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JP2014500004A - 抗ｃｔｌａ−４モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクター - Google Patents

抗ｃｔｌａ−４モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクター Download PDF

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JP2014500004A JP2013529691A JP2013529691A JP2014500004A JP 2014500004 A JP2014500004 A JP 2014500004A JP 2013529691 A JP2013529691 A JP 2013529691A JP 2013529691 A JP2013529691 A JP 2013529691A JP 2014500004 A JP2014500004 A JP 2014500004A
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Abstract

本発明は生命科学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は癌治療に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびに前記ベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。本発明はまた、被験者の癌を治療するための前記ベクターおよび被験者の癌を治療するための方法にも関する。さらにまた、本発明は、細胞内で抗CTLA-4モノクローナル抗体を産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強する方法ばかりでなく、細胞内で抗CTLA-4モノクローナル抗体を産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強するための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用にも関する。
【選択図】 図１

Description

本発明は生命科学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は癌治療に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびに前記ベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。本発明はまた、被験者の癌を治療するための前記ベクターおよび被験者の癌を治療する方法のための前記ベクターにも関する。さらにまた、本発明は、細胞内で抗CTLA-4モノクローナル抗体を産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強する方法ばかりでなく、細胞内で抗CTLA-4モノクローナル抗体を産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強するための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用にも関する。
癌は、手術、ホルモン療法、化学療法、放射線治療および/または他の治療で治療することができる。しかしながら、多くの場合、癌はしばしば進行病期を特徴とし、現在の処置では治すことができない。従って、癌細胞を標的とする新規なアプローチ、例えば遺伝子治療が求められている。
過去20年の間に、遺伝子導入技術は集中的に研究がなされてきた。癌遺伝子治療の目的は、腫瘍細胞に治療遺伝子を導入することである。標的細胞に導入されるこれらの治療遺伝子によって、例えば、変異遺伝子を矯正するか、活性癌遺伝子を抑制するか、または細胞に追加の性質を生じさせることができる。適切な外因性治療遺伝子は、限定するものではないが、免疫療法遺伝子、抗血管新生遺伝子、化学保護遺伝子および“自殺”遺伝子を含み、それらは、改変ウイルスベクターまたは、エレクトロポレーション、遺伝子銃および、脂質もしくはポリマーコーティングを含む非ウイルス法を利用することにより細胞に導入することができる。
最適のウイルスベクターの必要条件は、特定の標的細胞を見出し、その標的細胞内でウイルスゲノムを発現させるのに有効な能力を含む。さらにまた、最適のベクターは、標的組織または細胞内で活性を維持しなければならない。これらのすべてのウイルスベクターの性質は、この10年の間に開発されてきており、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは生物医学において広く研究されてきた。
抗腫瘍効果の腫瘍浸透および局所増幅をさらに改善するために、選択的腫瘍溶解剤、例えば、条件複製型(conditionally replicating)アデノウイルスが構築された。腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌の治療に有望なツールであり、臨床試験において、優れた安全性およびある程度の有効性が示された。腫瘍細胞は、腫瘍溶解性アデノウイルスが、腫瘍細胞内でそのウイルスの複製を行うことにより死滅する。複製の最終段階で、周囲の腫瘍組織への大量のビリオンの放出が起こり、効果的な腫瘍浸透および脈管再感染が行われる。非腫瘍細胞内での複製を妨げる、ウイルスゲノム内の操作された改変によって、腫瘍細胞はウイルスの複製を許容するが、正常細胞はそれを免れる。
アデノウイルスE1領域に部分欠失を作成するか、または組織もしくは腫瘍特異的プロモーター(TSP)を用いるかのいずれかによって複製を腫瘍組織に限定することができる。このようなプロモーターの挿入によって、標的細胞におけるベクターの効果を高めることができ、また組換えアデノウイルスベクターにおいて、外因性組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は一般的である。
大部分の臨床試験は、アデノウイルス5型(Ad5)に基づく初期世代アデノウイルスを用いて行われた。腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果は、それらの遺伝子送達能力に依存する。残念なことに、大部分の腫瘍は、主Ad5受容体の発現が低いため、Ad5カプシドに改変が導入された。例えば、血清型3ノブでのカプシド改変により、卵巣癌において、感染性の改善および優れた有効性が示された(Kanerva A, et al., Clin Cancer Res 2002;8:275-80; Kanerva A, et al., Mol Ther 2002;5:695-704; Kanerva A, et al., Mol Ther 2003;8:449-58)。同様に、Adベクターの繊維およびペントン基部は、細胞侵入機構の鍵メディエーターであるため、これらのカプシドタンパク質の遺伝子改変によって、組換えAdベクターのターゲッティングを達成することができる(Dmitriev I., et al. 1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713)。現在、大部分の臨床用途の腫瘍溶解性ウイルスは、重要なウイルス遺伝子のいくつかの欠失によって、複製に関して高度に弱毒化されている。これらのウイルスは優れた安全記録を示したが、抗腫瘍効果は限定されていた。
武装していない腫瘍溶解性ウイルスでの治療は、十分に免疫刺激性ではないため、持続的な抗腫瘍性治療的免疫応答をもたらさないことを臨床結果および前臨床結果は示している。この点において、腫瘍溶解性ウイルスは、より免疫刺激性であるように武装されている。さらに、腫瘍内でのウイルス複製および免疫調節タンパク質の発現は、サイトカイン産生を誘導し、腫瘍抗原を放出することによって免疫系を増強する(Ries SJ, et al., Nat Med 2000;6:1128-33)。
腫瘍溶解性ウイルスを武装することによって、従来の遺伝子送達の利点と複製コンピテント剤の有効性が組み合わされる。ウイルスの武装の目的の1つは、ウイルス複製を許容する細胞に対する免疫反応の誘導である。上記のように、ウイルス複製単独では、免疫原性ではあるものの、通常は、有効な抗腫瘍免疫を誘導するのには十分ではない。治療的免疫の誘導を増強するために、抗原提示細胞、例えば樹状細胞への腫瘍抗原の導入の簡便化ならびにそれらの刺激および/または成熟のための刺激タンパク質、例えばサイトカインでウイルスが武装された。免疫療法遺伝子の腫瘍細胞への導入ならびに、さらに、それらのタンパク質の翻訳は、免疫応答の活性化およびより効率的な腫瘍細胞の破壊をもたらす。この点において、最も関連性のある免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞(NK)および細胞傷害性CD8+T細胞である。
癌免疫療法の重要な新事実は、腫瘍の免疫逃避機構によって、この疾患を根絶するのに抗腫瘍免疫応答の誘導が十分ではないということの理解であった。代わりに、進行癌の免疫抑制的性質によって、抑制性T細胞のダウンレギュレーションもまた必要とされる(Dranoff G., Nat Rev Cancer 2004;4:11-22; de Visser KE et al., Nat Rev Cancer 2006;6:24-37)。これらの重要な制御経路の1つは、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)(CTLA-4、CD152)を含み、これはB7/CD28媒介刺激に対して作用する。CTLA-4にアンタゴニスト作用を持つ抗体の前臨床抗腫瘍効果は、以前、いくつかの腫瘍モデルにおいて示されている(Leach DR et al., Science 1996;271:1734-6; Kwon ED et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:15074-9)。
現在、CTLA-4に対する2つの完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)、IgG1イピリムマブ(以前はMDX-010)およびIgG2トレメリムマブ(以前はCP-675,206)が臨床開発中である。いくつかの公表された研究により、黒色腫および他の癌を有する患者におけるイピリムマブおよびトレメリムマブの生物活性および臨床活性が証明されている(Kirkwood JM et al., Clin Cancer Res 2010;16:1042-8; Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23; Ribas A et al., Oncologist 2007;12:873-83)。多くの試験において抗腫瘍活性は認められているが、重篤かつ致死性までもの副作用もまた報告されている。副作用は、全身投与による正常組織への暴露と関連するが、有効性は、腫瘍における免疫抑制阻害によって決定される。従って、CTLA-4 mAbの局所産生の可能性が正当化される。
CTLA-4は、Igスーパーファミリーの活性化誘導型I型膜貫通タンパク質であり、共刺激分子B7.1(CD80)およびB7.2(CD86)の抑制受容体として機能する共有結合ホモ二量体としてTリンパ球によって発現される(Ribas A et al., Oncologist 2007;12:873-83)。mAbによるCTLA-4遮断は、リンパ球によるインターロイキン-2(IL-2)およびインターフェロンγ(IFN-γ)の産生増加と主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子の発現増加をもたらす(Lee KM et al., Science 1998;282:2263-6; Paradis TJ et al., Cancer Immunol Immunother 2001;50:125-33)。
腫瘍が抗腫瘍免疫を逃れるために使用する主要な機構の1つは、調節性T細胞(T-Reg)を介するものである。T-Regをダウンレギュレートするためにこれまで用いられてきたいくつかのアプローチの中で、抗CTLA4 mAbのみが、唯一、大規模無作為化試験において安全性と有効性が確認された(Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23)。この試験は、腫瘍免疫療法の飛躍的前進を示すものであるが、他の抗CTLA4 mAbによる否定的な第3相試験が先行した(Ribas A et al. J Clin Oncol ASCO suppl. 2008; 287)。同様に、すべての抗CTLA4 mAb試験において、重篤な免疫関連有害事象(irAE)は死を引き起こしており、このアプローチの安全性に関して懸念が生じた。従って、遺伝子治療プラットフォームの利用などのさらなるアプローチが求められている。なぜなら、それによって、局所濃度を上昇させて有効性を増し、全身暴露に関連する副作用を減少させることが可能であるからである。
腫瘍に限局した抗CTLA4 scFv発現と全身的T-Reg枯渇との併用が相乗効果を示すことが報告されている(Tuve S, et al. Cancer Res 2007;67:5929-39)。さらにまた、抗CTLA-4 scFv抗体が腫瘍により継続的に発現され、抗CD25抗体がi.p投与されるとき、著者らは、マウスモデルにおいて、自己免疫反応を認めなかった(Tuve S, et al. Cancer Res 2007;67:5929-39)。対照的に、T-Reg枯渇と共に抗CTLA4 mAbが全身投与されるとき、自己免疫反応が認められる(Sutmuller RP et al., J Exp Med 2001;194:823-32; Takahashi T et al. J Exp Med 2000;192:303-10)。相乗効果の考えられる理由の1つは、T-Reg枯渇が調節性細胞数を減少させるとともに、抗CTLA-4が抑制性細胞の活性を抑制することである。さらに、抗CTLA4は、抗原提示細胞の抑制を阻害することもできる。
アデノウイルスは、中程度のサイズ(90〜100nm)の、エンベロープを持たない二十面体ウイルスであり、タンパク質カプシド内に約36000塩基対の二本鎖線状DNAを有する。このウイルスカプシドは、標的細胞へのウイルスの接着に関与する繊維構造を有する。最初に、標的細胞の受容体(例えば、コクサッキーウイルスアデノウイルス受容体(CAR))に繊維タンパク質のノブドメインが結合し、2番目に、ウイルスがインテグリン分子と相互作用し、3番目にウイルスが標的細胞内にエンドサイトーシスされる。次いで、エンドソームから核にウイルスゲノムが輸送され、ウイルスの用途のためにも標的細胞の複製機構が同様に用いられる(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。
アデノウイルスゲノムは、初期遺伝子(E1〜E4)、中期遺伝子(IXおよびIVa2)ならびに後期遺伝子(L1〜L5)を有し、これらは順次に転写される。初期遺伝子産物は、宿主細胞の防御機構、細胞周期および細胞代謝に作用する。中期および後期遺伝子は、新規ビリオンの産生のためのウイルス構造タンパク質をコードする(Wu and Nemerow, Trends Microbiol 2004;12:162-168; Russell W.C., J General Virol 2000;81;2573-2604; Volpers C. and Kochanek S. J Gene Med 2004;6, suppl 1: S164-71; Kootstra N.A. and Verma I.M. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003;43: 413-439)。
ヒトにおいて、50を超える異なるアデノウイルスの血清型が見出されている。血清型は、6つのサブグループA〜Fに分類され、異なる血清型は、異なる疾患、すなわち呼吸器疾患、結膜炎および胃腸炎と関連していることが知られている。アデノウイルス血清型5(Ad5)は呼吸器疾患を引き起こすことが知られており、遺伝子治療の分野で研究された最も一般的な血清型である。最初のAd5ベクターにおいて、E1および/またはE3領域が欠失され、このベクターへの異種DNAの挿入が可能となった(Danthinne X, Imperiale MJ., Gene Therapy. 2000;7:1707-1714)。さらにまた、他の領域の欠失ならびにさらなる変異によって、ウイルスベクターに追加の性質が付与された。実際、有効な抗腫瘍効果を達成するために、アデノウイルスの種々の改変が示唆されている。
それにもかかわらず、より効率的かつ正確な遺伝子導入ばかりでなく、遺伝子治療の特異性の増加および十分な腫瘍致死能力が求められている。治療ベクターの安全記録もまた優れたものでなければならない。本発明は、新規で創意に富む方法でアデノウイルスの腫瘍溶解性および免疫療法性の両方を利用することによる、これらの前述の性質を有する癌治療ツールを提供する。
本発明の目的は、アデノウイルスの前記の性質を獲得し、それと共に従来の癌治療の問題を解決するための新規方法およびツールを提供することである。より具体的には、本発明は、遺伝子治療のための新規方法およびツールを提供する。
本願は、組換えウイルスベクターの構築および前記ベクターに関連する方法を開示し、また、腫瘍細胞株、動物モデルならびに癌患者および健常人ドナーの血球における前記ベクターの使用を開示する。
本発明は、
1)カプシド改変、好ましくはアデノウイルス血清型3(Ad3)ノブでのカプシド改変(Ad5/3カプシドキメリズム（chimerism）)を含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖（backbone）、
2)E1のRb結合定常領域2(Rb binding constant region 2)における24bp欠失(D24)および
3)E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k/6.7Kの代わりに（in the place of）、CTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体(aCTLA MAb)をコードする核酸配列
を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
本発明はさらに、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む細胞に関する。
本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、被験者の癌を治療するための本発明のアデノウイルスベクターに関する。
本発明はまた、被験者の癌を治療する方法であって、癌、特に従来の化学療法薬および/または放射線治療に難治性の癌を患っている被験者への本発明のベクターまたは医薬組成物の投与を含む前記方法に関する。
さらに、本発明はまた、細胞内でCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を産生する方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、細胞内で前記ベクターのCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現することを含む前記方法に関する。
さらに、本発明はまた、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、細胞内で前記ベクターのCTLA-4(抗CTLA4 mAb)に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現させ、ウイルスゲノムの腫瘍特異的複製によって、腫瘍(正常組織ではなく)において抗CTLA4 mAbの産生量を増加させることを含む前記方法に関する。
さらに、本発明はまた、細胞内でCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。
さらに、本発明は、細胞内でCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
さらに、本発明はまた、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。
さらに、本発明は、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
本発明は、現行の治療的アプローチに難治性または不治の癌の治療のための新規ツールを提供する。また、多くの他の治療と比較して、治療に適する腫瘍タイプに関する制限がほとんどない。実際、提案された本発明ですべての固形腫瘍を治療することができる。本発明は、従来の技術よりもより大きな腫瘍およびより複雑な腫瘍を破壊するのに役立つことができる。処置は、腫瘍内、腔内、静脈内に行うことができ、これらの組み合わせで行うこともできる。本アプローチは、局所注射にもかかわらず全身有効性を示すことができる。本アプローチはまた、癌源細胞として提案された細胞(“癌幹細胞”)を根絶することもできる(Eriksson M et al. Mol Ther 2007; 15(12):2088-93)。
目的とする部位にベクターを輸送することを可能にすること以外にも、本発明のベクターは、導入遺伝子の発現および持続性をも確実にする。本発明は、従来の治療に対する治療抵抗性に関連する問題を解決する。さらにまた、本発明は、健常組織への毒性または損傷の少ない選択的治療のためのツールおよび方法を提供する。本発明の利点はまた、他の処置と比較して、異なった、かつ低減した副作用を含む。重要なことには、本アプローチは、化学療法、低分子阻害剤および放射線治療を含む多くの他の形態の治療と相乗的に作用し、従って併用レジメンで使用することができる。
武装していないアデノウイルスの複製を許容する細胞に対する免疫反応の誘導は、通常は、治療的腫瘍免疫の発現をもたらすのに十分には強くない。この弱点を克服するために、本発明は、細胞傷害性T細胞および抗原提示細胞を活性化し、制御性T細胞および他の抑制性細胞をダウンレギュレートすることによって抗腫瘍免疫を増強する、CTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体で武装されたアデノウイルスを提供する。抗CTLA-4 mAbはまた、多くの場合CTLA-4を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを直接に誘導することもできる。本発明のアデノウイルスベクターによって、前述のように、CTLA-4遮断抗体によって媒介されるいくつかの抗腫瘍機構が実現される:
(A):抗CTLA-4 mAbは、活性化T細胞の表面上のCTLA-4分子由来の免疫抑制シグナル伝達を遮断することができる(Chambers CA et al., Annu Rev Immunol 2001;19:565-94)。
(B):重要なT細胞の抑制性サブセット(制御性T細胞、T-Reg)は、構成的にCTLA-4を発現し、鍵抗原提示細胞である樹状細胞上のB7分子に結合することができる(Paust S et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:10398-403)。その後のインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼおよび他の抑制回路のアップレギュレーションは、細胞傷害作用の代わりに、その微小環境においてT細胞の免疫寛容化をもたらす(Munn DH et al., J Clin Invest 2004;114:280-90。
(C):CTLA-4発現T細胞(T-Regを含む)はまた、活性化T細胞に直接に結合することができる。なぜなら、活性化ヒトT細胞の表面上にB7共刺激分子が発現されるからである。CTLA-4遮断mAbは、この抑制性シグナル伝達に干渉し、腫瘍抗原特異的T細胞の局所増殖をもたらす(Paust S et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:10398-403)。
(D):CTLA-4は、多くの腫瘍細胞の表面上に発現されるが(Contardi E et al., Int J Cancer 2005;117:538-50)、おそらくこれは、細胞傷害性T細胞およびDCのB7に対する直接免疫抑制作用を反映している。興味深いことに、CTLA-4遮断mAbは、アポトーシスを引き起こすことによって腫瘍細胞の直接致死を誘導し(Ribas A et al., Oncologist 2007;12:873-83; Contardi E et al., Int J Cancer 2005;117:538-50)、in vivoで、これはさらに抗体依存性細胞傷害作用によって増強されることができる(Jinushi M et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:9190-5)。
(E):腫瘍によって発現されるCTLA-4は、腫瘍浸潤DCにおいてインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼの増加を引き起こすことができ、CTLA-4特異的モノクローナルAbはまた、この効果を遮断すると考えられる(Ribas A et al., Oncologist 2007;12:873-83)。
従って、5つの異なる機構は、安全上の懸念がもたれた全身暴露と関連する副作用がなければ、モノクローナル抗CTLA-4を含む本発明のアデノウイルスを、強力な抗腫瘍アプローチにする(Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23; Sanderson K et al., J Clin Oncol 2005;23:741-50。導入遺伝子によって媒介されるこれらの5つの機構に加えて、腫瘍溶解性ウイルスの複製が、抗腫瘍効果を高める。強力な免疫刺激が、アデノウイルスそれ自体によって媒介されるとすれば(Tuve S, et al. Vaccine. 2009;27(31):4225-39)、腫瘍溶解は、本アプローチの全般的免疫学的有用性を高める。以下の実施例9(図1、11、12)において、我々はこの点におけるさらなる改善(アデノウイルスゲノムへのCpGの添加によって、ウイルスの免疫刺激活性はさらに高まる)を開示する。
先行技術のアデノウイルスツールと比較して、本発明は、癌治療のための、より単純な、より有効な、安価な、無毒のおよび/または安全なツールを提供する。さらにまた、ヘルパーウイルスまたは組換え分子の共投与を必要としない。
本発明は、以前のウイルスの優れた安全性を保持し、高レベルの有効性をもたらす、感染性が増強された高度に有効な新世代のアデノウイルスを提供する。重要なことに、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの有効性に関して重要な免疫性因子を提供する腫瘍溶解性アデノウイルスを開示する。
本発明の新規製品は、癌治療におけるさらなる改善を可能にする。
図1は、単一標的、二重標的および抗CTLA4武装腫瘍溶解性アデノウイルスの構築を示す。腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-Δ24aCTLA4(単一標的;他は二重標的)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4およびAd5/3E2F-Δ24aCTLA4-CpG、複製欠損性Ad5/3-aCTLA4ならびに武装していない腫瘍溶解性Ad5/3-Δ24(陽性対照)および複製欠損性Ad5/3-Luc1(陰性対照)の概略図。 図2A〜2Fは、ウイルスによって産生された抗CTLA4モノクローナル抗体の発現および機能の評価を示す。図2A:天然条件(上列)または変性条件(下列)で、ヒトIg(H鎖およびL鎖の両方)の特異的検出のためのウェスタンブロットによって分析した、ウイルス感染したA549(左から右へレーン1および2)またはPC3-MM2(レーン3および4)細胞の無血清上清。レーン1および3:Ad5/3-Δ24aCTLA4に感染した細胞;レーン2および4:Ad5/3-aCTLA4に感染した細胞。図2B:ウイルス産生抗CTLA4モノクローナル抗体の活性を示す機能アッセイ。Jurkat細胞をイオノマイシン、ホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)および組換えヒトB7と共にインキュベートし、多くの場合、進行癌においてみられる状態である、抗原提示細胞によって刺激されたがサプレッサー細胞によって抑制されているT細胞に類似するCD28およびCTLA-4陽性細胞が得られた。Ad5/3-Δ24aCTLA4またはAd5/3-aCTLA4感染細胞からの上清は、B7/CTLA-4媒介抑制の抑制を引き起こした。これはT細胞活性化マーカーであるIL-2の産生増加として見られる。組換え抗CTLA4モノクローナル抗体を陽性対照として含めた。図2C:ウイルス産生抗CTLA4モノクローナル抗体に対する組換えCTLA-4(rCTLA-4)の親和性を示す機能喪失アッセイ。Jurkat細胞を前述同様に活性化したが、この場合は、rCTLA-4を添加してB7に結合させ、CTLA-4の活性化を抑制した。aCTLA4を含む上清が添加された場合、rCTLA-4が遮断され、B7がCTLA-4に結合することができ、IL-2産生が低下した。カラム、3つの独立した実験の平均;バー、SE*、P<0.05;***、P<0.001。図2D:A549、SKOV3-ip1、PC3-MM2腫瘍細胞株およびUT-SCC8低継代培養腫瘍外植片におけるCTLA4発現レベル。蛍光補助細胞選別において、すべての腫瘍細胞株はCTLA4陽性であった。図2Eおよび2F:抗CTLA4発現カセットの大きなサイズまたは抗CTLA4タンパク質の産生がAd5/3-Δ24aCTLA4の複製に影響しないことを示すアデノウイルスqPCR。簡潔に言えば、A549細胞をPBS、Ad5/3-Δ24およびAd5/3-Δ24aCTLA4に感染させ、上清および細胞から種々の時点でqPCRによってウイルス粒子数を測定した。ウイルス群間で有意差は見られなかった。 図3は、抗CTLA4武装アデノウイルスおよび対照ベクターの細胞致死効率を示す。腫瘍細胞株(A)PC3-MM2、(B)SKOV3-ip1、(C)A549および(D)低継代培養腫瘍外植片UT-SCC8を感染させた。すべての細胞株において、Ad5/3-Δ24aCTLA4は、陽性対照ウイルスAd5/3-Δ24と同様な腫瘍溶解能を示した。同様に、複製欠損性Ad5/3-aCTLA4も抗腫瘍活性を示した。これは腫瘍細胞がCTLA4を発現するためである。カラム、3連アッセイの平均;バー、SE.**、P<0.01;***、P<0.001。 図4は、抗CTLA-4モノクローナル抗体発現腫瘍溶解性アデノウイルスで処置された、ヒト前立腺癌異種植皮(PC3-MM2腫瘍)およびヒト肺癌異種植皮(A549腫瘍)を有する免疫不全マウスにおける腫瘍増殖抑制およびアポトーシスを示す。PC3-MM2腫瘍(n=8/群)はヌードマウスに定着させたが、これにはヒト抗CTLA-4は免疫学的活性を示さない。従って、このモデルは、抗CTLA-4の腫瘍溶解および前アポトーシス作用のみを測定する。7日後、0日目、2日目および4日目(矢印)に、腫瘍(直径5〜8mm)を1×108個のウイルス粒子で腫瘍内に処置した。モックマウスには、増殖培地のみを注射した。図4A:この高侵襲性モデルにおいて、Ad5/3-Δ24aCTLA4は一番すぐれた抗腫瘍活性を示した。腫瘍サイズは、平均初期サイズに対して示してある。点、平均;バー、SE;**、P<0.01(7日目におけるスチューデントt検定)。図4B:5日目に、免疫組織化学(褐色)によって、抗CTLA4(ヒトIgG、上列)またはアポトーシス(活性カスパーゼ-3、下列)の発現に関して腫瘍低温切片を染色した。40倍で画像を撮影した。図4C:7日目に、Ad5/3-Δ24aCTLA4またはAd5/3-aCTLA4で処置したマウスの腫瘍および血漿におけるヒトIgGレベルを測定した。Ad5/3-Δ24aCTLA4で処置した腫瘍において、Ad5/3-aCTLA4で処置した腫瘍と比較して81倍高い抗CTLA4 mAbが認められた(p<0.05)。さらに、Ad5/3-Δ24aCTLA4で処置された腫瘍において、同じ動物の血漿よりも43.3倍高い抗CTLA4 mAbが認められた(p<0.05)。平均血漿中濃度は392.6μg/gであったが(SE312.0)、これは、それぞれイピリムマブ(561μg/mL)およびトレメリムマブ450μg/mLで処置されたヒトにおいて耐性と報告された濃度より低い(REFS)(血漿1mLの重さはおよそ1g)。Ad5/3-Δ24aCTLA4腫瘍において、mAb濃度は16977μg/gであった。従って、この濃度は血漿中よりもずっと高い。カラム、3連アッセイの平均;バー、SE。図4D.肺癌モデルにおいて、Ad5/3-Δ24aCTLA4は、モックと比較して有意な抗腫瘍活性を示した(P<0.01)。Ad5/3-Δ24aCTLA4とAd5/3-Δ24の間の有意差は見られなかった。群は、動物規則により、その群からの最初のマウスを殺さなければならなかったときまでを示してある。点、平均;バー、SE。 図5は、Ad5/3-Δ24aCTLA4によって媒介される、癌患者の刺激された末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL-2およびIFN-γの産生増加を示す。癌患者(患者I244、患者C261、患者M158または患者X258)のPBMCをイオノマイシン、PMAおよび組換えヒトB7で刺激して、腫瘍によって誘導される免疫抑制を真似し、ウイルス感染したPC3-MM2細胞からの濾過した上清で処置した。IL-2(A)およびIFN-γ(B)はT細胞活性化のマーカーであり、FACSアレイによって測定した。組換え抗CTLA-4モノクローナル抗体を陽性対照として含めた。カラム、3つの独立した実験の平均;バー、SE.*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。 図6は、Ad5/3-Δ24aCTLA4による、健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL-2およびIFN-γの産生を示す。2名の健常ドナーからのPBMCをイオノマイシン、PMAおよび組換えヒトB7で刺激し、ウイルス感染したPC3-MM2細胞からの濾過された上清で処置した。増殖培地におけるIL-2(A)またはIFN-γ(B)レベルをFACSアレイで測定した。カラム、3つの独立した実験の平均;バー、SE.*、P<0.05;***、P<0.001。 図7は、図2、5および6に示した、実施例のために行った抗CTLA-4機能性アッセイの概略図を示す。in vivoで、樹状細胞は、T細胞表面上に、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)によってT細胞受容体(TCR)に対する抗原を提示する。免疫寛容の代わりの免疫応答のために、共刺激もまた必要である。これは、T細胞上のCD28に対するB7.1またはB7.2(DC上)の結合によって媒介される。T細胞活性化は、IL-2およびIFN-γの産生によって定量できる。図7A:無傷の免疫系の非存在下、in vitroでホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)およびイオノマイシンと共にPBMCをインキュベートすることによってT細胞活性化を刺激することができ、TCRおよびCD28シグナル伝達とは独立した活性化がもたらされる。図7B:T細胞活性化によって、負のフィードバック制御機構として、CTLA-4発現もまたアップレギュレートされる。図7C:CTLA-4は、B7に対してCD28よりも100倍高い親和性を有し、T細胞停止が生じる。図7D:抗CTLA-4抗体によるCTLA-4シグナル伝達の遮断は、抑制を遮断し、T細胞の活性化をもたらす。図7E:可溶性組換えヒトCTLA-4が添加される場合、抗CTLA-4 mAbが隔離され、B7が遊離されてCTLA-4に結合し、T細胞停止が生じる。図7F:抗CTLA4 mAbの非存在下、組換えCTLA-4が増殖培地に添加される場合、それがB7を隔離して、T細胞を活性化状態にする。 図8は、癌患者の刺激された末梢血単核細胞(PBMC)における、Ad5/3-Δ24aCTLA4による特異的抗CTLA4 mAb活性を示す。癌患者(患者I244、患者C261、患者M158または患者X258)のPBMCをイオノマイシン、PMA、組換えヒトB7および組換えヒトCTLA-4で刺激し、ウイルス感染したPC3-MM2細胞からの濾過した上清で処置した。増殖培地におけるIL-2(A)またはIFN-γ(B)レベルをFACSアレイによって測定した。カラム、3つの独立した実験の平均;バー、SE.*、P<0.05。 図9は、健常ドナーの刺激された末梢血単核細胞(PBMC)における、Ad5/3-Δ24aCTLA4による特異的抗CTLA4 mAb活性を示す。PBMCをイオノマイシン、PMA、組換えヒトB7および組換えヒトCTLA-4と共にインキュベートし、ウイルス感染したPC3-MM2細胞からの濾過した上清で処置した。増殖培地におけるIL-2(A)またはIFN-γ(B)レベルをFACSアレイで測定した。カラム、3つの独立した実験の平均。 図10は、抗CTLA4 mAbの発現の増加における複製コンピテントプラットフォームの有用性を複製欠損性ウイルスと比較して示す。PC3-MM2細胞を20000細胞/ウェルで播種し、それぞれのウイルスを用い、それぞれ1細胞当たり10VPで感染させた。感染後24時間、48時間および72時間で上清を採取し、ヒトIgGの量をELISAで分析した。複製欠損Ad5/3-aCTLA4と比較して、腫瘍溶解性ウイルスAd5/3-Δ24aCTLA4を用いて3倍の増加が観察された。カラム、5連アッセイの平均;バー、SE.***、P<0.001。 図11は、肺癌の異種植皮マウスモデルにおける、Toll様受容体9(TLR-9)を刺激するCpG分子を含む腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す。ヌードマウス(1群あたりマウス5匹、マウス1匹当たり2個の腫瘍)にA549細胞を移植し、生理食塩水(黒三角)、CpGリッチ腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad5-Δ24CpG、白丸)、腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad5-Δ24、黒四角)、腫瘍溶解性アデノウイルス+組換えCpGオリゴ(白四角)で処置した。抗腫瘍免疫の媒介にCpGリッチウイルスが最も有効であった。これは、組換えCpG分子と組み合わせて投与された腫瘍溶解性アデノウイルスよりもさらに有効であった。 図12Aは、72時間目に処置したマウスから採取した脾細胞に対して行ったMTS細胞致死アッセイの結果を示す(図11の場合と同じマウス)。示された時点でまだ生きていたA549細胞の百分率を示す。図12Bは、マウス抗CTLA4が抗ウイルス免疫に影響しないことを示唆する。図12Bは、インターフェロンγELISPOTアッセイの結果を示す。これは、マウス抗CTLA4が抗ウイルス免疫に影響しないことを示唆する。PBS、Ad5/3-Δ24、Ad5/3-Δ24およびマウスaCTLA4抗体またはマウスaCTLA4抗体単独で免疫適格C57Bl/6マウス(n=5)を3回処置した。2週間後、脾臓を採取し、UV不活化Ad5/3-Δ24または機能性ウイルスで刺激後に、インターフェロンγELISPOTでPBMCを分析した。SPU=スポット生成単位(spot producing unit)。
発明の詳細な説明
アデノウイルスベクター
他のアデノウイルスの場合と同様に、Ad5において、二十面体カプシドは、3つの主要タンパク質:ヘキソン(II)、ペントン基部(III)およびノブ付き繊維(IV)ならびに微量タンパク質:VI、VIII、IX、IIIaおよびIVa2からなる(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。タンパク質VII、小ペプチドmuおよび末端タンパク質(TP)がDNAに結合している。タンパク質Vは、タンパク質VIを介してカプシドに構造的な結合を提供している。構造タンパク質の一部のプロセシングには、ウイルスによってコードされるプロテアーゼが必要である。
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、カプシド改変、例えばアデノウイルス血清型3(Ad3)ノブを含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖(Ad5/3カプシドキメリズム)、E1のRb結合定常領域2における24bp欠失(D24)およびE3領域の欠失アデノウイルス遺伝子pl gp19k/6.7K部位の、CTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体(抗CTLA4 mAbまたはaCTLA4)をコードする核酸配列に基づく。
本発明の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに基づく。
Ad5ゲノムは、初期遺伝子(E1〜4)、中期遺伝子(IXおよびIVa2)ならびに後期遺伝子(L1〜5)を含み、左右にDNAの複製に必要な配列を含む逆向き末端反復配列(それぞれLITRおよびRITR)を有する。このゲノムはまた、パッケージングシグナル(ψ)および主要後期プロモーター(MLP)も含む。
初期遺伝子E1Aの転写により複製サイクルが開始され、次いでE1B、E2A、E2B、E3およびE4が発現される。E1タンパク質は、細胞がウイルス複製を許容するように細胞代謝を調節する。例えば、E1タンパク質はNF-κB、p53およびpRb-タンパク質を阻害する。E1AおよびE1Bは、協力してアポトーシスの阻害に機能する。E2(E2AおよびE2B)ならびにE4遺伝子産物はDNA複製を媒介し、E4産物もウイルスのRNA代謝をもたらし、宿主のタンパク質合成を妨げる。E3遺伝子産物は、宿主免疫系に対する防御、細胞溶解の促進およびウイルス子孫の放出に関与する(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
中期遺伝子IXおよびIVa2は、ウイルスカプシドの微量タンパク質をコードする。ウイルス構造成分の産生、カプシド形成および核におけるウイルス粒子の成熟をもたらす後期遺伝子L1〜5の発現はMLPによって影響される(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。
野生型アデノウイルスゲノムと比較して、本発明のアデノウイルスベクターは、E1領域、特にE1A領域のCR2からの24塩基対ならびにE3領域のgp19kおよび6.7Kを欠き、ウイルスの繊維におけるカプシド改変を含む。いくつかの実施形態において、野生型アデノウイルスゲノムと比較して、本発明のアデノウイルスベクターは、さらに、E1領域、特にE1A領域の上流にhTERTプロモーターまたはE2Fプロモーターを含み、E3領域のgp19kおよび6.7Kを欠く。いくつかの実施形態において、本発明はまた、E3領域にTLR-9結合性CpG島が富化したアデノウイルス主鎖を含む(図1)。
本発明の好ましい実施形態において、改善された/部分的領域E1およびE3に加えて、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、以下の領域:左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む。これらの領域は、任意の順序でベクター中に配置されることができるが、本発明の好ましい実施形態において、領域は5'から3'方向に順次に配置される。オープンリーディングフレーム(ORF)は、同じDNA鎖に配置されることもできるし、異なるDNA鎖に配置されることもできる。本発明の好ましい実施形態において、E1領域はウイルスパッケージングシグナルを含む。
本明細書において、語句“アデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖”は、Ad5起源の部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5およびE4からなる群から選択される1つまたはいくつかの領域を含むAd5のゲノムまたは部分的ゲノムのことを言う。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、Ad3の一部(例えば、カプシド構造の一部)を含むAd5の核酸主鎖を含む。
本明細書において、語句“部分的”領域は、対応する野生型領域と比較して任意の部分を欠く領域のことを言う。例えば“部分的E3”は、gp19k/6.7Kを欠くE3領域のことを言う。
本明細書において、語句“VA1”および“VA2”は、ウイルス結合性RNA1および2を指し、これらはアデノウイルスによって転写されるが翻訳されない。VA1およびVA2は細胞防御機構と戦う役割を有する。
本明細書において、語句“ウイルスパッケージングシグナル”は、一連のATリッチ配列からなり、カプシド形成プロセスを制御するウイルスDNAの一部のことを言う。
E1の24塩基対欠失(D24)は、Rb腫瘍抑制因子/細胞周期調節因子タンパク質への結合に関与し、従って合成期(S期)すなわちDNA合成期または複製期の誘導を可能にするCR2ドメインに行われる。pRbとE1Aの相互作用はE1Aタンパク質保存領域の8アミノ酸121〜127を必要とするが(Heise C. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139)、これらは、本発明において欠失されている。本発明のベクターは、Heise C. et al. (2000, Nature Med 6, 1134-1139)に記載のベクターのアミノ酸122〜129に対応するヌクレオチドの欠失を含む。D24を有するウイルスはG1-Sチェックポイントを乗り越える能力が低下していることが知られ、この相互作用を必要としない細胞、例えばRb-p16経路を欠損した腫瘍細胞においてのみ効率的に複製する(Heise C. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et al. 2000, Oncogene 19, 2-12)。
E3領域は、in vitroでのウイルス複製に必須ではないが、E3タンパク質は、宿主の免疫応答の制御、すなわち自然免疫応答および特異的免疫応答の両方の抑制に重要な役割を有する。E3におけるgp19k/6.7K欠失とは、アデノウイルスE3A領域からの965塩基対の欠失のことを言う。得られたアデノウイルス構築物において、gp19kおよび6.7K遺伝子の両方が欠失している(Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12: 87-94)。gp19k遺伝子産物は、小胞体における主要組織適合遺伝子複合体I(MHC1)分子に結合して隔離し、細胞傷害性Tリンパ球による感染細胞の認識を妨げることが知られている。多くの腫瘍はMHC1を欠損しているので、gp19kの欠失はウイルスの腫瘍選択性を増加させる(ウイルスは、野生型ウイルスよりも早く正常細胞から除去されるが、腫瘍細胞においては差異はない)。6.7Kタンパク質は細胞表面に発現され、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体2のダウンレギュレーションに関与する。
本発明において、CTLA-4 mAb導入遺伝子をコードするcDNAは、E3プロモーター下に、gp19k/6.7kが欠失されたE3領域に配置される。これによって、ウイルスの複製およびその後のE3プロモーターの活性化を許容する腫瘍細胞に導入遺伝子発現が限定される。E3プロモーターは、当該技術分野で公知の任意の外因性または内因性プロモーターであることができるが、好ましくは内因性プロモーターである。本発明の好ましい実施形態において、抗CTLA4 mAbをコードする核酸配列はウイルスE3プロモーターの制御下にある。
gp19k欠失は、抗CTLA4 mAb発現の視点から特に有用である。なぜなら、それによって、この能力を保持する腫瘍において腫瘍エピトープのMHC1提示を増強することができるからである。ここでは、抗CTLA4 mAbによる細胞傷害性T細胞の刺激によって、最適の利益を得ることができる。
抗CTLA4 mAbは、CTLA-4発現腫瘍細胞による細胞傷害性T細胞の活性化、調節性T細胞(T-Reg)のダウンレギュレーションならびに細胞傷害性T細胞および抗原提示細胞(例えば樹状細胞)の直接免疫抑制の抑制を含む種々の機構で作用することによって免疫応答を増強する。これら5つの導入遺伝子媒介機構に加えて、上記で説明したように、腫瘍溶解性ウイルスの複製が抗腫瘍効果を高める。
CTLA-4 mAbをコードするヌクレオチド配列は、治療される被験者に応じて任意の動物、例えばヒト、類人猿、ラット、マウス、ハムスター、イヌまたはネコに由来することができるが、好ましくは、ヒトの治療の視点から、CTLA-4 mAbは完全ヒト配列によってコードされる。CTLA-4 mAbをコードするヌクレオチド配列は、それらの効果を改善するために改変されることもできるし、未改変、すなわち野生型のものであることもできる。本発明の好ましい実施形態において、CTLA-4 mAbをコードする核酸配列は未改変である。
外因性エレメントの挿入によって、標的細胞におけるベクターの効果を増強することができる。外因性の組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は、組換えアデノウイルスベクターにおいては一般的であり、本発明においても用いることができる。いくつかの実施形態において、本発明のアデノウイルスは、好ましくはE1Aの上流に配置された、E1A領域を調節するためのhTERTまたはhTERTのバリアントまたはE2Fを含む。hTERTは、テロメラーゼを発現する細胞にそのベクターを振り向け、E2Fは、Rb/p16経路の欠損を有する細胞にそのベクターを振り向ける。この欠損は、高い発現レベルの遊離E2Fと高い活性のE2Fプロモーターをもたらす。しかしながら、ウイルス複製は、任意の他の適切なプロモーターによって標的細胞に限定されることができる。これらのプロモーターは、限定するものではないが、CEA、SLP、Cox-2、ミッドカイン、CXCR4、SCCA2およびTTSを含む。これらは、通例E1A領域を調節するために加えられるが、これに加えて、あるいはこれに変えて、E1BまたはE4などの他の遺伝子もまた制御されることができる。外因性絶縁体、すなわち非特異的エンハンサーに対するブロッキングエレメント、左ITR、天然E1Aプロモーターまたはクロマチンタンパク質もまた組換えアデノウイルスベクターに含ませることができる。場合により、本発明のベクターに必須ではない任意の追加の成分または改変を用いることができる。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルス主鎖におけるTLR-9結合性CpGリッチDNA領域を特徴とする(図1、11、12)。
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、カプシド改変を含む。大部分の成人は、最も広く使用されているアデノウイルス血清型Ad5に暴露されており、従って、その免疫系はアデノウイルス血清型Ad5に対して急速に中和抗体(NAb)を産生することができる。実際、抗Ad5NAb抗体保有は50%に達する可能性がある。アデノウイルスカプシドの複数の免疫原性タンパク質の大部分に対してNAbを誘導することができることが明らかにされたが、他方では、Ad5繊維ノブにおける小さな変化であっても、カプシド特異的NAbを回避することが可能であることも明らかにされた(Sarkioja M, et al. Gene Ther. 2008;15(12):921-9)。従って、ヒトにおけるアデノウイルスの使用に関して、ノブの改変は、遺伝子送達を維持し、増強する上で重要である。
さらにまた、Ad5は、繊維のノブ部分を介してCARと呼ばれる受容体に結合することが知られており、このノブ部分または繊維の改変によって、標的細胞への侵入を改善し、多くのまたは大部分の癌において腫瘍溶解の増強を引き起こすことができる(Ranki T. et al., Int J Cancer 2007;121:165-174)。実際、カプシド改変アデノウイルスは、癌細胞への改善された遺伝子送達のために好都合なツールである。
本明細書において、“カプシド”とは、ヘキソン、繊維およびペントン基部タンパク質を含むウイルスのタンパク質シェルのことを言う。腫瘍細胞へのウイルスの送達を改善する、当該技術分野で公知の任意のカプシド改変、すなわちヘキソン、繊維および/またはペントン基部タンパク質の改変を本発明に用いることができる。改変は、遺伝的改変および/または物理的改変であることができ、限定するものではないが、特定の細胞受容体を認識するおよび/または天然受容体結合を遮断するリガンドを組み込むための改変、アデノウイルスベクターの繊維またはノブドメインと他のアデノウイルスのノブとの置換のための改変(キメリズム)および特定の分子(例えば、線維芽細胞増殖因子-2、FGF2)のアデノウイルスへの添加のための改変を含む。従って、カプシド改変は、限定するものではないが、小ペプチドモチーフ(単数または複数)、ペプチド(単数または複数)、キメリズム(単数または複数)または変異(単数または複数)の繊維(例えば、ノブ、テールまたはシャフト部分)、ヘキソンおよび/またはペントン基部への組み込みを含む。本発明の好ましい実施形態において、カプシド改変は、Ad5/3キメリズム、インテグリン結合性(RGD)領域の挿入および/または繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である。本発明の特定の実施形態において、カプシド改変はAd5/3キメリズムである。
本明細書において、カプシドの“Ad5/3キメリズム”は、繊維のノブ部分がAd血清型3由来であり、繊維の残りの部分がAd血清型5由来であるキメリズムのことを言う。
本発明のベクターはまた、他の改変、例えばE1B領域の改変を含むことができる。
本明細書において、“RGD”とは、ペントン基部上に露出され、アデノウイルスの内在化を支援する細胞α-v-β-インテグリンと相互作用するアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフのことを言う。本発明の好ましい実施形態において、カプシド改変はRGD-4C改変である。“RGD-4C改変”とは、異種インテグリン結合性RGD-4Cモチーフの繊維ノブドメインのHIループへの挿入のことを言う。4Cとは、RGD-4Cにおいて硫黄架橋を形成する4つのシステインのことを言う。RGD-4Cペプチドを有する繊維をコードする組換えAd5ファイバー遺伝子の構築は、例えばDmitriev I.らの論文(Journal of Virology 1998;72:9706-9713)で詳細に説明されている。
本明細書において、“ヘパラン硫酸結合性ポリリジン改変”とは、繊維ノブC末端への7つのリジンからなるストレッチの付加のことを言う。
発現カセットは、ベクターを利用することにより、標的内、例えば細胞内で導入遺伝子を発現するために用いられる。本明細書において、語句“発現カセット”とは、cDNAまたは遺伝子をコードするヌクレオチド配列および、前記cDNAまたは遺伝子の発現を調節および/または制御するヌクレオチド配列を含むDNAベクターまたはその一部のことを言う。同様のまたは異なる発現カセットを1つのベクターまたはいくつかの異なるベクターに挿入することができる。本発明のAd5ベクターは、いくつかまたは1つの発現カセットを含むことができる。しかしながら、ただ1つの発現カセットが適切である。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは少なくとも1つの発現カセットを含む。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターはただ1つの発現カセットを含む。
本発明のアデノウイルスベクターを含む細胞は、任意の細胞、例えば真核細胞、細菌細胞、動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞などであることができる。細胞は、in vitro、ex vivoまたはin vivo細胞であることができる。例えば、細胞は、in vitro、ex vivoまたはin vivoでアデノウイルスベクターを製造するために用いることができるし、細胞は、アデノウイルスベクターに感染した標的、例えば腫瘍細胞であることもできる。
細胞内でCTLA-4 mAbを産生する方法において、本発明のベクターを含むビヒクルが細胞に運ばれ、CTLA-4 mAb遺伝子が発現され、タンパク質が翻訳され、パラクリン的に分泌される。“ビヒクル”とは、任意のウイルスベクター、プラスミドまたは他のツール、例えば本発明のベクターを標的細胞に送達することができる粒子であることができる。ベクターを細胞に送達するために、当該技術分野で公知の任意の慣用法を用いることができる。
本発明によって、被験者における腫瘍特異的免疫応答を増強させることができる。CTLA-4発現腫瘍細胞による細胞傷害性T細胞の活性化、調節性T細胞(T-Reg)のダウンレギュレーションならびに細胞傷害性T細胞および樹状細胞の直接免疫抑制の抑制は、CTLA-4 mAb発現の結果として生じる。
本発明の効果を経過観察または試験するために、免疫応答の種々のパラメータを測定することができる。最も一般的なマーカーは、限定するものではないが、血液または腫瘍における、腫瘍またはアデノウイルス特異的細胞傷害性T細胞の変化を含む。腫瘍またはリンパ組織において、抗原提示細胞の動員および活性化を試験することができる。さらにまた、調節性細胞サブセット(例えば制御性T細胞)の数または活性に関して試験することができる。血清サイトカインプロフィールはTh1/Th2環境を明らかにすることができ、これは免疫対免疫寛容にとって重要でもある。これらのマーカーのレベルは、抗体、プローブ、プライマーなどを用いる方法、例えばELISPOTアッセイ、四量体分析、五量体分析、細胞内サイトカイン染色、血中の抗体の分析および、血中または腫瘍における異なる細胞型の分析を含むが限定されない当該技術分野で公知の任意の慣用法に従って研究することができる。
癌
本発明の組換えAd5/3ベクターは、Rb経路、特にRb-p16経路における欠損を有する細胞内での複製能のために構築された。これらの欠損細胞は、動物およびヒトにおけるすべての腫瘍細胞を含む(Sherr C.J. 1996, Science 274, 1672-1677)。本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、Rb経路における欠損を有する細胞内で選択的に複製することができる。本明細書において、“Rb経路における欠損”とは、この経路の任意の遺伝子またはタンパク質の変異および/または後成的変化のことを言う。これらの欠損によって、腫瘍細胞はE2Fを過剰発現し、従って、効果的な複製のためにE2Fの放出のために通常必要とされるE1A CR2によるRbの結合が不必要である。
いくつかの本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが、ヒトテロメラーゼの触媒サブドメインであるヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を発現する細胞内での複製能のためにさらに構築された。hTERT遺伝子およびそのプロモーターの発現をアップレギュレートすることが見出されている細胞には、85%を超えるヒト腫瘍が含まれるが、大部分の正常な成人体細胞はテロメラーゼを欠くかまたはこの酵素を一過性に大変低レベルで発現する(Shay and Bacchetti 1997、Eur J Cancer 33:787-791)。このような、Rb-p16経路欠損/hTERTプロモーターの組み合わせは、悪性腫瘍および良性腫瘍を含む任意の癌または腫瘍を標的にすることができるばかりでなく、原発腫瘍および転移も遺伝子治療の標的とすることができる。E2F転写因子は、増殖調節に関連する鍵細胞事象に関与する様々な遺伝子セットの発現を制御する(Johnson and Schneider-Broussard 1998, Role of E2F in cell cycle control and cancer, Front Biosci. 1998 Apr 27;3:d447-8; Muller and Helin 2000, The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation, Biochim Biophys Acta. 2000 Feb 14;1470(1):M1-12)。
非周期正常細胞において、E2FはpRb/E2F複合体に隔離され、従って自由に利用できるE2Fはほとんどない。生理的増殖制御におけるその関連性は明らかであり、pRb経路はほぼすべてのヒト癌において破壊されており、大部分の癌において遊離E2Fが得られる。いくつかの異なる分子のいずれかの変異によってこの経路は破壊されることができる。しかしながら、共通する特徴は、E2Fプロモーターのその後の活性化によるE2Fレベルの上昇である。E2Fは多くの標的遺伝子のプロモーターに結合するが、その機能にとって重要なのは、自己活性化でもある。従って、p16/Rb機能不全の細胞は、高いE2Fレベルを特徴とし、それはそのプロモーターへのE2Fの結合によってさらに増幅される(Hanahan and Weinberg 2000, Cell 7;100(1):57-70; Johnson et al. 2002, Cancer Cell 1(4):325-37)。
しかしながら、アデノウイルスE1AがE2Fプロモーターによって調節される場合(例えばUS2008118470 A1の場合のように)、もしE1A/Rbを除去するD24欠失が同時に用いられなければ、自己増殖の悪循環のリスクが存在する。特に、正常細胞に存在する低レベルのE2FであってもE2Fプロモーターに結合すると考えられ、E1Aの発現をもたらし、pRb/E2F複合体からE2Fをさらに放出させ、さらなるE2Fプロモーター活性化をもたらし、さらなるE1Aをもたらすと考えられる。従って、E1AのpRbへの結合を隔離するD24欠失なしには、E2Fプロモーターは、正常細胞においても複製することができる腫瘍溶解性アデノウイルスをもたらす。これは、安全性に問題がある。
非メチル化二本鎖DNAは、自然免疫応答と適応免疫応答を架橋するエンドソーム受容体であるTLR9を刺激することができる。アデノウイルス主鎖へのCpGリッチ領域の挿入によって、抗原提示細胞におけるTLR9を刺激するアデノウイルスの能力が増強され、従ってT細胞刺激および成熟ばかりでなく、NK活性化も増強される(Nayak S, Herzog RW. Gene Ther. 2010 Mar;17(3):295-304.)。
本発明の特定の実施形態において、癌は任意の固形腫瘍である。本発明の好ましい実施形態において、癌は、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、脳腫瘍、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、および扁桃癌からなる群から選択される。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のベクターの少なくとも1つのタイプを含む。さらにまた、本組成物は、本発明の少なくとも2つ、3つまたは4つの異なるベクターを含むことができる。本発明のベクターに加えて、医薬組成物はまた、任意の他のベクター、例えば他のアデノウイルスベクター、例えばUS2010166799 A1に記載されているもの、他の治療上有効な薬剤、任意の他の薬剤、例えば薬学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、防腐薬、充填剤、安定化剤、増粘剤および/または対応する製品に通常みられる任意の成分を含むことができる。
医薬組成物は、投与に適した任意の形態、例えば固体形、半固体形または液体形であることができる。製剤は、限定するものではないが、溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、ペレットおよびカプセルからなる群から選択されることができる。
本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物はin situ癌ワクチンとして機能する。本明細書において、“in situ癌ワクチン”とは、腫瘍細胞を殺すとともに腫瘍細胞に対する免疫応答を増強させる癌ワクチンのことを言う。ウイルス複製は免疫系(Th1型細胞傷害性T細胞応答に有用)に対する強力な危険シグナルであり、APCの成熟および活性化ならびにNK細胞の動員のための強力な共刺激因子として機能する。
腫瘍免疫学の分野における重要な発見は、抗腫瘍免疫応答の誘導が、治療効果には十分ではないということである。代わりに、腫瘍媒介免疫抑制の抑制もまた重要である。腫瘍細胞溶解もまたAPCへの腫瘍断片およびエピトープの提示に役立ち、さらに炎症によって共刺激が生じる。従って、各腫瘍に関連してエピトープに依存しない(すなわち、HLA拘束性ではない)応答が生じ、従ってin situで起こる。標的細胞において腫瘍特異的免疫応答が活性化され、その後、被験者の全身レベルで、例えば遠隔転移において抗腫瘍作用が発揮されることが可能になる。
ベクターの有効量は、治療を必要とする被験者、腫瘍型、腫瘍の位置および腫瘍のステージを含む多くの因子に左右される。用量は、例えば、約108ウイルス粒子(VP)〜約1014VP、好ましくは約5x109VP〜約1013VP、より好ましくは約8x109VP〜約1012VPであることができる。本発明の特定の一実施形態において、ヒト用量は約5x1010〜5x1011VPの範囲である。
医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の従来の方法によって製造されることができ、例えば以下:バッチ、流加および潅流培養モード、カラムクロマトグラフィー精製、CsCl勾配精製ならびに低せん断細胞保持装置での潅流モードのいずれか1つを利用することにより製造されることができる。
投与
本発明のベクターまたは医薬組成物は、植物、動物およびヒトからなる群から選択される任意の真核被験者に投与されることができる。本発明の好ましい実施形態において、被験者はヒトまたは動物である。動物は、ペット、家畜および生産動物からなる群から選択されることができる。
被験者へのベクターまたは組成物の投与のために任意の慣用法を用いることができる。投与経路は、組成物の製剤または形態、疾患、腫瘍の位置、患者、共存症および他の因子によって決まる。本発明の好ましい実施形態において、投与は腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射または経口投与によって行われる。
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、ただ1回の投与だけで治療効果を発揮することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物は治療期間中に数回投与される。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物は、例えば、最初の2週間、4週間、毎月または治療期間中に1〜10回投与されることができる。本発明の一実施形態において、投与は最初の2週間に3〜7回行われ、次いで4週目に行われ、次いで毎月行われる。本発明の特定の実施形態において、投与は最初の2週間に4回行われ、次いで4週目に行われ、次いで毎月行われる。治療期間の長さは変えることができ、例えば2〜12か月間またはそれ以上続けることができる。
さらに、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの投与は、好ましくは、他の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、例えばUS2010166799 A1に記載されているものの投与と併用することができる。投与は同時または順次に行うことができる。
被験者における中和抗体を回避するために、本発明のベクターは、治療間で変えることができる。本発明の好ましい実施形態において、以前の治療のベクターと比較してカプシドの異なる繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される。本明細書において、“カプシドの繊維ノブ”とは、繊維タンパク質のノブ部分のことを言う(図1a)。あるいは、ウイルスの全カプシドが、異なる血清型のカプシドに交換されることもできる。
本発明の遺伝子治療は単独でも有効であるが、任意の他の治療、例えば旧来の治療とアデノウイルス遺伝子治療との併用は、いずれか一方単独よりもより有効であることができる。例えば、併用療法の各薬剤は腫瘍組織において独立して作用することもできるし、アデノウイルスベクターは化学療法または放射線治療に対して細胞を感受性にすることもできるし、かつ/または化学療法剤は、ウイルス複製のレベルを増強することもできるし、標的細胞の受容体状態に作用することもできる。あるいは、併用は、治療の有効性に有益なように被験者の免疫系を調節することができる。例えば、化学療法は、抑制性細胞、例えば制御性T細胞をダウンレギュレートするために使用することができる。あるいは、腫瘍溶解性ウイルス療法後に化学療法を用いて、腫瘍細胞の致死ならびにエピトープおよびウイルスのその後の放出によって免疫学的応答をブーストすることができる。化学療法はまた、腫瘍細胞を腫瘍溶解性ウイルスに感受性にすることもでき、逆もまた同様である。併用療法の薬剤は同時または順次に投与することができる。本発明の好ましい実施形態において、治療の免疫学的効果を増強するために、患者に同時シクロホスファミドが投与される。
本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への同時放射線治療の投与をさらに含む。本発明の他の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への同時化学療法の投与をさらに含む。本発明のさらに他の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への他の腫瘍溶解性アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターの投与をさらに含む。ベクターの投与は同時または順次であることができる。
本明細書において、“同時”とは、本発明の遺伝子治療の前、後または同時に投与された治療のことを言う。同時治療の期間は、数分から数週間であることができる。好ましくは、同時治療は数時間続けられる。一実施形態において、シクロホスファミドは、メトロノミック(metronomic)療法により静脈内ボーラスおよび経口の両方で投与される。
併用療法に適した薬剤は、限定するものではないが、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロマイド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。
本発明の好ましい実施形態において、本方法および使用は、被験者へのべラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬の投与をさらに含む。“カルシウムチャネル遮断薬”とは、カルシウムチャネルの伝導を破壊する薬物および天然物質のクラスのことを言い、べラパミル、ジヒドロピリジン、ガロパミル、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルスピリレンおよびフェンジリンからなる群から選択されることができる。
本発明の好ましい実施形態において、本方法および使用は、被験者へのオートファジー誘導剤の投与をさらに含む。オートファジーは、リソソーム機構による細胞自身の成分の分解を含む異化プロセスのことを言う。“オートファジー誘導剤”とは、オートファジーを誘導することができる薬剤を指し、限定するものではないが、mTORインヒビター、PI3Kインヒビター、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、テムシロリムス、シロリムスおよびテモゾロマイドからなる群から選択されることができる。本発明の特定の実施形態において、本方法は、被験者へのテモゾロマイドの投与をさらに含む。テモゾロマイドは、経口または静脈内テモゾロマイドのいずれかであることができる。オートファジー誘導剤は、免疫調節剤と併用されることができる。一実施形態において、抗CTLA4 mAbをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスは、テモゾロマイドおよびシクロホスファミドの両方と併用される。
本発明の一実施形態において、本方法または使用は、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む。“抗CD20治療”とは、CD20陽性細胞を致死させることができる薬剤のことを言い、リツキシマブおよび他の抗CD20モノクローナル抗体からなる群から選択されることができる。“中和抗体を遮断するためのアプローチ”とは、通常、感染から生じる抗ウイルス抗体の生成を抑制することができる薬剤のことを言い、種々の化学療法剤、免疫調節物質、コルチコイドおよび他の薬物からなる群から選択されることができる。これらの物質は、限定するものではないが、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレニゾロン、エトポシド、CD40L、FK506(タクロリムス)、IL-12、IFN-γ、インターロイキン10、抗CD8、抗CD4抗体、骨髄破壊および経口アデノウイルスタンパク質からなる群から選択されることができる。
本願に記載のアプローチは、中和抗体を克服することができる分子と併用することもできる。このような薬剤はリポソーム、リポプレックスおよびポリエチレングリコールを含み、これらはウイルスと混合することができる。あるいは、中和抗体は、アデノウイルスカプシドタンパク質からなる免疫血漿瀉血法カラムで除去することもできる。
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞のビリオン媒介腫瘍溶解を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、さらに、被験者における制御性T細胞をさらにダウンレギュレートすることができる物質の投与を含む。“制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質”とは、サプレッサーT細胞または制御性T細胞として同定される細胞の量を減少させる薬剤のことを言う。これらの細胞は、以下の免疫表現型マーカー:CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-およびGITR+の1つまたは多くを特徴づけることによって同定された。サプレッサーT細胞または制御性T細胞を減少させるこのような薬剤は、抗CD25抗体または化学療法剤からなる群から選択されることができる。これらの物質は、制御性T細胞数を減少させるのに有用であることができ、aCTLA4は、主にそれらの活性を抑制するのに有効である。
本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者へのシクロホスファミドの投与をさらに含む。シクロホスファミドは通常の化学療法剤であり、これはまた一部の自己免疫疾患にも用いられる。本発明において、シクロホスファミドはウイルス複製を増強するために、ならびに腫瘍に対する免疫応答の増強のためのNK細胞および細胞傷害性T細胞のaCTLA4誘導刺激の効果を増強するために用いることができる。シクロホスファミドは、静脈内ボーラスもしくは低用量経口メトロノミック投与またはそれらの併用で投与されることができる。
本発明において、CTLA-4遮断mAbが活性化細胞傷害性T細胞(本療法に有用であることができる)を殺さないことを確実にするために、ヒトIgG2サブタイプが選択された。IgG2は最小限の補体活性化およびAb依存細胞媒介細胞傷害を誘導し(Bruggemann M. et al. J Exp Med 1987;166:1351-1361)、また、ヒト用の視点から、サイトカイン放出症候群の可能性を減少させる(Ribas A et al., Oncologist 2007;12:873-83)。
本発明の任意の方法または使用は、in vivo、ex vivoまたはin vitroの方法または使用のいずれかであることができる。
本発明において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、CTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体で武装されている。本アプローチにおいて、腫瘍細胞は、ウイルス複製ならびに抗CTLA4 mAb抗腫瘍免疫活性化および直接アポトーシス促進性腫瘍細胞致死によって死滅される。さらなる利益は、ウイルス複製による腫瘍抗原放出から生じることができ、これにより、腫瘍標的に対するより具体的な免疫応答を潜在的に可能にすることによって抗CTLA-4 mAb療法の有効性を改善することができる(Hodi FS et al., N Engl J Med 2010; 363;8:711-23; Mokyr MB et al., Cancer Res 1998;58:5301-4; Wolchok JD and Saenger Y., Oncologist 2008;13 Suppl 4:2-9)。同様に、本治療の副作用は重複せず、これにより毒性を増強させないで有効性を増強させることを容易にすることができる。腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌細胞株における導入遺伝子として機能性抗CTLA4 mAbを効果的に発現することができることが示されている(図2)。同様に、腫瘍溶解性アデノウイルス複製と抗CTLA4 mAbとを併用し、細胞致死の増強を得ることが可能であることが見出された(図3〜4)。このことは、関心事であった。なぜなら、mAbによるCTLA-4遮断は、潜在的にウイルス複製を阻害することができるIFN-γおよび主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子の産生増加をもたらすからである(McCart JA et al., Gene Ther 2000;7:1217-23; Nakamura H et al., Cancer Res 2001;61:5447-52)。ウイルスによる腫瘍溶解と抗CTLA4 mAb発現との併用は、いずれかの単独の治療よりも高い抗腫瘍活性をin vivoでもたらした(図4)。T-Regを減少させるための低用量メトロノミックシクロホスファミドと組み合わせた、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)を発現する腫瘍溶解性ウイルスを用いた癌患者の治療に関する以前の報告がある(Cerullo V et al., Cancer Res;2010; 70:4297-309; Koski A et al., Mol Ther. 2010 Jul 27. [Epub ahead of print]. PMID: 20664527)。加えて、GM-CSF分泌腫瘍細胞免疫療法によるマウス抗CTLA-4の細胞媒介送達は、強力な抗腫瘍応答を活性化し、全身自己免疫の根拠の減少した長期の生存期間をもたらした(Simmons AD et al., Cancer Immunol Immunother 2008;57:1263-70)。従って、本アプローチの有効性は、従来の癌治療、例えば放射線化学療法、ワクチン、例えばGM-CSFおよび/または例えばシクロホスファミドによるT-Regの減少とのマルチモードアプローチにおいてさらに改善されることができる。
完全長mAbが腫瘍溶解性アデノウイルスから産生されることができることが示されるのは、今回が初めてである。同様に、これは、腫瘍標的化複製コンピテントプラットフォームによって発現された最初の完全ヒト抗CTLA4 mAbである。マウスにおいて行われた実験において、副作用は観察されなかった。癌患者のPBMCからのデータは、進行癌患者の治療のための腫瘍溶解性ウイルスベクターとしてのAd5/3-Δ24aCTLA4の臨床翻訳のための理論的根拠を提供している。すべてではないにしても、多くの固形腫瘍においてp16-Rb経路が欠損しているため(Sherr CJ., Science 1996;274:1672-724)、本発明のAd5/3-Δ24aCTLA4および他のΔ24欠損アデノウイルスは、利用可能な治療に難治性の多くの大部分の癌の治療に適している。Δ24に加えてhTERTまたはE2Fプロモーターも含む本発明のこれらの実施形態は、実質的にすべての癌に対する本発明の有用性を高めている。同様に、これらのプロモーターの添加によって、高い治療用量、副作用の減少および全身有用性の増強を可能にすることができる。重要なことに、ウイルスゲノムへのCpG部分の添加によって、抗腫瘍免疫応答を増強することができる。
本発明を以下の実施例で説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
動物
すべての動物プロトコルは、Experimental Animal Committee of the University of Helsinki and the Provincial Government of Southern Finland に審査され承認された。4〜5週齢のNMRIヌードマウスはTaconic社(Ejby、デンマーク)から入手し、試験の前に少なくとも1週間隔離した。マウスの健康状態をしばしばモニターし、何らかの痛みまたは苦痛の徴候が明らかになり次第それらを殺した。
細胞培養
ヒト頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)低継代培養腫瘍細胞培養物UT-SCC8(声門上喉頭)(27)を、10%FCS(PromoCell社、ハイデルベルク、ドイツ)、1%非必須アミノ酸(Gibco、Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)2mmol/Lグルタミン、100単位/mLペニシリンおよび100単位/mLストレプトマイシン(すべてSigma社、セントルイス、ミズーリ州)を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。UT-SCC細胞は、低継代培養で、一般的には継代培養15〜30で用いた。
ヒト形質転換胎児腎臓細胞株293、ヒト肺癌細胞株A549、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3-ip1およびヒト前立腺癌細胞株PC-3MM2;ならびにJurkat(クローンE6-1)ヒトTリンパ芽球性白血病細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC、マナッサス、バージニア州、米国)から入手した。すべての細胞株は、推奨条件で維持した。
ヒト試料
健常者および、従来の治療には難治性の進行性転移腫瘍患者の末梢血単核細胞(PBMC)をインフォームド・コンセントを得て入手した。
統計解析
両側スチューデントt検定を用い、0.05未満のP値を有意とみなした。
アデノウイルスの構築
IgG2型抗CTLA4 mAbをコードするcDNA配列を含むキメラアデノウイルスを作成した(図1)。アデノウイルスE3Aの6.7K/gp19K欠失部位に抗CTLA4 mAbのコード配列を導入して、複製コンピテントアデノウイルスAd5/3-Δ24aCTLA4(配列番号1)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4(配列番号2)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG(配列番号3)、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4(配列番号4)およびAd5/3-E2F-Δ24aCTLA4-CpG(配列番号5)を作成し、あるいはCMVプロモーターによって駆動される欠失E1に導入して、複製欠損性アデノウイルスAd5/3-aCTLA4(配列番号6)を作成した。
一般的なアデノウイルス調製技術を用いて腫瘍溶解性アデノウイルスを作成し増幅した(Kanerva A, et al., Mol Ther 2002;5:695-704; Bauerschmitz GJ, et al., Mol Ther 2006;14:164-74; Kanerva A and Hemminki A., Int J Cancer 2004;110:475-80; Volk AL, et al., Cancer Biol Ther 2003;2:511-5)。簡潔に言えば、導入遺伝子および他の部分(プロモーター、CpG、ポリA)を含むE1またはE3シャトルベクターのいずれかを最初に構築し、ヒト組換え酵素を特徴とする細菌細胞内でレスキュープラスミドと組み換えた。対照ウイルスAd5Luc1(Kanerva A et al., Clin Cancer Res 2002;8:275-80)およびAd5/3-Δ24(Kanerva A et al., Mol Ther 2003;8:449-58)を含むこれらのウイルスの主な特徴を図1に示す。
Ad5/3-Δ24aCTLA4を作成するために、プラスミドpTHSN-aCTLA4を作成した。pTHSN-aCTLA4は、6.7K/gp19Kが欠失したアデノウイルスゲノムのE3領域にIgG2型抗CTLA4 mAbのH鎖およびL鎖を含む。H鎖およびL鎖の等モル濃度は、両鎖間の内部リボソーム侵入部位(IRES)によって達成される。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)BJ5183細胞(Qbiogene社、アーヴィン、カリフォルニア州、米国)内で、FspI線状化pTHSN-aCTLA4と、血清型3ノブおよびE1Aにおける24bp欠失を含むレスキュープラスミドであるSrfI線状化pAdEasy-1.5/3-Δ24(Kanerva A et al., Clin Cancer Res 2002;8:275-80)との相同組換えによってpAdEasy-1.5/3-Δ24-aCTLA4を作成した。Ad5/3-Δ24aCTLA4のゲノムをPacI消化によって放出させ、次いでA549細胞にトランスフェクトした。このウイルスをA549細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的TCID50(50%組織培養感染量)アッセイを行い、感染性粒子力価を測定した。
Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4およびAd5/3-E2F-Δ24aCTLA4-CpGを作成するために、最初に抗CTLA増幅産物をpTHSNまたはpTHSN-CpGにサブクローニングし、続いて、pAd5/3-hTERT-E1AまたはpAd5/3-E2F-E1Aと組換えた(Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008;68:5533-9. Hakkarainen T, et al. Clin Cancer Res. 2009;15(17):5396-403)。得られたプラスミドをPacIで線状化し、増幅およびレスキューのためにA549細胞にトランスフェクトした。このウイルスをA549細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的TCID50(50%組織培養感染量)アッセイを行い、感染性粒子力価を測定した。
クローニングのすべての段階をPCRおよび複数の制限酵素処理で確認した。シャトルプラスミドpTHSN-aCTLA4を配列決定した。野生型E1の非存在をPCRにより確認した。最終ウイルスにおいて、配列決定およびPCRを用いてE1領域、導入遺伝子および繊維をチェックした。以前記載したように、野生型組換えのリスクを避けるために、トランスフェクションを含むウイルス産生のすべての段階をA549細胞で行った(Kanerva A et al. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Bauerschmitz GJ et al. 2006, Mol Ther 14, 164-74)。aCTLA4は、感染後約8時間で開始される複製関連導入遺伝子発現を引き起こすE3プロモーター(具体的には、内因性ウイルスE3A遺伝子発現調節因子)の制御下にある。E3は、6.7K/gp19Kの欠失を除けば無傷である。
非複製型E1欠失対照ウイルスAd5/3-aCTLA4を構築するために、抗CTLA4 mAb cDNAの両鎖をpShuttle-CMVに連結した。全アデノウイルスゲノムを含むpAdEasy-1.5/3プラスミド(Krasnykh VN, et al., J Virol 1996;70:6839-46)とPmeI線状化pShuttle-CMV-aCTLA4との間の相同組換えを行って、pAdEasy-1.5/3-aCTLA4を構築した。Ad5/3-aCTLA4のゲノムをPacIによって放出させ、293細胞にトランスフェクトした。このウイルスを293細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的プラークアッセイを行い、感染性粒子を測定した。
構築されたアデノウイルスのin vitroでの発現および機能性
構築されたアデノウイルスが抗CTLA4 mAbを発現することを確認するために、ウェスタンブロット分析を用いた。構築されたAd5/3-Δ24aCTLA4またはAd5/3-aCTLA4を用い、1細胞当たり10ウイルス粒子(VP)でA549またはPC3-MM2腫瘍細胞に感染させた。48時間後、ウイルス感染細胞の上清を0.02μmフィルター(Anotop、Whatman社、イングランド)で濾過し、15μLを還元または天然条件下で7.5%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。この膜をヤギ抗ヒトIgG(H鎖およびL鎖)(AbD serotec社、MorphoSys社、ドイツ)と共にインキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された二次抗体(Dako社、デンマーク)と共にインキュベートした。増強化学発光(GE Healthcare社、アマシャム、英国)によってシグナルの検出を行った。
ウェスタンブロットにおいて、感染後48時間の上清において、Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4は、天然条件では、予想されたおおよそ150kDaの抗CTLA4 mAbを発現し、変性条件では、おおよそ50kDaのH鎖およびおおよそ25kDaのL鎖を発現した(図2A)。
腫瘍溶解性ウイルスAd5/3-Δ24aCTLA4または複製欠損Ad5/3-aCTLA4による抗CTLA4 mAb発現を比較するために、PC3-MM2細胞を20000細胞/ウェルで播種し、それぞれのウイルスを用いて1細胞当たり10VPで感染させた。感染後24時間、48時間および72時間で上清を採取し、ヒトIgGの量をELISAで分析した(図10)。
Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4による機能性抗CTLA4 mAbの発現の確認のために、刺激されたJurkat細胞のIL-2産生増加を前述のように試験した(Lee KM et al., Science 1998;282:2263-68)。
Jurkat細胞(クローン6.1)を、0.3μg/mlのイオノマイシン(Sigma-Aldrich社)、0.03μg/mlのホルボールミリスチルアセタート(PMA)(Sigma-Aldrich社)および1μg/mlの組換えヒトB7 Fcキメラ(R&D Systems社)で刺激し、0.02μm濾過した(Anotop、Whatman社、イングランド)ウイルス感染したPC3-MM2細胞の上清で処置した。Jurkat細胞の刺激後48時間で、製造業者の使用説明書に従って、BD Cytometric Bead Arrat Human Soluble Protein Flex Set(Becton Dickinson社)によって増殖培地中のインターロイキン-2(IL-2)レベルを分析した。1細胞当たり10ウイルス粒子(VP)を用い、48時間後に上清を採取した。マウス抗ヒトCTLA-4(=CD152)mAb(BD Pharmingen(登録商標)、ヨーロッパ)を陽性対照として用いた。FCAP Array v.1.0.2(Soft Flow社)ソフトウェアを用いて分析した。図7に機能性アッセイの概略図を示す。
抗CTLA4 mAbは、細胞表面のCTLA-4に結合して、組換えB7(rB7)との免疫抑制相互作用を遮断する。この分析は、それぞれの同質遺伝子対照Ad5/3-Δ24またはAd5/3Luc1による感染細胞と比較して、Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4に感染した細胞の上清にmAb抗CTLA4活性が観察されたことを示している(図2B)。陽性対照として組換え抗CTLA4 mAbを用いたが、これはJurkat細胞から採取した上清よりも強力であった。
ウイルスによって発現された抗CTLA4 mAbのCTLA-4を介したシグナル伝達を遮断する能力をさらに確認するために、機能喪失アッセイを行った。機能喪失アッセイにおいて、Jurkat細胞を上記のように活性化したが、ただし、イオノマイシン、PMAおよび組換えB7に0.1μg/mlの組換えヒトCTLA-4/Fcキメラ(R&D Systems社)(rCTLA-4)を加えた。rCTLA-4は増殖培地中の抗CTLA4 mAbに結合し、細胞表面にCTLA-4を放出させてrB7と相互作用し、T細胞活性化を抑制するが、これはIL-2産生として観察される。それぞれの同質遺伝子である武装していない対照Ad5/3-Δ24またはAd5/3Luc1と比較して、Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4に感染した細胞からの上清では、抗CTLA4 mAb機能の喪失が観察された(図2C)。さらにまた、Ad5/3-Δ24aCTLA4腫瘍感染細胞の上清で、陽性対照よりもさらに高い、最も高い機能喪失が観察された。総合すれば、Ad5/3-Δ24aCTLA4での癌細胞の感染は、ヒトCTLA-4に対する機能性完全ヒトmAbの高発現をもたらし、これは、IL-2によって測定されるT細胞活性の低下を引き起こすことをこのデータは示している。
アデノウイルスE1およびE3領域における欠失、すなわち、それぞれ、E1のRb結合定常領域2における24bp欠失(D24)およびE3における6.7K/gp19K欠失を考慮に入れる場合、抗CTLA4発現カセットの挿入は、アデノウイルスパッケージングおよび機能性との適合性の提案された105%閾値をほんの少し下回ったゲノムサイズの増加と等しい(Kennedy & Parks, Mol Ther 2009;17:1664-6)。ゲノムサイズの増加または抗CTLA4の発現がウイルス複製に影響するかどうかを試験するために、A549細胞をAd5/3-Δ24aCTLA4、Ad5/3-Δ24またはPBSに感染させ、上清および細胞から種々の時点でqPCRによってウイルスゲノムを測定した(順方向プライマー、5′-TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3′、配列番号7;逆方向プライマー、5′-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3′;配列番号8;およびプローブ5′FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3′MGBNFQ、配列番号9、配列番号10、配列番号11)(Cerullo et al., 2010; Cancer Res;70:4297-309)。ウイルス群間で有意差は見られず、無傷の複製が示唆された。
腫瘍細胞株および低継代培養腫瘍外植片のCTLA-4発現
腫瘍細胞株のほぼ90%がCTLA-4を発現し、抗CTLA-4 mAbは直接抗腫瘍活性を有することができる(13)ということが報告されているため、用いたHNSCC低継代培養腫瘍外植片を含む腫瘍細胞株においてもそれが本当であるかどうかを調べた。
表面CTLA-4を分析するために、低継代培養腫瘍細胞培養物UT-SCC8または腫瘍細胞株A549、SKOV3-ip1およびPC3-MM2において、間接免疫蛍光法を行った。簡潔に言えば、一次抗体としてマウス抗ヒトCTLA-4 mAb(BD Pharmingen(登録商標)、ヨーロッパ)を用いて細胞ペレットを4℃で30分間インキュベートし、次いで二次抗体としてAlexa Fluor(登録商標)488ロバ抗マウスIgG(Invitrogen社)を用いて4℃でさらに30分間インキュベートした。LSRフローサイトメーター(BD Pharmingen(登録商標)、ヨーロッパ)を用いて蛍光強度を測定した。少なくとも40000細胞/試料が計数された。分析には、Clontech Discovery Labwareイムノサイトメトリーシステム(BD Pharmingen(登録商標)、ヨーロッパ)およびFlowJo7.6.1ソフトウェアを用いた。
A549、SKOV3-ip1およびPC3-MM2腫瘍細胞株は、それぞれ99.5%、96.6%および96.6%のCTLA-4発現を示したが、UT-SCC8低継代培養腫瘍外植片は90.3%のCTLA-4発現を示した(図2D)。
構築されたアデノウイルスのin vitroおよびin vivoでの腫瘍溶解能の評価
種々の腫瘍細胞株およびHNSCC低継代培養腫瘍細胞培養物に対するAd5/3-Δ24aCTLA4の腫瘍溶解性有効性(または細胞致死)を評価した。
HNSCC低継代培養腫瘍細胞培養物または腫瘍細胞株PC3-MM2、SKOV3-ip1もしくはA549を96ウェルプレートに1.5×104または1.0×104細胞/ウェルで播種した。翌日、2%FCSを含むDMEMにウイルスを種々の濃度(1、10、100、1000VP/細胞)で希釈し、細胞を37℃で1時間感染させ、洗浄し、5%FCSを含むDMEM中でインキュベートした。製造業者のプロトコル(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega)に従って細胞生存率を測定した。結果を図3に示す。
Ad5/3-Δ24aCTLA4は、すべての細胞株において、陽性対照ウイルスAd5/3-Δ24と同様な腫瘍溶解能を示した。また、腫瘍細胞はCTLA4を発現するため、複製欠損性Ad5/3-aCTLA4は抗腫瘍活性を示した。
Ad5/3-Δ24aCTLA4の腫瘍溶解効果は、それぞれ、PC3-MM2、SKOV3-ip1、A549およびUT-SCC8に対して、97.6%、78.2%、69.1%および57.3%の細胞致死を示した(図3)。Ad5/3-Δ24aCTLA4と、E3に導入遺伝子を含まないそのカウンターパート(Ad5/3-Δ24)は、分析した腫瘍細胞株のいずれにおいても、細胞傷害に統計的有意差を示さなかった。
非複製型Ad5/3-aCTLA4では、低ウイルス用量では細胞傷害は観察されなかった(図3)。しかしながら、最も高いAd5/3-aCTLA4用量では細胞傷害が観察され、PC3-MM2、SKOV3-ip1、A549およびUT-SCC8に対しては、それぞれ最大細胞致死率は96.2%、74.3%、49.1%および56.15%であった(図3)。この結果は、癌細胞の表面に発現されたCTLAとの抗CTLA-4の直接結合が細胞死を引き起こすという以前の証明と一致する(Contardi E et al., Int J Cancer 2005;117:538-50)。
Ad5/3-Δ24aCTLA4の抗腫瘍活性の評価
ヒト前立腺癌異種植皮を有する免疫不全ヌードマウスにおいて、抗CTLA-4モノクローナル抗体を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスでこのマウスを処置することによって、このアデノウイルスの腫瘍増殖抑制およびアポトーシスを評価した。
5〜6週齢雌NMRI/ヌードマウス(Taconic社、Ejby、デンマーク)の脇腹に5x106個のPC3-MM2細胞を注射することによって、ヒト前立腺外植片異種植皮を定着させた。7日後、1x108VPを1日おきに3回(0日目、2日目および4日目)、50μLの容量で腫瘍(n=8/群、直径5〜8mm)に注射し、対照腫瘍にはDMEMのみを注射した。腫瘍体積を算出するために、式(長さx幅2x0.5)を用いた。
5日目に、抗CTLA4(ヒトIgG)またはアポトーシス(活性カスパーゼ-3)の発現に関して、免疫組織化学によって腫瘍低温切片を染色した。Tissue Tek OCT(Sakura社、トランス、カリフォルニア州、米国)に封入した凍結腫瘍の4〜5μmの低温切片を調製し、アセトン中20℃で10分間固定した。一次抗体として、ヤギ抗ヒトIgG(H鎖およびL鎖)(AbD serotec社、MorphoSys社)および活性カスパーゼ-3に対するウサギモノクローナル抗体、1:200希釈、室温、1時間(BD Pharmingen(登録商標)、AB559565)を用いた。さらにまた、製造業者の使用説明書に従って、LSAB2System-HRPキット(K0673、DakoCytomation社、カーピンテリア、カリフォルニア州、米国)を用いて切片をインキュベートした。3,3’-ジアミノベンジジン(DAB、Sigma社、セントルイス、ミズーリ州、米国)を用いて結合抗体を可視化した。最後に、ヘマトキシリンで切片を対比染色し、エタノールで脱水し、キシレンで清澄化し、カナダバルサムでシールした。Olympus DP50カラーカメラを備えたLeica DM LB顕微鏡を用いて、40倍で典型的画像を記録した。
7日目に、Ad5/3-Δ24aCTLA4またはAd5/3-aCTLA4で処置したマウスの腫瘍および血漿におけるヒトIgGレベルを測定した(図4C)。Ad5/3-Δ24aCTLA4で処置した腫瘍において、Ad5/3-aCTLA4で処置した腫瘍と比較して、81倍高い抗CTLA4 mAbが認められた(p<0.05)。さらに、Ad5/3-Δ24aCTLA4で処置した腫瘍において、同じ動物の血漿と比較して、43.3倍高い抗CTLA4 mAbが認められた(p<0.05)。平均血漿中濃度は392.6μg/gであったが(SE312.0)、これは、それぞれイピリムマブ(561μg/mL)およびトレメリムマブ450μg/mLで処置されたヒトにおいて耐性と報告された濃度より低い(Weber JS, et al. J Clin Oncol 2008;26:5950-6. Ribas A, et al. J Clin Oncol 2005;23:8968-77. Tarhini AA、Iqbal F, Oncol Targets Ther 2010;3:15-25.)(血漿1mLの重さはおよそ1g)。Ad5/3-Δ24aCTLA4腫瘍において、mAb濃度は16977μg/gであった。従って、この濃度は血漿中よりもずっと高い。
ヒト抗CTLA-4 mAbはマウスCTLA-4に結合せず、異種植皮実験は、T細胞欠損ヌードマウスを必要とする。従って、このモデルは、腫瘍溶解性および前アポトーシス作用のみをアッセイする。それにもかかわらず、この侵襲性皮下前立腺癌異種植皮モデルにおいて、Ad5/3-Δ24aCTLA4は、モックと比較して有意な抗腫瘍効果を示した(p<0.01;図4A)。他の処置群は、モックと比較して有意な効果を示さなかった。Ad5/3-Δ24aCTLA4とAd5/3-Δ24の間に統計的有意差は認められなかったが(p=0.43)、抗CTLA4 mAb発現がこのウイルスの抗腫瘍有効性を低下させないというin vitroデータが追認された。
CTLA-4遮断Abは、アポトーシスを引き起こすことによって腫瘍細胞の直接致死を誘導することができることを考慮して、抗腫瘍効果が、ヒト抗CTLA4 mAb産生およびそれに続くアポトーシスの増加と関連するかどうかを評価した。Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4で処置した腫瘍において、ヒトmAb染色が観察されたが、Ad5/3-Δ24またはAd5/3-Luc1では観察されなかった(図4B)。ヒトmAbの発現は、アポトーシスの増加と関連していると推定される(図4B)。従って、Ad5/3-Δ24aCTLA4で処置した腫瘍は抗CTLA-4 mAbを発現し、アポトーシスの増加をもたらす。
Ad5/3-Δ24aCTLA4の腫瘍溶解性および前アポトーシス作用をさらに評価するために、ヒト肺癌異種植皮モデルを用いた。このモデルは、導入遺伝子の免疫調節機能を考慮に入れない。5〜6週齢雌NMRIヌードマウスの脇腹に5x106個のA549細胞を注射してヒト肺癌腫瘍を定着させた。Ad5/3-Δ24aCTLA4、組換え抗CTLA4タンパク質、非複製型対照ウイルスAd5/3lucIまたは腫瘍溶解性Ad5/3-Δ24で腫瘍を処置して、PC3-MM2腫瘍に関して前述のように測定した。腫瘍が平均直径15mmに達したとき、マウスを殺した。Ad5/3-Δ24aCTLA4とAd5/3-Δ24との間に統計的有意差は認められなかったが、これは、本発明のウイルスの複製依存性腫瘍溶解能が親ウイルスと類似していることを示唆している(図4D)。
抗CTLA4 mAbを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによる癌患者のT細胞の免疫調節
前臨床所見をヒトに拡張するために、化学療法に難治性な進行した固形腫瘍を有する患者のPBMCを試験した。癌患者のPBMC(類軟骨を患っている黒色腫患者I244、結腸癌を患っている患者C261、中皮腫を患っている患者M158または子宮頚を患っている癌患者X258)を、腫瘍によって誘導される免疫抑制を真似するために、0.3μg/mlのイオノマイシン(Sigma-Aldrich社)、0.03μg/mlのホルボールミリスチルアセタート(PMA)(Sigma-Aldrich社)および1μg/mlの組換えヒトB7 Fcキメラ(R&D Systems社)で刺激した。刺激後、0.02μm濾過した(Anotop、Whatman社、イングランド)Ad5/3-Δ24aCTLA4、Ad5/3-Δ24、Ad5/3-aCTLA4またはAd5/3-Luc1で感染したPC3-MM2細胞の上清でPBMCを処置した。
機能喪失アッセイにおいて、イオノマイシン、PMAおよび組換えB7に0.1μg/mlの組換えヒトCTLA-4/Fcキメラ(R&D Systems社)を加えた。PBMCの刺激後24時間で、製造業者の使用説明書に従って、BD Cytometric Bead Arrat Human Soluble Protein Flex Set(Becton Dickinson社)によって増殖培地中のインターロイキン-2(IL-2)またはインターフェロン-γ(IFN-γ)レベルを分析した。1細胞当たり10ウイルス粒子(VP)を用い、48時間後に上清を採取した。マウス抗ヒトCTLA-4(=CD152)mAb(BD Pharmingen(登録商標)、ヨーロッパ)を陽性対照として用いた。FCAP Array v.1.0.2(Soft Flow社)ソフトウェアを用いて分析した。
全4名の患者試料において、IL-2およびインターフェロンγによって測定されるように、抗CTLA4 mAbを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスからの上清は、T細胞活性を増強させることができた(図5)。この実験の理論的根拠は図7に示されている。興味深いことに、不死化したT細胞株であるJurkat細胞を用いた場合、組換えmAbはより有効であったが、患者試料を用いた場合、ウイルス上清は多くの場合より強力であった。同様なデータは機能喪失アッセイにおいて得られたが(図8)、理論的根拠は図7E〜Fに示す。
健常者からのPBMCに対する抗CTLA4 mAbの効果
実施例6に記載した実験を、健常者のPBMCを用いて同様に行った。癌患者と対照的に、Ad5/3-Δ24aCTLA4感染細胞からの上清はIL-2またはインターフェロンγの産生を増加させなかった。機能喪失アッセイにおいて、いずれも有意な変化が見られなかった。しかしながら、陽性対照組換えmAbがいずれの場合も有効であったため(図6におけるIL-2およびインターフェロンγの増加ならびに図8におけるそれらの減少(図6のドナー1およびドナー2において、それぞれ、IL-2の増加p<0.05およびp=0.206、INF-γの増加p<0.05およびp=0.120;図8のドナー1およびドナー2において、それぞれ、IL-2の減少p<0.001およびp<0.05;INF-γの減少p<0.001およびp<0.05;rB7、rCTLA4、イオノマイシンおよびPMAのみで処置した細胞と比較して)、これは用量効果であると想定された。このことは、機能喪失アッセイにおけるAd5/3-Δ24aCTLA4に関してみられる有意でない傾向(図8)および、Ad5/3-aCTLA4感染細胞からの上清によるいくつかのケースの有意な効果(図6および8)によって支持される。それにもかかわらず、癌患者において抗CTLA-4 mAbの効果がより著しかったが、これは、存在する進行癌によって、癌患者が高い程度の免疫抑制プロセスを継続しているせいであると推定された。
抗CTLA4 mAb発現の増加における複製コンピテントプラットフォームの有用性
抗CTLA4 mAbの発現の増加における複製コンピテントプラットフォームの有用性を複製欠損性ウイルスと比較して分析した。PC3-MM2細胞を20000細胞/ウェルで播種し、Ad5/3-Δ24aCTLA4およびAd5/3-aCTLA4を用い、それぞれ1細胞当たり10VPで感染させた。感染後24時間、48時間および72時間で上清を採取し、ヒトIgGの量をELISAで分析した。複製欠損Ad5/3-aCTLA4と比較して、腫瘍溶解性ウイルスAd5/3-Δ24aCTLA4を用いて3倍の増加が観察された。Ad5/3-aCTLA4(図10)。
腫瘍溶解性プラットフォームの有用性の1つは、高いレベルの導入遺伝子発現が得られることである。初期遺伝子の発現後、ウイルスゲノムは増幅し、10000コピーまでものウイルスDNAが製造される。これは、導入遺伝子が製造できるコピーよりもずっと多くのコピーをもたらす(図10)。
増強した免疫応答を有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクター
免疫応答をさらに増強するために、肺癌の異種植皮マウスモデルを用いて、ウイルス主鎖におけるToll様受容体9(TLR-9)を刺激するCpG分子を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルス(図1)を研究した。NMRIヌードマウス(1群あたりマウス5匹、マウス1匹当たり2個の腫瘍)にA549細胞を移植し、1x108個のVPのCpGリッチ腫瘍溶解性アデノウイルスAd5-Δ24CpG、Δ24欠失を含む腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス+CpGを含む組換えオリゴ(ODN 2395、InvivoGen社、米国)で処置した。前に述べたように、2日間隔で12日間腫瘍増殖を測定した。抗腫瘍免疫の媒介にCpGリッチウイルスAd5-Δ24CpGが最も有効であった(図11).
同じマウスから採取した脾細胞をUV不活化ウイルスで刺激し、A549細胞と1:1および10:1の比率で共培養した。72時間目にMTS細胞致死アッセイを行った。示された時点でまだ生きていたA549細胞の百分率を示す。図12Aに示しデータは、CpG改変ウイルスが抗原提示細胞を刺激することができ、これによって増強した抗腫瘍免疫応答が得られたことを示している。この応答は大変強力であったため、T細胞を欠くヌードマウスにおいてさえ、それを観察することができた。従って、免疫適格動物およびヒトにおいて、さらに良いデータが予想される。TLR-9刺激(これは抗腫瘍免疫を誘導する)の有用性は、aCTLA-4による抑制シグナルの同時ダウンレギュレーションによって最も顕著になると考えられる。
ウイルスによって産生される抗CTLA4の発現は、抗ウイルス免疫を増強することができ、それによってウイルス療法を妨げる恐れがある。このために、免疫適格マウスの脾細胞に対するマウス抗CTLA4とアデノウイルスの併用効果を評価した。PBS、Ad5/3-Δ24単独、Ad5/3-Δ24とマウスaCTLA4抗体の併用またはマウスaCTLA4抗体単独で免疫適格C57Bl/6マウス(n=5)を3回処置した(図12B)。2週間後、脾臓を採取し、インターフェロンγELISPOT(ヒトIFN-γ用ELISPOTPRO、3420-2APT-10、MABTECH AB社、スウェーデン)で脾細胞を分析した。UV不活化Ad5/3キメラウイルスまたはAd5ペプチド混合物によって刺激を行った。群間で有意差は認められなかった。これは、ウイルスによって引き起こされる免疫にマウス抗CTLA4抗体が影響しないことを示唆する。
ヒト癌患者における抗CTLA-4モノクローナル抗体を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの安全性と有効性
I.患者
進行性難治性固形腫瘍を有する患者をFinnish Medicines Association(FIMEA)に認可されたAdvanced Therapy Access Program(ATAP)に登録した。
標準治療に難治性な進行した固形腫瘍を有する癌患者の中から患者を選択する。選択基準は、従来の治療には難治性の固形腫瘍、WHOパフォーマンススコア3以下および主要臓器機能の不全であった。除外基準は、臓器移植片、HIV、重篤な心血管疾患、代謝疾患、肺疾患または腫瘍溶解性ウイルス処置を妨げる他の症状、所見もしくは疾患であった。医薬品の臨床試験の実施に関する基準(Good Clinical Practice)およびヘルシンキ宣言(Declaration of Helsinki)に基づいて文書でのインフォームド・コンセントを得、処置を行った。処置は、必要に応じて、腫瘍内、静脈内または腹腔内に行う。
II.aCTLA-4 mAbをコードするアデノウイルスベクターでの処置
臨床用の腫瘍溶解性アデノウイルスを製造し、患者の処置を開始する。
処置は腫瘍内注射で行う。処置の総数は、3週間ごとに3回である。ウイルス用量は、他の腫瘍溶解性ウイルスを用いた本発明者の以前のデータに基づいて選択する。しかしながら、必要に応じて、種々の投与スキームを用いることができる。例えば、連続処置の最初のラウンドに関しては、患者には、用量の一部、例えば用量の5分の4または5分の2を腫瘍内または腹腔内に投与し、用量の残りを静脈内に投与する。
投与時に、適切な条件下で、滅菌生理食塩水にウイルスを希釈する。ウイルス投与後、すべての患者をその病院において終夜モニターし、続いてその後4週間を外来患者としてモニターする。各来院時にフィジカルアセスメントおよび病歴を記録し、臨床的に意味のある検査値を経過観察した。
処置の副作用を記録し、有害事象共通用語規準v3.0(Common Terminology for Adverse Events v3.0)(CTCAE)に従ってスコアを付ける。多くの癌患者が疾患による症状を有するため、悪化していない場合は既存の症状はスコアしない。しかしながら、症状がより重篤になる場合、例えば処置前のグレード1が処置後にグレード2に変化する場合、それをグレード2とスコアする。
腫瘍サイズは、造影CT(CT)スキャンで評価する。最大腫瘍径を得る。注入された病変および注入されない病変を含むすべての疾患に固形癌の治療効果判定基準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumor)(RECIST1.1)基準を適用する。これらの基準は:有効(partial response)PR(腫瘍径の合計の30%を超える減少)、不変(stable disease)SD(増加減少なし)、進行・増悪(progressive disease)PD(20%を超える増加)である。PRに達しない明確な腫瘍の減少はやや有効(minor response)(MR)とスコアする。ベースラインにおいて上昇しているとき、血清腫瘍マーカーもまた評価し、同じ百分率を用いる。
経時的血液中ウイルスコピー数、抗ウイルス中和抗体の誘導、抗ウイルスおよび抗腫瘍T細胞の変化、他の免疫学的細胞型および抗腫瘍抗体の変化を含む免疫学的およびウイルス学的パラメータに関して患者の血清試料を分析する。さらに、有害事象を有害事象共通用語規準v3.0(CTCAE)に従ってグレードをつけ、中和抗体力価を測定し、CTのためのRECIST基準(Therasse P et al. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16)またはポジトロン断層法CT(PET-CT)のためのPERCIST基準(Wahl et al 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1:122S-50S)に従って有効性を評価する。すべての患者は処置前に進行性の腫瘍を有していた。疾患のステージは様々である。

Claims (35)

1)カプシド改変を含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖、
2)E1のRb結合定常領域2における24bp欠失(D24)および
3)E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k/6.7Kの代わりに、CTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体(aCTLA MAb)をコードする核酸配列
を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
以下の領域:左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む、請求項1または2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
領域が5'から3'方向に順次に配置される、請求項3に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
野生型領域がE1領域の上流に位置する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
E1領域がウイルスパッケージングシグナルを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
aCTLA MAbをコードする核酸配列がウイルスE3プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
E1領域の上流に、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターまたはE2Fプロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
ウイルスの主鎖にCpG部位をさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
CpG部位がE3領域にある、請求項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
E4領域が野生型である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
カプシド改変が、Ad5/3キメリズム、インテグリン結合性(RGD)領域の挿入および/または繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
カプシド改変がAd5/3キメリズムである、請求項12に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
カプシド改変がRGD-4C改変である、請求項12に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
少なくとも1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
ただ1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
ベクターが、Rb/p16経路における欠損を有する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
ベクターが、テロメラーゼを発現する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
請求項1〜18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む細胞。
請求項1〜18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。
in situ癌ワクチンとして機能する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
被験者の癌を治療するための、請求項1〜18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクター。
被験者の癌を治療する方法であって、請求項1〜18または20のいずれか1つに記載のベクターまたは医薬組成物の被験者への投与を含む前記方法。
癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、扁桃癌からなる群から選択される、請求項21〜23に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
被験者がヒトまたは動物である、請求項21〜24に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
投与が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射であるか、または経口投与である、請求項21〜25のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物が、治療期間中に数回投与される、請求項21〜26のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
以前の治療のベクターと比較して異なるカプシドの繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される、請求項21〜27のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
方法が、被験者への同時放射線治療または同時化学療法または他の同時癌治療の投与をさらに含む、請求項21〜28のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
方法が、被験者における、べラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬;オートファジー誘導剤;テモゾロマイド;制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質;シクロホスファミドおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される助剤の被験者への投与をさらに含む、請求項21〜29のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
方法が、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む、請求項21〜29のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
細胞内でCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を産生する方法であって、
a)請求項1〜18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、
b)細胞内で前記ベクターのCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現させること
を含む前記方法。
被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、
a)請求項1〜15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、
b)細胞内で前記ベクターのCTLA-4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現させ、
c)腫瘍溶解性プラットフォームを用いることによって抗CTLA4 mAbの発現量を増加させ、
d)腫瘍溶解性プラットフォームを用いることによって抗CTLA4 mAbの腫瘍対血漿比を増加させること
を含む前記方法。
細胞内で抗CTLA4 mAbを産生するための、請求項1〜18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。
CTLA4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための、請求項1〜18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
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