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JP2014506240A - ナノ粒子組成物への放射性核種の封入 - Google Patents

ナノ粒子組成物への放射性核種の封入 Download PDF

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JP2014506240A JP2013543530A JP2013543530A JP2014506240A JP 2014506240 A JP2014506240 A JP 2014506240A JP 2013543530 A JP2013543530 A JP 2013543530A JP 2013543530 A JP2013543530 A JP 2013543530A JP 2014506240 A JP2014506240 A JP 2014506240A
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Abstract

本発明は、対象者における癌及びその他の疾患を診断するために有用な撮影用組成物に関連する技術分野に関する。特に、本発明は、銅同位体である61Ｃｕ及び64Ｃｕ等の放射性核種等の金属体が封入された新規なリポソーム組成物を含む診断用化合物に関する。また、本発明は、リポソーム組成物等の送達システムに放射性核種等の金属体を封入するための新規な方法並びにリポソームの癌性組織及びより一般的には血管からの出血を伴う病理学的症状等の標的部位の診断及び治療のための使用に関する。本発明は、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）を利用するための新規な診断ツール（手段）を提供する。

Description

本発明は、対象者における癌及びその他の疾患を診断するために有用な撮影用組成物に関連する技術分野に関する。特に、本発明は、銅同位体である61Ｃｕ及び64Ｃｕ等の放射性核種又は金属体が封入された新規なリポソーム組成物を含む診断用化合物に関する。また、本発明は、リポソーム組成物等の送達システムに放射性核種等の金属体を封入するための新規な方法並びに放射性核種等の金属体を含むリポソームの癌性組織及び通常は血管からの出血を伴う病理学的症状等の標的部位の診断及び治療のための使用に関する。本発明は、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）を利用するための新規な診断ツール（手段）を提供する。
リポソームは、カプセル化及び／又は膜内に封入された様々な診断又は治療物質を送達するベシクルとして機能することができる。通常、リポソームは、１以上の二重層の膜によって外部環境から分離された内部コアからなるナノベシクルである。二重層膜は、疎水性領域と親水性領域を含む合成又は天然脂質等の両親媒性分子によって形成することができる（非特許文献１）。また、二重層膜は、粒子（例えば、ポリマーソーム又はポリマー粒子）を構成する両親媒性ポリマーによって形成することもできる。
リポソームは、例えば、有用な特性を有するか、有用な活性をもたらす化合物又は放射性核種等の担体として機能することができる。この場合、リポソームは内部に所望の物質を含むように形成される。リポソームに封入された物質は、リポソームの内部コア又はリポソームの二重層内に位置するリポソーム膜の外側表面に結合させることができる。リポソーム内に放射性核種を封入するための方法としては、例えば、リポソーム形成後の表面標識（非特許文献２）、予め形成したリポソームの脂質二重層への標識の導入（非特許文献３）、脂質キレート剤複合体の導入による予め形成したリポソームの表面標識（非特許文献４〜５）、予め形成したリポソームへの水相封入（非特許文献６〜９）が知られている。予め形成したリポソームへの水相封入によるリポソーム内への物質の封入は、物質の「ｌｏａｄｉｎｇ」、「ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ」、「ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ」とも呼ばれる。
水相封入によるリポソーム内への物質の封入は、リポソーム内において物質が保護された位置に存在するために生体内安定性が最も高いように思われる。リポソーム内に物質を封入する目的は、生体内の破壊的環境及び急速な排泄から物質を保護することである場合が多い。物質を封入することにより、物質の活性が有用ではなかったり、望ましくない可能性がある部位が存在する環境において物質が主として標的部位において活性を示すようにすることができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が外表面に結合したリポソームは血流中において長い循環時間を示すことが知られている。これらのリポソーム組成物は、注入直後にリポソームを攻撃し、リポソームの迅速な除去又は破裂並びに内部に封入された物質の早過ぎる放出を引き起こす免疫系を効果的に回避することができる。血流中における循環時間を長くすることにより、リポソーム内に封入された物質は標的組織に到達するまでリポソーム内にとどまることになる。この現象はパッシブターゲティング送達（ｐａｓｓｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）と呼ばれ、腫瘍領域又は炎症部位における長時間循環ナノ粒子の蓄積は、これらの領域における血管系の出血及び有効なリンパ排出系の欠如によるものである。例えば、長時間循環リポソーム内に封入された放射性診断物質をパッシブターゲティングによって患者の患部に送達して診断を容易にすることができる。アクティブ又はリガンドターゲッティング送達システムは、細胞表面抗原又は受容体を標的とするリガンドが表面に結合したリポソーム組成物である（非特許文献１０）。放射性核種が封入されたリポソーム組成物を含む製剤において長時間循環標的リポソームの特性を組み合わせることにより、標的部位（腫瘍等）における放射線送達の特異性と程度を有意に高めることができる。理想的には、リポソーム組成物は、（ｉ）高い封入効率（封入工程に使用される物質の全量に対する封入された物質の割合が高いこと）を達成し、（ｉｉ）安定した形態（保管時又はリポソームに封入された物質が所期の活性を示すと予想される部位又は環境にリポソームが到達する前における封入された物質の放出（漏出）が最小であること）で、所望の物質（化合物又は放射性核種）を含むように形成することができる。
リポソーム等のナノ粒子への放射性核種の封入は、脂質膜を透過して金属イオンを輸送することができる化合物（イオノフォア）を使用して行うことができる。膜障壁を通過した放射性核種は、好ましくは、強い親和性のためにリポソーム組成物の内部に封入されたキレート剤と結合し、遊離イオノフォアは放出され、放射性核種はリポソーム組成物内に封入される。
診断及び／又は治療用途においては、銅同位体が注目を集めている。診断用途においては、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）による診断撮影に使用することができる陽電子放射体の61Ｃｕ及び64Ｃｕが注目を浴びている。64Ｃｕは全ての崩壊様式を有する興味深い銅同位体であり、半減期が１２．７時間であって生物学的研究に適している。半減期が約６〜１２時間であれば、標的の迅速な識別を可能とする十分なバックグラウンドクリアランスとしながら、炎症性組織又は癌性標的においてリポソームを十分に蓄積させるために理想的であると思われる（非特許文献１１）。また、64Ｃｕは全ての銅同位体の化学特性を表すモデル核種として使用することができる。
治療用途のための理想的な放射性同位体は、β、α及びオージェ電子放出体等の低透過性放射線を放射する同位体である。そのような放射性同位体の例としては、67Ｃｕ、67Ｇａ、225Ａｃ、90Ｙ、177Ｌｕ、119Ｓｂが挙げられる。放射性医薬品としての低エネルギー放射性同位体が標的部位に到達すると、エネルギーは標的部位のみに照射され、周辺の正常な組織には照射されない。組織における異なる放射性同位体から放射された粒子のエネルギー並びにその範囲及び半減期は異なり、用途、疾患及び疾患組織へのアクセス可能性に応じて最も適切な放射性同位体は異なる。
診断用途のために理想的な放射性同位体は、比較的短い半減期を有し、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び／又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等の撮影技術によって検出される高透過放射線を放射する同位体である。放射性核種の半減期は、放射性医薬品を合成するために所望の化学反応を行うことができると共に、非標的器官からの除去を可能としながら、患者の標的組織において蓄積することができる程度に十分長くなければならない。放射性核種である64Ｃｕは、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ（非特許文献１２）及び治療（非特許文献１３）における用途において汎用的な同位体であることが証明されている。61Ｃｕ（Ｔ1/2＝３．３３時間）及び64Ｃｕ（Ｔ1/2＝１２．７時間）等の放射性核種からなる放射性医薬品及び放射性標識リポソーム組成物はポジトロン断層法（ＰＥＴ）による撮影に使用することができ、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に対する主な利点としては、ａ）コリメータの代わりに、互いに対向する一対のシンチレーターによって同時（＜１０-9秒）に検出された光子のみを登録する消滅放射線同時検出（ＡＣＤ）法を採用しており、検出視野が（非発散）円柱状であり、感度及び解像度が検出視野内において変化しないため、感度が著しく向上し（×３０〜４０）、空間分解能が約２倍（＜５ｍｍ）向上すること（非特許文献１４）、ｂ）ＰＥＴスキャナは、光子減衰、散乱及び偶発のための補正後に放射線濃度（例えば、Ｂｑ／ｍＬ）毎に全ての画像を得ることができ、ＰＥＴはＳＰＥＣＴよりも定量的な方法であると考えられる（非特許文献１５）ことが挙げられる。
特許文献１〜４は、イオノフォアを使用したリポソーム内への放射性核種の封入に基づく方法を開示している。上記方法においてリポソームに封入される放射性核種は、重い放射性核種並びに11Ｃ、18Ｆ、76Ｂｒ、77Ｂｒ、89Ｚｒ、67Ｇａ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、90Ｙ及び225Ａｃである。診断的見地からは、放射性核種が限定されているために上記方法はＰＥＴ撮影には使用することができず、ＳＰＥＣＴにしか使用することができない。
特許文献５は、中性子捕捉腫瘍治療のためのリポソーム封入化合物の組成物及び使用方法を開示している。特許文献５では、活性化後にのみ放射性を示す安定元素（ホウ素等）がリポソームに封入されている。
非特許文献１６は、理論的研究において放射性核種131Ｉ、67Ｃｕ、188Ｒｅ又は211Ａｔで標識されたリポソームの治療的有効性について分析しているが、標識リポソームを製造するための化学的方法については示唆していない。
現在、放射性銅同位体を使用した放射性医薬品は数えるほどしか見出されていない。放射性銅同位体を使用した放射性医薬品の例としては、低酸素症マーカーとしての60Ｃｕ−ＡＴＳＭや、腫瘍治療剤としての可能性が示唆されている64Ｃｕ−ＡＴＳＭ及び64Ｃｕ−ＰＴＳＭが挙げられる。その他の物質として、銅標識ペプチドや、放射性銅が二官能キレート剤を介して生体分子に結合した抗体も知られている。しかしながら、放射性医薬品を使用するための銅を封入したリポソーム組成物は得られていない。
いくつかの研究グループは、イオノフォアを使用せずに、脂質二重層のアニオン／カチオン透過性を測定している。
リポソーム組成物等のリン脂質二重層の低いイオン透過性（非特許文献１７〜２２）により、荷電イオン種の封入速度は非常に低くなることが知られている。従って、二重層透過拡散速度を上昇させ、リポソーム等のナノ粒子内への一価、二価及び三価カチオンの封入を向上させるためにイオノフォアが通常使用されている。
特許文献６は、イオノフォア及びキレート剤を使用して放射性核種を封入する方法を開示している。特許文献６には、キレート剤はイオノフォアであってもよいと記載されている。
特許文献７は、生物学的薬剤を封入したリポソームを開示している。特許文献７には、リポソーム内に生物学的薬剤を能動的に封入するためにイオン勾配、イオノフォア、ｐＨ勾配及び金属錯体形成を使用することができると開示されている。特許文献７は、浸透圧勾配を利用して封入効率又は封入速度を上昇させる、ナノ粒子内への金属体の封入方法は開示していない。
従って、診断用途に関連する技術分野において、ＰＥＴに有用な放射線診断物質及び撮影用物質等の様々な化合物の送達に有用な各種リポソーム組成物を提供することが求められている。
ＷＯ２００１／０６０４１７ ＷＯ２００４／０８２６２７ ＷＯ２００４／０８２６２６ 米国特許出願公開第２００９／００８１１２１号 欧州特許第３８６ １４６ Ｂ１号 ＷＯ２００６／０４３０８３ ＷＯ０３／０４１６８２
Lasic, Trends Biotechnol., 16:307-321, 1998 Phillips, Adv Drug Deliv Rev., 37:13-32, 1999 Morgan et al., J Med Microbiol., 14:213-217, 1981 Goto et al., Chem harm Bull.(Tokyo), 37:1351-1354, 1989 Seo et al., Bioconjucate Chem., 19:2577-2584, 2008 Hwang et al., Biochim Biophys Acta., 716:101-109, 1982 Phil-lips et al., Int J Rad Appl Instrum B, 19:539-547, 1992 Gabizon et al., J Liposome Res., 1:123-125, 1988 Henriksen et al., Nucl Med Bio., 31:441-449, 2004 Allen, Science, 303:1818-1822, 2004 Gabizon et al., Cancer Res., 50:6371-6378, 1990 Dehdashti et al., J Nucl Med.38:103P, 1997 Anderson et al., J Nucl Med., 36:2315-2325, 1998 Kostarelos et al., J Liposome Res., 9:429-460, 1999 Seo, Curr. Radiopharm., 1:17-21, 2008 Kostarelos et al., J Liposome Res, 9:407-424, 1999 Paula et al., Biophys. J., 74:319-327, 1998 Hauser et al., Nature, 239:342-344, 1972 Ceh et al., J. Phys. Chem. B, 102:3036-3043, 1998 Mills et al., Biochim. Biophys. Acta, 1716:77-96, 2005 Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:561-583, 1971 Puskin, J. Membrane Biol, 35:39-55, 1977
本発明は、リポソーム組成物又はナノ粒子内に封入された金属体及び／又は放射性核種の新規かつ改良された製造方法に関する。当技術分野における通常の一般知識とは対照的に、本願発明者らは、イオノフォアを使用することなく、金属体及び／又は放射性核種を効率的に封入することができることを見出した。従って、本発明に係る新規な方法では、イオノフォアを輸送分子として使用することなく、金属体又は放射性核種をナノ粒子内に封入する。
また、本願発明者らは、本発明のナノ粒子の膜における浸透圧ストレスの存在は、ナノ粒子の内部への金属体及び／又は放射性核種の封入工程を改善することを見出した。全ての銅同位体の化学的特性を表すモデル核種として陽電子放射体64Ｃｕを使用する。
本発明に係る金属体が封入されたナノ粒子組成物の製造方法は、イオノフォアを使用することを含まず、
ａ．ベシクル形成成分と、前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物を用意する工程と、
ｂ．前記金属体を含む溶液内において前記ナノ粒子組成物を培養することにより、前記ベシクル形成成分によって形成された膜を透過するカチオン金属体の移動を可能とすることによって前記ナノ粒子組成物の内部に前記金属体を封入する工程と、
を含む。
培養を含む前記封入工程では、リポソーム等のナノ粒子内に金属体を封入する。
本発明によれば、放射性核種の封入効率は１０％よりも高い。封入効率は、１０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％であることができる。
本発明の一実施形態において、培養温度は１００℃未満、例えば１０〜８０℃、例えば２２〜８０℃又は例えば３０〜８０℃である。
本発明に係る培養時間は、４８時間未満、例えば１〜２４０分、好ましくは１〜１２０分、より好ましくは１〜６０分である。
本発明に係る金属体は、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）及びラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）からなる群から選択される１種以上の放射性核種を含む（又は上記群から選択される１種以上の放射性核種からなる）ことができる。
本発明に係る金属体は、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ及びそれらの二価又は三価イオンからなる群から選択される１種以上の金属体を含むことができる。
本発明の一実施形態において、ナノ粒子の製造方法は、培養時にナノ粒子の外部とナノ粒子の内部との間に、例えば、５〜８００ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは５〜１００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧差を生じさせる工程を含む。
本発明に係るベシクル形成成分は、リン脂質、ＰＥＧ化リン脂質及びコレステロールからなる群から選択される１種以上の化合物、例えばＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ＲＧＤ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ＴＡＴＥからなる群から選択される１種以上の両親媒性化合物を含む。
本発明に係る物質封入成分は、キレート剤、還元剤及び前記放射性核種と共に低溶解性塩を形成する物質からなる群から選択され、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、シクラム及びシクレンからなる群から選択されるキレート剤である。
本発明に係るナノ粒子の内部ｐＨは、４〜８．５、例えば４．０〜４．５、例えば４．５〜５．０、例えば５．０〜５．５、例えば５．５〜６．０、例えば６．０〜６．５、例えば６．５〜７．０、例えば７．０〜７．５、例えば７．５〜８．０、例えば８．０〜８．５である。
本発明によって提供される放射性標識ナノ粒子は、２０％未満、例えば１５％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、例えば６％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満の放射線の漏出が観察される安定性を有する。
また、本発明は、
ａ．ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物と、
ｂ．前記ナノ粒子に封入される金属体を含む組成物と、
を含むキット・オブ・パーツを提供する。
また、本発明は、金属体が封入されたナノ粒子組成物であって、
ｉ．ベシクル形成成分と、
ｉｉ．前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、
ｉｉｉ．前記ナノ粒子組成物の内部に封入された金属体と、
を含むナノ粒子組成物を提供する。
本発明の特定の実施形態において、ナノ粒子の内部ｐＨは、６〜８．５、例えば６．０〜６．５、例えば６．５〜７．０、例えば７．０〜７．５、例えば７．５〜８．０、例えば８．０〜８．５である。
また、本発明は、例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャン、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）スキャン及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）から選択されてもよい画像検査法において、治療、監視又は診断を必要とする患者を治療、監視又は診断するための方法に使用されるナノ粒子組成物を提供する。
また、本発明は、本願明細書に開示する方法によって製造されたナノ粒子組成物を提供する。
図１は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）による、64Ｃｕ−リポソームと封入されなかった64Ｃｕの分離を示す。ＤＯＴＡが封入されたＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000からなるリポソームに64Ｃｕを封入（培養時間：６０分、培養温度：５０〜５５℃）したところ、高い封入効率（９６．７％）が得られた。 図２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）による、177Ｌｕ−リポソームと封入されなかった177Ｌｕの分離を示す。ＤＯＴＡが封入されたＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000からなるリポソームに177Ｌｕを封入（培養時間：６０分、培養温度：５０〜５５℃）したところ、８１．０％の封入効率が得られた。 図３は、イオノフォアを使用しない場合（破線）とイオノフォア（２ＨＱ）を使用した場合（実線）の、リポソームへの64Ｃｕの封入効率を培養温度の関数として示す。５０〜５５℃におけるイオノフォアを使用しない場合のリポソーム内への64Ｃｕの封入効率は９６．７％だった。 図４は、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000からなるリポソーム内へのＣｕ（ＩＩ）の遠隔封入実験で得られた標準曲線と結果のプロットを示す。非錯体Ｃｕ2+はＣｕ（ＩＩ）−選択性電極で測定し、得られた封入効率は
Figure 2014506240
 だった。◇はＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＣｕ（ＩＩ）標準曲線を示し、×は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＮ０3、ｐＨ６．８を示し、○は封入前のリポソー ムを示し、●は封入後のリポソームを示す。
図５は、１，２−Ｄｉ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉ−Ｏ−ＤＰＰＣ）の構造を示す。 図６は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000分散液が、ａ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、２０モル％コレステロール及び７０モル％ＤＳＰＣ、ｂ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、２５モル％コレステロール及び６５モル％ＤＳＰＣ、ｃ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、３０モル％コレステロール及び６０モル％ＤＳＰＣ、ｄ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、３５モル％コレステロール及び５５モル％ＤＳＰＣ、ｅ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、４０モル％コレステロール及び５０モル％ＤＳＰＣ、ｆ）１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000、５０モル％コレステロール及び４０モル％ＤＳＰＣ、ｇ）精製されたＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなるキレート剤（１０ｍＭ ＤＯＴＡ）含有リポソーム、を含むときの示差走査熱量法（ＤＳＣ）スキャンを示す。 図７は、３つの異なる温度（５０℃、４０℃及び３０℃）における、イオノフォアを使用しない場合のキレート剤含有リポソーム内への64Ｃｕ2+の封入効率を時間の関数として示す。リポソームは、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなる。リポソームの内部及び外部オスモル濃度の差（Δ（ｍＯｓｍ／Ｌ））は＋７５（内部オスモル濃度の方が高い）とした。ラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）を使用して内部の64Ｃｕ−ＤＯＴＡ錯体と封入又は錯体化されていない遊離64Ｃｕ2+の比率を64Ｃｕ封入効率（％）として測定した。 図８は、３つの異なる温度（５０℃、４０℃及び３０℃）における、イオノフォアを使用しない場合のキレート剤含有リポソーム内への64Ｃｕ2+の封入効率を時間の関数として示す。リポソームはＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなり、リポソームの内部及び外部オスモル濃度は等しい。ラジオＴＬＣを使用して内部の64Ｃｕ−ＤＯＴＡ錯体と封入又は錯体化されていない遊離64Ｃｕ2+の比率を64Ｃｕ封入効率（％）として測定した。
用語の定義
本願明細書において使用する「ベシクル」という用語は、内部空間の存在によって特徴付けられる実体を意味する。好適なベシクルは、本願明細書に開示する各種両親媒性成分等の脂質からなる。
本願明細書において使用する「ナノ粒子」という用語は、リポソーム、ポリマーソーム又は含水コアを取り囲む最も広い意味における膜を構成する脂質又はポリマーシェル構造体を意味する。
本願明細書において使用する「キレート剤」という用語は、遷移金属又は他の物質と共に２以上の配位結合を含む錯体を形成することができる極性基の存在によって特徴付けられる化学的部位、物質、化合物又は分子を意味する。本発明に係るキレート剤は、水溶性及び／又は非親油性物質であり、脂質によって形成されたベシクル等の疎水性膜を透過する金属体の輸送に使用される「親油性キレート剤」とは異なる。
本願明細書において使用する「金属体（ｍｅｔａｌ ｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、金属イオン又は放射性核種を意味し、「放射性核種」という用語は「放射性同位体」という用語と同じ意味で使用する。
本願明細書において使用する「ホスファチド」という用語は、グリセリン成分を含むリン脂質を意味する。
本願明細書において使用する「両親媒性」という用語は、極性領域及び非極性領域の両方を含む分子を意味する。
本願明細書において同じ意味で使用する「結合親和性」及び「親和性」という用語は、分子間の引力の度合いを意味する。親和性は、解離定数又は会合定数として定量的に表すことができる。本発明において、キレート剤又は他の物質封入成分の親和性は、遷移金属イオン又は他の金属体（Ｃｕ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）等）のためのキレート剤であるＤＯＴＡの結合親和性に関連するものであってもよい。
本願明細書において使用する「封入物質」という用語は、本願明細書に開示するリポソーム組成物又はナノ粒子組成物内に封入された金属同位体（放射性核種又は非放射性同位体）を意味する。
本願明細書において使用する「物質封入成分」という用語は、金属イオン又は放射性核種をリポソーム組成物内に封入することができる化合物を意味する。好適な物質封入成分は、キレート剤、他の物質を還元することができる物質（還元剤）又は放射性核種又は金属体と低溶解性塩を形成する物質である。
本願明細書において使用する「封入」という用語は、ナノ粒子組成物の内部への放射性核種又は金属体の取り込みを意味する。本発明の方法では、ナノ粒子組成物の内部への放射性核種又は金属体の取り込みは、放射性核種又は金属体を含む溶液を使用したナノ粒子組成物の培養によって行う。
本願明細書において使用する「封入効率」という用語は、調製に使用される放射性核種又は金属体の全量に対するナノ粒子組成物の内部に取り込まれた放射性核種又は金属体の割合（％）を意味する。
本願明細書において使用する「封入安定性」、「貯蔵安定性」又は「血清中安定性」という用語は、ナノ粒子組成物の内部における封入物質のリーク及び／又は放出の度合いを測定するためのナノ粒子組成物の安定性試験による安定性を意味する。
本願明細書において使用する「放射性標識錯体」という用語は、錯体を形成するキレート剤と放射性核種を意味する。
本願明細書において使用する「標的部分」という用語は、糖、オリゴ糖、ビタミン、ぺプチド、タンパク質、抗体、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）及び標的部位又は標的細胞内にナノ粒子を良好に供給するための脂質又はポリマー成分を介してナノ粒子の表面に結合した他の受容体結合リガンドを意味する。
本願明細書において使用する「医薬」、「薬剤」又は「医薬化合物」という用語は、ヒト又は動物の体内において局所的又は全身的（非局所的）に作用する生物学的、生理学的又は薬理学的に活性な物質を含む。
本願明細書において使用する「治療」という用語は、治癒的治療、予防的治療又は改善的治療を意味する。「治療」という用語は、臨床的に確立され得る有益な又は所望の生理学的結果を得るための方法（手段）を含む。本発明においては、有益な又は所望の臨床結果は、検出可能であるか否かを問わず、症状の軽減、疾患の程度の低減、安定した（悪化しない）症状、症状の進行又は悪化の遅延又は減速、症状の改善又は緩和、（部分的又は完全な）寛解等を含む。本願明細書において使用する「緩和」という用語は、本発明の組成物を投与しない場合と比較した場合の、生理学的症状の程度及び／又は望ましくない発現の減少及び／又は時間的な進行の減速又は遅延を意味する。
本願明細書において、「オスモル濃度」という用語は、溶液１リットル（Ｌ）あたりの溶質のオスモル数（Ｏｓｍ）として定義される溶質濃度（Ｏｓｍ／Ｌ）の尺度を意味する。
本発明は、効率的な封入温度及び好適なリポソーム組成物に基づく、リポソーム組成物又はナノ粒子内に封入された金属体及び／又は放射性核種の新規かつ改良された製造方法に関する。また、本願発明者らは、本発明のナノ粒子の膜における浸透圧ストレスの存在は、ナノ粒子の内部への金属体及び／又は放射性核種の封入工程を改善することを見出した。
本願発明者らは、予期せぬことに、イオノフォアを添加することなく荷電種（イオン）をナノ粒子に封入する方法は膜透過拡散速度を高めることを見出した。従って、本発明は、親油性イオノフォア又は他の担体を添加することなく、放射性核種（例えば、一価、二価及び三価カチオン）をリポソーム組成物内に迅速に封入する新規な方法を開示する。
過去４０年間にわたって、親油性イオノフォア又は錯体が、生体内シンチグラフィ撮影及び内部放射線治療用途のためのナノ粒子内の封入放射性核種（例えば、111Ｉｎ3+、177Ｌｕ3+、67/68Ｇａ2+、99mＴｃＯ4 -）の効率を高めるために使用されてきた。親油性イオノフォアを使用した場合の封入効率は９０〜９５％の高いレベルに達している。本発明は、親油性イオノフォア又は他の金属担体を使用せず、同様又はさらに高いリポソーム組成物内への放射性核種の封入効率を得ることができる新規な方法に関する。イオノフォアを使用せずにナノ粒子内に金属体及び／又は放射性核種を封入する製造方法はいくつかの利点を有する。イオノフォアは哺乳動物、特に人間にとって毒性を有する場合がある。従って、イオノフォアを使用して製造されたナノ粒子に対しては、規制認可前に広範な毒性試験を行う必要がある。また、そのようなナノ粒子は、イオノフォアをできるだけ除去するために使用前に精製する必要があり、イオノフォアの濃度が所定の閾値未満となるように精製の程度を監視する必要がある。
本発明のナノ粒子の製造は、そのような精製を行うことなく、少数の成分を使用して容易に行うことができる。本発明のナノ粒子を患者に投与する場合には、毒性等の副作用のリスクが減少する。また、本発明の新規な製造方法により、ナノ粒子の内部ｐＨをナノ粒子の安定性を向上させる範囲とすることができる。このようにして、先行技術と比較して本発明の使用に関連する有効期間及び保存要件等が向上するため、本発明のナノ粒子、方法又はキット・オブ・パーツの使用が容易となる。
また、親油性イオノフォアは放射性核種の封入（例えば、リポソーム内へのカチオンの封入）効率を高めるために有用だが、親油性イオノフォアは封入された放射性核種をリポソームから容易に放出させる場合がある。封入された材料が早期に放出すると、生体内におけるリポソームの分布の誤った推定や、診断画像の品質低下が生じ得る。
また、本発明は、炎症部位や癌組織等の血管からの出血を伴う病理学的症状を示す組織に金属体を送達するためのナノ粒子を提供することによって診断応用技術分野におけるニーズを満たすものである。
封入効率及び封入速度
リポソームのための封入方法の封入効率は、イオン交換クロマトグラフィー、放射線薄層クロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）、透析又はリポソーム封入放射性核種から未結合の放射性金属イオン又は放射性標識錯体を分離するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）等の公知の方法によって測定することができる。ＳＥＣを使用する場合には、未結合の放射性金属イオン又は放射性標識錯体の量に対するリポソーム内に保持されている放射線の量を、ＳＥＣ時の溶出プロファイルを監視し、放射線検出器で放射線を測定するか、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）又は誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用して金属体の濃度を測定することによって測定することができる。リポソームを含まない溶離画分に対するリポソームを含む溶離画分において測定された放射線の量を使用し、リポソーム内に保持された放射線の割合を算出することによって封入効率を決定することができる。同様に、公知のその他の方法を使用する場合には、リポソーム内の放射線の量をリポソーム内に封入されていない放射線の量と比較して封入効率の尺度とすることができる。
本発明の方法によれば、製造に使用する多量の放射性核種をナノ粒子内に封入することができる。本発明に係る方法の一実施形態において、封入効率は、１０％よりも高く、例えば１０〜１００％であり、例えば１５％、例えば２０％、例えば２５％、例えば３０％、例えば３５％、例えば４０％、例えば５０％、例えば６０％、例えば６５％、例えば７０％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％、例えば９９．５％又は例えば９９．９％よりも高い。本発明の別の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ（実施例を参照））、イオン交換クロマトグラフィー又は透析によって測定した封入効率は、３０％よりも高く、例えば３０〜１００％、例えば５５〜１００％、８０〜１００％又は９５〜１００％である。
好ましくは、本発明に係る方法の封入効率は、５５〜１００％、例えば８０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％、例えば９５〜９７％又は例えば９７〜９９．９％である。
封入速度
リポソーム内への金属イオンの封入は、（ｉ）脂質膜へのイオンの結合／配位／吸着、（ｉｉ）膜透過イオン拡散、（ｉｉｉ）キレート剤へのイオンの結合を含む複数の工程に分けることができる。本発明の方法では、金属体と比較して脂質及びキレート剤を大過剰とすることができ、金属体は例えば64Ｃｕ2+であってもよい。64Ｃｕ2+の例では、反応速度は64Ｃｕ2+濃度のみに依存する。Ｃｕ2+の膜への配位／結合速度は速く（おそらくは拡散律速）、Ｃｕ2+のキレート剤（ＤＯＴＡ等）への結合は秒単位の時間スケールで生じ、ラジオＴＬＣ又は他の従来の方法によって確認することができる。金属体の膜への結合速度は速いため、膜透過イオン拡散は最も可能性のある律速段階である。
通常、膜透過拡散速度は、輸送物質の濃度勾配（フィックの第一法則）、膜の相状態（ゲル、流体又は秩序液体）及び輸送物質の物理化学的性質（親水性又は疎水性）に依存する。従って、以下に示す一次式（１）（64Ｃｕ2+の場合を示すが、他の金属体にも使用することができる）が得られる。封入速度（図７及び図８に示す例）は式（１）によって特徴付けることができる。
Figure 2014506240
式中、ＡCu、ＡCu-chelator及びＡCu(ionophore)は、64Ｃｕ2+、64Ｃｕ−キレート剤及び64Ｃｕ−イオノフォアのＴＬＣ活性である。フィッティンパラメータａはプラトーレベル（一次反応速度論に従って封入が進行する場合にはａ＝１００％）であり、ｂはｔにおけるオフセット及び不確定性（ｔにおけるオフセット及び不確定性が小さい場合にはｂ＝１）であり、ｃは封入速度である。式（１）のフィッティングにより、各封入プロファイルは以下のように特徴付けられる。
（ｉ）初速度：
Figure 2014506240
 （ｉｉ）封入度が９５％に達するまでの時間：
Figure 2014506240
 （ｉｉｉ）６０分で達する封入度（％ｌｏａｄ1h）。後者は、ＳＥＣに基づく方法を使用して達成された封入度と同等である（例えば、実施例における結果（図３、表１、表２、表６及び表７）を参照）。
一次速度定数（ｃ）は、封入が行われる温度（図７及び図８を参照）及びオスモル濃度（以下を参照）等の異なるパラメータに依存する。一連の封入条件における初速度（ｖini）、ｔ(95%)及び％ｌｏａｄ1hを表８に示す。
本発明の方法の封入速度は、初速度、封入度が９５％に達するまでの時間及び６０分で達する封入度によっても表すことができる。
本発明の一実施形態においては、初速度は、０．５〜１００％／分、好ましくは３〜１００％／分、より好ましくは２３〜１００％／分である。
本発明の一実施形態において、封入度が９５％に達するまでの時間は、０〜３６０分、例えば１〜２４０分、好ましくは５〜２４０分、例えば５〜２０分又は例えば９〜１８分である。
本発明の一実施形態において、６０分で達する封入度は、１０〜１００％、好ましくは５５〜１００％、例えば８０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％、例えば９５〜９９．９％である。
ナノ粒子（リポソーム等）の封入方法は、初速度、封入度が９５％に達するまでの時間及び６０分で達する封入度によって表される封入効率及び封入速度等のパラメータを測定することによって比較することができる。従って、本願明細書に開示する方法により、封入効率又は封入速度に対するイオノフォアの貢献の有意性を決定することができる。
本発明は、金属体が封入されたナノ粒子（リポソーム等）の製造方法であって、ナノ粒子の封入にイオノフォアを使用しないか、１種以上のイオノフォアが封入速度又は封入効率に有意に貢献しない程度の少量で存在する方法を提供するものであり、上記方法は、本発明が提供する封入メカニズムと同一の封入メカニズムを実質的に使用する。従って、上記方法は、初速度、封入度が９５％に達するまでの時間及び６０分で達する封入度からなる群から選択されるパラメータによって表される封入効率及び／又は封入速度の有意な上昇が生じない量で１種以上のイオノフォアが存在する方法を含む。封入効率又は封入速度の差の有意性は、スチューデントのｔ−検定等の従来の統計学的方法を使用して算出することができる。
ナノ粒子
本発明の実施形態において、リポソーム組成物は、ベシクル形成成分及び物質封入成分を含むマイクロメートル又はナノメートルサイズの粒子である。ベシクル形成成分は、粒子の閉鎖障壁を形成する。物質封入成分は、負の電荷を有する１以上の基を含むか、イオンをトラップすることができる少なくとも１種の化学的部分を有することができる。また、物質封入成分は還元剤であってもよい。物質封入成分は、放射線診断薬又は放射線治療薬を含む金属体等の被包性薬剤と静電的互作用によって相互作用して安定錯体又は低溶解性塩を形成するか、被包性薬剤と還元によって相互作用して沈殿物を形成する。放射線診断薬又は放射線治療薬等の被包性薬剤を安定化させることにより、血液循環におけるベシクルからの薬剤の放出を防止又は最小化することができる。
物質封入成分は、負又は正の電荷を有する１以上の基を含むか、イオンをトラップすることができる少なくとも１種の化学的部分を有することができる。
金属体
本発明に係るナノ粒子は金属体を含む。本発明に係る金属体は当業者に公知であって、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン、七価カチオン等の金属の任意の酸化状態にある金属から選択することができる。
本発明の一実施形態において、金属体は、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンからなる群から選択されるカチオンであり、二価カチオン及び三価カチオンが好ましい。
本発明の一実施形態において、金属体はＣｕ（Ｉ）又はＣｕ（ＩＩ）等の銅である。
本発明のナノ粒子は、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）及びラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）からなる同位体からなる群から選択される金属放射性核種を含む（又は上記群から選択される金属放射性核種からなる）ことができる封入金属体を含み、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
別の実施形態において、封入金属体は、レニウム（186Ｒｅ）、ストロンチウム（89Sｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）及びアスタチン（211Ａｔ）からなる群から選択される同位体を含み、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
別の実施形態において、封入金属体は、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）及びルテチウム（177Ｌｕ）からなる群から選択される同位体を含み、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明の別の実施形態において、封入金属体の１種以上は、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｆｅ、Ｃｏ及びＮｉからなる群から選択される、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用することができる金属からなる群から選択される。金属体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明の好適な実施形態において、封入金属体の１種以上は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｔｉ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）からなる群から選択される。
放射性核種の組み合わせは、癌等の様々な疾患の同時監視／撮影及び治療及び／又は異なる撮影方法を使用した監視に有用である。放射性核種及び放射性核種の組み合わせは、アルファ粒子、ベータ＋粒子、ベータ−粒子、オージェ電子又はガンマ線等の１種以上の放射線を放射する場合がある。また、放射性核種を組み合わせることにより、１種以上の撮影及び／又は放射線治療を行うことができる。従って、別の実施形態において、本発明は、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ストロンチウム（89Ｓｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）、アスタチン（211Ａｔ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）及びラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）からなる群から選択される２種以上の放射性核種を含む金属体を含み、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよいベシクル及びその製造方法を提供する。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
別の実施形態において、金属体の組み合わせは、１種以上の撮影及び／又は放射線治療を可能とする１種以上の金属及び１種以上の放射性核種を含むことができる。従って、別の実施形態において、本発明は、金属の任意の酸化状態にあるＧｄ、Ｄｙ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉからなる群から選択される金属体と、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ストロンチウム（89Ｓｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）、アスタチン（211Ａｔ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）及びラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）からなる群から選択される放射性核種と、を含み、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよいベシクル及びその製造方法を提供する。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明において、ベシクル等のナノ粒子組成物は、64Ｃｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＴｉ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＭｎ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｏ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＮｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＤｙ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＴｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＣｒ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＭｎ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＣｏ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＮｉ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＧｄ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＤｙ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＴｉ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＣｒ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＭｎ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＦｅ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＦｅ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＣｏ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＮｉ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＧｄ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＤｙ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＴｉ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＣｒ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＭｎ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＦｅ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＦｅ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＣｏ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＮｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＴｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＭｎ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｏ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＮｉ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＤｙ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＴｉ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＣｒ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＭｎ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＦｅ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＦｅ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＣｏ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＮｉ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＧｄ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＤｙ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＴｉ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＣｒ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＭｎ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＦｅ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＦｅ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＣｏ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＮｉ（ＩＩ）、90Ｙ及びＧｄ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＤｙ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＴｉ（ＩＩ）、90Ｙ及びＣｒ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＭｎ（ＩＩ）、90Ｙ及びＦｅ（ＩＩ）、90Ｙ及びＦｅ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＣｏ（ＩＩ）、90Ｙ及びＮｉ（ＩＩ）からなる群から選択される１種以上の組み合わせを含むことができ、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
好適な実施形態において、ベシクル等のナノ粒子組成物は、64Ｃｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＴｉ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＭｎ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｏ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＮｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＤｙ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＴｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＣｒ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＭｎ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＣｏ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＮｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＴｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＭｎ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｏ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＮｉ（ＩＩ）からなる群から選択される金属体の１種以上の組み合わせを含むことができ、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
別の好適な実施形態において、ベシクル等のナノ粒子組成物は、64Ｃｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＧｄ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＧｄ（ＩＩＩ）からなる群から選択される金属体の１種以上の組み合わせを含むことができ、64Ｃｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）並びに68Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）の組み合わせが最も好ましい。
本発明に係るベシクルは、撮影のための１種以上の放射性核種及び治療のための１種以上の放射性核種の組み合わせを含むことができる。撮影のための放射性核種は、64Ｃｕ、61Ｃｕ、99mＴｃ、68Ｇａ、89Ｚｒ及び111Ｉｎ等の放射性核種を含む。
治療のための放射性核種は、64Ｃｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、67Ｇａ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、89Ｓｒ、153Ｓｍ、169Ｙｂ、201Ｔｌ、211Ａｔ、177Ｌｕ、225Ａｃ、90Ｙ、119Ｓｂ、117Ｓｎ、113Ｓｎ、159Ｄｙ、56Ｃｏ、59Ｆｅ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、103Ｐｄ、115Ｃｄ、118Ｔｅ、123Ｔｅ、131Ｂａ、140Ｂａ、149Ｇｄ、151Ｇｄ、160Ｔｂ、198Ａｕ、199Ａｕ、140Ｌａ、223Ｒａ及び224Ｒａ等の放射性核種を含む。
本発明の好適な実施形態において、ベシクル又はナノ粒子は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、225Ａｃ、90Ｙ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ及び119Ｓｂからなる群から選択される２種以上の放射性核種を含む。
本発明のさらに好適な実施形態は、ベシクル又はナノ粒子は、64Ｃｕ及び177Ｌｕ又は64Ｃｕ及び67Ｃｕ又は61Ｃｕ及び67Ｃｕ又は64Ｃｕ及び90Ｙ又は64Ｃｕ及び119Ｓｂ又は64Ｃｕ及び225Ａｃ又は64Ｃｕ及び188Ｒｅ又は64Ｃｕ及び186Ｒｅ又は64Ｃｕ及び211Ａｔ又は64Ｃｕ及び67Ｇａ又は61Ｃｕ及び177Ｌｕ又は61Ｃｕ及び90Ｙ又は61Ｃｕ及び119Ｓｂ又は61Ｃｕ及び225Ａｃ又は61Ｃｕ及び188Ｒｅ又は61Ｃｕ及び186Ｒｅ又は61Ｃｕ及び211Ａｔ又は61Ｃｕ及び67Ｇａ又は67Ｃｕ及び177Ｌｕ又は67Ｃｕ及び90Ｙ又は67Ｃｕ及び119Ｓｂ又は67Ｃｕ及び225Ａｃ又は67Ｃｕ及び188Ｒｅ又は67Ｃｕ及び186Ｒｅ又は67Ｃｕ及び211Ａｔ又は68Ｇａ及び177Ｌｕ又は68Ｇａ及び90Ｙ又は68Ｇａ及び119Ｓｂ又は68Ｇａ及び225Ａｃ又は68Ｇａ及び188Ｒｅ又は68Ｇａ及び186Ｒｅ又は68Ｇａ及び211Ａｔ又は68Ｇａ及び67Ｃｕを含む。
１種以上の放射性核種を含む本発明に係るナノ粒子又はベシクルは、臨床撮影及び／又は放射線治療に使用することができる。臨床撮影は、診断、治療効果の監視又は放射線治療に使用されるベシクルの位置の監視のための撮影を含む。
好適な実施形態において、本発明に係るベシクル又はナノ粒子は、64Ｃｕ及び177Ｌｕ又は64Ｃｕ及び67Ｃｕ又は61Ｃｕ及び67Ｃｕ又は64Ｃｕ及び90Ｙ又は64Ｃｕ及び119Ｓｂ又は64Ｃｕ及び225Ａｃ又は64Ｃｕ及び188Ｒｅ又は64Ｃｕ及び186Ｒｅ又は64Ｃｕ及び211Ａｔ等の、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び放射線療法に有用な放射性核種の組み合わせを含む。
さらに好適な実施形態において、本発明に係るベシクル又はナノ粒子は、64Ｃｕ及び177Ｌｕ等の、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び放射線療法に有用な放射性核種の組み合わせを含む。
本発明によれば、ナノ粒子は、キレート剤等のリンカー分子を介してナノ粒子組成物の内表面又は外表面に結合していてもよい銅とは異なる１種以上の同位体を含むことができる。同位体は、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99ｍＴｃ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ストロンチウム（89Ｓｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）、アスタチン（211Ａｔ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）、ラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）、レニウム（186Ｒｅ）、ストロンチウム（89Ｓｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）及びアスタチン（211Ａｔ）からなる群から選択されてもよく、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明の一実施形態において、金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、225Ａｃ、90Ｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、119Ｓｂ及び111Ｉｎからなる群から選択される放射性核種であってもよく、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明の好適な実施形態において、金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ及び177Ｌｕからなる群から選択される放射性核種であり、金属放射性核種の同位体は金属の任意の酸化状態にあってもよい。このような酸化状態としては、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンが挙げられる。
本発明の一実施形態において、金属体は、64Ｃｕ及び67Ｃｕ、61Ｃｕ及び67Ｃｕ、64Ｃｕ及び90Ｙ、64Ｃｕ及び119Ｓｂ、64Ｃｕ及び225Ａｃ、64Ｃｕ及び188Ｒｅ、64Ｃｕ及び186Ｒｅ、64Ｃｕ及び211Ａｔ、64Ｃｕ及び67Ｇａ、61Ｃｕ及び177Ｌｕ、61Ｃｕ及び90Ｙ、61Ｃｕ及び119Ｓｂ、61Ｃｕ及び225Ａｃ、61Ｃｕ及び188Ｒｅ、61Ｃｕ及び186Ｒｅ、61Ｃｕ及び211Ａｔ、61Ｃｕ及び67Ｇａ、67Ｃｕ及び177Ｌｕ、67Ｃｕ及び90Ｙ、67Ｃｕ及び119Ｓｂ、67Ｃｕ及び225Ａｃ、67Ｃｕ及び188Ｒｅ、67Ｃｕ及び186Ｒｅ、67Ｃｕ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び177Ｌｕ、68Ｇａ及び90Ｙ、68Ｇａ及び119Ｓｂ、68Ｇａ及び225Ａｃ、68Ｇａ及び188Ｒｅ、68Ｇａ及び186Ｒｅ、68Ｇａ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び67Ｃｕからなる群から選択される２種以上の放射性核種である。
本発明の別の実施形態において、金属体は、61Ｃｕ及び64Ｃｕ、61Ｃｕ及び67Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ又は61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ等の銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ）からなる群から選択される２種以上の放射性核種である。
本発明の一実施形態において、金属体は、カチオンＨｇ2+及びＣｕ+を除く、上述した金属体からなる群から選択される金属体である。
本発明の別の実施形態において、放射性核種は、患者の癌性疾患（通常は、血管からの出血を伴う病理学的症状）又は他の疾患を診断及び／又は治療するために有用なナノ粒子等の他の担体に封入されていてもよい。
本発明に係るリポソーム組成物を製造するためのベシクル形成成分及び物質封入成分について以下に詳細に説明する。
ベシクル形成成分
ベシクル形成成分は、親水性部分及び疎水性部分を含む合成又は天然両親媒性化合物である。ベシクル形成成分の例としては、脂肪酸、中性脂肪、ホスファチド、糖脂質、脂肪族アルコール及びステロイドが挙げられる。ベシクル形成成分のさらなる例としては、脂質、ジブロック及びトリブロック共重合体、ボラ脂質（ｂｏｌａｌｉｐｉｄ）、セラミド、スフィンゴ脂質、リン脂質、ＰＥＧ化リン脂質、コレステロールが挙げられる。
本発明の一実施形態において、ベシクル形成成分はナノ粒子の循環時間を増加させる。
本発明に係るベシクル形成成分又は本発明に係る方法におけるベシクル形成成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分又はその誘導体等の親水性ポリマー又は多糖を含むことができる。この場合、ベシクル形成成分は親水性ポリマー（ＰＥＧ等）又は多糖に由来する。一実施形態において、ポリマーは、タンパク質又は他の受容体親和性分子をポリマーに由来するベシクル形成成分に結合させることができるポリマーである。別の実施形態において、リポソーム組成物へのポリマー（ＰＥＧ等）の結合によって血流中における循環時間が長くなる。ＰＥＧ鎖を表面に含むベシクルは、血管からの出血から溢血させることができる。
本発明又は本発明に係る方法において使用される適当なベシクル形成脂質の例としては、１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン、１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１−オレオイル−２−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン、１−ステアロイル２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレオイルホスファチジルセリン、１，２−ジパルミトイルホスファチジルセリン、１，２−ジミリストイルホスファチジルセリン、１，２−ジステアロイルホスファチジルセリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルセリン、１−オレオイル−２−ステアロイルホスファチジルセリン、１−パルミトイル２−オレオイルホスファチジルセリン、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；１，２−ジオレオイルホスファチジルグリセリン、１，２−ジパルミトイルホスファチジルグリセリン、１，２−ジミリストイルホスファチジルグリセリン、１，２−ジステアロイルホスファチジルグリセリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルグリセリン、１−オレオイル−２−ステアロイルホスファチジルグリセリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルグリセリン、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルグリセリン等のホスファチジルグリセリン；ＰＥＧ化脂質；ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３０００］、ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］等のＰＥＧ化リン脂質；Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）１０００］｝、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）３０００］｝、Ｎ−オクタノイルスフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）５０００］｝等のＰＥＧ化セラミド；リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセリン、リゾホスファチジルセリン、セラミド；スフィンゴ脂質；ガングリオシドＧＭｌ等の糖脂質；糖脂質；スルファチド；ジパルミトイルグリセロホスファチジン酸等のホスファチジン酸；パルミチン脂肪酸；ステアリン脂肪酸；アラキドン脂肪酸；ラウリン脂肪酸；ミスチリン脂肪酸；ラウロレイン脂肪酸；フィセテリン脂肪酸；ミリストレイン脂肪酸；パルミトレイン脂肪酸；ペトロセリン脂肪酸；オレイン脂肪酸；イソラウリン脂肪酸；イソミスチリン脂肪酸；イソステアリン脂肪酸；コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、コレステロール硫酸、コレステリル−（４−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、エルゴステロール、ラノステロール等のステロール及びステロール誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール；ポリオキシエチレン付加脂肪酸アルコールエーテル；ポリオキシエチレン付加ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリンポリエチレングリコールオキシステアレート；グリセリンポリエチレングリコールリシノレート；エチレンオキシド付加大豆ステロール；；エチレンオキシド付加ヒマシ油；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン脂肪酸ポリマー；ポリオキシエチレン脂肪酸ステアレート；ジオレオイル−ｓｎ−グリセリン；ジパルミトイル−スクシニルグリセリン；１、３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセリン；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルホスファチジルコリン等の１−アルキル−２−アシルホスファチジルコリン；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン等の１−アルキル−２−アシルホスファチジルエタノールアミン；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルホスファチジルセリン等の１−アルキル−２−アシルホスファチジルセリン；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルホスファチジルグリセリン等の１−アルキル−２−アシルホスファチジルグリセリン；１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシルホスファチジルコリン等の１−アルキル−２−アルキルホスファチジルコリン；１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシルホスファチジルエタノールアミン等の１−アルキル−２−アルキルホスファチジルエタノールアミン；１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシルホスファチジルセリン等の１−アルキル−２−アルキルホスファチジルセリン；１−ヘキサデシル−２−ヘキサデシルホスファチジルグリセリン等の１−アルキル−２−アルキルホスファチジルグリセリン；Ｎ−スクシニルジオクタデシルアミン；パルミトイルホモシステイン；臭化ラウリルトリメチルアンモニウム；臭化セチルトリメチルアンモニウム；臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム；塩化Ｎ−［（１，２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−ｃ−（４’−トリメチルアンモニウム）−ブタノイル−ｓｎ−グリセリン（ＤＯＴＢ）が挙げられる。
本発明又は本発明に係る方法において使用される適当なベシクル形成脂質のさらなる例としては、水添大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）が挙げられる。
一実施形態において、ベシクル形成成分は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＣＨＯＬ（コレステロール）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＴＡＴＥ、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］−ＴＡＴＥ）からなる群から選択される化合物を含む。
一実施形態において、ベシクル形成成分は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＣＨＯＬ（コレステロール）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＴＡＴＥ、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］−ＴＡＴＥ）及び水添大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）からなる群から選択される化合物を含む。
ナノ粒子組成物の別の実施形態において、ベシクル形成成分は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（Ａ）、コレステロール（Ｂ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）（Ｃ）からなる群から選択される両親媒性化合物からなり、Ａのモル比は４５〜６５であり、Ｂのモル比は３５〜４５であり、Ｃのモル比は２〜２０である（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＝１００）。
ナノ粒子組成物の好適な実施形態において、ベシクル形成成分は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（Ａ）、コレステロール（Ｂ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）（Ｃ）からなる群から選択される両親媒性化合物からなり、Ａのモル比は４５〜６５であり、Ｂのモル比は３５〜４５であり、Ｃのモル比は１〜２０である（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＝１００）。
別の好適な実施形態において、ベシクル形成成分は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＣＨＯＬ（コレステロール）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］）を５０：４０：１０のモル比で含む。
本願明細書に開示する方法の別の実施形態において、ベシクル形成成分は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（Ａ）、コレステロール（Ｂ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）（Ｃ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］−ＴＡＴＥ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ＴＡＴＥ）（Ｄ）からなる群から選択される両親媒性化合物からなり、Ａのモル比は４５〜６５であり、Ｂのモル比は３５〜４５であり、Ｃのモル比は５〜１３であり、Ｄのモル比は０〜３である（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００）。
放射性標識ナノ粒子組成物は、ナノ粒子が標的分子を有する標的細胞に特異的に結合することを可能とする標的部分又は病的標的に特異的に結合する部分をさらに含むことができる。標的部分は、脂質固定分子又はＰＥＧ複合脂質成分を介してナノ粒子組成物の表面に結合していてもよい。
ベシクル形成成分は、ナノ粒子が標的分子を有する細胞に特異的に結合することを可能とする標的部分として作用する抗体、アフィボディ又はペプチドの脂質複合体をさらに含むことができる。
ベシクル形成成分は、ナノ粒子が病的標的（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ）に特異的に結合することを可能とする標的部分として作用する抗体、アフィボディ又はペプチドの脂質複合体からなることができる。
本発明において有用な抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体又はより高次の多重特異性抗体であってもよい。例えば、多重特異性抗体は、正常な組織と比較して標的部位に多量に存在する可能性のあるサイトカイン、細胞又は酵素の複数のエピトープに特異的であってもよい。
本願明細書において使用する「抗体」という用語は、エピトープに特異的に結合するタンパク質を意味する。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。本発明において有用なモノクローナル抗体は、例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、リンフォサイド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、ビタキシン、Ｌｙｍ−１及びベバシズマブからなる群から選択される。好適な実施形態において、モノクローナル抗体は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、リンフォサイド、ビタキシン、Ｌｙｍ−１及びベバシズマブからなる群から選択される。
本願明細書において使用する「アフィボディ」という用語は、多くの標的タンパク質に特異的に結合するように設計することができる小さく、安定した抗原結合分子を意味する。アフィボディ分子は、様々な意味でモノクローナル抗体を模倣すると共に、多くの用途において有用な特有の性質を有する。用途の例としては、アフィボディを血管新生又は炎症部位の組織又は細胞を標的とするリポソーム組成物に脂質複合体として導入することが挙げられ、リポソーム組成物は、診断及び／又は治療用途のために61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ等の銅同位体等の放射性核種を含む。本発明において有用なアフィボディ分子は、例えば、抗ＥｒｂＢ２アフィボディ分子及び抗フィブリノゲンアフィボディ分子からなる群から選択される。
本発明において有用なぺプチドは、ナノ粒子が病的標的に特異的に結合することを可能とする標的部分として作用し、ＲＧＤ、ソマトスタチン、その類似体及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。一実施形態において、ぺプチドは、ＲＧＤ、ソマトスタチン、その類似体及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。一実施形態において、ソマトスタチン類似体はオクトレオテート（ＴＡＴＥ）である。
ベシクル形成成分は、所定の流動性又は剛性を達成し、生体内におけるリポソーム組成物の安定性を制御し、リポソーム組成物内の封入物質の放出速度を制御するように選択される。ベシクル形成成分によって決定されるリポソーム組成物の剛性は、標的細胞へのリポソームの融合又はエンドサイトーシスにおいても何らかの役割を果たす場合がある。
ベシクルの表面電荷も、生体内におけるリポソーム組成物の安定性を制御し、リポソーム組成物内の封入物質の放出速度を制御するために重要なベシクルの封入における因子である。従って、本発明において、ベシクル形成成分は形成されたベシクルの表面電荷を制御するように選択することができる。
物質封入成分
本発明に係る物質封入成分又は本発明に係る方法における物質封入成分は、放射性核種等の遷移金属又は放射性標識物質と共にキレート錯体を形成するキレート剤であることができる。
キレート剤（ＤＯＴＡ等）がリポソーム内部の水相に存在する場合、キレート剤との強固な結合によって膜障壁を透過する金属イオンが内膜小葉から除去されるため、リポソームの外部と内部との間の平衡のシフトが生じる。金属イオンとキレート剤の非常に効果的な錯体形成により、リポソーム内部の遊離金属イオン濃度は無視できる程度となり、全ての金属イオンがリポソームに封入されるか、平衡に達するまで封入が進行する。過剰なキレート剤を使用すると、リポソーム内の金属イオン濃度は封入時にわたって低くなり、膜内外勾配はリポソームの外部の遊離金属イオン濃度によって決まる。
本発明において、キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）及びその誘導体；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（シクレン）及びその誘導体；１，４−エタノ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｅｔ−シクラム）及びその誘導体；１，４，７，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｉｓｏシクラム）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン（［１３］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−二酢酸（ＤＯ２Ａ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジ（メタンホスホン酸）（ＤＯ２Ｐ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ（メタンホスホン酸）（ＤＯ３Ｐ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）及びその誘導体；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその誘導体；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びその誘導体；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体及びその他のアダマンザン及びその誘導体からなる群から選択されてもよい。
別の実施形態において、本発明に係る物質封入成分は、他の物質を還元することができる物質（還元剤）であってもよい。還元剤の例としては、アスコルビン酸、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース、麦芽糖、アセトールが挙げられる。
本発明の一実施形態において、Ｃｕ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）カチオンであってもよい封入銅同位体は、ベシクル膜を介した拡散時に低い酸化状態に還元され、銅同位体がベシクル内にトラップされる。別の実施形態において、銅とは異なる放射性核種は、ベシクル膜を介した拡散時に低い酸化状態に還元され、銅とは異なる放射性核種がベシクル内にトラップされる。
別の実施形態において、本発明又は本発明に係る方法の範囲に含まれる物質封入成分は、銅同位体等の放射性核種又は金属体と低溶解性塩を形成する物質であってもよい。そのような物質の例としては、リン酸銅、シュウ酸銅、塩化銅が挙げられる。一実施形態において、銅（Ｃｕ（ＩＩ）かＣｕ（Ｉ））と共に形成される低溶解性塩は、リン酸銅、シュウ酸銅、塩化銅からなる群から選択される。
本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において、物質封入成分は、アダマンザンを含む大環状化合物；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（［１２］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン（［１３］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（［１４］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン（［１５］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン（［１６］ａｎｅＮ4）及びその誘導体；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びその誘導体等の金属イオンと結合することができるその他のキレート剤からなる群から選択されるキレート剤である。
本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において，物質封入成分は、１，４−エタノ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｅｔ−シクラム）及びその誘導体；１，４，７，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｉｓｏ−シクラム）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）及びその誘導体；２−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）酢酸（ＤＯ１Ａ）及びその誘導体；２，２’−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジイル）二酢酸（ＤＯ２Ａ）及びその誘導体；２，２’，２’’−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジ（メタンホスホン酸）（ＤＯ２Ｐ）及びその誘導体；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ（メタンホスホン酸）（ＤＯ３Ｐ）及びその誘導体；１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体；２−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１−イル）酢酸（ＴＥ１Ａ）及びその誘導体；２，２’−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，８−ジイル）二酢酸（ＴＥ２Ａ）及びその誘導体；その他のアダマンザン及びその誘導体からなる群から選択されるキレート剤である。
本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において、物質封入成分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、シクラム及びシクレンからなる群から選択される。
本発明又は本発明に係る方法の特に重要な実施形態において、物質封入成分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。
イオノフォア
イオノフォアは、イオン輸送体、親油性キレート剤、チャネル形成剤、親油性錯体等として特徴付けられる。通常、イオノフォアは、細胞膜又はリポソームの脂質二重層を透過してイオンを輸送する脂溶性分子と定義することができる。イオノフォアは、脂質膜のイオン透過性を向上し、膜を透過する分子の移動を容易にするために使用される。イオノフォアは大きく２つに分類することができる。１つは、特定のイオン又は分子に結合又はキレート結合し、周囲の環境から電荷を保護し、脂質膜の疎水性の内部を越えることを容易にする化合物、移動性担体又は親油性キレート剤である。もう１つは、親水性細孔を膜に導入し、膜の疎水性内部との接触を防止しながら、分子又は金属イオンを通過させるチャネル形成剤である。
イオノフォア又はイオンの輸送又はナノ粒子への封入を行うことができる他の成分を使用する従来の方法では、得られるナノ粒子は少量の封入に使用されたイオン輸送体又はイオノフォアを含む。本発明が提供するナノ粒子は、イオノフォア等のイオン輸送体を使用せずに製造される。従って、本発明は、イオノフォア等のイオン輸送体を含まないナノ粒子に関する。
本発明の別の実施形態において、本願明細書に定義するナノ粒子組成物は、添加されたイオノフォアを含まない。
本発明のナノ粒子に含まれないイオン輸送体又はイオノフォア化合物は、８−ヒドロキシキノリン（オキシン）；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルコピラノシド；８−ヒドロキシキノリングルクロニド；８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩；８−キノリノールヘミ硫酸塩；８−キノリノールＮ−オキシド；２−アミノ−８−キノリノール；５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジヨード−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジメチル−８−キノリノール；５−アミノ−８−ヒドロキシキノリン二塩酸塩；５−クロロ−８−キノリノール；５−ニトロ−８−ヒドロキシキノリン；７−ブロモ−５−クロロ−８−キノリノール；Ｎ−ブチル−２，２’−イミノ−ジ（８−キノリノール）；８−ヒドロキシキノリン安息香酸；２−ベンジル−８−ヒドロキシキノリン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン塩酸；２−メチル−８−キノリノール；５−クロロ−７−ヨード−８−キノリノール；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノリン；８−ヒドロキシ−７−ヨード−５−キノリンスルホン酸；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、その他のキノリン（１−アザナフタレン、１−ベンザジン）及びそれらの誘導体からなる群から選択されてもよい。一実施形態において、イオノフォア化合物は、８−ヒドロキシキノリン（オキシン）；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルコピラノシド；８−ヒドロキシキノリングルクロニド；８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩；８−キノリノールヘミ硫酸塩；８−キノリノールＮ−オキシド；２−アミノ−８−キノリノール；５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジヨード−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジメチル−８−キノリノール；５−アミノ−８−ヒドロキシキノリン二塩酸塩；５−クロロ−８−キノリノール；５−ニトロ−８−ヒドロキシキノリン；７−ブロモ−５−クロロ−８−キノリノール；Ｎ−ブチル−２，２’−イミノ−ジ（８−キノリノール）；８−ヒドロキシキノリン安息香酸；２−ベンジル−８−ヒドロキシキノリン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン塩酸；２−メチル−８−キノリノール；５−クロロ−７−ヨード−８−キノリノール；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノリン；８−ヒドロキシ−７−ヨード−５−キノリンスルホン酸；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、その他のキノリン（１−アザナフタレン、１−ベンゾアジン）及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
本発明のナノ粒子に含まれないか、本発明の方法に使用されないイオン輸送体又はイオノフォア化合物は、２−ヒドロキシキノリン−４−カルボン酸；６−クロロ−２−ヒドロキシキノリン；８−クロロ−２−ヒドロキシキノリン；カルボスチリル１２４；カルボスチリル１６５；４，６−ジメチル−２−ヒドロキシキノリン；４，８−ジメチル−２−ヒドロキシキノリン；その他の２−キノリノール化合物；８−ヒドロキシキノリン（オキシン）；８−ヒドロキシキノリン β−Ｄ−ガラクトピラノシド；８−ヒドロキシキノリンβ−Ｄ−グルコピラノシド；８−ヒドロキシキノリングルクロニド；８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸；８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩；８−キノリノールヘミ硫酸塩；８−キノリノールＮ−酸化物；２−アミノ−８−キノリノール；５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジヨード−８−ヒドロキシキノリン；５，７−ジメチル−８−キノリノール；５−アミノ−８−ヒドロキシキノリン二塩酸塩；５−クロロ−８−キノリノール；５−ニトロ−８−ヒドロキシキノリン；７−ブロモ−５−クロロ−８−キノリノール；Ｎ−ブチル−２，２’−イミノ−ジ（８−キノリノール）；８−ヒドロキシキノリンベンゾエート；２−べンジル−８−ヒドロキシキノリン；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン塩酸塩；２−メチル−８−キノリノール；５−クロロ−７−ヨード−８−キノリノール；８−ヒドロキシ−５−ニトロキノリン；８−ヒドロキシ−７−ヨード−５−キノリンスルホン酸；５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン；その他のキノリン；（１−アザナフタレン，１−ベンザジン）及びその化合物及び誘導体、［６Ｓ−［６α（２Ｓ*，３Ｓ*），８β（Ｒ*）９β、１１α］］−５−（メチルアミノ）−２−［［３，９，１１−トリメチル−８−［１−メチル−２−オキソ−２−（１Ｈ−ピロール−２−イル）エチル］−１，７−ジオキサスピロ［５．５］ウンデカ−２−イルｌ］メチル］−４−ベンゾオキサゾールカルボン酸（Ａ２３１８７）、ＨＭＰＡＯ（ヘキサメチルプロピレンアミンオキシム、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン３−カルボン酸）、ＢＭＥＤＡ（Ｎ−Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−Ｎ’，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン）、ＤＩＳＩ ＤＡ（ジイソプロピルイミノ二酢酸、フタルジアルデヒド及びその誘導体、２，４−ジニトロフェノール及びその誘導体、ジベンゾ−１８−クラウン−６及びその誘導体、ｏ−キシリレンビス（Ｎ，Ｎ−ジイソブチルジチオカルバメート）及びその誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラシクロへキシル−２，２’−チオジアセトアミド及びその誘導体、２−（１，４，８，１１−テトラチアシクロテトラデカ−６−イルオキシ）ヘキサン酸、２−（３，６，１０，１３−テトラチアシクロテトラデカン−１−オキシ）ヘキサン酸及びその誘導体、Ν，Ν−ビス（２−メルカプトエチル）−Ｎ’，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン及びその誘導体、ボーベリシン、エンニアチン、グラミシジン、イオノマイシン、ラサロシド、モネシン、ナイジェリシン、ノナクチン、ナイスタチン、サリノマイシン、バリノマイシン、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ）、サルチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン（ＳＩＨ）、１，４，７−トリスメルカプトエチル−１，４，７−トリアザシクロノナン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２−メルカプトエチル）−１，４，７−トリアザシクロノナン、モネシス、ＤＰ−ｂ９９、ＤＰ−１０９、ＢＡＰＴＡ、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ）、アラメチシン、ジー２−ピリジルケトンチオセミカルバゾン（ＨＤｐＴ）、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、ラサロシドＡ（Ｘ−５３７Ａ）、ラサロシドの５−ブロモ誘導体；環状デプシペプチド；環状ペプチド：ＤＥＣＹＬ−２；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラブチル−３，６−ジオキサオクタンチオアミド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラシクロヘキシル−３−オキサペンタンジアミド；Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ’，Ｎ’−ジオクタデシルジグリコールジアミド；Ｎ，Ｎ’−ジヘプチル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，−ブタンジアミド；Ｎ，Ｎ”−オクタメチレンビス［Ｎ’−へプチル−Ｎ’−メチル−マロンアミド；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ジプロピル−３，６−ジオキサオクタンジアミド；Ｎ−［２−（１Ｈ−ピロリルメチル）］−Ｎ’−（４−ペンテン−３−オン−２）−エタン−１，２−ジアミン（ＭＲＰ２０）；抗真菌毒素類；アベナシオリド、上記イオノフォアの誘導体、ＷＯ２０１１／００６５１０に記載されたイオノフォア及びその他の公知のイオノフォアからなる群から選択されてもよい。
ｐＨ勾配封入剤（中性のイオン化可能な部位によって金属体がリポソーム膜を透過することを可能とし、荷電形態に転化することによって金属体をリポソーム内に封入された状態とする１以上のイオン化可能な部位を有する物質）も本発明に係るイオノフォアとみなすことができる。イオン化可能な部位は、アミン基、カルボン酸基及び水酸基を含むことができる。酸性内部環境に応答して封入するｐＨ勾配封入剤は、酸性環境に応答して荷電されるイオン化可能な部位を含むことができ、塩基性内部環境に応答して封入する薬物は、塩基性環境に応答して荷電される部位を含む。塩基性内部環境の場合には、カルボン酸又は水酸基を含むイオン化可能な部位を使用することができる。
内部ｐＨ
本発明に係るナノ粒子の内部ｐＨは、ナノ粒子の特徴が最適化される範囲に制御することができる。
本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において、リポソーム組成物の内部ｐＨを制御して物質封入成分及び／又はイオノフォアを所望のプロトン化状態とし、放射性核種の効率的な封入を行う。
本発明又は本発明に係る方法の好適な実施形態において、リポソーム組成物の内部ｐＨを制御して物質封入成分を所望のプロトン化状態とし、放射性核種の効率的な封入を行う。
本発明又は本発明に係る銅同位体を封入したナノ粒子組成物の製造方法の別の実施形態において、ナノ粒子の合成時に、ナノ粒子の内部ｐＨが１〜１０、例えば１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９又は９〜１０となるように内部ｐＨを制御する。
本発明の好適な実施形態において、ナノ粒子の内部ｐＨは４〜８．５、例えば４．０〜４．５、４．５〜５．０、５．０〜５．５、５．５〜６．０、６．０〜６．５、６．５〜７．０、７．０〜７．５、７．５〜８又は８．０〜８．５である。
本発明の別の実施形態において、本発明に係るナノ粒子の内部ｐＨはナノ粒子の安定性を向上させるように最適化する。そのような安定性の向上により、例えば、有効期間を増加させたり、より広範な保存温度を採用することができ、ナノ粒子の使用が容易となる。例えば、内部ｐＨにより、放射性核種の封入と関係する又は放射性核種の封入とは無関係な物質封入成分の安定性の向上又はナノ粒子のその他の特徴の安定性の向上によってベシクルを形成するベシクル形成成分の安定性が向上し、安定性の向上が得られる。安定性の向上のために最適化された内部ｐＨは、１〜１０、例えば１〜２、例えば２〜３、例えば３〜４、例えば４〜５、例えば５〜６、例えば６〜７、例えば７〜８、例えば８〜９、例えば９〜１０であってもよい。
本発明の好適な実施形態において、ナノ粒子の安定性を向上させる内部ｐＨは、４〜８．５、例えば４．０〜４．５、例えば４．５〜５．０、例えば５．０〜５．５、例えば５．５〜６．０、例えば６．０〜６．５、例えば６．５〜７．０、例えば７．０〜７．５、例えば７．５〜８、例えば８．０〜８．５である。
浸透圧
ナノ粒子内に金属体及び／又は放射性核種を封入する場合には、ベシクル又はナノ粒子膜に小さな浸透圧ストレスを生じさせることが有利である。浸透圧ストレスは浸透圧差（内部及び外部オスモル濃度の不均衡又は差）である。浸透圧ストレスの存在により、小さなイオン（金属イオン又は放射性核種イオン等）の膜を通過する移動が容易に生じ、キレート剤等の大きな荷電分子はナノ粒子内に封入された状態で残る。
本発明によれば、リポソーム内への封入は、リポソームの製造時のリポソーム内に封入される水溶液及び外部溶液のオスモル濃度を制御することによって調節することができる。オスモル濃度（Ｏｓｍ）は（化学ポテンシャルの関数としての）水の活性の尺度であり、水溶液中のキレート剤及びその他の浸透圧的な活性薬剤を含む溶質の存在によって決まる。オスモライトの膜透過勾配はリポソームの状態に影響を与え、リポソームは水分の喪失のために柔弱になるか（Ｏｓｍinterior＜Ｏｓｍexterior）、水分の取り込みのために緊張し、浸透圧性膜透過圧力（Ｏｓｍinterior＞Ｏｓｍexierior）及び膜張力が生じる。通常、膜張力によって膜は伸張して二重層が薄くなり、透過性は増大する。また、膜張力によって欠陥（一時的な細孔）が形成され、膜透過性は増大する。従って、膜透過性は高浸透圧力（Ｏｓｍinterior＞Ｏｓｍexterior）とともに増大し、封入速度及び封入効率が高まると予想される。浸透圧（張力）が高すぎると、リポソームの溶解が誘発され、内容物のゆるやかな放出又はリポソームの機械的破損が生じる。例えば、１００ｎｍのベシクルを封入されたベシクル内媒体に対して低浸透圧溶液に入れると、水の流入が生じ、ベシクルは球形状となり、十分な浸透圧差によって膜が破壊され、ベシクル内溶質が部分的に放出される。しかしながら、膜内に存在するコレステロールは機械的安定性を与え、膜溶解張力を増加させ、それによって全体として浸透圧の不均衡に対してより高い耐性が得られる。
リポソーム内オスモル濃度は、リポソーム調製時に脂質膜を水和するために使用される溶液のオスモル濃度を従来の方法（オスモル濃度測定装置に通常使用される凝固点法等）で測定することによって得ることができる。また、同様な方法によってリポソーム外部の緩衝液のオスモル濃度を測定することができる。重要なこととして、緩衝液のオスモル濃度は緩衝液調整時の（例えば、ＮａＯＨ又はＨＣＩを使用する）ｐＨ調節の影響をに容易に受ける。
本発明の好適な実施形態において、オスモル濃度は凝固点法を使用して測定する。
オスモル濃度を制御することによって浸透圧ストレスを生成することができる。そのような浸透圧ストレスは、糖、塩、キレート剤、イオン、ペプチド、タンパク質、医薬化合物、緩衝液分子及び／又は溶質等の浸透性物質をナノ粒子に封入することによって制御することができる。
本発明の一実施形態において、ナノ粒子の内部のオスモル濃度は、４０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば４０〜１００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１００〜１５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１５０〜２００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２００〜２５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２５０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３００〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４００〜４５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５００〜５５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５５０〜６００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６５０〜７００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７００〜７５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７５０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌである。
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子の外部のオスモル濃度は、４０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば４０〜１００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１００〜１５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１５０〜２００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２００〜２５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２５０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３００〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４００〜４５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５００〜５５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５５０〜６００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６５０〜７００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７００〜７５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７５０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌである。
本発明の一実施形態において、ナノ粒子の内部とナノ粒子の外部との間のオスモル濃度の差は、５〜８００ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば５〜１０ｍＯｓｍ／Ｌ、例えば１０〜２０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１０〜２０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２０〜２０〜３０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３０〜４０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４０〜５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５０〜６０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６０〜７０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６０〜７０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７０〜８０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば８０〜９０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば９０〜１００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１００〜１５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば１５０〜２００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２００〜２５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば２５０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３００〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば３５０〜４００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４００〜４５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば４５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５００〜５５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば５５０〜６００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば６５０〜７００ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７００〜７５０ｍＯｓｍ／Ｌ又は例えば７５０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌである。
本発明の特定の実施形態において、前記ナノ粒子の外部と前記ナノ粒子の内部との間のオスモル濃度の差は１０〜１００ｍＯｓｍ／Ｌである。
安定性
本発明のナノ粒子は向上した安定性を有し、安定性は様々な試験を使用して測定することができる。
本発明の一実施形態において、放射性標識ナノ粒子は、緩衝液又はヒト血清内における所定時間の培養後に２０％未満の放射線の漏出が観察される安定性を有する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー又は透析等の精製を含む従来の方法によって測定した放射線の漏出は、２０％未満、例えば１５％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、例えば６％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満である。放射性核種等の金属体の量は、放射性検出器を使用して放射線として測定するか、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）又は誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用して金属体の濃度を測定することによって測定することができる。
本発明の一実施形態において、放射性標識ナノ粒子は、３７℃の緩衝液又はヒト血清中で２４時間培養し、漏出した放射性核種から放射性標識ナノ粒子を分離するための精製後に、２０％未満、例えば１５％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、例えば６％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満の放射線の漏出が観察される安定性を有する。前記精製は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー又は透析を含む。放射性核種等の金属体の量は、放射性検出器を使用して放射線として測定するか、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）又は誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用して金属体の濃度を測定することによって測定する。
ナノ粒子のサイズ
本発明に係るナノ粒子は任意のサイズを有していてもよい。ナノ粒子のサイズは、例えば、人体の部位に対するナノ粒子の標的性を向上させるか、人体内のナノ粒子の監視を向上させるためにナノ粒子を対象者に投与する用途のために最適化することができる。また、ナノ粒子のサイズは、ナノ粒子の安定性を向上させるか、ナノ粒子の製造を改善又は容易化するために最適化することができる。
一実施形態において、本発明のナノ粒子組成物は、３０ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜３００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜６０ｎｍ、例えば６０ｎｍ〜８０ｎｍ、例えば８０ｎｍ〜１００ｎｍ、例えば１００ｎｍ〜１２０ｎｍ、例えば１２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、例えば１５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、例えば１８０ｎｍ〜２１０ｎｍ、例えば２１０ｎｍ〜２４０ｎｍ、例えば２４０ｎｍ〜２７０ｎｍ、例えば２７０ｎｍ〜３００ｎｍ又は例えば３００ｎｍ〜６００ｎｍ、例えば３００ｎｍ〜４００ｎｍ又は例えば４００ｎｍ〜５００ｎｍ又は例えば５００ｎｍ〜６００ｎｍ又は例えば６００ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば６００ｎｍ〜７００ｎｍ又は例えば７００ｎｍ〜８００ｎｍ又は例えば８００ｎｍ〜９００ｎｍ又は例えば９００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有する。
一実施形態において、本願明細書に開示する放射性核種が封入されたナノ粒子組成物の製造方法により、３０ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜３００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜６０ｎｍ、例えば６０ｎｍ〜８０ｎｍ、例えば８０ｎｍ〜１００ｎｍ、例えば１００ｎｍ〜１２０ｎｍ、例えば１２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、例えば１５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、例えば１８０ｎｍ〜２１０ｎｍ、例えば２１０ｎｍ〜２４０ｎｍ、例えば２４０ｎｍ〜２７０ｎｍ、例えば２７０ｎｍ〜３００ｎｍ又は例えば３００ｎｍ〜６００ｎｍ、例えば３００ｎｍ〜４００ｎｍ又は例えば４００ｎｍ〜５００ｎｍ又は例えば５００ｎｍ〜６００ｎｍ又は例えば６００ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば６００ｎｍ〜７００ｎｍ又は例えば７００ｎｍ〜８００ｎｍ又は例えば８００ｎｍ〜９００ｎｍ又は例えば９００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有するナノ粒子が得られる。
一実施形態において、本願明細書に開示する銅が封入されたナノ粒子組成物の製造方法により、３０ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜３００ｎｍ、例えば３０ｎｍ〜６０ｎｍ、例えば６０ｎｍ〜８０ｎｍ、例えば８０ｎｍ〜１００ｎｍ、例えば１００ｎｍ〜１２０ｎｍ、例えば１２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、例えば１５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、例えば１８０ｎｍ〜２１０ｎｍ、例えば２１０ｎｍ〜２４０ｎｍ、例えば２４０ｎｍ〜２７０ｎｍ、例えば２７０ｎｍ〜３００ｎｍ又は例えば３００ｎｍ〜６００ｎｍ、例えば３００ｎｍ〜４００ｎｍ又は例えば４００ｎｍ〜５００ｎｍ又は例えば５００ｎｍ〜６００ｎｍ又は例えば６００ｎｍ〜１０００ｎｍ、例えば６００ｎｍ〜７００ｎｍ又は例えば７００ｎｍ〜８００ｎｍ又は例えば８００ｎｍ〜９００ｎｍ又は例えば９００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有するナノ粒子が得られる。
好適な実施形態において、本発明のナノ粒子組成物は、３０〜３００ｎｍ、例えば３０〜６０ｎｍ、例えば６０〜８０ｎｍ、例えば８０〜１００ｎｍ、例えば１００〜１２０ｎｍ、例えば１２０〜１５０ｎｍ、例えば１５０〜１８０ｎｍ、例えば１８０〜２１０ｎｍ、例えば２１０〜２４０ｎｍ、例えば２４０〜２７０ｎｍ、例えば２７０〜３００ｎｍの直径を有する。
好適な実施形態において、本願明細書に開示する放射性核種を封入したナノ粒子の製造方法により、３０〜３００ｎｍ、例えば３０〜６０ｎｍ、例えば６０〜８０ｎｍ、例えば８０〜１００ｎｍ、例えば１００〜１２０ｎｍ、例えば１２０〜１５０ｎｍ、例えば１５０〜１８０ｎｍ、例えば１８０〜２１０ｎｍ、例えば２１０〜２４０ｎｍ、例えば２４０〜２７０ｎｍ、例えば２７０〜３００ｎｍの直径を有するナノ粒子が得られる。
好適な実施形態において、本願明細書に開示する銅を封入したナノ粒子の製造方法により、３０〜３００ｎｍ、例えば３０〜６０ｎｍ、例えば６０〜８０ｎｍ、例えば８０〜１００ｎｍ、例えば１００〜１２０ｎｍ、例えば１２０〜１５０ｎｍ、例えば１５０〜１８０ｎｍ、例えば１８０〜２１０ｎｍ、例えば２１０〜２４０ｎｍ、例えば２４０〜２７０ｎｍ、例えば２７０〜３００ｎｍの直径を有するナノ粒子が得られる。
製造方法
本発明は、ベシクル形成成分と、前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、ナノ粒子組成物内に封入された金属体と、を含むナノ粒子組成物の製造方法を提供する。
本発明に係るナノ粒子組成物の製造方法は、
ａ．ベシクル形成成分と、前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物を用意する工程と、
ｂ．金属体を含む溶液内において前記ナノ粒子組成物を２２℃よりも高い温度で培養することによって前記ナノ粒子組成物の内部に金属体を封入する工程と、
を含む。
封入のためにイオノフォアを使用することを含まない、本発明に係るナノ粒子組成物の好適な製造方法は、
ａ．ベシクル形成成分と、前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物を用意する工程と、
ｂ．金属体を含む溶液内において前記ナノ粒子組成物を培養することにより、前記ベシクル形成成分の膜を透過するカチオン金属体の移動を可能とすることによって前記ナノ粒子組成物の内部に前記金属体を封入する工程と、
を含む。
一実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は、２２℃、例えば３０℃、例えば３５℃、例えば４０℃、例えば４５℃、例えば５０℃、例えば５５℃、例えば６０℃、例えば６５℃、例えば７０℃、例えば７５℃よりも高い。
別の実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は、１０℃、例えば１５℃、例えば２２℃、例えば３０℃、例えば３５℃、例えば４０℃、例えば４５℃、例えば５０℃、例えば５５℃、例えば６０℃、例えば６５℃、例えば７０℃、例えば７５℃よりも高い。
本発明に係る方法では、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は、ナノ粒子が劣化する臨界温度より低い。本発明において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は１００℃、例えば９０℃、例えば８５℃、例えば８０℃未満である。
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は、２２〜８０℃、例えば２２〜３０℃又は例えば３０〜８０℃、例えば３０〜４０℃、例えば３０〜３５℃又は例えば３５〜４０℃又は例えば４０〜８０℃、例えば４０〜４５℃又は例えば４５〜５０℃、例えば５０〜８０℃、例えば５０〜５５℃又は例えば５５〜６０℃又は例えば６０〜６５℃又は例えば６５〜７０℃又は例えば７０〜７５℃又は例えば７５〜８０℃であり、３０〜８０℃が好ましく、４０〜８０℃がより好ましい。
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は、１０〜８０℃、例えば１５〜８０℃又は例えば１５〜２２℃又は例えば２２〜８０℃、例えば２２〜３０℃、例えば３０〜８０℃、例えば３０〜４０℃、例えば３０〜３５℃又は例えば３５〜４０℃又は例えば４０〜８０℃、例えば４０〜４５℃又は例えば４５〜５０℃、例えば５０〜８０℃、例えば５０〜５５℃又は例えば５５〜６０℃又は例えば６０〜６５℃又は例えば６５〜７０℃又は例えば７０〜７５℃又は例えば７５〜８０℃であり、３０〜８０℃が好ましく、４０〜８０℃がより好ましい。
本発明の方法により、ナノ粒子内に金属体／放射性核種を単に拡散させる場合と比較して迅速にナノ粒子内に金属体／放射性核種を封入することができる。
本発明の一実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養は、４８時間未満、例えば３６〜４８時間又は例えば２４〜３６時間又は例えば１８〜２４時間又は例えば１６〜１８時間又は例えば１４〜１６時間又は例えば１２〜１４時間又は例えば１０〜１２時間又は例えば８〜１０時間又は例えば６〜８時間又は例えば４〜６時間又は例えば２〜４時間又は例えば１〜２時間又は例えば３０〜６０分間又は５〜３０分間又は１〜５分間にわたって行うことができる。
本発明に係る培養時間は、４８時間未満、例えば０〜３６０分間、例えば１〜２４０分間、好ましくは１〜１２０分間（例えば３〜１２０分間又は５〜１２０分間）、より好ましくは１〜６０分間、例えば５〜６０分間である。
本発明の方法は、本願明細書に定義する浸透圧ストレスをナノ粒子に生じさせる１以上の工程を含むことができる。本願発明者らは、ナノ粒子の内部とナノ粒子の外部との間のオスモル濃度の差によってナノ粒子内への金属体の封入が向上することを見出した。浸透圧ストレスは、ナノ粒子の内部イオン濃度と外部イオン濃度を不均衡にしてベシクルの膜を介して浸透圧の差を生じさせることによって生じさせることができる。
そのような浸透圧ストレス又は浸透圧は、塩、糖、イオン、キレート、ペプチド、タンパク質、医薬化合物、バッファ分子及び／又は他の溶質等の封入浸透性物質によって制御することができる。
本発明の一実施形態において、膜の浸透圧は、工程ａ）において、封入を向上させるオスモル濃度を有し、１種以上の本願明細書に定義する浸透性物質を含む溶液を使用してナノ粒子組成物を用意することによってナノ粒子の内部のオスモル濃度を制御することにより得られる。
本発明の別の実施形態において、膜の浸透圧は、工程ｂ）において、封入を向上させるオスモル濃度を有し、１種以上の本願明細書に定義する浸透性物質を含む溶液を使用してナノ粒子組成物を培養することによってナノ粒子の外部のオスモル濃度を制御することにより得られる。
本発明の一実施形態において、培養開始時点におけるナノ粒子の内部と培養溶液（ナノ粒子の外部）との間のオスモル濃度の差は５〜８００ｍＯｓｍ／Ｌである。
本発明の方法によれば、製造に使用する多量の放射性核種をナノ粒子内に封入することができる。本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ（実施例を参照））、イオン交換クロマトグラフィー又は透析によって測定した封入効率は９０％よりも高い。本発明に係る方法の別の実施形態において、封入効率は、３５％、例えば４０％、例えば５０％、例えば６０％、例えば６５％、例えば７０％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％又は例えば９６％又は例えば９７％又は例えば９８％又は例えば９９％よりも高い。
本発明の一実施形態において、培養時間が１〜２４０分間の場合の封入効率は、１０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％、例えば９５〜１００％（例えば９５〜９９．９％、例えば９５〜９９％）である。
本発明の一実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は３０〜８０℃であり、培養時間が１〜２４０分間の場合の封入効率は、１０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％、例えば９５〜１００％（例えば９５〜９９．９％、例えば９５〜９９％）である。
本発明の好適な実施形態において、ナノ粒子に金属体を封入するための培養温度は３０〜８０℃であり、培養時間が１〜６０分間の場合の封入効率は、１０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、例えば９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％、例えば９５〜９９．９％又は例えば９５〜９９％である。
本発明の方法は、金属体が封入されたナノ粒子を工程ｂ）で使用する培養溶液から精製する工程を含むことができる。本発明又は本発明に係る方法の一実施形態において、放射性核種が封入されたナノ粒子をＳＥＣ、イオン交換クロマトグラフィー又は透析によって精製する。
本発明又は本発明に係る方法の好適な実施形態において、銅が封入されたナノ粒子をＳＥＣ、イオン交換クロマトグラフィー又は透析によって精製する。
本発明に係る方法の一実施形態において、ナノ粒子への銅の封入後もナノ粒子組成物のサイズは実質的に同じである。本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への銅同位体の封入によるナノ粒子組成物のサイズの変化は、２０％未満、例えば１７％未満、例えば１４％未満、例えば１１％未満、例えば８％未満、例えば５％未満、例えば２％未満、例えば１％未満である。
本発明に係る方法の一実施形態において、ナノ粒子への放射性核種の封入後もナノ粒子組成物のサイズは実質的に同じである。本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への放射性核種の封入によるナノ粒子組成物のサイズの変化は、２０％未満、例えば１７％未満、例えば１４％未満、例えば１１％未満、例えば８％未満、例えば５％未満、例えば２％未満、例えば１％未満である。
本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への銅同位体の封入によるゼータ電位の変化は２０％未満である。本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への銅同位体の封入によるゼータ電位の変化は、１８％未満、例えば１６％未満、例えば１４％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満である。
本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への放射性核種の封入によるゼータ電位の変化は２０％未満である。本発明に係る方法の別の実施形態において、ナノ粒子への放射性核種の封入によるゼータ電位の変化は、１８％未満、例えば１６％未満、１４％未満、１２％未満又は１０％未満である。
ナノ粒子組成物の製造方法の別の実施形態において、物質封入成分のプロトン化又は脱プロトン反応によってリポソームの内部ｐＨを制御して放射性核種の効率的な封入を行う。
本願明細書に開示するナノ粒子組成物の製造方法は、癌性疾患（通常は、血管からの出血を伴う病理学的症状）を標的とするナノ粒子の外層に部位を結合させる工程をさらに含むことができる。本発明の別の実施形態において、ナノ粒子組成物の製造方法は、核局在配列ペプチド（ＮＬＳペプチド）等の細胞内ターゲティング特性を有する化合物を物質封入成分に結合及び／又はナノ粒子組成物内に封入させる工程をさらに含む。
本願明細書に開示するナノ粒子組成物の製造方法は、ナノ粒子組成物内に封入された放射性核種から放射される放射線の量を測定及び／又は検出する工程をさらに含むことができる。
本発明に係る方法は、イオノフォア等のイオン輸送体の使用を含まない。そのため、本発明に係る方法によって得られるナノ粒子は、イオン輸送体、親油性キレート剤又はイオノフォアを含まない。
キット・オブ・パーツ
本発明は、ナノ粒子を製造するためのキット・オブ・パーツを提供する。
本発明によれば、キット・オブ・パーツは、
ａ．ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物と、
ｂ．前記ナノ粒子に封入される金属体を含む組成物と、
を含むことができる（各成分は本願明細書に記載するとおりである）。
一実施形態において、金属体を含む組成物は放射性核種を含む。
金属体又は放射性核種は、特定の放射性核種の特性に応じて保管するか、製造者から供給を受ける。放射性核種は、（凍結乾燥された）塩又は水溶液として供給を受けるか、既存の生産設備及び開始材料を使用して合成することができる。放射性核種を含むナノ粒子の投与前に、キットのパーツａ及びｂを混合し、２２℃よりも高い温度で所定時間にわたって培養する。培養温度及び培養時間は本願明細書に記載するとおりである。
その後、好ましくはキットと共に供給された簡易試験手順を使用して封入効率の試験を行う。試験後、医薬を患者に投与する。
本発明によれば、キット・オブ・パーツは、ａ）ベシクル形成成分と、ｂ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物と、ｃ）前記ナノ粒子に封入される金属体を含む組成物の混合物を含むことができる（各成分は本願明細書に記載するとおりである）。放射性核種を含むナノ粒子の投与前に、パーツａ、ｂ及びｃの混合物を２２℃よりも高い温度で所定時間にわたって培養する。培養温度及び培養時間は本願明細書に記載するとおりである。
金属体が放射性核種、例えば陽電子放射の64Ｃｕを含む場合には、放射性核種は（凍結乾燥された）塩又は水溶液として使用直前にサイクロトロン施設から治療又は診断場所に直接供給する。放射性核種を含むナノ粒子の投与前に、キットのパーツａ、ｂ及びｃを混合し、好ましくはキットと共に供給された簡易試験手順を使用して封入効率の試験を行う。投与後に、患者に対してＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャンを行うことができる。最適な可視化は、投与から４〜４８時間後に達成される場合がある。
本発明の別の実施形態において、本願明細書に記載するようにナノ粒子組成物を投与した後、患者に対して磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行うことができる。本発明では、ＭＲＩをＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャンと組み合わせてもよく、組み合わせなくてもよい。
本発明によれば、キット・オブ・パーツは、
ａ．ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、ｉｉｉ）ＭＲＩに有用な金属体と、を含むナノ粒子組成物と、
ｂ．前記ナノ粒子に封入される１種以上の金属体を含む組成物と、
を含む（各成分は本願明細書に記載するとおりである）か、
ａ．ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物と、
ｂ．前記ナノ粒子に封入される１種以上の金属体を含む組成物と、
を含む（各成分は本願明細書に記載するとおりである）ことができる。
本発明の一実施形態において、キット・オブ・パーツは、64Ｃｕ及び177Ｌｕ又は64Ｃｕ及び67Ｃｕ又は61Ｃｕ及び67Ｃｕ又は64Ｃｕ及び90Ｙ又は64Ｃｕ及び119Ｓｂ又は64Ｃｕ及び225Ａｃ又は64Ｃｕ及び188Ｒｅ又は64Ｃｕ及び186Ｒｅ又は64Ｃｕ及び211Ａｔ等の放射性核種の組み合わせ等の、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び放射線療法の組み合わせに有用な放射性核種の組み合わせを含む。
本発明の好適な実施形態において、キット・オブ・パーツは、64Ｃｕ及び177Ｌｕ等の、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び放射線療法の組み合わせに有用な放射性核種の組み合わせを含む。
本発明の別の実施形態において、キット・オブ・パーツは銅同位体（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）等の放射性核種を含むナノ粒子の製造に使用され、同位体はキット・オブ・パーツのパーツであってもよく、キット・オブ・パーツのパーツでなくてもよい。本発明の上記実施形態において、キット・オブ・パーツは、ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物を含むことができる。本発明の別の実施形態において、キット・オブ・パーツは、ナノ粒子内に金属体を封入するための培養緩衝液をさらに含む。
好適な実施形態において、キット・オブ・パーツは、封入効率を評価するための試験手順をさらに含む。
本発明に係るナノ粒子を製造するためのキット・オブ・パーツは、イオノフォア等のイオン輸送体を含まない。
治療又は診断方法
本発明のナノ粒子は、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトにおける、血管からの出血を伴う疾患又は症状を診断、監視又は治療するために使用することができる。
血管からの出血は、血管新生又は組織の腫瘍性成長に関連する場合が多い。癌は、血管からの出血を特徴とする疾患の一例である。炎症は、血管からの出血を特徴とする疾患の別の例である。
癌は血管からの出血を特徴とする疾患であり、本発明は、唇、口又は喉の悪性新生物等の悪性新生物形成、例えば、舌、舌根、歯茎、口腔底、口蓋、耳下腺、大唾液腺、扁桃、口腔咽頭、鼻咽頭、梨状陥凹、咽喉頭又は唇、口又は喉のその他の部分の悪性新生物又は消化器官の悪性新生物、例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸Ｓ状結腸接合部接合、直腸、肛門及び肛門管、肝臓、肝内胆管、胆嚢、胆道のその他の部分、膵臓及び脾臓の悪性新生物、呼吸及び胸郭内器官の悪性新生物、例えば、鼻腔、中耳、副洞、喉頭、気管、気管支、肺、胸線、心臓、縦隔及び胸膜の悪性新生物、骨及び関節軟骨の悪性新生物、例えば、四肢の骨及び関節軟骨、骨及び関節軟骨の悪性新生物、皮膚、皮脂腺及び汗腺の悪性黒色腫、中皮及び軟部組織の悪性新生物、例えば、中皮腫の悪性新生物、カポジ肉腫、末梢神経及び自律神経系の悪性新生物、後腹膜及び腹膜の悪性新生物、結合及び軟組織の悪性新生物、例えば、血管、滑液包、軟骨、筋膜、脂肪、じん帯、リンパ輸送管、筋肉、滑液、腱、頭、顔、首、腹、骨盤及び結合及び軟組織の重複病変の悪性新生物、乳房及び女性生殖器の悪性新生物、例えば、外陰部、膣、子宮頚部、子宮体、子宮、卵巣、卵管、胎盤の悪性新生物、男性生殖器の悪性新生物、例えば、陰茎、前立腺、睾丸の悪性新生物、尿路の悪性新生物、例えば、腎臓、腎孟、輸尿管、膀胱、尿道又はその他の泌尿器官の悪性新生物、眼、脳及び中枢神経系のその他の部分の悪性新生物、例えば、眼及び付属器、髄膜、脳、脊椎、脳神経及び中枢神経系のその他の部分の悪性新生物、甲状腺及びその他の内分泌腺の悪性新生物、例えば、甲状腺、副腎、傍甲状腺、下垂体、頭蓋咽頭管、松果腺、頸動脈小体、大動脈体及びその他の傍神経節の悪性新生物、頭、顔、首、胸郭、腹及び骨盤の悪性新生物、リンパ節、呼吸及び消化器器官、腎臓、腎孟、膀胱、腎孟及びその他の泌尿器官の続発性悪性新生物、皮膚、脳、脳膜、神経系のその他の部分、骨、骨髄、卵巣及び副腎の続発性悪性新生物、リンパ系、造血性及び関連組織の悪性新生物、例えば、ホジキン病、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性非ホジキンリンパ腫、末梢性及び皮膚Ｔ細胞性悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ肉腫、悪性免疫増殖性疾患、例えば、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、アルファ重鎖病、ガンマ重鎖病、免疫増殖性小腸疾患、多発性骨髄腫瘍、悪性形質細胞腫、例えば、形質細胞性白血病、形質細胞腫、単発性骨髄腫、リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、単球性白血病、芽細胞白血病、幹細胞白血病、リンパ系、造血性及び関連組織のその他の悪性新生物、例えば、レッテレルーシヴェ病、髄索性組織球性細網症、悪性肥満細胞腫瘍、組織球性リンパ腫又はその他の悪性新生物形成等の癌性疾患の治療、監視又は診断に関する。
本発明によれば、血管からの出血を伴う疾患は、口腔、食道、胃、消化器官、中耳及び呼吸器系の上皮内癌、表皮内黒色腫、皮膚の上皮内癌、乳房の上皮内癌、女性又は男性生殖器の上皮内癌、膀胱、泌尿器官、眼、甲状腺及びその他の内分泌腺の上皮内癌又はその他の上皮内癌であってもよい。
本発明のナノ粒子又はベシクルは、好ましくはヒト等の対象者に投与するためのものである。
本発明によれば、ナノ粒子は、出血した血管を含む組織にナノ粒子を送達するように対象者に投与することができる。そのような投与により、ナノ粒子は血液又はリンパ液内を循環される。
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子は静脈内投与に使用される。
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子は経口投与に使用される。
本発明に係るベシクル又はナノ粒子は、１種以上の撮影に使用することができる。撮影は、疾患の治療、監視又は診断、化学療法又は放射線療法による治療の有効性の監視又は血管からの出血を伴う症状の監視のための方法の一部であってもよく、そのような方法の一部でなくてもよい。本発明に係る撮影は、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び核シンチグラフィを含む。
本発明の一実施形態において、本発明は、対象者の監視、治療有効性の監視、診断又は治療のための方法であって、
ａ．ベシクル形成成分と、物質封入成分と、１種以上の封入金属体と、を含むナノ粒子組成物を用意することと、
ｂ．前記ナノ粒子組成物を投与を必要とする対象者に投与することと、
を含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態において、本発明は、対象者の監視、治療有効性の監視、診断又は治療のための方法であって、
ａ．ベシクル形成成分と、物質封入成分と、ナノ粒子内に封入された１種以上の放射性核種と、を含むナノ粒子組成物を用意することと、
ｂ．前記ナノ粒子組成物を対象者に静脈内投与することと、
ｃ．所与の培養時間後にリポソーム組成物内における放射性核種から放射された放射線量を測定することと、
を含むか、
ａ．ベシクル形成成分と、物質封入成分と、ナノ粒子内に封入された１種以上の金属体と、を含むナノ粒子組成物を用意することと、
ｂ．前記ナノ粒子組成物を対象者に静脈内投与することと、
ｃ．従来の画像検査法を使用して前記対象者における前記金属体の存在及び／又は位置を測定することと、
を含む方法を提供する。
本発明の一実施形態において、本発明は、癌の監視、治療有効性の監視、診断又は治療のための方法であって、ａ．ベシクル形成成分と、物質封入成分と、Ｃｕ（ＩＩ）カチオン又はＣｕ（Ｉ）カチオンであってもよい銅同位体61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕの１種以上の放射性核種を含む放射性標識物質と、を含むナノ粒子組成物を用意することと、ｂ．前記ナノ粒子組成物を対象者に静脈内投与することと、ｃ．所与の培養時間後にリポソーム組成物内における前記放射性核種から放射された放射線量を測定することと、を含む方法を提供する。
実施例Ｉ
キレート剤を含むリポソームへの64Ｃｕ及び／又は177Ｌｕの改良された封入
キレート剤含有リポソーム組成物の調製
通常の薄膜水和反応及び反復押出を使用し、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）（モル比：５０：４０：１０）から形成したリポソーム内にキレート剤（ＤＯＴＡ）を封入した。簡単に説明すると、緩やかな窒素流下において脂質をクロロホルム内で混合し、乾燥して脂質膜を得た。残留有機溶媒を減圧下で一晩にわたって除去した。水溶液（キレート剤（ＤＯＴＡ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）（ｐＨ４．０又はｐＨ７．４、濃度：１０ｍＭ）を添加して脂質膜を分散させ、オスモル濃度を測定したところ、３２５ｍＯｓｍ／Ｌだった。次に、溶液を６５℃で６０分間にわたって水和した。ミニ押出機を使用し、多層膜ベシクル（ＭＬＶ）を１００ｎｍポリカーボネートフィルターによって反復押出して巨大単一膜ベシクル（ＬＵＶ）を得た。封入されなかったキレート剤をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ １×２５ｃｍ充填カラムを使用、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３１０ｍＯｓｍ／Ｌ）で溶出）で除去した。
リポソームへの放射性核種の封入
上述したように調製したリポソームの懸濁液を、放射性核種64Ｃｕ及び／又は177Ｌｕを含む乾燥させたバイアルに添加した。懸濁液を５０〜５５℃で６０分間にわたって培養した。放射性核種の封入効率は、64Ｃｕの場合には９０％を超え、177Ｌｕの場合には８０％を超えた。図１は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）による、64Ｃｕ−リポソームと封入されていない遊離64Ｃｕの分離を示す。図２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）による、177Ｌｕ−リポソームと封入されていない遊離177Ｌｕの分離を示す。
図３は、64Ｃｕの封入効率を温度の関数として示しており、２−ヒドロキシキノリン（２ＨＱ）を使用したイオノフォア封入と比較している。イオノフォア（２ＨＱ）を使用した場合のリポソーム組成物への64Ｃｕの封入効率は温度の関数としてわずかに上昇し、５０〜５５℃で最大封入効率（９２．４％±１．４％）が得られた。一方、イオノフォアを使用しない場合のリポソーム組成物への64Ｃｕの封入効率は温度の上昇と共に上昇し、５０〜５５℃においてイオノフォア（２ＨＱ）を使用した場合と比較して高い封入効率（９６．７％±１．０％）が得られた。
64Ｃｕ−リポソーム（リポソーム内部ｐＨ４．０）の貯蔵安定性（３７℃、２４時間）
精製した５００μＬの64Ｃｕ−リポソーム溶液を３７℃で２４時間放置し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）によって遊離64Ｃｕを64Ｃｕ−リポソームから分離することによって64Ｃｕ−リポソームの安定性について分析した。溶出プロファイルは、インライン放射能検出器を使用して監視した。１０ｍＭ ＤＯＴＡ（ｐＨ４．０）を含む64Ｃｕ−リポソームは、全放射能の９５％を超える放射能を維持していた。放射性核種は、好ましくは、強い親和性のためにリポソームの内部に封入されたＤＯＴＡと結合し、放射性核種はリポソーム内に封入される。
64Ｃｕ−リポソーム（リポソーム内部ｐＨ７．４）の貯蔵安定性（３７℃、２４時間）
精製した５００μＬの64Ｃｕ−リポソーム溶液を３７℃で２４時間放置し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用）によって遊離64Ｃｕを64Ｃｕ−リポソームから分離することによって64Ｃｕ−リポソームの安定性について分析した。溶出プロファイルは、インライン放射能検出器を使用して監視した。１０ｍＭ ＤＯＴＡ（ｐＨ７．４）を含む64Ｃｕ−リポソームは、全放射能の９５％を超える放射能を維持していた。放射性核種は、好ましくは、強い親和性のためにリポソームの内部に封入されたＤＯＴＡと結合し、放射性核種はリポソーム内に封入される。
本願明細書に開示する、放射性核種が封入されたナノ粒子組成物の製造方法は、新規なＰＥＴ造影剤を迅速かつ簡単に調製することができる。迅速な調製は、陽電子放射体である64Ｃｕの半減期が短いために重要であり、製品の製造において理想的である。本発明の方法は非常にロバストであり、４〜８のｐＨ範囲においてキレート剤を含むリポソーム組成物を使用して高い封入効率（＞９５％）を一貫して達成することができ、リポソーム内部の浸透圧を制御することができる。本願明細書に開示する方法は、放射性核種をリポソームに封入するために親油性イオノフォア等の担体を使用しないという利点を有する。本願明細書に開示する、放射性核種を含むナノ粒子の製造方法は、撮影剤及び治療薬としてのナノ粒子組成物を利用する際に必要な、封入放射性核種の９５％超を保持するナノ粒子を製造することができる。
実施例ＩＩ
Ｃｕ（ＩＩ）−封入のためのキレート剤含有リポソーム組成物の調製
キレート剤含有リポソーム内への非放射性Ｃｕ2+の封入試験を行い、Ｃｕ（ＩＩ）−イオン選択性電極を使用して評価した。電極は溶液に溶解したＣｕ2+の活性を電位に変換し、電位は電圧計又はｐＨ計によって測定する。従って、Ｃｕ（ＩＩ）−選択性電極は非錯体Ｃｕ2+イオン活性に反応する。電極の検出部は、参照電極と共にイオン特異性膜として製作されている。
標準的な薄膜水和及び反復押出を使用し、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（モル比：５０：４０：１０）から形成したリポソーム内にキレート剤（ＤＯＴＡ）を封入した。簡単に説明すると、緩やかな窒素流下において脂質をクロロホルム内で混合し、乾燥して脂質膜を得た。残留有機溶媒を減圧下で一晩にわたって除去した。水溶液（キレート剤（ＤＯＴＡ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＯ3、ｐＨ６．８５）（ｐＨ４．０）を添加して脂質膜を分散させた。次に、溶液を６５℃で６０分間にわたって水和した。ミニ押出機を使用し、多層膜ベシクル（ＭＬＶ）を１００ｎｍポリカーボネートフィルターによって反復押出して巨大単一膜ベシクル（ＬＵＶ）を得た。封入されなかったキレート剤をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ １×２５ｃｍ充填カラムを使用、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＯ3、ｐＨ６．８５、３１０ｍＯｓｍ／Ｌ）で溶出）で除去した。
リポソーム内へのＣｕ（ＩＩ）の封入
Ｃｕ（ＮＯ3）2標準溶液を調製し、Ｃｕ（ＩＩ）−選択性電極を使用して測定を行った（図４）。Ｃｕ（ＩＩ）−選択性電極は非錯体銅イオン活性に反応する。Ｃｕ（ＮＯ3）2をリポソーム（最終濃度：２５ｐｐｍ）に添加し、Ｃｕ（ＩＩ）−電極の反応を測定したところ、１８．１ｐｐｍの非錯体Ｃｕ（ＩＩ）に対応する１４１ｍＶ（図４）となった。Ｃｕ（ＩＩ）をリポソーム組成物内に封入するためにリポソーム懸濁液を５０〜５５℃で６０分間培養したところ、Ｃｕ（ＩＩ）−電極の反応は１．２ｐｐｍのＣｕ（ＩＩ）に対応する９４ｍＶとなった。Ｃｕ（ＩＩ）を添加しないブランク（バックグラウンド）測定（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＮＯ3、ｐＨ６．８５）を行った場合には、Ｃｕ（ＩＩ）−電極の反応は２．２ｐｐｍのＣｕ（ＩＩ）に対応する１０４ｍＶとなった。
下記式（４）を使用して封入効率を算出した。
Figure 2014506240
得られた結果は、本願明細書に開示した方法を使用する場合には、Ｃｕ（ＩＩ）のリポソーム組成物内への非常に高い封入効率（＞９５％）が得られることを示している（図４）。
実施例ＩＩＩ
イオノフォアを使用しない封入方法が二価カチオンに制限されるか否かを調べるために、２種類の放射性三価カチオン（177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+）を使用して試験を行った。また、放射性過テクネチウム酸塩（99mＴｃ）の封入試験も行った。99mＴｃは化学式ＴｃＯ4 -で表されるオキソアニオンである。イオノフォアを使用せずに、177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+の両方をキレート剤含有リポソームに封入することができた。一方、99mＴｃＯ4 -は封入されなかった（表１を参照）。
キレート剤含有リポソームは、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなるものとした。等張ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍ／Ｌ）を外部緩衝液として使用し、キレート剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＤＴＰＡ又はＤＯＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を内部緩衝液として使用した。約１０μＬの放射性177ＬｕＣｌ3、11IＩｎＣｌ3又は99mＴｃ過テクネチウム酸塩を精製したキレート剤含有リポソーム（５００μＬ）に添加し、５０〜５５℃で６０分間にわたって培養を行った。放射性177ＬｕＣｌ3及び11IＩｎＣｌ3はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（デンマーク）から購入し、99mＴｃ過テクネチウム酸塩はＫoｇｅ病院（デンマーク）の放射線科から提供を受けた。
Figure 2014506240
表１に示す結果は、上記封入方法により、非常に有利な封入速度でのリポソーム組成物のカチオン透過性（64Ｃｕ2+、177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+）が得られたことを示している。
本発明の封入方法の特性分析及び最適化のために、異なる実験を行い、以下のパラメータについて試験を行った：（１）脂質組成の影響、（２）脂質濃度及び封入量の影響、（３）遊離脂肪酸の影響、（４）一価イオン（Ｎａ+、Ｃｌ+）及び競合二価イオン（Ｃａ2+）の影響、（５）キレート成分の外部に対する影響、（６）リポソーム内部ｐＨの影響、（７）相挙動及び封入温度の影響、（８）封入速度及び温度の影響、（９）高浸透圧及び低浸透圧、（１０）イオノフォアを使用した場合と使用しない場合のＣｕ2+封入速度。
（１）脂質組成の影響
本研究で使用したリポソーム組成物は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）としてのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000）としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導化ホスファチジルエタノールアミンで形成した。ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000以外にコレステロールを膜に導入した。通常、コレステロールは二重層の厚みと流動性を増加させると共に膜透過性を低下させ、膜を変化させることはない。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000は負に荷電されている。評価したリポソームは、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000で構成した。リポソーム組成物の全体的な膜電位（ゼータ電位で評価）は、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（５０：４０：１０）からなる脂質組成の場合にはわずかに負であり、３００ｍＭグルコースを添加した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、３３６ｍＯｓｍ／Ｌ）内で測定すると約−１５ｍＶである（表２）。イオノフォアを使用せずに、表２に示す各リポソーム組成物を64Ｃｕ2+と共に５０〜５５℃で６０分間にわたって培養してリポソーム組成物内に64Ｃｕ2+を封入し、ＳＥＣによって評価した。
Figure 2014506240
負の膜電位は、リポソーム内へのカチオン性金属イオンの高い封入効率に影響を及ぼし得る（表１）。これを評価するために、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000を含まず、純粋なＤＳＰＣ又はＤＳＰＣとコレステロールの混合物（モル比：６０：４０）のみからなる中性リポソーム組成物に対して封入実験を行った。各リポソーム組成物は、内部にキレート剤（ＤＯＴＡ、１０ｍＭ）を高い濃度で含んでいた。キレート剤含有リポソームを放射性64ＣｕＣｌ2と共に乾燥させたバイアルに添加し、５０〜５５℃で６０分間にわたって培養した。高い64Ｃｕ2+封入効率が全てのリポソーム組成物において観察された（表２を参照）。
（２）脂質濃度及び封入量の影響
薬物をリポソーム内に封入するための従来の手段では、リポソーム調製時に所望の薬物を封入する（受動的封入）。受動的封入方法は、金属をリポソームの調製後に封入する能動的封入方法と比較して薬物等の封入効率が低い。受動的封入では、リポソームが形成される緩衝液に薬物又は放射性核種を単に含有させる。受動的封入はリポソームの封入水量に大きく依存するため、受動的封入ではリポソームのサイズは非常に重要である。
ここでは、64Ｃｕ2+の受動的封入試験を行った。受動的封入は以下に記載するように行った。緩やかな窒素流下、脂質（ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５５：４０：５）、脂質濃度：５０ｍＭ））をクロロホルム内で混合して脂質膜を得た。残留有機溶媒を減圧下で一晩にわたって除去した。水溶液（キレート剤（ＤＯＴＡ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）（ｐＨ４．０又はｐＨ７．４、濃度：１０ｍＭ）を放射性64ＣｕＣｌ2と共に添加して脂質膜を分散させた。溶液を６５℃で６０分間にわたって水和することによって64Ｃｕ2+を受動的に封入した。放射性試料に適用される自動化システムを使用し、64Ｃｕが受動的に封入された多層膜ベシクル（ＭＬＶ）を１００ｎｍポリカーボネートフィルターによって反復押出して64Ｃｕ封入巨大単一膜ベシクル（ＬＵＶｓ）を得、封入効率をＳＥＣによって評価した。ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000を５５：４０：５のモル比で含む、脂質濃度が５０ｍＭの１００ｎｍリポソーム溶液内では６．２５％の封入効率が得られた。上記結果から、脂質１ｍＭあたり〜０．１４％の64Ｃｕ2+が１００ｎｍのリポソーム内に受動的に封入（又は結合）されたと結論付けた。これは、１００ｎｍの単一膜リポソームの封入量及び封入度の推定と一致している。
Figure 2014506240
式中、Ｖentrap及びＶtotは封入量及び合計量であり、Ｃlipは脂質濃度であり、Ｎａはアボガドロ数であり、ａlip＝４０Å2は脂質組成物のおおよその平均断面積であり、Ｒはリポソームの半径である。
予め形成されたリポソーム内に金属カチオンを封入する方法が脂質濃度及び封入量と比例しているか否かを調べるために、ＤＳＰＣとＣＨＯＬの混合物（モル比：６０：４０）からなり、キレート剤が封入されていない中性の膜組成物への放射活性64Ｃｕ2+の取り込みを観察した。キレート剤を含まないリポソームは以下のように調製した。緩やかな窒素流下において脂質（ＤＳＰＣ及びＣＨＯＬ）をクロロホルム内で混合し、乾燥して脂質膜を得た。残留有機溶媒を減圧下で一晩にわたって除去した。水溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加して脂質膜を分散させ、オスモル濃度を測定したところ、３００ｍＯｓｍ／Ｌだった。次に、溶液を６５℃で６０分間にわたって水和した。ミニ押出機を使用し、多層膜ベシクル（ＭＬＶｓ）を１００ｎｍポリカーボネートフィルターによって反復押出して巨大単一膜ベシクル（ＬＵＶｓ）を得た。本実験に使用した緩衝液を他の各実験でも使用した（等張ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍ／Ｌ））。リポソームを64Ｃｕ2+と共に５０〜５５℃で６０分間にわたって培養し、ＳＥＣによって評価した。リポソームの封入効率は、脂質濃度が低い場合（５ｍＭ）には０．７５％であり、脂質濃度が１０倍高い場合（５０ｍＭ）には５．３％だった（表３を参照）。
Figure 2014506240
５０〜５５℃の温度を使用した受動的封入の封入効率（６．２５％）は、本発明の封入方法を使用して得られた封入効率（例えば、表１及び表２）よりも非常に低くなっている。また、表３に示す結果は、本発明の封入方法を使用したキレート剤が封入されていないリポソーム内への64Ｃｕ2+の封入は封入量及び／又はリポソームの脂質濃度と比例していること示しており、リポソーム内へのＣｕ2+の封入／結合は封入されたキレート剤が存在しなくとも生じ得ることを示唆している。また、三価金属イオン111Ｉｎ3+によって上記仮説について調べたところ、64Ｃｕ2+と同様な傾向がみられた（表３を参照）。金属イオンは単純な膜透過イオン平衡によって予め形成されたリポソームの水相内に受動的に封入又は輸送されるか、金属イオンはリポソームの膜内の脂質に結合する。金属イオンは、ＰＣの極性頭部基のフォスフェート部位に結合し得る。表３に示す結果は、脂質濃度及び／又はリポソーム封入量とリポソーム内へのＣｕ2+及びｌｎ3+イオンの結合又は輸送が相関を有することを明らかに示している。
（３）遊離脂肪酸の影響
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、プロトン化された状態でリン脂質二重層を透過して急速に拡散（フリップ・フロップ）することが知られている。しかしながら、二重層の疎水性コアを透過するフリップ・フロップ又は膜から水相への脱離のいずれが膜を透過するＦＦＡ輸送における律速段階であるのかについては現在も議論されている。ＦＦＡはいくつかのリポソーム膜に不安定化作用を示し、膜の透過率を高め、膜に対する物質の透過を容易にすることが知られている。しかしながら、ＦＦＡは完全に飽和した脂質膜のゲル状態を安定化させることも知られている。リポソーム等の脂質二重層溶液にＦＦＡを添加することにより、例えばパルミチン酸とＣａ2+イオンの存在下において膜透過性を飛躍的に高めることが示されている（Agafonov et al., BBA, 1609:153-160, 2003）。本発明のようなイオノフォアを使用しないリポソームの水相内への放射性核種の高い効率封入が遊離金属イオンの二重層透過拡散速度を高めるＦＦＡの存在に依存し得るか否かを評価するために（アシルリン脂質は少量のＦＦＡ不純物を含む）、ＦＦＡを含有しないリポソーム膜を使用して64Ｃｕ2+封入効率を測定した。リポソーム組成物におけるＤＳＰＣの代わりとして、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉ−Ｏ−ＤＰＰＣ）をＦＦＡ遊離脂質成分として使用した（図５を参照）。
１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉ−Ｏ−ＤＰＰＣ）及びＣＨＯＬ（モル比：６０：４０）をベシクル形成成分として使用し、キレート剤を含み、ＦＦＡを含まないリポソームを実施例Ｉ（「キレート剤含有リポソーム組成物の調製」）と同様にして調製した。１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉ−Ｏ−ＤＰＰＣ）及びＣＨＯＬ（モル比：６０：４０）をベシクル形成成分として使用し、キレート剤及びＦＦＡを含まないリポソームを（２）に記載されているようにして調製した。
キレート剤（１０ｍＭ ＤＯＴＡ）を含み、ＦＦＡを含まないリポソーム又はキレート剤及びＦＦＡを含まないリポソームを放射性64ＣｕＣｌ2と共に乾燥させたバイアルに添加し、５０〜５５℃で６０分間にわたって培養し、ＳＥＣによって評価した。キレート剤を含み、ＦＦＡを含まないリポソーム内への64Ｃｕ2+の高い効率の封入が観察され（表４）、キレート剤及びＦＦＡを含まないリポソームを対照として使用した。
Figure 2014506240
これにより、ＦＦＡがリポソーム内への遊離金属イオンの透過を誘発する可能性が排除された。キレート剤が封入されていないＦＦＡを含まないリポソーム（対照）は、キレート剤が封入されていないＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ（６０：４０）と同様な結果を示した（表３）。結論として、膜内にＦＦＡを含むリポソーム及び膜内にＦＦＡを含まないリポソームを本発明に使用することができることが分かった。
（４）一価イオン（Ｎａ+、Ｃｌ+）及び競合二価イオン（Ｃａ2+）の影響
Ｈａｕｓｅｒ及びＤａｗｓｏｎによる研究では、Ｃａ2+の濃度の約１０4倍の濃度で存在する場合にのみ、Ｎａ+及びＫ+等の一価イオンはＣａ2+を置き換えることができることが示されており（Hauser and Dawson, J. Biochem., 1:61-69, 1967）、これは二重層理論の予測と一致する（Lyklema, ISBN:0-12-460530-3, 5:3.208, 1995）。二重層は、イオン含有液体内に配置された場合に物体の表面に現れる構造である。物体はナノ粒子又はリポソーム等の固体粒子であってもよい。第１の層では、表面電荷（正又は負）は物体に直接吸着したイオンを含む。第２の層はクーロン力によって表面電荷に引き付けられたイオンで構成され、第１の層を電気的に遮断している。第２の層は、強固に固定されておらず、電気引力及び熱運動の影響を受けて液体内で移動する遊離イオンからなるためにナノ粒子に弱く結合する。
上述したように、等張ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍ／Ｌ）を使用した場合には５．３％の放射線がリポソームに結合／封入されたが（表３）、一価イオン（Ｎａ+及びＣｌ-）を添加しない場合には（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＯｓｍ／Ｌ）、１１％の放射線がＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ膜（５０ｍＭ）に結合した（表５を参照）。
Figure 2014506240
これは、ＮａＣｌの除去によって遮断が減少するため、負に荷電された脂質膜とＣｕ2+との間により強い相互作用があることを予測する二重層理論に一致している。これを実証するために、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ膜（５０ｍＭ）を使用した封入実験を、１０ｍＭのＣａ2+を添加してより高いイオン強度において行った（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、３１５ｍＯｓｍ／Ｌを使用）。膜における放射線の有意な減少（３％）が観察され（表５を参照）、Ｎａ+等の一価イオン及びＣａ2+等の二価イオンは膜表面において64Ｃｕ2+を効率的に移動させ、64Ｃｕ2+封入速度を低下させることが示された。これは、Ｃａ2+及びＺｎ2+等の二価カチオンとリン脂質膜との相互作用に関する過去の研究の結果と一致している（Altenbach and Seelig, Biochemistry, 23:3913-3920, 1984; Binder et al., Bio-phys. Chem., 90:57-74, 2001 ; Huster et al., Biophys. J., 78:3011-3018, 2000）。また、Ｂｉｎｄｅｒ及びＺｓｃｈoｒｎｉｇによる研究［Binder and Zschornig, Chem. Phys. Lipids, 115:39-61, 2002］は、Ｃａ2+は純粋なＰＯＰＣ脂質二重層の脂質頭部基に明らかに結合することを示している。上記結果は、金属カチオンＣｕ2+の膜への一次結合が、Ｃａ2+及びＮａ+等の一価及び二価イオンによる電荷遮断作用によって減少することを示唆している。
重要なこととして、表５に示す結果から、キレート剤含有リポソーム内にＣｕ2+（放射性及び非放射性二価イオン、並びに放射性三価カチオン177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+）を封入する本発明の方法は、Ｃａ2+、Ｎａ+及びＣｌ-の存在下又は非存在下で実施することができることが分かった。
（５）キレート成分の影響
リポソームの外部の各種成分（除去されていないキレート剤や緩衝液分子等）間の分布及び遊離金属イオン（放射性核種）の各種成分への結合は、膜透過拡散及び全体的な遠隔封入速度に対する遊離金属イオンの化学活性を決定する際に重要である。残留キレート剤又はその他の金属結合性成分がリポソームの外部に存在する場合には、封入速度及び封入効率は著しく低下する。これは、培養前に１０-6Ｍ ＤＯＴＡをキレート剤含有リポソーム溶液に添加した場合に観察された。封入効率は、キレート剤成分が外部に存在しない場合（＞９５％）場合と比較して２％に低下した。（試験を行った全てのカチオン（64Ｃｕ2+、177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+）の）高い封入効率を達成するためには、調整時に残留キレート剤（例えば、ＤＯＴＡ）をキレート剤含有リポソームの外部から除去することが重要である。リポソームの外部にキレート成分が存在すると、水相内のカチオン濃度（例えば、64Ｃｕ2+、177Ｌｕ3+及び111Ｉｎ3+）並びに膜結合画分の濃度が低下し、適切な時間スケール（時）内の封入効率が非常に低くなる。
キレート剤以外に、緩衝液成分は金属イオンと錯体を形成することができる。緩衝液であるＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）はＣｕ2+と相互作用し、６を超えるｐＨにおいてアルカリ加水分解を受ける錯体を形成することが知られており、その結果としてＣｕ（ＯＨ）2の沈殿が生じる（Sokolowska and Bal, J. Inorg. Biochem., 99:1653-1660, 2005）ＨＥＰＥＳは、Ｃｕ2+に対して比較的高い親和性を有する少量の不純物を含むことが知られている（Mash and Chin, Anal. Chem., 75:671-677, 2003）。仮説として、本発明の封入方法においてＨＥＰＥＳは金属イオンの担体分子として機能し、膜を透過してイオンを輸送し、イオンは封入されたキレート剤に優先的に結合する。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や「非配位性」緩衝液である２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を使用した場合にはキレート剤含有リポソーム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０））内への64Ｃｕ2+の同様に高い封入効率（＞９５％）が得られたため、ＨＥＰＥＳはＣｕ（ＩＩ）の担体分子として機能しないかもしれない（表６を参照）。ＰＢＳ又はＭＥＳ緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりに使用し、リポソームを実施例Ｉ（「キレート剤含有リポソーム組成物の調製」）と同様にして調製した。封入は５０〜５５℃で６０分間にわたって行い、ＳＥＣによって評価した。
Figure 2014506240
得られた結果は、各封入緩衝液を含む培養溶液を使用した本発明の方法を使用して高い封入効率が得られることを示している。
ただし、乾燥64ＣｕＣｌ2の溶解性は、ｐＨ７．４及び２２℃の温度においてＰＢＳ及び滅菌水と比較してＨＥＰＥＳ緩衝液においてより高いことが分かった。これは調製する際に都合が良い。より高い温度では、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ及び滅菌水内における乾燥64ＣｕＣｌ2の溶解性は同等だった。
（６）リポソーム内部ｐＨの影響
リポソーム封入技術における重要な発見は、膜透過イオン勾配を生成し、水性リポソーム内腔にイオン化薬物を能動的に封入するために利用することができることである（米国特許第５，７３６，１５５号、米国特許第５，０７７，０５６号及び米国特許第５，７６２，９５７号）。この方法では、リポソーム内に封入されるイオン化薬物が外部緩衝液内で荷電されず、水性の内部において荷電されるようにリポソーム二重層にｐＨ勾配を生じさせることを含む。これにより、薬物は中性の状態でリポソーム二重層を透過し、荷電されることによってリポソームの水性の内部にトラップ（封入）される。また、プロトン勾配が失われると、薬物が能動的に封入されたリポソームから薬物が漏出することが分かっている。
イオノフォアである２−ヒドロキシキノリン（２ＨＱ）を使用したリポソーム内への64Ｃｕ2+の封入に関する過去の研究（Petersen et al., Biomaterials, 32:2334-2341, 2011）では、４．０又は５．９の内部ｐＨを有するキレート剤含有リポソームにおいてそれぞれ＞９５％又は７０％の封入効率が観察されている。ｐＨ５．９で得られた低い封入効率は、64Ｃｕ2+の２ＨＱからＤＯＴＡへの好ましくない交換によるものと説明されている。また、別のイオノフォアであるオキシンも評価しているが、64Ｃｕ2+の保持に関して不安定なリポソームが得られている。このような不安定さ（64Ｃｕ2+の放出）は、膜透過ｐＨ勾配を消失させ、リポソーム内部ｐＨを上昇させるイオノフォアの能力によるものと説明されており、オキシンの場合には、配位子交換が数桁減少している。従って、イオノフォアはリポソーム組成物から封入金属イオンを容易に放出させることができる。
金属イオンの封入効率及び保持に対する内部リポソームｐＨの影響を本発明の封入方法を使用して調べた。実施例Ｉ（「キレート剤含有リポソーム組成物の調製」）と同様にして、リポソーム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）（ｐＨ４．０又は７．４）内にキレート剤（ＣDOTA＝１０ｍＭ）を封入した。等張ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍ／Ｌ）を外部緩衝液として使用した。リポソームを64Ｃｕ2+と共に５０〜５５℃で６０分間にわたって培養し、ＳＥＣによって評価した。64Ｃｕ2+の高い封入効率（＞９５％）が両リポソーム内部ｐＨ（４．０及び７．４）において得られた（表７を参照）。
Figure 2014506240
また、64Ｃｕ2+を封入したリポソームを使用し、３７℃又は２０℃で２４時間にわたってリポソーム溶液を培養した場合の放射性核種の保持について調べた。また、ヒト血清とリポソーム溶液を３７℃で２４時間混合（１：１）し、ヒト血清中のリポソーム溶液の安定性について調べた。各リポソーム溶液からの放射性核種（64Ｃｕ2+）の放出は観察されなかった（表７を参照）。
表７に示す結果から明らかなように、封入効率又は放射性核種の保持に影響を与えることなく、内部ｐＨを容易にｐＨ７．４に上昇させることができる。従って、本発明の封入方法は膜の両側のｐＨ勾配には依存しない。ｐＨ７．４よりも低いｐＨ（ｐＨ４．０等）では脂質の加水分解が生じる可能性があるため、リポソームの内部ｐＨとしては７．４が望ましい。従って、リポソームの内部ｐＨが７．４の場合には、リポソームの内部ｐＨが４．０の場合と比較してキレート剤含有リポソームの有効期間は著しく増加させることができる。
（７）相挙動及び封入温度の影響
従来のリポソームの処方では、かなりの量（例えば、３０〜４５モル％）のコレステロール又は同等の膜硬直化剤（他のステロール等）を添加する。通常、コレステロールは二重層の厚みと流動性を増加させると共にリポソームの膜透過性を低下させる。例えば、リポソームを含有するホスファチジルコリン（ＰＣ）に多量のコレステロールを添加すると、浸透勾配の存在下又は非存在下においてリポソームからのカルセイン（蛍光標識化合物）の漏出が減少したことが報告されている（Allen, et al. Biochim, Biophys. Acta, 597:418-426, 1980）。また、脂質二重層にコレステロールを添加することにより、液体結晶相の安定性及び流体相の移動度を引き継ぐ秩序液体相が形成される。ＤＳＰＣ二重層に３５モル％を超えるコレステロールを添加すると、主相転移は完全に生じなくなり、膜は広い温度範囲にわたって秩序液体相として存在するとみなすことができる。示差走査熱量法（ＤＳＣ）による実験によれば、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなるリポソーム膜は、４５〜６０℃において熱相転移を示さず、前記温度範囲において単一相（秩序液体相）として存在する（図６）。図３に示すように、イオノフォアを使用しない場合のリポソーム組成物への64Ｃｕ2+の封入効率は温度の上昇と共に上昇し、５０〜５５℃での６０分間の封入によって高い封入効率（９６．７％±１．０％）が得られた。イオノフォアを使用しない場合の封入効率は温度の上昇と共に上昇したが、リポソーム組成物では相転移温度が生じないため（図６）、相転移挙動によって封入効率の上昇は生じない。
（８）封入速度及び温度の影響
ラジオ薄層クロマトグラフィ（ラジオＴＬＣ）により、64Ｃｕ2+のキレート剤含有リポソーム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０））内への封入速度を、時間の関数としての錯体64Ｃｕ（例えば、64Ｃｕ−ＤＯＴＡ）と総64Ｃｕ量（錯体（64Ｃｕ−ＤＯＴＡ）と遊離64Ｃｕ2+の和）の比率として調べた。封入実験は反応バイアル内において３０℃、４０℃及び５０℃で行い、２μＬの試料を異なる時点でＴＬＣプレートにスポッティングした。64Ｃｕ2+がリポソーム内に封入されている場合には、金属イオンは優先的にＤＯＴＡに結合し、64Ｃｕ−ＤＯＴＡ錯体が形成される。ＴＬＣプレートは有機溶離液（１０％酢酸アンモニウム：メタノール（５０：５０））内で使用し、64Ｃｕ−ＤＯＴＡ錯体を遊離64ＣｕＣｌ2から分離した。64Ｃｕ−ＤＯＴＡの保持率（Ｒf）は約０．３であり、64Ｃｕ2+（イオン）は原点（Ｒf＝０）上に残っていた。リポソーム試料をＴＬＣプレートにスポッティングすると、リポソームはすぐに乾燥し、内部（64Ｃｕ−ＤＯＴＡ）がＴＬＣプレート上を移動した。内部の64Ｃｕ−ＤＯＴＡ錯体と総64Ｃｕ量（錯体（64Ｃｕ−ＤＯＴＡ）と遊離64Ｃｕ2+の和）の比率を封入効率（式（１）に定義）として算出した。対照として、遊離64Ｃｕ2+をＴＬＣプレートにスポッティングし、64Ｃｕ2+上に非放射性キレート剤含有リポソームをスポッティングした。対照は、ＴＬＣプレート上で生じる64Ｃｕ2+とＤＯＴＡの錯体形成の誤った推定を排除するためのものである。64Ｃｕ−ＤＯＴＡピークはＴＬＣプレート上に存在しなかったため、ＴＬＣプレート上で錯体形成は生じなかった。
リポソーム内への金属イオンの封入は、（ｉ）脂質膜へのイオンの結合／配位／吸着、（ｉｉ）二重膜透過イオン拡散、（ｉｉｉ）キレート剤へのイオンの結合を含む複数の工程に分けることができる。上記封入手順では、脂質とキレート剤は64Ｃｕ2+と比較して大過剰であり、反応速度は64Ｃｕ2+濃度のみに依存する。Ｃｕ2+の膜への配位／結合速度は速く（おそらくは拡散律速）、Ｃｕ2+のＤＯＴＡへの結合は秒単位の時間スケールで生じ（ラジオＴＬＣによって確認）、膜透過イオン拡散が最も可能性のある律速段階である。通常、膜透過拡散速度は、輸送物質の濃度勾配（フィックの第一法則）、膜の相状態（ゲル、流体又は秩序液体）及び輸送物質の物理化学的性質（親水性又は疎水性）に依存する。従って、以下に示す一次式（６）が得られる。封入速度（図７及び図８に示す例）は下記式によって特徴付けることができる。
Figure 2014506240
式中、ＡCu、ＡCu-chelator及びＡCu(ionophore)は、64Ｃｕ2+、64Ｃｕ−ＤＯＴＡ及び64Ｃｕ（２ＨＱ）2のＴＬＣ活性である。フィッティンパラメータａはプラトーレベル（一次反応速度論に従って封入が進行する場合にはａ＝１００％）であり、ｂはｔにおけるオフセット及び不確定性（ｔにおけるオフセット及び不確定性が小さい場合にはｂ＝１）であり、ｃは封入速度である。式（７）のフィッティングにより、各封入プロファイルは以下のように特徴付けられる。
（ｉ）初速度：
Figure 2014506240
 （ｉｉ）封入度が９５％に達するまでの時間：
Figure 2014506240
 （ｉｉｉ）６０分で達する封入度（％ｌｏａｄ1h）。後者は、ＳＥＣに基づく方法を使用して達成された封入度と同等である（図３、表１、表２、表６及び表７を参照）。
一次速度定数（ｃ）は、封入が行われる温度（図７及び図８を参照）及びオスモル濃度（以下を参照）等の異なるパラメータに依存する。一連の封入条件における初速度（ｖini）、ｔ(95%)及び％ｌｏａｄ1hを表８に示す。
Figure 2014506240
等浸透圧条件における５０℃でのリポソーム内への64Ｃｕ2+の封入効率（図８）は高い初速度を示し、時間の関数として徐々に低下し、飽和している。温度を下げると、初速度は著しく低下し（表８）、封入度が９５％に達するまでの時間は３０分から数時間に増加した（等浸透圧封入）。高浸透圧条件における封入（セクション９を参照）及びイオノフォアを使用した封入（セクション１０を参照）でも同様な温度による作用が観察された。
（９）高浸透圧及び低浸透圧
高浸透圧条件が金属イオンの封入速度及び封入効率を向上させるか否かを調べるために、高浸透圧勾配（Δ（ｍＯｓｍ／Ｌ）＝＋７５）、低浸透圧勾配（Δ（ｍＯｓｍ／Ｌ）＝−４０）又は等浸透圧勾配（Δ（ｍＯｓｍ／Ｌ）＝０）（表９を参照）を有するキレート剤含有リポソーム内への64Ｃｕ2+の封入実験を行った。リポソームの調製及び封入実験は、緩衝液オスモル濃度を変更した（表９を参照）以外は実施例Ｉと同様にして行った。
Figure 2014506240
ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなるリポソーム組成物は、内部において高いキレート剤濃度（ＤＯＴＡ、１０ｍＭ）を有していた。オスモル濃度は、ＮａＣｌ濃度を調節するか、蔗糖を添加することによって制御した（表９を参照）。５０〜５５℃における封入効率（６０分後に評価）（表９に結果を示す）は、実験の時間枠内において全てのケースにおいてＣｕ2+の高い封入効率（＞９４％）が得られることを示している。ただし、表９に示す結果は、異なるオスモル濃度間における封入速度の差を示している。
また、キレート剤含有リポソーム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０））を使用し、３つの異なる温度（３０℃、４０℃及び５０℃）及び２つの浸透圧条件（等圧浸透圧及び高浸透圧）においてラジオＴＬＣ（図７及び図８）を使用して64Ｃｕ2+封入速度を時間の関数として評価した。得られたデータ（図７及び図８）により、等圧浸透圧条件及び高浸透圧条件の両方において、温度を上げると封入速度（表８における初速度（ｖini））及び封入効率（表８における％ｌｏａｄ1h）が向上することが確認された。封入速度及び封入効率は、等圧浸透圧条件で封入を行った場合よりも、高浸透圧条件において封入を行った場合の方が高かった。オスモル濃度の上昇による封入速度及び封入効率の最も大きな変化は３０℃と４０℃で観察され、５０℃ではほとんど変化はみられなかった。
上記結果は、温度及びオスモル濃度としてのパラメータを調節することによって封入速度及び封入効率を有意に調節することができることを示している。これらのパラメータは封入方法の有効性にとって重要である。
（１０）イオノフォアを使用した場合と使用しない場合のＣｕ2+封入速度
図３に示すように、イオノフォア（２ＨＱ）を使用した場合のリポソーム組成物への64Ｃｕ2+の封入効率（ＳＥＣによって評価した％ｌｏａｄ1h）は温度の関数としてわずかに上昇し、５０〜５５℃で６０分間にわたって封入を行った場合に最大封入効率（９２．４％±１．４％）が得られた。一方、イオノフォアを使用しない場合のリポソーム組成物への64Ｃｕ2+の封入効率は温度の上昇と共に上昇し、５０〜５５℃で６０分間にわたって封入を行った場合にイオノフォアを使用した場合と比較して高い封入効率（９６．７％±１．０％）が得られた。これらの結果は、イオノフォアを使用せずに封入を行った場合と比較して、64Ｃｕ2+、リポソーム及びイオノフォアを培養する際に５０℃未満において封入効率が上昇することを示している。図３の封入実験に使用したイオノフォアの濃度は１００μΜだった。イオノフォアは哺乳動物にとって有害である可能性があるため、封入後のリポソームは静脈注射前に精製する必要があり、これはリポソームの製造において不利である。
イオノフォア（Ｃ2HQ＝１００μΜ）を使用した場合と使用しない場合における、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（モル比：５０：４０：１０）からなるリポソームの水相への64Ｃｕ2+の封入速度を比較した。速度の測定結果に対する浸透圧の影響を調べるために、等浸透圧条件を有するようにリポソームを調製した。溶液は異なる温度（３０℃、４０℃及び５０℃）で培養し、ラジオＴＬＣによって時間の関数として上述したように評価した。図３の結果によって実証されたラジオＴＬＣの結果（表８）は、イオノフォアを使用した場合には、（ｉ）封入速度（初速度（ｖini））及び封入効率（％ｌｏａｄ1h）が上昇し（５０℃未満）、（ｉｉ）封入度が９５％に達するまでの時間（ｔ(95%)）が減少した。また、イオノフォアを使用した場合には、封入のための活性化エネルギーが減少し、イオノフォアを使用しない場合と比較して、温度変化の関数としての封入速度及び封入効率の変化は小さくなった。
過去の研究は、リポソーム組成物等のリン脂質二重層の低いイオン透過性により、荷電イオン種の封入速度は非常に低くなることを示している（Paula et al., Biophys. J., 74:319-327, 1998; Hauser et al., Nature, 239:342-344, 1972; Ceh et al., J. Phys. Chem. B, 102:3036-3043, 1998; Mills et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1716:77-96, 2005; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:561 -583, 1971 ; Puskin, J. Membrane Biol, 35:39-55, 1977）。一方、本発明の封入方法を使用した実験によって得られた結果は、荷電イオンである64Ｃｕ2+／63Ｃｕ2+、111Ｉｎ3+及び177Ｌｕ3+は迅速かつ効率的にキレート剤含有リポソームに封入されることを示している。上記結果は、二重層透過拡散速度を上昇させるためのイオノフォア又はその他の親油性錯体の使用は、二価及び三価カチオンの封入をやや向上させるのみであることを示している。
本実施例により、二価又は三価イオン（例えば、64Ｃｕ2+、111Ｉｎ3+及び177Ｌｕ3+）は、先に封入されたキレート剤と錯体形成することにより、リポソームの内部に高い濃度で受動的に封入されることが示された。
引用文献
Agafonov et al., BBA, 1609: 153-160, 2003
Allen, et al. Biochim, Biophys. Acta, 597:418-426, 1980
Allen, Science, 303: 1818-1822, 2004
Altenbach and Seelig, Biochemistry, 23:3913-3920, 1984
Anderson et al., J Nucl Med., 36: 2315-2325, 1998
Binder et al., Bio-phys. Chem., 90:57-74, 2001
Binder and Zschornig, Chem. Phys. Lipids, 1 15:39-61 , 2002 Ceh et al., J. Phys. Chem. B, 102:3036-3043, 1998
Dehdashti et al., J Nucl Med. 38: 103P, 1997
Gabizon et al., J Liposome Res., 1 : 123-125, 1988
Gabizon et al., Cancer Res., 50: 6371-6378, 1990
Goto et al., Chem harm Bull. (Tokyo), 37: 1351-1354, 1989
Hauser and Dawson, J. Biochem., 1 :61-69, 1967
Hauser et al., Nature, 239:342-344, 1972
Henriksen et al., Nucl Med Bio., 31 : 441-449, 2004
Huster et al., Biophys. J., 78:3011-3018, 2000
Hwang et al., Biochim Biophys Acta., 716: 101-109, 1982
Kostarelos et al., J Liposome Res, 9:407-424, 1999
Lyklema, ISBN:0-12-460530-3, 5:3.208, 1995
Mash and Chin, Anal. Chem., 75:671-677, 2003
Mills et al., Biochim. Biophys. Acta, 1716:77-96, 2005
Morgan et al., J Med Microbiol., 14: 213-217, 1981
Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:561-583, 1971 Paula et al., Biophys. J., 74:319-327, 1998
Petersen et al., 2011 , Biomaterials, 32:2334-2341 , 201 1 Phillips, Adv Drug Deliv Rev., 37: 13-32, 1999
Phillips et al., Int J Rad AppI Instrum B, 19: 539-547, 1992 Puskin, J. Membrane Biol, 35:39-55, 1977
Seo et al., Bioconjucate Chem., 19: 2577-2584, 2008 Seo, Curr. Radiopharm., 1 : 17-21 , 2008
Sokolowska and Bal, J. Inorg. Biochem., 99: 1653-1660, 2005

Claims (61)

  1. 放射性核種等の金属体が封入されたナノ粒子組成物の製造方法であって、イオノフォアを使用することを含まず、
    ａ．ベシクル形成成分と、前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物を用意することと、
    ｂ．前記金属体を含む溶液内において前記ナノ粒子組成物を培養することにより、前記ベシクル形成成分によって形成された膜を透過するカチオン金属体の移動を可能とすることによって前記ナノ粒子組成物の内部に前記金属体を封入する工程と、
    を含む方法。
  2. 放射性核種の封入効率が、１０％、例えば４０％、例えば５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９７％又は例えば９９％よりも高い、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ナノ粒子組成物を１００℃未満の温度で培養する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ナノ粒子組成物を１０〜８０℃、例えば２２〜８０℃又は３０〜８０℃の温度で培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ナノ粒子組成物を４８時間未満培養する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ナノ粒子組成物を１〜２４０分間培養する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ナノ粒子組成物を１〜１２０分間培養する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ナノ粒子組成物を１〜６０分間培養する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 培養時間が１〜２４０分間の場合の前記封入効率が１０〜１００％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 培養時間が１〜２４０分間の場合の前記封入効率が８０〜１００％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 培養時間が１〜２４０分間の場合の前記封入効率が９５〜１００％である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ナノ粒子の内部に前記金属体を封入するための培養温度が３０〜８０℃であり、培養時間が１〜２４０分間の場合の前記封入効率が１０〜１００％である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ナノ粒子の内部に前記金属体を封入するための培養温度が３０〜８０℃であり、培養時間が１〜６０分間の場合の前記封入効率が１０〜１００％である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ナノ粒子の内部に前記金属体を封入するための培養温度が３０〜８０℃であり、培養時間が１〜６０分間の場合の前記封入効率が８０〜１００％である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ナノ粒子の内部に前記金属体を封入するための培養温度が４０〜８０℃であり、培養時間が１〜６０分間の場合の前記封入効率が９５〜１００％である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記金属体はカチオンである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記カチオン金属体は二価又は三価カチオンである、及び／又は前記金属体は二価又は三価カチオンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記金属体は、銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99mＴｃ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ガリウム（67Ｇａ、68Ｇａ）、ストロンチウム（89Ｓｒ）、サマリウム（153Ｓｍ）、イッテルビウム（169Ｙｂ）、タリウム（201Ｔｌ）、アスタチン（211Ａｔ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、イットリウム（90Ｙ）、アンチモン（119Ｓｂ）、スズ（117Ｓｎ、113Ｓｎ）、ジスプロシウム（159Ｄｙ）、コバルト（56Ｃｏ）、鉄（59Ｆｅ）、ルテニウム（97Ｒｕ、103Ｒｕ）、パラジウム（103Ｐｄ）、カドミウム（115Ｃｄ）、テルル（118Ｔｅ、123Ｔｅ）、バリウム（131Ｂａ、140Ｂａ）、ガドリニウム（149Ｇｄ、151Ｇｄ）、テルビウム（160Ｔｂ）、金（198Ａｕ、199Ａｕ）、ランタン（140Ｌａ）及びラジウム（223Ｒａ、224Ｒａ）からなる群から選択される１種以上の放射性核種を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、225Ａｃ、90Ｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、119Ｓｂ及び111Ｉｎからなる群から選択される放射性核種である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ及び177Ｌｕからなる群から選択される放射性核種である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕからなる群から選択される放射性核種である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. １種以上の金属体が、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ及びそれらの二価又は三価イオンからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記金属体は、64Ｃｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＴｉ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＭｎ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、64Ｃｕ及びＣｏ（ＩＩ）、64Ｃｕ及びＮｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＤｙ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＴｉ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＣｒ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＭｎ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＦｅ（ＩＩＩ）、68Ｇａ及びＣｏ（ＩＩ）、68Ｇａ及びＮｉ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＧｄ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＤｙ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＴｉ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＣｒ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＭｎ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＦｅ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＦｅ（ＩＩＩ）、111Ｉｎ及びＣｏ（ＩＩ）、111Ｉｎ及びＮｉ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＧｄ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＤｙ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＴｉ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＣｒ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＭｎ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＦｅ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＦｅ（ＩＩＩ）、99mＴｃ及びＣｏ（ＩＩ）、99mＴｃ及びＮｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＧｄ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＤｙ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＴｉ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｒ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＭｎ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＦｅ（ＩＩＩ）、177Ｌｕ及びＣｏ（ＩＩ）、177Ｌｕ及びＮｉ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＧｄ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＤｙ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＴｉ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＣｒ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＭｎ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＦｅ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＦｅ（ＩＩＩ）、67Ｇａ及びＣｏ（ＩＩ）、67Ｇａ及びＮｉ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＧｄ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＤｙ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＴｉ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＣｒ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＭｎ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＦｅ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＦｅ（ＩＩＩ）、201Ｔｌ及びＣｏ（ＩＩ）、201Ｔｌ及びＮｉ（ＩＩ）、90Ｙ及びＧｄ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＤｙ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＴｉ（ＩＩ）、90Ｙ及びＣｒ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＭｎ（ＩＩ）、90Ｙ及びＦｅ（ＩＩ）、90Ｙ及びＦｅ（ＩＩＩ）、90Ｙ及びＣｏ（ＩＩ）、90Ｙ及びＮｉ（ＩＩ）からなる群から選択される組み合わせであり、金属放射性核種の同位体は、一価カチオン、二価カチオン、三価カチオン、四価カチオン、五価カチオン、六価カチオン及び七価カチオンを含む金属の任意の酸化状態にある、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記金属体は、請求項１８に記載の群から選択される２種以上の放射性核種である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記金属体は、64Ｃｕ及び67Ｃｕ、61Ｃｕ及び67Ｃｕ、64Ｃｕ及び90Ｙ、64Ｃｕ及び119Ｓｂ、64Ｃｕ及び225Ａｃ、64Ｃｕ及び188Ｒｅ、64Ｃｕ及び186Ｒｅ、64Ｃｕ及び211Ａｔ、64Ｃｕ及び67Ｇａ、61Ｃｕ及び177Ｌｕ、61Ｃｕ及び90Ｙ、61Ｃｕ及び119Ｓｂ、61Ｃｕ及び225Ａｃ、61Ｃｕ及び188Ｒｅ、61Ｃｕ及び186Ｒｅ、61Ｃｕ及び211Ａｔ、61Ｃｕ及び67Ｇａ、67Ｃｕ及び177Ｌｕ、67Ｃｕ及び90Ｙ、67Ｃｕ及び119Ｓｂ、67Ｃｕ及び225Ａｃ、67Ｃｕ及び188Ｒｅ、67Ｃｕ及び186Ｒｅ、67Ｃｕ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び177Ｌｕ、68Ｇａ及び90Ｙ、68Ｇａ及び119Ｓｂ、68Ｇａ及び225Ａｃ、68Ｇａ及び188Ｒｅ、68Ｇａ及び186Ｒｅ、68Ｇａ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び67Ｃｕからなる群から選択される２種類の放射性核種である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記金属体は、61Ｃｕ及び64Ｃｕ、61Ｃｕ及び67Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ又は61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ等の銅（61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ）からなる群から選択される２種以上の放射性核種である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 培養時にはナノ粒子の外部と前記ナノ粒子の内部との間に浸透圧差が存在する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ナノ粒子の外部と前記ナノ粒子の内部との間の浸透圧差は５〜８００ｍＯｓｍ／Ｌである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ナノ粒子の外部と前記ナノ粒子の内部との間の浸透圧差は５〜１００ｍＯｓｍ／Ｌである、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 前記ベシクル形成成分は、脂質、セラミド、スフィンゴ脂質、リン脂質及びＰＥＧ化リン脂質からなる群から選択される１種以上の化合物を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記ベシクル形成成分は、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ＴＡＴＥからなる群から選択される１種以上の両親媒性化合物を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記物質封入成分は、キレート剤、還元剤及び前記放射性核種と共に低溶解性塩を形成する物質からなる群から選択される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記物質封入成分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（［１２］ａｎｅＮ4）、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン（［１３］ａｎｅＮ4）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（［１４］ａｎｅＮ4）、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン（［１５］ａｎｅＮ4）、１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン（［１６］ａｎｅＮ4）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）からなる群から選択されるキレート剤である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記物質封入成分は、１，４−エタノ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｅｔ−シクラム）、１，４，７，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ｉｓｏ−シクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、２−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）酢酸（ＤＯ１Ａ）、２，２’−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジイル）二酢酸（ＤＯ２Ａ）、２，２’，２’’−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯ３Ａ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，７−ジ（メタンホスホン酸）（ＤＯ２Ｐ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ（メタンホスホン酸）（ＤＯ３Ｐ）、１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、２−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１−イル）酢酸（ＴＥ１Ａ）、２，２’−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，８−ジイル）二酢酸（ＴＥ２Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）からなる群から選択されるキレート剤である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記物質封入成分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、シクラム及びシクレンからなる群から選択されるキレート剤である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記物質封入成分は、アスコルビン酸、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース、麦芽糖及びアセトールからなる群から選択される還元剤である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ナノ粒子の内部ｐＨは、４〜８．５、例えば４．０〜４．５又は例えば４．５〜５．０又は例えば５．０〜５．５又は例えば５．５〜６．０又は例えば６．０〜６．５又は例えば６．５〜７．０又は例えば７．０〜７．５又は例えば７．５〜８又は例えば８．０〜８．５である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記放射性標識ナノ粒子は、２０％未満、例えば１５％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、例えば６％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満の放射線の漏出が観察される安定性を有する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. イオノフォアを使用せずにナノ粒子内への封入を行うためのキット・オブ・パーツであって、
    ａ．ｉ）ベシクル形成成分と、ｉｉ）前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、を含むナノ粒子組成物と、
    ｂ．前記ナノ粒子に封入される金属体を含む組成物と、
    を含むキット・オブ・パーツ。
  40. 前記金属体は、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の放射性核種の１種以上を含む、請求項３９に記載のキット・オブ・パーツ。
  41. 前記金属体は銅同位体（61Ｃｕ、64Ｃｕ及び67Ｃｕ）から選択される１種以上の放射性核種である、請求項３９又は４０に記載のキット・オブ・パーツ。
  42. 請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法を使用して製造されたナノ粒子組成物。
  43. 金属体が封入された請求項４２に記載のナノ粒子組成物であって、
    ｉ．ベシクル形成成分と、
    ｉｉ．前記ベシクル形成成分によって囲まれた物質封入成分と、
    ｉｉｉ．前記ナノ粒子組成物の内部に封入された金属体と、
    を含み、
    イオノフォアを含まないナノ粒子組成物。
  44. 前記金属体は、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の金属体の１種以上を含む、請求項４２又は４３に記載のナノ粒子組成物。
  45. ＰＥＧから誘導された両親媒性化合物をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  46. 前記ベシクル形成成分が１種以上の両親媒性化合物を含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  47. 前記ベシクル形成成分は、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００−ＴＡＴＥからなる群から選択される１種以上の両親媒性化合物を含む、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  48. 前記物質封入成分はキレート剤である、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  49. 前記物質封入成分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−１５テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メタンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、シクラム及びシクレンからなる群から選択されるキレート剤である、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  50. 前記金属体は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、177Ｌｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、225Ａｃ、90Ｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ及び119Ｓｂからなる群から選択される１種以上の放射性核種を含む、請求項４２〜４９のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  51. 前記金属体は、64Ｃｕ及び67Ｃｕ、61Ｃｕ及び67Ｃｕ、64Ｃｕ及び90Ｙ、64Ｃｕ及び119Ｓｂ、64Ｃｕ及び225Ａｃ、64Ｃｕ及び188Ｒｅ、64Ｃｕ及び186Ｒｅ、64Ｃｕ及び211Ａｔ、64Ｃｕ及び67Ｇａ、61Ｃｕ及び177Ｌｕ、61Ｃｕ及び90Ｙ、61Ｃｕ及び119Ｓｂ、61Ｃｕ及び225Ａｃ、61Ｃｕ及び188Ｒｅ、61Ｃｕ及び186Ｒｅ、61Ｃｕ及び211Ａｔ、61Ｃｕ及び67Ｇａ、67Ｃｕ及び177Ｌｕ、67Ｃｕ及び90Ｙ、67Ｃｕ及び119Ｓｂ、67Ｃｕ及び225Ａｃ、67Ｃｕ及び188Ｒｅ、67Ｃｕ及び186Ｒｅ、67Ｃｕ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び177Ｌｕ、68Ｇａ及び90Ｙ、68Ｇａ及び119Ｓｂ、68Ｇａ及び225Ａｃ、68Ｇａ及び188Ｒｅ、68Ｇａ及び186Ｒｅ、68Ｇａ及び211Ａｔ、68Ｇａ及び67Ｃｕからなる群から選択される２種の放射性核種を含む、請求項４２〜５０のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  52. 抗体、アフィボディ及びペプチド成分からなる群から選択される標的部分をさらに含む、請求項４２〜５１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  53. 前記物質封入成分に結合した核局在配列ペプチド（ＮＬＳペプチド）等の細胞内標的特性を有する化合物を含む、請求項４２〜５２のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  54. 前記ナノ粒子の内部ｐＨは、４〜８．５、例えば４．０〜４．５又は例えば４．５〜５．０又は例えば５．０〜５．５又は例えば５．５〜６．０又は例えば６．０〜６．５又は例えば６．５〜７．０又は例えば７．０〜７．５又は例えば７．５〜８．０又は例えば８．０〜８．５である、請求項４２〜５３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  55. 前記ナノ粒子の内部ｐＨは、６〜８、例えば６．０〜６．５、例えば６．５〜７．０、例えば７．０〜７．５、例えば７．５〜８である、請求項４２〜５４のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  56. 前記ナノ粒子の直径は３０〜１０００ｎｍである、請求項４２〜５５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  57. 前記放射性標識ナノ粒子は、２０％未満、例えば１５％未満、例えば１２％未満、例えば１０％未満、例えば８％未満、例えば６％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満の漏出が観察される安定性を有する、請求項４２〜５６のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  58. 対象者の治療、監視、治療有効性の監視又は診断のための方法に使用される、請求項４２〜５７のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  59. 撮影に使用される、請求項４２〜５８のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  60. ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャン及び／又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）スキャン及び／又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用される、請求項４２〜５９のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
  61. 薬剤として使用される、請求項４２〜６０のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016084334A (ja) * 2014-10-23 2016-05-19 行政院原子能委員會核能研究所 放射ターゲット薬物調製用キット及び放射ターゲット薬物の調製方法及び用途
JP2018519370A (ja) * 2015-05-04 2018-07-19 フェルザンティス アーゲーＶｅｒｓａｎｔｉｓ Ａｇ 膜内外ｐＨ勾配ベシクルを調製する方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2881928A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-invasive imaging
AU2013202947B2 (en) 2012-06-13 2016-06-02 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan
US9717724B2 (en) 2012-06-13 2017-08-01 Ipsen Biopharm Ltd. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies
US9993427B2 (en) * 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
US20160303264A1 (en) * 2013-10-23 2016-10-20 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for non-invasive imaging and drug delivery
US11318131B2 (en) 2015-05-18 2022-05-03 Ipsen Biopharm Ltd. Nanoliposomal irinotecan for use in treating small cell lung cancer
KR20180037210A (ko) 2015-08-20 2018-04-11 입센 바이오팜 리미티드 암 치료를 위한 리포좀 이리노테칸 및 parp 저해제를 이용하는 조합요법
TW202126293A (zh) 2015-08-21 2021-07-16 英商益普生生物製藥有限公司 使用包含微脂伊立替康(irinotecan)及奧沙利鉑(oxaliplatin)之組合療法治療轉移性胰臟癌的方法
RU2599462C1 (ru) * 2015-09-22 2016-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНОЛОГИЯ" (ООО "БИОТЕХНОЛОГИЯ") Способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей
JP6941606B2 (ja) 2015-10-16 2021-09-29 イプセン バイオファーム リミティド 安定化カンプトテシン医薬組成物
EP3354270A4 (en) * 2016-10-21 2019-04-24 Obshestvo S Ogranichennoi Otvetstvennost'yu "Biotehnologiya" METHOD FOR ACTIVATION OF APOPTOSIS OF CELLS WITH MULTIPLE SIGNALING OF SOLID MALIGNANT TUMORS
SG11201903615WA (en) 2016-11-02 2019-05-30 Ipsen Biopharm Ltd Treating gastric cancer using combination therapies comprising liposomal irinotecan, oxaliplatin, 5-fluoruracil (and leucovorin)
US11798700B2 (en) 2018-03-26 2023-10-24 The University Of British Columbia Systems, apparatus and methods for separating actinium, radium, and thorium
CN109063231B (zh) * 2018-06-15 2023-06-27 中国核电工程有限公司 基于GUM导则的核素不确定度对临界系统keff影响的评定方法
EP3917499A4 (en) * 2019-01-29 2022-10-19 The Johns Hopkins University Adhesive/adsorption switch on nanoparticles to increase tumor uptake and delay tumor clearance
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
WO2023183559A1 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Engineered ionophores for transport of metal ions
WO2024258223A1 (ko) * 2023-06-14 2024-12-19 주식회사 지티아이바이오사이언스 방사성 동위원소를 포함하는 나노입자 조성물을 제조하는 장치 및 이의 제조 방법
FR3156311A1 (fr) * 2023-12-08 2025-06-13 Aken Medical Nanoparticules radioactives de type cœur/enveloppe utiles en radiothérapie ciblée
FR3156312A1 (fr) * 2023-12-08 2025-06-13 Aken Medical Nanoparticules radioactives de type cœur/enveloppes utiles en radiothérapie ciblée

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61218515A (ja) * 1985-01-31 1986-09-29 ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド 微量乳化を用いる小胞の製造方法
JP2001510451A (ja) * 1996-10-30 2001-07-31 ザ ユニバーシティ オブ ブリティシュ コロンビア 弱塩基性薬物を担持するイオン運搬体―中介リポゾーム
JP2003522808A (ja) * 2000-02-21 2003-07-29 アンチキャンサー セラピューティック インベンションズ エイエス 放射線治療用リポソーム
JP2005120095A (ja) * 1997-09-08 2005-05-12 Skyepharma Inc 多胞状リポソームへの薬剤封入量の調節
JP2005519861A (ja) * 2001-07-27 2005-07-07 ターゲサム・インコーポレーテッド 治療剤及び撮像剤としての脂質構築物
JP2006045132A (ja) * 2004-08-05 2006-02-16 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソーム含有磁気共鳴造影剤
JP2008517049A (ja) * 2004-10-22 2008-05-22 アルゲッタ エイエス 併用治療用の細胞毒性製剤
JP2010235464A (ja) * 2009-03-30 2010-10-21 Natl Inst Of Radiological Sciences 治療薬剤の標的部位への集積及び放出を追跡可能な治療薬剤含有リポソームおよびその製造方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4310506A (en) * 1979-02-22 1982-01-12 California Institute Of Technology Means of preparation and applications of liposomes containing high concentrations of entrapped ionic species
US5077056A (en) 1984-08-08 1991-12-31 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US5736155A (en) 1984-08-08 1998-04-07 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US5622713A (en) 1985-09-17 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Method of detoxifying animal suffering from overdose
JP2710847B2 (ja) 1987-11-04 1998-02-10 ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド 中性子捕獲療法剤およびその製法
US5258499A (en) 1988-05-16 1993-11-02 Vestar, Inc. Liposome targeting using receptor specific ligands
US5688488A (en) 1989-04-03 1997-11-18 Purdue Research Foundation Composition and method for tumor imaging
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5525232A (en) 1990-03-02 1996-06-11 The Liposome Company, Inc. Method for entrapment of cationic species in lemellar vesicles
JPH075561B2 (ja) 1991-12-17 1995-01-25 工業技術院長 α−アミノ酸のジアミド誘導体
CA2093381A1 (en) * 1992-04-07 1993-10-08 Hideyuki Sawahara Liposome formulation and process for production thereof
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US5945502A (en) 1997-11-13 1999-08-31 Xerox Corporation Electroluminescent polymer compositions and processes thereof
AU2002340670A1 (en) * 2001-11-13 2003-05-26 Celator Technologies, Inc. Lipid carrier compositions and methods for improved drug retention
CA2480408A1 (en) 2002-02-26 2003-09-04 Masahiro Murakami A method for encapsulating metal complex in liposomes
WO2004082627A2 (en) 2003-03-18 2004-09-30 Ethicon, Inc. ENZYME REPLACEMENT THERAPY WITH 17-β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE-TYPE 2
WO2004082626A2 (en) 2003-03-18 2004-09-30 Ethicon, Inc. Aromatase inhibitor diagnosis and therapy
WO2006021008A2 (en) 2004-08-20 2006-02-23 Lind Stuart E Ionophores as cancer chemotherapeutic agents
ITMI20050328A1 (it) 2005-03-03 2006-09-04 Univ Degli Studi Milano Composti peptidomimetrici e preparazione di derivati biologicamente attivi
TW200922630A (en) 2007-09-26 2009-06-01 Nat Health Research Institutes Liposome compositions useful for tumor imaging and treatment
WO2009140215A2 (en) 2008-05-11 2009-11-19 Geraghty, Erin Method for treating drug-resistant bacterial and other infections with clioquinol, phanquinone, and related compounds
CA2768444A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Rigshospitalet Loading technique for preparing radionuclide and ionophore containing liposomes in which the ionophore is 2-hydroxyquionoline (carbostyril) or structurally related 2-hydroxyquinolines

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61218515A (ja) * 1985-01-31 1986-09-29 ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド 微量乳化を用いる小胞の製造方法
JP2001510451A (ja) * 1996-10-30 2001-07-31 ザ ユニバーシティ オブ ブリティシュ コロンビア 弱塩基性薬物を担持するイオン運搬体―中介リポゾーム
JP2007284460A (ja) * 1996-10-30 2007-11-01 Univ Of British Columbia 弱塩基性薬物を担持するイオン運搬体−中介リポゾーム
JP2005120095A (ja) * 1997-09-08 2005-05-12 Skyepharma Inc 多胞状リポソームへの薬剤封入量の調節
JP2003522808A (ja) * 2000-02-21 2003-07-29 アンチキャンサー セラピューティック インベンションズ エイエス 放射線治療用リポソーム
JP2005519861A (ja) * 2001-07-27 2005-07-07 ターゲサム・インコーポレーテッド 治療剤及び撮像剤としての脂質構築物
JP2006045132A (ja) * 2004-08-05 2006-02-16 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソーム含有磁気共鳴造影剤
JP2008517049A (ja) * 2004-10-22 2008-05-22 アルゲッタ エイエス 併用治療用の細胞毒性製剤
JP2010235464A (ja) * 2009-03-30 2010-10-21 Natl Inst Of Radiological Sciences 治療薬剤の標的部位への集積及び放出を追跡可能な治療薬剤含有リポソームおよびその製造方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016084334A (ja) * 2014-10-23 2016-05-19 行政院原子能委員會核能研究所 放射ターゲット薬物調製用キット及び放射ターゲット薬物の調製方法及び用途
JP2018519370A (ja) * 2015-05-04 2018-07-19 フェルザンティス アーゲーＶｅｒｓａｎｔｉｓ Ａｇ 膜内外ｐＨ勾配ベシクルを調製する方法

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