JP2014022323A - 試料ホルダおよび電子顕微鏡像の観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生物試料を染色等することなく、極めて簡便に且つ大気圧下で、高分解能・高コントラストの電子顕微鏡観察を可能とすること。
【解決手段】試料ホルダ２０の上部本体２１の内部には、絶縁性薄膜１１と２次電子放射防止薄膜１２の積層体が設けられており、電子銃４０から射出された電子線４１は２次電子放射防止薄膜側から入射する。絶縁性薄膜１１の下面は試料付着面であり、観察対象となる試料３０が吸着等により保持されている。２次電子放射防止薄膜１２は２次電子放出係数δが小さい材質から成り、好ましくは非絶縁性である。つまり、２次電子放射防止薄膜１２は電気的抵抗が高いながらも導電性を有しているため、電子線照射部位の帯電レベルは低くなる。その結果、電子線照射による帯電効果は低減し、２次電子放射防止薄膜１２の表層で発生した２次電子が膜外へと放射され難くなり、２次電子放出に起因する画像のコントラスト低下が抑制される。
【選択図】図１

Description

本発明は電子顕微鏡像の観察技術に関し、特に、照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料を、コントラストの高い鮮明な電子顕微鏡像画像として観察するに好適な技術に関する。

走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、無機材料系試料や有機材料系試料の形態観察はもとより生物試料の観察にも広く用いられ、バクテリアやウィルスといった肉眼では観察不能な微生物の観察に好適な機器である。

しかし、このような生物試料は電子線の照射により損傷を受けやすいことに加え、高いコントラストの画像を得にくいという問題がある。このため、生物試料をＳＥＭ観察する場合、一般には、観察対象である試料をホルムアルデヒド等で固定化して金やプラチナあるいはカーボン等を表面にコーティングしたり重金属等で染色するなどの手法により前処理を行い、これにより、試料への電子線ダメージを軽減するとともにコントラストを高めるという工夫がなされる。

また、最近では、生物試料に対して上述のコーティングや染色を施すことなく高コントラストの画像を得る手法も開発されている（特許文献１および非特許文献１を参照）。この方法では、薄い試料支持膜（カーボン膜）の下面（裏面）に観察対象試料を付着させ、試料支持膜の上面（表面）から比較的低い電圧で加速された電子線を照射する。試料支持膜に入射した電子線は支持膜内部で拡散しながら広がり、支持膜の下面付近に到達した電子が２次電子を放出する。この２次電子は支持膜下面に付着している観察対象試料に吸収され、これによりコントラストが形成され、鮮明なＳＥＭ画像を得ることができる。

このような２次電子のエネルギは１０ｅＶ程度と極めて低く、生物試料に吸収されても殆どダメージを与えることがないだけではなく、この電子線の吸収の度合いがそのままコントラストとして得られるために極めてクリアで高コントラストなＳＥＭ画像を得ることができる。このような観察条件は、「間接２次電子コントラスト条件」と呼ばれる。

また、この方法をさらに進展させ、絶縁性薄膜の下部に導電性薄膜を形成し、電子線入射に起因する帯電効果を利用して、分解能やコントラストを更に向上させる方法も開発されている（特許文献２および非特許文献２を参照）。

特開2010-097844号公報 特願2011-286018の明細書

T.Ogura,「A high contrast method of unstained biological samples under a thin carbon film by scanning electron microscopy」, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377, p79-84 (2008) T.Ogura,「Direct observation of the inner structure of unstained atmospheric cells by low-energy electrons」, Meas. Sci. Technol. Vol.23, 085402(8pp) (2012)

上述したように、従来は、電子線照射により損傷を受けやすく且つ高いコントラストの画像を得にくい生物試料をＳＥＭ観察する場合、表面コーティングや染色の処理を行っていた。しかし、このような処理には熟練が必要であるのみならず、染色に用いられる薬剤は主として酢酸ウラン等の有害物質であるため環境面からも好ましくない。

また、間接２次電子コントラスト条件で観察されたＳＥＭ画像は極めてコントラストが高いものの、分解能は比較的低いという問題がある。加えて、さらに、通常条件で加速された低エネルギの２次電子では、観察試料の内部を透過することができず、内部構造観察には適さない。

一方、上述した絶縁性薄膜の下部に導電性薄膜を形成して電子線入射に起因する帯電効果を利用する方法において生物試料を導電性薄膜下部に付着させて観察を行うと、２次電子の散乱に起因して分解能が低下してしまう。

これは、導電性薄膜がグランド電位となるため、電子線照射による帯電効果により絶縁性薄膜から導電性薄膜へと２次電子が透過してしまい、生物試料が保持されている位置には電位勾配が形成されないためである。この現象は、生物試料を試料ホルダ内に大気圧下で密閉して観察する場合にはより顕著となる。さらに、絶縁性薄膜上部では、帯電による２次電子が多量に発生し、これも画像のコントラストを低下させる原因となる。

本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、走査型電子顕微鏡による観察を行うに際し、生物試料を染色等することなく、極めて簡便に且つ大気圧下で、高分解能・高コントラストの観察を可能とし、電子線によるダメージも大幅に低減さ得る試料ホルダならびにこれを用いた電子顕微鏡像の観察方法を提供することにある。

上述の課題を解決するために、本発明に係る試料ホルダは、電子顕微鏡像の観察に用いられる試料ホルダであって、２次電子放出係数δが小さい２次電子放射防止薄膜側を電子線入射面とし絶縁性薄膜側を試料付着面とする２次電子放射防止薄膜と絶縁性薄膜の積層体と、前記絶縁性薄膜に対向し且つ離間して設けられた導電性薄膜とを備え、前記導電性薄膜の電位は、電子顕微鏡のグランド電位と同電位若しくはプラス電位に制御可能である、ことを特徴とする。

好ましくは、前記２次電子放射防止薄膜は非絶縁性である。

例えば、前記２次電子放射防止薄膜は、チタン、カーボン、アルミニウム、シリコンの何れかを主成分とする。

また、例えば、前記２次電子放射防止薄膜の厚みが３０ｎｍ以下である。

好ましくは、前記絶縁性薄膜は、窒化シリコン、酸化シリコン、カプトン、ポリイミドの何れかを主成分とする。

例えば、前記絶縁性薄膜の厚みが２００ｎｍ以下である。

好ましくは、前記導電性薄膜は、ニッケル、チタン、アルミニウム、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とする。

例えば、前記導電性薄膜の厚みが３０ｎｍ以下である。

本発明に係る試料ホルダは、前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射側の表面に金属粒子を付着させている態様としてもよい。

この場合、好ましくは、前記金属粒子の直径は１０μｍ以下である。

また、本発明に係る試料ホルダは、前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射面若しくは前記絶縁性薄膜の試料付着面に金属パターンが設けられている態様としてもよい。

この場合、好ましくは、前記金属パターンの線幅は１０μｍ以下である。

さらに、本発明に係る試料ホルダは、前記絶縁性薄膜の試料付着面が親水化処理されている態様としてもよく、前記絶縁性薄膜の試料付着面に試料吸着材を備えている態様とすることもできる。

この場合、好ましくは、前記絶縁性薄膜の試料付着面の端部には吸水材が設けられている。

本発明に係る試料ホルダは、例えば、前記絶縁性薄膜と前記導電性薄膜とは高さが２００μｍ以下のスペーサにより離間されている。

また、本発明に係る試料ホルダは、前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射面側に、電子線入射照射領域の直径に略等しい直径の開口部を有する視野絞りを備えている態様としてもよい。

本発明に係る電子顕微鏡像の観察方法は、本発明に係る試料ホルダを用いた電子顕微鏡像の観察方法であって、電子線の加速電圧を、入射電子の５０％以上が前記積層体内で吸収若しくは遮蔽される値に設定し、該電子線を前記電子線入射面上で走査する。

また、本発明に係る電子顕微鏡像の観察方法は、前記絶縁性薄膜の試料付着面に液体を滴下し、該液体で観察試料を保持する態様としてもよい。

本発明に係る試料ホルダに設けられる２次電子放射防止薄膜は、電気的抵抗は高いながらも導電性を有している。このため、電子線照射部位の帯電レベルは低く、上述の電子線照射による帯電効果が低減され、２次電子放射防止薄膜の表層で発生した２次電子が膜外へと放射されて画像のコントラストを低下させることがない。

一方、絶縁性薄膜は、入射電子により帯電して内部がマイナスの電位となる。生物試料等の観察試料はこの絶縁性薄膜の下面に保持されており、導電性薄膜が対向して設けられている。この導電性薄膜を電子顕微鏡のグランド電位と同電位若しくはプラス電位に制御した場合には、絶縁性薄膜と導電性薄膜との間に電位勾配が生じ、生物試料の内部を透過した２次電子がこの電位勾配に沿って移動することとなるため、試料内部で散乱され難くなり分解能が向上する。

また、入射電子線の多くは、２次電子放射防止薄膜と絶縁性薄膜の積層体の内部で散乱乃至は吸収され、観察試料への電子線ダメージが大幅に低減する。

さらに、絶縁性薄膜の試料付着面を親水化処理し、この絶縁性薄膜の試料付着面に、試料吸着材としての液体（水溶液等）を滴下して観察試料を保持する態様とすれば、細胞や細菌、ウィルス等の生物試料を生きた状態で観察することも可能となる。なお、試料吸着材は液体（水溶液）に限定されず、その材質等は観察対象の試料に応じて適宜変更すればよい。

本発明に係る試料ホルダの構成例の概要を説明するためのブロック図である。 絶縁性薄膜１１と２次電子放出係数δが小さい２次電子放射防止薄膜１２の積層体に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子を示す図である。 絶縁性薄膜１１と２次電子放出係数δが大きい薄膜１２Ｈの積層体に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子を示す図である。 絶縁性薄膜１１に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子を示す図である。 薄膜として２次電子放出係数δが小さなＴｉを形成して撮影したバクテリアのＳＥＭ画像である。 薄膜として２次電子放出係数δが大きなＣｒを形成して撮影したバクテリアのＳＥＭ画像である。 薄膜を形成することなく絶縁性薄膜に電子線を直接入射させて撮影したバクテリアのＳＥＭ画像である。 絶縁性薄膜に対向し且つ離間して設けられる導電性薄膜の効果を説明するための図で、電子線入射により発生した２次電子の状態を示す図である。 絶縁性薄膜に対向し且つ離間して設けられる導電性薄膜の効果を説明するための図で、２次電子が観察試料を透過して導電性薄膜の下部から出射する状態を示す図である。 導電性薄膜の有無が画像のコントラストに及ぼす影響について説明するためのＳＥＭ画像で、導電性薄膜としてＮｉが形成されている場合のＳＥＭ画像である。 導電性薄膜の有無が画像のコントラストに及ぼす影響について説明するためのＳＥＭ画像で、導電性薄膜が形成されていない場合のＳＥＭ画像である。 絶縁性薄膜の試料付着面に親水化処理を施し、この試料付着面に液体（水溶液）を滴下して形成した液体層で観察試料としての生物試料を大気圧下で保持した状態でＳＥＭ像を得る態様を説明する図である。 ２次電子放射防止薄膜に、フォーカス調整等のための金属粒子を設けた態様を説明するための図である。 ２次電子放射防止薄膜に、フォーカス調整等のための金属パターンを設けた態様を説明するための図である。

以下に、図面を参照して、本発明の試料ホルダならびにこれを用いた電子顕微鏡像の観察方法について説明する。

図１は、本発明に係る試料ホルダの構成例の概要を説明するためのブロック図である。この図に示した例では、試料ホルダ２０は、上部本体２１と下部本体２２とを備えている。上部本体２１の内部には、絶縁性薄膜１１と２次電子放射防止薄膜１２の積層体が設けられており、電子銃４０から射出された電子線４１は２次電子放射防止薄膜側から入射する。絶縁性薄膜１１の下面は試料付着面であり、観察対象となる試料３０が吸着等により保持されている。なお、符号１３および１８で示したものは、試料ホルダ２０の機械的な強度を担保等するためのフレームである。

２次電子放射防止薄膜１２は２次電子放出係数δが小さい材質から成り、好ましくは非絶縁性である。つまり、２次電子放射防止薄膜１２は電気的抵抗が高いながらも導電性を有しているため、電子線照射部位の帯電レベルは低くなる。その結果、電子線照射による帯電効果は低減し、２次電子放射防止薄膜１２の表層で発生した２次電子が膜外へと放射され難くなり、２次電子放出に起因する画像のコントラスト低下が抑制される。

このような２次電子放射防止薄膜１２の材質としては、チタン、カーボン、アルミニウム、シリコンの何れかを主成分とするものを例示することができる。また、２次電子放射防止薄膜１２の厚みは、例えば、３０ｎｍ以下とする。

電子線の加速電圧は、好適には、入射電子の５０％以上が絶縁性薄膜１１と２次電子放射防止薄膜１２の積層体の内部で吸収若しくは遮蔽される値に設定され、この電子線を電子線入射面上で走査する。そして、試料３０を透過してきた２次電子４２を、２次電子検出器５０により検知して得られた強度プロファイルにより２次元的なＳＥＭ画像を得る。

入射した電子線４１は絶縁性薄膜１１の内部で拡散しながら広がり（拡散領域１４）、２次電子を生成しながら絶縁性薄膜１１の下面（試料付着面）に到達する。電子線４１が入射すると、絶縁性薄膜１１の絶縁性のために、絶縁性薄膜１１の電位は電子注入量に応じた負の電位となる。

絶縁性薄膜１１に対向して、スペーサ１５を介して、耐圧性を有する導電性薄膜１６が離間して設けられており、当該離間内部は絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１６により密閉され、内圧を大気圧に保持することも可能である。スペーサ１５の高さ、すなわち、絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１６との間隔は、例えば、２００μｍ以下とする。

絶縁性薄膜１１の材質としては、窒化シリコン、酸化シリコン、カプトン、ポリイミドの何れかを主成分とするものを例示することができ、絶縁性薄膜１１の厚みは、例えば、２００ｎｍ以下とする。

また、導電性薄膜１６の材質としては、ニッケル、チタン、アルミニウム、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とするものを例示することができ、導電性薄膜１３の厚みは、例えば、３０ｎｍ以下であるとする。

なお、図１に示した態様では、導電性薄膜１６の耐圧性を担保するために、下面側に耐圧薄膜１７を設けている。

導電性薄膜１６の電位は、電子顕微鏡のグランド電位と同電位若しくはプラス電位に制御可能とされる。その結果、帯電により負電位となっている絶縁性薄膜１１との間に急峻な電位勾配が形成され、観察試料３０の内部を透過した２次電子がこの電位勾配に沿って移動することとなり、試料内部で散乱され難くなり分解能が向上する。

なお、導電性薄膜１６の電位制御は、例えば、導電性薄膜１６に電位制御のための電極等を設け、試料ホルダ２０に設けられた端子等からの外部から電圧を印加するなどして行う。

また、図１に示したように、試料ホルダ２０の上部２次電子放射防止薄膜の電子線入射面側）に、電子線入射照射領域の直径に略等しい直径の開口部を有する視野絞り２３を設けたり、試料ホルダ２０の下部（電子線出射面側）に視野絞り２４を設けたりしてもよい。

視野絞り２３は、電子線入射部位から上方へと放出される２次電子を試料ホルダ２０外へと漏れ出すことを防止することに寄与する。このような２次電子は試料３０の情報を含んでいないため、これが検知されてしまうと画質を落としてしまう。また、視野絞り２４は、試料ホルダ２０の下部から出射され２次電子検出器５０によって検知される２次電子の視野角を限定するためのもので、観察画像の分解能向上に寄与する。

図２Ａ〜図２Ｃは電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子を模式的に示す図で、図２Ａは絶縁性薄膜１１と２次電子放出係数δが小さい２次電子放射防止薄膜１２の積層体に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子、図２Ｂは絶縁性薄膜１１と２次電子放出係数δが大きい薄膜１２Ｈの積層体に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子、そして、図２Ｃは絶縁性薄膜１１に電子線が入射した際の２次電子の放射（放出）の様子を示している。

図２Ａに示す態様では、絶縁性薄膜１１の上に２次電子放出係数δが小さい２次電子放射防止薄膜１２を積層させているため、電子線４１が入射した際に表層から放出される２次電子４３の量が低減する。また、この２次電子放射防止薄膜１２は若干の導電性を有しているため、表層の帯電レベルが低く抑えられ、帯電効果による２次電子の放出も抑制される。

一方、図２Ｂに示す態様では、絶縁性薄膜１１の上に２次電子放出係数δが大きい薄膜１２Ｈを積層させているため、電子線４１が入射した際の表層からの２次電子４３の放出量が多く、これが２次電子検出器に検出されて画像のコントラストを低下させる。

また、図２Ｃに示す態様では、絶縁性薄膜１１に電子線４１が直接入射するため、当該絶縁性薄膜１１の内部に大量の電子が蓄積され、表面が大きな負電位となる。このため、絶縁性薄膜１１の表層に生じた２次電子４３はクーロン反発力により外部へと放出され、これが画像のコントラストを低下させる。

図３Ａ〜図３Ｃは、絶縁性薄膜１１の上部に設けられる薄膜の有無および当該薄膜の２次電子放出係数δの違いが画像のコントラストに及ぼす影響について説明するためのＳＥＭ画像で、これらの観察はバクテリアを試料として行っている。なお、観察条件は何れも、加速電圧２．６ｋＶで倍率３万とした。

図３Ａは薄膜として２次電子放出係数δが小さいＴｉ（２次電子放射防止薄膜）を厚み５ｎｍで形成して得たＳＥＭ画像であり、図３Ｂは薄膜として２次電子放出係数δが大きなＣｒを形成して得たＳＥＭ画像であり、図３Ｃは薄膜を形成することなく絶縁性薄膜に電子線を直接入射させたＳＥＭ画像である。

薄膜として２次電子放出係数δが小さいＴｉが形成されている場合（図３Ａ）、電子線が入射した際に表層から放出される２次電子の量が低減するとともに表層の帯電レベルも低く抑えられ、高いコントラストの画像が得られ、バクテリアの内部や鞭毛の様子を鮮明に観察することができる。

これに対して、Ｔｉよりも２次電子放出係数が大きなＣｒの薄膜（厚み５ｎｍ）が形成されている場合（図３Ｂ）、２次電子放出量が多いために全体的に白みがかった画像となりコントラストが低下する。その結果、バクテリアの内部や鞭毛の様子を観察し難くなる。

また、このような薄膜を形成することなく絶縁性薄膜に電子線を直接入射させた場合（図３Ｃ）、帯電レベルが部位ごとに異なる結果としての帯電ムラが生じ、試料の中央部に本来の構造には無いはずの「白抜け」が観察されてしまう。

図４Ａおよび図４Ｂは、絶縁性薄膜１１に対向し且つ離間して設けられる導電性薄膜１６の効果を説明するための図で、図４Ａは電子線入射により発生した２次電子の状態を、図４Ｂは上記２次電子が観察試料３０を透過して導電性薄膜１６の下部から出射する状態を、それぞれ示している。なお、この図に示した例では、スペーサ１５を介して設けられた絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１６の離間内部の圧力は大気圧とされている。

２次電子放出係数δが小さいＴｉ等の２次電子放射防止薄膜１２は抵抗Ｒｓを介してグランド電位とされ、導電性薄膜１６もまたグランド電位とされている。

電子線４１が入射すると、２次電子放射防止薄膜１２の内部で発生した２次電子の多くは絶縁性薄膜１１へと流れ込み、絶縁性薄膜１１は帯電して負電位となる。そのため、グランド電位にある導電性薄膜１６との間に急峻な電位勾配が形成される（図４Ａ）。そして、絶縁性薄膜１１の下面から射出された２次電子はこの電位勾配に沿って観察試料３０へと入射・移動し、一部は試料内部で吸収され、残りの２次電子が試料３０を透過して導電性薄膜１６の下面から出射する（図４Ｂ）。出射した２次電子４２は２次電子検出器により検出され画像を形成する。上記電位勾配は、観察試料３０が生物試料である場合にも形成されるから、生物試料の内部の構造等を大気圧下で、しかも高いコントラストと分解能の下で観察することができる。

なお、この図に示した例では、導電性薄膜１６の電位はグランド電位（０Ｖ）とされているが、プラス電位（正電位）としてもよい。

図５Ａおよび図５Ｂは、導電性薄膜１６の有無が画像のコントラストに及ぼす影響について説明するためのＳＥＭ画像で、これらの観察もバクテリアを試料として行っている。なお、観察条件は何れも、加速電圧２．６ｋＶで倍率３万とした。

図５Ａは導電性薄膜１６として厚みが５ｎｍのＮｉが形成されている場合のＳＥＭ画像であり、図５Ｂは導電性薄膜１６が形成されていない場合のＳＥＭ画像である。

導電性薄膜１６として厚みが５ｎｍのＮｉが形成されている場合（図５Ａ）、バクテリアの細胞壁や細胞内部が極めてクリアに観察され、高い分解能であることが確認できる。高い分解能の画像がコントラストも良好に得られており、バクテリアの細胞壁や内部の様子を鮮明に観察することができる。

これに対して、導電性薄膜１６が形成されていない場合（図５Ｂ）、コントラストは顕著に低下して画像は全体的にボケたものとなり、細胞壁や内部の様子が観察し難くなる。

図６は、絶縁性薄膜１１の試料付着面に親水化処理を施し、この試料付着面に、試料吸着材としての液体（水溶液）６１を滴下して１００ｎｍ以下程度の薄い液体層を形成させ、この液体層で観察試料３０としての生物試料を大気圧下で保持した状態でＳＥＭ像を得る態様を説明する図で、絶縁性薄膜１１の試料付着面の端部には上記液体（水溶液）を拡散させないための吸水材６２が設けられている。なお、この図では、試料吸着材が液体（水溶液）である例を示したが、その材質等は観察対象の試料に応じて適宜変更可能である。

生物試料３０は、この液体層に一部が浸る状態で保持されるため、生物試料３０の生きたままでの観察が可能となる。なお、上記液体層は、透過２次電子の散乱を減少させ、分解能を高める効果も奏する。

図７Ａおよび図７Ｂは、２次電子放射防止薄膜１２に、フォーカス調整等のための金属粒子７１（図７Ａ）や金属パターン７２（図７Ｂ）を設けた態様を説明するための図で、（ａ）は断面図で（ｂ）は上面図である。

絶縁性薄膜１１や２次電子放射防止薄膜１２は極めて平坦であるため、フォーカスや非点調整が困難である。そのため、直径が１０μｍ以下の金属粒子７１や線幅が１０μｍ以下の金属パターン７２を適当な間隔で設けておくと、フォーカスや非点の調整が容易となる。

なお、金属パターン７２は、絶縁性薄膜１１の試料付着面に設けるようにしてもよい。

上述したように、本発明により、照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料の電子顕微鏡像を、表面コーティングや染色の処理を行うことなく、高分解能でコントラスト高く観察することを可能とする技術が提供される。本発明は特に、バクテリアやウィルス或いはタンパク質複合体等の生物試料の観察に有用である。

１１ 絶縁性薄膜
１２ ２次電子放射防止薄膜
１２Ｈ ２次電子放射係数の大きい薄膜
１６ 導電性薄膜
１３、１８ フレーム
１４ 拡散領域
１５ スペーサ
１７ 耐圧薄膜
２０ 試料ホルダ
２１ 上部本体
２２ 下部本体
２３、２４ 視野絞り
３０ 試料
４０ 電子銃
４１ 電子線
４２、４３ ２次電子
５０ ２次電子検出器
６１ 液体（水溶液）
６２ 吸水材
７１ 金属粒子
７２ 金属パターン

Claims (19)

1. 電子顕微鏡像の観察に用いられる試料ホルダであって、
   ２次電子放出係数δが小さい２次電子放射防止薄膜側を電子線入射面とし絶縁性薄膜側を試料付着面とする２次電子放射防止薄膜と絶縁性薄膜の積層体と、前記絶縁性薄膜に対向し且つ離間して設けられた導電性薄膜とを備え、
   前記導電性薄膜の電位は、電子顕微鏡のグランド電位と同電位若しくはプラス電位に制御可能である、
   ことを特徴とする試料ホルダ。
2. 前記２次電子放射防止薄膜は非絶縁性である、請求項１に記載の試料ホルダ。
3. 前記２次電子放射防止薄膜は、チタン、カーボン、アルミニウム、シリコンの何れかを主成分とする、請求項１に記載の試料ホルダ。
4. 前記２次電子放射防止薄膜の厚みが３０ｎｍ以下である、請求項１に記載の試料ホルダ。
5. 前記絶縁性薄膜は、窒化シリコン、酸化シリコン、カプトン、ポリイミドの何れかを主成分とする、請求項１に記載の試料ホルダ。
6. 前記絶縁性薄膜の厚みが２００ｎｍ以下である、請求項１に記載の試料ホルダ。
7. 前記導電性薄膜は、ニッケル、チタン、アルミニウム、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とする、請求項１に記載の試料ホルダ。
8. 前記導電性薄膜の厚みが３０ｎｍ以下である、請求項１に記載の試料ホルダ。
9. 前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射側の表面に金属粒子を付着させている、請求項１に記載の試料ホルダ。
10. 前記金属粒子の直径は１０μｍ以下である、請求項９に記載の試料ホルダ。
11. 前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射面若しくは前記絶縁性薄膜の試料付着面に金属パターンが設けられている、請求項１に記載の試料ホルダ。
12. 前記金属パターンの線幅は１０μｍ以下である、請求項１１に記載の試料ホルダ。
13. 前記絶縁性薄膜の試料付着面が親水化処理されている、請求項１に記載の試料ホルダ。
14. 前記絶縁性薄膜の試料付着面に試料吸着材を備えている、請求項１に記載の試料ホルダ。
15. 前記絶縁性薄膜の試料付着面の端部には吸水材が設けられている、請求項１３に記載の試料ホルダ。
16. 前記絶縁性薄膜と前記導電性薄膜とは高さが２００μｍ以下のスペーサにより離間されている、請求項１に記載の試料ホルダ。
17. 前記２次電子放射防止薄膜の電子線入射面側に、電子線入射照射領域の直径に略等しい直径の開口部を有する視野絞りを備えている、請求項１に記載の試料ホルダ。
18. 請求項１乃至１７の何れかに記載の試料ホルダを用いた電子顕微鏡像の観察方法であって、
    電子線の加速電圧を、入射電子の５０％以上が前記積層体内で吸収若しくは遮蔽される値に設定し、該電子線を前記電子線入射面上で走査する、電子顕微鏡像の観察方法。
19. 請求項１３に記載の試料ホルダを用いた電子顕微鏡像の観察方法であって、
    前記絶縁性薄膜の試料付着面に液体を滴下し、該液体で観察試料を保持する、電子顕微鏡像の観察方法。