JP2014209090A - 細胞分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞が保存された保存液の保存温度の違いに起因する光学情報のばらつきを抑制することができる、細胞分析方法を提供する。【解決手段】細胞分析方法は、細胞が保存されている保存液を、所定の温度に調整する温度調整工程と、温度調整工程で温度調整された保存液に保存されていた細胞に光を照射して光学情報を取得する測定工程と、を含む。【選択図】図４

Description

本発明は、生体から採取された細胞を分析する細胞分析方法及び装置に関する。

従来、細胞のＤＮＡ量を自動的に分析し、そのＤＮＡ量に基づいて細胞の癌化に関する情報を提供する分析装置が知られている。
例えば、下記特許文献１には、被験者から採取した細胞にＰＩ染色等の処理を施して測定試料を調製し、調製した測定試料をフローセルに流し、当該フローセルを流れる測定試料に光を照射することで個々の細胞について蛍光信号や散乱光信号を取得し、各信号の波形を解析することによりＤＮＡ量や核の大きさ、細胞の大きさ等を反映した特徴パラメータを抽出し、その特徴パラメータを用いて細胞の癌化・異型化を判別する細胞分析装置が開示されている。
また、下記特許文献２には、細胞が保存された、アルコールを含む保存液を収容する生体容器を細胞分析装置にセットし、当該装置内で生体容器内の保存液を希釈液に置換した後にＰＩ染色処理等を行い、フローセルに流すための測定試料を調製することが記載されている。

特開２００９−１０３６８７号公報 特開２０１２−６８１０８号公報

特許文献２では、分析される細胞がアルコールを含む保存液に保存されている。このように、保存液に細胞が保存される場合、細胞が保存された保存液の保存温度は、病院や検査施設によって様々であり、室温で保存される場合もあれば冷蔵保存される場合もある。また、細胞を病院から検査センター等に輸送する場合には、輸送環境によって保存温度が変動する場合がある。このように保存液の保存温度は保存条件や輸送条件等によって異なっている。

本出願の発明者が、細胞が保存された保存液を、特許文献２記載のような細胞分析装置に供給して細胞の分析を行ったところ、保存液の保存温度の違いによって、測定される光学情報（蛍光情報や散乱光情報）にばらつきが生じることが分かった。

本発明は、上記の課題を解決する目的でなされたものであり、細胞が保存された保存液の保存温度の違いに起因する光学情報のばらつきを抑制することができる、細胞分析方法及び装置を提供することを目的とする。

本出願の発明者は、細胞が保存された保存液の保存温度と細胞分析装置で取得される光学情報との関係について鋭意研究を重ねた結果、細胞分析装置に供給された細胞が保存された保存液を所定の温度に調整することによって、その保存液に保存されていた細胞が細胞分析装置に供給された際に取得される光学情報のばらつきを抑制できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の観点による細胞分析方法は、細胞が保存されている保存液を、所定の温度に調整する温度調整工程と、前記温度調整工程で温度調整された保存液に保存されていた細胞に光を照射して光学情報を取得する測定工程と、を含んでいる。
本発明の細胞分析方法によれば、保存液を所定の温度に調整する工程を含むことによって、保存液の保存温度に関わらず、測定工程で取得される光学情報のばらつきを好適に抑制することができる。したがって、この光学情報を用いたその後の処理においても保存液の保存温度の影響を排除した正確な結果を得ることが可能となる。

本発明の細胞分析方法は、前記温度調整工程により温度調整された保存液を希釈液に置換することで、測定試料を調製する測定試料調製工程をさらに含んでいてもよい。
前記光学情報は、散乱光情報を含んでいてもよい。この場合、細胞分析方法は、前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、前記情報取得工程は、前記散乱光情報に基づいて、前記細胞情報として細胞の大きさに関する情報を取得する工程を含むものであってもよい。
この場合、細胞分析方法は、光学情報である散乱光情報のばらつきを抑制することができるので、この散乱光情報に基づいて取得される細胞の大きさに関する情報のばらつきも抑制することができる。

前記測定試料調製工程は、さらに染色試薬を用いて、前記測定試料を調製するものであってもよい。この場合、染色試薬は、核酸染色色素を含んでいてもよい。このように核酸染色色素を用いて測定試料を調製することで、細胞核やその内部（核酸）に関する情報を取得し得る。
また、前記測定試料調製工程は、前記測定試料を所定の温度に調整するものであってもよい。これにより、染色試薬と細胞との反応を促進することができる。

前記光学情報は、蛍光情報を含んでいてもよい。この場合、前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、前記情報取得工程は、前記蛍光情報に基づいて、前記細胞情報としてＤＮＡ量及び細胞核の大きさの少なくとも一方に関する情報を取得する工程を含むことが好ましい。
この場合、細胞分析方法は、光学情報である蛍光情報のばらつきを抑制することができるので、この蛍光情報に基づいて取得されるＤＮＡ量及び細胞核の大きさに関する情報のばらつきも抑制することができる。

本発明の細胞分析方法は、前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、前記情報取得工程は、前記細胞情報として細胞の癌化に関する情報を取得する工程を含んでいてもよい。
この場合、細胞分析方法は、光学情報のばらつきを抑制することができるので、この光学情報に基づいて取得される細胞の癌化に関する情報のばらつきも抑制することができる。
前記保存液は、アルコールを含んでいてもよい。

本発明の第２の観点による細胞分析装置は、細胞が保存されている保存液を、所定の温度に調整する温度調整部と、前記温度調整部により温度調整された保存液を希釈液に置換することで、測定試料を調製する測定試料調製部と、前記測定試料調製部により調製された測定試料に含まれる細胞に光を照射して光学情報を取得する測定部と、を備えている。

このように保存液を所定の温度に調整する温度調整部を備えることによって、細胞分析装置に供給される保存液の保存温度に関わらず、測定部で取得される光学情報のばらつきを好適に抑制することができる。したがって、この光学情報を用いたその後の処理においても前記保存温度の影響を受けない正確な結果を得ることが可能となる。

前記光学情報は、散乱光情報を含んでいてもよい。この場合、細胞分析装置は、前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、前記情報処理部は、前記散乱光情報に基づいて、前記細胞情報として細胞の大きさに関する情報を取得するものであってもよい。
この場合、細胞分析装置は、光学情報である散乱光情報のばらつきを抑制することができるので、この散乱光情報に基づいて取得される細胞の大きさに関する情報のばらつきも抑制することができる。

前記測定試料調製部は、染色試薬を用いて、前記測定試料を調製するものであってもよい。この場合、染色試薬は、核酸染色色素を含んでいてもよい。このように核酸染色色素を用いて測定試料を調製することで、細胞核やその内部の核酸に関する情報を取得し得る。
また、前記測定試料調製部は、前記測定試料を所定の温度に調整するものであってもよい。これにより、染色試薬と細胞との反応を促進することができる。

前記光学情報は、蛍光情報を含んでいてもよい。この場合、前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、前記情報処理部は、前記蛍光情報に基づいて、前記細胞情報としてＤＮＡ量及び細胞核の大きさの少なくとも一方に関する情報を取得することが好ましい。
この場合、細胞分析装置は、光学情報である蛍光情報のばらつきを抑制することができるので、この蛍光情報に基づいて取得されるＤＮＡ量及び細胞核の大きさに関する情報のばらつきも抑制することができる。

細胞分析装置は、前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、前記情報処理部は、前記細胞情報として細胞の癌化に関する情報を取得するものであってもよい。
本発明の細胞分析装置は、光学情報のばらつきを抑制することができるので、この光学情報に基づいて取得される細胞の癌化に関する情報のばらつきも抑制することができる。

本発明によれば、細胞が保存された保存液の保存温度の違いに起因する光学情報のばらつきを抑制することができる。

本発明の一実施の形態に係る細胞分析装置の全体構成を示す斜視図である。 細胞分析装置における測定装置の内部の構成を模式的に示す説明図である。 フローサイトメータの構成を示す説明図である。 細胞分析装置の動作手順を示すフローチャートである。 （ａ）は、本測定において得られる前方散乱光信号（ＦＳＣ）と側方蛍光信号（ＳＦＬ）を説明する図、（ｂ）は、子宮頸部の上皮細胞の拡大断面を模式的に示す図、（ｃ）は、Ｎ／Ｃ比と細胞の大きさとの関係を示すグラフである。 （ａ）は、細胞周期におけるＤＮＡ量と細胞数との関係を示す説明図、（ｂ）は細胞周期毎に変化するＤＮＡ量を示す図である。 Ｎ／Ｃ比と細胞幅（細胞の大きさ）との関係を示すスキャッタグラムである。 ＤＮＡ量と細胞数との関係を示すヒストグラムである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−１の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−２の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−３の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−４の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−５の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−６の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験１−７の結果を示すグラフである。 子宮頸部の上皮細胞に関する実験２の結果を示すグラフである。 口腔粘膜の上皮細胞に関する実験３−１の結果を示すグラフである。 口腔粘膜の上皮細胞に関する実験３−２の結果を示すグラフである。 口腔粘膜の上皮細胞に関する実験３−３の結果を示すグラフである。

図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞分析装置の全体構成を示す斜視図である。
本実施の形態の細胞分析装置１は、患者（被験者）から採取した細胞（生体試料）を含む測定試料をフローセルに流し、フローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの光（前方散乱光、側方散乱光、側方蛍光）を検出してその光信号を分析することにより、癌化又はその過程にある細胞（以下、これらをまとめて「癌化細胞」ともいう）が含まれているか否かを判定する。より具体的には、細胞分析装置１は、患者から採取した子宮頸部の上皮細胞を用いて子宮頸癌をスクリーニングするために用いられる。

図１に示されるように、細胞分析装置１は、患者から採取した生体試料の測定等を行う測定装置２と、この測定装置２に接続され、測定結果の分析及び表示（出力）等を行うデータ処理装置３とを備えている。測定装置２の前面には、患者から採取した生体試料（細胞）が保存された、メタノールを主成分とする保存液を収容する試料容器４（図２参照）を複数セットするための検体セット部２ａが設置されている。データ処理装置３は、入力部３１と表示部３２と制御部３３とを備えている。

［測定装置２の構成］
図２は、細胞分析装置における測定装置の内部の構成を模式的に示す説明図である。
図２に示されるように、検体セット部２ａは、試料容器４が複数セットされたラック４ａを、検体ピペット部１１による試料の吸引位置まで順次搬送する。
検体ピペット部１１は、試料容器４内の試料を温度調整部１０に移送する。また、検体ピペット部１１は、温度調整部１０内の試料を第１分散部１２に移送する。さらに、検体ピペット部１１は、第１分散部１２内の試料を、副検出部１３と弁別・置換部１４とに移送する。また、検体ピペット部１１は、弁別・置換部１４において濃縮された濃縮液を測定試料容器５に供給する。検体ピペット部１１は、温度調整部１０と、第１分散部１２の試料収容部１２ａと、副検出部１３の試料取込部１３ａと、弁別・置換部１４と、試料受渡部１１ｂに位置付けられた測定試料容器５との上方位置へ移動可能に構成されている。

検体ピペット部１１は、試料の吸引及び吐出を行うピペット１１ａを有し、図示しない検体定量部（定量シリンダ、定量シリンダ内のピストンを駆動するモータ等）により試料を定量して所定量の試料を上記した各部に供給することが可能なように構成されている。
温度調整部１０は、検体セット部２ａの試料容器４から移送された保存液を所定の温度に調整する。具体的に、温度調整部１０は、温度調整用の試料容器がセットされる試料セット部１０ａを備え、この試料セット部１０ａ内の試料容器を加温することによってその内部の保存液の温度を調整するように構成されている。

第１分散部１２は、試料に含まれる凝集細胞を分散させるための第１分散処理を試料に実行する。具体的には、第１分散処理は、凝集細胞にせん断力を付与して分散するせん断力付与処理である。第１分散部１２は、試料を収容可能な試料収容部１２ａを含み、試料収容部１２ａに供給された試料中の凝集細胞に対して機械的にせん断力を付与するように構成されている。

副検出部１３は、主検出部２２による本測定の前に試料の濃度測定を行う。副検出部
１３は、後述する主検出部２２とほぼ同じ構成のフローサイトメータ４０（図３（ａ）参照）を採用している。
弁別・置換部１４は、第１分散部１２による第１分散処理後の試料を受け入れ、試料に含まれるメタノールを主成分とする保存液を希釈液で置換（希釈）する。具体的には、液体は通すが細胞は通さないフィルタによって試料に含まれるメタノールを主成分とする保存液を所定の程度除去し、緩衝液を添加する。これにより保存液中のメタノールによる、後述するＤＮＡの染色への影響が小さくなるため、良好に測定対象細胞のＤＮＡを染色することができる。さらに、弁別・置換部１４は、試料に含まれる測定対象細胞（被験者から採取された子宮頸部の上皮細胞）と、それ以外の細胞（赤血球、白血球、細菌など）及び夾雑物とを弁別する。さらに、弁別・置換部１４は、主検出部２２による測定に必要な細胞測定数を得るために、試料に含有される測定対象細胞の濃縮を行う。弁別・置換部１４は、処理の効率化のために２つ設けられている。

容器移送部１５は、反応部１８にセットされた測定試料容器５を、はさみ状の把持部１５ａにより把持して、試料受渡部１１ｂと、第２分散部１６と、液体除去部１７と、反応部１８とに移送する。容器移送部１５は、所定の円周状軌跡に沿って把持部１５ａを移動させるように構成されている。容器移送部１５はまた、把持部１５ａを上下方向に移動させることが可能なように構成されている。試料受渡部１１ｂと、第２分散部１６と、液体除去部１７と、反応部１８とは、この円周状軌跡上に配置されている。これにより、反応部１８にセットされた測定試料容器５を、容器移送部１５の把持部１５ａにより把持して、円周状軌跡上の各部に移送することが可能となる。

第２分散部１６は、第１分散部１２による第１分散処理が実行された試料に対して、第１分散処理とは異なる第２分散処理を実行する。具体的には、第２分散部１６は、第１分散部１２による第１分散処理が実行され、弁別・置換部１４において濃縮された（測定対象細胞の濃度が高められた）試料に超音波振動を付与するように構成されている。第２分散部１６により、第１分散処理の後に残存する凝集細胞が単一細胞に分散される。

液体除去部１７は、第２分散部１６による第２分散処理の後、測定試料容器５の外表面に付着した液分を除去（水切り）する。第２分散処理は、測定試料容器５が液体中に漬けられた状態で実行される。液体除去部１７は、測定試料容器５の外表面に空気流を供給することにより、測定試料容器５の外表面に付着した水滴を除去するように構成されている。これにより、測定試料容器５が反応部１８などの各部にセットされたときに、液体の各部への付着が防止される。

反応部１８は、測定試料容器５内の試料と、第１試薬添加部１９及び第２試薬添加部２０により添加される試薬との反応を促進させる。反応部１８は、図示しない駆動部により回転可能に構成された円形の回転テーブル１８ａを備えている。回転テーブル１８ａの外周縁部には、測定試料容器５をセット可能な複数の保持部１８ｂが設けられている。この保持部１８ｂに、測定試料容器５がセットされる。回転テーブル１８ａの回転による保持部１８ｂの軌跡と、容器移送部１５の把持部１５ａの円周状軌跡とは所定位置で交差しており、この交差位置で容器移送部１５が測定試料容器５を保持部１８ｂにセットすることが可能なように構成されている。反応部１８は、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５を所定温度（約３７℃）に加温して、試料と試薬との反応を促進させる。

第１試薬添加部１９と第２試薬添加部２０とは、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５内に試薬を供給する。第１試薬添加部１９と第２試薬添加部２０とは、回転テーブル１８ａの周縁部近傍の位置に設置され、それぞれ、回転テーブル１８ａにセットされた測定試料容器５の上方の位置Ｐ１、Ｐ２まで移動可能な供給部１９ａ、２０ａを有する。これにより、回転テーブル１８ａにより位置Ｐ１、Ｐ２に測定試料容器５が搬送されたときに、測定試料容器５内に供給部１９ａ、２０ａから所定量の試薬を添加することが可能となる。

第１試薬添加部１９により添加される試薬は、細胞にＲＮＡ除去処理を行うためのＲＮａｓｅである。第２試薬添加部２０により添加される試薬は、細胞にＤＮＡ染色処理を行うための染色液である。ＲＮＡ除去処理により、細胞中のＲＮＡが分解され、細胞核のＤＮＡのみを測定することが可能となる。ＤＮＡ染色処理は、色素を含む蛍光染色液であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により行われる。ＤＮＡ染色処理により、細胞内の核に選択的に染色が施される。これにより、核からの蛍光が検出可能となる。なお、本発明における「測定試料調製部」は、温度調整部１０を経たのち主検出部２２に到るまでの間で生体試料の調製を行う部位をいい、本実施の形態の場合では、分散部１２，１６、弁別・置換部１４、反応部１８、試薬添加部１９，２０が含まれる。

試料吸引部２１は、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５内の試料（測定試料）を吸引して、吸引した測定試料を主検出部２２に移送する。試料吸引部２１は、回転テーブル１８ａの周縁部近傍の位置に設置され、回転テーブル１８ａにセットされた測定試料容器５の上方の位置Ｐ３まで移動可能なピペット２１ａを有する。これにより、試料吸引部２１は、回転テーブル１８ａにより位置Ｐ３に測定試料容器５が搬送されたときに、測定試料容器５内の測定試料を吸引することが可能となる。試料吸引部２１はまた、図示しない流路を介して、主検出部２２のフローセル４３（図３（ａ）参照）に接続されており、ピペット２１ａにより吸引された測定試料を主検出部２２のフローセル４３に供給することが可能となるように構成されている。

主検出部２２は、測定試料からの光（前方散乱光、側方散乱光、側方蛍光）を検出するためのフローサイトメータ４０を備えており、各光に基づく信号（光学信号）を後段の回路に出力する。フローサイトメータ４０については、追って、図３（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。

容器洗浄部２３は、試料吸引部２１により測定試料が主検出部２２に供給された後の測定試料容器５の内部を洗浄する。容器洗浄部２３は、回転テーブル１８ａの保持部１８ｂに保持された測定試料容器５内に洗浄液を吐出することにより、測定試料容器５の内部を洗浄するように構成されている。これにより、その後の測定処理において同じ測定試料容器５を用いた場合に、他の試料とのコンタミネーションを抑制できる。

図３（ａ）は、主検出部２２のフローサイトメータ４０の構成を示す図である。図３に示されるように、半導体レーザ４１から出射されたレーザ光は、複数のレンズを含むレンズ系４２によりフローセル４３を流れる測定試料に集光される。フローセル４３には、上述したように、試料吸引部２１のピペット２１ａにより吸引された試料が供給される。
レンズ系４２は、図３（ｂ）に示されるように、半導体レーザ４１側（図３（ａ）、（ｂ）の左側）から順に配置される、コリメータレンズ４２ａと、シリンダレンズ系（平凸シリンダレンズ４２ｂ＋両凹シリンダレンズ４２ｃ）と、コンデンサレンズ系（コンデンサレンズ４２ｄ＋コンデンサレンズ４２ｅ）とから構成されている。

集光レンズ４４は、測定試料中の細胞の前方散乱光を、フォトダイオード４５からなる散乱光検出器に集光する。側方光用の集光レンズ４６は、測定対象細胞及びこの細胞中の核の側方散乱光と側方蛍光とを集光し、ダイクロイックミラー４７へと導く。ダイクロイックミラー４７は、側方散乱光をフォトマルチプライヤ（光電子増倍管）４８へ反射させるとともに、側方蛍光をフォトマルチプライヤ（光電子増倍管）４９の方へ透過させる。このようにして、側方散乱光はフォトマルチプライヤ４８に集光され、側方蛍光はフォトマルチプライヤ４９に集光される。これらの光は、測定試料中の細胞及び核の特徴を反映したものとなっている。

フォトダイオード４５とフォトマルチプライヤ４８、４９とは、受光した光信号を電気信号に変換して、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）とを出力する。これらの出力信号は図示しないプリアンプにより増幅され、測定装置２の制御部２４（図２参照）に出力される。この制御部２４は、フォトダイオード４５及びフォトマルチプライヤ４８，４９から出力された光学信号を処理する機能や、主検出部２２及び副検出部１３の動作を制御する機能、試料の調製を行う各部２ａ、１０〜１２、１４〜２１，２３の動作を制御する機能、データ処理装置３との間で各種情報の送受信を行う機能等を有している。

制御部２４は、マイクロプロセッサ等の演算部やＲＯＭ，ＲＡＭ等からなる記憶部を含んでいる。記憶部には、各検出部２２，１３や試料調製を行う各部２ａ、１０〜１２、１４〜２１，２３の動作を制御するための制御プログラムや各種データが格納される。測定装置２の制御部２４で処理された各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬは、通信部を介してデータ処理装置３に送信される。

主検出部２２は、上述したように、図３（ａ）に示したフローサイトメータ４０を備えており、測定試料から、前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）とを出力する。制御部２４は、主検出部２２からの出力信号に対して必要な信号処理を実行する。
また、副検出部１３は、主検出部２２とほぼ同じ構成のフローサイトメータ４０を採用しているので、構成については説明を省略する。副検出部１３は、主検出部２２による本測定の前に試料の濃度測定を行う。本実施の形態では、副検出部１３は、前方散乱光信号（ＦＳＣ）を取得するよう構成されており、前方散乱光信号に基づいて上皮細胞に該当する大きさの細胞の数を計数するための信号を出力する。副検出部１３から出力された前方散乱信号ＦＳＣは、制御部２４に入力され、処理される。

［データ処理装置の構成］
図１に示されるように、データ処理装置３は、例えばノートＰＣやデスクトップＰＣ等のパーソナルコンピュータからなり、入力部３１と、表示部３２と、制御部３３とを含んでいる。制御部３３は、ＣＰＵ、ＲＯＭ，ＲＡＭ及びハードディスク等からなる記憶部、ＣＤ−ＲＯＭドライブ等の読出装置、及び各種入出力インタフェース等を備えている。制御部３３の記憶部には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等の各種プログラムの他、図２に示される測定装置２の制御部２４への動作命令の送信、測定装置２で行った測定結果の受信及び分析処理、並びに、処理した分析結果の表示等を行う操作プログラムがインストールされている。また、データ処理装置３は、測定装置２の制御部２４に通信可能に接続され、測定装置２とデータ処理装置３との間でデータの送受信を行うことが可能である。

データ処理装置３のＣＰＵは、記憶部にインストールされたプログラムを実行することにより、各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬに基づいて、前方散乱光強度、側方蛍光強度等の特徴パラメータを取得し、これらの特徴パラメータに基づいて、細胞や核を分析するための頻度分布データを作成する。そして、データ処理装置３のＣＰＵは、この頻度分布データに基づいて、測定試料中の粒子の弁別処理を行い、癌化の判定を行う。

［細胞分析装置１による分析手順］
細胞分析装置１による分析に際して、生体試料（細胞）と、メタノールを主成分とする保存液とが収容された試料容器４が操作者により検体セット部２ａ（図２参照）にセットされ、細胞分析装置１による分析が開始される。以下、図４を参照して細胞分析装置１による分析の手順を説明する。

測定が開始されると、まず、温度調整部１０により、保存液の温度調整が行われる。具体的には、検体セット部２ａにセットされた試料容器４内の試料が、検体ピペット部１１によって吸引され、試料セット部１０ａにセットされた試料容器に供給される。そして試料容器中の保存液が、所定の温度となるように温度調整される（ステップＳ１）。温度調整部１０における調整温度は、細胞分析装置１が設置される室内の温度（設置環境温度）とほぼ同じかこれよりも高温となっている。細胞分析装置１が設置される室内の温度は、通常、２２℃〜２５℃程度（最大でも３０℃程度）であり、これに対して、本実施の形態の温度調整部１０は、保存液を約３７℃の温度に加温するように構成されている。また、温度調整部１０は、１０分間保存液を加温するように構成されている。なお、保存温度の違いによる光学情報のばらつきを抑制するために温度調整された保存液の温度は、２５℃〜５０℃の範囲であれば特に制限されない。保存温度の違いによる光学情報のばらつきをより抑制する観点から、３０℃〜４５℃の範囲が好ましく、３５℃〜４５℃の範囲がより好ましく、３５℃〜４０℃の範囲がさらに好ましい。

このような温度調整部１０における保存液の温度調整によって、細胞分析装置１に供給される前の保存液の保存温度に関わらず、保存液を略一定の温度に調整し、保存液中の細胞のアルコール固定を促進し、細胞を安定化させることができる。これにより、のちに主検出部２２や副検出部１３において測定される光学信号（光学情報）の温度によるばらつきを抑制することが可能となっている。なお、保存液の保存温度の違いによって光学信号にばらつきが生じること、及び、保存液の温度調整によって当該光学信号のばらつきを抑制できることについては実験により検証した。この実験の詳細については後述する。また、本実施の形態の温度調整部１０による保存液の調整温度や調整時間は、光学信号のばらつきを効果的に抑制することができるように前記実験の結果に基づいて適正化されている。

次いで、温度調整部１０により温度調整された保存液に保存されている生体試料は、第１分散部１２により試料中の凝集細胞の分散処理（第１分散処理）が行なわれる（ステップＳ２）。具体的には、温度調整部１０の試料セット部１０ａにセットされた試料容器内の試料が、検体ピペット部１１によって吸引され、試料収容部１２ａ内に供給される。試料収容部１２ａに供給された試料は、第１分散部１２で分散される。

第１分散処理が終了すると、検体ピペット部１１により、分散済みの試料が副検出部１３の試料取込部１３ａに供給され、図３（ａ）のフローセル４３と同様の副検出部１３のフローセルに、分散済みの試料が所定量だけ流される。副検出部１３では、フローサイトメトリー法によって、試料に含まれる、上皮細胞の数の検出（プレ測定）が行なわれる（ステップＳ３）。本実施の形態では、上皮細胞の細胞数と、副検出部１３に供給された試料の体積とから、この試料の濃度が算出される。

続いて、算出された濃度に基づいて、制御部２４により、本測定に用いる測定試料を調製するための試料の吸引量が決定される（ステップＳ４）。すなわち、プレ測定に用いた試料の濃度（単位体積あたりの細胞の数）と、本測定における癌細胞検出のために必要な上皮細胞の細胞数とに基づき、本測定を行うために必要な試料の液量が演算される。本実施の形態では、主検出部２２のフローセル４３に供給する上皮細胞の数が所定の数（Ａ）である。この場合、弁別・置換部１４に供給する試料中の上皮細胞の数は、前記所定の数（Ａ）よりも多い数（Ｂ）である必要がある。このため、前記所定の数（Ａ）よりも多い数（Ｂ）の上皮細胞が弁別・置換部１４に供給されるよう、ステップＳ４における試料の液量が演算される。

次に、演算された液量の試料について弁別・置換処理が実行される（ステップＳ５）。すなわち、制御部２４により検体ピペット部１１が駆動され、第１分散部１２の試料収容部１２ａから、演算された液量だけ第１分散処理後の試料が吸引される。吸引された試料が弁別・置換部１４に供給されることにより、弁別・置換処理が開始される。

次に、第２分散部１６により試料中の凝集細胞の分散処理（第２分散処理）が行われる（ステップＳ６）。具体的には、容器移送部１５が反応部１８の保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５を把持して取り出し、試料受渡部１１ｂに位置付ける。そして、弁別・置換部１４から検体ピペット部１１によって吸引された試料が、試料受渡部１１ｂに位置付けられた測定試料容器５に供給される。その後、この測定試料容器５が容器移送部１５により第２分散部１６に移送され、第２分散処理が実行される。

第２分散処理後の試料を含む測定試料容器５が反応部１８の保持部１８ｂにセットされ
ると、第１試薬添加部１９により試薬（ＲＮａｓｅを含む。以下、当該試薬をＲＮＡ除去剤ともいう）が添加され、反応部１８により加温されて、測定試料容器５内の測定対象細胞のＲＮＡ除去処理が行われる（ステップＳ７）。ＲＮＡ除去処理の後、第２試薬添加部２０により試薬（染色液）が添加され、反応部１８により加温されて、測定試料容器５内の測定対象細胞のＤＮＡ染色処理が行われる（ステップＳ８）。本実施の形態では、プレ測定により、本測定で必要となる有意細胞数がある程度一定に保たれているため、細胞を染色する際の染色の程度は、測定ごとにばらつきにくくなっている。また、本実施の形態では、温度調整工程（ステップＳ１）において保存液の温度が略一定に調整されることによって、保存液中の細胞に含まれるクロマチンの変性が促進されることによって細胞が安定化し、染色の程度がばらつきにくくなっている。

次いで、ＤＮＡ染色処理済みの測定試料が、試料吸引部２１により吸引される。吸引された測定試料は、主検出部２２のフローセル４３（図３（ａ）参照）に送られ、測定試料中の細胞に対する本測定が行われる（ステップＳ９）。

本測定後、得られた測定データが測定装置２の制御部２４からデータ処理装置３に送信される（ステップＳ１０）。具体的には、測定試料中の各細胞について得られた前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）とが、データ処理装置３に送信される。データ処理装置３の制御部３３（ＣＰＵ）は、測定装置２から測定データを受信したか否かを常時判定している。測定装置２から測定データを受信すると、データ処理装置３の制御部３３により、その測定データに基づいて分析処理が行われる（ステップＳ１１）。なお、ステップＳ１１の分析処理の詳細については、後に図７及び図８を参照して説明する。

［癌化情報の取得手順］
次に、本実施の形態における癌化情報の取得手順について説明する。
図５（ａ）は、本測定（図４のステップＳ９）において得られる前方散乱光信号（ＦＳＣ）と側方蛍光信号（ＳＦＬ）を説明する図である。図５（ａ）には、細胞核を含む細胞の模式図と、当該細胞から得られる前方散乱光信号の波形及び側方蛍光信号の波形とが示されている。縦軸は光の強度を表している。前方散乱光強度の波形の幅は、細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）を表しており、側方蛍光強度の波形の幅は、細胞核の幅を示す数値（細胞核の大きさＮ）を表している。斜線で示すように、側方蛍光強度の波形と所定のベースラインとにより決められる領域の面積は、細胞のＤＮＡ量を表している。

図５（ｂ）は、子宮頸部の上皮細胞の拡大断面を模式的に示す図である。図５（ｂ）に示されるように、子宮頸部においては、基底膜側から順に、基底細胞により形成される層（基底層）と、傍基底細胞により形成される層（傍基底層）と、中層細胞により形成される層（中層）と、表層細胞により形成される層（表層）とが形成されている。基底膜付近の基底細胞が傍基底細胞、傍基底細胞が中層細胞、中層細胞が表層細胞へと分化する。

癌にいたる過程において、基底細胞は異形成を獲得し異型細胞となる。異型細胞は増殖能を獲得し、基底層側から表層側を占めるようになる。このため、癌にいたる初期段階においては、子宮頸部の上皮細胞では、基底層と、傍基底層と、中層とに存在する細胞に、癌化細胞が多く存在する。逆に、癌にいたる初期段階においては、子宮頸部の上皮細胞の表層側に存在する細胞には、癌化細胞が極めて少ない。

上皮細胞では、表層側の層から基底膜側の層に向かうにしたがい、細胞の大きさは順次小さくなるが、細胞核の大きさは順次大きくなることが分かっている。したがって、細胞の大きさ（Ｃ）に対する細胞核の大きさ（Ｎ）の比率（以下、「Ｎ／Ｃ比」という）も、表層側の層から基底膜側の層に向かうにしたがい順次大きくなる。このため、Ｎ／Ｃ比と細胞の大きさＣは、たとえば図５（ｃ）に示すような関係となる。なお、被験者から採取可能な子宮頚部の上皮細胞は、傍基底細胞、中層細胞、及び、表層細胞であり、前癌病変は、上述したように基底細胞側に早期に現れる。

図６（ａ）は、細胞周期におけるＤＮＡ量と細胞数との関係を示す図である。図６（ａ）に示されるように、細胞は、一定のサイクル（細胞周期）にしたがって、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの細胞となって出発点に戻る。細胞周期は、その段階に応じて、Ｇ１期（Ｓ期に入るための準備と点検の時期）と、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）と、Ｇ２期（Ｍ期に入るための準備と点検の時期）と、Ｍ期（分裂期）の４期に分けることができ、この４期に細胞の増殖が休止しているＧ０期（休止期）を加えると、細胞は、５期のうちいずれかのステージにある。

細胞周期にしたがって細胞が増殖する際、細胞内の核の染色体も増加するため、細胞のＤＮＡ量を測定することで、当該細胞が細胞周期のどの状態にあるのかを推定することができる。正常な細胞の場合、図６（ｂ）に示されるように、Ｇ０／Ｇ１期におけるＤＮＡ量は一定の値（２Ｃ）であり、続くＳ期においてはＤＮＡ量が徐々に増加し、その後Ｇ２期に入ると一定の値（４Ｃ）となり、この値はＭ期においても維持される。ここで、Ｃとは、半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量のことを表す。すなわち、２Ｃは半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量の２倍のＤＮＡ量、４Ｃは半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量の４倍のＤＮＡ量を表す。細胞周期のＧ０期又はＧ１期の正常細胞のＤＮＡ量は２Ｃとなる。そして、正常な細胞について、ＤＮＡ量のヒストグラムを作成すると、図６（ａ）に示すようなヒストグラムとなる。最も高いピークはＤＮＡ量が最も少ないＧ０／Ｇ１期にある細胞に対応し、次に高いピークはＤＮＡ量が最も多いＧ２／Ｍ期にある細胞に対応し、それらの間はＳ期にある細胞に対応している。

正常な細胞の場合、Ｓ期とＧ２／Ｍ期の状態にある細胞の数は、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の数に比べて極めて少ない。しかし、癌化細胞の場合、Ｓ期とＧ２／Ｍ期の状態にある細胞の数は、正常な細胞に比べて多くなる。また、癌化細胞の場合、細胞の染色体の数も多くなるため、ＤＮＡ量も多くなる。

そこで、本実施の形態では、癌化の判定において、Ｎ／Ｃ比とＤＮＡ量とに着目した判定方法が用いられる。
具体的には、Ｎ／Ｃ比の大きい細胞を抽出する。続いて、このように抽出された細胞群のうち、ＤＮＡ量が多い細胞とＤＮＡ量が少ない細胞とを抽出することにより、癌化細胞である可能性が高い細胞（第１細胞）と癌化細胞である可能性が低い細胞（第２細胞）とを効果的に抽出する。一般に、組織の癌化が進むと、第１細胞の数が増加し、第２細胞の数が減少する。このため、両細胞数の比は、組織が正常である場合と癌化した場合とで大きく異なる。癌化の判定は、この比に基づいて行われる。このように、互いに増減傾向が逆の２つの細胞数の比が用いられると、測定試料に含まれる測定対象細胞が比較的少なくても、信頼性の高い判定結果を得ることができる。

具体的には、データ処理装置３の制御部３３は、図７に示されるようなＮ／Ｃ比と細胞の大きさ（細胞幅）との関係を示すスキャッタグラムを作成し、このスキャッタグラムにおいて細胞の大きさが所定の範囲（例えば、１０μｍ以上５０μｍ以下の範囲）にあり、かつＮ／Ｃ比が所定の範囲（例えば、０．２以上１以下の範囲）にある細胞の測定データを分析対象として抽出する。これにより、癌化細胞が少ない表層に存在する表層細胞を分析対象から除くことができる。なお、上記の抽出を行う前に、白血球と上皮細胞の測定データを分離する処理や、単一上皮細胞と凝集上皮細胞の測定データを分離する処理等を行ってもよい。また、細胞の大きさについて考慮せず、Ｎ／Ｃ比の範囲のみを用いて細胞の測定データの抽出を行ってもよい。

次に、データ処理装置３の制御部３３は、抽出された細胞の測定データについて、図８に示されるヒストグラムを作成する。このヒストグラムにおいて、横軸はＤＮＡ量を表しており、縦軸は細胞数を表している。
次に、データ処理装置３の制御部３３は、図８のヒストグラムにおいて、ＤＮＡ量が正常細胞のＳ期以上である細胞数Ｎ１（ｂよりも大きくｃ以下の範囲にあるＤＮＡ量を有する細胞数）、すなわち、図６（ａ）にも示されるように、細胞周期がＧ０期又はＧ１期にある正常細胞のＤＮＡ量を超えるＤＮＡ量を有する細胞の数を取得する。さらに、制御部３３は、ＤＮＡ量が正常細胞の２Ｃである細胞の数Ｎ２（ａ以上ｂ以下の範囲にあるＤＮＡ量を有する細胞数）、すなわち、細胞周期がＧ０期又はＧ１期にある正常細胞のＤＮＡ量を有する細胞の数を取得する。

続いて、データ処理装置３の制御部３３は、ＤＮＡ量がＳ期以上である細胞の数Ｎ１を、ＤＮＡ量が２Ｃである細胞の数Ｎ２で除算した値（両細胞数Ｎ１，Ｎ２の比（Ｎ１／Ｎ２））を取得する。そして、制御部３３は、両細胞数Ｎ１，Ｎ２の比を所定の閾値と比較することによって癌化の判定を行う。すなわち、Ｎ１／Ｎ２の値が所定の閾値以上であれば、癌化の判定を陽性とし、Ｎ１／Ｎ２の値が所定の閾値未満であれば、癌化の判定を陰性とする。

その後、データ処理装置３の制御部３３は、癌化に関する情報を表示部３２に表示したり、外部に出力したりする。例えば、癌化の判定が陽性である場合には、表示部３２に、再検査が必要である旨の表示を行い、癌化の判定が陰性である場合には、表示部３２に、再検査が不要である旨の表示を行う。

［温度調整部１０における温度調整条件について］
上述したように、測定装置２の温度調整部１０は、生体試料が主検出部２２又は副検出部１３に送られる前に、保存液の温度を所定の温度に調整するものである。主検出部２２及び副検出部１３において取得される光学信号は、保存液の温度の違いによってばらつきが生じ、その結果、光学信号を用いた癌化の判定が正確に行えなくなる可能性がある。例えば、側方蛍光信号や前方散乱光信号にばらつきが生じると、細胞核の大きさＮや細胞の大きさＣにもばらつきが生じ、図７に示されるスキャッタグラムの作成に悪影響を及ぼす可能性がある。また、側方蛍光信号にばらつきが生じると、細胞のＤＮＡ量にもばらつきが生じ、図８に示されるヒストグラムを正確に作成できず、癌化の判定に悪影響を及ぼす可能性がある。特に、側方蛍光信号の強度は、ＤＮＡの染色の程度によって変わるため、保存液の温度の違いはＤＮＡの染色の程度に影響を与えると考えられる。

本発明者は、生体試料が保存された保存液を所定の温度範囲に調整することによって、光学信号のばらつきを抑制できることを以下の実験により検証した。同時に、光学信号のばらつきを抑制するために効果的な調整温度及び調整時間を求めた。また、保存液のアルコール濃度を変化させたときの温度調整の効果についても検証した。以下、当該実験の詳細について説明する。なお、以下の実験１及び実験２は、子宮頸部における上皮細胞に関する実験であり、実験３は、口腔粘膜における上皮細胞（以下、「口腔細胞」ともいう）に関する実験である。

＜実験１＞
以下、実験１におけるプロトコルを示す。
１．材料
（生体試料） 生体試料としての培養細胞に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション社（ＡＴＣＣ社）より入手したＨｅｌａ細胞を用いた。
（染色液） シグマ社のＰＩ（ヨウ化プロピジウム）をエチレングリコールで希釈したものを用いた。
（ＲＮＡ除去剤） シグマ社のＲＮａｓｅＡを、Ｔｒｉｓ塩酸水溶液（ｐＨ７．５ １０ｍＭ）で希釈したものを用いた。
（保存液）実験内容により、以下の４つのパターンの保存液を使用した。
保存液１：メタノール４０ｖｏｌ％、酢酸０．８ｖｏｌ％の水溶液
保存液２：エタノール４０ｖｏｌ％、酢酸０．８ｖｏｌ％の水溶液
保存液３：メタノール２５〜８０ｖｏｌ％、酢酸０．８ｖｏｌ％の水溶液
保存液４：エタノール２５〜８０ｖｏｌ％、酢酸０．８ｖｏｌ％の水溶液
（希釈液）Ｔｒｉｓ塩酸水溶液（ｐＨ７．５ １０ｍＭ）を使用した。

２．条件
（保存条件）培養細胞を保存した保存液を４℃又は３０℃で２４時間静置した。臨床現場において細胞を含む保存液は検査まで保存されるが、保存温度は一般的に４℃〜３０℃が想定される。本実験における保存液の静置は、一般的に想定される保存温度の下限（４℃）又は上限（３０℃）の温度のもとで行われた。
（温度調整条件）上記の通り静置した後、以下の３つのパターンのいずれかで保存液の温度を調整した。
・パターン１：３０℃〜５０℃の範囲で選択された複数の調整温度のうち、いずれかの温度で１０分間加温
・パターン２：調整温度３７℃で１０分間加温
・パターン３：調整温度３７℃で、３〜２０分の範囲で選択された複数の時間のうち、いずれかの時間加温

３．実験手順
保存液中で２４時間保存した培養細胞をマイクロチューブ内で上記調整温度に加温したのち、遠心分離（１００００ｒｐｍ，１分間）を行い、アスピレータにて上清を除去した。その後、残存液（３０μＬ）に１ｍｌの希釈液を加え、再度、遠心分離（１００００ｒｐｍ，１分間）を行い、アスピレータにて上清を除去した。その後、残存液（３０μＬ）に、染色液、ＲＮＡ除去剤、及び希釈液を加えて測定試料を調製し、上記の温度調整条件（パターン１〜３のいずれか）で静置した。その後、測定試料をフローサイトメータに流して光学信号（側方蛍光信号、前方散乱光信号）を取得した。そして、４℃保存の保存液を用いて取得された光学信号と、３０℃保存の保存液を用いて取得された光学信号とを比較し、そのばらつきを求めた。

〔実験結果〕
（実験１−１）
本実験では、細胞が保存された保存液１（メタノールベース）を３０℃〜５０℃の範囲で温度調整した場合と、温度調整を行わなかった場合（加温なし、すなわち４℃又は３０℃の状態）とで、蛍光量のばらつきを求めた。なお、蛍光量は、側方蛍光信号波形の面積である。この蛍光量は細胞のＤＮＡ量に相関しており、ＤＮＡ量が多いほど蛍光量は多くなる。本実験及び以下に説明する他の実験においては、図８における２Ｃがピークを示すときの蛍光量（値Ｘ）のばらつきを求めた。
その結果、図９に示されるように、加温なしの場合、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率（蛍光量が大きい方を小さい方で割って求めた比率（百分率））は、約１０５％となった。この比率が大きいほど、蛍光量のばらつきが大きいと言える。

これに対して、３０℃〜５０℃の範囲で６つの温度（３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃）を選択して１０分間温度調整を行ったところ、いずれの場合も４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量の比率が加温なしの場合よりも小さくなった。すなわち、３０℃〜５０℃の範囲で温度調整することによって、保存温度の違いによる蛍光量のばらつきが抑制された。特に、３０℃〜４５℃の範囲で蛍光量の比率が小さくなり、３５℃〜４０℃の範囲でより蛍光量の比率が小さくなった。また、３７℃の温度調整で、蛍光量の比率が１０１％以下となり、最も高い効果を得られることが分かった。したがって、上記の実施の形態における温度調整部１０においては保存液の調整温度を３７℃とした。また、以下に説明する実験１−２〜２−３においても、最も効果が高いと考えられる３７℃に調整温度を設定した。

（実験１−２）
本実験では、細胞が保存された保存液２（エタノールベース）を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１０に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率は約１０２％となり、加温なしの場合の比率（１０８％〜１０９％）よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる蛍光量のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。そして、本実験により、保存液のベースとなるアルコールの種類に関わらず、温度調整の効果を得ることができると考えられる。

（実験１−３）
本実験では、細胞が保存された保存液１を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、前方散乱光信号から求められる細胞径（細胞の大きさＣ、図５（ａ）参照）のばらつきを調べた。
その結果、図１１に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された細胞径と、３０℃保存の保存液を用いて取得された細胞径との比率は約１０２％となり、加温なしの場合の比率（１０５％〜１０６％）よりも小さくなり、保存温度の違いによる細胞径のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。

（実験１−４）
本実験では、細胞が保存された保存液１を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、側方蛍光信号から求められる細胞核径（細胞核の大きさＮ、図５（ａ）参照）のばらつきを調べた。
その結果、図１２に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された細胞核径と、３０℃保存の保存液を用いて取得された細胞核径との比率は１００．０％〜１００．４％となり、加温なしの場合の比率（１０１．６％〜１０２．０％）よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる細胞核径のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。
また、実験１−３と実験１−４の結果から、保存液の温度調整によって、Ｎ／Ｃ比のばらつきを抑制できることが分かった。

（実験１−５）
本実験は、メタノール濃度を変えた複数の保存液３を用いて、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１３に示されるように、いずれのメタノール濃度でも、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率が、加温なしの場合よりも小さくなった。本実験の結果により、メタノール濃度に関わらず、温度調整の効果を得ることができると考えられる。

（実験１−６）
本実験は、エタノール濃度を変えた複数の保存液４を用いて、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１４に示されるように、いずれのエタノール濃度でも、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量の比率が、加温なしの場合よりも小さくなった。本実験により、エタノール濃度に関わらず、温度調整の効果を得ることができると考えられる。

（実験１−７）
本実験では、細胞が保存された保存液１を、３７℃で時間を変化（３〜２０分）させて温度調整した場合と、温度調整しなかった場合（温度調整時間０分）とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１５（ａ）に示されるように、いずれの温度調整時間においても４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率が、加温なしの場合よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる蛍光量のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。また、図１５（ｂ）には、温度調整時間に対する保存液の温度の変化を示しており、これによれば、温度調整時間が３分経過すると、ほぼ調整温度である３７℃にまで保存液が昇温しており、蛍光量のばらつきも抑制されていることがわかる。また、本実験より、温度調整時間が１０分のときに、蛍光量のばらつきが最も小さくなっていることがわかる。したがって、上記の実施の形態における温度調整部１０においては保存液の温度調整時間を１０分間とした。

＜実験２＞
以下、実験２におけるプロトコルを示す。
１．材料
（生体試料） 生体試料として、３人の子宮頸癌患者の子宮頸部から上皮細胞を含む臨床検体を採取し、それぞれを臨床検体１〜３とした。
（染色液） 実験１と同じ
（ＲＮＡ除去剤） 実験１と同じ
（保存液） 実験１の保存液１と同じ
（希釈液） 実験１と同じ

２．条件
（保存条件）臨床検体を保存した保存液を４℃又は３０℃で７日間静置した。
（温度調整条件）上記の通り静置した後、各保存液を調整温度３７℃で、１０分間加温した。

３．実験手順
保存液中で保存した臨床検体を用いて実験１と同様の手順で試料を調製し、上記の温度調整条件で静置した。その後、測定試料をフローサイトメータに流して光学信号（側方蛍光信号、前方散乱光信号）を取得した。そして、４℃保存の保存液を用いて取得された光学信号と、３０℃保存の保存液を用いて取得された光学信号とを比較し、そのばらつきを求めた。

〔実験結果〕
本実験では、臨床検体１〜３が保存された保存液を、それぞれ３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１６に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率は、臨床検体１で１０４．０％、臨床検体２で１０２．１％、臨床検体３で１０４．４％となり、それぞれ加温なしの場合の比率（同１０８．２％、１０６．５％、１０６．７％）よりも小さくなった。したがって、いずれの子宮頸癌患者から採取した臨床検体であっても、保存温度の違いによる蛍光量のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。

＜実験３＞
以下、口腔細胞に関する実験３のプロトコルを示す。
１．材料
（生体試料）口腔内の細胞を以下の手順で採取した。
綿棒に唾液を十分に含ませ、その綿棒を口腔内に押し当てて１０秒間擦過した(右頬、左頬でそれぞれ一本ずつ、計２本の綿棒を用いた）。擦過後、速やかに、５．０ｍＬ容量の容器内に収容した保存液２．２ｍＬ中に綿棒を入れ、回転させることによって細胞を洗い落とした。そして、４４０μＬずつ１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに分注した。
（染色液） 実験１と同じ
（ＲＮＡ除去剤） 実験１と同じ
（保存液）メタノール４０ｖｏｌ％、酢酸０．８ｖｏｌ％の水溶液

２．条件
（保存条件）口腔細胞を保存した保存液を４℃又は３０℃で２４時間静置した。
（温度調整条件）上記の通り静置した後、調整温度３７℃で１０分間加温した。

３．実験手順
実験１と同様の手順で測定試料を調整し、その測定試料をフローサイトメータに流し、測定試料をフローサイトメータに流して光学信号（側方蛍光信号、前方散乱光信号）を取得した。そして、４℃保存の保存液を用いて取得された光学信号と、３０℃保存の保存液を用いて取得された光学信号とを比較し、そのばらつきを求めた。

〔実験結果〕
（実験３−１）
本実験では、口腔細胞が保存された保存液を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、蛍光量のばらつきを調べた。
その結果、図１７に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量と、３０℃保存の保存液を用いて取得された蛍光量との比率が１０３％〜１０４％となり、加温なしの場合の比率（１０５％〜１０６％）よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる蛍光量のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。

（実験３−２）
本実験では、口腔細胞が保存された保存液を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、前方散乱光信号から求められる細胞径（細胞の大きさＣ、図５（ａ）参照）のばらつきを調べた。
その結果、図１８に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された細胞径と、３０℃保存の保存液を用いて取得された細胞径との比率は約１０２％となり、加温なしの場合の比率（１０５％〜１０６％）よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる細胞径のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。

（実験３−３）
本実験では、口腔細胞が保存された保存液を、３７℃で１０分間温度調整した場合と、温度調整しなかった場合とで、側方蛍光信号から求められる細胞核径（細胞核の大きさＮ、図５（ａ）参照）のばらつきを調べた。
その結果、図１９に示されるように、４℃保存の保存液を用いて取得された細胞核径と、３０℃保存の保存液を用いて取得された細胞核径との比率は１００．０％〜１００．５％となり、加温なしの場合の比率（１０１．０％〜１０１．５％）よりも小さくなった。したがって、保存温度の違いによる細胞核径のばらつきを温度調整によって抑制できることが分かった。

以上の実験３の各結果から、口腔粘膜の上皮細胞においても子宮頸部の上皮細胞と同様に、保存液を所定の温度で調整することによって、保存液の温度の違いによる光学信号のばらつきを抑制することができ、その結果、ＤＮＡ量や細胞の大きさ、細胞核の大きさ等の細胞情報を正確に取得することができる。

本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示された発明の範囲内において、適宜変更が可能である。
例えば、上記実施の形態の細胞分析装置は、子宮頸部の上皮細胞が分析対象とされていたが、上記実験３によって検証されたとおり、口腔粘膜の上皮細胞が分析対象とされていてもよい。また、膀胱、咽頭などの他の上皮細胞、さらには臓器の上皮細胞が分析対象とされていてもよい。

上記実施の形態では、Ｎ／Ｃ比は、側方蛍光強度の波形の幅に基づいて得られる細胞核の幅を示す数値（細胞核の大きさＮ）と、前方散乱光強度の波形の幅に基づいて得られる細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）との比として算出された。しかしながら、これに限らず、Ｎ／Ｃ比は、細胞核の面積と細胞の面積との比として算出されてもよい。上記実施の形態では、前方散乱光強度の波形の幅に基づいて細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）を得た。これにより、所定の方向に長い形をしている細胞がフローセルを流れた際にも、細胞の大きさを精度良く表すことができる。

上述したように、本発明の実施の形態において、保存液は、細胞が保存される液体であれば特に制限されないが、保存液はアルコールを含むことが好ましい。本発明の実施の形態において、保存液に含まれるアルコールとしては特に制限されないが、メタノールあるいはエタノールを挙げることができる。また、本発明の実施の形態において、保存液中のアルコール濃度としては、実験１−５、及び実験１−６に示したように、特に制限されない。ただし、２５ｖｏｌ％未満のアルコール濃度の場合、細胞が壊れやすくなるため、細胞を保存する観点からは２５ｖｏｌ％以上が好ましい。また、６０％を超えるアルコール濃度の場合、細胞が凝集しやすくなるため、フローサイトメータを用いたフローサイトメトリー法で細胞を測定する場合、６０ｖｏｌ％以下がより好ましい。以上のことから保存液中のアルコール濃度としては、好ましくは２５ｖｏｌ％以上６０ｖｏｌ％以下である。

上記実施の形態では、温度調整部１０が、細胞分析装置１の測定装置２と一体に設けられているが、測定装置２とは別体の独立したユニットとして構成されていてもよい。

また、上記実施の形態では、光学情報として、フローセルを流れる測定試料中の各細胞について前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）を取得する構成について述べたが、本発明はこれに限らない。たとえば、上記実施の形態では細胞のＤＮＡ量を表す値を取得するために側方蛍光信号を用いたが、側方である必要はなく、異なる角度で取得される蛍光信号（たとえば、前方蛍光信号）を用いてもよい。また、主検出部２２がさらに撮像部を備え、光学情報として、フローセルを流れる測定試料中の各細胞について撮像信号を取得してもよい。この場合、例えば、撮像部は、パルスレーザからなる光源とカメラとを備えており、パルスレーザからのレーザ光はレンズ系を経てフローセル４３に入射し、さらに対物レンズ及びダイクロイックミラーを透過してカメラに結像する。パルスレーザは、所定のタイミングで発光してカメラによる撮像を可能にする。

１ ：細胞分析装置
２ ：測定装置
２ａ ：検体セット部
３ ：データ処理装置（情報処理部）
１０ ：温度調整部
１３ ：副検出部（測定部）
１４ ：弁別・置換部
１９ ：第１試薬添加部（測定試料調製部）
２０ ：第２試薬添加部（測定試料調製部）
２２ ：主検出部（測定部）
２３ ：容器洗浄部

Claims (20)

1. 細胞が保存されている保存液を、所定の温度に調整する温度調整工程と、
   前記温度調整工程で温度調整された保存液に保存されていた細胞に光を照射して光学情報を取得する測定工程と、
   を含む細胞分析方法。
2. 前記温度調整工程により温度調整された保存液を希釈液に置換することで、測定試料を調製する測定試料調製工程をさらに含む、請求項１に記載の細胞分析方法。
3. 前記光学情報は、散乱光情報を含む、請求項１又は２に記載の細胞分析方法。
4. 前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、
   前記情報取得工程は、前記散乱光情報に基づいて、前記細胞情報として細胞の大きさに関する情報を取得する工程を含む、請求項３に記載の細胞分析方法。
5. 前記測定試料調製工程は、さらに染色試薬を用いて、前記測定試料を調製する、請求項２に記載の細胞分析方法。
6. 前記染色試薬は、核酸染色色素を含む、請求項５に記載の細胞分析方法。
7. 前記測定試料調製工程は、前記測定試料を所定の温度に調整する、請求項５又は６に記載の細胞分析方法。
8. 前記光学情報は、蛍光情報を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
9. 前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、
   前記情報取得工程は、前記蛍光情報に基づいて、前記細胞情報としてＤＮＡ量及び細胞核の大きさの少なくとも一方に関する情報を取得する工程を含む、請求項８に記載の細胞分析方法。
10. 前記測定工程で得られた光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報取得工程をさらに含み、
    前記情報取得工程は、前記細胞情報として細胞の癌化に関する情報を取得する工程を含む、請求項１に記載の細胞分析方法。
11. 前記保存液は、アルコールを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
12. 細胞が保存されている保存液を、所定の温度に調整する温度調整部と、
    前記温度調整部により温度調整された保存液を希釈液に置換することで、測定試料を調製する測定試料調製部と、
    前記測定試料調製部により調製された測定試料に含まれる細胞に光を照射して光学情報を取得する測定部と、
    を備えている細胞分析装置。
13. 前記光学情報は、散乱光情報を含む、請求項１２に記載の細胞分析装置。
14. 前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、
    前記情報処理部は、前記散乱光情報に基づいて、前記細胞情報として細胞の大きさに関する情報を取得する、請求項１３に記載の細胞分析装置。
15. 前記測定試料調製部は、さらに染色試薬を用いて、前記測定試料を調製する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の細胞分析装置。
16. 前記染色試薬は、核酸染色色素を含む、請求項１５に記載の細胞分析装置。
17. 前記測定試料調製部は、前記測定試料を所定の温度に調整する、請求項１５又は１６に記載の細胞分析装置。
18. 前記光学情報は、蛍光情報を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の細胞分析装置。
19. 前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、
    前記情報処理部は、前記蛍光情報に基づいて、前記細胞情報としてＤＮＡ量及び細胞核の大きさの少なくとも一方に関する情報を取得する、請求項１８に記載の細胞分析装置。
20. 前記測定部で取得された光学情報に基づき、細胞情報を取得する情報処理部をさらに備え、
    前記情報処理部は、前記細胞情報として細胞の癌化に関する情報を取得する、請求項１２に記載の細胞分析装置。