JP2014176351A - Method for producing ethanol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はセルロース系バイオマス等からの効率的なエタノール生産方法に関する。 The present invention relates to an efficient method for producing ethanol from cellulosic biomass.
セルロース系バイオマスは、環境面から微生物の発酵によるエタノール生産原料として注目されている。特に、最近では未利用バイオマスの有効活用という観点から、木材、紙類、あるいはバガス（サトウキビの搾りかす）及びワラ類のような農業廃棄物といったようなセルロース系のバイオマス原料の利用が検討されている。 Cellulosic biomass is attracting attention as an ethanol production raw material by fermentation of microorganisms from the environmental aspect. In particular, recently, from the viewpoint of effective utilization of unused biomass, utilization of cellulosic biomass raw materials such as wood, paper, or agricultural waste such as bagasse (sugar cane) and straws has been studied. Yes.
セルロース系バイオマスを用いて微生物の発酵によってエタノールを生産するためには、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースやこれらの一部分解物である多糖類を酵素法や希硫酸などを用いる加水分解法により分解し、六炭糖であるグルコース、マンノース及びガラクトースや五炭糖であるキシロースを主成分とする糖化液を得、この糖化液中の糖を微生物の発酵に供する必要がある。この糖化液中にはしばしばグルコース同士がβ−１，４結合した２糖類であるセロビオースが含まれる場合がある。しかし、５単糖のキシロースや２糖類のセロビオースはエタノール発酵しづらいことが知られている。実際、グルコース等から効率よくエタノールを生産可能な酵母として知られているサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はキシロースやセロビオースからはエタノールを生産することができない。一方、キシロースやセロビオースからエタノールを生産できる酵母としては、クルイベロマイセス・セロビオボラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｖｏｒｕｓ、現在ではカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に分類）が報告されているが（非特許文献１、特許文献１等）、そのエタノール生産効率は十分とはいえない。
In order to produce ethanol by fermentation of microorganisms using cellulosic biomass, cellulose, hemicellulose, and polysaccharides, which are partially decomposed products of these, are hydrolyzed using enzymatic methods or dilute sulfuric acid. It is necessary to decompose to obtain a saccharified solution mainly composed of glucose, mannose and galactose, which are hexoses, and xylose, which is a pentose, and to use the sugars in the saccharified solution for fermentation of microorganisms. This saccharified solution often contains cellobiose, which is a disaccharide in which glucose is β-1,4 bonded. However, it is known that xylose as a monosaccharide and cellobiose as a disaccharide are difficult to be fermented with ethanol. In fact, Saccharomyces cerevisiae, which is known as a yeast capable of efficiently producing ethanol from glucose or the like, cannot produce ethanol from xylose or cellobiose. On the other hand, as yeast capable of producing ethanol from xylose or cellobiose, Kluyveromyces cellobiobulus (currently classified as Candida intermedia) has been reported (Non-patent
ところで、微生物によるグルコース等の糖から発酵によりエタノールを生産するにあたっては、理論上はエタノールの原料である糖濃度を高くすればするほど、生産性があがるように思われる。しかし、一般に、グルコース濃度が高すぎるとエタノールの生産速度が速くなりすぎ、発酵に用いている菌体内に急速にエタノールが蓄積し、菌体のエタノール耐性の問題から却って発酵が阻害されてしまう（非特許文献２，３）。この現象はグルコース阻害（グルコースリプレッション）として知られている。このグルコース阻害の影響から、発酵液中のエタノール濃度の上限値は、組み換え体のような特殊な微生物を用いない限り、通常４．５質量％程度が上限となる場合が多い（非特許文献４）。
このグルコース阻害は、前述したセルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵においても生じるが、これによってセルロース系バイオマス糖化液中に含まれるグルコース以外の糖であるキシロースやセロビオースは一層消費されづらくなってしまう。そして、通常、セルロース系バイオマス糖化液中に含まれる糖類の消費では、グルコースを完全に消費した後でなければキシロースを消費できず、さらにはキシロースを消費した後でなければセロビオースを消費できないという序列があるため、グルコースの消費がグルコース阻害により停止してしまうと、キシロースやセロビオースの発酵が進行しなくなってしまう（例えば、非特許文献３等）。
By the way, when ethanol is produced from a sugar such as glucose by a microorganism by fermentation, it seems that the higher the concentration of sugar as a raw material of ethanol, the higher the productivity. However, in general, when the glucose concentration is too high, the production rate of ethanol becomes too fast, and ethanol accumulates rapidly in the cells used for fermentation, and the fermentation is inhibited due to the problem of ethanol resistance of the cells ( Non-patent documents 2, 3). This phenomenon is known as glucose inhibition (glucose repression). From the influence of this glucose inhibition, the upper limit of the ethanol concentration in the fermentation broth usually has an upper limit of about 4.5% by mass unless a special microorganism such as a recombinant is used (Non-Patent Document 4). ).
This glucose inhibition also occurs in ethanol fermentation using the saccharified liquid obtained from the cellulose-based biomass described above, but this makes it more difficult to consume xylose and cellobiose, which are sugars other than glucose contained in the cellulose-based biomass saccharified liquid. turn into. And usually, in the consumption of saccharides contained in cellulosic biomass saccharified liquid, xylose can only be consumed after glucose is completely consumed, and cellobiose can only be consumed after xylose is consumed. Therefore, when the consumption of glucose stops due to glucose inhibition, fermentation of xylose or cellobiose does not proceed (for example, Non-Patent Document 3).
前述のように、グルコース阻害は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いるエタノール生産に及ぼす影響が大きい。
そのため、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵では、主な糖源としてグルコースを用いた場合と比較して、エタノール生産濃度の上限はさらに低くなり、また発酵速度も低くなってしまい、エタノールの生産効率が図りづらいという課題があった。
従って、本発明の課題は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液等のキシロースやセロビオースを含有する発酵用液から、エタノールを効率良く生産するための方法を提供することにある。
As described above, glucose inhibition has a large effect on ethanol production using a saccharified solution obtained from cellulosic biomass.
Therefore, in ethanol fermentation using saccharified liquid obtained from cellulosic biomass, the upper limit of ethanol production concentration is further lower and the fermentation rate is lower than when glucose is used as the main sugar source. There was a problem that the production efficiency of ethanol was difficult to achieve.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing ethanol from a fermentation solution containing xylose and cellobiose such as a saccharified solution obtained from cellulosic biomass.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カンジダ・インターメディアに属する酵母を用いて、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が特定量であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が特定量である発酵用液を用いることにより、エタノール生産効率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor used yeast belonging to Candida intermedia and cultured it in a medium containing 0.5 to 5% by mass of xylose before subjecting the yeast to ethanol production. After that, as a fermentation liquid used for ethanol production, the total content of all saccharides with respect to the total amount of the fermentation liquid is a specific amount, and the content of cellobiose with respect to the total content of all saccharides is a specific amount. It discovered that ethanol production efficiency increased by using the liquid for fermentation, and came to complete this invention.
すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。
〔１〕カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いてエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が１５〜８５質量％である発酵用液を用いることを特徴とするエタノールの生産方法。
〔２〕カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が、４−６−４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母である〔１〕に記載のエタノールの生産方法。
That is, the present invention provides the following [1] and [2].
[1] A method for producing ethanol using yeast belonging to Candida intermedia, wherein the yeast is cultured in a medium containing 0.5 to 5% by mass of xylose before being used for ethanol production. Later, as a fermentation liquid used for ethanol production, the total content of all saccharides with respect to the total amount of the fermentation liquid is 8 to 20% by mass, and the content of cellobiose with respect to the total content of all saccharides is 15 to 15%. A method for producing ethanol, characterized by using a fermentation liquid of 85% by mass.
[2] The method for producing ethanol according to [1], wherein the yeast belonging to Candida intermedia is named 4-6-4T2 and deposited as FERM BP-11509.
本発明によれば、キシロースやセロビオースを含有するセルロース系バイオマスから効率的にエタノールを生産することができる。 According to the present invention, ethanol can be efficiently produced from cellulosic biomass containing xylose or cellobiose.
本発明の方法は、セルロース系バイオマスの糖化液からのエタノール生産に最適に用いられるものであるが、通常のエタノール生産に用いるセルロース系バイオマスの糖化処理よりもセロビオース含有量をあえて高い濃度となるように調整したものを発酵用液として用いる点に特徴がある。また、それと共に、特定の酵母を用いる点、及びエタノール生産に用いる酵母の前培養をキシロース存在下で行う点にも特徴がある。これらの特徴により、エタノール生産において必ずしも有利とはいえないセルロース系バイオマスからエタノールの生産効率を高め、エタノールを高濃度で生産することが可能となる。本発明においてこのような効果が得られるメカニズムについて定かではないが、以下のようなメカニズムと推定される。
通常であれば高いセロビオース含有量ではエタノール発酵は進みづらい。しかし、本発明ではエタノール発酵に供する前にキシロースの存在下で前培養を行うことで酵母の細胞内のβ−グルコシダーゼ活性を十分に高めることができると推定される。酵母自らが有するこのβ−グルコシダーゼによってエタノール生産で用いる発酵用液中に多量に含まれるセロビオースのβ−１，４結合を分解し、エタノール発酵の直接の発酵原料であるグルコースを供給することができる。このように、発酵原料のグルコースを、エタノール発酵を行う酵母自身の有するβ−グルコシダーゼによって発酵用液内のセロビオースから調達するために、グルコース濃度とエタノール生産のバランスが良好に保たれ易いと考えられる。その結果、グルコース阻害がかかりづらく、エタノールを高濃度で生産でき、生産効率が高まるものと考えられる。また、かかるメカニズムから、キシロース資化性とグルコース資化性を共に有し、これらの糖からエタノールを生産可能な特定の酵母を用いた点も効果を奏しているものと考えられる。
The method of the present invention is optimally used for ethanol production from a saccharified liquid of cellulosic biomass, but the cellobiose content is higher than the saccharification treatment of cellulosic biomass used for normal ethanol production. It is characterized in that what is adjusted to is used as a fermentation solution. In addition, there is a feature in that a specific yeast is used, and that yeast used for ethanol production is pre-cultured in the presence of xylose. Due to these characteristics, it is possible to increase the production efficiency of ethanol from cellulosic biomass, which is not necessarily advantageous in ethanol production, and to produce ethanol at a high concentration. Although the mechanism for obtaining such an effect in the present invention is not clear, the following mechanism is presumed.
Normally, ethanol fermentation is difficult to proceed at high cellobiose content. However, in the present invention, it is presumed that β-glucosidase activity in yeast cells can be sufficiently increased by pre-culturing in the presence of xylose before subjecting to ethanol fermentation. This β-glucosidase possessed by the yeast itself can break down β-1,4 bonds of cellobiose contained in a large amount in the fermentation liquid used in ethanol production, and supply glucose which is a direct fermentation raw material for ethanol fermentation. . Thus, since the fermentation raw material glucose is procured from cellobiose in the fermentation liquid by β-glucosidase possessed by the yeast that performs ethanol fermentation, it is considered that the balance between glucose concentration and ethanol production is easily maintained. . As a result, it is difficult to inhibit glucose, ethanol can be produced at a high concentration, and the production efficiency is considered to increase. In addition, from this mechanism, it is considered that the use of a specific yeast having both xylose utilization ability and glucose utilization ability and capable of producing ethanol from these sugars is also effective.
（１）酵母
本発明のエタノールの生産方法では、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が用いられる。該酵母としてはカンジダ・インターメディアに属する酵母であれば特に限定されず、例えば、独立行政法人 製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）から入手可能なカンジダ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」等であってもよいし、カンジダ・インターメディアの突然変異株であってもよい。その中でも、本発明者がカンジダ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得したカンジダ・インターメディア「４−６−４Ｔ２」と命名し、「ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９」として独立行政法人 製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託した酵母を用いることが特に好ましい。
(1) Yeast In the ethanol production method of the present invention, yeast belonging to Candida intermedia is used. The yeast is not particularly limited as long as it belongs to Candida intermedia, and may be, for example, Candida intermedia “NBRC10601” available from the National Institute for Product Evaluation (NITE), It may be a mutant strain of Candida Intermedia. Among them, Candida intermedia “4-6-4T2” obtained by the present inventor by naturally mutating Candida intermedia “NBRC10601” as a parent strain according to a conventional method and selecting a strain having higher ethanol-producing ability than the parent strain. It is particularly preferable to use a yeast named “FERM BP-11509” and deposited with the National Institute for Product Evaluation (NITE).
前記４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する。ここで、グルコース及びキシロースとの共存下とは、少なくともグルコースとキシロースを含む原料液体（発酵用液）中に４−６−４Ｔ２が共存することを意味する。従来の酵母は、前述のようにキシロースの消費効率が十分でないもの、或いはグルコース又はキシロースのうちいずれか一方からのエタノール生産能を有するものの、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合は、カタボライトリプレッションによりグルコースが完全に消費されるまでキシロースがほとんど消費されないものであったが、４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合であっても、その両方から短時間で効率よくエタノールを生産する能力を有する。
また、４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースを含有する原料液体から短時間で効率良くエタノールを生産するが、このとき副生成物としてのキシリトールがほとんど生成されない。また、４−６−４Ｔ２は、このような糖からのエタノールの生産能力以外については親株と同等の性質を有する。
The 4-6-4T2 has an ability to efficiently produce ethanol from glucose and xylose in a short time in the presence of glucose and xylose. Here, coexistence with glucose and xylose means that 4-6-4T2 coexists in a raw material liquid (fermentation liquid) containing at least glucose and xylose. As described above, the conventional yeast has insufficient xylose consumption efficiency, or has ethanol-producing ability from either glucose or xylose, but when both glucose and xylose are present, catabolite repression Xylose was hardly consumed until glucose was completely consumed by 4-6-4T2, but both ethanol and ethanol were efficiently consumed in a short time even when both glucose and xylose were present. Have the ability to produce.
Moreover, 4-6-4T2 efficiently produces ethanol from a raw material liquid containing glucose and xylose in a short time, but at this time, almost no xylitol as a by-product is produced. Moreover, 4-6-4T2 has the same properties as the parent strain except for the ability to produce ethanol from such sugars.
（２）エタノール生産に供する前に実施する酵母の前培養
本発明においては、エタノール生産に供する前に、キシロースを０．５〜５質量％含有する培地で前培養を行う必要があり、培地中にキシロースを１〜３質量％含有することがより好ましい。キシロース含有量がこの範囲を外れた場合には、本発明のエタノール生産用の発酵用液中で効率のよいエタノール生産を行うことができない。
(2) Preculture of yeast to be performed before ethanol production In the present invention, it is necessary to perform preculture in a medium containing 0.5 to 5% by mass of xylose before being used for ethanol production. It is more preferable to contain 1 to 3% by mass of xylose. When the xylose content is outside this range, efficient ethanol production cannot be performed in the fermentation liquid for ethanol production of the present invention.
キシロースとしては、キシロースそのものを含有させてもよいし、キシロースを含有するセルロース系バイオマスを酵素法または希硫酸法等の加水分解法によって糖化した糖化液を用いることもでき、培地中のキシロース濃度が前記範囲になるように、セルロース系バイオマス糖化液を前培養の培地中に添加すればよい。なお、セルロース系バイオマスの糖化液には、キシロース以外にもグルコースやマンノースやガラクトース等のセルロースやヘミセルロース由来の糖が含まれ、これらの濃度が高いと生育阻害を起こす場合がある。そのため、キシロースおよび他の糖を含んだ培地中の全糖濃度は１０質量％以下とすることが好ましい。前培養の培地に含まれるキシロース以外の成分は特に限定されるものではないが、生育に適したアミノ酸、尿素、無機窒素塩、有機窒素塩、ポリペプトン、酵母アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源；酵母エキス等があげられる。 As xylose, xylose itself may be contained, or a saccharified solution obtained by saccharifying cellulosic biomass containing xylose by an enzymatic method or a hydrolysis method such as dilute sulfuric acid method may be used. What is necessary is just to add a cellulose biomass saccharified liquid to the culture medium of preculture so that it may become the said range. In addition, the saccharified solution of cellulose-based biomass contains, in addition to xylose, cellulose such as glucose, mannose, and galactose, and sugars derived from hemicellulose. If these concentrations are high, growth inhibition may occur. Therefore, the total sugar concentration in the medium containing xylose and other sugars is preferably 10% by mass or less. Components other than xylose contained in the pre-culture medium are not particularly limited, but nitrogen sources such as amino acids suitable for growth, urea, inorganic nitrogen salts, organic nitrogen salts, polypeptone, yeast amino acid-free nitrogen base, etc. A yeast extract and the like.
前培養の温度は、好ましくは１０℃〜３７℃であり、より好ましくは２５℃〜３２℃である。ｐＨは、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５である。
また、前培養は好気条件で行うことが好ましい。
The pre-culture temperature is preferably 10 ° C to 37 ° C, more preferably 25 ° C to 32 ° C. The pH is preferably 4-7, more preferably 4.5-6.5.
In addition, pre-culture is preferably performed under aerobic conditions.
（３）エタノール生産用発酵用液
本発明のエタノールの生産方法に用いられる発酵用液では、発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が１５〜８５％質量である発酵用液が用いられる。この糖類としては、セルロース系バイオマスの糖化液を用いることができる。
(3) Fermentation solution for ethanol production In the fermentation solution used in the ethanol production method of the present invention, the total content of all saccharides relative to the total amount of the fermentation solution is 8 to 20% by mass, and all saccharides are used. The liquid for fermentation whose content of cellobiose with respect to the total content of 15-85% is used. As this saccharide, a saccharified solution of cellulosic biomass can be used.
本発明で用いることができるセルロース系バイオマス糖化液とは、農業残渣（稲ワラ、麦ワラ、バガス（サトウキビの搾りかす）等）、林業残渣（材木等）等から得られるセルロース系バイオマス、すなわちセルロースとヘミセルロースを含むバイオマスを酵素法や希硫酸法等の加水分解法により糖類に分解して得られる液を指す。なお、セルロースはグルコースを構造単位とし、ヘミセルロースはグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトース等を構造単位とする多糖類である。 The cellulose-based biomass saccharified liquid that can be used in the present invention is cellulose-based biomass obtained from agricultural residues (rice straw, wheat straw, bagasse (sugar cane squeezed), etc.), forestry residues (timber, etc.), ie, cellulose and It refers to a liquid obtained by decomposing biomass containing hemicellulose into saccharides by a hydrolysis method such as an enzymatic method or dilute sulfuric acid method. Cellulose is a polysaccharide whose structural unit is glucose, and hemicellulose is a polysaccharide whose structural unit is glucose, xylose, mannose, galactose or the like.
本発明で用いられる発酵用液は、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％である必要があり、８〜１５質量％であることが好ましく、１０〜１５質量％であることがより好ましい。本発明のエタノール生産法によれば、従来よりも高いエタノール濃度まで発酵させることが可能となり、後の蒸留、濃縮工程にかかるエネルギーを削減することが可能となるが、糖濃度８質量％未満の場合、理論上、生産可能なエタノール濃度は４質量％未満と低く抑えられてしまい、本発明の効果を十分に発揮できない。そのため、糖濃度は８質量％以上とすることが好ましい。一方、糖類の濃度が高すぎる場合には酵母自身のエタノール耐性が十分でないため、糖類の濃度は２０質量％以下とする必要がある。 In the fermentation liquid used in the present invention, the total content of all saccharides with respect to the total amount of the fermentation liquid needs to be 8 to 20% by mass, preferably 8 to 15% by mass, and 10 to 15%. More preferably, it is mass%. According to the ethanol production method of the present invention, it is possible to ferment to a higher ethanol concentration than before, and it is possible to reduce the energy required for the subsequent distillation and concentration steps, but the sugar concentration is less than 8% by mass. In this case, theoretically, the ethanol concentration that can be produced is suppressed to a low level of less than 4% by mass, and the effects of the present invention cannot be exhibited sufficiently. Therefore, the sugar concentration is preferably 8% by mass or more. On the other hand, when the saccharide concentration is too high, the ethanol itself has insufficient ethanol resistance, so the saccharide concentration needs to be 20% by mass or less.
含有する糖類としては、本発明の発酵用液の必須成分であるセロビオースの他、セルロース系バイオマス糖化液に含まれるグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトース等が挙げられる。例えば、バガスやコーンストーバーや広葉樹等のセルロース系バイオマスの糖化液は、通常、含有する糖の単位としては（なお、グルコースを構造単位とするセルロースやセロビオースはグルコースとして換算）、グルコースとキシロースの質量比が７：３〜５：５程度であり、本発明ではこのような比率でグルコースとキシロースを含有するセルロース系バイオマス糖化液も用いることができる。また、さらに本発明に用いられる発酵用液中の各成分の含有量の範囲内であれば、必要に応じて、別途糖類を添加してもよい。 Examples of the saccharide to be contained include glucose, xylose, mannose, galactose and the like contained in cellulosic biomass saccharified liquid, in addition to cellobiose, which is an essential component of the fermentation liquid of the present invention. For example, saccharified liquids of cellulosic biomass such as bagasse, corn stover, and hardwood are usually used as sugar units (note that cellulose and cellobiose with glucose as a structural unit are converted to glucose), and the mass of glucose and xylose. The ratio is about 7: 3 to 5: 5. In the present invention, a cellulose-based biomass saccharified solution containing glucose and xylose at such a ratio can also be used. Furthermore, if it is in the range of content of each component in the fermentation liquid used for this invention, you may add saccharides separately as needed.
本発明で用いられる発酵用液に含まれるセロビオースは、グルコース同士がβ−１，４結合した２糖類であり、一般的にセルロース系バイオマスを分解、糖化することで得られる。本発明においては、全ての糖類の合計含有量に対するこのセロビオースの含有量が１５〜８５質量％である必要があり、２０〜７０質量％であることが好ましく、３０〜６０質量％であることがより好ましい。かかる濃度範囲とするためには、セルロース系バイオマスの糖化条件を、適宜、完全に単糖になる前のマイルドな条件とすることで調整することができる。また、通常の条件で得られたセルロース系バイオマス糖化液に、セロビオースを添加して調整してもよい。 Cellobiose contained in the fermentation liquid used in the present invention is a disaccharide in which glucoses are β-1,4 bonded, and is generally obtained by decomposing and saccharifying cellulosic biomass. In the present invention, the content of cellobiose with respect to the total content of all saccharides needs to be 15 to 85% by mass, preferably 20 to 70% by mass, and preferably 30 to 60% by mass. More preferred. In order to obtain such a concentration range, the saccharification conditions of the cellulosic biomass can be appropriately adjusted by making them mild conditions before becoming completely monosaccharides. Moreover, you may adjust by adding cellobiose to the cellulose biomass saccharified liquid obtained on the normal conditions.
本発明で用いることのできるセルロース系バイオマスの糖化液は、酵素法であっても、希硫酸法等の加水分解法であっても得ることができる。ただし、後者の加水分解法では分解後のｐＨがエタノール発酵には適さないため、揮発性の発酵阻害物質である酢酸やフルフラール等を軽減する目的および糖を濃縮する目的で蒸留工程等を行ったり、ｐＨを調整したりするなどして、本発明の発酵用液に用いるのに適した濃度やｐＨに調整する必要がある。また、加水分解法では、酵素法とは異なり、分解の過程で選択的にβ−１，４結合を残してセロビオースを本発明で必要とされる所定濃度に調整することが難しい。よって、本発明の発酵用液に用いる糖化液を得る手段としては、酵素法を用いることが好ましい。 The saccharified solution of cellulosic biomass that can be used in the present invention can be obtained by an enzymatic method or a hydrolysis method such as a dilute sulfuric acid method. However, in the latter hydrolysis method, the pH after decomposition is not suitable for ethanol fermentation, so a distillation step or the like is performed for the purpose of reducing acetic acid, furfural, etc., which are volatile fermentation inhibitors, and concentrating sugar. It is necessary to adjust the concentration and pH to be suitable for use in the fermentation liquid of the present invention by adjusting the pH. In addition, in the hydrolysis method, unlike the enzyme method, it is difficult to adjust the cellobiose to a predetermined concentration required in the present invention by selectively leaving β-1,4 bonds in the process of decomposition. Therefore, it is preferable to use an enzymatic method as a means for obtaining a saccharified solution used for the fermentation solution of the present invention.
酵素法としては、セルロース分解酵素であるセルラーゼが用いられる。セルラーゼは種々の酵素から構成されており、通常、非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖を切断するエンドグルカナーゼ、結晶性及び非結晶性セルロース鎖の末端からセロビオースで糖を切り出すセロビオヒドラーゼ、及びこれらの酵素により生成したセロビオースをグルコースに分解するβ−グルコシダーゼなどが含まれている。そのため、このセルラーゼ中のβ−グルコシダーゼの含有量を適宜調整することにより、セルロース系バイオマスがセロビオースを経てグルコースにまで十分に分解されるのを防ぎ、セロビオースを残すことができる。このように、酵素法によれば糖化液中の全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量を所定量に調整しやすい、よって、本発明の発酵用液に含有させる糖類としてセルロース系バイオマス糖化液を用いる場合には、この糖化液は酵素法によって製造することが好ましい。
なお、セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法において糖化法として酵素法を用いる場合には、酵素反応と発酵反応を同時に行う並行複発酵を採用することが効率的であるが、本発明のエタノール生産方法もこの並行複発酵を採用することができる。その場合、セロビオース濃度の調整は並行複発酵における酵素反応の調整により行うことができる。そして、本発明に適合するように並行複発酵の酵素反応を調整することは、並行複発酵の効率を高める効果も期待できる。理由は以下の通りである。並行複発酵において酵素反応が進み過ぎてグルコース濃度が高くなり過ぎると、グルコースがセロビオヒドラーゼに結合して活性低下し糖化効率が低下したり、グルコース阻害によりエタノール生産効率が低下したりする場合がある。しかし、本発明に適合するように、酵素反応を調整してセロビオース濃度を調整すれば、生成するグルコース量を調整することができる。その結果、並行複発酵におけるエタノール生産の効率性を高めることができる。
また、β−グルコシダーゼは、セルロースからグルコースを生産するために必要な他の酵素（エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ）に比べ、酵素活性が低く、グルコースを生産するためには多量必要であり、酵素法によるバイオエタノール製造のコストアップにつながっている。よって、本発明で用いるセロビオースを所定量含有させる上記の糖化液の製造方法では、このβ−グルコシダーゼ使用量を低減しつつもエタノール効率も高めることができるので、コスト面でも有利である。
Cellulase, which is a cellulolytic enzyme, is used as the enzyme method. Cellulase is composed of various enzymes, and is usually an endoglucanase that acts on non-crystalline cellulose to cleave the cellulose chain, cellobiohydrase that cleaves sugar with cellobiose from the ends of the crystalline and non-crystalline cellulose chains, And β-glucosidase that decomposes cellobiose produced by these enzymes into glucose. Therefore, by appropriately adjusting the content of β-glucosidase in this cellulase, it is possible to prevent cellulosic biomass from being sufficiently decomposed into glucose via cellobiose and leave cellobiose. Thus, according to the enzymatic method, it is easy to adjust the content of cellobiose relative to the total content of all saccharides in the saccharified solution to a predetermined amount. Therefore, cellulose-based biomass saccharification is used as the saccharide to be included in the fermentation liquid of the present invention. When a liquid is used, this saccharified liquid is preferably produced by an enzymatic method.
In addition, when using an enzymatic method as a saccharification method in an ethanol production method from cellulosic biomass, it is efficient to employ parallel double fermentation in which an enzyme reaction and a fermentation reaction are performed simultaneously, but the ethanol production method of the present invention Can also adopt this parallel double fermentation. In that case, the cellobiose concentration can be adjusted by adjusting the enzyme reaction in parallel double fermentation. And adjusting the enzyme reaction of parallel double fermentation so as to be compatible with the present invention can also be expected to increase the efficiency of parallel double fermentation. The reason is as follows. When the enzyme reaction proceeds too much in parallel double fermentation and the glucose concentration becomes too high, glucose binds to cellobiohydrase and the activity decreases and saccharification efficiency decreases, or ethanol production efficiency decreases due to glucose inhibition There is. However, the amount of glucose produced can be adjusted by adjusting the enzyme reaction to adjust the cellobiose concentration so as to conform to the present invention. As a result, the efficiency of ethanol production in parallel double fermentation can be increased.
In addition, β-glucosidase has a low enzyme activity compared to other enzymes (endoglucanase and cellobiohydrolase) necessary for producing glucose from cellulose, and a large amount is necessary for producing glucose. This has led to an increase in bioethanol production costs. Therefore, in the method for producing a saccharified solution containing a predetermined amount of cellobiose used in the present invention, the ethanol efficiency can be increased while reducing the amount of β-glucosidase used, which is advantageous in terms of cost.
本発明のエタノール生産に用いる発酵用液には、上記糖類の他にも適宜必要な成分を含有していてもよい。例えば、アミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源や、酵母エキス等を添加してもよい。なお、発酵方式として連続発酵法を用いた場合には、培養槽中のエタノールを含有する発酵液の抜き出し時に酵母も抜き出され、発酵槽内での酵母の増殖が必要となる場合が多いため、長期にわたる連続発酵を行う際には、このような成分を酵母の増殖に適するように適宜含有させることが好ましい。 The fermentation solution used for ethanol production of the present invention may contain necessary components as appropriate in addition to the above saccharides. For example, nitrogen sources such as amino acids, urea, polypeptone, amino acid-free nitrogen base, yeast extract, etc. may be added. In addition, when the continuous fermentation method is used as a fermentation method, yeast is also extracted when the fermentation solution containing ethanol in the culture tank is extracted, and it is often necessary to grow the yeast in the fermentation tank. When performing continuous fermentation over a long period of time, it is preferable to appropriately contain such components so as to be suitable for yeast growth.
（３）発酵条件
上記以外の発酵条件については、適宜、選択すればよいが、好ましい条件を挙げると以下の通りである。
(3) Fermentation conditions The fermentation conditions other than those described above may be selected as appropriate, but preferred conditions are as follows.
本発明のエタノール生産方法は、エア供給速度を０．００１〜５００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量とすることが好ましい。この範囲とすることでエタノール生産効率をより向上させることができる。エア供給速度は０．０５〜１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．５０〜１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．１０〜１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。 In the ethanol production method of the present invention, the air supply rate is preferably 0.001 to 500 L / hour / g dry cell weight. By setting it as this range, ethanol production efficiency can be improved more. The air supply rate is more preferably 0.05 to 100 L / hour / g dry cell weight, more preferably 0.50 to 10 L / hour / g dry cell weight, and 0.10 to 1.0 L / hour / g dry. The cell weight is particularly preferred.
本発明のエタノール生産方法は、回分発酵法で行ってもよいし連続発酵法で行ってもよいが、本発明のエタノール生産方法ではセルロース系バイオマスに含まれる通常は発酵しづらいセロビオースやキシロースからも効率的にエタノール生産を行うことができるため、これらを含有する発酵用液を連続投入しても効率的に消費出来る点で、連続発酵にも適している。本発明を連続発酵法で行う場合、発酵用液を０．０００２〜２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給することが好ましく、０．００５〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．０１〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。 The ethanol production method of the present invention may be carried out by a batch fermentation method or a continuous fermentation method, but in the ethanol production method of the present invention, cellobiose or xylose which is usually difficult to ferment contained in cellulosic biomass is also used. Since ethanol can be produced efficiently, it is suitable for continuous fermentation because it can be efficiently consumed even if a fermentation solution containing these is continuously added. When the present invention is performed by a continuous fermentation method, it is preferable to supply the fermentation solution into the fermentor at a supply rate of 0.0002 to 2 L / hour / g dry cell weight, and 0.005 to 0.5 L / hour. / G dry cell weight is more preferable, 0.01 to 0.5 L / hour / g dry cell weight is more preferable, and 0.01 to 0.1 L / hour / g dry cell weight is particularly preferable.
エタノール生産中の酵母濃度は、乾燥菌体重量で０．５〜５質量％に調整することが好ましい。回分発酵法においては、エタノール発酵工程前の増殖工程においてこの濃度に調整すればよい。連続発酵法においては、培養開始前に前培養した酵母をこの濃度の範囲となるように植菌するか、植菌後、酵母濃度を２倍程度の増殖をともなってもよく、エタノール生産中は発酵用液の供給速度（すなわち発酵液抜き出し速度）や酸素濃度等の培養条件を調整しこの濃度の範囲となるように調整すればよい。
エタノール生産中の温度は、２０〜３５℃とすることが好ましい。
It is preferable to adjust the yeast concentration during ethanol production to 0.5 to 5 mass% in terms of dry cell weight. In the batch fermentation method, the concentration may be adjusted in the growth step before the ethanol fermentation step. In the continuous fermentation method, the pre-cultured yeast is inoculated so as to be within this concentration range before the start of the culture, or after the inoculation, the yeast concentration may be multiplied by about twice, and during ethanol production, What is necessary is just to adjust culture | cultivation conditions, such as the supply speed | rate (namely, fermentation liquid extraction speed | rate) of fermentation liquid, and oxygen concentration, and it may adjust so that it may become this range of concentration.
The temperature during ethanol production is preferably 20 to 35 ° C.
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
（参考例１）
以下の手順に従い、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に保存されている酵母カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として、馴養及び自然変異により４−６−４Ｔ２株を取得した。
(Reference Example 1)
According to the following procedures, the yeast Candida intermedia “NBRC10601” stored in the National Institute for Biological Information (NITE), National Institute of Product Evaluation Technology, is used as a parent strain and subjected to 4-6 4T2 stock was acquired.
まず、グルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液のｐＨを水酸化マグネシウムにて５．０に調整し、この溶液２０％と液体培地（酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％）８０％を混合した。この混合溶液１０ｍＬにキシロースを１％添加し、酵母カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を１白金耳植菌し、３０℃で３日間培養し培養液を得た。
次いで、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液と液体培地を５０％ずつ混合し、この混合液１０ｍＬに上記３日間培養した培養液を１００μＬ添加し、更に７日間培養した。更に、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液８０％と培地２０％を混合し、この混合液１０ｍＬに上記７日間培養した培養液を１００μＬ加え３０日間更に培養し、馴養株液とした。
上記馴養株液を１０００倍希釈し、ＹＮＢ寒天培地（グルコース：５％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で４日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
First, the pH of an acetic acid aqueous solution containing 1% by mass of glucose and xylose was adjusted to 5.0 with magnesium hydroxide, 20% of this solution and a liquid medium (yeast extract: 1%, amino acid-free yeast nitrogen base) : 2%) 80% was mixed. 1% of xylose was added to 10 mL of this mixed solution, 1 platinum ear inoculation of yeast Candida intermedia “NBRC10601” was inoculated, and cultured at 30 ° C. for 3 days to obtain a culture solution.
Next, 50% of an acetic acid aqueous solution containing 1% by mass of glucose and xylose each having a pH adjusted to 5.0 in the same manner as described above and a liquid medium were mixed, and the culture solution cultured for 3 days in 10 mL of the mixture was added. 100 μL was added and further cultured for 7 days. Further, 80% acetic acid aqueous solution containing 1% by mass of glucose and xylose each adjusted to pH 5.0 in the same manner as above and 20% medium were mixed, and 10 mL of the mixed solution was cultured for 7 days. 100 μL was added and further cultured for 30 days to obtain a conditioned strain solution.
The acclimatized strain solution was diluted 1000 times and applied to a medium of YNB agar medium (glucose: 5%, yeast extract: 1%, amino acid-free yeast nitrogen base: 2%, agar: 2%) at 25 ° C. After culturing for 4 days, a strain having formed a colony was obtained.
上記取得した株をＹＮＢ寒天培地（トレハロース：２％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で３日間培養した後、コロニーが形成されたのを確認し、４℃で保管した。４℃において拡大したコロニーを選抜し、リン酸緩衝液（キシロース：２．５％、ＫＨ2ＰＯ4：０．１Ｍ、ｐＨ＝５．０、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００６Ｍ）でエタノール生産試験を実施し、親株よりもエタノール生産能の高い株を選抜した。 After the obtained strain was applied to a medium of YNB agar medium (trehalose: 2%, yeast extract: 1%, amino acid-free yeast nitrogen base: 2%, agar: 2%) and cultured at 25 ° C. for 3 days The colony was confirmed to be formed, and stored at 4 ° C. Colonies expanded at 4 ° C. were selected, and ethanol was added with a phosphate buffer (xylose: 2.5%, KH 2 PO 4 : 0.1 M, pH = 5.0, MgSO 4 .7H 2 O: 0.006 M). A production test was carried out, and a strain having a higher ethanol productivity than the parent strain was selected.
このようにして目的とする酵母を選抜し、これをカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）４−６−４Ｔ２株と命名した。本菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９である。 In this way, the target yeast was selected and named the Candida intermedia 4-6-4T2 strain. This strain has been deposited with the Patent Organism Depositary (NITE), National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE), and its deposit number is FERM BP-11509.
（実施例１）
カンジダ・インターメディア ＮＢＲＣ１０６０１をＹＮＢ培地（キシロース２質量％、２％酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃で前培養を行った。この前培養液を、発酵用液（グルコース５質量％、セロビオース５質量％、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．５））に２重量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加し、温度３０℃、エア供給量は０．２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量で、発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、エタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
なお、参考として上記発酵用液で糖類としてはグルコース１０質量％のみとした発酵用液を用いて、それ以外の条件は上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図１に示す。
Example 1
Candida intermedia NBRC10601 was added to YNB medium (xylose 2% by mass, 2% yeast nitrogen base (without amino acid), 1% yeast extract), and pre-cultured at a temperature of 30 ° C. for 48 hours. This pre-cultured solution is added to the fermentation solution (glucose 5% by mass, cellobiose 5% by mass, 0.1M phosphate buffer (pH 4.5)) at 2% by weight (corresponding to dry cell weight). Added, the temperature is 30 ° C, the air supply is 0.2 L / hour / g dry cell weight, ethanol is produced without supplying the fermentation solution and removing the fermentation solution, and the change in ethanol concentration over time It was measured.
For reference, ethanol was produced under the same conditions as described above using a fermentation solution in which only 10% by mass of glucose was used as the saccharide in the fermentation solution, and changes over time in the ethanol concentration were measured.
The above results are shown in FIG.
比較のために、前培養のＹＮＢ培地中の糖類としてキシロースに代えてグルコースを２質量％含有した培地を用いる以外は、上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図２に示す。
For comparison, ethanol production was carried out under the same conditions as above except that a medium containing 2% by mass of glucose was used instead of xylose as the saccharide in the pre-cultured YNB medium, and changes over time in the ethanol concentration were measured.
The above results are shown in FIG.
図１からは、キシロースを２質量％含有する培地で前培養した場合、全糖類を１０質量％含有しかつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いてエタノール生産を行ったものは、グルコース阻害がかかりづらく、比較的直線的にエタノールの生産をし続け、高濃度のエタノールを生産できることがわかる。一方、グルコースのみを１０質量％含有する発酵用液は初期の発酵速度は速いが、その後発酵速度が遅くなり、発酵後７２時間時後点でのエタノール濃度はセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液と比べ低くなっていることがわかる。すなわち、前者の発酵用液中のセロビオースをグルコース単位で換算した場合にほぼ同等量のグルコースを含有しているにもかかわらず、グルコース阻害の影響を受け、含有するグルコースが有効活用されていないことがわかる。 From FIG. 1, when pre-cultured in a medium containing 2% by mass of xylose, ethanol was produced using a fermentation solution containing 10% by mass of total saccharide and 50% by mass of cellobiose in the total saccharide. It can be seen that glucose is not easily hindered by glucose inhibition and can continue to produce ethanol relatively linearly to produce a high concentration of ethanol. On the other hand, the fermentation liquid containing only 10% by mass of glucose has a high initial fermentation rate, but then the rate of fermentation becomes slow, and the ethanol concentration at 72 hours after fermentation is 50% by mass of cellobiose in the total sugars. It turns out that it is low compared with the liquid for fermentation which contains. That is, when cellobiose in the former fermentation liquid is converted into glucose units, it contains almost the same amount of glucose, but it is affected by glucose inhibition and the contained glucose is not effectively utilized. I understand.
また、図２からは、前培養で糖類としてグルコースのみを含有する培地で培養した酵母をエタノール生産に供した場合には、グルコースからエタノール生産を行うことができるが、セロビオースからのエタノール量が極めて低いことがわかる。 In addition, from FIG. 2, when yeast cultured in a medium containing only glucose as a saccharide in the preculture is used for ethanol production, ethanol production from glucose can be performed, but the amount of ethanol from cellobiose is extremely high. It turns out that it is low.
（実施例２）
酵母としてカンジダ・インターメディア ＮＢＲＣ１０６０１に代えてカンジダ・インターメディア ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９）を用いた以外は、前培養、エタノール生産とも全て実施例１と同様に行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図３に示す。
(Example 2)
Except for using Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) instead of Candida intermedia NBRC10601 as yeast, all of the preculture and ethanol production were carried out in the same manner as in Example 1, and the ethanol concentration over time. Changes were measured.
The above results are shown in FIG.
また、比較のために、前培養のＹＮＢ培地中の糖類としてキシロースに代えてグルコースを２質量％含有した培地を用いる以外は、上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図４に示す。
For comparison, ethanol production was carried out under the same conditions as above except that a medium containing 2% by mass of glucose was used instead of xylose as the saccharide in the pre-cultured YNB medium, and changes in ethanol concentration over time were measured. did.
The above results are shown in FIG.
図３、図４によれば、実施例で用いたＮＢＲＣ１０６０１株と同じく、カンジダ・インターメディアに属する４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９）を用いた場合でも、同様の傾向を示し、キシロースの全培養と全糖類合計量当たりセロビオースを５０質量％含有する発酵液を用いることで、効率的なエタノール生産ができることがわかる。 According to FIGS. 3 and 4, similar to the NBRC10601 strain used in the examples, even when 4-6-4T2 (FERM BP-11509) belonging to Candida intermedia was used, the same tendency was observed. It can be seen that efficient ethanol production can be achieved by using the fermentation broth containing 50% by mass of cellobiose per total culture and total amount of saccharides.
（実施例３）
カンジダ・インターメディア ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０９）をＹＮＢ培地（キシロース２質量％、グルコース１質量％、２％酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃で前培養を行った。この前培養液を、発酵用液（全糖類合計量１３質量％（糖類の種類と含有量は表１の通り）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．５））に２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加し、温度３０℃、エア供給量は０．２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量で、発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、エタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
結果を図５に示す。
(Example 3)
Candida intermedia 4-6-4T2 (FERM BP-11509) was added to YNB medium (xylose 2% by mass,
The results are shown in FIG.
図５によれば、全糖類の合計量に占めるセロビオースの含有率が本発明の範囲内である（２）〜（５）の発酵用液は、セロビオースを含有せずグルコースを多く含む（１）の発酵用液よりもエタノール生産効率が高いことがわかる。
また、セロビオースによるエタノール生産効率向上効果は、セルロース系バイオマス糖化液に含まれるキシロースの共存下においても発揮できることがわかる。なお、セルロース系バイオマス（バガス、コーンストーバー、広葉樹）の場合、通常、含有する糖の単位としては（なお、グルコースを構造単位とするセルロースやセロビオースはグルコースとして換算）、グルコースとキシロースの質量比が７：３〜５：５の範囲であるため、（１）〜（５）の発酵液はセルロース系バイオマス糖化液を模擬したものといえる。
したがって、本発明はセルロース系バイオマス糖化液からの効率的なエタノール生産方法として極めて有用であることがわかる。
According to FIG. 5, the content of cellobiose in the total amount of all saccharides is within the scope of the present invention. The liquid for fermentation of (2) to (5) does not contain cellobiose and contains a large amount of glucose (1). It can be seen that the ethanol production efficiency is higher than the fermentation liquid.
Moreover, it turns out that the ethanol production efficiency improvement effect by a cellobiose can be exhibited even in the coexistence of the xylose contained in a cellulose biomass saccharified liquid. In the case of cellulosic biomass (bagasse, corn stover, hardwood), the unit of sugar to be contained is usually (cellulose or cellobiose with glucose as a structural unit is converted to glucose), and the mass ratio of glucose to xylose is Since it is the range of 7: 3-5: 5, it can be said that the fermentation liquid of (1)-(5) imitates the cellulosic biomass saccharified liquid.
Therefore, it turns out that this invention is very useful as an efficient ethanol production method from a cellulose biomass saccharified liquid.
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