の量のオリゴヌクレオチドが、すべてのオリゴヌクレオチドについて、磁気ストレプトアビジンビーズ上に結合したことを示す。しかしながら、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したオリゴヌクレオチドを切断した後に、明確なパターンが見られる。オリゴヌクレオチドの３’末端へのデオキシイノシンの距離が大きくなるほど、信号および推測上、切断は、より大きくなる。これらの結果により、デオキシイノシンが、伸長産物の推定上の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチドのところにあるすべての伸長オリゴヌクレオチドを設計するに至った（図２３）。
ビーズおよびエンドヌクレアーゼＶの滴定：ビオチン化伸長産物を効率的に捕捉するためのＳｏｌｕｌｉｎｋ磁気ストレプトアビジンビーズおよび質量タグを放出させるための捕捉産物を切断するためのエンドヌクレアーゼＶの量を、７０プレックスアッセイを使用して、一連の実験において評価した。
最初の実験により、１０、２０、および３０μｌのＳｏｌｕｌｉｎｋ磁気ストレプトアビジンビーズならびに１０、２０、および３０単位のエンドヌクレアーゼＶを比較した。信号対雑音比は、１０単位のエンドヌクレアーゼＶと組み合わせて２０および３０μｌの磁気ビーズを使用した場合以外、試験したすべての組み合わせで、同様の結果を示す（図２４）。１０μｌのビーズおよび１０ＵエンドヌクレアーゼＶと３０μｌのビーズおよび３０ＵエンドヌクレアーゼＶを手動で比較する遺伝子型をコールした場合、同一の結果が見られた。
これらの結果を追跡調査するために、実験により、以下の条件を比較した；１０μｌビーズ／１０ＵエンドヌクレアーゼＶ；５μｌビーズ／１０ＵエンドヌクレアーゼＶ、１０μｌビーズ／５ＵエンドヌクレアーゼＶ、および５μｌビーズ／５ＵエンドヌクレアーゼＶ。手動遺伝子型コールまたは信号対雑音比のいずれかを検査した場合、１０または５μｌいずれかの磁気ビーズを使用した場合に、同様の結果が見られた（図２５）。しかしながら、５ＵエンドヌクレアーゼＶを使用した場合、１０ＵエンドヌクレアーゼＶと比較した場合、手動のコールおよび信号対雑音比の両方において有意な低下があった。
これらの結果を確認するために、さらなる実験により、以下の条件を比較した；１０μｌビーズ／１２ＵエンドヌクレアーゼＶ；５μｌビーズ／６ＵエンドヌクレアーゼＶ、５μｌビーズ／１２ＵエンドヌクレアーゼＶ、および５μｌビーズ／１８ＵエンドヌクレアーゼＶ。手動の遺伝子型コールおよび信号対雑音比の両方を比較した場合、１０または５μｌのＳｏｌｕｌｉｎｋ磁気ビーズを比較した場合に、同様の結果が見られた（図２６）。様々な量のエンドヌクレアーゼＶを比較した場合、１２および１８ＵエンドヌクレアーゼＶで同様の結果が見られた。しかしながら、６ＵのエンドヌクレアーゼＶを使用した場合、信号の低下が、観察された（図２６）。
実施例１１：代わりとなるオリゴヌクレオチド切断メカニズム
リボヌクレオチド：最初の実験では、リボヌクレオチドを含む伸長オリゴヌクレオチドを使用した。伸長および続く磁気ストレプトアビジンビーズ上への捕捉の後に、質量タグは、リボヌクレオチドのＲＮアーゼＡ切断によって放出させる。方法は、以下のセクションにおいて概説される。アッセイは、ＳＮＰ ｒｓ１０００５８６およびｒｓ１０１３１８９４について一緒に開発した。２プレックス反応は、うまくいき、遺伝子型ははっきりと見られる（図８）。今後克服するべき課題は、凍結融解によるリボヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドの切断である。
光開裂性：エンドヌクレアーゼＶによるデオキシイノシンの切断の代わりとなるものを探索するために、光開裂性リンカーを含有するオリゴヌクレオチドを試験した（ＩＤＴ）。リンカーは、３００〜３５０ｎｍのスペクトル範囲のＵＶ光への曝露により切断することができる１０原子スペーサーアームを含有する。
メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）：エンドヌクレアーゼＶによるデオキシイノシンの切断の使用にさらに代わりになるものとして、メチルホスホネート修飾を含有するオリゴヌクレオチドを検査した。オリゴヌクレオチドは、単一の位置にリン酸主鎖の修飾を含有し、ここで、酸素がメチル基と置換されている。これは、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または水酸化カリウム（ＫＯＨ）および熱によって切断することができる中性に荷電した主鎖をもたらす。一連の実験は、わずか５０ｍＭのＮａＯＨまたは２００ｍＭ ＫＯＨの添加ならび１時間７０℃での加熱によってオリゴヌクレオチドを切断することができることを示した。
ｄＳｐａｃｅｒ、ホスホロチオエート／ホスホラミダイト：詳細に探索されていなかった３つの代わりとなる切断メカニズムは、ヌクレオチドの１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）との交換およびホスホロチオエートまたはホスホラミダイトのいずれかを生成する主鎖修飾である。ホスホロチオエート修飾により、架橋酸素を硫黄と交換する。これにより、含水アセトン中の３０／５０ｍＭ硝酸銀水溶液（ジチオトレイトールあり／なし）または５０ｍＭヨウ素のいずれかによる処理により主鎖を切断するのを可能にする。ホスホラミダイト修飾により、架橋酸素をアミド基と交換する。結果として生じるＰ−Ｎ結合は、８０％ＣＨ３ＣＯＯＨによるかまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ手順の間の処理により切断することができる。
実施例１２：ビオチン競合放出方法を使用するビオチン化伸長産物の単離
ビオチン化伸長産物を精製し、遊離ビオチンを使用してストレプトアビジンコーティング磁気ビーズから該産物を放出させるための方法が、本明細書において記載され、図２７Ａ〜Ｇにおいて例証される。いくつかの実施形態において、方法を利用して、多型同定のために、一塩基伸長反応液を精製し、かつ単離し、かつ分析する。
関心のあるゲノム領域（たとえば、遺伝的バリエーションを有する領域）は、ＰＣＲベースの方法を使用して、標的にすることができる（図２７Ａを参照されたい）。関心のある領域のＰＣＲ増幅の後に、反応産物を、シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）により処理して、取り込まれなかったヌクレオチド三リン酸を脱リン酸する。関心のある多型を含む、関心のある領域は、関心のあるヌクレオチド残基に対応する一塩基伸長（ＳＢＥ）反応を使用するヌクレオチドプローブによって標的にすることができる（たとえば多型；図２７Ｂを参照されたい）。ＳＢＥ反応では、ビオチン標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸ターミネーターを利用する。ビオチン化伸長産物を、続いて、捕捉し（図２７Ｃ参照されたい）、洗浄し、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズおよび磁気分離を利用して、未使用の反応成分から精製した（図２７Ｄを参照されたい）。
精製された伸長産物は、上昇した温度条件下で、遊離ビオチンとの競合によってストレプトアビジンコーティング磁気ビーズから続いて溶出させた（図２７Ｅを参照されたい）。関心のある領域由来のビオチン化伸長産物を含有する溶出物を、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に分注し（図２７Ｆを参照されたい）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を使用して分析する（図２７Ｇを参照されたい）。反応成分および条件は、本明細書において記載される。
方法
Figure 2014515264
Figure 2014515264
ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して、ビオチン化伸長産物を捕捉するための成分および手順。
ＰＣＲ反応のそれぞれのウェルにビーズと共に等容量の２×結合バッファーを添加する。
２×結合バッファー中２５μｌビーズ
２５μｌ伸長産物
プレートを回転させて、室温で１５〜３０分間、混合する。
磁気分離機にプレートを置き、上清を除去する。
ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用する、ビオチン化伸長産物の精製および洗浄のための成分および手順。
以下のように１×洗浄バッファーを添加する：
試薬 反応当たりの容量［μｌ］
１×洗浄バッファー ５０
穏やかに混合し、その後、磁石上に２〜３分間置いてビーズを捕捉する；上清を除去する。
以下のように、チューブに１×洗浄バッファーを添加して合計２回の洗浄を繰り返す：
試薬 反応当たりの容量［μｌ］
１×洗浄バッファー １００
穏やかに混合し、その後、磁石上に２〜３分間置いてビーズを捕捉する；上清を除去する。
以下のように水を添加する：
試薬 反応当たりの容量［μｌ］
水 １００
穏やかに混合し、その後、磁石上に２〜３分間置いてビーズを捕捉する；上清を除去する。
以下のように、合計２回の洗浄を繰り返すためにチューブに水を添加する：
試薬 反応当たりの容量［μｌ］
水 １００
穏やかに混合し、その後、磁石上に２〜３分間置いてビーズを捕捉する；上清を除去する。
続く分析のための、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズからの、捕捉ビオチン化伸長産物の溶出。
ビオチン化伸長産物は、上昇した温度で、遊離ビオチンとの競合を使用して、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズから溶出した。反応条件を下記の表に示す。
１５μｌのビオチンを添加する（処理した樹脂、２５ｎｇ／μｌ）。
５分間、９０℃まで加熱。その後、４℃まで冷ます。
ビーズを捕捉するために、２〜３分間、磁石上に置く。
表において記載されるように磁気ビーズを捕捉した後に、溶出物をビーズから取り出し、さらなる分析のために調製した。いくつかの実施形態において、さらなる分析のための調製が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法における使用に適した固体支持体上への分注または配置を含む。ある実施形態において、固体支持体が、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）固体支持体である。ビオチン化伸長産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって時に分析され、これは、伸長産物の質量の差を使用して、関心のある領域の（たとえば多型の部位の）サンプルの遺伝子型を解明する。代表的なスペクトルの軌跡を図２８に示す。
図２８は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した一塩基反応産物における質量差を示す。非伸長プライマーは、およそ５９９７ダルトンの質量でスペクトルの軌跡上に示される。２つの伸長反応産物もまた、図２８において示され、ｄｄＵ反応産物は、インプット鋳型の約１０％に相当し、およそ６６６５ダルトンの質量を有し、ｄｄＡ反応産物は、インプット鋳型の約９０％に相当し、およそ６６８７ダルトンの質量を有する。質量６５１０および６５７９のさらなる点線は、ＢＲＡＦ＿２＿ＷＴおよびＢＲＡＦ＿２＿Ｒマーカー一塩基伸長産物の対立遺伝子について予想される質量である。
実施例１３：伸長および固相からの伸長オリゴヌクレオチドの放出
典型的なマルチプレックス（すなわちｉＰＬＥＸ）を、伸長ステップ（たとえば実施例８）の後に続けた。関心のある領域のＰＣＲ増幅を実行し、その後に取り込まれなかったヌクレオチドのＳＡＰ脱リン酸化を続けた。一塩基伸長では、ビオチン化ジデオキシヌクレオチドを利用した。この伸長は、マイナーな種に対応するヌクレオチドのみまたは４つのヌクレオチドすべてを含めることのいずれかによって実行した。ビオチン化オリゴヌクレオチドは、様々なメーカーのストレプトアビジンビーズを使用して捕捉した。放出ステップについては、結合したビオチン化オリゴヌクレオチドと競合させるための遊離ビオチンの使用と、イノシン切断法を比較した。この反応の他の成分は、前に記載されるアッセイと同様のものとした（たとえば実施例８）。ＰＣＲ増幅、ＳＡＰ脱リン酸化、および伸長のために使用した条件を、下記の表８に示す。
Figure 2014515264
伸長の後に、反応液を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに導入した。伸長産物を、短時間、捕捉させた。続く洗浄ステップを実行して、捕捉された伸長産物以外の反応成分を除去した（表９）。この手順により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法における妨害付加生成物を産生する塩を除去し、これにより、ｉＰＬＥＸワークフローと共にここで用いられる陰イオン交換樹脂手順を省くのを可能にした。洗浄の後に、捕捉された伸長産物は、２５ｎｇ／ｕｌの高モル遊離ビオチン溶液を導入することによって、ビーズから溶出した。溶出の後に、伸長産物は、溶出剤中に残った。きれいにした分析物は、ここで、バイオアレイチップ上に分注する準備ができ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル上で少量の種を不明瞭にし得る、非伸長プライマー、塩、および他の混入物が実質的になく、したがって、より高感度の検出を可能にした。図２９Ａ〜Ｇは、この手順のフローチャートを示す。
Figure 2014515264
イノシン切断
代替の溶出法として、捕捉された伸長産物からの質量タグのイノシン切断を実行した。この方法は、伸長オリゴヌクレオチド設計についてビオチン競合アプローチと違っている。このアプローチは、伸長産物に対応させるために伸長プライマーの５’末端上に非鋳型配列を必要とした。さらに、このオリゴヌクレオチドは、標的の相補的配列および質量タグ配列識別子を隔てるイノシン残基を用いて合成した。このイノシン残基を通して、質量タグは、エンドヌクレアーゼＶ活性によって捕捉剤から切断された。このプロセスの切断部分は、図３０Ａおよび３０Ｂにおいて示される。
ストレプトアビジンビーズ選択および溶出評価（ビオチン対イノシン切断）
５つのストレプトアビジンビーズ産物を評価のために選択した。選択は、遊離ビオチンの表面特徴および結合能力に基づくものとした。これらの特徴を表１０に列挙する。
Figure 2014515264
ビーズの性能は、３’ビオチンを用いて合成したオリゴヌクレオチドを使用して評価した。２つのオリゴヌクレオチドを、同一の「配列特異的」領域を用いて設計した；一方は５’修飾を有しなかったが、他方は、イノシン残基と共に５’質量タグを含有した。捕捉および溶出戦略の効率を評価するために、それぞれのスペクトル内の相対的な測定値を用いた。さらなるオリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれのサイズが、比較のために、溶出産物の許容され得る質量範囲内となるように設計した。
試験手順は、３’ビオチン化オリゴヌクレオチドの捕捉、一連の洗浄の実行、および続く溶出を含んだ（ビオチン競合対イノシン切断）。この戦略は、ＰＣＲおよび伸長ステップの間に発生し得た変動性を軽減する。ビーズおよび溶出戦略は、捕捉可能なオリゴヌクレオチドの限界に対する応答によって評価した。この評価は、２ｕＭ〜０．０３１ｕＭに３’ビオチン化オリゴヌクレオチドを連続希釈することによって実行した。試験したそれぞれの濃度について、等量の定量オリゴヌクレオチドを溶出剤に添加して、ビーズ捕捉および溶出効率を測定した。
定量オリゴヌクレオチドの高さに対する捕捉オリゴヌクレオチドの比は、評価したそれぞれのビーズについてそれぞれの濃度で測定した。この最初の実験は、ビオチン競合方法が、溶出法より性能が優れていることを示した。両方の溶出法は、最も低度の出発インプットで捕捉産物を示したが、ビオチン捕捉は、比によって示されるように、より捕捉され、溶出された産物をはっきりと示した。この結果は、使用したビーズに関係なく明白であり、ビオチン競合を溶出戦略として選んだ。データはまた、ＤｙｎａｌＭ２８０およびＤｙｎａｌＴ１の性能不足を示した。この実験を反映するデータは、図３１および図３２において見ることができる。
ビーズ評価
次のアプローチにより、さらなる開発のために捕捉ビーズを分析した。この実験は、ＰＣＲ鋳型から外れた伸長産物からビーズ性能を評価するために、提唱される超高感度検出ワークフローのステップをすべて利用した。インプット材料を制御するために、競合因子オリゴヌクレオチドを鋳型材料として使用した。ＰＣＲ、ＳＡＰ、伸長、および捕捉を、前に概説されるように実行した。鋳型相補体、ビオチン−ｄｄＵＴＰは、伸長反応において使用した唯一のヌクレオチドとした。競合因子オリゴヌクレオチド鋳型濃度は、およそ６０，０００分子〜およそ３０分子に連続希釈した。希釈はそれぞれ、６回反復した。すべての反応について、伸長オリゴヌクレオチドの１ｕＭ溶液の１ｕｌを使用した。評価したビーズは、Ｄｙｎａｌ Ｍ２７０、Ｄｙｎａｌ Ｃ１、およびＳｏｌｕｌｉｎｋとした。以前の研究において用いられるのと同じ戦略を使用して、それぞれのビーズの結合性能を解明するために、１ｕＭ定量オリゴヌクレオチド溶液の１ｕｌを、ビオチン捕捉後に溶出剤に添加した。
この評価の結果は、Ｄｙｎａｌ Ｃ１が、すべての鋳型濃度で、ＳｏｌｕｌｉｎｋおよびＭ２７０の両方より性能が優れていることを実証した。Ｍ２７０は、いかなる産物をも捕捉しなかった。Ｄｙｎａｌ Ｃ１については、測定値として高さまたは面積のいずれかを使用する定量オリゴヌクレオチドに対する伸長産物の比における緩やかな低下が、それがインプット量に関係したように観察された。この同じ関係は、Ｓｏｌｕｌｉｎｋにより観察されず、捕捉の限界を示唆した。この実験についてのデータは、図３３および図３４において見ることができる。
ゲノムバリアント（すなわちゲノムミックスモデル）
プロセスの確立のために本質的な成分および手順により、開発を実際のサンプルに移した。モデル系は、以前の検証（Ｏｎｃｏｃａｒｔａ検証）において十分に特徴付けられたサンプルおよびアッセイを使用して開発した。使用した遺伝材料は、ＡＴＣＣから市販で入手可能であり、体細胞変異体を持つことが公知である。サンプルＨＴＢ−２６Ｄ（乳腺癌（ｂｒｅａｓｔ ａｄｅｎｏｍｃａｒｃｉｎｏｍａ）に由来する細胞株のゲノムＤＮＡ）は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）コード領域に変異体を持つ。具体的には、このサンプルは、以前に、ＢＲＡＦ−２において体細胞変異体を示した（野生型−Ｇ；変異体−Ｔ）。このサンプルは、３０％が変異体であることが特徴付けられた。サンプルＨＴＢ−３８Ｄ（結腸直腸腺癌に由来する細胞株のゲノムＤＮＡ）もまた、ＢＲＡＦ領域に変異体を持つ。このサンプルは、以前に、ＢＲＡＦ−１５において変異体を示した（野生型−Ｔ；変異体−Ａ）。このサンプルは、１５％が変異体であることが特徴付けられた。ＨＴＢ−２６Ｄは、ＢＲＡＦ−１５について野生型であり、ＨＴＢ−３８Ｄは、ＢＲＡＦ−２について野生型である。
遺伝材料を得る容易性をしのぐ、これらのアッセイおよびサンプルの選択についての１つの論理的根拠は、含まれる特異的な遺伝子型であった。ビオチン−ｄｄＣＴＰおよびビオチン−ｄｄＴＴＰは、１Ｄａの質量によってのみ分離される。この質量差は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器の分解能の範囲内にあるが、産物の間のより大きな質量差を評価した。続いて、異なるベンダーが、１６炭素リンカー（対オリジナルのセットの１１炭素リンカー）を有するビオチン−ｄｄＵＴＰを提供することが分かった。このアッセイにおける１６炭素リンカーとの１１炭素リンカーの交換は、あらゆる可能性のある設計の問題を軽減した。
このモデル系における感度を評価するために、２つのサンプルは、混合し、それぞれの対応する体細胞変異体をさらに希釈した。２つのサンプルを様々な比で混合し、３０％〜１．５％までサンプル２６ＤについてＢＲＡＦ−２における体細胞変異体を滴定し、サンプル３８Ｄについて１５％〜０．７５％までＢＲＡＦ−１５バリアントを滴定した。滴定ポイントについて、それぞれ、二通り実行し、ＳＡＰの後に再び組み合わせた。混合した分析物は、２つの異なる反応に再分配した。反応のうちの１つは、４つのビオチン−ｄｄＮＴＰすべてに供し、他方は、ビオチン−ｄｄＵＴＰ（ＢＲＡＦ−２について）およびビオチン−ｄｄＡＴＰ（ＢＲＡＦ−１５について）だけを使用した。捕捉および溶出は、Ｄｙｎａｌ−Ｃ１ビーズおよび遊離ビオチン競合により実行した。図３５は、これらの４つのシナリオについての結果を示す。
ＢＲＡＦ−２変異体は、４つのビオチン−ｄｄＮＴＰすべてを用いて実行した反応においてわずかな信号を示した（左上のパネル、図３５）。通常、この種の信号は、ベースライン雑音を超えて有意であると考えられなかった。ビオチン−ｄｄＵＴＰだけ（ＢＲＡＦ−２反応について、図３５の左下）を用いると、非常に明確で異なる信号が、変異体について観察された。この同様の観察は、サンプル３８ＤについてのＢＲＡＦ−１５アッセイにおける０．７５％の変異体について該当した。ビオチン−ｄｄＡＴＰのみ（図３５の右下）が伸長組成物中に含まれた場合、非常に明確で異なる信号が、ＢＲＡＦ−１５変異体について観察された。このデータは、より豊富な野生型配列に対応するビオチン−ｄｄＮＴＰを排除することによる、信号対雑音比（ＳＮＲ）の有意な増加を実証した。ＢＲＡＦ−１５の場合には、４つすべてのビオチン−ｄｄＮＴＰを伸長反応に含めた場合、反応において変異体について観察された信号はなかった（右上パネル、図３５）。
低度の存在量のバリアントの検出および定量化
いくつかの実施形態において、野生型（たとえば高度な存在量の種）伸長産物が生成されないアッセイにおいて存在する標的変異体バリアント（たとえば低度な存在量のバリアント）の分子の量が、伸長反応において含まれる合成鋳型の使用によって決定される。この評価の最初の目的は、高感度のレベルで、混合物中のマイナーな寄与（すなわち低度の存在量の変異体の）を確実に検出する能力を評価することであった。ここで要約されるポストＰＣＲ濃縮戦略よって、この能力が、野生型（たとえば高度な存在量の種）伸長産物を有効に除去することによって可能であることを決定する。鋳型のインプット量が既知である場合、アッセイ（たとえば伸長反応）において存在する標的変異体分子（すなわち変異体伸長産物）の量（たとえばコピー数、濃度、パーセンテージ）を決定することが可能である。サンプルにおける標的変異体バリアント（すなわち突然バリアント伸長産物）の量（たとえばコピー数、濃度、パーセンテージ）および／または標的変異体バリアントのパーセンテージは、伸長反応における合成鋳型の既知量を含めることによって定量化される。合成鋳型は、オリゴヌクレオチド種にハイブリダイズすることができ、伸長されることとなるオリゴヌクレオチド種の３’側のすぐのところに位置する変異体位置に塩基置換を含有することができる。塩基置換は、野生型または標的変異体バリアント（たとえば第１のバリアント、低度な存在量のバリアント、ＳＮＰ）と異なる。合成鋳型中に存在する塩基置換は、合成鋳型の導入前にサンプル中に存在しない。合成鋳型における塩基置換に相補的なｄｄＮＴＰもまた、反応の中に導入される。標的変異体バリアントにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種は、合成鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド種と同時に増幅される（たとえば、同時に伸長する）。合成鋳型の段階希釈溶液を含む複数の反応を実行することによって、標的変異体バリアントの量および／またはパーセンテージを確かめることができる。標的変異体バリアントの量および／またはパーセンテージは、標的変異体バリアントと等しい伸長産物を産出する合成鋳型の量によって決定される。
変異体の定量は、記載されるように、ゲノムミックスモデルに対して実行した。５、１、０．５、および０．１の一定の変異体パーセンテージで、合成鋳型滴定を適用し、合計２０ｎｇのインプットＤＮＡを示す理論的な数の分子を標的した。結果は、５および１％のサンプルについて変異体分子の正確なカウントを示した。プロセスは、推測上、限られた鋳型によるＰＣＲサンプリングバイアスにより、より低度のレベルでは、同様に正確ではなかった。図３６は、１％の変異体についての滴定プロファイルを示す。
結論
野生型伸長産物の排除は、本明細書において開示されるマルチプレックスアッセイの感度を増加させることができる。いくつかの実施形態において、同じプレックスのアッセイが、同じ野生型遺伝子型を有するかまたは同じ変異体遺伝子型を有する。いくつかの実施形態において、健康な集団のゲノムＤＮＡに対して設計された「変異体」を有する合成鋳型またはプラスミド構築物（すなわちＨＡＰＭＡＰコンソーシアムサンプル）を使用することができる。この戦略は、設計の課題を軽減することができ、同じプレックスについて様々なアッセイにおいて様々な変異体パーセンテージを人工的に生成するという異なる利点を有することができる（競合因子のみ）。いくつかの実施形態において、合成鋳型（たとえばプラスミドまたはオリゴヌクレオチド鋳型）が、コントロールとして使用される。いくつかの実施形態において、合成鋳型（たとえばプラスミドまたはオリゴヌクレオチド鋳型）が、キット中に含まれる。
いくつかの実施形態において、設計が、野生型（すなわちより豊富な）ヌクレオチドに適合される。この方法において、１つのプレックスにおけるアッセイはすべて、野生型について同じヌクレオチドを共有し、使用される伸長ミックスは、このヌクレオチドを除外する。いくつかの実施形態において、設計を、変異体に適合させることができる。いくつかの実施形態において、プレックスにおけるアッセイがすべて、共通して同じ変異体塩基を有する。ある実施形態において、伸長ミックスが、変異体塩基のみを含有する。いくつかの実施形態において、圧倒的なバックグラウンド野生型ＤＮＡとの非特異的相互作用の危険性がある。いくつかの実施形態において、選ばれる設計スタイルに依存して、除去されるそれぞれの野生型塩基または残されるそれぞれの変異体塩基に相当する少なくとも１つのコントロールプレックスがあるべきである。
ワークフローの改善
記載されるプロセスは、自動化に適用可能である。自動化について考慮するための重要なステップは、ビーズ調整、ビーズ添加、ビーズ洗浄、および溶出産物の吸引とすることができる。
実施例１４：マルチプレックスアッセイおよびキットを使用する「野生型」および「変異体」遺伝子型の検出
アッセイ設計
より高感度の検出の障害は、低レベルの変異体がベースラインを超えてもはや目に見えないポイントまで強度をスケーリングする野生型ピークの存在であった。検出からの野生型ピークの除去により、感度および信号対雑音比は改善された。シングルプレックス内で設計されるアッセイは、対応する野生型塩基と共通する同じ野生型ピークを伸長反応から除去するかまたはその特異的な塩基のみと共通する同じ変異体ピークを伸長反応において含むように設計される（表１１）。材料費の点では、伸長反応において使用される１つの塩基のみで変異体対立遺伝子に対して向けられるプレックスを選ぶ戦略が、モデル系に使用される。
マルチプレックス（すなわちプレックス（単数形））設計を３つのクラスのアッセイに分ける。３つのクラスは、野生型として他の３つのヌクレオチドのそれぞれに相当する。４つのマルチプレックスアッセイ（すなわちプレックス（複数形））は、異なる変異体塩基を標的にするそれぞれのプレックスを用いるこの論理的根拠を使用して設計される。このアッセイ設計戦略は、すべての可能な野生型／変異体の組み合わせの探索を可能にする。
設計は、肺パネル由来の６つの領域を組み込む。それぞれの設計された「変異体」は、すべての可能な野生型／変異体の組み合わせについての要件を促進するために、フォワードおよびリバース方向に調べた。設計は、あらゆる可能性のある、エキソヌクレアーゼ由来のさらなる信号を回避するように、伸長オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲプライマー由来のオーバーラップを回避する。モデル中に設計した変異体は、肺パネルにおいて使用される実際の体細胞変異体に相当する。マルチプレックスによる設計を表１２に概説する。４つのマルチプレックスを設計して、それらがまた、非環式伸長ミックスを使用して１つのプレックスにおいてともにマルチプレックス化することができるようにする。設計は、互いに領域を分離するＥｃｏＲＩ部位を組み込む（図３７）。モデルの使用に先立って、プラスミドは、領域を分離するようにおよびゲノムの状況をより十分に反映するようにＥｃｏＲＩ制限消化酵素により切断する。
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コントロール
プロセスのエレメントは、下流の分析についてのコントロールにつながる。産物捕捉の失敗は、限られた鋳型、ＰＣＲ／伸長の失敗、または捕捉および溶出の失敗によるものであり得る。これらの特定の変数による問題を評価するために、コントロールアッセイを、設計したそれぞれのプレックスに含める。設計したコントロールは、ヒトアルブミン遺伝子を標的にする。適切な機能のＰＣＲおよび伸長により十分に鋳型にされるコントロールが、それぞれの反応において示される。４つの別々の伸長オリゴヌクレオチドが、このコントロールについて意図される。これらの伸長オリゴヌクレオチドは、４つのヌクレオチドのそれぞれに相当する残基を標的にし、適切な伸長ヌクレオチドミックスと共に使用される。
伸長アッセイに続いて、３’逆位ｄＴＴＰを有する５’ビオチン化オリゴヌクレオチドが、捕捉および溶出のためのコントロールとしてすべてのアッセイに加えられる。任意の分析物の非存在と一致するこの信号の非存在は、捕捉および／または溶出の失敗をユーザに通知する。特定のこのコントロールのモル濃度は、検出においてあらゆる低レベルの変異体を隠してしまうのを回避するために反応を圧倒するべきでない。
溶出最適化
捕捉され、洗浄された産物は、１５ｕｌの高モルビオチン溶液の中に溶出される。１５ｕｌ溶出液について適切な高さでビーズをペレットにする新しい器材は、Ｍａｔｒｉｘ ＰｌａｔｅＭａｔｅ ２Ｘ２および／またはＥｐｉｍｏｔｉｏｎ ５０７５を使用して、プロセスに対して最適化される。滴定実験を使用して、新しいプレートの性能を評価する。プロセスの試験として、この評価は、捕捉コントロールのそれぞれの希釈液に対して三通り行われる。捕捉コントロールは、ｉＰＬＥＸ様の溶液の中に加えられる。試験溶液は、器材を使用して、典型的な伸長後プロセスを受ける。
ＰｌａｔｅＭａｔｅについての自動化調節は、溶出実験前に行われる。滴定は、２５００分子からおよそ１分子のインプット捕捉オリゴヌクレオチドをもたらす１２ステップの段階希釈を包含する。新しい器材による方法は、ビーズの損失を伴うことなく洗浄の間にペレットを維持するための能力について最適化される。最終的に、性能は、捕捉オリゴヌクレオチドの検出によって実証される感度によって判断される。
品質管理
４つのマルチプレックスは、プラスミドのみに対して、非環式伸長ミックスを使用して、典型的なｉＰＬＥＸプロセスにより最初に実行される。これは、プラスミド製造についての品質の測定として実行される。制限消化酵素もまた、最適化され、構成成分断片への完全な消化作用を確実にするためにアガロースゲルにおいて可視化される。
捕捉コントロール最適化
捕捉コントロールのどの濃度が続く実験に適切かを決定するために最初に実験する。このコントロールは、変異体がなく、そのため伸長ピークがない反応について有用である。この状況において、ピークの非存在が、伸長産物を生成するのに十分な鋳型がないという結果であるかまたは捕捉もしくは溶出の失敗であるかどうかを決定することが必要である。プラスミドの滴定は、四通り、実行される。それぞれの反復実験について、異なる濃度の捕捉オリゴヌクレオチドが、使用される。プラスミドの滴定は、５０％の変異体〜０．０１％の変異体および変異体なしの反応の８つの希釈液による感度実験を反映する。使用される捕捉コントロールの最も低度の濃度が、溶出最適化実験から決定される。この濃度は、１つの反復実験についてインプットとして、他の３つの反復実験について倍加濃度として使用される。捕捉コントロールの性能は、変異体アッセイ検出が捕捉コントロールピークの存在によってどのように達成されるかによって評価される。ピークは、スペクトルにおいて優勢でありすぎることによって、低レベルの変異体を不明瞭にするべきでない。しかしながら、捕捉コントロールピークは、低レベルの変異体濃度ではっきりと検出されなければならない。この実験の発見は、続く感度、特異性、およびコンコーダンスアッセイにおける捕捉コントロール濃度についての根拠となる。オリゴヌクレオチドが伸長反応に関与しないので、３’逆位ｄＴは、これらの反応に必要ではない。しかしながら、コントロールは、伸長反応自体にコントロールの組み込みを可能にするようにこのように設計される。
感度および特異性
プロセスの感度閾値の確立は、ヒトＤＮＡに対するプラスミドＤＮＡを滴定することを含む。感度閾値は、変異体分析物が検出可能でなくなった場合にまたはバリアントの単一のコピーが少数の鋳型に使用されるポイントまで決定される。混合物の様々な希釈液が、使用される。鋳型変異体分子の数は、１５０００、３７５０、９３８、２３５、５９、１５、４、および０とする。野生型コピーのそれぞれの数は、１５０００、２６２５０、２９０６２、２９７６５、２９９４１、２９９８５、２９９９６、および３００００とする。組み合わせると、これらの８つの混合物は、５０％、１２．５％、３．１３％、０．７８％、０．２％、０．０５％、０．０１％、および０％の変異体濃度をそれぞれ示す。鋳型の合計は、９０ｎｇ／ｒｘｎまたは３０，０００ゲノムコピーである。それぞれのプレックスのすべての希釈液は、４８の反復実験により実行される。それぞれのマルチプレックスについての４８の非鋳型反応を実行する余剰の２枚のプレートは、非特異的相互作用の程度を評価するためにコントロールとして実行される。さらに、５０％の変異体および１２．５％の変異体を使用して二通り実行される４８のサンプルの「ゴールデンスタンダード（ｇｏｌｄｅｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）」プレートは、用いられている適切な比を確立する。全体で、感度および特異性のトライアルは、１９の９６ウェルプレートを必要とする。ＰＣＲおよびＳＡＰは、最新のｉＰＬＥＸプロトコールに従って実行される。ＳＡＰ後の反応は、代わりとなる終結ヌクレオチド基質としてビオチン−ｄｄＮＴＰを含有する伸長反応に供される（「ゴールデンスタンダードプレート」以外）。他のすべての反応成分は同じとする。表１３は、それぞれの構成成分ＤＮＡの分子数および重量の点からモデル系希釈構成を示す。表１４および表１５は、反応当たりのそれぞれの成分についての濃度におけるＰＣＲから伸長までの全プロセスを列挙する。
最初の分析は、統計的に有意な感度閾値を確立するためには、どのポイントで信号が観察されなくなるかを考慮する。この分析は、すべてのマルチプレックスを包含する全体的なデータを考慮し、また、特異的な塩基を伸長させる場合に生じ得る変動性および野生型バックグラウンド遺伝子型が、もしあれば、伸長の成功に対してどのような影響を有するのかをも考慮に入れる。この分析によって、感度が特異性に対してどのように効果が有するかを評価する。
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コンコーダンス
コンコーダンス分析は、感度および特異性の実験から収集されたデータを考慮する。反復実験はすべて、それぞれの実験内の一致および実験を介した一致について測られる。「ゴールデンスタンダード遺伝子型」は、モデル系の品質管理においてモデル系自体を実行することによって確立される。
コンコーダンスのさらなる測定は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって提供されるサンプルにより実行される。Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、遺伝的に明確なｇＤＮＡおよびＦＦＰＥ細胞参照標準を提供する。評価は、調製されたＦＦＰＥであるわずか２３のサンプルしか考慮しない。８〜１５の変異体が、Ｈｏｒｉｚｏｎによって調製されたリストから選択される。検出系の能力を探索するために、選択される変異体を、対応する野生型バージョンと共に購入するかまたは健康な集団サンプルと社内で混合する。Ｈｏｒｉｚｏｎによって提供されるサンプルは、５０％変異体の状態であり、この関連において高感度の検出を評価するために希釈が必要とされる。希釈系列は、感度および特異性の評価において利用されるものと同じとする。さらに、非鋳型コントロールを実行し、合計サンプル数を２４にする。サンプルはすべて、合計８つの９６ウェルプレートについて四通り実行する。この実験設計は、希釈なしのＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃサンプルを使用するｉＰＬＥＸ「ゴールデンスタンダード」を含むであろう。この評価は、従来のｉＰＬＥＸに対するコンコーダンスをさらに評価するだけではなく、実際のＦＦＰＥサンプルの性能についての情報をも与える。
コントロール変数
前濃縮プロセシング：反応はすべて、伸長ステップまでｉＰＬＥＸ ＳＯＰに従って実行する。これらのプロセスは、表１４および表１５において詳述される。試薬の同じロットが研究にわたって使用されるように、使用される試薬はすべて、制御される。
ビーズプロセシング：調整、洗浄、および溶出ステップは、信頼できる系をもたらすために他の研究から確立した。溶出戦略が前試験段階から決められた後、定められたプロトコールが、すべての続いて起こる実験について使用される。
サンプルＤＮＡ：３つの供給源に由来するＤＮＡを、すべての研究に使用する。第１のものは、モデル系を含有するプラスミドＤＮＡである。第２は、ヨーロッパの家系のユタ州の住民由来のＨａｐＭａｐサンプルである。最後は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって提供されたＤＮＡである。
機器：プレおよびポストＰＣＲ機器は、ＰｌａｔｅＭａｔｅ ２Ｘ２および／またはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ４０００を含む。ナノ分注は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ ＲＳ１０００で実行し、分析物の検出は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ａｎａｌｙｚｅｒ ４を使用する。機器シリアル番号はすべて、カタログに掲載されている。
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反応変数
この試験計画において用いられる実験は、いくつかのパラメータについて評価される。コントロール変数は、いくつかのパラメータに対して潜在的な影響を有する。信頼でき、望ましい結果を達成するプロセスの能力が、評価される。コントロール変数によって確実に確かめることができる反応変数に対するあらゆる関係が、説明される。
・ピークの高さ
・ピーク信頼スコア
・予想される遺伝子型
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ビーズプロセス
ビーズは、２×結合バッファー中で調整し、最終容量の２５ｕｌの調整ビーズを、９ｕｌ伸長反応液に添加する。水を添加し、全容量を５０ｕｌにする。ビーズ捕捉は、容量に適応させるために９６ウェルプレート中で実行する。伸長産物の捕捉は、３０分間、室温で、ヘマトロジーローテータ（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｒｏｔａｔｏｒ）上で実行する。捕捉の後に、ビーズは、１×Ｔｒｉｓ緩衝液中で反応成分を洗浄する。この洗浄は、合計２回の洗浄について繰り返す。その後、ビーズは、水により洗浄する。水による洗浄は、合計２回以上の洗浄についてさらに繰り返す。洗浄ステップはそれぞれ、１００ｕｌ全容量を利用する。９６ウェルプレート磁石を使用して、ビーズをペレットにする。洗浄ステップは、手動でまたは自動化の使用を通して行うことができる。洗浄されたビーズは、１５ｕｌの濃縮遊離ビオチン溶液（２５ｎｇ／ｕｌ；処理した樹脂）中に再懸濁する。遊離ビオチンを、５分間、９０℃で、ビオチン化伸長産物と競合させる。１５ｕｌ再懸濁液のうち、１０ｕｌを吸引し、ビーズを磁石下でペレットにする。この１０ｕｌのきれいな溶出剤は、分注のために３８４ウェルプレート中に分注する。ビーズ調整および洗浄パラメータを、表１６に示す。
分注パラメータは、容量の高さおよび分析物の特徴が与えられた、典型的な分注プロトコールに対していくつかの改変を必要とする。吸引オフセットは、８ｍｍに設定し、分注速度は、典型的なｉＰＬＥＸ生化学から、この分析物における粘性差について説明するおよそ１５０ｍｍ／秒または他のより高速な分注速度に変更する。
実施例１５：実施形態の非限定的な例
本技術のある実施形態の非限定的な例を、以下に提供する。
Ａ１．組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が
（ａ）増幅条件下で、標的核酸またはその一部分を増幅することによって、標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中のアンプリコンを接触させるステップであって、セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含むステップ、
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、捕捉剤を含むステップ、
（ｄ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
（ｅ）競合因子との競合によって、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される、方法。
Ａ１．１．（ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能な程度に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する、実施形態Ａ１の方法。
Ａ１．２．組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が
（ａ）増幅条件下で、標的核酸またはその一部分を増幅することによって、標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中のアンプリコンを接触させるステップであって、
（ｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含み、
（ｉｉ）セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、
（ｉｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、かつ
（ｉｖ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応するステップ、
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、捕捉剤を含むステップ、
（ｄ）捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、固相と伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
（ｅ）競合因子との競合によって、固相から、固相と相互作用した伸長オリゴヌクレオチドと会合した、質量による識別が可能なタグを放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された、質量による識別が可能なタグを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される、方法。
Ａ２．
競合因子との競合が、競合因子と固相を接触させることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．２のいずれか一項に記載の方法。
Ａ３．競合因子が、遊離した捕捉剤またはその競合断片もしくは多量体からなる、実施形態Ａ１〜Ａ２のいずれか一項に記載の方法。
Ａ３．１．競合因子が、遊離した捕捉剤からなる、実施形態Ａ３に記載の方法。
Ａ４．捕捉剤を含むヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸にコンジュゲートされた捕捉剤である、実施形態Ａ１〜Ａ３．１のいずれか一項に記載の方法。
Ａ５．ヌクレオチド三リン酸が、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である、実施形態Ａ４に記載の方法。
Ａ６．捕捉剤が、結合ペアのメンバーを含む、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれか一項に記載の方法。
Ａ７．捕捉剤が、ビオチンを含む、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれか一項に記載の方法。
Ａ８．固相が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ９．捕捉剤が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれか一項に記載方法。
Ａ１０．固相が、ビオチンを含む、実施形態Ａ９に記載の方法。
Ａ１１．遊離した捕捉剤との競合による、質量による識別が可能なタグの放出が、上昇した温度条件下で実行される、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか一項に記載の方法。
Ａ１２．上昇した温度条件が、約５分間の、摂氏約９０度での処理を含む、実施形態Ａ１１に記載の方法。
Ａ１３．（ｃ）が、１つの容器において実行され、方法が、放出された、質量による識別が可能なタグを、（ｅ）および（ｆ）の間に、他の容器に移動させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれか一項に記載の方法。
Ａ１４．（ａ）において産生されたアンプリコンを含有する溶液が、アンプリコンの中に組み込まれないあらゆるヌクレオチドから末端のリン酸を除去する作用物質により処理される、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか一項に記載の方法。
Ａ１５．末端のリン酸が、ホスファターゼと溶液を接触させることによって除去される、実施形態Ａ１〜Ａ１４のいずれか一項に記載の方法。
Ａ１６．ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである、実施形態Ａ１５に記載の方法。
Ａ１７．アルカリホスファターゼが、シュリンプアルカリホスファターゼである、実施形態Ａ１６に記載の方法。
Ａ１８．伸長オリゴヌクレオチドにおける末端のヌクレオチドが、捕捉剤を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか一項に記載の方法。
Ａ１９．伸長オリゴヌクレオチドにおける１つ以上の非末端ヌクレオチドが、捕捉剤を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２０．ハイブリダイゼーション配列が、約５〜約２００ヌクレオチド長である、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２１．固相が、平らな表面、ビーズ、シリコンチップ、または前述のものの組み合わせから選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２２．固相が、常磁性である、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２３．質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析法である、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２４．質量分析法が、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法である、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２５．約１〜約５０以上の標的核酸の存在または非存在が、検出される、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２６．質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２７．質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドコンポマーである、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか一項に記載の方法。
Ａ２８．ヌクレオチドコンポマーが、約５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長である、実施形態Ａ２７に記載の方法。
Ａ２９．標的核酸が、ゲノムＤＮＡである、実施形態Ａ１〜Ａ２８のいずれか一項に記載の方法。
Ａ３０．ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡである、実施形態Ａ２９に記載の方法。
Ａ３１．（ｆ）における検出が、放出が競合因子との競合を含まない方法についての信号対雑音比よりも大きい信号対雑音比を含む、実施形態Ａ１〜Ａ３０のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ１．組成物における複数の遺伝的バリアントの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、該方法が
（ａ）複数の標的核酸種またはその一部分に由来する複数のアンプリコンを調製するステップであって、それぞれの標的核酸種が、第１のバリアントおよび第２のバリアントを含むステップ、
（ｂ）オリゴヌクレオチド種にアンプリコンをハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種に由来するアンプリコンにハイブリダイズし、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を生成するステップ、ならびに
（ｃ）伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップであって、
（ｉ）１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、
（ｉｉ）第１のバリアントにハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、第２のバリアントにハイブリダイズするハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成するステップ、
（ｄ）捕捉剤を捕捉する固相に伸長オリゴヌクレオチド種を捕捉するステップ、
（ｅ）固相から、（ｄ）において固相に結合した伸長オリゴヌクレオチド種を放出させるステップ、ならびに
（ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において固相から放出されたそれぞれの伸長オリゴヌクレオチド種の質量を検出するステップを含み、それによって、遺伝的バリアントの存在、非存在、または量が、検出される、方法。
Ｂ２．それぞれのオリゴヌクレオチド種が、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含む、実施形態１に記載の方法。
Ｂ３．第１のバリアントが、より低度の存在量のバリエーションであり、第２のバリアントが、より高度な存在量のバリエーションである、実施形態１または２に記載の方法。
Ｂ４．遺伝的バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアントであり、第１のバリアントが、より低度の存在量の対立遺伝子であり、第２のバリアントが、より高度な存在量の対立遺伝子である、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ５．１つ以上の終結ヌクレオチドが、１つの終結ヌクレオチドからなる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ６．１つ以上の終結ヌクレオチドが、２つの終結ヌクレオチドからなる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ７．１つ以上の終結ヌクレオチドが、３つの終結ヌクレオチドからなる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ８．１つ以上の終結ヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから独立して選択される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ９．伸長組成物が、非終結ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ１０．伸長組成物が、１つ以上の伸長ヌクレオチドを含み、この伸長ヌクレオチドが、捕捉剤を含まない、実施形態９に記載の方法。
Ｂ１１．伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、放出剤との固相の接触を含む、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ１２．捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体を含み、固相が、ストレプトアビジンを含み、かつ放出剤が、遊離したビオチンまたはビオチン類似体を含む、実施形態１１に記載の方法。
Ｂ１３．放出剤が、固相に対して捕捉剤よりも高い親和性を有する、実施形態１１または１２に記載の方法。
Ｂ１４．（ｅ）における伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約３０℃〜約１００℃の加熱を含む、実施形態１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ１５．約６０℃〜約１００℃の加熱を含む、実施形態１４に記載の方法。
Ｂ１６．約８９℃〜約１００℃の加熱を含む、実施形態１４に記載の方法。
Ｂ１７．約９０℃までの加熱を含む、実施形態１４に記載の方法。
Ｂ１８．複数の標的核酸種が、２０以上の標的核酸種である、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ１９．複数の標的核酸種が、２００以上の標的核酸種である、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２０．複数の標的核酸種が、２００〜３００の標的核酸種である、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２１．（ｃ）における伸長条件が、２０〜３００回のサイクリングを含む、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２２．（ｃ）における伸長条件が、２００〜３００回のサイクリングを含む、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２３．伸長反応が、競合因子オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２４．伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後に、固相を洗浄することを含む、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２５．洗浄が、質量分析法分析において妨害付加生成物を産生する塩を除去する、Ｂ２４に記載の実施形態。
Ｂ２６．伸長オリゴヌクレオチドが、イオン交換樹脂と接触されない、Ｂ２５に記載の実施形態。
Ｂ２７．（ｆ）における検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音比よりも大きな信号対雑音比によるものである、実施形態Ｂ１〜Ｂ２６のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２８．変異体対立遺伝子のみの伸長についての信号対雑音比が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についての信号対雑音比よりも大きい、実施形態Ｂ１〜Ｂ２７のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ２９．（ｆ）において変異体対立遺伝子を検出する感度が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についてよりも、変異体対立遺伝子のみの伸長について、大きい、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ３０．第２のバリアントの伸長オリゴヌクレオチド種が、検出されない、実施形態Ｂ１〜Ｂ２９のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ３１．遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、実施形態Ｂ１２〜Ｂ３０のいずれか一項に記載の方法。
Ｂ３２．遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、Ｂ３１に記載の実施形態。
Ｂ３３．組成物が、合成鋳型を含み、組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが、決定され、合成鋳型が、第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか一項に記載の方法。
＊＊＊
本明細書において本明細書によって参照されるそれぞれの特許、特許出願、刊行物、および文書の全体は、参照によって組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物、および文献の引用は、前述のもののうちのいずれかが先行技術に関連していることを許可するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文献の内容または日付に関していかなる許可も構成しない。
改良は、本技術の基礎的な側面から逸脱することなく、前述のものに対して行われてもよい。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に関して実質的に具体的に記載されたが、当業者らは、本出願において具体的に開示される実施形態に対して変更がなされてもよいが、これらの改良および改善が、本技術の範囲および精神内にあることを認識するであろう。
本明細書において適切に説明的に記載された技術は、本明細書において具体的に開示されない任意のエレメント（複数可）の非存在下において実施されて得る。したがって、たとえば、本明細書におけるそれぞれの実例において、用語「含む」、「〜から本質的になる」、および「〜からなる」のうちのいずれも、他の２つの用語のどちらかと交換されてもよい。用いられる用語および表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示され、記載される特徴またはその一部分のいかなる等価物をも排除せず、様々な変更が、主張される本技術の範囲内で可能である。用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントのいずれかが記載されていることが、文脈的に明確でない限り、１つのまたは複数の、それが修飾するエレメントを指すことができる（たとえば、「試薬」は、１つ以上の試薬を意味することができる）。本明細書において使用される用語「約」は、基礎をなすパラメータの１０％以内の値を指し（すなわち１０％プラスまたはマイナス）、一連の値の初めの用語「約」の使用は、それぞれの値を修飾する（すなわち、「約１、２、および３」は、約１、約２、および約３である）。たとえば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含むことができる。したがって、本発明の技術が、代表的な実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されるが、本明細書において開示されるコンセプトの変更および変形が、当業者らによって行われてもよく、そのような変更および変形は、本技術の範囲内にあると考えられることが理解されたい。
本技術の実施形態は、続く請求項（複数可）において記載される。

Claims (67)

  1. 組成物における複数の遺伝的バリアントの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、該方法が
    （ａ）複数の標的核酸種またはその一部分に由来する複数のアンプリコンを調製するステップであって、それぞれの標的核酸種が、第１のバリアントおよび第２のバリアントを含むステップ、
    （ｂ）オリゴヌクレオチド種に該アンプリコンをハイブリダイズさせるステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、標的核酸種に由来するアンプリコンにハイブリダイズし、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を生成するステップ、ならびに
    （ｃ）伸長条件下で、１つ以上の終結ヌクレオチドを含む伸長組成物と、該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種を接触させるステップであって、
    （ｉ）該１つ以上の終結ヌクレオチドの少なくとも１つが、捕捉剤を含み、
    （ｉｉ）該第１のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長され、該第２のバリアントにハイブリダイズする該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド種が、終結ヌクレオチドによって伸長されず、それによって、伸長オリゴヌクレオチド種を生成するステップ、
    （ｄ）該捕捉剤を捕捉する固相に該伸長オリゴヌクレオチド種を捕捉するステップ、
    （ｅ）該固相から、（ｄ）において該固相に結合した該伸長オリゴヌクレオチド種を放出させるステップ、ならびに
    （ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において該固相から放出されたそれぞれの伸長オリゴヌクレオチド種の質量を検出するステップを含み、それによって、該遺伝的バリアントの存在、非存在、または量が、検出される、方法。
  2. それぞれのオリゴヌクレオチド種が、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１のバリアントが、より低度の存在量のバリエーションであり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量のバリエーションである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記遺伝的バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアントであり、前記第１のバリアントが、より低度の存在量の対立遺伝子であり、前記第２のバリアントが、より高度な存在量の対立遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、１つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、２つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、３つの終結ヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記１つ以上の終結ヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから独立して選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記伸長組成物が、非終結ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記伸長組成物が、１つ以上の伸長ヌクレオチドを含み、該伸長ヌクレオチドが、捕捉剤を含まない、請求項９に記載の方法。
  11. 前記伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、放出剤との該固相の接触を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記捕捉剤が、ビオチンまたはビオチン類似体を含み、該固相が、ストレプトアビジンを含み、かつ該放出剤が、遊離したビオチンまたはビオチン類似体を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記放出剤が、該固相に対して前記捕捉剤よりも高い親和性を有する、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. （ｅ）における前記伸長オリゴヌクレオチド種の放出が、約３０℃〜約１００℃の加熱を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 約６０℃〜約１００℃の加熱を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 約８９℃〜約１００℃の加熱を含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 約９０℃までの加熱を含む、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記複数の標的核酸種が、２０以上の標的核酸種である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記複数の標的核酸種が、２００以上の標的核酸種である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記複数の標的核酸種が、２００〜３００の標的核酸種である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. （ｃ）における伸長条件が、２０〜３００回のサイクリングを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. （ｃ）における伸長条件が、２００〜３００回のサイクリングを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  23. 該伸長反応が、競合因子オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記伸長オリゴヌクレオチド種が捕捉された後に、該固相を洗浄することを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 該洗浄が、質量分析法分析において妨害付加生成物を産生する塩を除去する、２４に記載の請求項。
  26. 伸長オリゴヌクレオチドが、イオン交換樹脂と接触されない、２５に記載の請求項。
  27. （ｆ）における検出が、競合因子との競合を伴わない放出後の検出についての信号対雑音比よりも大きな信号対雑音比によるものである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 変異体対立遺伝子のみの伸長についての信号対雑音比が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についての信号対雑音比よりも大きい、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. （ｆ）において変異体対立遺伝子を検出する感度が、野生型および変異体対立遺伝子の伸長についてよりも、変異体対立遺伝子のみの伸長について大きい、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第２のバリアントの前記伸長オリゴヌクレオチド種が、検出されない、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約１０〜約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、請求項１２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記遊離したビオチンまたはビオチン類似体が、約２５ｕｇ／ｍｌの濃度で添加される、３１に記載の請求項。
  33. 前記組成物が、合成鋳型を含み、前記組成物における第１のバリアントの量および／またはパーセンテージが決定され、該合成鋳型が、該第１のバリアントおよび第２のバリアントと異なるバリアントを含み、同じオリゴヌクレオチド種にハイブリダイズする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が、
    （ａ）増幅条件下で、該標的核酸またはその一部分を増幅することによって、該標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中の該アンプリコンを接触させるステップであって、該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、該アンプリコンが溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含む、ステップ、
    （ｃ）１つ以上のヌクレオチドによって、該アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、該１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、該捕捉剤を含むステップ、
    （ｄ）該捕捉剤が固相と相互作用する条件下で、該固相と該伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
    （ｅ）競合因子との競合によって、該固相と相互作用した該伸長オリゴヌクレオチドを放出させるステップ、ならびに
    （ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された該伸長オリゴヌクレオチドを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する伸長オリゴヌクレオチドの存在または非存在によって決定される、方法。
  35. （ｉ）１つのオリゴヌクレオチド種の質量が、該セットにおける他のオリゴヌクレオチド種の質量と検出可能に異なり、（ｉｉ）それぞれのオリゴヌクレオチド種が、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応する、請求項３０に記載の方法。
  36. 組成物における、複数の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法が、
    （ａ）増幅条件下で、該標的核酸またはその一部分を増幅することによって、該標的核酸のアンプリコンを調製するステップ、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドのセットと溶液中の該アンプリコンを接触させるステップであって、
    （ｉ）該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、該アンプリコンが該溶液中に存在する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で１つのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション配列を含み、
    （ｉｉ）該セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列の５’に位置する、質量による識別が可能なタグを含み、
    （ｉｉｉ）１つのオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量が、該セットにおける他のオリゴヌクレオチドの質量による識別が可能なタグの質量と検出可能な程度に異なり、かつ
    （ｉｖ）それぞれの質量による識別が可能なタグが、特異的なアンプリコンに特異的に対応し、それによって、特異的な標的核酸に特異的に対応するステップ、
    （ｃ）該アンプリコンにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを１つ以上のヌクレオチドによって伸長させることによって、捕捉剤を含む伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップであって、該１つ以上のヌクレオチドのうちの１つが、終結ヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドに添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上が、該捕捉剤を含むステップ、
    （ｄ）該捕捉剤が該固相と相互作用する条件下で、固相と該伸長オリゴヌクレオチドを接触させるステップ、
    （ｅ）競合因子との競合によって、該固相から、該固相と相互作用した該伸長オリゴヌクレオチドと会合した、該質量による識別が可能なタグを放出させるステップ、ならびに
    （ｆ）質量分析法によって、（ｅ）において放出された、該質量による識別が可能なタグを検出するステップを含み、それによって、それぞれの標的核酸の存在または非存在が、対応する、質量による識別が可能なタグの存在または非存在によって決定される、方法。
  37. 競合因子との競合が、競合因子と該固相を接触させることを含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記競合因子が、遊離した捕捉剤またはその競合断片もしくは多量体からなる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記競合因子が、遊離した捕捉剤からなる、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記捕捉剤を含む前記ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸にコンジュゲートされた捕捉剤である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ヌクレオチド三リン酸が、ジデオキシヌクレオチド三リン酸である、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記捕捉剤が、結合ペアのメンバーを含む、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記捕捉剤が、ビオチンを含む、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記固相が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記捕捉剤が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記固相が、ビオチンを含む、請求項１１に記載の方法。
  47. 遊離した捕捉剤との競合による、前記質量による識別が可能なタグの放出が、上昇した温度条件下で実行される、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記上昇した温度条件が、摂氏約９０度での約５分間の処理を含む、請求項４３に記載の方法。
  49. （ｃ）が、１つの容器において実行され、前記方法が、前記放出された、質量による識別が可能なタグを、（ｅ）と（ｆ）との間に、別の容器に移動させるステップをさらに含む、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  50. （ａ）において産生されたアンプリコンを含有する前記溶液が、該アンプリコンの中に組み込まれていないあらゆるヌクレオチドから末端のリン酸を除去する作用物質により処理される、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記末端のリン酸が、ホスファターゼと前記溶液を接触させることによって除去される、請求項３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである、請求項４７に記載の方法。
  53. 前記アルカリホスファターゼが、シュリンプアルカリホスファターゼである、請求項４８に記載の方法。
  54. 前記伸長オリゴヌクレオチドにおける末端のヌクレオチドが、前記捕捉剤を含む、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記伸長オリゴヌクレオチドにおける１つ以上の非末端ヌクレオチドが、前記捕捉剤を含む、請求項３０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ハイブリダイゼーション配列が、約５〜約２００ヌクレオチド長である、請求項３０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記固相が、平らな表面、ビーズ、シリコンチップ、または前述のものの組み合わせから選択される、請求項３０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記固相が、常磁性である、請求項３０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析法である、請求項３０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記質量分析法が、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法である、請求項３０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  61. 約１〜約５０以上の標的核酸の存在または非存在が、検出される、請求項３０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドからなる、請求項３０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記質量による識別が可能なタグが、ヌクレオチドコンポマーである、請求項３０〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ヌクレオチドコンポマーが、約５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長である、請求項５９に記載の方法。
  65. 前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡである、請求項３０〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡである、請求項６１に記載の方法。
  67. 前記放出ステップ（ｅ）が、競合因子との競合を含む場合、（ｆ）における前記検出が、競合因子との競合を含まない放出ステップと比較して、信号対雑音比における増加を含む、請求項３０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
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