JP2014215041A - 粒子計数装置およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】フローサイトメトリーを行うための装置に存在する問題を解消し、電気抵抗法を行うための構成が加わった場合のタイムラグの問題をも解消し得る粒子計数装置とその製造方法を提供すること。【解決手段】当該装置は、分析すべき粒子Ｘ１を含んだ試料液Ｍ１を流すための流路１１を有するフローセル部１と、該流路中の光照射点に照射光Ｌ１をビーム光Ｌ２として照射するための光照射装置２と、該光照射点に該ビーム光Ｌ１を照射した結果の光Ｌ３を検出するための受光装置とを有する。光照射装置２は、光源装置Ｌｓと、不透明フィルム２２に光透過孔２３が設けられてなるビーム光形成用フィルム２１とを有する。光透過孔２３によって、照射光Ｌ１の断面形状がビーム光Ｌ２の断面形状へと変更され、それによって照射側のレンズなどの光学装置が省略されている。【選択図】図１

Description

本発明は、血液細胞など液体中の粒子を少なくともフローサイトメトリーに基いて分析するための粒子計数装置とその製造方法に関するものである。

血液中の赤血球、白血球、血小板などの血液細胞を分析し、計数などを光学的に行なう方法として、フローサイトメトリーが知られている。フローサイトメトリーは、流路を進む試料液中の血液細胞に所定の照射光をビーム光として焦点を合わせて照射し、その結果得られる光散乱や光吸収度などの光学的特性から該血液細胞の識別を行なう手法である（例えば、特許文献１）。

図９は、フローサイトメトリーを行なうための装置の構成例を示す断面図であって、同図のような装置は、フローサイトメーターとも呼ばれている。
同図に示すように、フローサイトメトリーでは、血液細胞を含んだ試料液Ｍ１０を流路１１０に流し、光源装置Ｌｓ１０から照射光Ｌ１０を光学系ＯＰ１０を通して流路上の光照射点に絞って照射し、血液細胞Ｘ１０に該照射光Ｌ１０が当たって生じる散乱の度合い、各血液細胞の吸光の度合いなど、種々の光学的特性を光学系ＯＰ２０を通して受光装置Ｌｒ１０で測定し、そこから血液細胞の大きさ、種類、状態などを特定する。

前記の流路１１０を含んだ測定用装置１２０は、フローセルとも呼ばれている。
フローセル１２０の少なくとも一部の管壁は、流路１１０に照射光Ｌ１０を照射し得るように透明となっている。
尚、図９の装置構成では、流路１１０の上流側（図では光照射点の下側）が２重管の構造となっており、内管１３０から流れ出す試料液Ｍ１０の流れが、外管から流れ出すシース流１４０に取り巻かれた状態で流路１１０に入るようにされている。この構成によって、試料液の流れが細くなり、血液細胞が１つ１つ順に流路１１０を通過し、個々の血液細胞に照射光Ｌ１０を照射できる。

しかしながら、図９に示すような従来の装置の構成では、流路１１０内の細い流れの中心に照射光Ｌ１０を点状となるように照射するために、レンズなどの光学系部品ＯＰ１０を多数配置する必要があり、よって、そのような大掛かりな光学系の構成では、装置の小型化が困難となる。
また、それら光学系部品を照射位置と焦点について高い精度にて調整する必要があり、組み立てのコストが高くなる。
さらに、血球分析装置をパームトップ型（手のひらサイズ型）とする場合には、フローセル部分を測定ごとに使い捨てできるように交換可能な小型のカートリッジとすることが好ましい態様である。しかし、カートリッジの交換毎に上記のような光学系の調整が必要とならないように（特に照射点の位置が３次元方向に変動しないように）、カートリッジを高い寸法精度にて製造するする必要があり、カートリッジのコストが高くなる。

またさらに、近年、上記のようなフローサイトメーターに、電気抵抗法（インピーダンス法とも呼ばれる）を行なうための構成をさらに加えた装置が開発されている。
電気抵抗法は、図１０（ａ）に示すように、所定の検体血液を希釈液中に分散させた試料液Ｍ１０を流路１００に導入し、該流路１００の途中に、オリフィスのごとく流路の断面積が小さくなったアパーチャ（小孔）２００を設け、該アパーチャ２００を間に置いた位置に一対の電極３００、３１０を設けることによって、アパーチャ２００を通過する粒子の容積を、電極間の電気的な特性の変化に基いて測定する手法である。
試料液中の１つの血液細胞Ｘ１０がアパーチャ２００を通過する際に、電極間の電気抵抗またはインピーダンスはパルス状に変化する。よって、一対の電極３００、３１０に定電流電源４００から電圧を印加しておくと、前記のようなインピーダンスの変化に応じて印加電圧も図１０（ｂ）に示すようにパルス状（パルス電圧）に変化する。
このパルス電圧の数を、例えば定電流電源に接続した演算部５００などによって計数（カウント）することによって、血液細胞の数を知ることができる。
また、血液細胞がアパーチャを通過するときのパルス電圧の高さＶpは、その血液細胞の大きさに比例するので、該パルス電圧高さによって血液細胞の体積の大小を判定することができる。該パルス電圧の幅Ｖwは、流速が一定の場合には、その血液細胞の大きさに比例してパルス電圧幅も大きくなることから、パルス電圧幅Ｖwによっても血液細胞の体積の大小をある程度判定することができる。

電気抵抗法によって血球の計数を行なう装置の構成については、例えば特許文献２〜４などに詳細に記載されている。尚、特許文献３の装置では、独自の構成によってアパーチャの下流側の流路が２つに分岐し、また、特許文献４の装置では、独自の構成によってアパーチャの下流側に一対の電極が設けられているが、いずれも、一対の電極の間にアパーチャを位置させて粒子の大きさを判定する電気抵抗法の基本的な原理は上記と同様である。

図１１は、図９のフローサイトメーターに、電気抵抗法のためのアパーチャと電極対とを組み込んだ構成を例示する断面図である。試料液の流れやシース流の形成、光照射のための光学系の全体的な構成は、図９と同様である。光学系の各部の符号は、図９と同様であり省略している。
図１１の装置の構成では、同図の下方から上方へと向かう流路において、ビーム光の照射点の直前にアパーチャ２００が設けられ、該アパーチャを流れの方向に挟んだ一対の電極（一点鎖線で示す）３００、３１０が設けられ、電気抵抗法が実施可能になっている。
また、図１１の装置では、流路の上流側（図の下側）が３重管の構造となっており、内管１３０からの試料液Ｍ１０の流れが第１シース流１４１に取り巻かれ、細い流れとなった状態でアパーチャ２００に入り、さらに該アパーチャを通過した後の流れが第２シース流１４２に取り巻かれ、乱流が抑制された流れとなって照射点に入るようになっている。

フローサイトメーターに電気抵抗法のための部品を組み込んだ図１１のような装置では、光学系部品に関する上記問題（構造が大掛かりであるという問題）のみならず、次のような２種類の測定のタイムラグの問題が更に加わる。
即ち、図１１の構成の場合、ある１つの粒子がアパーチャ２００を通過する時にインピーダンス測定（電気抵抗法）が行なわれ、次いで、その粒子が照射点を通過する時に吸光度などの測定（フローサイトメトリー）が行われる。そのため、１つの粒子に関するこれら２つの測定法の各測定結果の間には、図１２に示すようにタイムラグ（時間的なずれ）が生じる。
よって、そのタイムラグをデータ処理ソフトなどによって補正し、これら２種類の測定結果を１つの粒子に関するデータ対（〔粒子容積、吸光度〕などのデータ対）として対応付ける必要がある。しかし、このようなタイムタグは、個々の装置の流量やフローセルの形状・製造誤差などによって変動するので、データ処理ソフトによる補正のみならず、試料液の流量やシース液の流量を所定の範囲内に収めるための部品精度や微調整も必要となる。

上記のようなフローサイトメトリーにおける光学系部品に関する問題や、電気抵抗法を加える場合のタイムラグの問題は、血液細胞を対象とする計数装置や血球分類装置のみならず、フローサイトメトリーを用いて種々の粒子の分析を行なう装置にも、同様に生じ得る問題である。

特開平８−３２７５２９号公報 特開２００４−２５７７６８号公報 特開２０１１−１８０１１７号公報 特開２００５−０６２１３７号公報

本発明の課題は、フローサイトメトリーを行うための装置に存在する上記問題を解消し、さらには、電気抵抗法を行うための構成が加わった場合の上記タイムラグの問題をも解消し得る粒子計数装置とその製造方法を提供することにある。

本発明の主たる構成は次のとおりである。
（１）少なくともフローサイトメトリーによって試料液中の粒子の分析を行ない得る構成を有する粒子分析装置であって、
分析すべき粒子を含んだ試料液を流すための流路を有するフローセル部と、該流路中の光照射点に照射光をビーム光として照射するための光照射装置と、該光照射点に該ビーム光を照射した結果の光を検出するための受光装置とを有し、
前記光照射装置は、
照射光を発する光源装置と、
該照射光を透過させない不透明フィルムに、該照射光の断面形状をビーム光の断面形状へと変更し得る光透過孔が設けられてなるビーム光形成用フィルムとを有し、
光源装置から発せられた照射光が、ビーム光形成用フィルムの透過孔を通過することでビーム光となって光照射点に照射される構成となっていることを特徴とする、粒子分析装置。
（２）上記フローセル部および流路が、流路形成用基板の一方の主面である第一面に形成された溝と、該溝を管路状の流路とすべく該溝を覆って該流路形成用基板に積層された被覆層とによって構成されており、
該被覆層が透明であって、その上に上記ビーム光形成用フィルムがさらに積層されているか、または、該被覆層が上記ビーム光形成用フィルムを兼ねている、
上記（１）記載の粒子分析装置。
（３）上記流路形成用基板の他方の主面である第二面には、第一面の流路中の光照射点に対応する部位を中心として、光照射点を通過した光を受光装置へと集光するためのレンズとして機能する曲面部分が一体形成されている、
上記（１）または（２）記載の粒子分析装置。
（４）当該粒子分析装置が、さらに、電気抵抗法によって試料液中の粒子の分析を行ない得る構成を有し、
上記流路のうちの光照射点を含む微小区間が、電気抵抗法を行うためのアパーチャとなるよう断面積が減少しており、かつ、電気抵抗法を行うための電極が、流路中において該アパーチャを間に置いた位置に設けられており、
前記構成によって、フローサイトメトリーと電気抵抗法とが１つの微小区間において行うことができるようになっている、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の粒子分析装置。
（５）上記流路が、上記微小区間内においてまたは上記微小区間の下流側の出口において、分岐している、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の粒子分析装置。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の粒子分析装置の製造方法であって、
流路を有するフローセル部に対して、少なくとも光照射点を含む流路が存在する領域を覆って不透明フィルムを固定し、
次いで、該不透明フィルムに対し、光照射点に対応する位置に光透過孔を形成する加工を施して、該不透明フィルムをビーム光形成用フィルムとする工程を有することを特徴とする、前記製造方法。

本発明の粒子計数装置では、光源側において、従来のような複雑な光学系の部品を用いず、不透明フィルムに設けた微小な光透過孔によってビーム光を作り出し、光照射点に到達させている。この光源側の構成によって、多数の光学系の部品が省略され、装置全体のコンパクト化が可能となり、部品コストも低減される。
また、不透明フィルムに設けた光透過孔の位置によって、ビーム光の光路が決定されるので、流路に対してビーム光を照射する位置を高精度に位置合わせでき、多数の光学系の部品による照射光の位置合わせや焦点合わせの調整工程が省略され、組み立てコストを削減することもできる。

また、光検出器側についても、後述の流路形成用基板の第一面に流路を形成する態様では、該流路形成用基板の第二面（裏面）に集光レンズを一体成形しておけば、受光装置側の光学系の部品も省略することができ、かつ、該光学系の位置合わせも不用となる。
光照射装置の光源装置は半導体レーザーを用いればよく、受光装置の素子はフォトダイオードでよいので、これら複雑な部品とその調整を排除した構成から、フローセル部を測定ごとに使い捨てできるように交換可能な小型のカートリッジとすることが可能となる。

また、本発明によれば、流路の微小区間の特定のポイントに対し細径のビーム光を照射する構成が容易に得られる。よって、その流路の微小区間だけを、電気抵抗法を行うためのアパーチャとなるように小さい断面積とすれば、該アパーチャの孔内にビーム光を照射することが可能になる。
アパーチャの孔内に光照射点を設定することによって、フローサイトメトリーによる測定と電気抵抗法による測定とを同時に行うことができるので、図１２に示したような測定のタイムラグが生じなくなり、該タイムラグの問題が根本的に解消される。

図１は、本発明による粒子計数装置の一実施例を模式的に示した部分断面図であって、流路に沿って切断し内部の構造を示している。同図では、光照射点を中心として光源装置から受光素子にいたる部分のみを記載しており、図９や図１１に示したようなシース流を形成するための前段の構造などは図示を省略している。 図２は、本発明において、ビーム光形成用フィルムの使用に適したフローセル部の好ましい構成例を示した部分断面図である。光源装置や受光装置は図示を省略している。図２（ａ）は、当該装置を流路の流れ方向に沿って切断したときの図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のＡ−Ａ断面矢視図である。 図３は、本発明による粒子計数装置の製造方法の特徴的な工程を説明するための断面図である。 図４は、本発明において、受光用のレンズを一体的に形成した構成例を示した断面図である。 図５は、本発明において、電気抵抗法のアパーチャ内でフローサイトメトリーのための光照射を行う場合の構成例を示した断面図である。光源装置や受光装置は図示を省略している。図５（ａ）は、当該装置を流路の流れ方向に沿って切断したときの図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）の上面図であって、ビーム光形成用フィルムによって隠れた主要部分の外形線を破線で示している。 図６は、図５の態様において、流路が電気抵抗法のアパーチャにおいて分岐する場合の構成例を示した断面図である。光源装置や受光装置は図示を省略している。図６（ａ）は、当該装置を分岐した流路の左右の流れ方向に沿って切断したときの図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）の上面図であって、ビーム光形成用フィルムによって隠れた主要部分の外形線を破線で示している。図６（ｂ）には、上方からの試料液がアパーチャにおいて図の左右の方向に分岐する様子が表れている。 図７は、当該装置の構成の変形例を示す図である。 図８は、当該装置によって得られるスキャッターグラムの一例を示す図である。 図９は、フローサイトメトリーを行なうための従来の装置の構成例を示す断面図である。 図１０は、電気抵抗法の基本的な原理と装置構成を説明するための図であって、図１０（ａ）はアパーチャと電極の配置例を示しており、図１０（ｂ）は血球がアパーチャを通過する際に現れる電極間の電圧の変動を模式的に示している。 図１１は、図９のフローサイトメーターに電気抵抗法のためのアパーチャと電極対とを組み込んだ、従来の装置の構成を例示する断面図である。 図１２は、図１１に示した装置における、電気抵抗法による測定結果とフローサイトメトリーによる測定結果との間のタイムラグを示すグラフ図である。

以下、実施例を挙げながら、本発明による装置の構成を詳細に説明し、かつ、本発明の製造方法を説明する。
図１は、本発明による粒子計数装置の一実施例を模式的に示した図である。当該装置は、少なくともフローサイトメトリーによって試料液中の粒子の分析を行ない得るよう、フローセル部１と、光照射装置２と、受光装置３とを有する。
フローセル部１は、分析すべき粒子Ｍ１を含んだ試料液Ｘ１を流すための流路１１を有しており、照射光が通過可能なように透明な壁部１２を有している。図１の例では、光の通過に関係する部分だけが透明となっているが、フローセル部全体が同じ材料で形成されている構造が単純であり好ましい。
光照射装置２は、流路１１中の光照射点に照射光Ｌ１をビーム光Ｌ２として照射する装置であって、照射光Ｌ１を発する光源装置Ｌｓと、ビーム光形成用フィルム２１とを有して構成されており、光照射点に焦点を合わせるためのレンズが排除されている。光照射点は、従来技術においてレンズを用いて焦点を定めていた流路中の設計上の一点であり、光を当てるための粒子の通過点である（図１において粒子Ｘ１を描いている位置の中心点）。ビーム光形成用フィルム２１は、照射光Ｌ１を透過させない不透明フィルム２２に、該照射光Ｌ１の断面形状をビーム光Ｌ２の断面形状へと変更し得る光透過孔２３が設けられたものである。該ビーム光形成用フィルム２１は、光源装置Ｌｓと光照射点との間に位置し、光源装置Ｌｓから発せられた照射光Ｌ１が、該ビーム光形成用フィルム２１の透過孔２３を通過することでビーム光Ｌ２となって、光照射点に照射される構成となっている。
受光装置３は、光照射点の粒子Ｘ１にビーム光Ｌ２を照射した結果生じる光Ｌ３（粒子が存在しない場合にはビーム光Ｌ２の通過）を検出するための装置であって、同図の例では、集光用の光学系部品ＯＰ１と受光素子Ｌｒとを有して構成されている。
上記のように、当該粒子計数装置には、少なくとも光源側にレンズなどの光学系が無いので、構造がコンパクトであり、かつ、光学系の調整も不要となっている。

フローセル部１の構造は、従来公知のフローセルの構造と同様であってもよく、流路の少なくとも光照射点に外部から照射すべき波長の光が到達でき、かつ、流路を流れる粒子に該光が照射された結果生じる光が外部に出ることができるよう透明な壁部を有するものであればよい。
フローセル部の全体の形状は、円管状であってもよいが、外面にビーム光形成用フィルムを接合する点からは、その接合面は平面であるほうが組み立てなどの製造が容易であり好ましい。また、フローセル部は、照射光が透過し得る透明材料によって全体が形成されている方が、構造が単純となるので好ましい。そのような透明材料としては、次に説明する流路形成用基板の材料が挙げられる。

図２は、ビーム光形成用フィルムの使用に適したフローセル部の態様を示す図である。
同図に示すように、流路形成用基板１３の一方の主面である第一面１３ａに流路１１となる溝１１ａが形成されており、該溝を覆って透明な被覆層１４が流路形成用基板１３に積層され、それによって溝１１ａが管路状の流路１１となって、フローセル部１を形成している。そして、被覆層１４上には、不透明フィルム２２が積層されており、該フィルムには流路１１の中心に位置合わせされた光透過孔２３が設けられており、ビーム光形成用フィルム２１となっている。光透過孔２３から溝内に入ったビーム光（図示せず）は、流路形成用基板１３を透過し、下方の受光装置（図示せず）によって検出される。
同図の例では、溝１１ａを覆って流路を形成するための専用の被覆層１４を設けているが、該被覆層がビーム光形成用フィルムを兼ねていてもよい。ただし、その場合には、流路の試料液が漏洩しないように、光透過孔は単純な貫通孔ではなく、孔内に光透過性材料が充填されたものとされる。

図２の例では、流路形成用基板の形状を単純な板状として描いているが、組み立て等に適するように、該基板の外面には種々の凹凸、曲面、斜面などが設けられていてもよい。
流路形成用基板の材料は、フローセルとしての機械的強度を有し、かつ、照射光が透過し得る透明材料であればよく、例えば、アクリル樹脂（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、オレフィン系樹脂（シクロオレフィン・ポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィン・コポリマー（ＣＯＣ））、シリコーン樹脂（ＰＤＭＳ）などの樹脂組成物が好ましい材料として挙げられる。
流路形成用基板の厚さ（図２のｔ１）は、特に限定はされず、溝の深さに応じて適宜決定すればよい。フローサイトメトリーの光照射点や電気抵抗法のアパーチャとなるような微小な流路以外の部分では、流路（溝）の深さが大きくなることから、０．５〜１０ｍｍ程度が好ましく、１〜３ｍｍがより好ましい範囲である。
また、後述のように、流路形成用基板の第二面１３ｂに集光用のレンズなどの付帯的な構造を形成する場合には、そのために必要な厚さを適宜加えればよい。

流路形成用基板１３への溝１１ａの加工方法は特に限定はされないが、成形型を用い、第一面１３ａに溝を持った部品として流路形成用基板を樹脂成形する方法が好ましい。
また、他の溝加工方法としては、平板に対して後から溝加工を行う方法や、流路形成用基板をさらに複数の層（底面のための層と、側壁のための層）に分けて溝を構築する方法などが挙げられる。

フローセル部の流路の断面形状（流路を流れ方向に垂直に切断したときの断面の形状）は、特に限定はされず、円形であっても正方形や長方形などの方形であってもよい。
図２のように、流路形成用基板に溝を形成する場合には、該溝の断面形状は、半円形、正方形や長方形などの方形、Ｕ字形（方形の底辺（溝の底となる辺）が半円形となった形）などが加工上の点からは好ましく、それらのなかでも、流れが比較的均一でありかつ平行光が保たれるという点からは、正方形が好ましい形状である。正方形のコーナー部分には、必要に応じて丸みをつけてもよい。

流路の断面形状の大きさ、とりわけ、フローサイトメトリーの光照射点となる流路の断面形状の大きさ、および、電気抵抗法のアパーチャとなる流路の断面形状の大きさは、計数の対象とする粒子が試料液やシース液の流れに囲まれながら１つだけ通過し得る大きさであることが好ましい。
粒子が血液細胞である場合、フローサイトメトリーの光照射点となる流路の断面形状の大きさ、および、電気抵抗法のアパーチャとなる流路の断面形状の大きさは、例えば、断面形状が円形である場合には、直径が２０μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、５０μｍ〜１００μｍがより好ましい範囲である。また、図２のように、流路を流路形成用基板の溝によって形成し、該溝の断面形状を正方形とする場合には、その１辺は、２０μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、３５μｍ〜５０μｍがより好ましい範囲である。

被覆層の材料は、特に限定はされないが、好ましい材料としては、アクリル（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、オレフィン系樹脂（ＣＯＣ、ＣＯＰ）などが挙げられる。
被覆層の厚さは、特に限定はされないが、流路を維持するための最小限の機械的強度を有しかつビーム光の障害とならないようにできるだけ薄い方が好ましい点からは、０．０５ｍｍ〜１ｍｍ程度が好ましく、０．１ｍｍ〜０．２ｍｍがより好ましい。

被覆層を流路形成用基板に積層する方法としては、接着剤層や粘着剤層を介在させた接合が好ましい方法として挙げられる。これら接着剤や粘着剤は、流路を流れる液体に対して悪影響を与えずまた悪影響を受けない安定した材料からなるものであればよい。
図１、図２の態様では、ビーム光形成用フィルムを光照射装置に属する部材として示しているが、図７（ｃ）に変形例を示すように、ビーム光形成用フィルム２１が被覆層を兼用していてもよく、該ビーム光形成用フィルムがフローセル部の一部となっていてもよい。その場合の光透過孔２３ａは、流路の液体が漏洩しないように透明材料によって充填されているか、または、その部分だけが透明になっていることが必要である。

本発明では、光照射装置は、光源装置とビーム光形成用フィルムとを有して構成されるが、例えば、光源装置がＬＥＤ（発光ダイオード）である場合には、照射光をある程度の平行光線とするためのレンズが該ＬＥＤのモールド樹脂部分に設けられていてもよい。
光源装置は、計数の対象とする粒子に応じて適切な波長の光を出射し得るものであればよく、半導体レーザー、固体レーザー装置、ランプ、ＬＥＤ、ＱＣＬ（量子カスケードレーザー）など特に限定はされないが、光強度が高く、装置全体の構成をよりコンパクトにできる点からは、半導体レーザーが好ましい。

照射光の波長は、計数の対象とする粒子によって異なり、従来技術を参照してよいが、粒子が血液細胞である場合、５００ｎｍ〜７００ｎｍが好ましい波長範囲である。
照射光の断面形状は、ビーム光形成用フィルムの光透過孔の断面形状以上の大きさを有し、該光透過孔の断面形状を包含し得るものであればよい。

ビーム光形成用フィルムは、ビーム光の広がりを抑制する点からは、光照射点により近い方が好ましく、よって、ビーム光形成用フィルムをフローセル部の表面に密着させるのが好ましい態様である。流路形成用基板に溝を形成して流路とする場合において、被覆層がビーム光形成用フィルムを兼用する態様は、ビーム光形成用フィルムを光照射点に最も接近させ得る態様である。

ビーム光形成用フィルム２１の素地である不透明フィルム２２は、独立して形成されたフィルム部材であってもよいし、フローセルの外面（図２の態様では被覆層の上面）に不透明塗料のコーティングなどによって形成された不透明被膜であってもよい。製造コストがより安価である点からは、該不透明フィルムは、独立して形成されたフィルム部材であることが好ましい。
不透明フィルムは、照射光を透過させないフィルムであればよいが、後述の光透過孔を容易に加工し得る点からは、照射光を透過させない顔料や染料を含んで有色不透明となった樹脂製フィルムが好ましい態様である。そのような樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、塩化ビニル樹脂（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等が挙げられる。
樹脂中に含まれる顔料や染料は、公知のものであってよく、例えば、カーボン、酸化鉄などが挙げられる。
後述の製造方法における光透過孔を加工を容易にする点や照射光の反射を抑制する点からは、顔料や染料の色は黒色が好ましい。

不透明フィルムの厚さは、特に限定はされないが、適当な加工性と充分な光の不透過性とを得る点からは、２０μｍ〜５００μｍ程度が好ましく、５０μｍ〜１００μｍがより好ましい。
不透明フィルムが独立して形成されたフィルム部材である場合、上記した接着剤層や粘着剤層を介在させて、該不透明フィルムをフローセル部の表面に積層するのが好ましい態様である。

不透明フィルムに形成される光透過孔の断面形状は、フローサイトメトリーのために適した断面形状のビーム光を形成し得るものであればよい。
ビーム光は、断面形状が円形であるような線状の光だけでなく、細いスリットを通過した平板状の光であってもよい。ビーム光が平板状の光である場合、該ビーム光の帯状の細長い断面形状が流路を横切る方向に延びるように該ビーム光を照射するのが好ましい。
ビーム光の断面形状やその大きさは、計数の対象とする粒子に応じて適宜決定すればよい。粒子が血液細胞である場合、該ビーム光の断面形状のうち、流路の流れ方向についての外径寸法（該断面形状が円形の場合には直径。該断面形状が帯状の場合には帯幅）は、１０μｍ〜２００μｍ程度が好ましく、５０μｍ〜１００μｍがより好ましい範囲である。
よって、上記のようなビーム光の断面形状を、光透過孔の断面形状として採用すればよい。

光透過孔は、不透明フィルムに形成された貫通孔（孔内にフィルム材料が無い態様）であってもよいし、孔内に透明材料が存在し光だけが透過し得る態様であってもよい。貫通孔は、不透明フィルムに対して形成が容易であり、位置決め精度も高いので好ましい。
不透明フィルムに光透過孔を形成する方法は特に限定はされないが、レーザー光の照射（高温による局所的な溶融、レーザーアブレーションによる局所的な破壊など）による穿孔加工、または、色素の局所的な破壊が好ましい方法である。また、レジストを用いた光透過孔のエッチングや、フローセルの外面に対して光透過孔だけを残して印刷法や種々の堆積法によって不透明フィルムを形成する方法であってもよい。

本発明による製造方法は、本発明の粒子分析装置を製造するに際して、フローセルにビーム光形成用フィルムを付与するための好ましい方法を提供する。
当該製造方法では、先ず、図３（ａ）に示すように、フローセル部１に対して、少なくとも光照射点を含む流路１１が存在する領域に不透明フィルム２２を固定する。
次いで、図３（ｂ）に示すように、該不透明フィルム２２に対して、光照射点Ｐに対応する位置に光透過孔２３を形成する加工を施し、該不透明フィルム２２をビーム光形成用フィルム２１とする。
図３（ｂ）の例は、レーザー光を照射して不透明フィルムに微細孔を開ける穴加工の例である。下層の被覆層はレーザー光を吸収しないため、穴加工がされない。
当該製造方法によれば、光透過孔の加工のためのレーザー光の標的への位置合わせだけが必要なので、加工が容易でありかつ位置決め精度が高く、不透明フィルムをフローセル部に貼り合わせる時に高精度な位置合わせが不要である。
これに対して、光透過孔を有するビーム光形成用フィルムを予め別途形成し、それをフローセル部に貼り合わせるといった方法では、既に形成された光透過孔を流路の中心に位置合わせするために、ビーム光形成用フィルム全体を移動させる必要があり、しかも、接着剤を介在させて貼り合わせる必要がある。ビーム光形成用フィルムは、上記のとおり薄いので、そのような微調整には手間がかかり高い精度が得られない。

当該製造方法における光透過孔の加工のためのレーザー光（レーザー装置）は、特に限定はされないが、ＹＡＧレーザー、ＣＯ₂レーザー、エキシマレーザー、Ａｒレーザーなどが好ましいものとして挙げられる。

図４は、流路形成用基板に溝を加工する場合の好ましい態様を示している。
同図の態様では、流路形成用基板１３の他方の主面である第二面１３ｂに、集光するためのレンズとして機能する曲面部分ＯＰ２が一体形成されている。該レンズとして機能する曲面部分ＯＰ２は、流路（第一面１３ａに形成された溝）中の光照射点に対応する部位を中心として設けられ、該光照射点を通過した光（光照射点の粒子にビーム光Ｌ２が当たって生じた光Ｌ３、または、図４のようにビーム光Ｌ２がそのまま通過した光）を受光装置へと集めるように設計されていればよい。

曲面部分ＯＰ２は、図４に示すような単純な凸面レンズであってもよいし、フレネルレンズのような特殊な曲面を持ったレンズであってもよい。また、他の光学機器との組み合わせによっては凹面レンズであってもよい。
該レンズとして機能する曲面部分ＯＰ２は、流路形成用基板１３の第二面１３ｂに対する後加工によって形成してもよいが、第一面の溝と同様、成形型を用い、第二面１３ｂに溝を持った部品として流路形成用基板を樹脂成形する方法が好ましい。

図５は、本発明の装置のより好ましい態様を示す図である。
図５の態様では、図４に示した構成に加えて、電気抵抗法による粒子の分析をフローサイトメトリーによる測定と同時に行ない得る構成がさらに付与されている。図５に示すように、流路１１のうちの光照射点を含む微小区間（長さα）が、電気抵抗法を行うためのアパーチャ４０となるように、流路（溝）１１の断面積が微小区間に向かって減少している。また、電気抵抗法を行うための電極４１、４２が、該アパーチャ４０を間において、図の流路内に上流側と下流側に設けられている。
同図の態様では、光照射点にビーム光を照射するためのビーム光形成用フィルムや、流路形成用基板１３の第二面１３ｂに設けた該レンズとして機能する曲面部分ＯＰ２は、図４について説明した態様と同様である。
この構成によって、１つの微小区間においてフローサイトメトリーによる光照射を行って光学的な分析をし、同じ位置において、該微小区間をアパーチャとして電気抵抗法を行って電気的な分析を行うことができるので、図１２に示したような測定結果の時間的なずれ（タイムラグ）が根本的に無い。

微小区間は、電気抵抗法を行うためのアパーチャとして機能し得る区間長さαを有するものであればよい。流路について述べたとおり、アパーチャとして好ましい微小区間の断面形状は、粒子が試料液やシース液の流れに囲まれながら１つだけ通過し得る大きさであることが好ましい。
電気抵抗法を行うためのアパーチャとして好ましい微小区間の長さαは、粒子によっても異なるが、粒子が血液細胞である場合には、２０μｍ〜２００μｍ程度であり、４０μｍ〜１００μｍがより好ましい長さの範囲である。
電気抵抗法を行うための流路（溝）は、図５（ａ）、（ｂ）に示すように、アパーチャとなっている微小区間から離れるにつれて、深さ方向および幅方向に、なだらかに増加している。このような流路の増減自体については、従来技術を参照してもよい。

図６は、図５に示した態様の特殊な構成例を示す図である。
図６の態様では、図５に示した構成において電気抵抗法をより好ましく実施すべく、流路が微小区間（アパーチャ４０）において分岐しており、図６（ｂ）に示すように、上方の流路１１から流れてきた試料液は、微小区間（光透過孔２３が設けられた部分）に流入し、図の左右の流路１１ａ、１１ｂに分かれて流出する。このような流路の分岐は、微小区間（アパーチャ）の下流側の出口に設けられていてもよい。電極４１、４２は、微小区間を間において設けられているが、流路が分岐しているので、どちらの電極も微小区間の下流側に位置することになる。このような流路の分岐と電極の配置によって、電極に発生する気泡がアパーチャを通過しないため、気泡によるノイズが減少するという効果が得られる。

図７は、図４〜図６に示した構成の変形例を示す図である。
図７（ａ）の例では、アパーチャ４０を形成すべくフローセル部１の外形がテーパー状に減少しており、平板状のビーム光形成用フィルム２１とフローセル部１との間には隙間が存在している。
図７（ｂ）の例では、アパーチャ４０を形成すべくフローセル部１の外形がテーパー状に減少しているが、ビーム光形成用フィルム２１がフローセル部１の外形に密着しており、両者の間には隙間は無い。
図７（ｃ）の例では、ビーム光形成用フィルム２１がフローセル部１の一部となっている。

本発明において計数の対象となる粒子は、特に限定はされず、例えば、薬剤等を封入した微粒子、リポソームなどであってもよいが、赤血球、白血球、血小板などの血液細胞を計数の対象とする場合、本発明の装置は、手のひらに乗る程度の小型化が可能であるため、その有用性は顕著になる。
また、フローサイトメトリーを行うための光照射点を含んだ流路の部分（加えて、電気抵抗法を行うためのアパーチャを含んだ流路の部分）を装置本体に対して交換可能（使い捨て可能）なカートリッジ型とすることが可能であり、この点でも、血球計数装置として有用である。

血液細胞を計数の対象とする場合の、試料液やシース液、フローサイトメトリーを行うための照射光の強度、受光感度、電気抵抗法を行うための印加電圧、フローサイトメトリーによる粒子計数結果のグラフ化（度数分布グラフやスキャッターグラム化）、さらには、電気抵抗法を併用する際の粒子計数結果のグラフ化、分析方法、データ処理方法などは、従来技術を参照すればよい。

当該装置を白血球分類の計測に用いる場合の一例を示す。
全血に溶血、希釈、染色の処理を施して試料液を作成し、当該装置によって個々の血球について、フローサイトメトリーによる吸光度と電気抵抗法による容積とを得る。
得られた個々の血球ごとの測定データ（容積、吸光度）を、Ｘ軸（容積に対応する横軸）とＹ軸（吸光度に対応する縦軸）とからなるＸ−Ｙ平面上にプロットし、図８に示すようなスキャッターグラムを得る。得られたスキャッターグラムは、ＬＭＮＥマトリクスと呼ばれるものであり、４種類の白血球、即ち、リンパ球（Ｌ：Lymphocyte）、単球（Ｍ：Monocyte）、好中球（Ｎ：Neutrophil）、好酸球（Ｅ：Eosinophil）の分布の様子を好ましく示すものである。
本発明の装置は、フローサイトメトリーによる吸光度と電気抵抗法による容積とを、同じ位置でかつ簡素な構成で測定することを可能にしているので、小型化された装置であっても、タイムラグに起因するエラーの少ない信頼性の高いグラフとなっている。

本発明によって、フローサイトメトリーを行うための従来の装置において問題となっていた光学系の大掛かりな構造が省略され、コンパクト化が可能となっただけでなく、調整や加工も簡単になった。また、フローサイトメトリーと電気抵抗法とを同位置において行うことが可能となったので、タイムラグの問題が解消された。これによって、特に、血液細胞の分類や計数に好ましい装置を提供することが可能になった。

１ フローセル部
１１ 流路
２ 光照射装置
２１ ビーム光形成用フィルム
２２ 不透明フィルム
２３ 光透過孔
３ 受光装置
Ｌ１ 照射光
Ｌ２ ビーム光
Ｌ３ 粒子にビーム光を照射して生じる光
Ｌｓ 光源装置
Ｍ１ 分析すべき粒子
Ｘ１ 試料液Ｘ１

Claims (6)

1. 少なくともフローサイトメトリーによって試料液中の粒子の分析を行ない得る構成を有する粒子分析装置であって、
   分析すべき粒子を含んだ試料液を流すための流路を有するフローセル部と、該流路中の光照射点に照射光をビーム光として照射するための光照射装置と、該光照射点に該ビーム光を照射した結果の光を検出するための受光装置とを有し、
   前記光照射装置は、
   照射光を発する光源装置と、
   該照射光を透過させない不透明フィルムに、該照射光の断面形状をビーム光の断面形状へと変更し得る光透過孔が設けられてなるビーム光形成用フィルムとを有し、
   光源装置から発せられた照射光が、ビーム光形成用フィルムの透過孔を通過することでビーム光となって光照射点に照射される構成となっていることを特徴とする、粒子分析装置。
2. 上記フローセル部および流路が、流路形成用基板の一方の主面である第一面に形成された溝と、該溝を管路状の流路とすべく該溝を覆って該流路形成用基板に積層された被覆層とによって構成されており、
   該被覆層が透明であって、その上に上記ビーム光形成用フィルムがさらに積層されているか、または、該被覆層が上記ビーム光形成用フィルムを兼ねている、
   請求項１記載の粒子分析装置。
3. 上記流路形成用基板の他方の主面である第二面には、第一面の流路中の光照射点に対応する部位を中心として、光照射点を通過した光を受光装置へと集光するためのレンズとして機能する曲面部分が一体形成されている、
   請求項１または２記載の粒子分析装置。
4. 当該粒子分析装置が、さらに、電気抵抗法によって試料液中の粒子の分析を行ない得る構成を有し、
   上記流路のうちの光照射点を含む微小区間が、電気抵抗法を行うためのアパーチャとなるよう断面積が減少しており、かつ、電気抵抗法を行うための電極が、流路中において該アパーチャを間に置いた位置に設けられており、
   前記構成によって、フローサイトメトリーと電気抵抗法とが１つの微小区間において行うことができるようになっている、請求項１〜３のいずれか１項記載の粒子分析装置。
5. 上記流路が、上記微小区間内においてまたは上記微小区間の下流側の出口において、分岐している、請求項１〜４のいずれか１項記載の粒子分析装置。
6. 請求項１〜５のいずれか１項記載の粒子分析装置の製造方法であって、
   流路を有するフローセル部に対して、少なくとも光照射点を含む流路が存在する領域を覆って不透明フィルムを固定し、
   次いで、該不透明フィルムに対し、光照射点に対応する位置に光透過孔を形成する加工を施して、該不透明フィルムをビーム光形成用フィルムとする工程を有することを特徴とする、前記製造方法。