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JP2014210761A - 抗イヌｎ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体ならびにそれを用いた免疫学的測定方法、および免疫学的測定用キット - Google Patents

抗イヌｎ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体ならびにそれを用いた免疫学的測定方法、および免疫学的測定用キット Download PDF

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Masaaki Kojima
正章 小島
蜂巣　達之
Tatsuyuki Hachisu
達之 蜂巣
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SHIBAYAGI KK
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Abstract

【課題】 抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体）、この抗体を用いたイヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）を測定する免疫学的測定方法、および伴侶動物の心疾患または心臓に寄生する感染症の検出方法を提供すること。
【解決手段】 この発明の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体は、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部位、例えば、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの３１〜６７番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体またはイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの６８〜９８番のアミノ酸配列の1部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体からなる。この発明のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの免疫学的測定方法は、この抗体の１種または２種を用いたサンドイッチ測定法に基づく方法である。また、本発明は、犬などの伴侶動物の心疾患、例えば僧帽弁閉鎖不全症、心不全、またはイヌフィラリア症などの心臓に寄生する感染症を検出することができる。
【選択図】なし

Description

この発明は、抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体）およびそれを用いた免疫学的測定方法に関するものである。さらに詳細には、この発明は、イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）のヒトＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を認識する抗体ならびにその抗体を用いたイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法、およびその測定方法を用いたイヌ等の伴侶動物の心疾患ならびにフィラリア症を検査する検査方法、および免疫学的測定用キットに関するものである。
近年、犬、猫等の伴侶動物においても、人間同様、食習慣や環境などの変化により生活習慣病が増加するにしたがって心疾患も増加している。さらに、犬、猫等の伴侶動物の飼育環境が改善されたことにより、高齢まで生きる動物が増加するにつれて、心臓の疾患も急増しているのが実情である。人の心疾患と同様に、伴侶動物の心疾患についても、症状の早期発見と、症状に合った適切な治療が必要である。
伴侶動物の心疾患も、病気の程度や種類などに応じてその治療法を決めるために、その心疾患の症状を精密に検査・診断する必要がある。しかし、伴侶動物血液についての検査は、ヒト血液についての臨床検査に対して使用されている試薬や手法を実質的にそのまま使用されているのが現状である。したがって、伴侶動物に適した伴侶動物専用の検査・診断法の開発が要望されている。
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、ヒトに対して、強力な利尿・ナトリウム利尿作用、血管拡張作用を有することから、高血圧症、浮腫性疾患、腎不全、心不全などの種々のヒト疾患への臨床応用が期待され、うっ血性心不全患者に対して心機能改善効果を奏することが報告された（非特許文献１）。また、ＡＮＰは、急性心不全症に対する第一選択薬としてすでに広く臨床応用されている（急性心不全治療ガイドライン２００６年改訂版）。さらに、最近、ＡＮＰは、急性腎不全、心筋梗塞（再灌障害）についての臨床研究についての報告がなされている（非特許文献２、３）。
ＡＮＰは、１２６個のアミノ酸からなるプロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏＡＮＰ）として心房筋細胞で生合成され、主として心房内顆粒に蓄積され、心房圧刺激に応じて、ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列１〜９８（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）とｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列９９〜１２６（ＡＮＰ）に分解されて血液中に分泌される。血中のＡＮＰ濃度は、心不全や慢性腎不全のマーカーとして免疫学的測定法による診断にすでに応用されているが、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは、一方では、例えば敗血症に対する有用なマーカーであると報告されているが（非特許文献４）、他方では、心不全にとってはリスクファクターとなるとも報告されている（非特許文献５）。また、うっ血性心不全症のイヌにおいても、ＡＮＰが増加すると報告されている（非特許文献６）。
また、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１〜９８）はさらに血液循環中に３つのＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１〜３０）、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）およびＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（７９〜９８）に分解され、これらはそれぞれ多くの疾患において血中で濃度が上昇し、それらの疾患の重要なマーカーであることも示されている（例えば、非特許文献７参照）。
一方、ｐｒｏＡＮＰ測定方法自体も公知である。特許文献１には、γ−ＡＮＰ（ｐｒｏＡＮＰ）の１〜２５番のアミノ酸配列からなる部分を認識するモノクローナル抗体を用いたγ−ＡＮＰ（ｐｒｏＡＮＰ）の免疫学的測定法が開示されている。
ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの異なる部位を認識する２種類のモノクローナル抗体を用いて、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定するためのサンドイッチ免疫学的測定方法が報告されている（非特許文献８、特許文献２、３）。
非特許文献８には、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの１〜３０番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体とＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの７９〜９８番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体等を用いて、サンドイッチ法によりヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを免疫学的に測定する方法が開示されている。
特許文献２には、試料と、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの特定部位を認識する第１の抗体と、該ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの特定部位とは異なるＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ部位を認識する標識した第２の抗体とをインキュベートする工程、および生成した抗原抗体複合体を検出する工程を包含するヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する方法が記載されている。好ましい実施態様によれば、上記第１または第２の抗体は、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの４３〜６６番のアミノ酸配列に含まれる部分を認識する。
特許文献３には、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの１〜３０番のアミノ酸配列を認識する第１モノクローナル抗体およびＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの６５〜８４番のアミノ酸配列を認識する標識第２モノクローナル抗体を用いたヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの免疫学的測定法が開示されている。
特許文献４には、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの中間領域（ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列５３〜８３番に広がる領域）の部分的な配列に特異的に結合する２つの抗体を用いた、心臓病および敗血症の診断における、部分的なＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを同定するための改善されたサンドイッチイムノアッセイが開示されている。
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、イヌ等の動物に対しても、心不全の診断に有用であり、かつ、イヌの心不全を予知する強力なツールとなる可能性が示されたと記載されている（非特許文献９）。この文献には、ある研究では、 イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰは前臨床の心臓疾患のマーカーとして有用であると評価されているが、その評価はまだ異論があると報告されている。また、この文献での評価にしても、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの１〜９８番のアミノ酸配列に対する抗体を用いる市販されているキットを用いて行われたものであって、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰに特異的な抗体を用いた評価ではない。
また、非特許文献１０には、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸残基８０〜９６の抗血清を用いたＲＩＡキットを使用して、心不全のイヌに対するＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの測定結果が開示されている。さらに、非特許文献１１には、同様に、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸残基７９〜９８に対する抗体を使用したＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのイヌ僧帽弁閉鎖不全症に対するＲＩＡの測定結果を開示している。
しかし、これらはいずれもヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１〜９８）に対する抗体を用いた測定系であり、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰに特異的な抗体を用いた測定系ではないので、イヌなどの伴侶動物に対する正確な結果とは言えない。そこで、イヌなどの伴侶動物のＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの特異的な抗体を用いた測定系の開発が要望されている。
特許第２５６１５１３号公報 特開平８−２２６９１９号公報 特開２００５−１１４４８０号公報 公表２００６−５２３２９８号公報
Saito, Y., et al., Circulation 1987; 76: 1362-74 Kitakaze, M., et al., Lancet 2007; 370: 1483-93 Kasama, S., et al., Eur. Heart J. 2008; 29; 1485-94 Hoffmann, U., et al., Clin Lab. 2005; 51 (7- 8):373-9 Berger R, et al., European Journal of Clinical Investigation, 2005, 35 (1), 24-31 Asano, K., et al., Journal of Veterinary Medical Science, 1999, 61, 523-529 Daggubati et al., Cardiovascular Research (1997), 246-255 Upsala Journal of Medical Science 102, 99 -108 (1997) Tarnow, I., et al., The Veterinary Journal 180 (2009) 195-201 Prosek, R., et al., J. Vet. Intern. Med. 2007; 21: 238-242 Haggstrom, J., et al., Journal of Veterinary Cardiology, Vol. 2, No. 1, May 2000, 7-16
そこで、かかる要望を達成すべく鋭意検討した結果、本発明者らは、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ特異抗体を作製するために、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列のヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部分を認識できる抗体を作製することに成功し、かつ、この抗体を用いたイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの免疫学的測定方法を完成した。
したがって、この発明の主な目的は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列部位を認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体からなる抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を提供することである。
この発明の好ましい態様は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列のヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列部分、例えば、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３１〜６７番およびイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列６８〜９８番の１部または全部をそれぞれ認識できる２種類の抗体を提供することである。
この発明の別の好ましい態様は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を産生するハイブリドーマ株を提供することである。
この発明の別の目的は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を用いて、イヌなどの伴侶動物のＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法を提供することである。
この発明の好ましい態様は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列のヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列部分、例えば、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３１〜６７番およびイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列６８〜９８番の１部または全部をそれぞれ認識できる２種類の抗体を用いたイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法を提供することである。
この発明の好ましい態様は、免疫学的測定方法が、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、凝集法、発光免疫測定法など、より好ましくは、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法などの免疫学的測定方法を提供することである。
この発明の更に別の目的は、免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定用キットを提供することである。また、この発明の好ましい態様は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、凝集法、発光免疫測定法など、より好ましくは、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法などの免疫測定法を実施するための免疫学的測定用キットを提供することである。
この発明のさらに別の目的は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体および上記免疫学的測定方法を用いてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定してイヌなどの伴侶動物の僧帽弁閉鎖不全症や心不全症などの心疾患を検出する心疾患検出方法を提供することである。
この発明のさらに別の目的は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体および上記免疫学的測定方法を用いてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定して、フィラリア症などの心臓に寄生する感染症、特にイヌフィラリア症などの伴侶動物感染症を検出する感染症検出方法を提供することである。
上記目的を達成するために、この発明は、その主な態様として、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部位を認識する抗体からなる抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの３１〜６７番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体および／またはイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの６８〜９８番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体からなる抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体がイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３２〜４０番を認識する抗体、または抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体がイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列
７４〜８２番を認識する抗体を提供する。
この発明のさらに好ましい態様は、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体がイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３２〜４０番を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、または抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体がイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列７４〜８２番を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供する。
この発明は、そのさらに好ましい態様として、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３２〜４０番を認識するモノクローナル抗体がクローン番号２Ｅ３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１８）、またイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列７４〜８２番を認識するモノクローナル抗体がクローン番号３Ｄ２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１９）であることを提供する。
この発明の別の態様は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を用いて、イヌなどの伴侶動物のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体が、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３１〜６７番およびイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列６８〜９８番の１部もしくは全部をそれぞれ認識することからなる免疫学的測定方法を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、上記免疫学的測定方法が、放射能測定法、酵素測定法、発光測定法、凝集法などであることを特徴としている。また、この発明は、その好ましい態様として、免疫学的測定方法が、イムノクロマトグラフィー法、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法などの酵素免疫測定法、ラテックス凝集法などの凝集法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの発光免疫測定法などであることを特徴としている。
この発明は、さらに別の態様として、この発明の免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定用キットを提供する。また、この発明は、その好ましい態様として、イムノクロマトグラフィー法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、凝集法、発光免疫測定法など、より好ましくは、イムノクロマトグラフィー法、ＥＬＩＳＡ法などの免疫測定法を実施するための免疫学的測定用キットを提供する。
この発明は、その別の態様として、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体および上記免疫学的測定方法を用いてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定することにより、イヌなどの伴侶動物の心疾患、例えば僧帽弁閉鎖不全症、心不全症などの心疾患を検出する伴侶動物の心疾患検出方法を提供する。
この発明のさらに別の態様は、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体および上記免疫学的測定方法を用いてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定することにより、イヌなどの伴侶動物のフィラリア症などの心臓に寄生する感染症を検出する動物の感染症検出方法を提供する。
上述したように、この発明は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部位を認識する抗体、好ましくは、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列の異なる部位（３１〜６７番と６８〜９８番）を認識する各抗体、ならびにそれらの抗体を用いたイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法、およびその測定方法を用いたイヌ等の伴侶動物の心疾患やフィラリア症等の心臓に寄生する感染症などを検査する検査方法に関するものである。したがって、この発明に係る免疫学的測定方法では、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを特異的に測定することが可能であることから、従来のような抗ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体ではなく、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ特異抗体とイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ標準品を用いてイヌなどの伴侶動物の心疾患や感染症などを特異的にかつ迅速に検出できるという効果を奏する。
また、この発明において、免疫測定法として、特にイムノクロマトグラフィー法を用いた場合、その操作が極めて簡便で、比較的短時間で判定ができ、測定に特に高価な装置も必要とせず、現場に持ち運びができるなど、臨床に応用出来ることが大いに期待される。
イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ標準曲線の例を示す図であって、標準曲線の測定範囲（１２．５〜４００ｐｇ/ｍｌ）を示している。 検体希釈率の相関試験を示す図であって、イヌ心疾患に診断された５３頭（ビーグル／キャバリア／チワワ／スピッツ／ゴールデンレトリバー／雑種）から血漿検体（EDTA−アプロチニン）で採血した検体を２．５倍希釈と５倍希釈した相関試験の結果を示している。 この発明に係るイムノクロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定用キットの平面図を示す。 この発明に係るイムノクロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定用キットの断面図を示す。 この発明に係るイムノクロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定用キットを用いた測定結果を示す図である。
この発明は、イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）を認識可能な抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体）ならびにその抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体を用いたイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定する免疫学的測定方法、およびその測定方法を用いたイヌ等の伴侶動物の心疾患やフィラリア症などの感染症を検査する検査方法に関するものである。
この発明に係る抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部位を認識する抗体であって、例えば、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ３１〜６７番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗体（以下、「抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体」ともいう）およびイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ６８〜９８番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗体（以下、「抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体」ともいう）である。
具体的には、この発明に係る抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ３１〜６７番のアミノ酸配列の１部、例えばイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列３２〜４０番（配列番号２：ＡＥＳＰＱＡＬＳＥ）を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり、かかるモノクローナル抗体が好ましい。この抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、２０１２年５月９日付けで、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１８として寄託されている。
また、この発明に係る抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体は、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ６８〜９８番のアミノ酸配列の１部、例えばイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列７４〜８２番（配列番号３：ＲＳＰＷＤＳＳＤＲ）を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり、かかるモノクローナル抗体が好ましい。この抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、２０１２年５月９日付けで、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１９として寄託されている。
この発明に係るイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを認識する抗体はいずれも、当該技術分野では慣用されている公知の一般的手法によって調製することができる。
この発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えばイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列の特定部分のペプチドもしくはその誘導体、かかる特定部分ペプチドを有する合成ペプチドなどを使用することができる。ペプチドもしくはその誘導体は、例えばマウス、ラットなどの動物の組織もしくは細胞から慣用の方法により調製することができる。合成ペプチドは、ペプチドシンセサイザー等を使用して公知の方法で化学的に合成、あるいは上記ペプチドやその誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても調製することができる。
上記のようにして得られた抗原は、可溶化したものを直接免疫することができるが、適当な担体に結合させた複合体として免疫することもできる。 担体としては天然高分子担体や合成高分子担体が使用でき、天然高分子担体としては、例えばウシなどの哺乳動物の血清アルブミン、チログロブリン、ヘモグロビン、ヘモシアニンなどを使用、また合成高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類などの重合体もしくは共重合体などのラテックス等を使用することができる。抗原を担体に結合するには、種々の縮合体を用いるのがよい。縮合体としては、例えば、ジアゾニウム化合物、ジアルデヒド化合物、ジマレイミド化合物、マレイミド活性エステル化合物、カルボジイミド化合物などを用いるのがよい。
上記のようにして得られた抗原を免疫用の免疫原として、マウス、ラット、ウサギなどの動物に対して、例えば腹腔内、静脈、皮下などに投与して抗体を作製することができる。免疫原は抗体産生能を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントなどの適切なアジュバントに乳濁し、得られた乳濁液を動物に投与して免疫してもよい。免疫は、通常２〜６週毎に１回、計２〜１０回程度追加免疫を行うのがよい。
この発明の抗体を作製するに際しては、抗原を免疫したマウスなどの動物から抗体価が認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓を採集し、含まれる抗体産生細胞（脾臓細胞）を、哺乳類由来、好ましくはマウス由来のミエローマ細胞と融合することにより、この発明の抗体を産生するハイブリドーマ株を調製することができる。脾臓細胞とミエローマ細胞との融合は、当該技術分野において常用されている方法に従ってポリエチレングリコールなどの融合促進剤を用いて行うことができる。融合により得られたハイブリドーマ株は、スクリーニングやクローニングなどにより所望のハイブリドーマ株を選択することができる。また得られた抗体は、例えば、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、塩析法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換カラム法、ゲルろ過法などにより分離精製することができる。
この発明の抗体は、上記のハイブリドーマ株をマウスなどの動物の腹腔内などに投与し、その腹水などの体液から採集することによって作製することができる。得られた抗体は、当該技術分野において公知の方法により容易に精製することができる。
この発明でいう免疫学的測定方法とは、強い親和性と良好な特異性を持つ抗体を結合試薬として利用した測定方法である。
この発明に係る免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法などの酵素免疫測定法、ラテックス凝集法などの凝集法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの発光免疫測定法などが挙げられる。これら免疫学的測定方法のうち、この発明においては、この発明に係る抗体を使用することができる限りでは、特に限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ法やイムノクロマトグラフィー法などの免疫測定方法が好ましい。そこで、本発明においては、免疫学的測定法として、ＥＬＩＳＡ法ならびにイムノクロマトグラフィー法を例に挙げて説明するが、これらの免疫測定方法に限定されるものではないことは言うまでもない。
この発明に係る免疫学的測定方法としては、例えば、直接法、間接法、競合法、非競合法、サンドイッチ法などの多くの変法が含まれるが、サンドイッチ法が好ましい。これらの免疫学的測定方法は、いずれも当該技術分野で慣用されている測定原理に従って行うことができる。
この発明の免疫学的測定法は、一般的には、抗体（一次抗体）を、９６ウェルプレート、ポリスチレンビーズ等のビーズ、チューブ、ニトロセルロース等のメンブレンなどの支持体に固定し、抗原を含む血液、血清などの試料と共にインキュベートする工程、さらに酵素標識した別の抗体（二次抗体）を加えてインキュベートして酵素標識抗体抗原複合体（コンジュゲート）を生成する工程、および酵素標識抗体抗原複合体を検出して目的とする抗原を測定する工程から構成されている。これらの工程は、使用する抗体以外は、いずれも当該技術分野で慣用されている手法によって実施することができ、かつ、使用する試薬等もいずれも当該技術分野で慣用されている試薬等を使用することができる。
この発明の免疫学的測定方法において、上記第１の抗体としては、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ３１〜６７番のアミノ酸配列を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３）並びに、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ６８〜９８番目のアミノ酸配列を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２）のいずれも使用することができる。また、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体も、上記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体もいずれも、酵素物質、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、着色粒子などにより標識して第２の抗体として使用することができる。さらに、抗体と標識物との結合には、ビオチン−アビジン系の化合物を用いることもできる。
この発明において標識に使用できる酵素としては、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが挙げられ、発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルミノール、ルミノール誘導体などが挙げられる。また放射性同位元素としては、例えば、［125Ｉ］、［131Ｉ］、［3Ｈ］、［14Ｃ］などが挙げられる。さらに、着色粒子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体等の有機高分子のラテックス着色粒子、金コロイド、銀コロイドなどの金属コロイドや金属硫化物等の金属粒子などが挙げられる。
さらに具体的に、免疫学的測定方法のうち、代表的な酵素免疫測定法の１態様として、ＥＬＩＳＡ法を例に挙げて簡単に説明する。ただし、この発明は、下記態様に一切限定されるものではなく、下記の例はＥＬＩＳＡ法を具体的に説明するための１例示である。
ＥＬＩＳＡ法では、通常９６ウエルマイクロプレートのウエルの表面に、抗体をコーティングまたは固相化し、この抗体を一次抗体（つまり、キャプチャー抗体）として、測定対象物質である抗原を捉まえるために利用します。このウエルに、測定対象物質としての抗原を含む溶液（標準液、または検体、測定試料）を添加し、一次抗体に抗原を結合させる。次に、抗原のキャプチャー抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する抗体（酵素標識二次抗体という）を予め酵素で化学的に標識し、一次抗体抗原複合体に添加することにより、酵素標識二次抗体は、キャプチャー抗体と結合した抗原を認識し結合させる。その後、酵素に対する色原性基質溶液を添加して、酵素反応により基質が色素に変化させた後、反応停止液を添加して、酵素反応を停止させる。酵素反応停止後、この色素の呈色を比色法で測定することによってキャプチャー抗体に結合した抗原を色素としてその吸光度を測定して、その吸光度から測定試料中の抗原量を算出することができる。ＥＬＩＳＡ法は、詳述したように、抗体−抗原−抗体の形、すなわちサンドイッチの形で測定するのが好ましい。
上記態様において、酵素標識二次抗体としては、例えば、ビオチン標識二次抗体などを使用するのがよい。ただし、このように抗体に酵素を標識すると、抗体の結合能に立体障害などが生じる可能性があり、１分子の抗体に多くの酵素を結合するのが困難になることもある。かかる困難を克服するために、卵白中に含まれるアビジンに酵素を結合させたアビジン−酵素複合物を、抗原と結合したビオチン標識二次抗体と反応させるのがよい。また、アビジン−酵素複合物としては、例えば、アビジン−ペルオキシダーゼ複合物を使用するのがよく、ペルオキシダーゼとしては、例えば、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いるのがよい。かかるアビジン−ペルオキシダーゼ複合物などのアビジン−酵素複合物の酵素に対する色原性基質としては、例えば、ＴＭＢ（3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン）などが挙げられる。さらに、反応停止液としては、硫酸などの酸を使用するのがよい。
次に、免疫学的測定方法のうち、別の代表的な免疫測定法であるイムノクロマトグラフィー法について、図３および図４を参照して簡単に説明する。図３は、この発明に係るイムノクロマトグラフィー法に基づく免疫学的測定用に使用する１実施態様であるイムノクロマトグラフィー用ストリップの平面図である。図４はその断面図である。
図３および図４に示すように、イムノクロマトグラフィー用ストリップ（Ａ）は、一般的には、展開方向の上流側には、表層にサンプルバッド（１０）と、サンプルバッド（１０）の下部にコンジュゲートパッド（２０）とが配置され、コンジュゲートパッド（２０）の下部に、メンブレン（３０）が、メンブレン（３０）の下流側上部に設けた吸収パッド（４０）の下部に至るまで下流側に延伸して配置されている。さらに、メンブレン（３０）の下部にストリップ（Ａ）の全長を支持するパッキングシート（５０）が配置された構成になっている。
サンプルバッド（１０）は、測定対象の試料を滴加する部分であって、例えば、セルロース繊維、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロンなどの均一の特性を有する材質であって、試料を毛細管作用で展開できる材質のもので作製したものがよい。測定対象の試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿等の動物の体液や排泄物を使用することができる。
コンジュゲートパッド（２０）は、標識化抗体を保持するパッドであり、例えば、セルロース繊維、ガラス繊維、不織布などの材質で作製することができる。コンジュゲートパッド（２０）は、上記材質の繊維などに一定量の標識化抗体溶液を滴下又は浸し、乾燥して作製することができる。コンジュゲートパッド（２０）では、サンプルバッド（１０）から毛細管現象で移動してきた試料に含まれる測定対象物質（抗原）が、標識化抗体との抗原抗体反応などにより、標識化抗体−抗原コンジュゲートの形で捕捉され認識される。
コンジュゲートパッド（２０）において、標識化抗体を作成するための標識化物質としては、免疫凝集反応に用いられる着色粒子などが好ましく、例えば、金コロイド、銀コロイドなどの金属コロイドならびにその複合コロイドが好ましい。かかる金属コロイドの平均粒径は、約１〜５００ｎｍ、好ましくは約1〜５０ｎｍが好ましい。着色粒子による抗体の標識化反応は、当該技術分野で慣用されている方法に従って行うことができる。
メンブレン（３０）は、クロマトグラフ担体としての役割を果たすことから、材質としては多孔性担体が好ましく、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布などの材質でシート状に作製するのが好ましい。ただし、メンブレン（３０）の素材は、サンプルバッド（１０）で滴加した測定対象の試料が、コンジュゲートパッド（２０）を経由して毛細管現象で展開移動できる材質であれば、特に限定することなしに用いることができる。
メンブレン（３０）には、展開方向の下流側に検査対象物質の有無（陽性または陰性）を判定するゾーンとしてテストライン（３２）が設けられ、コンジュゲートパッド（２０）に保持された標識化抗体とは異なる抗体が固定化されていて、その標識化抗体を捕捉できるように構成されている。テストライン（３２）に固定化される抗体は、コンジュゲートパッド（２０）に保持された標識化抗体が第１の抗体であれば、第２の抗体が固定化され、逆に、コンジュゲートパッド（２０）に保持された標識化抗体が第２の抗体であれば、第１の抗体が固定化される。
メンブレン（３０）のテストライン（３２）では、固定化された抗体が、コンジュゲートパッド（２０）で捕捉された標識化抗体−抗原複合体と抗原抗体反応により、標識化抗体−抗原−抗体複合体（サンドイッチの形）で捕捉され認識される。この結果、測定試料中に測定対象物質が含まれていると、標識化抗体−抗原−抗体複合体の形で捕捉され認識されることになり、その標識化抗体の標識化物質である着色粒子によって可視化できるようになっている。このように金属コロイドを用いることにより、測定対象の試料中に含まる抗原の有無を可視化できることで簡便な測定を可能になり、現場での測定に極めて有用である。
また、メンブレン（３０）には、コントロールライン（３４）を、テストライン（
３２）の下流側に配設することができる。コントロールライン（３４）には、標識抗体に対する抗体が固定化されていて、標識抗体が抗原抗体反応で捕捉され可視化される。テストライン（３２）が陰性でも、コントロールライン（３４）だけが着色粒子によって可視化されることになる。
吸収パッド（４０）は、添加された試料がクロマトグラフィーにより移動して吸収されるパッドであり、材質としては、ろ紙などの吸収性能が高い材料で作製するのがよい。また、パッキングシート（５０）は、サンプルバッド（１０）の下端から吸収パッド（
４０）までの下端まで延伸してストリップ（Ａ）の全長を支持するように配置されていて、その材質は特に限定されるものではない。
次に、イムノクロマトグラフィーストリップ（Ａ）を用いた測定方法を簡単に説明する。サンプルバッド（１０）に滴下された測定対象物質を含む試料は、展開移動してコンジュゲートパッド（２０）に移動し、そこに風乾されている標識化抗体と抗原抗体反応により複合体を形成する。試料を含む複合体は、メンブレン（３０）をさらに展開移動して、テストライン（３２）に至り、テストライン（３２）に固定化されている固相化抗体と抗原抗体反応により結合して、標識化抗体−抗原−抗体複合体（サンドイッチの形）で捕捉され、金属コロイドなどの標識化物質によって可視化され認識される。したがって、測定試料中に測定物質が含まれている場合には、陽性の判定が下されることになる。反対に、テストライン（３２）が陰性であれば、コントロールライン（３４）だけが着色粒子によって可視化されることになる。試料はさらに展開移動して吸収パッド（４０）で吸収される。
この発明に係る免疫学的測定用キットは、少なくとも、９６ウエルマイクロプレートやイムノクロマトグラフィー用ストリップなどの支持体と、第１の抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３））と、第２の抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２））と、酵素や金属コロイドなどの標識化物質と、から構成するのがよい。
この発明の免疫学的測定用キットをＥＬＩＳＡ法キットとして使用する場合は、支持体として９６ウエルマイクロプレート、標識化物質としてＨＲＰなどを使用する他、ビオチンと、アビジンとＨＲＰ等の酵素複合物と、ＴＭＢ等の色原性基質と、硫酸等の酸などの反応停止液と、から構成するのがよい。
この発明の免疫学的測定用キットをイムノクロマトグラフィー法として使用する場合は、支持体としてイムノクロマトグラフィー用ストリップを用いるのがよい。イムノクロマトグラフィー用ストリップは、そのコンジュゲートパッドには、金属コロイドなどの標識化物質で標識された標識化抗体、例えば、標識化第１の抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３））または標識化第２の抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２））が風乾され、またそのメンブレンのテストラインには、コンジュゲートパッドに風乾された抗体とは異なる抗体、つまり第１の抗体または第２の抗体が固定化されているのが好ましい。また、このイムノクロマトグラフィー法には、イムノクロマトグラフィー用ストリップの他に、試料を展開する展開液も備えられているのが、現場での使用に際して便利である。
以下、この発明を実施例により詳細に説明するが、下記実施例はこの発明を限定する意図で記載されるものでは一切なく、この発明をより具体的に説明するために例示として記載されるものである。したがって、下記実施例により包含される態様は、この発明の範囲に包含されるものである。
［免疫原の作製］
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を作製するために、まず、免疫原を次のようにして作製した。
抗原としてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列３２〜４０番のＮ末端側にシステインを加えた合成ペプチド１（ＣＡＥＳＰＱＡＬＳＥ）とイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列７４〜８２番のＣ末端側にシステインを加えた合成ペプチド２（ＲＳＰＷＤＳＳＤＲＣ）を合成して作製した。次いで、得られた各合成ペプチドをキャリヤー蛋白質（ＫＬＨ：ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）にＩｍｊｅｃｔマレイミド活性化ＫＬＨキット（Pierce Cat#77606）を用いて結合した。つまり、Ｉｍｊｅｃｔマレイミド活性化ｍｃＫＬＨ試薬に精製水を加え１０ｍｇ/ｍｌとして、マレイミド活性化ｍｃＫＬＨ６ｍｇ/ｍｌに、キットの緩衝液で３．０ｍｌに溶解した合成ペプチド３．０ｍｇを加えて、２５℃で２時間反応させた後、生理食塩水に対して４℃で２晩透析し、各７ｍｇの合成ペプチド−ＫＬＨ複合体を得、これを免疫原とした。
なお、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの全アミノ酸配列（９８アミノ酸）は下記の通りである。
［配列番号１］
NPVYGSVSNA DLLDFKNLLD RLEDKMPLED EAESPQALSE QNAEAGAALS PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG ALGRSPWDSS DRSALLKSKL RALLAAPR
分子量はアミノ酸組成より１０４６８。
また、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ測定系の標準品であるイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ合成ペプチド（９８アミノ酸）は下記の通りである。
NPVYGSVSNA DLLDFKNLLD RLEDKMPLED EAESPQALSE QNAEAGAALS PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG ALGRSPWDSS DRSALLKSKL RALLAAPR
参考までに、ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列３２〜４０番はＶＶＰＰＱＶＬＳＥであり、またヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列７４〜８２番はＲＧＰＷＤＳＳＤＲである。
上記のようにして作成した２種類の免疫原を同様な方法で免疫した。ＢＡＬＢ/ｃマウス（日本エスエルシー株式会社製）に、免疫原として１匹あたり１００μgの上記合成ペプチド−ＫＬＨ複合体を腹腔内投与して免疫した。初回免疫後、追加免疫を２週間隔で３回行った。初回および２回目の免疫では、フロイント完全アジュバントと共に投与した。
［モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の作製］
２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株は同様な方法で作製した。つまり、免疫したマウスから最終免疫後３日目に摘出した脾臓細胞（１．１×１０８個）と、マウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３；ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）２．１×１０７個）を、５０％のポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて融合した。融合により得られたハイブリドーマ株を、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地で選択した。細胞融合後１０日目に特異抗体産生ハイブリドーマ株のスクリーニングを行った。スクリーニングはＥＬＩＳＡ法で行った。
ＥＬＩＳＡ法は次のようにして行った。９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに、１０μｇ/ｍｌの合成ペプチド１（ＣＡＥＳＰＱＡＬＳＥ）または合成ペプチド２（ＲＳＰＷＤＳＳＤＲＣ）を含むＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））１００μｌ加えて、４℃で１晩固定した。次に、このウェルを２５％のブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）を含む溶液で１回洗浄した後、この溶液を２００μｌ添加してブロッキングを行った。その後、各ウェルを０．０５%のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、ハイブリドーマ株の培養上清を１００μｌ加えて室温で２時間反応させ、ウェルを３回洗浄した。続いて、１μｇ/ｍｌのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを含むＰＢＳを１００μｌ加え、室温で２時間反応させた。このウェルを３回洗浄後、ＴＭＢ（3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン）（Ｄａｋｏ社製）を１００μｌ加えて室温で２０分間の酵素反応を行い、１Ｍ硫酸溶液を１００μl加えて反応を停止した。その後、各ウェルについて、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）で主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。
さらに、特異抗体の産生が陽性を示したウェル中のハイブリドーマ株を、限界希釈法により３回クローニングして、上記合成ペプチド１および合成ペプチド２をそれぞれ認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株１および２を得た。この得られたハイブリドーマ株１および２の培養上清を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Mouse monoclonal antibody isotyping Test kit、Serotec社）を用いて、ハイブリドーマ株１および２が産生する抗体のサブクラスをそれぞれ決定した。その結果、新たに得られたモノクローナル抗体は次の通りであった。
ハイブリドーマ株１のクローン番号：２Ｅ３、アイソタイプ：ＩｇＧ１（κ）
ハイブリドーマ株２のクローン番号：３Ｄ２、アイソタイプ：ＩｇＧ１（κ）
これらのモノクローナル抗体２Ｅ３と３Ｄ２の、各ペプチドとの反応性を上記ＥＬＩＳＡ法により確認した結果、モノクローナル抗体２Ｅ３は合成ペプチド１と反応するが、合成ペプチド２とは反応しないことが、また逆に、モノクローナル抗体３Ｄ２は合成ペプチド２と反応するが、合成ペプチド１とは反応しないことが確認された。このように、２Ｅ３抗体は合成ペプチド１を認識し、３Ｄ２抗体は合成ペプチド２に含まれる部分を認識することより、２つの抗体が両ペプチドを含む物質（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）の異なる部分を認識していることが確認された。
モノクローナル抗体１を産生するハイブリドーマ株（クローン番号：２Ｅ３）は、２０１２年５月９日付けで、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１８として寄託されている。また、モノクローナル抗体２を産生するハイブリドーマ株（クローン番号：３Ｄ２）は、２０１２年５月９日付けで、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１９として寄託されている。
［免疫学的測定手順］
９６ウエルプレートの各ウエルに抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（クローン番号：２Ｅ３）を常法に従って固相化した後、洗浄液３００μｌ／ウエルで３回洗浄した。次に、希釈検体（血漿１０μｌを５倍希釈した検体）または標準溶液（安定剤を含むイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ合成ペプチド）を５０μｌ／ウエル添加した後、プレートを室温、８００ｒｐｍで１０秒間３回撹拌し、２時間静置し、洗浄液３００μｌ／ウエルで３回洗浄した。洗浄後、各ウエルに、ビオチン標識抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（クローン番号：３Ｄ２）を５０μｌ／ウエルずつ添加し、室温、８００ｒｐｍで１０秒間３回撹拌し、２時間静置した。静置後、洗浄液３００μｌ／ウエルで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ・アビジン結合物を５０μｌ／ウエル添加し、室温、８００ｒｐｍで１０秒間３回撹拌し、３０分間静置した。静置後、ＴＭＢ（３、
３′、５、５′―テトラメチルベンジジン）５０μｌ／ウエルを添加し、室温、８００ｒｐｍで１０秒間３回撹拌し、３０分間静置した。その後、１Ｍ硫酸を５０μｌ／ウエル添加して反応を停止させ、撹拌した後、吸光度（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）を測定した。
実施例２に記載した免疫学的測定手順に従って、健常犬および僧帽弁閉鎖不全症犬から採取した検体についてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定した結果を表１および表２にそれぞれ示す。本実施例では、ブリーダー２施設の９〜１２ヶ月齢のビーグル犬からＥＤＴＡ−２Ｎａ（最終濃度１．０〜１．５ｍｇ／ｍｌ）とアプロチニン（最終濃度１００〜５００ＫＩＵ／ｍｌ、ＫＩＵ：Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｕｎｉｔ）を用いた採血条件で採血した検体を健常犬の検体として用いた。また、本実施例では、獣医病院Ａで僧帽弁閉鎖不全症犬（ＭＲ）に診断された４〜１３歳の犬種（キャバリア、チワワ、シーズ、スピッツ、ビーグル、ヨーキー）からＥＤＴＡ−２Ｎａ（最終濃度１．０〜１．５ｍｇ／ｍｌ）とアプロチニン（最終濃度１００〜５００ＫＩＵ／ｍｌ）を用いた採血条件で採血した検体を僧帽弁閉鎖不全症犬（ＭＲ）の検体として用いた。
上記測定結果から、僧帽弁閉鎖不全症犬（ＭＲ）のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値は、ｔ検定によりｐ＜０．０１で健常犬ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値と有意である。
実施例２に記載した免疫学的測定手順に従って、獣医病院Ａでフィラリア症犬から採取した検体についてイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定した結果を表３に示す。本実施例では、獣医病院Ａでフィラリア症に診断された８〜１４歳の犬種（スピッツ、ラブラドール、雑種、ゴールデンレトリバー）から実施例３の採血条件で採血した検体をフィラリア症犬（ＨＷＤ）の検体として用いた。
上記測定結果から、フィラリア症犬（ＨＷＤ）のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値は、ｔ検定によりｐ＜０．０１で健常犬ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値と有意である。この測定結果は、フィラリア症などの心臓に寄生する感染症自体の罹患の可否の診断にも有用であることを示している。
International Small Animal Cardiac Health Council （ＩＳＡＣＨＣ １９９２）によ
るイヌ心疾患の程度の分類法により獣医病院ＢでＩＳＡＣＨＣ分類 １ｂ、２に診断された心疾患犬から実施例３と同様の採取条件で採血した検体を実施例２に記載した免疫学的測定手順に従ってイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰを測定した結果を表４に示す。
（測定結果）
表２で示した僧帽弁閉鎖不全症犬（ＭＲ）のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値と、表３で示したフィラリア症犬（ＨＷＤ）のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ値を合わせた心疾患犬測定結果の合計の平均値は５９５ｐｇ/ｍｌ、ＳＤ値は１７５ｐｇ/ｍｌ、ＳＥ値は３７ｐｇ/ｍｌであった。
さらに、表２で示した僧帽弁閉鎖不全症犬（ＭＲ）、表３で示したフィラリア症犬（ＨＷＤ）および表４で示した心疾患クラス別（ＩＳＡＣＨＣ分類１ｂ、２）測定結果を合わせた全心疾患検体測定結果の合計の平均値は５５１ｐｇ/ｍｌ、ＳＤ値は１９５ｐｇ/ｍｌ、ＳＥ値は３４ｐｇ/ｍｌであった。
この結果から、健常犬のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ測定値の２ＳＤ値（５５．２ｐｇ/ｍｌ）＋平均値（７１．１ｐｇ/ｍｌ）を健常犬範囲（１２６．３ｐｇ/ｍｌ）とすると、この発明に係るイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの免疫学的測定方法は、イヌの健康診断（僧房弁閉鎖不全症ならびに心臓に寄生する感染症）として有用である。
本実施例では、市販品［ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１−９８）ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ、
商品名「ｐｒｏＡＮＰ（１−９８）」ＢＩＯ ＭＥＤＩＣＡ製］を用いて、イヌの検体を調べた結果を示す。
実施例３に記載した採血条件に従って、健常犬および心疾患犬から採取した検体について実施例２に記載した免疫学的測定手順に従って測定した結果と市販品による測定した結果を表５にそれぞれ示す。
表中、Ｎ．Ｄは、検出限界以下（６．５９ｎｇ／ｍｌ以下＝０．６３ｎｍｏｌ/Ｌ以
下）を意味する。
＊は、１２検体中１検体測定を意味する。なお、凍結融解１回時は１．０１ｎｍｏｌ
/Ｌ、凍結融解２回時は０．９７１ｎｍｏｌ/Ｌであった。
本実施例では、ブリーダー１施設の９〜１２ヶ月齢雄のビーグル犬から採血した検体を健常犬の検体として、また、獣医病院Ａで心疾患（僧房弁閉鎖不全症：１１個体、僧房弁閉鎖不全症以外の心疾患：１個体）と診断された７〜１５歳の犬種（ミニチュアダックスフント、雑種、ヨーキー、シーズー、キャバリア、ヨークシャーテリア、マルチーズ、ウエルッシュコーギー、スピッツ）から採血した検体を心疾患犬の検体として用いた。
本実施例では、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（本発明）については、実施例２の免疫学的測定方法に従って測定した。測定範囲は、１２．５〜４００ｐｇ/ｍｌ＝１.１９〜３８．２ｐｍｏｌ/Ｌであった。
一方、市販品の測定範囲は、０．６３〜１０ｎｍｏｌ/Ｌ＝６．５９〜１０４．７ｎｇ/ｍｌであった（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの分子量は１０４６７で計算）。また、抗体としては羊由来ポリクローナル抗体、標準品としてはヒトｐｒｏＡＮＰ(１−９８)＝ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ(１−９８)合成ペプチドを使用して、ポリクローナル抗体とポリクローナル抗体のサンドイッチ法により測定した。なお、特異性は、ヒトｐｒｏＡＮＰ（１〜３０）＜１％、ヒトｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）＜１％、ヒトｐｒｏＡＮＰ（７９〜９８）＜１％、ＡＮＰ＜１％であった。また、ヒト検体の中央値は１．４５ｎｍｏｌ/Ｌ（血漿参考値）であった。
それぞれの検体は、前処理（保管条件による確認試験）を行った。凍結融解１回目は、入手した状態で−３５℃に保管し、測定時に融解した。凍結融解２回目は、輸送条件による凍結融解並びに再検査時の測定値による影響確認試験として行った。検体入手（−３５℃凍結）→室温融解（２２．８℃）３０分間→４℃１８時間保管→凍結（−３５℃）→融解→測定。
（測定結果）
この発明に係るイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴで測定した結果は、測定範囲が、１２．５〜４００ｐｇ/ｍｌ＝１．１９〜３８．２ｐｍｏｌ/Ｌであった。
これに対して、市販品で測定した結果では、１検体のみ測定範囲に入り、定量値を得たが、その他の全ての検体は、検量線範囲外（低値）であった。キット標準品には、ヒトｐｒｏＡＮＰ（１−９８）（ヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（１−９８））合成品が添付されており、その測定範囲は、０．６３〜１０ｎｍｏｌ／Ｌ（ヒト血漿参考値：NT-pro ANPの中央値は１．４５ｎｍｏｌ／Ｌ) であり、測定範囲（重量換算）は６．５９〜１０４．７ｎｇ／ｍｌであった。
市販品の測定範囲は、本発明のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴの測定範囲よりも約２６０〜５２０倍高濃度の測定範囲となっている。
上記の試験結果から、本発明のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴでの、
イヌ検体を凍結融解２回までは再現性がある結果が得られた。文献（Inge T. The Veterinary Journal 180, 195-201, 2009）によれば、市販品のBio Medica社製によるコントロール犬測定平均値は２４６ｐｍｏｌ／Ｌ（２５７０ｐｇ/ｍｌ）を示している。 つまり、現在市販されているBio Medica社製の測定範囲（０．６３ 〜１０ｎｍｏｌ/Ｌ）（ヒト検体中央値は１．４５ｎｍｏｌ/Ｌ）では、健常イヌ検体は検出限界以下となる。上述の測定結果でも、同様に、健常イヌ検体は検出限界以下となっている。また、この発明のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ ＥＬＩＳＡにより健常犬検体（EDTA・アプロチ二ン含有）を測定した平均値（７１ｐｇ/ｍｌ）よりも約３６倍の高濃度を示した。これらのことは、市販品のヒトｐｒｏＡＮＰ（１−９８）を認識する羊由来ポリクローナル抗体がイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰに対する特異性・反応性に適合していないことが考えられる。そこで、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ特異抗体と標準品によるイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ専用測定系が必要であることが示されている。
本実施例は、イムノクロマトグラフィー法による免疫学的測定方法に関するものである。
［材料の調製］
（金コロイド懸濁液）
金コロイド懸濁液は、金コロイド（株式会社ワインレッドケミカル）を１０ｍＭトリス緩衝液（和光純薬工業社製、ｐＨ８．６）で２倍に希釈して調製した。
（抗体溶液）
抗体溶液は、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２）を、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．６）で０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製して作製した。
（１％ＢＳＡ−ＰＥＧ混合液）
１％ＢＳＡ−ＰＥＧ混合液は、ＢＳＡ１ｇを１０ｍＭトリス 緩衝液（ｐＨ８．６）で溶解後、１００ｍｌにメスアップして、１％ＢＳＡ−１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．６）を作製し、得られた１％ＢＳＡ−１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．６、４．５ｍｌ）に１％ＰＥＧ溶液（ＰＥＧ４０００、和光純薬工業社製）０．５ｍｌを混和して作製した。
（標識金コロイド保存液）
５％Ｄ（＋）トレハロースニ水和物（和光純薬工業社製）５ｇを精製水で溶解後、１００ｍｌにメスアップして、５％Ｄ（＋）トレハロースニ水和物溶液を作製した。得られたトレハロースニ水和物溶液にＢＳＡ１ｇを溶解後、１００ｍｌにメスアップして、１％ＢＳＡ−５％Ｄ（＋）トレハロースニ水和物溶液として作製して、標識金コロイド保存液とした。
（検体泳動用緩衝液）
カゼインナトリウム（和光純薬工業社製）２．５ｇを１０ｍＭトリス 緩衝液（ｐＨ８．６）で溶解後、１００ｍｌにメスアップして、２．５％カゼインナトリウム−１０ｍＭトリス 緩衝液（ｐＨ８．６）作製して、検体泳動用緩衝液とした。
［標識反応］
上記で調製した金コロイド懸濁液１００μｌと抗体（クローン＃３Ｄ２）溶液１００μｌを混合し、０．５ｍｌシリコナイズチューブに入れボルテックスミキサーで混合し、１５分間静置した。この懸濁液に１％ＢＳＡ−ＰＥＧ混合液２００μｌを加え、ボルテックスミキサーで混合し、１５分間静置した。続いて、この懸濁液を４℃、８０００ｇで３分間遠心分離操作をした後、上清を取り除いた。さらに、この溶液に１％ＢＳＡ−ＰＥＧ混合液２００μｌを加え、ボルテックスミキサーで分散し、１５分間静置した後、４℃、８０００ｇで３分間遠心分離操作をして、上清を取り除いた。このように調製した溶液に標識金コロイド保存液１００μｌを添加して分散した。なお、金コロイドおよび、他の試薬ならびに溶液は２〜８℃で保存した。
［イムノクロマトグラフィーストリップの材料の調製］
（コンジュゲートパット）
コンジュゲートパットは、グラスファイバー（ミリポア社製、Glass Fiber Conjugate Pad）を用いて、その先端部に金コロイド標織抗体溶液５０μｌを 塗布した後、室温で乾燥して作製した。
（抗体固相化メンブレン）
抗体固相化メンブレンの材料としては、メンブレン（ミリポア社製、Hi Flow Plus HFB09004）を使用した。
（ＩｇＧ希釈液）
カゼイン１０ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（和光純薬工業社製、ｐＨ７．４)５ｍｌと混和して作製した。
（抗体固相化抗体）
抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３）をＩｇＧ希釈液１００μｇ／ｍｌで希釈して調製した。
（ブロツキング液）
カゼイン ０．５ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解後、１００ｍｌにメスアップして、０．５％カゼイン・２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を作製してブロッキング液とした。
（スクロース液）
スクロース（和光純薬工業社製）３ｇを０．３％コール酸溶液（和光純薬工業社製）で溶解後、１００ｍｌにメスアップして、３％スクロース・０．３％コール酸溶液を作製してスクロース液とした。
（その他材料）
サンプルパットとしては Cellulose Fiber Sample Pad（ミリポア社製）、吸収パットとしてはAbsobet Pad （ミリポア社製）、パッキングシートとしてはニップンエンジニアリング（株）の製品を使用した。
［イムノクロマトグラフィーストリップの作製方法］
本実施例で使用したイムノクロマトグラフィーストリップは、上記で調製したイムノクロマトグラフィーストリップの材料を用いて作製した。まず、コンジュゲートパッド（２０）に金コロイド標識抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２）５０μｌを先端に塗布し、室温で乾燥させた。次に、メンブレン上のテストラインの位置に、固相化抗体として、抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３）（１００μｇ／ｍｌ）（６μｌ）を１ｍｍ幅で塗布後、室温で６０分間乾燥した。次に、メンブレンをブロツキング液に浸し、２０分間穏やかに振とうした後、精製水に浸して５分間穏やかに振とうした（２回）。続いて、メンブレンをスクロース液に浸して１０分間穏やかに振とう後、メンブレン表面の余分な水分を吸い取り、室温で乾燥することによって、イムノクロマトグラフィーメンブレン（３０）を作製した。このイムノクロマトグラフィーメンブレンを用いて、図３および図４に示す模式図のようにイムノクロマトグラフィーストリップ（Ａ）を作製した。
［測定方法］
上記イムノクロマトグラフィーストリップ（Ａ）のサンプルパット（１０）にイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（０．５μｇ/０．５ｍｌ、検体泳動用緩衝液）を添加した。これにより、コンジュゲートパッド（２０）に風乾された金コロイド標識抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２）を、サンプルパット（１０）から展開してきた検体泳動用緩衝液中のイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰと抗原抗体反応により結合させた。さらに、検体泳動用緩衝液は、イムノクロマトグラフィーメンブレン（３０）中を展開してテストライン（３２）に到達すると、そのテストラインに固定化された抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３）を、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ−金コロイド標識抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体複合体と抗原抗体反応により結合させたところ、テストラインにバンドが形成したのを確認した。
［測定結果］
上記簡易テストの結果は、図５に示すように、イムノクロマトグラフィーストリップのテストラインにイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのバンドを確認した。
この発明に係る抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体ならびにこの抗体を使用したイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの免疫学的測定方法は、例えば、犬や猫などの伴侶動物の僧帽弁閉鎖不全症、心不全等の心疾患、ならびにフィラリア症等の感染症の検査法として有用である。
Ａ イムノクロマトグラフィーストリップ
１０ サンプルパット
２０ コンジュゲートパッド
３０ イムノクロマトグラフィーメンブレン
３２ テストライン
３４ コントロールライン
４０ 吸収パッド

Claims (21)

  1. イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）のヒトＮＴ−ｐｒｏＡＮＰのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列部位を認識することを特徴とする抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体）。
  2. 請求項１に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体であって、イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ、アミノ酸９８残基）の３１〜６７番のアミノ酸配列の１部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体またはイヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰの６８〜９８番のアミノ酸配列の1部もしくは全部を認識する抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体からなる抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体。
  3. 請求項１または２に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体であって、前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体が、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列の３２〜４０番（配列番号２：ＡＥＳＰＱＡＬＳＥ）を認識すること、および前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体が、イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰアミノ酸配列の７４〜８２番（配列番号３：ＲＳＰＷＤＳＳＤＲ）を認識することを特徴とする抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体。
  4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体であって、前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体を産生するハイブリドーマ株のクローン番号が２Ｅ３（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１８）であること、および前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体を産生するハイブリドーマ株のクローン番号が３Ｄ２（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３１９）であることを特徴とする抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体。
  5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体であって、前記抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体。
  6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体であって、前記抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体。
  7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体）を用いてイヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ）を測定することを特徴とする免疫学的測定方法。
  8. 請求項７に記載の免疫学的測定方法であって、イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチドを含む検体を前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体（第１の抗体）と接触させる工程、および前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ抗体（第１の抗体）と異なる前記イヌＮ末端プロ心房性利尿ぺプチドを認識した標識抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体（第２の抗体）に結合させて、前記イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチドを測定することを特徴とする免疫学的測定方法。
  9. 請求項７または８に記載の免疫学的測定方法であって、前記第１の抗体が前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体または前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体であること、および前記第２の抗体が前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体または前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体であること、ただし前記第１の抗体は前記第２の抗体と同じであっても、異なっていてもよいことを特徴とする免疫学的測定方法。
  10. 請求項７ないし９のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法であって、前記第１の抗体が前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体であり、前記第２の抗体が前記抗イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体であることを特徴とする免疫学的測定方法。
  11. 請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法であって、前記第１の抗体および前記第２の抗体はいずれもモノクローナル抗体であることを特徴とする免疫学的測定方法。
  12. 請求項７ないし１１のいずれか１項に記載する免疫学的測定方法であって、前記検体が、体液、血液、血清またはＥＤＴＡもしくはアプロチニンを含有していてもよい血漿からなる検体であることを特徴とする免疫学的測定方法。
  13. 請求項１２に記載する免疫学的測定方法であって、前記検体が、血漿（ヘパリン・ＥＤＴＡ・クエン酸）にアプロチニンを含む検体であることを特徴とする免疫学的測定方法。
  14. 請求項７ないし１３のいずれか１項に記載する免疫学的測定方法であって、前記免疫学的測定方法が、酵素測定法、蛍光測定法、化学発光法、放射能測定法、ラテックス法および散乱光法から選ばれるサンドイッチ測定法であることを特徴とする免疫学的測定方法。
  15. 請求項７ないし１４のいずれか１項に記載するイヌ検体免疫学的測定方法であって、前記アビジンに標識する物質が、酵素物質、蛍光物質、化学物質、生物発光物質またはラジオアイソトープであることを特徴とするイヌ検体免疫学的測定方法。
  16. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗イヌＮ末端プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド抗体および請求項７ないし１５のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法を用いてイヌ心疾患またはイヌ心臓に寄生する感染症を検出する検出方法。
  17. 請求項１６に記載の検出方法であって、前記イヌ心疾患が僧帽弁閉鎖不全症もしくは心不全症であること、および前記感染症がイヌフィラリア症であることを特徴とする検査方法。
  18. 少なくとも、支持体と、第１の抗体（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３））と、第２の抗体（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２））と、標識化物質と、からなることを特徴とする免疫学的測定用キット。
  19. 請求項１８に記載する免疫学的測定用キットであって、前記支持体が、９６ウエルマイクロプレートまたはイムノクロマトグラフィーストリップであり、前記標識化物質が酵素または金属コロイドであることを特徴とする免疫学的測定用キット。
  20. 請求項１８または１９に記載する免疫学的測定用キットであって、前記免疫学的測定用キットが、９６ウエルマイクロプレートと、ビオチンと、アビジンと西洋わさび由来パーオキシダーゼ複合物と、色原性基質と、反応停止液と、からなることを特徴とする免疫学的測定用キット。
  21. 請求項１８または１９に記載する免疫学的測定用キットであって、前記支持体がイムノクロマトグラフィーストリップからなり、該イムノクロマトグラフィーストリップのコンジュゲートパッドには、金属コロイドで標識された標識化第１の抗体（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（３１〜６７）抗体（２Ｅ３））または標識化第２の抗体（イヌＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ（６８〜９８）抗体（３Ｄ２））が含まれ、またテストラインには、コンジュゲートパッドに含まれた抗体とは異なる抗体、つまり第１の抗体または第２の抗体が固定化されていることを特徴とする免疫学的測定用キット。
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