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JP2014082987A - 塩基配列解析方法、塩基配列解析装置及び塩基配列解析プログラム - Google Patents

塩基配列解析方法、塩基配列解析装置及び塩基配列解析プログラム Download PDF

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友彦 中村
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淳志 梶原
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Abstract

【課題】核酸増幅反応と融解曲線解析とを、連続して行うことができる塩基配列解析方法を提供する。
【解決手段】核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅手順と、前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定手順と、前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析手順と、を含む、塩基配列解析方法を提供する。この塩基配列解析方法によれば、核酸増幅反応と融解曲線解析とを同一の反応場で続けて行うことができる。
【選択図】図２

Description

本技術は、塩基配列解析方法、塩基配列解析装置及び塩基配列解析プログラムに関する。より詳しくは、濁度測定手順と融解曲線解析手順とを含む塩基配列解析方法等に関する。
二本鎖を形成する核酸鎖が２本の一本鎖核酸に解離（融解）する温度を融解温度（Ｔｍ値）という。融解曲線解析では、二本鎖を形成する核酸鎖を徐々に昇温して２本の一本鎖核酸に融解させながら融解に伴って変化するシグナルを検出することにより、温度変化に対するシグナル検出量の変化を測定する。融解温度は、温度変化に対してシグナル検出量の変化をプロットして得られる融解曲線から決定することができる。融解温度は２本の一本鎖核酸の相同性を反映するため、融解温度に基づけば２本の一本鎖核酸の塩基配列の同一性を判定できる。このため、融解曲線解析は、核酸増幅反応の特異性の確認や一塩基多型（ＳＮＰｓ）等の遺伝子型の判定など、核酸を解析するために利用されている。
二本鎖を形成する核酸鎖の融解の検出には、蛍光物質が一般的に用いられている。例えば、標的核酸鎖と二本鎖を形成可能な核酸プローブに蛍光標識を施すことにより、標的核酸鎖と核酸プローブとが解離した時点で蛍光標識が発光、あるいは消光して、核酸鎖の解離を検出することができる。また、二本鎖核酸鎖にインターカレートして蛍光を生じるインターカレーターなどを用いて二本鎖から一本鎖への変化を検出することも可能である。
蛍光物質は、融解曲線解析に限らず、増幅核酸鎖の検出や定量など、核酸の解析に広く用いられている。一方、増幅核酸鎖の検出には、蛍光物質を用いず、試料の濁度を検出する方法も採用されている。ＤＮＡ合成酵素による伸長反応では、副産物としてピロリン酸が生成され、これが反応溶液中のマグネシウムイオンと結合し、ピロリン酸マグネシウムが生成される。ピロリン酸マグネシウムの生成量が試料への溶解が可能な量を超えると、ピロリン酸マグネシウムが析出し、反応溶液は白濁を呈する。この白濁の程度を測定することにより、増幅核酸鎖の検出や定量が可能となる。
そこで、例えば特許文献１には、「蛍光物質を励起する光を出射する第一の光源と、蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致する波長域の光を出射する第二の光源と、第一の光源と第二の光源とを切り換えて発光させる制御部とを有し、前記第一の光源からの光及び前記第二の光源からの光が、導光部材にて重複する光学系路上を通過して核酸の増幅反応の反応場となる反応領域に照射され、増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質による光量と、増幅反応の進行に伴って光により励起された蛍光物質から生じる蛍光の強度とを検出できる核酸増幅反応装置」が開示されている。
特開２０１２−３４６１７号公報
上記の融解曲線解析を核酸増幅反応による増幅核酸鎖に対して行う場合、核酸が増幅された後に融解曲線解析を開始するため、核酸増幅反応から融解曲線解析への切り替えを、所定のタイミングで行う必要がある。
そこで、本技術は、核酸増幅反応と融解曲線解析とを続けて行うことが可能な塩基配列解析方法を提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本技術は、核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅手順と、前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定手順と、前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析手順と、を含む、塩基配列解析方法を提供する。
前記融解曲線解析手順は前記濁度が所定の値に達した時点で行うことが好ましい。
また、前記プローブ核酸鎖の融解温度は前記核酸増幅反応の反応温度より低く、前記プローブ核酸鎖の存在下で前記核酸増幅反応を行うことが好ましい。
さらに、前記プローブ核酸鎖の融解温度は、前記核酸増幅反応に用いるプライマーの融解温度より低いことが好ましく、前記プライマーの融解温度より５〜１５℃低いことが、より好ましい。
前記プローブ核酸鎖として、塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖を用いてもよい。
前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖は、各々波長の異なる光を発する蛍光物質で標識されていてもよく、前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖のうち、一のプローブ核酸鎖は、前記増幅産物に含まれる塩基配列の一部と完全に一致していてもよい。
前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応とすることができ、前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行ってもよい。
本技術はまた、反応場への照射光を出射する光源と、前記照射光によって前記反応場内の核酸増幅反応液から生じる光を検出する検出部と、前記反応場を加熱又は冷却する温度調節部と、前記検出部からの信号入力に基づいて光源の駆動モードを切り替える制御部と、を有し、前記制御部は、前記駆動モードを核酸増幅反応モードから融解曲線解析モードに切り替える、塩基配列解析装置を提供する。
前記光源は、第１の光源と第２の光源とを含み、該第１の光源から出射される光の波長は、該第２の光源からの光が照射された前記核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致することが好ましい。
前記制御部は、前記核酸増幅反応モードから前記融解曲線解析モードへの切り替えとして、前記反応場への前記照射光を出射する光源を、前記第１の光源から前記第２の光源へ切り替えることができる。
また、本技術に係る塩基配列解析装置は、前記第１の光源から出射される光と前記第２の光源から出射される光とを重複する光学経路へ導く導光部材を有していてもよい。
さらに、前記第２の光源は、単数若しくは複数のレーザ光源及び／又はＬＥＤ光源とすることができ、前記検出部は、前記蛍光物質から生じる蛍光を時分割に検出するよう構成されていてもよい。
前記光源及び／又は前記反応場から出射される光の進行方向を制限する遮光構造体が設けられていてもよく、前記遮光構造体は、複数の、前記光源と前記検出部の間の光学経路の位置に対応して、複数の開口部を有することが好ましい。
本技術はさらに、核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅ステップと、前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定ステップと、前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析ステップと、をコンピュータに実行させる塩基配列解析プログラムを提供する。
本技術により、核酸増幅反応と融解曲線解析とを同一の反応場で続けて行うことができる塩基配列解析方法等が提供される。
本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置の模式図である。 第一実施形態に係る塩基配列解析装置における核酸解析方法を説明するためのフローチャートである。 塩基配列解析装置における核酸解析方法の変形例を説明するためのフローチャートである。 本技術の第二実施形態に係る塩基配列解析装置の模式図である。 試験例１において測定された試験群１から３の濁度に基づくＴｔ値を示す図面代用グラフである。 試験例２において測定された試験群１から３の融解曲線を示す図面代用グラフである。 試験例２において測定された試験群１から３の融解曲線を示す図面代用グラフである。
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置の構成
（１）光源
（２）検出部
（３）温度調節部
（４）制御部
（５）反応領域
２．第一実施形態に係る塩基配列解析装置の動作
（１）核酸増幅手順
（２）濁度測定手順
（３）融解曲線解析手順
３．本技術の第二実施形態に係る塩基配列解析装置の構成
（１）励起フィルタ
（２）遮光構造体
４．本技術に係る塩基配列解析方法及び塩基配列解析プログラム
１．本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置の構成
図１は、本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１の模式図である。塩基配列解析装置Ａ１は、核酸増幅反応の反応場である反応領域５２への照射光を出射する光源（図１においては、第１光源１１及び第２光源１２）と、照射光によって反応領域５２（反応場）内の核酸増幅反応液から生じる光を検出する検出部２と、反応領域５２（反応場）を加熱又は冷却する温度調節部３ａと、検出部２からの信号入力に基づいて光源１１，１２の駆動モードを切り替える制御部４と、を有している。また、本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１において、光源には、第１光源１１と第２光源１２とが含まれる。
さらに、本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１には、第１光源１１（第１の光源）から出射される光と第２光源１２（第２の光源）から出射される光とを重複する光学経路へ導く導光部材１３１が、備えられている。
以下、図１を参照しながら、塩基配列解析装置Ａ１の各構成を順に説明する。なお、塩基配列解析装置Ａ１による解析の対象となる核酸増幅反応液は、塩基配列解析装置Ａ１とは別体として構成されたマイクロチップＢ１の反応領域５２に保持されているものとして説明する。また、図１では、マイクロチップＢ１に設けられた複数の領域のうち、２つの反応領域５２，５２を代表として示す。
（１）光源
塩基配列解析装置Ａ１には、図１に示すように、反応領域５２へ光を照射する光源として、第１光源１１と第２光源１２の２種類が備えられている。
第１光源１１は、核酸増幅反応過程で核酸増幅反応液の濁度を測定するための光Ｌ１を出射する。第１光源１１からの光Ｌ１の波長は、第２光源１２からの光Ｌ２が照射された核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質から生じる蛍光Ｌ２１の波長域に一致することが好ましい。塩基配列解析装置Ａ１においては、第２光源１２からの光Ｌ２によって励起された蛍光物質から生じる発光Ｌ２１を透過可能とする蛍光フィルタ１７が備えられている。このため、第１光源１１から出射される光Ｌ１を蛍光物質由来の蛍光Ｌ２１と同じ波長域の光とすることで、光Ｌ１が蛍光フィルタ１７を透過できるようになり、反応領域５２において生ずる光Ｌ１１，Ｌ２１が同じ検出部２で検出可能となる。
第１光源１１からの光Ｌ１は、例えば、通常の重水素ランプ、タングステンランプ、キセノンランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ等の光源から出射されるような様々な波長が混合されている光などであってもよい。蛍光フィルタ１７の透過波長域等に一致する波長域としては、例えば、４５０ｎｍ以上、特に４５０〜７８０ｎｍが挙げられる。
第２光源１２は、核酸増幅反応によって生成された増幅産物の融解曲線解析において、核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質に励起光Ｌ２（図１においては、光Ｌ２と表示。）を出射する。この励起光Ｌ２は、所望の蛍光物質の吸収スペクトルに対応した特定の波長域を有するものであり、蛍光物質から生じる蛍光Ｌ２１の波長域と重複しない波長域のものである。励起光Ｌ２は、反応領域５２に到達し、融解曲線解析に用いられる蛍光物質を励起する。そして、蛍光物質から生じる蛍光Ｌ２１は、蛍光フィルタ１７を介して検出部２に到達する。
第２光源１２（第二の光源）としては、例えば、レーザ光源、ＬＥＤ光源、水銀ランプ、タングステンランプ等が挙げられる。これらを単独で、又は複数組み合わせて使用してもよい。特に、単数若しくは複数の、レーザ光源及び／又はＬＥＤ光源が好適である。レーザ光源の場合、狭いスペクトル幅で高出力であるため、従来必要であった励起フィルタを排除することが可能となる。また、第２光源１２に導光板を備えることによって、波長の異なる複数種のレーザ光源による多色での励起が可能となり、この時、波長の異なる複数の励起光を第２光源から時分割して出射することも可能である。
本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１においては、第１光源１１と第２光源１２の、各々の光源から出射された光Ｌ１，Ｌ２の光路が重複するように、導光部材１３１が設けられている。本技術に係る塩基配列解析装置において、導光部材１３１は必須の構成ではないが、この導光部材１３１を用いることにより、光路上の集光レンズ１５や検出部２の数を減らすことができ、塩基配列解析装置全体の小型化が可能となる。
導光部材１３１には、光学入射端部１３１ａが設けられており、光学入射端部１３１ａに、第１光源１１又は第２光源１２から出射された光Ｌ１，Ｌ２が入射される。導光部材１３１内部には、入射された光Ｌ１，Ｌ２が反応領域５２の方向に向かわせるような部材（例えばプリズム、反射板や凹凸等）が設けられている。また、塩基配列解析装置Ａ１において、導光部材１３１と反応領域５２との間には、集光レンズ１５及び絞り１６が配置されることが好ましい。
（２）検出部
検出部２は、反応領域５２から出射される光Ｌ１１又は蛍光Ｌ２１を検出する。検出部２の構成は、少なくとも第１光源１１からの光Ｌ１を照射された反応領域５２から生じる散乱光あるいは反応領域５２を透過した透過光を含む光Ｌ１１と、第２光源１２からの励起光Ｌ２によって反応領域５２から生じる蛍光Ｌ２１とを検出することが可能であれば特に限定されない。検出部２としては、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ（光電子倍増管）、フォトダイオード等が挙げられる。
また、塩基配列解析装置Ａ１において、散乱光又は透過光を含む光Ｌ１１や蛍光Ｌ２１が検出部２へ到達する光路上の、反応領域５２と検出部２との間には、蛍光フィルタ１７や集光レンズ１５が備えられていることが好ましい。蛍光フィルタ１７は、反応領域５２からの蛍光Ｌ２１や散乱光又は透過光を含む光Ｌ１１を良好に透過させるものが好ましい。例えば、蛍光フィルタ１７としては、マルチバンドパスフィルター等が挙げられる。また、この具体的な波長帯域としては４５０ｎｍ以上、より具体的には４５０〜７８０ｎｍが挙げられる。なお、前述した第２光源１２から出射される励起光Ｌ２が時分割で反応領域５２に出射される場合には、塩基配列解析装置Ａ１において、反応領域５２内の蛍光物質から発生する蛍光Ｌ２１を時分割に検出する検出部２を有することが好ましい。
（３）温度調節部
温度調節部３ａは、反応領域５２を所望の温度となるように加熱又は冷却するための構成である。反応領域５２の温度を変えることが可能であれば、その構成については特に限定されないが、例えば、光透過性のあるＩＴＯヒータ等の透明導電膜等が挙げられる。温度調節部３ａは、反応領域５２に近接する位置に設けられていることが好ましい。
（４）制御部
制御部４は、上述した第１光源１１、第２光源１２、温度調節部３ａの駆動を制御する。制御部４による第１光源１１等の制御については、後述する。制御部４は、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成でき、ハードディスク内にはＯＳと後述する塩基配列解析プログラムなどが格納されている。
（５）反応領域
反応領域５２は、後述する核酸の増幅反応及び融解曲線解析の反応場であり、反応領域５２から生じる光Ｌ１１，Ｌ２１を、塩基配列解析装置Ａ１によって測定できるよう構成されていれば、反応領域５２の構成は特に限定されない。反応領域５２を構成するものとしては、例えば、市販の核酸増幅反応用のプラスチック製チューブ等であってもよく、また、例えば図１に示すように、マイクロチップＢ１に形成された溝を反応領域５２としてもよい。
マイクロチップＢ１は、複数の基板５１, ５１が貼り合わされてなる。本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１では、反応領域５２に収容された試料について光学的に分析するため、基板５１，５１には、光透過性を有し自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。基板５１, ５１の材料は、ガラスや、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種プラスチック類とできる。また、反応領域５２内には、予め、核酸増幅反応及び融解曲線解析に必要な試薬類の一部が収容された状態であってもよい。
２．第一実施形態に係る塩基配列解析装置の動作
次に、本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１の動作について、図２に示すフローチャートに則して説明する。本技術に係る塩基配列解析方法には、フローチャート（図２）に示すように、核酸増幅手順Ｓ１、濁度測定手順Ｓ２、融解曲線解析手順Ｓ３、の各手順が含まれる。
（１）核酸増幅手順
図２中、符号Ｓ１は、核酸増幅反応よって増幅産物を得る核酸増幅手順である。本手順Ｓ１では、反応領域５２（図１、参照。）に増幅対象の核酸鎖を含む試料（核酸増幅反応液）を導入し、核酸増幅反応を行い、融解曲線解析の標的配列を含む増幅核酸鎖を得る。
第一実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１を用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplificationProcess）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。
核酸増幅反応が温度サイクルを伴う場合や、加熱操作が必要な場合には、反応領域５２内の試料への加熱は、温度調節部３ａによって行うことができる。また、温度調節部３ａにおける加熱又は冷却については、制御部４によって制御されるように、塩基配列解析装置Ａ１が構成されていてもよい。
塩基配列解析装置Ａ１を用いて行う核酸増幅反応については、温度サイクルを実施しない等温核酸増幅反応が好ましく、特にLoop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法で核酸増幅反応を行うことが好ましい。ＬＡＭＰ法では、増幅産物の生成量が多いことによって、核酸増幅に伴う塩の生成量が多く、後述する濁度測定が容易である。
反応領域５２内の試料（核酸増幅反応液）には、核酸増幅反応において増幅対象である核酸鎖と、核酸増幅反応に必要な試薬類が含まれている。具体的には、増幅の対象である核酸鎖の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」とも称する」）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、試薬類には、後述する融解曲線解析に必要なプローブ核酸鎖も含まれていることが好ましい。本技術に係る塩基配列解析方法において、融解曲線解析のためのプローブ核酸鎖の存在下で核酸増幅手順Ｓ１の核酸増幅反応を行うことにより、核酸増幅反応によって増幅核酸鎖を得る手順に連続して融解曲線解析を開始することが可能となる。
プローブ核酸鎖の融解温度（Ｔｍ値）は、核酸増幅反応の反応温度より低いことが好ましく、核酸増幅反応の際、増幅核酸鎖と二本鎖を形成して核酸の増幅の妨げとならないように、核酸増幅反応に用いるプライマーの融解温度より低いことが、より好ましい。特に、プローブ核酸鎖の融解温度は、プライマーの融解温度より５〜１５℃低いことが好ましい。プローブ核酸鎖の融解温度については、実際に核酸増幅反応を行う条件下で、融解曲線解析を実施することにより実測することができる。また、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法等の公知の方法から適宜選択して算出することもできる。
本手順Ｓ１において、塩基配列解析装置Ａ１の制御部４は、駆動モードとして「核酸増幅反応モード」を選択している。「核酸増幅反応モード」とは、反応領域５２内の核酸増幅反応液に含まれる核酸の増幅に適した状態に塩基配列解析装置Ａ１の各構成を制御するモードである。具体的には、本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１のように２種類の光源（第１光源１１，第２光源１２）が備えられた装置では、次に述べる濁度測定手順Ｓ２に用いる第１光源１１を駆動させる。また、核酸増幅反応が温度サイクルを伴う方法によるものであれば、制御部４は、「核酸増幅反応モード」において温度調節部３ａを駆動させ、所望の温度サイクルを実施する。
（２）濁度測定手順
図２中、符号Ｓ２は、核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定手順である。本手順では、核酸増幅手順Ｓ１によって核酸増幅反応が行われた反応領域５２内の核酸反応液の濁度を測定し、核酸が増幅しているかどうか判定する。
核酸増幅反応に伴って生成される塩としては、例えば、ピロリン酸とこれに結合可能な金属イオンにより生じたものが挙げられる。これらの塩が、核酸増幅反応液に溶解可能な量を超えて生成されることにより、析出し、濁度物質となる。本技術に係る塩基配列解析方法において、濁度測定の対象となる濁度物質は、核酸増幅反応に伴って生成され、光学的に測定可能な物質であれば、特に限定されない。
濁度測定手順Ｓ２の開始は、核酸増幅手順Ｓ１の開始と同時であってもよく、核酸増幅手順Ｓ１を開始した後、所定の時間が経過してからでもよい。いわゆるリアルタイムＰＣＲのように、核酸鎖の増幅過程における濁度の測定が必要な場合には、濁度測定手順Ｓ２は、核酸増幅手順Ｓ１の開始と同時、あるいは開始直後に開始することが好ましい。一方、増幅核酸鎖が核酸増幅反応液に含まれているか判定することのみが必要であれば、濁度測定手順Ｓ２の開始は、核酸増幅手順Ｓ１を開始していから所定の時間が経過した後に行えばよい。
濁度測定手順Ｓ２において、制御部４は、所定のタイミングで、第１光源１１から濁度測定のための光Ｌ１を出射させる。第１光源１１から出射された光Ｌ１は、導光部材１３１、集光レンズ１５を経て反応領域５２へ照射される。光Ｌ１が照射されることにより、反応領域５２では、核酸増幅生成過程で生成された濁度物質による散乱光、或いは反応領域５２を透過した透過光を含む光Ｌ１１が生ずる。光Ｌ１１は、集光レンズ１５、蛍光フィルタ１７を経て検出部２において検出される。なお、濁度測定手順Ｓ２においては、反応領域５２に生ずる散乱光を検出してもよく、反応領域５２の透過光を検出してもよく、あるいはその両方を検出してもよい。本技術に係る塩基配列解析方法において、濁度の測定方法は特に限定されない。
制御部４による第１光源１１からの光Ｌ１の出射は、例えば図２に示すように、予め濁度について所定値を規定しておき、核酸増幅反応液の濁度が所定値を超えるまでは、所定の間隔で繰り返してもよい。制御部４は、核酸増幅反応液の濁度が所定値を超えた時点で、次に述べる融解曲線解析手順Ｓ３を開始させる。
一方、図３に示すように、制御部４は、核酸増幅反応を開始してから一定時間経過後に、第１光源１１から光Ｌ１を出射させ、核酸増幅反応液の濁度を測定するようにしてもよい。核酸増幅反応液の濁度が所定値を超えた場合には、制御部４は、次に述べる融解曲線解析手順Ｓ３を開始させ、濁度が所定値を超えなかった場合には、融解曲線解析に必要な増幅核酸鎖が得られなかったとして、塩基配列解析方法を終了させる。
（３）融解曲線解析手順
図２中、符号Ｓ３は、核酸増幅反応の反応場でプローブ核酸鎖と増幅産物（増幅核酸鎖）との融解曲線解析を行う融解曲線解析手順である。本手順Ｓ３は、核酸増幅反応液の濁度が所定の値に達した時点で行うことが好ましい。本手順Ｓ３では、励起光Ｌ２を反応領域５２に照射し、核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質から生じる蛍光Ｌ２１を測定して、増幅産物の融解曲線解析を行う。
制御部４は、駆動モードを核酸増幅反応モードから融解曲線解析モードに切り替え、融解曲線解析手順Ｓ３を開始させる。制御部４における駆動モードの切り替えは、反応領域５２（反応場）から生じる光Ｌ１１に基づく核酸増幅反応液の濁度が所定値に達した時点で行うことが好ましい。
「融解曲線解析モード」とは、制御部４が検出部２からの信号入力に基づいて、反応領域５２内の核酸増幅反応液に含まれる増幅核酸鎖とプローブ核酸鎖との融解曲線解析に適した状態に塩基配列解析装置Ａ１の各構成を制御するモードである。具体的には、本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１のように２種類の光源（第１光源１１，第２光源１２）が備えられた装置では、反応領域５２への照射光を出射する光源を、第１光源１１（第１の光源）から第２光源１２（第２の光源）へ切り替える。なお、本手順Ｓ３において、制御部４は、励起光Ｌ２の出射のタイミングや出力（励起光波長や光量等）、時分割を制御してもよい。また、制御部４は、本手順Ｓ３において、光源の他、温度調節部３ａを駆動させ、核酸増幅反応液を所望の温度となるように制御する。
融解曲線解析手順Ｓ３で用いる蛍光物質としては、例えば、二本鎖核酸に結合して蛍光を発するインターカレーターや、二本鎖の形成によって蛍光を生じる又は蛍光を消失する標識が施されたプローブ核酸鎖を用いることができる。プローブ核酸鎖を用いる場合には、一本鎖核酸への融解に伴って増加あるいは減少する蛍光の強度に基づいて融解曲線を得ることができる。二本鎖の形成によって蛍光が消失するプローブ核酸鎖としては、例えば、市販のＱＰｒｏｂｅと称されるものを利用できる。
融解曲線解析手順Ｓ３においては、プローブ核酸鎖として、塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖を用いてもよい。例えば、増幅核酸鎖の異なる部分にプローブ核酸鎖を設計することで、一回の融解曲線解析で増幅核酸鎖の複数の部分の塩基配列を解析することが可能である。また、塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖のうち、一のプローブ核酸鎖は、増幅産物に含まれる塩基配列の一部と完全に一致するよう設計してもよい。塩基配列が未知の部分に対して設計したプローブ核酸鎖を用いた融解曲線解析において、増幅核酸鎖の一部と完全に一致するプローブ核酸鎖による融解曲線を基準として、融解曲線解析を行うことも可能である。
塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖を一回の融解曲線解析に用いる場合、各々波長の異なる光を発する蛍光物質で標識されていることが好ましい。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン（fluorescein）やその誘導体類の一つであるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン（rhodamin）やその誘導体、ボデピー（BODIPY）色素類などが挙げられる。
融解曲線解析手順Ｓ３において、蛍光物質によって標識されたプローブ核酸鎖を複数種類用いる場合には、上述した時分割により、各蛍光物質の強度を検出することが好ましい。
制御部４は、融解曲線解析手順Ｓ３の初めに、反応領域５２内の核酸増幅反応液をプローブ核酸鎖の融解温度未満まで冷却させる。冷却により核酸増幅反応液の温度がプローブ核酸鎖の融解温度よりも低くなると、プローブ核酸鎖が増幅産物にハイブリダイズして二本鎖が形成される。冷却は、通常、核酸増幅反応の反応温度（６５℃付近）から、室温〜４０℃まで行われる。
試料の冷却を行う前に、増幅産物（増幅核酸鎖）の熱変性を行ってもよい。熱変性は、通常、９０〜１００℃、好ましくは９５℃前後まで加熱することによって行われる。熱変性により増幅産物の二本鎖形成部分が部分的に解離する。増幅産物の二本鎖形成部分にプローブ核酸鎖を設計した場合には、本手順Ｓ３の初めに増幅核酸鎖を熱変性させる手順を加えることにより、プローブ核酸鎖を増幅核酸鎖の標的配列にハイブリダイズさせることができる。
次に、融解曲線を得るために、制御部４は、冷却された核酸増幅反応液を加熱するよう、温度調節部３ａを駆動させる。また、制御部４は、核酸増幅反応液の加熱と同時に、第２光源１２からの励起光Ｌ２の出射を開始させる。
反応領域５２内のハイブリダイズした状態にある増幅核酸鎖とプローブ核酸鎖は、核酸増幅反応液の温度の上昇に伴い、一本鎖核酸に融解していく。核酸増幅反応液中の蛍光物質は、励起光Ｌ２を照射されることにより、蛍光Ｌ２１を発する。蛍光Ｌ２１は、蛍光フィルタ１７や集光レンズ１５を経て検出部２において検出される。融解曲線解析において、昇温は、通常、冷却後の温度（室温〜４０℃）から、９０℃付近まで行い、温度変化に対する蛍光検出量の変化を測定する。
温度調節部３ａによって加熱された核酸増幅反応液が、９０℃付近の所定の温度に達した時点で、制御部４は、第２の光源１２からの励起光Ｌ２の出射を止め、融解曲線解析手順Ｓ３を終了させる。また、制御部４は、励起光Ｌ２の停止に合わせて、温度調節部３ａによる核酸増幅反応液の加熱も停止させる。
本技術に係る塩基配列解析装置Ａ１においては、制御部４が、核酸増幅反応液の濁度が所定値に達した時点で、駆動モードを核酸増幅反応モードから融解曲線解析モードに切り替えることにより、核酸増幅反応と融解曲線解析とを連続的に行うことが可能となる。
また、塩基配列解析装置Ａ１の制御部４が、増幅核酸鎖が所定の濃度に達してから駆動させる光源を切り替えることにより、増幅核酸鎖の有無を確認するなどの他の手順を加えることなく、核酸増幅反応が行われた反応場と同一の反応場に試料を保持した状態で、核酸増幅反応と融解曲線解析とを行うことできる。
さらに、塩基配列解析装置Ａ１を用いて行う塩基配列解析方法においては、プローブ核酸鎖の融解温度が、核酸増幅反応の反応温度より低くなっているため、核酸増幅反応の際、プローブ核酸鎖が増幅対象の核酸鎖にハイブリダイズすることが防止される。このため、プローブ核酸鎖を核酸増幅反応液に加えた状態であっても、核酸増幅反応が妨げられず、核酸増幅反応を開始する前に、融解曲線解析に必要な試薬類を反応領域に導入することができ、塩基配列を解析するための操作が簡便となる。
また、核酸増幅反応液の濁度を測定する濁度測定手順によって、増幅核酸鎖が融解曲線解析に適した量まで増幅されたことが確認された試料のみを、融解曲線解析に供することができる。このため、本技術に係る塩基配列解析方法によって、増幅核酸鎖の融解曲線解析の精度が向上する。
３．本技術の第二実施形態に係る塩基配列解析装置の構成
図４に、本技術の第二実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ２の模式図を示す。塩基配列解析装置Ａ２は、励起フィルタ１８と遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ以外の構成については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成部分については、同一の符号を付し、説明については省略する。
（１）励起フィルタ
塩基配列解析装置Ａ２には、第２光源１２から出射された光Ｌ２から特定の波長域の光のみを透過可能とする励起フィルタ１８が備えれられている。励起フィルタ１８は、第２光源１２と反応領域５２との間に配設されていることが好ましい。また、励起フィルタ１８は、第２光源１２から出力される光Ｌ２を所望の蛍光検出が可能な特定波長の励起光にするものが好適である。励起フィルタ１８としては、例えば、バンドパスフィルター等が挙げられる。
図４に示すように、濁度測定に用いる第１光源１１から出射された光Ｌ１の光路上に、励起フィルタ１８は設けられないため、塩基配列解析装置Ａ２には、導光部材１３２が反応領域５２と励起フィルタ１８との間に設けられている。導光部材１３２には光学入射端部１３２ａが設けられており、光学入射端部１３２ａに、第１光源１１から出射された光が入射される。導光部材１３２内部には、第一実施形態と同様に、入射された光が反応領域５２の方向に向かわせるような部材（例えばプリズム、反射板や凹凸等）が設けられていて、第２光源１２から出射された光Ｌ２と第１光源１１から出射された光Ｌ１とは、重複する光路を経て、反応領域５２へ到達する。
なお、本技術の第一実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ１と第二実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ２においては、光源は２種類（第１光源１１、第２光源１２）設けられているが、本技術に係る塩基配列解析装置に設けられる光源は１つであってもよい。この場合、一つの光源から出射される光であっても、濁度測定手順Ｓ２においては、濁度の測定に適した波長域の光のみが透過可能な励起フィルタ１８を、融解曲線解析手順Ｓ３においては、蛍光物質の励起に適した波長域の光のみが透過可能な励起フィルタ１８を、各々、適切なタイミングで反応領域５２への光学経路上に設置すればよい。
（２）遮光構造体
塩基配列解析装置Ａ２には、反応領域５２，（反応場）から出射される光Ｌ１１，Ｌ２１の進行方向を制限する遮光構造体１９ａ，１９ｂが設けられている。また、反応場５２からの光Ｌ１１，Ｌ２１の出射方向を制限する目的とは別に、光源（第１光源１１、第２光源１２）から出射される光Ｌ１，Ｌ２の進行方向を制限する遮光構造体１９ｃ，１９ｄが設けられている。すなわち、塩基配列解析装置Ａ２においては、隣接する光学系から漏れ込む迷光を抑制する遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄが、光源（第１光源１１，第２光源１２）と検出部２との間の光学経路に隣接して複数箇所に設置されている。遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄを設けることにより迷光が抑制されるため、塩基配列解析装置Ａ２を用いて行う解析の精度が向上する。
図４に示す塩基配列解析装置Ａ２においては、検出部２に近接して設けられた遮光構造体１９ａと反応領域５２に隣接して設けられた遮光構造体１９ｂが、反応領域５２から出射される光Ｌ１１，Ｌ２１の進行方向を制限する。一方、第２光源１２に隣接して設けられた遮光構造体１９ｄと反応領域５２に隣接して設けられた遮光構造体１９ｃが、光源（第１光源１１、第２光源１２）から出射される光Ｌ１，Ｌ２の進行方向を制限する。本技術に係る塩基配列解析装置Ａ２においては、遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄの数は特に限定されず、光源（第１光源１１、第２光源１２）又は反応領域５２の何れか一方から出射される光に対して、遮光構造体が設けられていてもよい。しかし、塩基配列解析装置Ａ２を用いて行う解析の精度を向上させるために、光源（第１光源１１、第２光源１２）と反応領域５２から出射される各々の光に対して、迷光を抑制する位置に遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄが設けられていることが好ましい。
遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄは、所定の厚みを有する板状の構造体であることが好ましい。また、図４に示すように、遮光構造体１９ｂ，１９ｃが反応領域５２を構成するマイクロチップＢ１の基板５１，５１に接する位置に設けられる場合には、温度調節部３ｂ，３ｃを兼ねる構成であってもよい。さらに、遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄは、単数又は複数の所定形状の開口部１９１ａ，１９１ｂ，１９１ｃ，１９１ｄを有していてもよい。開口部１９１ａ，１９１ｂ，１９１ｃ，１９１ｄは、複数の、光源（第１光源１１、第２光源１２）と検出部２との間の光学経路の位置に対応して、複数設けられていることが好ましい。
遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄは、例えば、ステンレス、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）等の金属膜に、例えばフォトリソグラフィ法を用いたエッチングによって、単数又は複数の開口部１９１ａ，１９１ｂ，１９１ｃ，１９１ｄをパターン形成することにより作製することが可能である。開口部１９１ａ，１９１ｂ，１９１ｃ，１９１ｄは、遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄの光源（第１光源１１、第２光源１２）又は反応領域５２に対向する領域に設けられていることが好ましい。
本実施形態に係る塩基配列解析装置Ａ２においては、励起フィルタ１８が塩基配列解析装置Ａ２に備えられることにより、様々な波長が混合されている重水素ランプ、タングステンランプ、キセノンランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ等の通常の光源を利用した場合であっても、蛍光物質の励起に適した波長の光のみを反応領域５２に照射することができる。また、上述した第２光源１２がレーザー光源である場合には、蛍光物質によっては有効な励起波長のレーザーが入手できない場合がある。しかし、励起フィルタ１８を用いることで、所望の波長の励起光とできるため、融解曲線解析に用いる蛍光物質を幅広く選択することが可能となる。
また、塩基配列解析装置Ａ２においては、遮光構造体１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄを備えることによって、周辺の光源や反応領域からの迷光を抑制することが可能となる。このため、マクロチップＢ１のような反応領域５２が隣接して複数存在する場合であっても、時分割で各反応領域５２を励起／光検出せずに、塩基配列解析方法において精度の高い光学検出を行うことができる。また複数の反応領域５２から出射される光Ｌ１１，Ｌ２１の検出に要する時間も大幅に短縮することができる。その他、本実施形態の前記以外の構成及び効果は、上述した第一実施形態と同様である。
４．本技術に係る塩基配列解析方法及び塩基配列解析プログラム
本技術に係る塩基配列解析方法は、上述した塩基配列解析装置Ａ１，Ａ２の制御部４によって実行される動作に対応するものである。また、塩基配列解析装置Ａ１，Ａ２の制御部４には、この動作を実行するための塩基配列解析プログラムが格納されている。
本技術に係る塩基配列解析プログラムは、ハードディスクに格納・保持され、ＣＰＵ及びＯＳの制御下でメモリに読み込まれて、上述の解析操作を実行する。また、塩基配列解析プログラムは、コンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録されたものとできる。記録媒体としては、コンピュータで読み取り可能な記録媒体であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の円盤形記録媒体が用いられる。また、磁気テープ等のテープ型記録媒体を用いてもよい。また、一部の処理をＤＳＰ（Digital Signal Processor）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）、ＰＬＤ（Programing Logic Device）、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）等のハードウェアで構成し、上記ソフトウェアプログラムと連携させて高速処理を行う構成も採用できる。
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅手順と、前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定手順と、前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析手順と、を含む、塩基配列解析方法。
（２）前記融解曲線解析手順は前記濁度が所定の値に達した時点で行う、上記（１）記載の塩基配列解析方法。
（３）前記プローブ核酸鎖の融解温度は前記核酸増幅反応の反応温度より低く、前記プローブ核酸鎖の存在下で前記核酸増幅反応を行う、上記（１）又は（２）記載の塩基配列解析方法。
（４）前記プローブ核酸鎖の融解温度は、前記核酸増幅反応に用いるプライマーの融解温度より低い、上記（１）〜（３）の何れかに記載の塩基配列解析方法。
（５）前記プローブ核酸鎖の融解温度は、前記プライマーの融解温度より５〜１５℃低い、上記（４）記載の塩基配列解析方法。
（６）前記プローブ核酸鎖として、塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖を用いる上記（１）〜（５）の何れかに記載の塩基配列解析方法。
（７）前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖は、各々波長の異なる光を発する蛍光物質で標識されている、上記（６）記載の塩基配列解析方法。
（８）前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖のうち、一のプローブ核酸鎖は、前記増幅産物に含まれる塩基配列の一部と完全に一致する、上記（６）又は（７）記載の塩基配列解析方法。
（９）前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、上記（１）〜（８）の何れかに記載の塩基配列解析方法。
（１０）前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行う、上記（９）記載の塩基配列解析方法。
（１１）反応場への照射光を出射する光源と、前記照射光によって前記反応場内の核酸増幅反応液から生じる光を検出する検出部と、前記反応場を加熱又は冷却する温度調節部と、前記検出部からの信号入力に基づいて光源の駆動モードを切り替える制御部と、を有し、前記制御部は、前記駆動モードを核酸増幅反応モードから融解曲線解析モードに切り替える、塩基配列解析装置。
（１２）前記光源は、第１の光源と第２の光源とを含み、該第１の光源から出射される光の波長は、該第２の光源からの光が照射された前記核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致する、上記（１１）記載の塩基配列解析装置。
（１３）前記制御部は、前記核酸増幅反応モードから前記融解曲線解析モードへの切り替えとして、前記反応場への前記照射光を出射する光源を、前記第１の光源から前記第２の光源へ切り替える、上記（１２）記載の塩基配列解析装置。
（１４）前記第１の光源から出射される光と前記第２の光源から出射される光とを重複する光学経路へ導く導光部材を有する、上記（１２）又は（１３）記載の塩基配列解析装置。
（１５）前記第２の光源は、単数若しくは複数のレーザ光源及び／又はＬＥＤ光源である、上記（１２）〜（１４）の何れかに記載の塩基配列解析装置。
（１６）前記検出部は、前記蛍光物質から生じる蛍光を時分割に検出する、上記（１２）〜（１５）の何れかに記載の塩基配列解析装置。
（１７）前記光源及び／又は前記反応場から出射される光の進行方向を制限する遮光構造体が設けられた、上記（１１）〜（１６）の何れかに記載の塩基配列解析装置。
（１８）前記遮光構造体は、複数の、前記光源と前記検出部の間の光学経路の位置に対応して、複数の開口部を有する、上記（１７）記載の塩基配列解析装置。
＜試験例１＞
１．核酸増幅反応液の濁度測定
融解曲線解析に用いるプローブ核酸鎖の存在下で核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応液の濁度を測定し、プローブ核酸鎖の核酸増幅反応への影響を検証した。
［材料と方法］
本試験例において、核酸増幅反応は、ＬＡＭＰ法により行った。核酸増幅反応における増幅対象の鋳型核酸鎖には、ビフィズス菌のゲノムＤＮＡを用いた。ビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum、ＮＢＲＣ番号：100015 ）は、製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）のBiological Resource Center （ＮＢＲＣ）より入手した。また、鋳型核酸鎖の増幅には、表１に示す５種類のプライマーを用いた。このうち、プライマーＦＩＰは、上流側２２塩基に鋳型核酸鎖の塩基配列の一部に相補的な配列を有し、下流側２０塩基に鋳型核酸鎖の塩基配列の一部と相同な配列を有している。また、プライマーＢＩＰは、上流側２１塩基に鋳型核酸鎖の塩基配列の一部と相同な配列を有し、下流側２０塩基に鋳型核酸鎖の塩基配列の一部に相補的な配列を有している。本試験例では、便宜的に、プライマーＦＩＰについて、上流側２２塩基の部分をプライマーＦＩＰ（Ｆ１ｃ）と表記し、下流側２０塩基の部分をプライマーＦＩＰ（Ｆ２）と表記する。また、プライマーＢＩＰについても同様に、上流側２１塩基の部分をプライマーＢＩＰ（Ｂ１）と表記し、下流側２０塩基の部分をプライマーＢＩＰ（Ｂ２ｃ）と表記する。
各プライマーのＴｍ値は以下のとおりである。プライマーＦ３：６４．２℃、プライマーＢ３：６１．２℃、プライマーＦＩＰ（Ｆ１ｃ）：７２．４℃、プライマーＦＩＰ（Ｆ２）：６８．６℃、プライマーＢＩＰ（Ｂ１）：７１．１℃、プライマーＢＩＰ（Ｂ２ｃ）：６６．７℃、プライマーＬＦ：６６．５℃。プライマーのＴｍ値算出には最近接塩基対法を用い、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）濃度を５０ｍＭとし、プライマー濃度については、Ｆ３、Ｂ３を各々０．２５μＭ、ＦＩＰ、ＢＩＰを各々２μＭ、ＬＦを１μＭとして算出した。なお、プライマーＦＩＰとプライマーＢＩＰについては、上流側と下流側とに分けて、Ｔｍ値を算出した。これは、ＬＡＭＰ法の反応機序において、プライマーＦＩＰ又はプライマーＢＩＰの上流側が核酸鎖とアニールする状態と、下流側が核酸鎖とアニールする状態の、２つの状態が含まれるためである。
Figure 2014082987
核酸増幅反応液には、後述する試験例２の融解曲線解析に用いるプローブ核酸鎖（表２参照。）を、核酸増幅反応を開始する前に加えた。プローブ核酸鎖として、本試験例では、表２に示す塩基配列の末端に蛍光物質が結合されたＱＰｒｏｂｅを用いた。これらのＱＰｒｏｂｅは、日鉄環境エンジニアリングより入手した。
表２に示すプローブ核酸鎖は、融解温度（Ｔｍ値）が７４．２℃のProbe 1、融解温度が５３．５℃で、鋳型核酸鎖の配列の一部と完全に一致するProbe 2、融解温度が５４．５℃で、鋳型核酸鎖の配列と一塩基の不一致を塩基配列中に有するProbe 3、の３種類である。各プローブ核酸鎖のＴｍ値の算出には最近接塩基対法を用い、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）濃度を５０ｍＭとし、プローブ濃度を０．２μＭとして算出した。本試験例では、Probe 1〜3の３種類のプローブ核酸鎖のうち、何れか１種類のプローブ核酸鎖を核酸増幅反応液に加えた。
Figure 2014082987
上記の鋳型核酸鎖、プライマー及びプローブ核酸鎖と、ＬＡＭＰ試薬（栄研化学）とを混合し、核酸増幅反応用容器に分注し、核酸増幅反応液（２５μｌ）とした。核酸増幅反応液において、Probe 1を含むものを試験群１とし、Probe 2を含むものを試験群２とし、Probe 3を含むものを試験群３とした。核酸増幅反応液における、鋳型核酸鎖、プライマー及びプローブ核酸鎖の濃度を表３に示す。核酸増幅反応は、６３℃で行い、核酸増幅反応液の濁度測定には、Loopamp EXIA（栄研化学）を用いた。
Figure 2014082987
［結果］
図５に、本試験例の結果を示す。図５は、核酸増幅反応における試験群１から３のＴｔ値（分）を示す。図５に示すＴｔ値は、各試験群の３検体の平均値である。Ｔｔ値とは、核酸増幅反応を始めてから核酸増幅反応液の濁度の上昇速度が所定の閾値を超えた時点までに要した時間であり、Ｔｔ値が小さいほど、効率的に核酸増幅反応が起こっていることを示す。
図５に示すように、核酸増幅反応液の濁度測定の結果に基づき、試験群１〜３の全ての試験群において、核酸鎖が増幅されていることが確認された。また、核酸増幅反応の反応温度（６３℃）より融解温度が９℃程度低いプローブ核酸鎖（Probe 2、Probe 3）を含む試験群２及び試験群３においては、融解温度が反応温度付近のProbe 1を含む試験群１に比べ、Ｔｔ値が小さかった。
本試験例の結果から、プローブ核酸鎖の存在下においても、核酸増幅反応によって鋳型核酸鎖が増幅されることが確認された。また、プローブ核酸鎖の存在下で行われる核酸増幅反応においては、プローブ核酸鎖の融解温度が核酸増幅反応の反応温度より低い方が、より効率的に核酸鎖が増幅されることが示された。
＜試験例２＞
２．増幅核酸鎖とプローブ核酸鎖との融解曲線解析
試験例１で得られた増幅核酸鎖（増幅産物）とプローブ核酸鎖との融解曲線解析を行い、増幅核酸鎖における一塩基の差異の検出を試みた。
［材料と方法］
融解曲線解析には、上記の試験例１で得られた核酸増幅反応液に含まれる増幅核酸鎖と、プローブ核酸鎖を用いた。すなわち、試験例１で核酸の増幅が確認された試験群１〜３を、容器を交換したり、他の試薬等を加えることなく、そのまま本試験例の融解曲線解析に用いた。
試験例１に用いた試験群１〜３については、一度３０℃まで冷却した後、融解曲線解析を３０℃〜９０℃の温度範囲で行った。蛍光強度の測定には、蛍光測定装置Ｃｈｒｏｍｏ４（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用い、１℃ごとに各試験群の蛍光強度を測定し、各温度での保持時間は、５秒に設定した。
［結果］
図６に本試験例で得られた、試験群１〜３の融解曲線を示す。図６の縦軸は、ＱＰｒｏｂｅであるプローブ核酸鎖（Probe 1〜3）に基づく蛍光強度であり、横軸は温度である。
ＱＰｒｏｂｅには、蛍光標識されたシトシンが末端に存在するため、核酸鎖とハイブリダイズしていない状態では、蛍光物質が発光するが、核酸鎖とハイブリダイズすると、蛍光標識されたシトシンがグアニンと対合するため、グアニンの影響により蛍光物質が消光する。従って、融解曲線解析における核酸増幅反応液の温度上昇に伴って、核酸鎖にハイブリダイズしていたプローブ核酸鎖が核酸鎖から外れると蛍光物質が蛍光を発し、核酸鎖から外れるプローブ核酸鎖の増加に応じて、その蛍光強度も増加する。
図７は、試験群１〜３の融解曲線について、単位時間あたりの蛍光強度増加量（ｄＩ／ｄＴ）として示す。図７の縦軸は蛍光強度であり、横軸は温度である。図７に示す蛍光強度から推定された各試験群における核酸鎖とプローブ核酸鎖との融解温度（Ｔｍ値）は、Probe 1（試験群１）が６８℃、Probe 2（試験群２）が５４℃、Probe 3（試験群３）が４８℃であった。Probe 3については、表１に示す塩基配列から算出される融解温度（５４．５℃）よりも、融解曲線解析における蛍光強度増加量の変動によって推定された融解温度（４８℃）の方が低くなっていた。これは、Probe 3に増幅核酸鎖と不一致である塩基が塩基配列中に含まれるためであると考えられる。
本試験例の結果から、核酸増幅反応開始前に、核酸増幅反応液に加えられたプローブ核酸鎖によって、増幅核酸鎖とプローブ核酸鎖との融解曲線解析が可能であることが示された。また、この融解曲線解析によって、プローブ核酸鎖と増幅核酸鎖の間の一塩基の不一致を検出できることが示された。
試験例１及び試験例２の結果から、核酸増幅反応液の濁度の測定に続けて融解曲線解析を行うことによって、核酸鎖が増幅されたことを確認した上で、増幅核酸鎖について融解曲線解析を開始することができるため、確実に増幅核酸鎖に対する融解曲線解析ができることが示された。また、核酸増幅反応をプローブ核酸鎖の存在下で行ったため、核酸増幅反応の後に、増幅核酸鎖とプローブ核酸鎖を含む核酸増幅反応液に他の試薬類を添加することなく、そのまま同じ容器を用いて、融解曲線解析を行うことが可能であった。
Ａ１，Ａ２：塩基配列解析装置、１１：第１光源、１２：第２光源、１３１，１３２：導光部材、１３１ａ，１３２ａ：光学入射端部、１５：集光レンズ、１６：絞り、１７：蛍光フィルタ、１８：励起フィルタ、１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９１ｄ：遮光構造体、１９１ａ，１９１ｂ，１９１ｃ，１９１ｄ：開口部、２：検出部、３ａ，３ｂ，３ｃ：温度調節部、４：制御部、Ｂ１：マイクロチップ、５１：基板、５２：反応領域

Claims (19)

  1. 核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅手順と、
    前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定手順と、
    前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析手順と、を含む、
    塩基配列解析方法。
  2. 前記融解曲線解析手順は前記濁度が所定の値に達した時点で行う、
    請求項１記載の塩基配列解析方法。
  3. 前記プローブ核酸鎖の融解温度は前記核酸増幅反応の反応温度より低く、前記プローブ核酸鎖の存在下で前記核酸増幅反応を行う、
    請求項２記載の塩基配列解析方法。
  4. 前記プローブ核酸鎖の融解温度は、前記核酸増幅反応に用いるプライマーの融解温度より低い、
    請求項３記載の塩基配列解析方法。
  5. 前記プローブ核酸鎖の融解温度は、前記プライマーの融解温度より５〜１５℃低い、
    請求項４記載の塩基配列解析方法。
  6. 前記プローブ核酸鎖として、塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖を用いる、
    請求項５記載の塩基配列解析方法。
  7. 前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖は、各々波長の異なる光を発する蛍光物質で標識されている、
    請求項６記載の塩基配列解析方法。
  8. 前記塩基配列の異なる複数のプローブ核酸鎖のうち、一のプローブ核酸鎖は、前記増幅産物に含まれる塩基配列の一部と完全に一致する、
    請求項７記載の塩基配列解析方法。
  9. 前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、
    請求項８記載の塩基配列解析方法。
  10. 前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行う、
    請求項９記載の塩基配列解析方法。
  11. 反応場への照射光を出射する光源と、
    前記照射光によって前記反応場内の核酸増幅反応液から生じる光を検出する検出部と、
    前記反応場を加熱又は冷却する温度調節部と、
    前記検出部からの信号入力に基づいて光源の駆動モードを切り替える制御部と、
    を有し、
    前記制御部は、前記駆動モードを核酸増幅反応モードから融解曲線解析モードに切り替える、
    塩基配列解析装置。
  12. 前記光源は、第１の光源と第２の光源とを含み、
    該第１の光源から出射される光の波長は、該第２の光源からの光が照射された前記核酸増幅反応液に含まれる蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致する、
    請求項１１記載の塩基配列解析装置。
  13. 前記制御部は、前記核酸増幅反応モードから前記融解曲線解析モードへの切り替えとして、前記反応場への前記照射光を出射する光源を、前記第１の光源から前記第２の光源へ切り替える、
    請求項１２記載の塩基配列解析装置。
  14. 前記第１の光源から出射される光と前記第２の光源から出射される光とを重複する光学経路へ導く導光部材を有する、
    請求項１３記載の塩基配列解析装置。
  15. 前記第２の光源は、単数若しくは複数のレーザ光源及び／又はＬＥＤ光源である、
    請求項１４記載の塩基配列解析装置。
  16. 前記検出部は、前記蛍光物質から生じる蛍光を時分割に検出する、
    請求項１５記載の塩基配列解析装置。
  17. 前記光源及び／又は前記反応場から出射される光の進行方向を制限する遮光構造体が設けられた、
    請求項１６記載の塩基配列解析装置。
  18. 前記遮光構造体は、複数の、前記光源と前記検出部の間の光学経路の位置に対応して、複数の開口部を有する、
    請求項１７記載の塩基配列解析装置。
  19. 核酸増幅反応によって増幅産物を得る核酸増幅ステップと、
    前記核酸増幅反応の反応液の濁度を測る濁度測定ステップと、
    前記核酸増幅反応の反応場で、プローブ核酸鎖と前記増幅産物との融解曲線解析を行う融解曲線解析ステップと、
    をコンピュータに実行させる塩基配列解析プログラム。
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