JP2014018150A - 核酸クロマトグラフィー検査具およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】表示部を形成する際の作業効率を向上させる技術を提供する。
【解決手段】細長形状の多孔性シート１０と、バッキング部材と、を備え、多孔性シート１０は、表面に、標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定されている帯状の表示部１５を有し、表示部１５は複数の非真円形状のスポットの集合体により形成されている核酸クロマトグラフィー検査具１ａ。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、感染症やアレルギーなどに関する診断や、細菌やウィルスなどの検出に使用可能な核酸クロマトグラフィー検査具に関する。

ウィルスや細菌に由来する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の有無、および特定の疾患や体質に関連した変異遺伝子に由来する核酸の有無を調べることにより、感染症、腫瘍などの遺伝性疾患、体質などを的確に診断することが可能である。例えば、ウィルス感染の有無を診断する場合には、患者の粘膜などから試料を採取し、ＰＣＲ法を用いてウィルスに由来する核酸のみを増幅する処理を行う。この処理で得られた試料において、ウィルスに由来する核酸が検出されると、患者がウィルスに感染しているものと判定することができる。今日では、ゲノム解析の発展によって核酸の塩基配列に関する情報が蓄積されているのに加え、ＰＣＲ法の改良によって、ウィルスや細菌に由来する核酸や特定の変異遺伝子に由来する核酸を選択的に増幅することはたやすくなっている。そこで、上述した核酸を対象とした診断法の適用をさらに一般的に広めるため、特定の核酸の有無を簡便に判定する技術が求められている。

特定の核酸（以下、「標的核酸」という）の有無を簡便に判定する技術として、核酸クロマトグラフィー検査具が提案されている（特許文献１、２）。この核酸クロマトグラフィー検査具は、ペーパークロマトグラフィーと同様の仕組みで液体の試料を多孔性シート内に展開し、試料中に含まれる標的核酸を、多孔性シートの表面に固定した核酸プローブによって捕獲し、さらに捕獲した標的核酸を発色させることにより、多孔性シートの表面に標的核酸の検出を表示するというものである。このように、核酸クロマトグラフィー検査具では、試料中に標的核酸が含まれている場合には多孔性シートの表面に表示が現れる一方、試料中に標的核酸が含まれていない場合には多孔性シートの表面に表示が現れないという、極めて単純な仕組みで標的核酸の有無を判定することが可能である。

一般的に、核酸クロマトグラフィー検査具は、細長い長方形の多孔性シートを、細長い長方形の台紙（バッキングシート）に貼り付けて作られた試験片（これを通常「ストリップ」と呼ぶ）の形で広く用いられている（特許文献３、４）。例えば、試料を調製する際に標的核酸を予め色素で標識しておいた場合には、上述のストリップの先端部を試料の入ったテストチューブに挿し込んでおくと、この後は何の操作を行わなくても、毛細管現象によって多孔性シート内を試料が展開していき、核酸プローブを固定した部分（表示部）で標的核酸が多孔性シートに捕獲され、蓄積されていくことで、多孔性シート表面の表示部を発色させることも可能となる。このように、ストリップの先端部を試料の入ったテストチューブに挿し込むだけという非常に簡便なハンドリングで標的核酸の有無の判定をすることができるので、核酸クロマトグラフィー検査具のストリップを用いると、多数の試料を同時に検査可能になるという利点もある。

特開２００１−１５７５９８号公報 特表２００５−５０３５５６号公報 特開２００６−２０１０６２号公報 特開２０１０−１４５０７号公報

従来、ストリップに表示部を形成するために、核酸プローブを含む多数のスポットをライン状に配置した集合体を形成することが知られている。具体的には、複数の微小液滴を滴下して、乾燥させることにより、真円状のスポットを多数形成している。ところが、このような微小スポットの集合体によりライン状の表示部を形成するためには、液滴を吐出するための装置を用いる場合、その装置を何度も表示部上を往復させる必要がある。そのため、表示部を形成するのに時間を要し、作業効率が上がらないという問題がある。また、多数のスポットを形成するため、表示部に滲みや色むらが発生し易く、特に、表示部の輪郭部分が不鮮明となる問題があった（従来技術の第１の問題点）。

また、複数の標的核酸を含む試料を、同時に一本のストリップで検査する場合、表示部が複数同時に発色することがある。その場合、同時に発色した表示部が容易に判別可能とするためには、隣り合う表示部が一定距離以上離れている必要がある。一方、これら隣り合う表示部が離れ過ぎていると、隣り合う２つの発色した表示部の間に、発色していない表示部が存在しているか否かが容易に判別できなくなる可能性がある。また、ストリップの幅（短手方向の長さ）が短いと、ストリップの厚さとの差が小さくなる。そのため、一見しただけでは、ストリップの上面を見ているのか、側面を見ているのかが判別できないおそれがある。一方、ストリップの幅が大きいと、多孔性シート内を試料が均等に浸透して行かず、表示部の発色が不均一であったり、不鮮明となってしまうことがある。しかしながら、表示部の幅や表示部間の距離や、ストリップの幅について、充分な検討はなされておらず、上述のような弊害を回避する具体的な解決策が求められている。（従来技術の第２の問題点）。

上記の従来技術の第１の問題点に鑑みて、本願の第１発明の目的は、表示部の輪郭部分を鮮明にし、視認性が向上した表示部を有する核酸クロマトグラフィー検査具を提供することにある。また、このような核酸クロマトグラフィー検査具を製造する方法として、液滴を吐出するための装置の往復回数を減らし、作業効率を向上させる技術を提供することを目的とする。

また、上記の従来技術の第２の問題点に鑑みて、本願の第２発明の目的は、複数の標的核酸を同時に検出する際、隣り合う表示部を明確に判別でき、且つ、どのプローブを固定させた表示部が発色したか、明確に判定することを可能とする核酸クロマトグラフィー検査具を提供することにある。

本発明は、以下に示す核酸クロマトグラフィー検査具、および核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法である。

［１］ 標的核酸を含む試料液体を展開し、前記標的核酸を検出して表示するための細長形状の多孔性シートと、前記多孔性シートが貼り付けられたバッキング部材と、を備え、前記多孔性シートは、表面に、前記多孔性シートの長手方向と交わる角度に延びる帯状の表示部を有し、前記表示部は、前記標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定された複数の非真円形状のスポットの集合体により形成されるものである核酸クロマトグラフィー検査具。

［２］ 複数の前記スポットは、前記多孔性シートの長手方向および短手方向のそれぞれにおいて、前記スポットの重心が整列しているとともに、前記スポット同士が、少なくとも一部において重なっている前記［１］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［３］ 前記スポットの形状が、楕円形状である前記［２］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［４］ 複数の前記スポットの前記楕円形状の長軸方向が互いに平行である前記［３］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［５］ 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの長手方向と平行である前記［３］または［４］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［６］ 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの短手方向と平行である前記［３］または［４］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［７］ 前記多孔性シートが繊維状の材料からなり、前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの繊維の目の方向と平行である前記［３］または［４］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［８］ 前記楕円形状の短径に対する長径の比が、１．１〜３．５である前記［３］〜［７］のいずれかに記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［９］ 前記［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法であって、前記核酸プローブを含有する複数の液滴を、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させて吐出することにより、前記液滴が前記多孔性シート上に着滴して形成される、複数の非真円形状のスポットであり、隣り合う前記スポット同士が少なくとも一部において重なっているスポットの集合体を形成する吐出工程と、前記非真円形状のスポットを乾燥して、前記核酸プローブを前記多孔性シートの表面に固定させる乾燥工程と、を含む核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１０］ 前記吐出工程において、前記液滴を吐出するための吐出ユニットを、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させた状態で、前記液滴を吐出する前記［９］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１１］ 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの長手方向に傾斜させる前記［９］または［１０］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１２］ 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの短手方向に傾斜させる前記［９］または［１０］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１３］ 前記吐出工程において、前記吐出ユニットを、前記表示部の長手方向に移動させながら、前記液滴を吐出する前記［９］〜［１２］のいずれかに記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１４］ 前記吐出工程において、１つのスポットが乾燥した後に、当該スポットに隣接するスポットを形成するための液滴を吐出する前記［９］〜［１３］のいずれかに記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１５］ 前記スポット１つ分以上の間隔を隔てて１列のスポットを形成した後、当該列に形成された２つの隣接するスポットの間に、更に液滴を吐出してスポットを形成する前記［１４］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１６］ 第１の列を形成した後、１列以上の間隔を隔てて第２の列を形成し、その後、前記第１の列と、前記第２の列との間に、更に第３の列を形成する前記［１４］または［１５］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。

［１７］ 標的核酸を含む試料液体を展開し、前記標的核酸を検出して表示するための細長形状の多孔性シートと、前記多孔性シートが貼り付けられたバッキング部材と、を備え、前記多孔性シートは、表面に、前記多孔性シートの長手方向と交わる角度に延びる複数の帯状の表示部を有し、複数の前記表示部の幅をＬ１とし、隣り合う２つの前記表示部の間の距離をＬ２とした場合に、Ｌ２／Ｌ１の値が０．２〜２の範囲にある核酸クロマトグラフィー検査具。

［１８］ 前記多孔性シートの短手方向の長さＬ３が、２〜５ｍｍである前記［１７］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

［１９］ 前記Ｌ２が、０．１〜１ｍｍである前記［１７］または［１８］に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。

本願の第１発明（上記［１］〜［８］に記載されている発明）においては、核酸クロマトグラフィー検査具の多孔性シート表面における表示部のスポット形状が非真円状、例えば、楕円形状であるため、表示部の輪郭部分にスポットの楕円形状に伴う微細な凹凸が形成されている。このような、微細な凹凸により輪郭部分が直線状である場合に比べて、発色した表示部の視認性が向上する。また、第１発明の核酸クロマトグラフィー検査具を製造する方法（上記［９］〜［１６］に記載されている発明）によれば、多孔性シートの表面に対して斜め方向から、液滴を吐出することにより、非真円形状、例えば、楕円形状のスポットが形成されるため、垂線方向から液滴を吐出した場合と比較して、同体積の液滴であっても、より広い面積を有するスポットを形成することができる。そのため、液滴を吐出するための装置の往復回数を減らすことが可能となり、表示部を形成する際の作業効率が向上する。

また、本願の第２発明（上記［１７］および［１８］に記載されている発明）においては、核酸クロマトグラフィー検査具の表示部の幅Ｌ１と、隣り合う２つの表示部の間の距離Ｌ２の比が、０．２〜２の範囲にあるため、複数の標的核酸を同時に検出する際、隣り合う表示部を明確に判別でき、且つ、どのプローブを固定させた表示部が発色したか、明確に判定することが可能である。更に、多孔性シートの短手方向の長さＬ３が２〜５ｍｍである場合には、ストリップの幅と厚さを一目で判別することが可能であり、且つ、試料を多孔性シート内で均等に展開させることが可能である。

本願の第１発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。 図１Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具の側面図である。 図１Ａ中の枠α部分の拡大図である。 図１Ａに示されている核酸クロマトグラフィー検査具の一使用態様を示す模式図である。 図３Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具の一使用形態を示す模式図である。 本願の第２発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。 図４Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具の側面図である。 図４Ａ中の枠β部分の拡大図である。 図４Ａに示されている核酸クロマトグラフィー検査具の一使用態様を示す模式図である。 図６Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具の一使用形態を示す模式図である。 比較例１の核酸クロマトグラフィー検査具の表示部を示す部分拡大図である。 展開工程および検出工程の説明図である。

以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。

１．第１発明：
図１Ａは、本願の第１発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。図１Ｂは、図１Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具１ａの側面図である。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａは、細長形状の多孔性シート１０と、バッキング部材２０とを備えている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、吸収パッド４０を備えている。

まず、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａにおいて、多孔性シート１０の表面には、標的核酸を検出した時に表示が現れる検出面１３が設けられている。この検出面１３内には表示部１５が設けられている。表示部１５は、多孔性シート１０の長手方向Ｙと交わる角度に延びる、帯状の領域であり、この帯状の領域内に標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定されている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、多孔性シート１０がバッキング部材２０の貼付面に貼り付けられている。

図２は、図１Ａ中の枠α部分の拡大図である。このように、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａにおいて、表示部１５は、核酸プローブが複数の非真円形状のスポットに固定されている。表示部１５は、このような非真円形状のスポット１７の集合体により形成されるものである。なお、図２では、多孔性シート１０の長手方向Ｙおよび短手方向Ｘのそれぞれにおいて、スポット１７の重心が整列しているとともに、スポット同士が、少なくとも一部において重なっており、且つ、スポット１７が楕円形状であり、その長軸方向が多孔性シートの長手方向に平行となっている場合を示す。

非真円形状としては、具体的には、楕円形状等が好ましい。ここで、楕円形状とは、幾何学的に正確な楕円を意味するだけでなく、楕円に近い形状をも含むものとする。例えば、ティアドロップ形状等の一方向に対して左右対称に広がった形状をも含む。

本実施形態においては、スポット１７の形状が、楕円形状であるため、表示部１５の輪郭部分が必然的に、微細な凹凸形状を示す。これにより、輪郭部分が直線状に形成される場合と比較して、表示部１５が発色した場合の視認性が向上する。

また、上記スポットは、多孔性シートの長手方向および短手方向のそれぞれにおいて、各スポットの重心が整列しているとともに、スポット同士が、少なくとも一部において重なっていることが好ましい。特に、表示部１５の全域がスポットによって埋め尽くされていること、即ち、スポットが形成されていない部分が存在しないことが好ましい。このようにスポットが配置されることにより、核酸プローブを表示部１５の全域にわたって均等に固定させることが可能となる。ここで、「多孔性シートの長手方向および短手方向のそれぞれにおいて、各スポットの重心が整列している」とは、多孔性シートの長手方向または短手方向に平行な直線状に存在するスポットが、等間隔に並んでいる状態を意味する。

上記スポットが楕円形状である場合、楕円形状の長軸方向は、互いに平行であることが好ましい。そして、楕円形状の長軸方向が、多孔性シートの長手方向、または短手方向に平行であることが好ましい。或いは、多孔性シートが繊維状の材料からなる場合、楕円形状の長手方向が繊維の目の方向と平行であることが好ましい。このように楕円形状の長軸方向が全て平行であり、その長軸方向を、多孔性シートの長手方向、短手方向、または繊維の目の方向と平行にすることにより、表示部の輪郭に微細な凹凸（ギザギザ）を形成することが可能となる。

また、スポットが楕円形状である場合、楕円形状の短径に対する長径の比が、１．１〜３．５であることが好ましく、１．１〜３．０であることが更に好ましく、１．１〜２．５であることが特に好ましい。短径に対する長径の比が、１．１〜３．５であると、表示部の輪郭部分の凹凸が微細になり、表示部の視認性が向上する。具体的には、長径が０．１４ｍｍ程度であり、短径が０．０６ｍｍ程度であることが好ましい。

次に、本願の第１発明の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法の一実施形態について、以下説明する。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法は、上述した核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法である。そして、本製造方法は、核酸プローブを含有する複数の液滴を、多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させて、吐出することにより、液滴が多孔性シート上に着滴して形成される複数の非真円形状のスポットであり、隣り合うスポット同士が少なくとも一部において重なっているスポットの集合体を形成する吐出工程と、非真円形状のスポットを乾燥して、核酸プローブを多孔性シートの表面に固定させる乾燥工程と、を含むものである。

吐出工程においては、液滴を、多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させて吐出する。即ち、液滴を多孔性シートに対して斜め方向から吐出し、着滴させることにより、着滴した液滴により形成されるスポットが非真円形状となる。

このように、液滴を多孔性シートに対して傾斜させて吐出し、着滴させることにより、同じ体積の液滴であっても、垂直に吐出した場合と比較して、より広い面積を有するスポットを形成することができる。即ち、より少ない吐出回数で、より広い面積にスポットを形成することができるため、生産効率を向上させることが可能となる。

非真円形状としては、例えば、吐出液滴の、多孔性シートに平行な速度成分に長い形状を有していることが好ましい。具体的には、楕円形状が好ましい。ここで、楕円形状とは、幾何学的に正確な楕円を意味するだけでなく、楕円に近い形状をも含むものとする。例えば、ティアドロップ形状等の一方向に対して左右対称に広がった形状をも含む。

スポットは、隣り合うスポット同士が少なくとも一部において重なるように、液滴が吐出され、着滴したものである。更には、表示部１５の全域が、スポットで埋め尽くされるように、液滴が吐出され、着滴したものであることが好ましい。

液滴の１滴当たりの体積としては、３０〜３５０ｐｌが好ましく、５０〜２５０ｐｌが更に好ましく、７５〜１５０ｐｌが特に好ましい。液滴の１滴当たりの体積を上記数値範囲内にすることで、所望の大きさのスポットを形成することが可能となる。

液滴の吐出に際し、傾斜させる角度としては、所望する非真円形状に応じて、適宜変更することが可能である。傾斜角度としては、垂線に対して、４５°〜７５°が好ましい。例えば、６０°とすることができる。例えば、１滴当たりの体積１００ｐｌの液滴を、多孔性シートの垂線に対して６０°傾斜させた方向から吐出することにより、長径が０．１４ｍｍ、短径が０．０６ｍｍの楕円形状のスポットを形成することができる。

また、傾斜させる方向としては、特に制限されず、目的のスポット形状に応じて、適宜変更することができる。例えば、楕円形状の長軸方向が多孔性シートの長手方向に平行なスポットを形成する場合には、液滴の吐出方向を多孔性シートの長手方向に沿って傾ければ良い。また、楕円形状の長軸方向が多孔性シートの短手方向に平行なスポットを形成する場合には、液滴の吐出方向を多孔性シートの短手方向に沿って傾ければ良い。多孔性シートが繊維状の材料からなる場合には、着滴した液滴は、繊維の目に沿って多孔性シートに浸透するため、楕円形状のスポットが形成され易くなる。そのため、繊維状の多孔性シートの繊維の目の方向が予め分かっている場合には、その繊維の目の方向と平行にすることにより、容易に楕円形状のスポットを形成することができる。

上述のような液滴の吐出には、例えば、特開２００３−７５３０５号公報に記載の吐出ユニット（日本ガイシ株式会社製ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッター）を使用することができる。具体的に、上述のような液滴の吐出は、上記吐出ユニットを、多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させた状態で、液滴を吐出することにより実現することが可能である。

吐出ユニットは、核酸クロマトグラフィー検査具の短手方向に移動させながら、液滴を連続して吐出させることが好ましい。即ち、表示部１５が延びる方向に沿って吐出ユニットを移動させることが好ましい。このように吐出ユニットを移動させながら、液滴を連続して吐出させることにより、１回の移動で多数の液滴を吐出させることが可能となる。結果、作業効率を向上させることができる。

吐出工程においては、１つのスポットが乾燥した後に、そのスポットに隣接するスポットを形成するための液滴を吐出することが好ましい。このように、隣接するスポットが乾燥してから、次のスポットを形成することにより、完成する表示部の滲みや色むらを抑制することが可能となる。これを実現する具体的な方法としては、スポット１つ分以上の間隔を隔てて、先ずは１列のスポットを形成した後、この列に形成された２つの隣接するスポットの間に、更に液滴を吐出してスポットを形成する方法を挙げることができる。

また、第１の列を形成した後、１列以上の間隔を隔てて第２の列を形成し、その後、第１の列と第２の列との間に、更に第３の列を形成することによって、完成する表示部の滲みや色むらを抑制することが可能となる。例えば、図２に示されているように、表示部が、幅方向にその一部において重なって、等間隔に並んだ６列のラインｙ１〜ｙ６により形成されている場合、ｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４、ｙ５、ｙ６の順にラインを形成した場合、ｙ１とｙ２、ｙ２とｙ３のように、隣接する２本のラインは、その一部が重なっているため、滲みや色むらが生じやすい。そこで、例えば、ｙ１、ｙ４、ｙ２、ｙ５、ｙ３、ｙ６や、ｙ１、ｙ３、ｙ５、ｙ２、ｙ４、ｙ６の順でラインを形成することにより、隣接するラインを連続して形成することがないため、滲み等に起因するライン幅の誤差を低減するとともに、色むらを抑制することが可能となる。

本実施形態において製造される核酸クロマトグラフィー検査具は、上述の吐出工程において、スポットの集合体を形成した後、スポットを乾燥して、核酸プローブを多孔性シートに固定させる乾燥工程を経ることにより、完成する。

乾燥させる際の条件は、特に限定されるものではなく、例えば、５０℃で３０分間等とすることができる。

本実施形態においては、幅が多孔性シートの長手方向の長さであり、多孔性シートの短手方向に長い長方形の多孔性の原シートに表示部を形成した後、当該多孔性の原シート多孔性シートの短手方向の長さ（幅）に切断しても良い。このような方法により、表示部を形成することにより、吐出ユニットの移動を最小限に抑えつつ、多数のスポットを一度の移動で形成することが可能となるため、作業効率が向上する。また、上記多孔性の原シートを、バッキング部材の原シートに貼り付けた複合シートとして、表示部を形成した後、切断することによっても、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具を作製することができる。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、多孔性シート１０は、ニトロセルロース、セルロース、ポリエーテルスルホン、ナイロン、ＰＶＤＦなどから作られた、無数の細孔を有するシートを用いることが可能である。中でも、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ナイロンなど、繊維状の材料から作られた多孔性シートが好ましい。このような、繊維状の材料から作られたシートは、液滴が着滴した場合、スポットが繊維の目の方向に伸張し易く、楕円形状等の非真円形状のスポットが形成され易い。

図３Ａ，３Ｂは、図１Ａに示されている核酸クロマトグラフィー検査具１ａの一使用態様を示す模式図である。なお、図３Ａが図１Ａと同じ方向から観た正面図、図３Ｂが図１Ｂと同じ方向から観た側面図である。図示されているように、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａについては、例えば、テストチューブ５０内に入っている液体の試料５５の中に、核酸クロマトグラフィー検査具１ａの先端部４５を浸して使用することができる。こうして先端部４５を試料５５の中に浸しておくと、試料５５が毛細管現象によって多孔性シート１０内を展開して、もう一方の先端部（吸収パッド４０が設けられている先端部）まで送られていく。このとき、試料５５内に標的核酸が含まれていると、この標的核酸が表示部１５に固定されている核酸プローブによって捕獲され、その結果、標的核酸を標識する色素によって表示部１５が発色するようになる（図３Ａ，３Ｂ中の表示部１５ａ，１５ｂを参照）。

図３Ａに示されているように、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、検出面１３が２本の位置マーカー１４ａ，１４ｂによって長手方向Ｙに沿って３つの区画に仕切られており、これら３つの区画に表示部１５ａ〜１５ｃが１つずつ設けられている。そして、表示部１５ａ〜１５ｃには、それぞれ異なる種類の標的核酸（異なる塩基配列の標的核酸）を捕獲するための核酸プローブが固定されている。例えば、表示部１５ａにアレルギー疾患のマーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブ、表示部１５ｂに腫瘍マーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブ、および表示部１５ｃにウィルス感染のマーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブを固定しておくと、一度の検査で上述した３種の疾患を患っているのか否かを判定することが可能となる。これを図３Ａ，３Ｂに示されている例に当てはめて考えると、図３Ａ，３Ｂ中の試料５５が採取された患者については、表示部１５ａ、１５ｂで発色が観察され、表示部１５ｃで発色が観察されないので、アレルギー疾患および腫瘍を患っている一方で、ウィルス疾患を患っていないと判定されることになる。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、表示部１５ａ〜１５ｃは、長手方向Ｙと直交する幅方向Ｘに沿って直線状に延びている。なお、本実施形態では、表示部１５は、多孔性シート１０の幅方向Ｘに沿って直線状に延びている必要はなく、試料５５が多孔性シート１０内を展開していく過程で、試料５５が表示部１５を横断していくように設けられているものであればよい。表示部１５については、例えば、長手方向Ｙに対して４５度で交わる角度で延びる帯形状や、蛇行した帯形状などの任意の形状を適用することができる。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、多孔性シート１０の一部と接触し、多孔性シート１０を展開してきた試料５５を吸収する吸収パッド４０が設けられている。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａのように吸収パッド４０が設けられている場合には、吸収パッド４０が多孔性シート１０を展開してきた試料５５を吸収、保持することが可能となるので、多孔性シート１０内に展開させる試料５５の液量を増加させることが可能となり、ひいては、核酸クロマトグラフィー検査具１ａにアプライされる標的核酸の量も増加させることが可能となる。その結果として、表示部１５に捕獲される標的核酸の量も増加し、標的核酸の検出を示すシグナル（発色）が濃く現れるようになるのでよい。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、試料５５が多孔性シート１０内を展開している際に、標的核酸の全部または一部が一本鎖のポリヌクレオチド構造を有するように調製しておき、また、核酸プローブも標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチド構造と特異的にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド構造（標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド）を少なくとも一部に有するものを用いる。こうした標的核酸と核酸プローブを用いると、標的核酸が表示部１５に到達したときに、標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチド構造と、核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド構造とがハイブリダイズ（二本鎖形成）し、標的核酸が核酸プローブを介して表示部１５に固定される。なお、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１ａでは、核酸プローブについては、標的核酸の有する一本鎖ポリヌクレオチド構造と特異的にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド構造を有するものであれば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、あるいはモルフォリノアンチセンスオリゴなど、特に制限はされない。

また、標的核酸についても、一本鎖ＤＮＡ、端部が一本鎖構造とされた二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなどを適用することが可能である。標的核酸の標識についても通常用い得る方法を適用すればよい。ＰＣＲ法を用いて標的核酸を調製する場合には、ポリメラーゼ反応の基質となるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも１種に予め標識したものを用いてＰＣＲ産物を直接的に標識する手法や、無標識のＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ）に事後的に標識を付加する手法を用いることができる。無標識のＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ）に事後的に標識を付加する手法としては、例えば、ＰＣＲ産物の両端が特定の塩基配列の一本鎖ポリヌクレオチド構造となるように改変したＰＣＲプライマーを用い、この改変型のＰＣＲプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物の一本鎖ポリヌクレオチド構造に対して、これと相補的な塩基配列を有する標識された一本鎖ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、標的核酸を標識する方法を挙げることができる。

２．第２発明：
図４Ａは、本願の第２発明の核酸クロマトグラフィー検査具の一実施形態を示す正面図である。図４Ｂは、図４Ａに示されている白抜き矢印Ｖ_Ｌの方向（側方）から観察した、核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａの側面図である。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａは、細長形状の多孔性シート１１０と、バッキング部材１２０とを備えている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、吸収パッド１４０を備えている。

まず、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａにおいて、多孔性シート１１０の表面には、標的核酸を検出した時に表示が現れる検出面１１３が設けられている。この検出面１１３内には表示部１１５が設けられている。表示部１１５は、多孔性シート１１０の長手方向Ｙと交わる角度に延びる、帯状の領域であり、この帯状の領域内に標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定されている。さらに、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、多孔性シート１１０がバッキング部材１２０の貼付面に貼り付けられている。

図５は、図４Ａ中の枠β部分の拡大図である。図５中、表示部１１５ｃの幅Ｌ１と、隣り合う２つの表示部１１５ｃ，１１５ｅとの間の距離Ｌ２とは、Ｌ２／Ｌ１の値が０．２〜２の範囲であるという関係を有している。そして、多孔性シートの短手方向の長さ（以下、「多孔性シートの幅」ともいう）Ｌ３は、２〜５ｍｍである。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具は、表示部１１５の幅Ｌ１と、隣り合う２つの表示部１１５，１１５の間の距離Ｌ２の比Ｌ２／Ｌ１が、０．２〜２の範囲にあるため、複数の標的核酸を同時に検出する際、隣り合う表示部１１５，１１５を明確に判別でき、且つ、どのプローブを固定させた表示部１１５が発色したか、明確に判定することが可能である。Ｌ２／Ｌ１が０．２未満であると、隣り合う表示部１１５，１１５の間の距離Ｌ２が、表示部の幅Ｌ１に対して小さくなる、即ち、表示部１１５の間隔が密になる。そのため、隣り合う表示部１１５，１１５が両方とも発色した場合、両表示部が１本のラインに見えてしまい、いずれか一方の表示部が発色しているのか、両法の表示部が発色しているのか、判別し難い場合がある。一方、Ｌ２／Ｌ１が２超であると、隣り合う表示部１１５，１１５の間の距離Ｌ２が、表示部の幅Ｌ１に対して大きくなる、即ち、表示部１１５の間隔がまばらになる。そのため、２つの発色した表示部の間に発色していない表示部が存在しているか否かが容易に判別できなくなる可能性がある。

また、多孔性シートの短手方向の長さＬ３が２〜５ｍｍであるため、核酸クロマトグラフィー検査具の上面か側面かを一目で判別することが可能であり、且つ、試料が多孔性シート内を均等に展開して行くことが可能である。多孔性シートの短手方向の長さＬ３が２ｍｍ未満であると、核酸クロマトグラフィー検査具自体の厚さとの差が小さくなる。そのため、一見しただけでは、検査具の上面、両側面、下面の区別が付き難くなり、上面にのみ表示される検出ラインを確認することが困難な場合がある。一方、多孔性シートの短手方向の長さＬ３が５ｍｍ超であると、多孔性シート内を試料が均等に浸透して行かず、表示部１１５内で、発色の濃淡にバラツキが生じることがあったり、表示部１１５が不鮮明となってしまうことがある。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａにおいて、隣り合う２つの表示部の間の距離Ｌ２は、０．１〜１ｍｍであることが好ましく、０．３〜０．９ｍｍであることが更に好ましく、０．４〜０．８ｍｍであることが特に好ましい。Ｌ２が０．１ｍｍ未満であると、隣り合う２つの表示部が両方とも着色した場合、表示部が１本のラインに見えるため、２つの表示部が着色していることを確認することが困難となる場合がある。Ｌ２が１ｍｍ超であると、隣り合う２つの表示部が両方とも着色した場合、隣り合う２つの表示部が着色しているのか、それとも、１つ以上の表示部を挟んだ２本の表示部が着色しているのかの判定が困難となる場合がある。また、多数の標的核酸について同時に検査する場合、検査する標的核酸の数に応じて、通常、核酸プローブの種類も増加する。そのため、各種類の核酸プローブを固着させた表示部もそれぞれ必要となるため、Ｌ２が長いと、多孔性シート上に形成することが可能な表示部の数が制限されてしまう可能性がある。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、多孔性シート１１０は、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ナイロンなどから作られた、無数の細孔を有するシートを用いることが可能である。

図６Ａ，６Ｂは、図４Ａに示されている核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａの一使用態様を示す模式図である。なお、図６Ａが図４Ａと同じ方向から観た正面図、図６Ｂが図４Ｂと同じ方向から観た側面図である。図示されているように、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａについては、例えば、テストチューブ１５０内に入っている液体の試料１５５の中に、核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａの先端部１４５を浸して使用することができる。こうして先端部１４５を試料１５５の中に浸しておくと、試料１５５が毛細管現象によって多孔性シート１１０内を展開して、もう一方の先端部（吸収パッド１４０が設けられている先端部）まで送られていく。このとき、試料１５５内に標的核酸が含まれていると、この標的核酸が表示部１１５に固定されている核酸プローブによって捕獲され、その結果、標的核酸を標識する色素によって表示部１１５が発色するようになる（図６Ａ中の表示部１１５ｃを参照）。

図４Ａに示されているように、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、検出面１１３が３本の位置マーカー１１４ａ〜１１４ｃによって長手方向Ｙに沿って位置マーカー１１４ｃを下端として３つの区画に仕切られており、これら３つの区画に表示部１１５が３本ずつ設けられている。そして、各表示部１１５には、それぞれ異なる種類の標的核酸（異なる塩基配列の標的核酸）を捕獲するための核酸プローブが固定されている。例えば、表示部１１５ｃにアレルギー疾患のマーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブ、表示部１１５ｄに腫瘍マーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブ、および表示部１１５ｅにウィルス感染のマーカーとなる標的核酸に対する核酸プローブを固定しておくと、一度の検査で上述した３種の疾患を患っているのか否かを判定することが可能となる。これを図６Ａ，６Ｂに示されている例に当てはめて考えると、図６Ａ，６Ｂ中の試料１５５が採取された患者については、表示部１１５ｃで発色が観察され、表示部１１５ｄ，１１５ｅで発色が観察されないので、アレルギー疾患を患っている一方で、腫瘍およびウィルス疾患を患っていないと判定されることになる。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、各表示部１１５は、長手方向Ｙと直交する幅方向Ｘに沿って直線状に延びている。なお、本実施形態では、表示部１１５は、多孔性シート１１０の幅方向Ｘに沿って直線状に延びている必要はなく、試料１５５が多孔性シート１１０内を展開していく過程で、試料１５５が表示部１１５を横断していくように設けられているものであればよい。表示部１１５については、例えば、長手方向Ｙに対して４５度で交わる角度で延びる帯形状や、蛇行した帯形状などの任意の形状を適用することができる。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、多孔性シート１１０の一部と接触し、多孔性シート１１０を展開してきた試料１５５を吸収する吸収パッド１４０が設けられている。本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａのように吸収パッド１４０が設けられている場合には、吸収パッド１４０が多孔性シート１１０を展開してきた試料１５５を吸収、保持することが可能となるので、多孔性シート１１０内に展開させる試料１５５の液量を増加させることが可能となり、ひいては、核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａにアプライされる標的核酸の量も増加させることが可能となる。その結果として、表示部１１５に捕獲される標的核酸の量も増加し、標的核酸の検出を示すシグナル（発色）が濃く現れるようになるのでよい。

本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、試料１５５が多孔性シート１１０内を展開している際に、標的核酸の全部または一部が一本鎖のポリヌクレオチド構造を有するように調製しておき、また、核酸プローブも標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチド構造と特異的にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド構造（標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド）を少なくとも一部に有するものを用いる。こうした標的核酸と核酸プローブを用いると、標的核酸が表示部１１５に到達したときに、標的核酸の一本鎖ポリヌクレオチド構造と、核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド構造とがハイブリダイズ（二本鎖形成）し、標的核酸が核酸プローブを介して表示部１１５に固定される。なお、本実施形態の核酸クロマトグラフィー検査具１０１ａでは、核酸プローブについては、標的核酸の有する一本鎖ポリヌクレオチド構造と特異的にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド構造を有するものであれば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、あるいはモルフォリノアンチセンスオリゴなど、特に制限はされない。

また、標的核酸についても、一本鎖ＤＮＡ、端部が一本鎖構造とされた二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなどを適用することが可能である。標的核酸の標識についても通常用い得る方法を適用すればよい。ＰＣＲ法を用いて標的核酸を調製する場合には、ポリメラーゼ反応の基質となるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも１種に予め標識したものを用いてＰＣＲ産物を直接的に標識する手法や、無標識のＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ）に事後的に標識を付加する手法を用いることができる。無標識のＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ）に事後的に標識を付加する手法としては、例えば、ＰＣＲ産物の両端が特定の塩基配列の一本鎖ポリヌクレオチド構造となるように改変したＰＣＲプライマーを用い、この改変型のＰＣＲプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物の一本鎖ポリヌクレオチド構造に対して、これと相補的な塩基配列を有する標識された一本鎖ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、標的核酸を標識する方法を挙げることができる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１，２および比較例１）
まず、第１の発明に関する実施例１，２および比較例１について説明する。

［核酸クロマトグラフィー検査具の作製］
メルクミリポア製Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ メンブレンシート（以下、「多孔性シート」と称する）（４５ｍｍ×３００ｍｍ）をメルクミリポア製ラミネート加工メンブレンカード（以下、「バッキング部材」と称する）（６０ｍｍ×３００ｍｍ）に貼り付けて、複合シートを作製した。続いて、下記の手順１〜７に従い、複合シートの多孔性シートの表面に、表１に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、日本ガイシ株式会社製ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いてスポットし、キャプチャーＤＮＡプローブを多孔性シートの表面に固定化し、次いで、複合シートを細長形状に切断する加工を行うことにより、核酸クロマトグラフィー検査具のストリップを得た。なお、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターは、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた装置である。

［手順１：キャプチャーＤＮＡプローブ溶液の調製］
９種類のキャプチャーＤＮＡプローブを表１の塩基配列に従って合成し、これらのキャプチャーＤＮＡプローブをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒで溶解した水溶液を、ＳＳＣ緩衝液およびブロモフェノールブルーと混合して、ブロモフェノールブルー０．０５ｗｔ％、キャプチャーＤＮＡプローブ濃度２〜６０μＭの溶液を調製した。

［手順２：スポット条件の検討］
複合シートの多孔性シートの表面にキャプチャーＤＮＡ溶液をスポットするのに先立ち、検査用のシート上に検査スポットを行うことにより、スポット条件の検討を行った。具体的には、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターの吐出ユニット内に配置した液体注入部に、キャプチャーＤＮＡプローブ溶液を注入し、吐出ユニットから検査用シートに向けてキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を吐出して検査用のシート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査用シートに対して、（ｉ）スポットが形成されないことはないか、（ｉｉ）スポットがいびつな形状ではないか、（ｉｉｉ）スポット径が設計値から１０％以上ずれていないか、（ｉｖ）不要なスポット（一般に「サテライト」と称されているスポット）が発生していないか、（ｖ）スポット位置がスポット径の３分の１以上ずれていないか、という５項目について実施した。キャプチャーＤＮＡプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されているので、上記（ｉ）〜（ｖ）の項目については検査用のシート上のスポットを目視で観察することにより検査可能であった。

上述の品質の検査の結果、検査スポットで不良が検出されたときは、吐出ユニット内に配置された圧電／電歪素子の駆動信号を調整して、検査スポットを再度行った。駆動信号の調整は電圧値、所定電圧までの上昇時間、所定電圧値のキープ時間、電圧立ち下げ時間の変更により行った。それでもなお不良が検出されるときは、真空吸引によって吐出ユニットからキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を抜き取り、液体注入部にキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を再度注入した後に、検査スポットを行った。以上の操作を、不良スポットが検出されなくなるまで繰り返した。

［手順３：キャプチャーＤＮＡプローブ溶液のスポット］
上述の手順２の条件検討後、下記のスポット方法１〜３のいずれかの方法にてスポットを行うことにより、スポット形状が楕円形状であり、その長手方向が多孔性シートの長手方向に平行である表示部（実施例１）、スポット形状が楕円形状であり、その長手方向が多孔性シートの短手方向に平行である表示部（実施例２）、スポット形状が真円形状である表示部（比較例１）をそれぞれ有する核酸クロマトグラフィー検査具を作製した。

［スポット方法１（実施例１）］
不良スポットが検出されなくなったことを確認した後、以下の方法でキャプチャーＤＮＡプローブを、複合シートの多孔性シートの表面にスポットした。本スポット方法１では、吐出ユニットを、多孔性シートの長手方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に対して、３０°垂線側に傾けた角度（垂線に対する傾斜角度：６０°）から多孔性シート上に液滴を吐出するように配置して、全てのスポットを行った。

まず、１種類のキャプチャーＤＮＡプローブ溶液につき、スポットのピッチを横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．０４ｍｍ、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に０．０８ｍｍで、多孔性シートの表面でスポットが横方向、縦方向に一直線上に並ぶように、吐出ユニットと多孔性シートが非接触の状態でスポットを行った。着弾した後のスポット形状は、短径（幅方向Ｘ）が０．０６ｍｍ、長径（長手方向Ｙ）が０．１４ｍｍの楕円形状であった。具体的には、多孔性シート上で、吐出ユニットを複合シートの横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に一直線上に移動させ、終点まで到達したら、複合シートを縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に１列分または複数列分だけ移動させ、再び複合シートの横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に一直線上に移動させるという手順にて、複合シートの多孔性シートの表面に横方向３００ｍｍ、縦方向０．５ｍｍのライン（完成品の「表示部」に対応）の形成を行った。

吐出ユニットから吐出されたキャプチャーＤＮＡプローブのスポットが着弾し、当該スポットが乾燥する前に、隣接する次のスポットが着弾して、両者が接触すると、滲みや色むらが発生する恐れがある。そこで、まず、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．０８ｍｍのピッチで前半のスポットを行い、続いて、スポットとスポットとの隙間にキャプチャーＤＮＡプローブのスポットを着弾させる態様で、０．０８ｍｍのピッチにて後半のスポットを行った。このように、前半、後半に分けてスポットをすることにより、０．０４ｍｍのピッチのスポット列を形成すると、滲みや色むらを防ぐことが可能となった。

上述の長さ３００ｍｍ×幅０．５ｍｍのラインは、図２に示されているように、ライン縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に並ぶ、ｙ１〜ｙ６のスポット列により形成されている。ｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４、ｙ５、ｙ６の順にスポット列を形成することにより、長さ３００ｍｍ×幅０．５ｍｍのラインを形成することができるが、先のスポット列が乾燥する前に、後続のスポット列が重なってしまうと、この重なった部分で滲みや色むらが発生する恐れがある。そこで、ｙ１、ｙ６、ｙ２、ｙ５、ｙ３、ｙ４の順でスポットを行った。これにより、先のスポット列が乾燥する前に、後続のスポット列が重なってしまう状況を回避することができ、その結果、ライン幅が０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍ（設計値０．５０ｍｍ±誤差０．０５ｍｍ）の範囲内に収まるように、滲みの発生を抑制可能であった。なお、ｙ１、ｙ４、ｙ２、ｙ５、ｙ３、ｙ６の順、もしくは、ｙ１、ｙ３、ｙ５、ｙ２、ｙ４、ｙ６の順のように隣接するスポット列を連続して形成しないようにすることにより、ライン幅が０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍ（設計値０．５０ｍｍ±誤差０．０５ｍｍ）の範囲内に収まるのに加えて、ライン内の色むらを防ぐことが可能であった。

最終的に、複合シートの多孔性シートの表面に、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］のピッチが１．２ｍｍにて、９本の、長さ３００ｍｍ×幅０．５ｍｍのライン（ライン幅の設計値からの誤差が０．１ｍｍ以下）を形成した。これらの９本のラインは、それぞれ１種類ずつ異なるキャプチャーＤＮＡプローブ（表１中のプローブ番号１〜９）から形成した。すなわち、９種類のキャプチャーＤＮＡプローブ（プローブ番号１〜９）のそれぞれを多孔性シートの表面の異なる場所に固定した。

［スポット方法２（実施例２）］
吐出ユニットを、多孔性シートの短手方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に対して３０°垂線側に傾けた角度（垂線に対する傾斜角度：６０°）から多孔性シート上に液滴を吐出するように配置して、全てのスポットを行ったこと以外は、上述のスポット方法１と同様の方法によりラインを形成した。なお、スポットのピッチは、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．０８ｍｍ、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に０．０４ｍｍとし、着弾した後のスポット形状は、長径（幅方向Ｘ）が０．１４ｍｍ、短径（長手方向Ｙ）が０．０６ｍｍの楕円形状であった。また、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．０８ｍｍのピッチでスポットを形成するために、まず、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．１６ｍｍのピッチで前半のスポットを行い、続いて前半のスポットで形成されたスポットとスポットとの隙間にキャプチャーＤＮＡプローブのスポットを着弾させる態様で、０．１６ｍｍのピッチにて後半のスポットを行った。

［スポット方法３（比較例１）］
吐出ユニットを、多孔性シートの垂線方向から液滴を多孔性シート上に吐出するように配置して、全てのスポットを行ったこと以外は、上述のスポット方法１と同様の方法によりラインを形成した。なお、スポットのピッチは、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］ともに０．０５ｍｍとし、着弾した後のスポット形状は、直径が０．０７〜０．１ｍｍの真円であった。また、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．０５ｍｍのピッチでスポットを形成するために、まず、横方向［完成品の「幅方向Ｘ」に対応］に０．１ｍｍのピッチで前半のスポットを行い、続いて前半のスポットで形成されたスポットとスポットとの隙間にキャプチャーＤＮＡプローブのスポットを着弾させる態様で、０．１ｍｍのピッチにて後半のスポットを行った。

得られたラインは、図７に示されているように、ライン縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］に並ぶ、ｙ１〜ｙ１０のスポット列により形成されている。ｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４、ｙ５、ｙ６、ｙ７、ｙ８、ｙ９、ｙ１０の順にスポット列を形成することにより、長さ３００ｍｍ×幅０．５ｍｍのラインを形成することができるが、先のスポット列が乾燥する前に、後続のスポット列が重なってしまうと、この重なった部分で滲みや色むらが発生する恐れがある。そこで、ｙ１、ｙ１０、ｙ２、ｙ９、ｙ３、ｙ８、ｙ４、ｙ７、ｙ５、ｙ６の順でスポットを行った。これにより、先のスポット列が乾燥する前に、後続のスポット列が重なってしまう状況を回避することができ、その結果、ライン幅が０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍ（設計値０．５０ｍｍ±誤差０．０５ｍｍ）の範囲内に収まるように、滲みの発生を抑制可能であった。さらに、ｙ１、ｙ６、ｙ２、ｙ７、ｙ３、ｙ８、ｙ４、ｙ９、ｙ５、ｙ１０の順、もしくは、ｙ１、ｙ３、ｙ５、ｙ７、ｙ９、ｙ２、ｙ４、ｙ６、ｙ８、ｙ１０の順のように隣接するスポット列を連続して形成しないようにすることにより、ライン幅が０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍ（設計値０．５０ｍｍ±誤差０．０５ｍｍ）の範囲内に収まるのに加えて、ライン内の色むらを防ぐことが可能であった。

［手順４：位置マーカーラインのスポット］
上述のスポット方法１〜３において形成する表示部の位置の判定を容易にするために、顔料系マゼンタインクを含んだ液体をスポットすることにより、位置マーカーのラインを形成した。なお、位置マーカーのラインは、上述のスポット方法１〜３のキャプチャーＤＮＡプローブ溶液のスポットと、それぞれ同様の方法でスポットを行うことにより形成した。その結果、図８（ａ）に示すように、９本のキャプチャーＤＮＡプローブのライン［ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）で着色］と、３本の位置マーカーのライン（顔料系マゼンタインクで着色）とがストライプ状に配置された複合シートを得た。

［手順５：キャプチャーＤＮＡの固定化］
手順４を経てキャプチャーＤＮＡプローブのライン、位置マーカーのラインの形成が完了したのち、複合シートを５０℃で３０分間加熱することにより、キャプチャーＤＮＡプローブを多孔性シートの表面に固定し、位置マーカーの顔料系マゼンタインクを多孔性シートの表面に固着した。

［手順６：検査］
上述の手順２で行った検査と同様の項目［（ｉ）〜（ｖ）］に関して、複合シートの多孔性シートに対して検査を行った。

［手順７：加工］
メルクミリポア製吸収パッド（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を、多孔性シートに５ｍｍ程度被るように装着した。吸収パッドを固定するために、粘着テープ（２５ｍｍ×３００ｍｍ）を吸収パッドの上面部に貼った。続いて、この複合シートについて裁断機もしくはギロチン式のカッターを用いて切断を行い、幅３．５ｍｍ、長さ６０ｍｍのストリップ（核酸クロマトグラフィー検査具）を８５個得た。

［評価試験］
実施例１〜１０、比較例１，２の核酸クロマトグラフィー検査具のストリップについて、下記の手順８〜１０に従った、クロマトグラフィー法により評価を行った。

［手順８：移動相の準備］
プローブ番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するサンプルＤＮＡ（なお、アミノ基で修飾）を、カルボキシル化ラテックス粒子（色：青色、平均粒子径：４００ｎｍ）に固定した。このサンプルＤＮＡを固定したラテックス粒子を滅菌水で分散し、移動相とした。

［手順９：展開工程］
０．２ｍｌマイクロチューブに、移動相５０μｌを分注し、核酸クロマトグラフィー検査具のストリップの先端を移動相に浸積した。浸漬直後から、移動相が毛細管現象により、多孔性シート内を上方（吸収パッドが設けられているもう一方の先端の方向）に向かって移動した［図８（ａ）〜８（ｄ）を参照］。ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）は、多孔性シートに固定されていないため、移動相により洗い流された。こうして洗い流されることで、ブロモフェノールブルーによるラインは消失した［図８（ａ）〜８（ｄ）中、焼失したラインの位置を星印（＊）で示す］。こうして移動相が上方に移動していくにつれて、ブロモフェノールブルーによる９本のラインが順次消失していくので、移動相が多孔性シート内のどこの位置まで到達しているのかを容易に確認することが可能であった。なお、位置マーカーの顔料系マゼンタインクは、メンブレンシート（多孔性シート）に固着しており、移動相に不溶であるため、移動相によって洗い流されなかった。

［手順１０：検出工程］
移動相中のサンプルＤＮＡは、プローブ番号１のキャプチャーＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を有しているため、ハイブリダイゼーション反応によって、プローブ番号１のキャプチャーＤＮＡプローブに特異的に結合する。これにより、サンプルＤＮＡを固定したラテックス粒子が、プローブ番号１のキャプチャーＤＮＡプローブに捕捉される。プローブ番号１のキャプチャーＤＮＡプローブが固定されている表示部では、サンプルＤＮＡとプローブ番号１のキャプチャーＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応の進行に伴い、ラテックス粒子が蓄積、凝集し、発色した［図８（ｄ）を参照］。移動相への浸漬から約２０分で、移動相がすべて吸収パッドに移動して反応が終了した。以上の手順９、手順１０で述べたように、ブルーのラインの色が移動相の展開（上昇）とともに一旦消失した後［図８（ｃ）を参照］、プローブ番号１の表示部がラテックス粒子の蓄積、凝集により発色した［図８（ｄ）を参照］。

以上の通り、実施例１、２、および比較例１の核酸クロマトグラフィー検査具は、いずれもプローブ番号１の表示部が発色した。即ち、吐出ユニットの角度を変更して、スポット形状を真円以外の形状、例えば、楕円形状とすることにより、スポットピッチを変更して吐出ユニットの移動回数を減らすことができ、生産効率を向上させることができた。

（実施例３〜９、比較例２〜５）
次に、第２の発明に関する実施例３〜９、および比較例２〜５について説明する。

下記のように、手順３のスポットにおいて、ライン幅およびライン間の間隔を変更したこと、および、手順７の加工において、ストリップ幅を変更したこと以外は、上述の比較例１の核酸クロマトグラフィー検査具と同様の方法により、実施例３〜９、および比較例２〜５の核酸クロマトグラフィー検査具を作製した。

具体的には、実施例３〜６、および比較例２、３用の核酸クロマトグラフィー検査具では、複合シートの多孔性シートの表面に、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］のピッチが１．２ｍｍにて、９本の、長さ３００ｍｍ×幅０．５ｍｍのライン（ライン幅の設計値からの誤差が０．１ｍｍ以下）を形成した。即ち、ライン幅Ｌ１が０．５ｍｍであり、ライン間の距離Ｌ２が１．１５ｍｍとなるように、９本のラインを形成した。これらの９本のラインは、それぞれ１種類ずつ異なるキャプチャーＤＮＡプローブ（表１中のプローブ番号１〜９）から形成した。すなわち、９種類のキャプチャーＤＮＡプローブ（プローブ番号１〜９）のそれぞれを多孔性シートの表面の異なる場所に固定した。

また、手順７の加工工程においては、表２に示すストリップ幅となるように切断を行った。これら実施例３〜６、および比較例２、３用の核酸クロマトグラフィー検査具について、上述の手順８〜１０のように、クロマトグラフィー法により評価を行った。評価結果を表２に示す。

（視認性）
表２に示されているように、実施例３〜６、比較例３のように、ストリップ幅が２ｍｍ以上の場合には、検出ラインを容易に確認することができた［評価結果：良、表２中では丸印（○）で表示］。一方、比較例２のように、ストリップ幅が２ｍｍ未満の場合には、ストリップ幅と厚さの差が小さくなってしまうため、検出ラインを確認するのが困難となる場合があった［評価結果：不可、表２中ではクロス印（×）で表示］。

（移動相の展開性）
表２に示されているように、実施例３〜６、比較例２のように、ストリップ幅が５ｍｍ以下の場合には、移動相が均等に展開し、まだら模様となっていない明瞭な検出ラインが確認できた［評価結果：良、表２中では丸印（○）で表示］。一方、比較例３のように、ストリップ幅が５ｍｍ超の場合には、移動相が均等に展開せず、まだら模様の検出ラインとなった、即ち、検出ラインの内部で発色の濃淡が認められた［評価結果：不可、表２中ではクロス印（×）で表示］。

更に、実施例７〜９および比較例４、５用の核酸クロマトグラフィー検査具を、以下のようにして作製した。

上述の手順３において９種類のラインを形成するパターンを次のようにしたこと以外は、実施例３〜６、比較例３、４用の核酸クロマトグラフィー検査具の作製方法における手順１〜７の通りに、実施例７〜９および比較例４、５用の核酸クロマトグラフィー検査具を作製した。

複合シートの多孔性シートの表面に、縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］のライン幅Ｌ１が０．５ｍｍであり、同縦方向［完成品の「長手方向Ｙ」に対応］におけるライン間距離（隣り合う２つのラインの間の距離）Ｌ２が０ｍｍ（Ｌ２／Ｌ１が０：比較例４）、Ｌ１が０．５ｍｍであり、Ｌ２が０．１ｍｍ（Ｌ２／Ｌ１が０．２：実施例７）、Ｌ１が０．５ｍｍであり、Ｌ２が０．７ｍｍ（Ｌ２／Ｌ１が１．４：実施例８）、Ｌ１が０．５ｍｍであり、Ｌ２が１ｍｍ（Ｌ２／Ｌ１が２：実施例９）、Ｌ１が０．５ｍｍであり、Ｌ２が１．２５ｍｍ（Ｌ２／Ｌ１が２．５：比較例５）となるように、表示部（ライン）を形成した。

上記のように作製した実施例７〜９、および比較例４、５用の核酸クロマトグラフィー検査具について、手順８の移動相の準備において、プローブ番号１の塩基配列に相補的な塩基配列を有するサンプルＤＮＡに加えて、プローブ番号２の塩基配列に相補的な塩基配列を有するサンプルＤＮＡを更に含む移動相としたこと以外は、実施例７〜９および比較例４、５用の核酸クロマトグラフィー検査具についての場合と同様に、手順８〜１０の評価を行った。評価結果を表３に示す。

（同時検出時の視認性）
表３に示されているように、実施例７〜９のように、Ｌ２／Ｌ１が０．２〜２の範囲にある場合には、プローブ番号１のラインとプローブ番号２のラインが発色していることが容易に確認でき［評価結果：良、表３中では丸印（○）で表示］、同時検出時の視認性に優れたストリップであることが確認できた。比較例４のように、Ｌ２／Ｌ１が０．２未満である場合、プローブ番号１のラインとプローブ番号２のラインが１本のラインであるように見えるため、２本のラインが発色したことを確認することが困難であった。また、比較例５のように、Ｌ２／Ｌ１が２超である場合には、プローブ番号１のラインとプローブ番号２のラインとの間に発色していない１本のラインが存在するのか否か、即ち、２本のラインが連続して発色しているのか否かの判定が困難であった［評価結果：不可、表３中ではクロス印（×）で表示］。

本発明は、感染症やアレルギーなどに関する診断や、細菌やウィルスなどの検出に使用可能な核酸クロマトグラフィー検査具として利用できる。

１，１ａ：核酸クロマトグラフィー検査具、１０：多孔性シート、１３：検出面、１４ａ〜１４ｃ：位置マーカー、１５，１５ａ〜１５ｃ：表示部、１７：スポット、２０：バッキング部材、４０：吸収パッド、４５：試料採取部（先端部）、５０：テストチューブ、５５：試料、１０１，１０１ａ：核酸クロマトグラフィー検査具、１１０：多孔性シート、１１３：検出面、１１４ａ〜１１４ｃ：位置マーカー、１１５，１１５ａ〜１１５ｅ：表示部、１１７：スポット、１２０：バッキング部材、１４０：吸収パッド、１４５：試料採取部（先端部）、１５０：テストチューブ、１５５：試料。

Claims (19)

1. 標的核酸を含む試料液体を展開し、前記標的核酸を検出して表示するための細長形状の多孔性シートと、
   前記多孔性シートが貼り付けられたバッキング部材と、を備え、
   前記多孔性シートは、表面に、前記多孔性シートの長手方向と交わる角度に延びる帯状の表示部を有し、
   前記表示部は、前記標的核酸を捕獲するための核酸プローブが固定された複数の非真円形状のスポットの集合体により形成されるものである核酸クロマトグラフィー検査具。
2. 複数の前記スポットは、前記多孔性シートの長手方向および短手方向のそれぞれにおいて、前記スポットの重心が整列しているとともに、前記スポット同士が、少なくとも一部において重なっている請求項１に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
3. 前記スポットの形状が、楕円形状である請求項２に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
4. 複数の前記スポットの前記楕円形状の長軸方向が互いに平行である請求項３に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
5. 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの長手方向と平行である請求項３または４に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
6. 前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの短手方向と平行である請求項３または４に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
7. 前記多孔性シートが繊維状の材料からなり、
   前記楕円形状の長軸方向が、前記多孔性シートの繊維の目の方向と平行である請求項３または４に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
8. 前記楕円形状の短径に対する長径の比が、１．１〜３．５である請求項３〜７のいずれか１項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法であって、
   前記核酸プローブを含有する複数の液滴を、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させて吐出することにより、前記液滴が前記多孔性シート上に着滴して形成される複数の非真円形状のスポットであり、隣り合う前記スポット同士が少なくとも一部において重なっているスポットの集合体を形成する吐出工程と、
   前記非真円形状のスポットを乾燥して、前記核酸プローブを前記多孔性シートの表面に固定させる乾燥工程と、を含む核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
10. 前記吐出工程において、前記液滴を吐出するための吐出ユニットを、前記多孔性シートの表面の垂線に対して傾斜させた状態で、前記液滴を吐出する請求項９に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
11. 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの長手方向に傾斜させる請求項９または１０に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
12. 前記吐出ユニットを、前記多孔性シートの短手方向に傾斜させる請求項９または１０に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
13. 前記吐出工程において、前記吐出ユニットを、前記表示部の長手方向に移動させながら、前記液滴を吐出する請求項９〜１２のいずれか１項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
14. 前記吐出工程において、１つのスポットが乾燥した後に、当該スポットに隣接するスポットを形成するための液滴を吐出する請求項９〜１３のいずれか１項に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
15. 前記スポット１つ分以上の間隔を隔てて１列のスポットを形成した後、当該列に形成された２つの隣接するスポットの間に、更に液滴を吐出してスポットを形成する請求項１４に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
16. 第１の列を形成した後、１列以上の間隔を隔てて第２の列を形成し、その後、前記第１の列と、前記第２の列との間に、更に第３の列を形成する請求項１４または１５に記載の核酸クロマトグラフィー検査具の製造方法。
17. 標的核酸を含む試料液体を展開し、前記標的核酸を検出して表示するための細長形状の多孔性シートと、
    前記多孔性シートが貼り付けられたバッキング部材と、を備え、
    前記多孔性シートは、表面に、前記多孔性シートの長手方向と交わる角度に延びる複数の帯状の表示部を有し、
    複数の前記表示部の幅をＬ１とし、隣り合う２つの前記表示部の間の距離をＬ２とした場合に、Ｌ２／Ｌ１の値が０．２〜２の範囲にある核酸クロマトグラフィー検査具。
18. 前記多孔性シートの短手方向の長さＬ３が、２〜５ｍｍである請求項１７に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。
19. 前記Ｌ２が、０．１〜１ｍｍである請求項１７または１８に記載の核酸クロマトグラフィー検査具。