JP2014060978A - Ethanol producing yeast and method of producing ethanol using the same - Google Patents
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Abstract
【課題】エタノールを効率よく生成できる酵母ならびにこれを用いたエタノールの製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のエタノール生成酵母は、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体である。
（Ｘ）ＨＳＴ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
本発明のエタノール生成酵母を、キシロース存在下で培養することにより、効率よくエタノールを生成できるため、キシロース等を含むバイオマスを原料として有効利用できる。
【選択図】図７A yeast capable of efficiently producing ethanol and a method for producing ethanol using the same are provided.
The ethanol-producing yeast of the present invention is a transformant having a xylose-metabolizing enzyme gene and satisfying at least one of the following conditions (X) or (Y).
(X) Yeast transformant in which HST1 protein is inactivated (Y) Yeast transformant introduced with expression vector of QNS1 gene The ethanol-producing yeast of the present invention is efficiently cultured in the presence of xylose. Since ethanol can be produced, biomass containing xylose or the like can be used effectively as a raw material.
[Selection] Figure 7
Description
本発明は、エタノールを生成する酵母およびこれを用いたエタノールの製造方法に関し、具体的には、キシロースを効率よくエタノールに変換する酵母およびこれを用いたエタノールの製造方法に関する。 The present invention relates to a yeast that produces ethanol and a method for producing ethanol using the same. Specifically, the present invention relates to a yeast that efficiently converts xylose into ethanol and a method for producing ethanol using the same.
近年、化石燃料の枯渇、ＣＯ２ガス削減等の観点から、廃棄物であるバイオマスを原料とし、燃料となるエタノールを生成する研究が進められている。前記バイオマスとしては、例えば、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサスおよび廃材等があげられる。これらの廃棄物は、多糖としてヘミセルロースを含んでおり、前記ヘミセルロースには、キシロース、アラビノース等の五炭糖が含まれる。このため、これらの五炭糖を基質として利用できることが望ましい。 In recent years, from the viewpoint of depletion of fossil fuels, CO 2 gas reduction, and the like, research is being conducted to produce ethanol as a fuel using biomass as waste as a raw material. Examples of the biomass include corn cob, rice straw, switchgrass, Eliansus, and waste materials. These wastes contain hemicellulose as a polysaccharide, and the hemicellulose contains pentose sugars such as xylose and arabinose. For this reason, it is desirable that these pentose sugars can be used as a substrate.
一方、酵母を用いた一般的なエタノールの製造方法として、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の醗酵による、デンプンからのエタノール生成が広く知られている。デンプンは、グルコースがα−１，４結合した多糖であり、加水分解酵素によって容易に分解できる。そして、分解により得られるグルコースは、サッカロミセス セレビシエの最も好ましい炭素源であり、１分子のグルコースから２分子のエタノールを、発酵により生成できる。しかしながら、前記バイオマスを原料とする場合、サッカロミセス セレビシエは、前記ヘミセルロース中の五炭糖、特にキシロースを醗酵できない。そこで、前記バイオマスを原料とするエタノール生成には、キシロース発酵能を有する酵母ピキア スティピティス（Pichia stipitis）のキシロース還元酵素遺伝子およびキシリトール脱水素酵素遺伝子等のキシロース代謝酵素遺伝子を、サッカロミセス セレビシエに導入して、キシロース醗酵能を付与した形質転換体を使用する方法が広く利用されている。 On the other hand, as a general method for producing ethanol using yeast, ethanol production from starch by fermentation of Saccharomyces cerevisiae is widely known. Starch is a polysaccharide in which glucose is α-1,4-linked and can be easily degraded by hydrolase. And glucose obtained by decomposition | disassembly is the most preferable carbon source of Saccharomyces cerevisiae, and can produce | generate 2 molecules of ethanol from 1 molecule of glucose by fermentation. However, when the biomass is used as a raw material, Saccharomyces cerevisiae cannot ferment the pentose sugar, particularly xylose, in the hemicellulose. Accordingly, the ethanol production of the biomass as a raw material, xylose metabolizing enzyme gene such as xylose reductase gene and xylitol dehydrogenase gene in yeast Pichia Sutipitisu with xylose fermentability (Pichia stipitis), was introduced into Saccharomyces cerevisiae A method of using a transformant imparted with xylose fermentation ability is widely used.
そこで、前記収率を改善する方法として、例えば、キシロース代謝酵素の改変等が、報告されている（非特許文献１〜４）。しかしながら、これらの方法によっても、十分な収率の向上は実現されていない。 Therefore, as a method for improving the yield, for example, modification of xylose metabolizing enzyme has been reported (Non-Patent Documents 1 to 4). However, even with these methods, a sufficient improvement in yield has not been realized.
そこで、本発明は、エタノールを効率よく生成できる酵母ならびにこれを用いたエタノールの製造方法の提供を目的とする。 Then, an object of this invention is to provide the yeast which can produce | generate ethanol efficiently, and the manufacturing method of ethanol using the same.
前記目的を達成するために、本発明のエタノール生成酵母は、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体であることを特徴とする。
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
To achieve the above object, the ethanol-producing yeast of the present invention is a transformant having a xylose metabolizing enzyme gene and satisfying at least one of the following conditions (X) or (Y): To do.
(X) Yeast transformant in which Hst1 protein is inactivated (Y) Yeast transformant introduced with an expression vector of QNS1 gene
本発明のエタノールの製造方法は、前記本発明のエタノール生成酵母を用いてエタノール発酵を行う発酵工程を含むことを特徴とする。 The method for producing ethanol of the present invention is characterized by including a fermentation step of performing ethanol fermentation using the ethanol-producing yeast of the present invention.
本発明のエタノール生成酵母によれば、キシロースを基質として、効率よくエタノールを生成できる。このため、本発明は、例えば、前述の廃棄物等のバイオマスを原料として、エタノールをバイオプロセスによって製造できるため、極めて有用といえる。 According to the ethanol-producing yeast of the present invention, ethanol can be efficiently produced using xylose as a substrate. For this reason, the present invention can be said to be extremely useful because, for example, ethanol can be produced by a bioprocess using biomass such as the aforementioned waste as a raw material.
（１）エタノール生成酵母
本発明のエタノール生成酵母は、前述のように、キシロース代謝酵素遺伝子を有し、かつ、下記（Ｘ）または（Ｙ）の少なくとも一方の条件を満たす形質転換体であることを特徴とする。
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体
(1) Ethanol-producing yeast As described above, the ethanol-producing yeast of the present invention is a transformant having a xylose-metabolizing enzyme gene and satisfying at least one of the following conditions (X) or (Y): It is characterized by.
(X) Yeast transformant in which Hst1 protein is inactivated (Y) Yeast transformant introduced with an expression vector of QNS1 gene
本発明のエタノール生成酵母が、エタノールを効率よく生成できる理由、すなわち、キシロースからエタノールへの変換を効率よく行える理由は、以下のように推測される。なお、この推測は、本発明を限定するものではない。 The reason why the ethanol-producing yeast of the present invention can produce ethanol efficiently, that is, the reason why it is possible to efficiently convert xylose to ethanol is presumed as follows. Note that this assumption does not limit the present invention.
グルコースを原料とする醗酵の場合、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ／ＮＡＤＨのバランスは変化しない。他方、キシロース還元酵素は、キシロースをキシリトールに変換する際、同時に、補酵素であるＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に変換し、また、キシリトール脱水素酵素は、キシリトールをキシルロースに変換する際、同時に、補酵素であるＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する。このため、キシロースを原料とする発酵の場合、酵母による発酵が進むにしたがって、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋が減少し、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＨが増加する方向に傾き、両者のバランスの変化が原因となって、キシロースからのエタノール収率が低下すると考えられる。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、まず、ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨの増加が重要であるとの知見を得て、ＮＡＤのｄｅ ｎｏｖｏ合成系を促進すべく、Ｈｓｔ１タンパク質を不活性化した酵母形質転換体、ならびに、Ｑｎｓ１タンパク質を高発現する酵母形質転換体の製造を試みた。その結果、Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化およびＱｎｓ１タンパク質の高発現の少なくとも一方を実現することによって、前記形質転換体は、野生型である同一株と比較して、エタノール収率が向上するとの結果を得て、本発明を確立するに至った。 In the case of fermentation using glucose as a raw material, the balance of NADP / NADPH or NAD / NADH does not change. On the other hand, when xylose reductase converts xylose to xylitol, it simultaneously converts the coenzyme NADPH to NADP + , and xylitol dehydrogenase simultaneously converts xylitol to xylulose by coenzyme. Convert some NAD + to NADH. For this reason, in the case of fermentation using xylose as a raw material, NADPH or NAD + decreases as NAF proceeds, and the NADP or NADH increases, and the balance between the two causes a change in xylose. It is thought that the ethanol yield from the water decreases. Thus, as a result of diligent research, the present inventors first obtained the knowledge that an increase in NAD or NADPH is important, and in order to promote the de novo synthesis system of NAD, yeast in which Hst1 protein was inactivated An attempt was made to produce a transformant and a yeast transformant that highly expresses Qns1 protein. As a result, by realizing at least one of inactivation of the Hst1 protein and high expression of the Qns1 protein, the transformant has the result that the ethanol yield is improved as compared with the same strain which is a wild type. As a result, the present invention has been established.
本発明において、前記酵母は、特に制限されない。前記酵母は、例えば、出芽酵母および分裂酵母があげられる。前記出芽酵母は、例えば、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)があげられ、ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４、Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）、ＣＢ１１（Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｗ３０３−１Ａ（ＢＹ４８４８）等があげられる。前記分裂酵母は、例えば、シゾサッカロミセス ジャポニクス（Schizosaccharomyces japonicus、Hasegawaea japonicus）、シゾサッカロミセス オクトスポルス（Schizosaccharomyces octosporus、Octosporomyces octosporus）およびシゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等があげられる。この他に、例えば、ピキア スティピティス（Pichia stipitis）、キャンディダ マグノリアエ（Candida magnoliae）等も使用できる。 In the present invention, the yeast is not particularly limited. Examples of the yeast include budding yeast and fission yeast. Examples of the budding yeast include Saccharomyces cerevisiae , and include NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, X2180-1A (ATCC26786), CB11 (Berkeley Stock Center), and W30348 (B). The fission yeast, for example, Schizosaccharomyces japonicus (Schizosaccharomyces japonicus, Hasegawaea japonicus), Schizosaccharomyces Okutosuporusu (Schizosaccharomyces octosporus, Octosporomyces octosporus) and Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), and the like. In addition, for example, Pichia Sutipitisu (Pichia stipitis), Candida magnolia e (Candida magnoliae) or the like can be used.
本発明において、前記（Ｘ）の形質転換体は、Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体である。本発明において、Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化される前の酵母を、親株酵母または宿主酵母ともいう。 In the present invention, the transformant (X) is a yeast transformant in which the Hst1 protein is inactivated. In the present invention, the yeast before the Hst1 protein is inactivated is also referred to as parent yeast or host yeast.
ＨＳＴ１（NAD-dependent protein deacetylase HST1）タンパク質は、ＮＡＤ＋依存型ヒストン脱アセチル化酵素の一種であり、ＯＲＣ（複製開始点認識複合体）−依存型サイレンシングまたは減数分裂抑制に必要なＳｕｍ１ｐ／Ｒｆｍ１ｐ／Ｈｓｔ１ｐ複合体の必須因子である。 HST1 (NAD-dependent protein deacetylase HST1) protein is a kind of NAD + dependent histone deacetylase, Sum1p / Rfm1p required for ORC (replication origin recognition complex) -dependent silencing or meiosis suppression / Hst1p complex essential factor.
本発明において、前記Ｈｓｔ１タンパク質は、前述のように、不活性化されていればよく、具体的には、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能が不活性化されていればよい。前記Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化は、特に制限されず、例えば、前記Ｈｓｔ１タンパク質そのものを発現しない形態でもよいし、前記Ｈｓｔ１タンパク質の前記本来の機能が変異により不活性化された形態でもよいし、前記Ｈｓｔ１タンパク質が前記本来の機能を有し且つ前記機能が中和によって不活性化された形態でもよい。前記Ｈｓｔ１タンパク質の不活性化の具体例は、例えば、前記Ｈｓｔ１タンパク質をコードするＨＳＴ１遺伝子の破壊もしくは前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害、または、前記Ｈｓｔ１タンパク質の中和によって不活性化されてもよい。 In the present invention, the Hst1 protein only needs to be inactivated as described above. Specifically, the original function of the Hst1 protein only needs to be inactivated. The inactivation of the Hst1 protein is not particularly limited. For example, the Hst1 protein itself may not be expressed, or the original function of the Hst1 protein may be inactivated by mutation. The Hst1 protein may have the original function and the function is inactivated by neutralization. A specific example of inactivation of the Hst1 protein may be inactivated by, for example, disruption of the HST1 gene encoding the Hst1 protein, inhibition of expression of the HST1 gene, or neutralization of the Hst1 protein.
本発明において、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、例えば、前記破壊されたＨＳＴ１遺伝子から発現するタンパク質が、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能を奏さないように、破壊されていることを意味し、例えば、本来のＨＳＴ１遺伝子の機能を奏さないということもできる。このように、本来の前記Ｈｓｔ１タンパク質の機能を奏さないタンパク質は、以下、「変異Ｈｓｔ１タンパク質」ともいう。前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは、例えば、前記破壊が行われていないＨＳＴ１遺伝子を意味する。本発明において、遺伝子とは、特に示さない限り、例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ等のＲＮＡのいずれの意味でもよい。 In the present invention, the disruption of the HST1 gene means, for example, that the protein expressed from the disrupted HST1 gene has been disrupted so as not to perform the function of the original Hst1 protein. It can also be said that the function of the HST1 gene is not exhibited. Thus, the protein that does not exhibit the function of the original Hst1 protein is hereinafter also referred to as “mutant Hst1 protein”. The original HST1 gene means, for example, an HST1 gene that has not been destroyed. In the present invention, the gene may mean any of RNA such as DNA and mRNA unless otherwise specified.
前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、特に制限されず、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子の変異があげられる。前記変異は、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子における、塩基の欠失、置換、付加および／または挿入があげられ、いずれか一種類の変異でもよいし、二種類以上の変異の組合せでもよい。前記ＨＳＴ１遺伝子の配列は、例えば、全領域が変異してもよいし、部分領域が変異してもよい。具体例として、前記変異が欠失の場合、例えば、全領域が欠失してもよいし、部分領域が欠失してもよい。この場合、例えば、前記全領域の欠失によって、前記ＨＳＴ１タンパク質自体が発現しない状態でもよいし、前記部分領域の欠失によって、前記ＨＳＴ１タンパク質が部分的に欠失した前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。前記変異が置換の場合、例えば、全領域が置換してもよいし、部分領域が置換してもよい。この場合、例えば、前記置換によって、前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは異なるアミノ酸をコードするコドンに設計し、これによって、前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。前記変異が挿入の場合、例えば、全領域にわたって塩基が挿入されてもよいし、部分領域において塩基が挿入されてもよい。この場合、例えば、塩基の挿入によって、前記ＨＳＴ１遺伝子の読み枠を変化させ、前記本来のＨＳＴ１遺伝子とは異なるアミノ酸配列をコードするように設計し、これによって、前記変異Ｈｓｔ１タンパク質として発現してもよい。 The disruption of the HST1 gene is not particularly limited, and examples thereof include mutation of the HST1 gene. Examples of the mutation include base deletion, substitution, addition and / or insertion in the HST1 gene, and any one kind of mutation or a combination of two or more kinds of mutations may be used. For example, the entire region of the HST1 gene sequence may be mutated, or a partial region may be mutated. As a specific example, when the mutation is a deletion, for example, the entire region may be deleted or a partial region may be deleted. In this case, for example, the HST1 protein itself may not be expressed due to the deletion of the entire region, or the HST1 protein is expressed as the mutant Hst1 protein partially deleted due to the deletion of the partial region. May be. When the mutation is substitution, for example, the entire region may be substituted, or a partial region may be substituted. In this case, for example, the substitution may be designed to be a codon encoding an amino acid different from the original HST1 gene, thereby expressing the mutant Hst1 protein. When the mutation is insertion, for example, a base may be inserted over the entire region, or a base may be inserted in a partial region. In this case, for example, the reading frame of the HST1 gene is changed by insertion of a base, and it is designed to encode an amino acid sequence different from the original HST1 gene, so that it can be expressed as the mutant Hst1 protein. Good.
本発明において、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害は、特に制限されず、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子の転写および翻訳の少なくとも一方の阻害があげられる。具体的に、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子のｍＲＮＡへの転写自体が阻害されてもよいし、前記ＨＳＴ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが切断されてもよいし、前記ＨＳＴ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡに基づく翻訳が阻害されてもよい。前記ＨＳＴ１遺伝子の転写および翻訳の阻害には、例えば、前記ＨＳＴ１遺伝子またはそのｍＲＮＡを標的とした、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよびリボザイム等の核酸分子が利用できる。前記核酸分子を利用する遺伝子の発現阻害の技術は、例えば、遺伝子からのｍＲＮＡ転写を阻害する手段、または、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解による、タンパク質への翻訳を阻害する手段等として確立されている。このため、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害のために、例えば、前記核酸分子を設計することは、当業者であれば技術常識に基づいて行うことができる。また、前記核酸分子の構成材料は、特に制限されず、例えば、天然由来の核酸でもよいし、ＰＮＡ等の人工核酸等でもよく、何ら制限されない。 In the present invention, the expression inhibition of the HST1 gene is not particularly limited, and examples thereof include inhibition of at least one of transcription and translation of the HST1 gene. Specifically, for example, transcription of the HST1 gene into mRNA may be inhibited, mRNA transcribed from the HST1 gene may be cleaved, or translation based on mRNA transcribed from the HST1 gene May be inhibited. For inhibition of transcription and translation of the HST1 gene, for example, nucleic acid molecules such as siRNA, antisense and ribozyme targeting the HST1 gene or mRNA thereof can be used. The gene expression inhibition technique using the nucleic acid molecule is established, for example, as a means for inhibiting mRNA transcription from a gene or a means for inhibiting translation into a protein by degradation of mRNA transcribed from the gene. ing. Therefore, for example, designing of the nucleic acid molecule for the inhibition of the expression of the HST1 gene can be performed by those skilled in the art based on common technical knowledge. The constituent material of the nucleic acid molecule is not particularly limited, and may be, for example, a naturally-derived nucleic acid or an artificial nucleic acid such as PNA, and is not limited at all.
前記酵母として、例えば、サッカロミセス セレビシエを使用する場合、サッカロミセス属由来のＨＳＴ１遺伝子およびＨｓｔ１タンパク質は、例えば、Saccharomyces Genome Databaseにおいて、登録番号ＹＯＬ０６８Ｃで登録されている。サッカロミセス セレビシエのＨＳＴ１遺伝子の全長塩基配列を、配列番号１に示し、Ｈｓｔ１タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号２に示す。 For example, when Saccharomyces cerevisiae is used as the yeast, the HST1 gene and Hst1 protein derived from the genus Saccharomyces are registered under the registration number YOL068C in the Saccharomyces Genome Database, for example. The full-length base sequence of Saccharomyces cerevisiae HST1 gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the full-length amino acid sequence of Hst1 protein is shown in SEQ ID NO: 2.
前記ＨＳＴ１遺伝子の塩基配列が配列番号１であり、前記ＨＳＴ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２の場合、例えば、前記ＨＳＴ１タンパク質の不活性化は、以下のような態様が例示できる。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。前記ＨＳＴ１遺伝子は、例えば、前述のように、全領域を変異させてもよいし、部分領域を変異させてもよく、前記変異は、欠失が好ましい。前記ＨＳＴ１遺伝子において前記変異させる領域は、例えば、配列番号１における３４６〜１２３９番目を含むことが好ましく、具体例として、配列番号１における３４６〜１２３９番目を含む領域が欠失していることが好ましい。また、これに対応して、前記ＨＳＴ１タンパク質において前記変異させる領域は、例えば、配列番号２における１１６〜４１３番目を含むことが好ましく、具体例として、配列番号２における１１６〜４１３を含む領域が欠失していることが好ましい。 When the base sequence of the HST1 gene is SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the HST1 protein is SEQ ID NO: 2, for example, inactivation of the HST1 protein can be exemplified as follows. In addition, this invention is not restrict | limited to these illustrations. For example, as described above, the entire region of the HST1 gene may be mutated or a partial region may be mutated, and the mutation is preferably a deletion. The region to be mutated in the HST1 gene preferably includes, for example, positions 346 to 1239 in SEQ ID NO: 1, and as a specific example, a region including positions 346 to 1239 in SEQ ID NO: 1 is preferably deleted. . Correspondingly, the region to be mutated in the HST1 protein preferably includes, for example, positions 116 to 413 in SEQ ID NO: 2, and as a specific example, the region including 116 to 413 in SEQ ID NO: 2 is missing. It is preferable to have lost.
つぎに、本発明において、前記（Ｙ）の形質転換体は、ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体である。本発明において、ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入される前の酵母を、親株酵母または宿主酵母ともいう。 Next, in the present invention, the transformant of (Y) is a yeast transformant into which an expression vector for the QNS1 gene has been introduced. In the present invention, the yeast before the expression vector for the QNS1 gene is introduced is also referred to as a parent yeast or a host yeast.
本発明において、Ｑｎｓ１（Glutamine-dependent NAD(+) synthetase）タンパク質は、ＮＡＤ生成経路の最終ステップにおいて、脱アミドＮＡＤ＋からＮＡＤ＋を合成する反応を触媒する酵素であり、ＱＮＳ１遺伝子は、前記Ｑｎｓ１タンパク質をコードする遺伝子である。 In the present invention, Qns1 (Glutamine-dependent NAD ( +) synthetase) protein, in the final step of NAD generation path is an enzyme that catalyzes a reaction for synthesizing NAD + from deamidation NAD +, QNS1 gene, the QNS1 It is a gene that encodes a protein.
前記（Ｙ）の酵母形質転換体は、前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが、前記ＱＮＳ１遺伝子を発現可能なように導入されていればよい。 The yeast transformant of (Y) only needs to be introduced so that the expression vector of the QNS1 gene can express the QNS1 gene.
前記ＱＮＳ１遺伝子の由来は、特に制限されない。前記ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、酵母由来があげられ、好ましくは、サッカロミセス属由来、より好ましくは、サッカロミセス セレビシエ由来があげられる。サッカロミセス属由来のＱＮＳ１遺伝子は、例えば、Saccharomyces Genome Databaseにおいて、登録番号ＹＨＲ０７４Ｗで登録されている。サッカロミセス セレビシエのＱＮＳ１遺伝子の全長塩基配列を、配列番号３に示し、Ｑｎｓ１タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号４に示す。 The origin of the QNS1 gene is not particularly limited. Examples of the QNS1 gene include yeast, preferably Saccharomyces, and more preferably Saccharomyces cerevisiae. The QNS1 gene derived from the genus Saccharomyces is registered under the registration number YHR074W in the Saccharomyces Genome Database, for example. The full-length base sequence of the Saccharomyces cerevisiae QNS1 gene is shown in SEQ ID NO: 3, and the full-length amino acid sequence of the Qns1 protein is shown in SEQ ID NO: 4.
前記ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、下記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＡＤ＋合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Examples of the QNS1 gene include polynucleotides selected from the group consisting of the following (a) to (g).
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (b) consisting of a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and NAD + Polynucleotide encoding a protein having a synthetic activity (c) A polynucleotide encoding a protein having a NAD + synthetic activity (d), comprising a base sequence having 90% or more identity to the base sequence of SEQ ID NO: 3. A polynucleotide encoding a protein having a NAD + synthesizing activity, comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 A polynucleotide (f) encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 In the amino acid sequence of ID NO: 4, one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of the polynucleotide (g) SEQ ID NO: 4 which encodes a protein having an NAD + synthesis activity A polynucleotide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to an amino acid sequence and encoding a protein having NAD + synthetic activity
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記置換等の塩基の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１または２個である。 In the above (b), “1 or several” may be within a range in which the protein encoded by the polynucleotide of (b) has the above activity. The number of bases such as the substitution is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, further preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3. Most preferably, it is 1 or 2.
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは、９５％以上、より好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。 In the above (c), “identity” may be, for example, within a range in which the protein encoded by the polynucleotide of (c) has the above activity. The identity is preferably 95% or more, more preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, and still more preferably 99% or more. The identity can be calculated from default parameters using analysis software such as BLAST and FAST (hereinafter the same).
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイ、プラークハイブリダイゼーションアッセイ等の公知の方法があげられる。ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。 In (d) above, the “hybridizing polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide in (a). The hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays. The hybridization assay is not particularly limited, and examples thereof include known methods such as Southern hybridization assay, colony hybridization assay, plaque hybridization assay and the like. Hybridization assays are described, for example, in Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.” [(Cold Spring Harbor Laboratory 198) (Cold Spring Harbor Laboratory 9). The described methods can also be employed.
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。洗浄の条件は、例えば、次のような条件があげられる、低ストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、４０℃で、２ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。中ストリンジェントな条件としては、例えば、５５℃で、２ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。高ストリンジェントな条件としては、例えば、５５℃の条件下で、０．１ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。洗浄のストリンジェンシーの程度も、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。 In (d) above, the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, moderate stringent conditions, and highly stringent conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C. “Medium stringent conditions” are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. The degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like. The “stringent conditions” are described in, for example, the above-mentioned “Sequence of Molecular Blocking: A Laboratory Manual 2nd Ed.” (Cold Spring Harbor Laboratories, edited by Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition”. 1989)] etc. The conditions for washing are, for example, the following conditions, and low stringent washing conditions include, for example, 2 × SSC, 0 at 40 ° C. Wash in 1% SDS, such as medium stringent conditions, for example, at 55 ° C. in 2 × SSC, 0.1% SDS, for example, stringent conditions at 55 ° C. Below, Washing in 1x SSC, 0.1% SDS The degree of stringency of washing can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, ionic strength, time, etc. Is possible.
前記（ｅ）のポリヌクレオチドは、配列番号４のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。 The polynucleotide (e) is a polynucleotide encoding the protein of SEQ ID NO: 4, and can be designed, for example, by substituting the corresponding codon based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
前記（ｆ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記置換等のアミノ酸の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜９個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１または２個である。 In the above (f), “1 or several” may be within a range in which the protein encoded by the polynucleotide of (f) has the above activity. The number of amino acids such as substitution is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, still more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3. Most preferably, it is 1 or 2.
前記（ｇ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｇ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは、９５％以上、より好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに好ましくは、９９％以上である。 In the above (g), the “identity” may be, for example, a range in which the protein encoded by the polynucleotide of (g) has the above activity. The identity is preferably 95% or more, more preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, and still more preferably 99% or more.
前記ＱＮＳ１遺伝子は、これらの例示には限定されず、例えば、下記表１に示す種由来のＱＮＳ１遺伝子が同様に利用できる。 The QNS1 gene is not limited to these examples, and for example, the QNS1 gene derived from the species shown in Table 1 below can be similarly used.
前記改変ＱＮＳ１遺伝子は、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。 The modified QNS1 gene can be produced by, for example, a known genetic engineering technique or a synthetic technique.
前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターは、例えば、親株酵母（宿主酵母）において、前記ＱＮＳ１遺伝子がコードするタンパク質を発現可能なように、機能的に前記遺伝子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記親株酵母に対する前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、後述する本発明のエタノール生成酵母の製造方法において説明する。 The expression vector for the QNS1 gene only needs to contain the gene functionally so that the protein encoded by the QNS1 gene can be expressed in the parent strain yeast (host yeast), and other configurations are not limited. Not. The method for introducing the expression vector into the parent yeast is not particularly limited, and will be described in the method for producing ethanol-producing yeast of the present invention described later.
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記ＱＮＳ１遺伝子を挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）等があげられる。前記ＹＥｐ型ベクターは、例えば、ＹＥｐ２４(J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)、前記ＹＣｐ型ベクターは、例えば、ＹＣｐ５０(M. D. Rose et al., Gene, 60, 237, 1987)、前記ＹＩｐ型ベクターは、例えば、ＹＩｐ５(K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979)、等が報告されている。この他にも、例えば、ｐＹＥ２２ｍ（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）、ＹＩｐ１(X70480）等があげられる。これらは、容易に入手可能である。中でも、前記基本ベクターは、過剰発現系ベクターが好ましい。 The expression vector can be prepared, for example, by inserting the QNS1 gene into a backbone vector (hereinafter also referred to as “basic vector”). The type of the basic vector is not particularly limited, and examples thereof include a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type). The YEp type vector is, for example, YEp24 (JR Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983), and the YCp type vector is, for example, YCp50 (MD Rose et al., Gene , 60, 237, 1987), YIp5 vectors (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) and the like have been reported. Other examples include pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995), YIp1 (X70480), and the like. These are readily available. Among them, the basic vector is preferably an overexpression vector.
前記発現ベクターは、例えば、前記挿入した遺伝子の発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、親株酵母内で機能すればよく、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されず、前記遺伝子の発現を機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて行うことができる。前記遺伝子は、例えば、発現を促進できることから、前記プロモーターに対してセンス方向に導入することが好ましい。 The expression vector preferably has, for example, a regulatory sequence that regulates the expression of the inserted gene. The regulatory sequence only needs to function in the parent strain yeast, and examples thereof include a promoter, terminator, enhancer, polyadenylation signal sequence, origin of replication sequence (ori) and the like. As the regulatory sequence, for example, a sequence provided in advance in the basic vector may be used, the regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, and the regulatory sequence provided in the basic vector It may be replaced with the regulatory sequence. In the expression vector, the arrangement of the regulatory sequence is not particularly limited as long as it is arranged so that the expression of the gene can be functionally regulated, and can be performed based on a known method. For example, the gene is preferably introduced in the sense direction with respect to the promoter because it can promote expression.
前記発現ベクターの具体例としては、例えば、下記（ｉ）〜（iii）の構成要素を含む発現カセットを有する形態があげられる。（ｉ）親株酵母内で転写可能なプロモーター（ii）前記プロモーターに結合した目的遺伝子（iii）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、親株酵母内で機能するシグナル Specific examples of the expression vector include a form having an expression cassette containing the following components (i) to (iii). (I) Promoter that can be transcribed in the parent strain yeast (ii) Target gene linked to the promoter (iii) Signal functioning in the parent strain yeast regarding transcription termination and polyadenylation of RNA molecules
前記プロモーターおよびターミネーターは、例えば、親株酵母内で機能すればよく、その組合せは特に制限されない。前記プロモーターは、例えば、ＴＤＨ３ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＧＡＬ１ｐ、ＧＡＬ１０ｐ、ＡＤＨ２ｐ、ＰＨＯ５ｐ、ＣＵＰ１ｐ、ＭＦα１ｐ等があげられる。また、高発現プロモーターは、ＴＤＨ３ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＰＧＩ１ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＡＤＨ１ｐ等があげられる。 The promoter and terminator only need to function in the parent strain yeast, for example, and the combination is not particularly limited. Examples of the promoter include TDH3p, PYK1p, PGK1p, TPI1p, GAL1p, GAL10p, ADH2p, PHO5p, CUP1p, MFα1p, and the like. Examples of the high expression promoter include TDH3p, TPI1p, PGK1p, PGI1p, PYK1p, ADH1p and the like.
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性等の耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。前記栄養要求性マーカーは、例えば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子等があげられる。前記薬剤耐性マーカーは、例えば、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネティシン耐性等のマーカーがあげられる。この他にも、例えば、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子として、ｆａｓ２ｍ遺伝子（猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992）、ＰＤＲ４遺伝子（Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）等が利用可能である。 The expression vector may further include a selection marker coding sequence, for example. Examples of the selection marker include an auxotrophic marker, a resistance marker such as drug resistance, a fluorescent protein marker, an enzyme marker, and a cell surface receptor marker. Examples of the auxotrophic marker include URA3 gene and LEU2 gene. Examples of the drug resistance marker include markers such as hygromycin resistance, zeocin resistance, and geneticin resistance. In addition to this, for example, copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), and cerulenin resistance gene, fas2m gene (Owaku Kaoru et al., Biochemistry) 64, 660, 1992), PDR4 gene (Hussain et al., Gene, 101, 149, 1991) and the like can be used.
また、本発明のエタノール生成酵母は、例えば、前述のように、前記（Ｘ）の酵母形質転換体でもよいし、前記（Ｙ）の酵母形質転換体でもよいし、前記（Ｘ）の条件と前記（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体でもよい。中でも、エタノール生成能に優れることから、前記（Ｘ）および（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体が好ましい。 The ethanol-producing yeast of the present invention may be, for example, as described above, the yeast transformant of (X), the yeast transformant of (Y), or the conditions of (X) It may be a yeast transformant that satisfies both conditions (Y). Especially, since it is excellent in ethanol production | generation ability, the yeast transformant which satisfy | fills both said (X) and (Y) is preferable.
本発明のエタノール生成酵母において、前記キシロース代謝酵素遺伝子は、例えば、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである。 In the ethanol-producing yeast of the present invention, the xylose metabolizing enzyme gene is at least one selected from the group consisting of, for example, a xylose reductase gene, a xylitol dehydrogenase gene, and a xylulose phosphorylase gene.
本発明のエタノール生成酵母は、例えば、キシロース還元酵素の触媒能を有し、さらに、キシリトール脱水素酵素およびキシルロースリン酸酵素の触媒能を有することが好ましい。本発明のエタノール生成酵母において、前記酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有する触媒能でもよいし、前記酵素のコード遺伝子を酵母に導入して、前記酵素を発現させることによって付与された触媒能でもよい。前記コード遺伝子の導入は、例えば、前記コード遺伝子を有する発現ベクターの導入により行うことができる。これらの３種類の遺伝子は、例えば、それぞれ別個の発現ベクターに挿入されてもよいし、そのうち２種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入し、残り１種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入してもよいし、３種類の前記遺伝子を１つの発現ベクターに挿入してもよい。中でも、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸酵素遺伝子を、同じ発現ユニットで制御できることから、前記３種類の遺伝子を１つの発現ベクターに挿入して使用することが好ましい。なお、前記発現ベクターの構築等に関しては、例えば、前述した前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターの説明を援用できる。 The ethanol-producing yeast of the present invention preferably has, for example, the catalytic ability of xylose reductase, and further has the catalytic ability of xylitol dehydrogenase and xylulose phosphate. In the ethanol-producing yeast of the present invention, the catalytic ability of the enzyme may be, for example, the catalytic ability originally possessed by the yeast, or a catalyst imparted by introducing the coding gene of the enzyme into the yeast and expressing the enzyme. Noh. The coding gene can be introduced, for example, by introducing an expression vector having the coding gene. These three types of genes may be inserted into separate expression vectors, for example, or two of them may be inserted into one expression vector, and the remaining one type of gene may be inserted into one expression vector. Alternatively, three types of the genes may be inserted into one expression vector. Among these, since the xylose reductase gene, the xylitol dehydrogenase gene and the xylulose phosphate enzyme gene can be controlled by the same expression unit, it is preferable to use the three types of genes inserted into one expression vector. For the construction of the expression vector, the description of the expression vector for the QNS1 gene described above can be used, for example.
前記キシロース還元酵素の触媒能は、キシロースを還元してキシリトールに変換する機能であり、例えば、前述のように、ＮＡＤＰＨを補酵素として、キシリトールを生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシロース還元酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシロース還元酵素の還元能でもよいし、キシロース還元酵素のコード遺伝子（以下、キシロース還元酵素遺伝子）を導入し、キシロース還元酵素を発現することによって付与された還元能でもよい。 The catalytic ability of the xylose reductase is a function of reducing xylose and converting it into xylitol. For example, as described above, NADPH is used as a coenzyme to generate xylitol. In the ethanol-producing yeast of the present invention, the catalytic ability of the xylose reductase may be, for example, the reduction ability of xylose reductase inherent in yeast, or a gene encoding xylose reductase (hereinafter referred to as xylose reductase gene) is introduced. It may be the reducing ability imparted by expressing xylose reductase.
前者の場合、酵母は、例えば、ピキア スティピティス（Pichia stipitis）、キャンディダ マグノリアエ（Candida magnoliae）等があげられる。後者の場合、本発明のエタノール生成酵母は、例えば、キシロース還元酵素遺伝子が導入された酵母が好ましい。 In the former case, examples of yeast include Pichia stipitis and Candida magnoliae . In the latter case, the ethanol-producing yeast of the present invention is preferably, for example, a yeast into which a xylose reductase gene has been introduced.
前記キシリトール脱水素酵素の触媒能は、キシリトールを還元してキシルロースに変換する機能であり、例えば、前述のように、ＮＡＤを補酵素として、キシルロースを生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシリトール脱水素酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシリトール脱水素酵素の還元能でもよいし、キシリトール脱水素酵素のコード遺伝子（以下、キシリトール脱水素酵素遺伝子）を導入し、キシリトール脱水素酵素を発現することによって付与された還元能でもよい。 The catalytic ability of the xylitol dehydrogenase is a function of reducing xylitol and converting it to xylulose. For example, as described above, NAD is used as a coenzyme to produce xylulose. In the ethanol-producing yeast of the present invention, the catalytic ability of the xylitol dehydrogenase may be, for example, the reducing ability of xylitol dehydrogenase inherent in yeast, or a coding gene of xylitol dehydrogenase (hereinafter referred to as xylitol dehydrogenase gene). ) And the reduction ability imparted by expressing xylitol dehydrogenase.
前記キシルロースリン酸化酵素の触媒能は、キシルロースをリン酸化する機能であり、キシルロース５−リン酸（Ｘ５Ｐ）を生成する。本発明のエタノール生成酵母において、前記キシルロースリン酸化酵素の触媒能は、例えば、酵母が本来有するキシルロースリン酸化酵素のリン酸化能でもよいし、キシルロースリン酸化酵素のコード遺伝子（以下、キシルロースリン酸化酵素遺伝子）を導入し、キシルロースリン酸化酵素を発現することによって付与されたリン酸化能でもよい。 The catalytic ability of the xylulose phosphorylase is a function of phosphorylating xylulose and produces xylulose 5-phosphate (X5P). In the ethanol-producing yeast of the present invention, the catalytic ability of the xylulose kinase may be, for example, the phosphorylation ability of xylulose kinase, which is inherent in the yeast, or the gene encoding xylulose kinase (hereinafter referred to as xylose). It may be the phosphorylating ability imparted by introducing xylulose phosphorylase and introducing xylulose kinase.
本発明のエタノール生成酵母は、例えば、前記キシロース還元酵素遺伝子、前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸酵素遺伝子が導入された酵母形質転換体が好ましい。このような形質転換体は、例えば、キシロースを単独の炭素源とする培地を使用する場合も、キシロースを炭素源として効果的にエネルギーを確保できる。他方、これら３種類の遺伝子のうち、キシロース還元酵素遺伝子のみを導入した酵母の場合、例えば、炭素源として、キシロースの他に、炭素源としてグルコース等を含有する培地を使用することが好ましい。 The ethanol-producing yeast of the present invention is preferably, for example, a yeast transformant into which the xylose reductase gene, the xylitol dehydrogenase gene and the xylulose phosphate enzyme gene are introduced. Such a transformant can effectively secure energy using xylose as a carbon source even when, for example, a medium using xylose as a single carbon source is used. On the other hand, among these three types of genes, in the case of yeast into which only the xylose reductase gene has been introduced, for example, a medium containing glucose or the like as a carbon source in addition to xylose is preferably used.
前記キシロース還元酵素遺伝子および前記キシロース還元酵素の由来は、特に制限されない。前記キシロース還元酵素遺伝子および前記キシロース還元酵素は、例えば、サッカロミセス属、ピキア属、シゾサッカロミセス属、アスペルギルス属等の酵母由来、ラクトバチルス属由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシロース還元酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。 The origin of the xylose reductase gene and the xylose reductase is not particularly limited. Examples of the xylose reductase gene and the xylose reductase include yeasts such as Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Aspergillus, and Lactobacillus. The following table shows the origin, gene name and database registration number of the xylose reductase gene as specific examples. These are merely examples and do not limit the present invention.
前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシリトール脱水素酵素の由来は、特に制限されない。前記キシリトール脱水素酵素遺伝子および前記キシリトール脱水素酵素は、例えば、サッカロミセス属、アスペルギルス属、スタフィロコッカス属、ピキア属等の酵母由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシリトール脱水素酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。 The origin of the xylitol dehydrogenase gene and the xylitol dehydrogenase is not particularly limited. Examples of the xylitol dehydrogenase gene and the xylitol dehydrogenase include those derived from yeasts such as Saccharomyces, Aspergillus, Staphylococcus, and Pichia. The following table shows the origin, gene name, and database registration number of the xylitol dehydrogenase gene as specific examples. These are merely examples and do not limit the present invention.
前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸化酵素の由来は、特に制限されない。前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子および前記キシルロースリン酸化酵素は、例えば、サッカロミセス属、スタフィロコッカス属、ピキア属等の酵母由来、エッセリシア属由来等があげられる。以下の表に、具体例として、前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子の由来、遺伝子名およびデータベースの登録番号を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。 The origins of the xylulose kinase gene and the xylulose kinase are not particularly limited. Examples of the xylulose phosphatase gene and the xylulose phosphatase include those derived from yeasts such as Saccharomyces, Staphylococcus, and Pichia, and from Escherichia. The following table shows the origin, gene name and database registration number of the xylulose kinase gene as specific examples. These are merely examples and do not limit the present invention.
前記キシロース還元酵素遺伝子が導入された酵母は、例えば、下記表に示す酵母株等が使用できる。 As the yeast into which the xylose reductase gene has been introduced, for example, yeast strains shown in the following table can be used.
本発明のエタノール生成酵母において、前記親株酵母と、ＱＮＳ１遺伝子、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子およびキシルロースリン酸酵素遺伝子の由来は、それぞれ、特に制限されず、例えば、前述した親株酵母および各遺伝子の由来を、適宜組合せてもよい。具体例としては、前記親株酵母がサッカロミセス セレビシエであり、これに対して、ＱＮＳ１遺伝子がサッカロミセス セレビシエ由来であることが好ましく、さらに、ピキア スティピティス由来キシロース還元酵素遺伝子、ピキア スティピティス由来キシリトール脱水素酵素遺伝子および／またはサッカロミセス セレビシエ由来キシルロースリン酸酵素遺伝子の組合せが例示できる。 In the ethanol producing yeast of the present invention, the origins of the parent yeast and the QNS1 gene, xylose reductase gene, xylitol dehydrogenase gene and xylulose phosphate enzyme gene are not particularly limited. The origins of the genes may be combined as appropriate. As a specific example, it is preferable that the parent yeast is Saccharomyces cerevisiae, whereas the QNS1 gene is preferably derived from Saccharomyces cerevisiae, and further, a Pichia stipitsis-derived xylose reductase gene, a Pichia stipitsis-derived xylitol dehydrogenase gene, and A combination of xylulose phosphate enzyme genes derived from Saccharomyces cerevisiae can be exemplified.
（エタノール生成酵母の製造方法）
つぎに、本発明のエタノール生成酵母の製造方法について説明する。なお、以下の方法は、例示であって、本発明は、これらの方法に制限されない。
(Method for producing ethanol-producing yeast)
Below, the manufacturing method of the ethanol producing yeast of this invention is demonstrated. The following methods are examples, and the present invention is not limited to these methods.
本発明において、前記（Ｘ）のＨｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対する、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害等を行うことで製造できる。前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊は、例えば、前記親株酵母に対して、リコンビナーゼを使用した相同組換えにより行うことができ、市販のキット等が使用できる。また、前記ＨＳＴ１遺伝子の発現阻害は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子を導入することにより行うことができる。 In the present invention, the yeast transformant in which the Hst1 protein of (X) is inactivated, for example, as described above, disrupts the HST1 gene, inhibits the expression of the HST1 gene with respect to the parent strain yeast Can be manufactured. The HST1 gene can be disrupted, for example, by homologous recombination using a recombinase with respect to the parent strain yeast, and a commercially available kit or the like can be used. The HST1 gene expression can be inhibited, for example, by introducing a nucleic acid molecule such as siRNA into the parent strain yeast as described above.
本発明において、前記（Ｙ）のＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、前述のＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターを導入することにより製造できる。 In the present invention, the yeast transformant introduced with the expression vector of the (Y) QNS1 gene is produced, for example, by introducing the aforementioned expression vector of the QNS1 gene into the parent strain as described above. it can.
本発明において、前記（Ｘ）と（Ｙ）の両方の条件を満たす酵母形質転換体は、例えば、前述のように、親株酵母に対して、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等と、前記ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターの導入とを行うことで製造できる。前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等と前記発現ベクターの導入とは、例えば、いずれが先でもよく、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等を行った後に、前記発現ベクターを導入してもよいし、前記発現ベクターを導入した後に、前記ＨＳＴ１遺伝子の破壊等を行ってもよい。 In the present invention, the yeast transformant that satisfies both the conditions (X) and (Y) is, for example, as described above, with respect to the parent strain, disruption of the HST1 gene and the expression of the QNS1 gene. It can be manufactured by introducing a vector. The HST1 gene disruption or the like and the introduction of the expression vector may be performed first, for example, after the HST1 gene disruption or the like, the expression vector may be introduced, or the expression vector is introduced. After that, the HST1 gene may be disrupted.
前記親株酵母に前記発現ベクターを導入する形質転換方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。前記方法は、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, p163（1983））等があげられ、この他にも、例えば、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 （1978）”、“Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual”等に記載の方法が採用できる。 The transformation method for introducing the expression vector into the parent strain yeast is not particularly limited, and a known method can be used. Examples of the method include an electroporation method, a spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)), a lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, p163 (1983)) and the like. In addition, for example, the methods described in “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, “Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual”, etc. Can be adopted.
その他、一般的なクローニング技術に関しては、例えば、“Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）”等を参照できる。 Other general cloning techniques include, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”, “Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY).
前記発現ベクターが前記親株酵母に導入されたか否かする方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。例えば、前記発現ベクターが有する前記各選択マーカーを利用して確認できる。あるいは、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換された前記親株酵母からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等によって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認できる。また、予め蛍光色素等によって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出できる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によって増幅産物を確認する方法も利用できる。これらの方法を使用して、前記発現ベクターが導入された前記親株酵母を、本発明における前記（Ｙ）の酵母形質転換体として選択できる。 The method for determining whether or not the expression vector has been introduced into the parent yeast is not particularly limited, and a known method can be used. For example, it can be confirmed using each of the selection markers possessed by the expression vector. Alternatively, it can be performed by PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method and the like. For example, DNA is prepared from the transformed parent strain yeast, and a DNA-specific primer is designed to perform PCR. Thereafter, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as a single band, It can be confirmed that it has been transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, a method in which an amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or an enzyme reaction can be used. Using these methods, the parent yeast strain into which the expression vector has been introduced can be selected as the yeast transformant of (Y) in the present invention.
前記親株酵母は、特に制限されず、例えば、前述のような各種酵母が使用できる。また、前記親株酵母は、例えば、キシロース還元能を有する酵母、キシロース還元能を有さない酵母のいずれであってもよい。後者の場合は、前述のように、例えば、前記親株酵母に、前記キシロース還元酵素遺伝子を導入すればよい。 The parent strain yeast is not particularly limited, and for example, various yeasts as described above can be used. The parent strain yeast may be, for example, either a yeast having xylose reducing ability or a yeast not having xylose reducing ability. In the latter case, as described above, for example, the xylose reductase gene may be introduced into the parent strain yeast.
（エタノールの製造方法）
つぎに、本発明のエタノールの製造方法は、前述のように、前記本発明のエタノール生成酵母を用いてエタノール発酵を行う発酵工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のエタノール生成酵母を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のエタノールの製造方法は、例えば、さらに、前記本発明のエタノール生成酵母を培養する培養工程を有してもよく、前記培養工程により培養菌体を取得した後、前記発酵工程を行ってもよい。
(Ethanol production method)
Next, as described above, the method for producing ethanol of the present invention includes a fermentation step in which ethanol fermentation is performed using the ethanol-producing yeast of the present invention. The present invention is characterized by using the ethanol-producing yeast of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. The ethanol production method of the present invention may further include, for example, a culture step of culturing the ethanol-producing yeast of the present invention. After obtaining cultured cells by the culture step, the fermentation step is performed. Also good.
前記培養工程および前記発酵工程において、前記培地の種類は、特に制限されず、例えば、酵母の培養に使用できる公知の培地があげられ、前記培地にキシロースを含有させることが好ましい。前記培地は、例えば、ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト、ポリペプトン、グルコース）、ＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ６．７ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）等があげられる。前記培養工程に使用する場合、前記培地において、キシロースは、例えば、含まれても、含まれなくてもよい。前記発酵工程に使用する場合、前記培地のキシロースの含有量は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜８０ｇ／Ｌであり、より好ましくは５０〜８０ｇ／Ｌである。具体例として、例えば、前記ＹＰＤ培地にキシロースが含まれていてもよいし、キシロースのみが炭素源であるＹＰＸ培地（イーストエキストラクト、ポリペプトン、キシロース）等でもよい。 In the culturing step and the fermentation step, the type of the medium is not particularly limited, and examples thereof include known media that can be used for yeast culture, and it is preferable that the medium contains xylose. Examples of the medium include YPD medium (yeast extract, polypeptone, glucose), SD medium (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / l, glucose 20 g / l), and the like. When used in the culturing step, xylose may or may not be included in the medium, for example. When used in the fermentation step, the xylose content of the medium is not particularly limited, and is, for example, 10 to 100 g / L, preferably 20 to 80 g / L, and more preferably 50 to 80 g / L. . As a specific example, for example, the YPD medium may contain xylose, or a YPX medium (yeast extract, polypeptone, xylose) in which only xylose is a carbon source.
前記培地へのキシロースの添加は、例えば、単品のキシロースの添加でもよいし、キシロース含有原料の添加でもよい。前記原料は、キシロースを含んでいればよく、特に制限されず、例えば、キシロースを含む生物由来の原料、すなわち、キシロース含有バイオマスが好ましい。前記バイオマスは、日本国農林水産省が発行した「バイオマス・ニッポン総合戦略」において、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」と定義されている。この定義から、「キシロース含有バイオマス」は、例えば、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものであって、キシロースを含むもの」と定義できる。前記キシロース含有バイオマスは、特に制限されず、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、麦、モロコシ（こうりゃん）、ソルガム等の否可食部、廃木材、パルプ廃液、バガス、もみ殻、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラス等があげられる。 The addition of xylose to the medium may be, for example, addition of single xylose or addition of a xylose-containing raw material. The raw material is not particularly limited as long as it contains xylose, and for example, a biological material containing xylose, that is, xylose-containing biomass is preferable. The biomass is defined as “renewable organic resources derived from living organisms excluding fossil resources” in the “Biomass Nippon Integrated Strategy” issued by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan. From this definition, “xylose-containing biomass” can be defined as, for example, “a renewable, organic organic resource excluding fossil resources and containing xylose”. The xylose-containing biomass is not particularly limited, for example, sugarcane, corn, sugar beet, potato, sweet potato, wheat, sorghum, sorghum and other edible parts, waste wood, pulp waste liquid, bagasse, rice husk, Examples include corn cob, rice straw, switchgrass, Eliansus, and Napiergrass.
前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、酵母培養時の公知の条件が採用できる。培養温度は、例えば、２８〜３５℃であり、好ましくは、３０〜３２℃である。培養時間は、特に制限されず、例えば、１〜９６時間であり、好ましくは、１〜４８時間である。酵母の培養は、例えば、好気条件下が好ましく、例えば、振とう培養が好ましい。また、前記発酵工程における発酵条件についても、特に制限されず、例えば、酵母によるアルコール発酵時の公知の条件が採用できる。発酵温度は、例えば、２８〜３５℃であり、好ましくは、３０〜３２℃である。発酵時間は、特に制限されず、例えば、１〜９６時間であり、好ましくは、１〜４８時間である。また、前記発酵条件は、例えば、嫌気条件から微好気条件下であり、好ましくは、通気なしで、６０ｒｐｍでゆっくり攪拌する等である。 The culture conditions in the culture step are not particularly limited, and known conditions during yeast culture can be employed. The culture temperature is, for example, 28 to 35 ° C, and preferably 30 to 32 ° C. The culture time is not particularly limited, and is, for example, 1 to 96 hours, preferably 1 to 48 hours. The yeast culture is preferably under aerobic conditions, for example, shaking culture is preferable. Moreover, it does not restrict | limit especially about the fermentation conditions in the said fermentation process, For example, the well-known conditions at the time of alcoholic fermentation by yeast are employable. Fermentation temperature is 28-35 degreeC, for example, Preferably, it is 30-32 degreeC. Fermentation time is not particularly limited, and is, for example, 1 to 96 hours, preferably 1 to 48 hours. Moreover, the fermentation conditions are, for example, from anaerobic conditions to slightly aerobic conditions, and preferably agitating slowly at 60 rpm without aeration.
本発明のエタノール生成酵母は、生成したエタノールを細胞外に放出するため、本発明の製造方法は、さらに、前記発酵工程により得られた培養物から、菌体を含む固体画分と液体画分とを分離する工程を含んでもよい。前記分離は、例えば、遠心分離、ろ過等により行える。 Since the ethanol-producing yeast of the present invention releases the produced ethanol to the outside of the cell, the production method of the present invention further comprises a solid fraction and a liquid fraction containing bacterial cells from the culture obtained by the fermentation step. May be included. The separation can be performed, for example, by centrifugation, filtration or the like.
また、本発明の製造方法は、さらに、前記固体画分または前記液体画分から、エタノールを精製する精製工程を含んでもよい。前記固体画分は、酵母を含むため、例えば、酵母を破壊して、細胞内からエタノールを放出させ、エタノールを精製できる。前記液体画分は、細胞内から放出されたエタノールを含むため、前記液体画分から直接エタノールを精製できる。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、各種クロマトグラフィーが使用できる。 The production method of the present invention may further include a purification step of purifying ethanol from the solid fraction or the liquid fraction. Since the solid fraction contains yeast, for example, the yeast can be destroyed, ethanol can be released from the cells, and ethanol can be purified. Since the liquid fraction contains ethanol released from the cells, ethanol can be purified directly from the liquid fraction. The purification method is not particularly limited, and for example, various chromatography can be used.
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to the aspect described in the Example.
以下に、実施例で使用した材料および方法を示す。なお、特に示さない限り、使用した試薬等のマニュアルに準じて処理を行った。 The materials and methods used in the examples are shown below. In addition, unless otherwise indicated, the treatment was performed according to the manual for the reagents used.
１．酵母株
実施例において、以下に示す酵母株を使用した。株名とあわせて、分譲の登録番号および遺伝子型を示す。
1. In the yeast strain examples, the yeast strains shown below were used. Along with the stock name, the registration number and genotype of the sales are shown.
実施例において、ＨＳＴ１遺伝子とＱＮＳ１遺伝子の取得には、S.cerevisiae Ｘ２１８０−１Ａ株を、ＨＳＴ１遺伝子破壊株とＱＮＳ１遺伝子高発現株の育種には、ＨＨ４７２株およびＨＨ５９４株を用いた。ＨＨ４７２株およびＨＨ５９４株は、Ｘ２１８０−１Ａ株に、P.stipitisのキシロース還元酵素遺伝子（ＸＹＬ１）とキシリトール脱水素酵素遺伝子（ＸＹＬ２）とS.cerevisiaeのキシルロースリン酸化酵素遺伝子（ＸＫＳ１）の発現ユニットが、遺伝子型に示したようなプロモーター制御下で、ＶＩ染色体のＧＡＴ１とＰＡＵ５との間のノンコーディング領域に組み込まれている。なお、本発明は、これらの株に限定されない。 In Examples, the S. cerevisiae X2180-1A strain was used for obtaining the HST1 gene and the QNS1 gene, and the HH472 strain and the HH594 strain were used for breeding the HST1 gene-disrupted strain and the QNS1 gene high-expressing strain. The HH472 and HH594 strains are different from the X2180-1A strain in that the expression unit of the P. stipitis xylose reductase gene (XYL1), the xylitol dehydrogenase gene (XYL2) and the S. cerevisiae xylulose kinase gene (XKS1). Is incorporated into the non-coding region between GAT1 and PAU5 of the VI chromosome under the control of a promoter as shown in the genotype. The present invention is not limited to these strains.
２．培地
培地は、後述する目的に応じて、以下の培地を使用した。下記培地において、「＊」は、個別にろ過滅菌した後に、培地に添加したことを示す。
（１）ＹＰＤ培地
イーストエキストラクト １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ２０ｇ／Ｌ、グルコース＊ ２０ｇ／Ｌ
（２）ＹＰＧｌｙ培地
イーストエキストラクト １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ２０ｇ／Ｌ、グリセロール ２０ｇ／Ｌ
（３）ＹＰＸ培地
イーストエキストラクト １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ２０ｇ／Ｌ、キシロース＊ ５０〜６０ｇ／Ｌ
2. As the medium , the following medium was used according to the purpose described later. In the following media, “*” indicates that the solution was individually sterilized by filtration and then added to the media.
(1) YPD medium yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, glucose * 20 g / L
(2) YPGly medium yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, glycerol 20 g / L
(3) YPX medium yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, xylose * 50-60 g / L
３．ＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡの調製
酵母細胞を、５０μｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。前記ｂｕｆｆｅｒの組成は、０．１２５ｍｇ／ｍｌ ザイモリアーゼ１００Ｔ、１ｍｏｌ／Ｌ ソルビトール、４０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウムバッファー ｐＨ６．８、１ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオスレイトールとした。前記懸濁液を、３０℃で１時間インキュベートした後、プロテアーゼＥ １ｍｇ／ｍｌを５μｌ加え、さらに、５５℃で２０分、９９℃で１０分インキュベートした。インキュベート後の懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１０分遠心し、染色体ＤＮＡを含む上清を回収した。これを鋳型ＤＮＡとした。
3. Preparation of template DNA for PCR Yeast cells were suspended in 50 μl of lysis buffer. The composition of the buffer was 0.125 mg / ml zymolyase 100T, 1 mol / L sorbitol, 40 mmol / L potassium phosphate buffer pH 6.8, 1 mmol / L dithiothreitol. The suspension was incubated at 30 ° C. for 1 hour, 5 μl of protease E 1 mg / ml was added, and further incubated at 55 ° C. for 20 minutes and 99 ° C. for 10 minutes. The suspension after the incubation was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant containing the chromosomal DNA was recovered. This was used as template DNA.
４．ＨＳＴ１遺伝子破壊のためのユニットの作製
サッカロミセス セレビシエのＨＳＴ１遺伝子は、Saccharomyces Genome Databaseにおいて登録されており、登録番号は、ＹＯＬ０６８Ｃである。この塩基配列情報に基づいて、サッカロミセス セレビシエの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによって、ＨＳＴ１遺伝子の部分配列の増幅産物を得た。具体的には、以下の通りに行った。
4). Production of a unit for HST1 gene disruption The HST1 gene of Saccharomyces cerevisiae is registered in the Saccharomyces Genome Database, and the registration number is YOL068C. Based on this nucleotide sequence information, an amplification product of a partial sequence of the HST1 gene was obtained by PCR using Saccharomyces cerevisiae chromosomal DNA as a template. Specifically, it was performed as follows.
サッカロミセス セレビシエは、サッカロミセス セレビシエＸ２１８０−１Ａ株を使用した。この酵母株の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記プライマーｐｄＨＳＴ１＿Ｆ１およびｐｄＨＳＴ１＿Ｒ１を用いて、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列を、ＰＣＲによって増幅した。また、下記プライマーｐｄＨＳＴ１＿Ｆ２およびｐｄＨＳＴ１＿Ｒ２を用いて、ＨＳＴ１遺伝子のＣ末端側をコードする部分配列を、ＰＣＲによって増幅した。
ｐｄＨＳＴ１＿Ｆ１（配列番号５）
5’-TACCCGTTTAAACGCGGGCGATACTTTCATGTTGG-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｒ１（配列番号６）
5’-CCCGGCGCGCCGATATCGAATCCCAGCAATTTTATCA-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｆ２（配列番号７）
5’-CCCGGCGCGCCGATATCAAGTTTGAAAGTGGCTCCTG-3’
ｐｄＨＳＴ１＿Ｒ２（配列番号８）
5’-TCCCCGTTTAAACGCTTGTTTCTTTCGTGGCTGTTT-3’
As Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae X2180-1A strain was used. Using the chromosomal DNA of this yeast strain as a template, a partial sequence encoding the N-terminal side of the HST1 gene was amplified by PCR using the following primers pdHST1_F1 and pdHST1_R1. In addition, a partial sequence encoding the C-terminal side of the HST1 gene was amplified by PCR using the following primers pdHST1_F2 and pdHST1_R2.
pdHST1_F1 (SEQ ID NO: 5)
5'-TACCCGTTTAAACGCGGGCGATACTTTCATGTTGG-3 '
pdHST1_R1 (SEQ ID NO: 6)
5'-CCCGGCGCGCCGATATCGAATCCCAGCAATTTTATCA-3 '
pdHST1_F2 (SEQ ID NO: 7)
5'-CCCGGCGCGCCGATATCAAGTTTGAAAGTGGCTCCTG-3 '
pdHST1_R2 (SEQ ID NO: 8)
5'-TCCCCGTTTAAACGCTTGTTTCTTTCGTGGCTGTTT-3 '
取得した各ＤＮＡ断片を、クローニングキット（Invitrogen社、商品名GENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kit）を用いて、ベクターｐＵＣ１９ＰＮのＮｏｔＩサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１（図１）を得た。この際、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列とＨＳＴ１遺伝子のＣ末端側をコードする部分配列とが並ぶように挿入した。これらの部分配列の間には、ＥｃｏＲＶサイトがある。なお、ｐＵＣ１９ＰＮは、市販のベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに、ＰｍｅＩ−ＮｏｔＩ−ＰｍｅＩリンカーを挿入したベクターである。そして、挿入したこれらの部分配列は、ＤＮＡシークエンスにより確認した。これらの部分配列を取得するために用いる染色体ＤＮＡは、前述の株に限定するものではなく、サッカロミセス セレビシエに属する酵母であれば、何れの酵母から調製されたものであってもよい。染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによる目的遺伝子の増幅およびその後の単離は、ＰＣＲプライマーの調製を含め、当業者に周知な方法で行うことができる。 Each obtained DNA fragment was inserted into the NotI site of the vector pUC19PN using a cloning kit (Invitrogen, trade name GENEART (registered trademark) Seamless Cloning and Assembly Kit) to obtain a plasmid pUCpHST1 (FIG. 1). At this time, the partial sequence encoding the N-terminal side of the HST1 gene and the partial sequence encoding the C-terminal side of the HST1 gene were inserted in a line. Between these partial sequences is an EcoRV site. PUC19PN is a vector in which a PmeI-NotI-PmeI linker is inserted into the SmaI site of a commercially available vector pUC19. These inserted partial sequences were confirmed by DNA sequencing. The chromosomal DNA used for obtaining these partial sequences is not limited to the aforementioned strains, and may be prepared from any yeast as long as it belongs to Saccharomyces cerevisiae. Amplification of the target gene by PCR using chromosomal DNA and subsequent isolation can be performed by methods well known to those skilled in the art including preparation of PCR primers.
つぎに、プラスミドｐＵＧＲＦＲＴ（図２）をＥｃｏＲＶで切断し、両端にＦＲＴ配列を持つジェネティシン耐性遺伝子（ＦＲＴ−ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ−ＦＲＴ）を切り出した。このジェネティシン耐性遺伝子をｐＵＣｐＨＳＴ１のＥｃｏＲＶサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣｐＨＳＴ１Ｇ（図３）を得た。このｐＵＣｐＨＳＴ１ＧをＰｍｅＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルから切り出した。前記断片は、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列およびＣ末端側をコードする部分配列を持ち、これらの部分配列の間に、Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む。このＤＮＡ断片を前記ゲルから精製および抽出した。精製および抽出は、illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification kitを用いて、マニュアルに従って行った。ＦＲＴは、酵母２μプラスミド上に存在し、リコンビナーゼによって組換えが起こる、組換え部位である。ＦＲＴ配列はGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC（配列番号９）である。 Next, plasmid pUGRFRT (FIG. 2) was digested with EcoRV to cut out a geneticin resistance gene (FRT-PGK1p :: KanMX-FRT) having FRT sequences at both ends. This geneticin resistance gene was inserted into the EcoRV site of pUCpHST1 to obtain plasmid pUCpHST1G (FIG. 3). This pUCpHST1G was cleaved with PmeI and subjected to agarose gel electrophoresis. Then, a DNA fragment of about 2.0 kbp was cut out from the agarose gel. The fragment has a partial sequence encoding the N-terminal side of the HST1 gene and a partial sequence encoding the C-terminal side, and includes a G418 resistance marker gene (PGK1p :: KanMX) between these partial sequences. This DNA fragment was purified and extracted from the gel. Purification and extraction were performed according to the manual using illustra ™ GFX ™ PCR DNA and Gel Band Purification kit. FRT is a recombination site that is present on the yeast 2μ plasmid and undergoes recombination by recombinase. The FRT sequence is GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC (SEQ ID NO: 9).
５．ＱＮＳ１遺伝子の取得
サッカロミセス セレビシエのＱＮＳ１遺伝子は、Saccharomyces Genome Databaseにおいて登録されており、登録番号は、ＹＨＲ０７４Ｗである。この塩基配列情報に基づいて、サッカロミセス セレビシエの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによって、ＱＮＳ１遺伝子の部分配列の増幅産物を得た。具体的には、以下の通りに行った。
5). Acquisition of QNS1 gene Saccharomyces cerevisiae QNS1 gene is registered in the Saccharomyces Genome Database, and the registration number is YHR074W. Based on this nucleotide sequence information, an amplification product of a partial sequence of the QNS1 gene was obtained by PCR using Saccharomyces cerevisiae chromosomal DNA as a template. Specifically, it was performed as follows.
サッカロミセス セレビシエは、サッカロミセス セレビシエＸ２１８０−１Ａ株を使用した。この酵母株の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記プライマーｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿ＦおよびｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｒを用いて、ＱＮＳ１遺伝子のＯＲＦ配列を、ＰＣＲによって増幅した。
ｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｆ（配列番号１０）
5’-AAAAGCAGGCTCCGCAGGCCTATGTCACATCTTATCACTTTAGC-3’
ｐｅｎｔｒＳｔｕＱＮＳ１＿Ｒ（配列番号１１）
5’-AGAAAGCTGGGTCGGAGGCCTAATCAATAGACATAATGTC-3’
As Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae X2180-1A strain was used. Using the chromosomal DNA of this yeast strain as a template, the ORF sequence of the QNS1 gene was amplified by PCR using the following primers pentrStuQNS1_F and pentrStuQNS1_R.
pentrStuQNS1_F (SEQ ID NO: 10)
5'-AAAAGCAGGCTCCGCAGGCCTATGTCACATCTTATCACTTTAGC-3 '
pentrStuQNS1_R (SEQ ID NO: 11)
5'-AGAAAGCTGGGTCGGAGGCCTAATCAATAGACATAATGTC-3 '
取得したＤＮＡ断片を、クローニングキット（Invitrogen社、商品名GENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kit）を用いて、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩで切断したベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯに挿入し、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１（図４）を得た。挿入したＱＮＳ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列は、シークエンスによって確認した。 The obtained DNA fragment was inserted into a vector pENTR-D-TOPO cleaved with NotI-AscI using a cloning kit (Invitrogen, trade name GENEART (registered trademark) Seamless Cloning and Assembly Kit), and pENTR-D-QNS1. (FIG. 4) was obtained. The nucleotide sequence of the ORF of the inserted QNS1 gene was confirmed by sequencing.
６．ＱＮＳ１遺伝子高発現ベクターの構築
Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒとして、ｐＹＣＨＴＰＩ−ＲｆＡプラスミド（図５）を使用した。そして、Invitrogen社のマニュアルに従って、前記ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１と前記プラスミドｐＹＣＨＴＰＩ−ＲｆＡとのＬＲ反応を行った。これにより、プラスミドｐＹＣＨ＿ＲｆＡのＲｆＡ配列とｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＱＮＳ１のＱＮＳ１遺伝子を交換し、ＱＮＳ１遺伝子高発現ベクターであるｐＹＣＨＱＮＳ１（図６）を作製した。ｐＹＣＨＱＮＳ１において、ＱＮＳ１遺伝子は、ＴＰＩ１プロモーターにより制御される。
6). Construction of QNS1 gene high expression vector The pYCHTPI-RfA plasmid (FIG. 5) was used as the destination vector. Then, according to the manual of Invitrogen, LR reaction between the pENTR-D-QNS1 and the plasmid pYCHTPI-RfA was performed. Thereby, the RfA sequence of plasmid pYCH_RfA and the QNS1 gene of pENTR-D-QNS1 were exchanged to prepare pYCHQNS1 (FIG. 6), which is a QNS1 gene high expression vector. In pYCHQNS1, the QNS1 gene is controlled by the TPI1 promoter.
７．ＨＳＴ１遺伝子破壊株の取得
前記「４．」において、ｐＵＣｐＨＳＴ１ＧからＰｍｅＩで切り出した約２．０ｋｂｐの精製ＤＮＡ断片、すなわち、ＨＳＴ１遺伝子のＮ末端側をコードする部分配列およびＣ末端側をコードする部分配列を持ち、これらの部分配列の間にＧ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む断片を用いて、ＨＨ４７２株を形質転換した。得られた形質転換体を、ジェネティシン３００μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ培地に塗布した。生育した株において、ＦＲＴ−ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ−ＦＲＴ断片が、ＨＳＴ１遺伝子のＯＲＦと置き換わったことを確認するために、数個のコロニーからゲノミックＤＮＡを調製した。これを鋳型として、下記プライマーＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）およびｐＰＧＫ６５７−ｒ１、または、下記プライマーＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）およびＧ４１８＿Ｆ１のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）は、ＨＳＴ１遺伝子のＯＲＦの５’上流の配列であり、ＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）は、Ｇ４１８耐性遺伝子の配列である。
ＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）（配列番号１２）
5’-AAGCAGACAGGCACCATTG-3’
ｐＰＧＫ６５７−ｒ１（配列番号１３）
5’-GCAATCAATAGGAAGACAGG-3’
ＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）（配列番号１４）
5’-CGGACATTTTCATTCAAGAGG-3’
Ｇ４１８＿Ｆ１（配列番号１５）
5’-TGGTTGTAACACTGGCAGAG-3’
7). Acquisition of HST1 gene disruption strain In the above “4.”, a purified DNA fragment of about 2.0 kbp cut out from pUCpHST1G with PmeI, that is, a partial sequence encoding the N-terminal side and a C-terminal side of the HST1 gene The HH472 strain was transformed with a fragment containing the G418 resistance marker gene (PGK1p :: KanMX) between these partial sequences. The obtained transformant was applied to a YPD medium containing 300 μg / ml of geneticin. In order to confirm that the FRT-PGK1p :: KanMX-FRT fragment replaced the ORF of the HST1 gene in the grown strain, genomic DNA was prepared from several colonies. Using this as a template, PCR was performed using the following primers HST1U_F (RTG1C_F) and pPGK657-r1, or the following primers HST1D_R (NUF2C_F) and G418_F1. HST1U_F (RTG1C_F) is a sequence 5 ′ upstream of the ORF of the HST1 gene, and HST1D_R (NUF2C_F) is a sequence of a G418 resistance gene.
HST1U_F (RTG1C_F) (SEQ ID NO: 12)
5'-AAGCAGACAGGCACCATTG-3 '
pPGK657-r1 (SEQ ID NO: 13)
5'-GCAATCAATAGGAAGACAGG-3 '
HST1D_R (NUF2C_F) (SEQ ID NO: 14)
5'-CGGACATTTTCATTCAAGAGG-3 '
G418_F1 (SEQ ID NO: 15)
5'-TGGTTGTAACACTGGCAGAG-3 '
プラスミドｐＹＲＮＦＬＰ（図３）を用いて、ＰＣＲで適切な長さのＤＮＡが増幅された株をさらに形質転換した。得られた形質転換体を、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆａｔｅ ５０μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ培地に塗布した。ｐＹＲＮＦＬＰプラスミドは、酵母２μプラスミド上にあるリコンビナーゼを、ＴＤＨ３ｐ制御下で発現する、ＹＲｐタイプのプラスミドである。リコンビナーゼを発現すると、ＦＲＴ配列間で組換えが生じるため、ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸは、ゲノムからループアウトされる。ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸがループアウトしたことは、前記プライマーＨＳＴ１Ｕ＿Ｆ（ＲＴＧ１Ｃ＿Ｆ）およびＨＳＴ１Ｄ＿Ｒ（ＮＵＦ２Ｃ＿Ｆ）を用いてＰＣＲを行うこと、および、前記形質転換体のＧ４１８耐性がなくなることにより確認した。前記形質転換体は、Ｈｓｔ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）において、１１６〜４１３番目が欠失している。さらに、前記形質転換体は、前記ＹＰＧｌｙ培地で生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。また、ＹＲｐタイプのプラスミドは、安定性が悪く、選択圧をかけない状態では、細胞からすぐに脱落する。このため、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆａｔｅを含まない培地で生育させることにより、プラスミドｐＹＲＮＦＬＰを脱落させることができる。従って、本方法によりＨＳＴ１遺伝子を破壊した株は、薬剤耐性を持たないため、同じ方法で、複数の遺伝子をさらに破壊できる。 The plasmid pYRNNFLP (FIG. 3) was used to further transform a strain in which DNA of an appropriate length was amplified by PCR. The obtained transformant was applied to a YPD medium containing 50 μg / ml of Nursethricin dihydrogen sulfate. The pYRNNFLP plasmid is a YRp type plasmid that expresses the recombinase on the yeast 2μ plasmid under the control of TDH3p. Since recombinase expression causes recombination between FRT sequences, PGK1p :: KanMX is looped out of the genome. It was confirmed that PGK1p :: KanMX was looped out by performing PCR using the primers HST1U_F (RTG1C_F) and HST1D_R (NUF2C_F), and the G418 resistance of the transformant disappeared. The transformant is deleted at positions 116 to 413 in the amino acid sequence of the Hst1 protein (SEQ ID NO: 2). Further, the transformant was confirmed to grow on the YPGly medium and confirmed not to be a respiratory-deficient strain. In addition, YRp type plasmids are poorly stable and fall off cells immediately without applying selective pressure. For this reason, the plasmid pYRNNFLP can be removed by growing it in a medium that does not contain Nurseothricin dihydrosulfate. Therefore, since the strain in which the HST1 gene is disrupted by this method does not have drug resistance, a plurality of genes can be further disrupted by the same method.
８．ＱＮＳ１遺伝子高発現株の取得
前記「６．」で得たプラスミドｐＹＣＨＱＮＳ１を用いて、ＨＨ４７２株を形質転換し、ハイグロマイシン耐性株を取得することにより、ＱＮＳ１遺伝子高発現株を得た。形質転換体は、前記ＹＰＧｌｙ培地で生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。
8). Acquisition of a QNS1 gene high expression strain The plasmid pYCHQNS1 obtained in the above "6." was used to transform the HH472 strain to obtain a hygromycin resistant strain, thereby obtaining a QNS1 gene high expression strain. The transformant was confirmed to grow on the YPGly medium, and not to be a respiratory-deficient strain.
９．ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株の取得
ＨＳＴ１遺伝子を破壊したＨＨ４７２株を使用した以外は、前記「８．」と同様にして、プラスミドｐＹＣＨＱＮＳ１を用いて形質転換を行い、ＨＳＴ１遺伝子が破壊され、且つ、ＱＮＳ１遺伝子を高発現するＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株を得た。
9. HST1 gene disruption / acquisition of QNS1 gene high expression strain Except for using the HH472 strain in which the HST1 gene was disrupted, transformation was performed using the plasmid pYCHQNS1 in the same manner as in “8.”, and the HST1 gene was disrupted. And the HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain which highly expresses QNS1 gene was obtained.
１０．キシロース発酵試験（スモールスケール）
まず、前記ＹＰＤ培地１０ｍｌに、一白金耳の酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間、振とう培養した。得られた培養液から酵母を集菌し、新たなＹＰＤ培地２０ｍｌに懸濁し、３０℃で３時間、振とう培養した。培養後、酵母を集菌し、発酵試験用培地である前記ＹＰＸ培地で２回洗浄した後、新たなＹＰＸ培地２ｍｌに、ＯＤ６００が２０または２５となるように植菌し、その懸濁液を、容量３ｍｌのマイクロチューブに入れて蓋をし、３０℃でインキュベートした。そして、この培養液から、所定時間後にサンプリングして、遠心、ろ過後、回収した上清について、高速液体クロマトグラフィーによって成分の分析を行った。
10. Xylose fermentation test (small scale)
First, one platinum loop yeast was inoculated into 10 ml of the YPD medium, and cultured with shaking in a 30 ° C. incubator for 20 hours. Yeast was collected from the obtained culture broth, suspended in 20 ml of fresh YPD medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 hours. After culture, the yeast is collected, washed twice with the YPX medium, which is a fermentation test medium, and then inoculated into 2 ml of a new YPX medium so that the OD600 is 20 or 25. The cap was placed in a 3 ml microtube and incubated at 30 ° C. And it sampled after predetermined time from this culture solution, the component was analyzed by the high performance liquid chromatography about the collect | recovered supernatant after centrifugation and filtration.
１１．キシロース発酵試験（ラージケール）
容量１００ｍｌのメディウム瓶を用いて、発酵試験を行った。前記メディウム瓶の蓋から内部に、内径シリコンチューブを通した。前記メディウム瓶の内部において、前記チューブの一方の先端は、前記内部の培地に接触しない長さに調節した。前記メディウム瓶の外部において、前記チューブの他方の先端には、逆止弁を取り付け、前記瓶内の内圧が高くなった場合は、前記弁を通じて、前記瓶の内部から外部に気体が抜けて、前記内圧が外圧と同じになるようにした。
11. Xylose fermentation test (large kale)
A fermentation test was performed using a medium bottle with a capacity of 100 ml. An inner diameter silicon tube was passed through the inside of the lid of the medium bottle. Inside the medium bottle, one end of the tube was adjusted to a length that did not contact the internal medium. At the outside of the medium bottle, a check valve is attached to the other tip of the tube, and when the internal pressure in the bottle becomes high, gas escapes from the inside of the bottle through the valve, The internal pressure was made the same as the external pressure.
まず、前記ＹＰＤ培地１０ｍｌに、一白金耳の酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間振とう培養した。得られた培養液全量を、容量３００ｍｌの三角フラスコ中の前記ＹＰＤ培地１００ｍｌに植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間振とう培養した。培養後、遠心により酵母全量を回収し、再び、容量５００ｍｌの三角フラスコ中の前記ＹＰＤ培地２００ｍｌに懸濁し、３０℃で６時間振とう培養した。培養後、酵母を集菌し、発酵試験用培地である前記ＹＰＸ培地で２回洗浄した後、前記メディウム瓶中の新たなＹＰＸ培地４５ｍｌに、ＯＤ６００が２０になるように植菌した。前記メディウム瓶は、内部における前記ＹＰＸ培地が入っている量の深さまで、水浴につけ、３０℃に温度を保ち、滅菌したスターラーバーを入れて、６０ｒｐｍの速度で攪拌しながら培養した。そして、この培養液から、所定時間後に、１ｍｌサンプリングして、遠心、ろ過後、回収した上清について、高速液体クロマトグラフィーによって成分の分析を行った。 First, yeast of one platinum loop was inoculated into 10 ml of the YPD medium, and cultured with shaking in a 30 ° C. incubator for 20 hours. The total amount of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of the YPD medium in a 300 ml Erlenmeyer flask, and cultured with shaking in a 30 ° C. incubator for 20 hours. After cultivation, the whole amount of yeast was collected by centrifugation, suspended again in 200 ml of the YPD medium in a 500 ml Erlenmeyer flask, and cultured with shaking at 30 ° C. for 6 hours. After culturing, yeasts were collected and washed twice with the YPX medium, which is a fermentation test medium, and then inoculated into 45 ml of a new YPX medium in the medium bottle so that the OD600 was 20. The medium bottle was placed in a water bath, maintained at a temperature of 30 ° C., and sterilized with a stirrer bar until the depth of the inside containing the YPX medium was added, and cultured while stirring at a speed of 60 rpm. Then, 1 ml was sampled from the culture solution after a predetermined time, centrifuged, filtered, and the collected supernatant was analyzed for components by high performance liquid chromatography.
１２．エタノール、キシロースの測定
前記上清サンプルについて、高速液体クロマトグラフィーにより、各成分の定量を行った。前記上清サンプルにおける各成分の濃度は、既知濃度の純品サンプルのピーク面積から算出した。
（１）分離カラムおよび条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＨ−Ｇ（６．０×５０ｍｍ）＋ＳＨ１０１１（８．０×３００ｍｍ）
溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
カラムオーブン：６０℃
検出器：ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）２８０ｎｍ（フルフラール類）
示差屈折率検出器（ＲＩ）（他の糖類）
（２）装置構成
ＨＰＬＣ本体：日立Ｌ−２０００シリーズ
ポンプ：Ｌ−２１３０
オートサンプラ：Ｌ−２２００
ＤＡＤ検出器：Ｌ−２４５０
ＲＩ検出器：Ｌ−２４９０
カラムオーブン：島津 ＣＴＯ−１０Ａ
12 Measurement of ethanol and xylose Each component of the supernatant sample was quantified by high performance liquid chromatography. The concentration of each component in the supernatant sample was calculated from the peak area of a pure sample having a known concentration.
(1) Separation column and condition column: Shodex SUGAR SH-G (6.0 × 50 mm) + SH1011 (8.0 × 300 mm)
Eluent: 5 mmol / L H 2 SO 4
Flow rate: 0.6 ml / min
Column oven: 60 ° C
Detector: Diode array detector (DAD) 280 nm (furfurals)
Differential refractive index detector (RI) (other sugars)
(2) Apparatus configuration HPLC main unit: Hitachi L-2000 series pump: L-2130
Autosampler: L-2200
DAD detector: L-2450
RI detector: L-2490
Column oven: Shimadzu CTO-10A
［実施例１］
ＨＳＴ１遺伝子破壊株について、エタノール生成を確認した。
[Example 1]
Ethanol production was confirmed for the HST1 gene disruption strain.
親株として、ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株を使用し、前記「８．ＨＳＴ１遺伝子破壊株の取得」に従って、ＨＳＴ１遺伝子破壊株を育種した。そして、親株（ｎ＝３）と、ＨＳＴ１遺伝子破壊株（ｎ＝８）について、前記「１０．キシロース発酵試験（スモールスケール）」に従って、発酵試験を行い、高速液体クロマトグラフィーにてエタノールとキシロースを定量した。この際、前記「１０．」における条件を、ＯＤ６００＝２０とし、前記所定時間を４８時間とした。 As parental strains, HH472 strain and HH594 strain were used, and the HST1 gene disrupted strain was bred according to the above-mentioned “8. Acquisition of HST1 gene disrupted strain”. Then, the parent strain (n = 3) and the HST1 gene disruption strain (n = 8) were subjected to a fermentation test according to the “10. Xylose fermentation test (small scale)”, and ethanol and xylose were separated by high performance liquid chromatography. Quantified. At this time, the condition in “10.” was OD600 = 20, and the predetermined time was 48 hours.
これらの結果を、図７および図８に示す。図７および図８は、消費したキシロースの濃度、生成したエタノールの濃度を示すグラフであり、図７が、親株ＨＨ４７２とＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ４７２Δｈｓｔ１の結果であり、図８が、親株ＨＨ５９４とＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１の結果である。図７および図８において、白いバーが、消費したキシロース濃度（ΔＸＹＬ，ｇ／Ｌ）、黒いバーが、生成したエタノール濃度（ＥｔＯＨ，ｇ／Ｌ）、白い菱形が、エタノール収率（ＥＹ，％）を示す。そして、エタノール収率は、「キシロース資化量×０．５１」で表わされる量のエタノールが生成した場合を、収率１００％として計算した。その結果、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株のどちらを親株にした場合でも、前記親株よりもキシロースからのエタノール収率が増加した。具体的に、ＨＨ４７２株の場合、エタノールの収率は、親株が５２．４％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、５９．２％であった。ＨＨ５９４株の場合は、エタノールの収率は、親株が７３．８％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株は、７７．４％であった。キシロース資化量は、親株およびＨＳＴ１遺伝子破壊株の間でほとんど同じであった。 These results are shown in FIG. 7 and FIG. FIG. 7 and FIG. 8 are graphs showing the concentration of consumed xylose and the concentration of produced ethanol. FIG. 7 shows the results of the parent strain HH472 and the HST1 gene-disrupted strain HH472Δhst1, and FIG. 8 shows the parent strain HH594 and the HST1 gene. It is the result of the disrupted strain HH594Δhst1. In FIG. 7 and FIG. 8, the white bar indicates the consumed xylose concentration (ΔXYL, g / L), the black bar indicates the generated ethanol concentration (EtOH, g / L), and the white rhombus indicates the ethanol yield (EY,%). ). And the ethanol yield was calculated by assuming that the amount of ethanol represented by “xylose assimilation amount × 0.51” was generated as 100% yield. As a result, the ethanol yield from xylose was higher in the HST1 gene disrupted strain than in the parent strain regardless of whether the HH472 strain or the HH594 strain was used as the parent strain. Specifically, in the case of the HH472 strain, the ethanol yield was 52.4% for the parent strain, while that for the HST1 gene disrupted strain was 59.2%. In the case of the HH594 strain, the ethanol yield was 73.8% for the parent strain, whereas it was 77.4% for the HST1 gene disrupted strain. The amount of xylose utilization was almost the same between the parent strain and the HST1 gene disruption strain.
［実施例２］
ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株について、エタノール生成を確認した。
[Example 2]
Ethanol production was confirmed for the HST1 gene disruption strain, the QNS1 gene high expression strain, and the HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain.
ＨＨ４７２株とＨＨ５９４株を親株として、前記「７．」、「８．」および「９．」に従って、ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株、ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株を育種した。そして、それぞれ、一株について、前記「１１．キシロース発酵試験（ラージスケール）」に従って、発酵試験を行い、高速液体クロマトグラフィーにてエタノール、キシロースを定量した。この際、前記「１１．」における条件をＯＤ６００＝２０とし、前記所定時間を、０．５、２、８、２４、４８時間とした。 Using HH472 strain and HH594 strain as parent strains, HST1 gene disruption strain, QNS1 gene high expression strain, and HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain were bred according to the above “7.”, “8.” and “9.”. Each strain was subjected to a fermentation test according to “11. Xylose fermentation test (large scale)”, and ethanol and xylose were quantified by high performance liquid chromatography. At this time, the condition in “11.” was OD600 = 20, and the predetermined time was 0.5, 2, 8, 24, and 48 hours.
これらの結果を、図９および図１０に示す。図９および図１０は、消費したキシロースの濃度、生成したエタノールの濃度を示すグラフであり、図９が、親株ＨＨ４７２、ＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ４７２Δｈｓｔ１およびＱＮＳ１遺伝子高発現株ＨＨ４７２ＱＮＳ１の結果であり、図１０が、親株ＨＨ５９４、ＨＳＴ１遺伝子破壊株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株ＨＨ５９４Δｈｓｔ１＋ＱＮＳ１の結果である。図９と図１０の左図は、消費したキシロース濃度（ΔＸＹＬ，ｇ／Ｌ）を示し、図９と図１０の右図は、生成したエタノール濃度（ＥｔＯＨ，ｇ／Ｌ）を示す。そして、エタノール収率は、「キシロース資化量×０．５１」で表わされる量のエタノールが生成した場合を、収率１００％として計算した。 These results are shown in FIG. 9 and FIG. FIG. 9 and FIG. 10 are graphs showing the concentration of consumed xylose and the concentration of produced ethanol. FIG. 9 shows the results of the parent strain HH472, HST1 gene disruption strain HH472Δhst1 and the QNS1 gene high expression strain HH472QNS1. These are the results of the parent strain HH594, HST1 gene disruption strain HH594Δhst1 and HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain HH594Δhst1 + QNS1. 9 and 10 show the consumed xylose concentration (ΔXYL, g / L), and the right diagrams of FIGS. 9 and 10 show the generated ethanol concentration (EtOH, g / L). And the ethanol yield was calculated by assuming that the amount of ethanol represented by “xylose assimilation amount × 0.51” was generated as 100% yield.
図９に示すように、ＨＨ４７２株を親株とした場合、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＱＮＳ１遺伝子高発現株は、親株よりもエタノールの生成量が増加した。具体的に、エタノールの収率は、親株が５１．５％であるのに対し、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＱＮＳ１遺伝子高発現株は、それぞれ６０．５％および６１．５％であった。 As shown in FIG. 9, when the HH472 strain was used as the parent strain, the amount of ethanol produced in the HST1 gene disrupted strain and the QNS1 gene high expression strain was higher than that in the parent strain. Specifically, the yield of ethanol was 51.5% for the parent strain, whereas those for the HST1 gene disrupted strain and the high expression strain of QNS1 gene were 60.5% and 61.5%, respectively.
また、図１０に示すように、ＨＨ５９４株を親株とした場合、ＨＳＴ１遺伝子破壊株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、親株よりもエタノールの生成量が増加した。特に、ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、ＨＳＴ１遺伝子を破壊し、且つ、ＱＮＳ１遺伝子を高発現させることによって、ＨＳＴ１遺伝子破壊株よりも、さらにエタノール生成量が増加した。具体的に、エタノールの収率は、親株が６１．４％であるのに対し、前記ＨＳＴ１遺伝子破壊株および前記ＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株は、それぞれ７１．８％および７９．３％であった。なお、キシロース資化速度は、親株、ＨＳＴ１遺伝子破壊株、ＱＮＳ１遺伝子高発現株およびＨＳＴ１遺伝子破壊／ＱＮＳ１遺伝子高発現株の間で同じであった。 Further, as shown in FIG. 10, when the HH594 strain was used as the parent strain, the HST1 gene disrupted strain and the HST1 gene disrupted / QNS1 gene high expression strain had an increased amount of ethanol production than the parent strain. In particular, the HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain increased the amount of ethanol produced more than the HST1 gene disruption strain by disrupting the HST1 gene and high expression of the QNS1 gene. Specifically, the ethanol yield is 61.4% for the parent strain, whereas the HST1 gene disruption strain and the HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain are 71.8% and 79.3%, respectively. Met. The xylose utilization rate was the same among the parent strain, the HST1 gene disruption strain, the QNS1 gene high expression strain, and the HST1 gene disruption / QNS1 gene high expression strain.
このように、酵母のＨＳＴ１遺伝子の破壊、酵母におけるＱＮＳ１遺伝子の高発現、または、酵母のＨＳＴ１遺伝子の破壊および酵母におけるＱＮＳ１遺伝子の高発現によって、キシロースからエタノールへの変換効率を向上できた。以上の結果から、本発明によれば、キシロースを含むバイオマスを原料として、バイオプロセスによるエタノールの効率よい生成が可能となる。 Thus, the conversion efficiency from xylose to ethanol could be improved by disruption of yeast HST1 gene, high expression of QNS1 gene in yeast, or disruption of yeast HST1 gene and high expression of QNS1 gene in yeast. From the above results, according to the present invention, it is possible to efficiently produce ethanol by bioprocess using biomass containing xylose as a raw material.
以上のように、本発明のエタノール生成酵母によれば、キシロースを基質として、効率よくエタノールを生成できる。このため、本発明は、例えば、前述の廃棄物等のバイオマスを原料として、エタノールをバイオプロセスによって製造できるため、極めて有用といえる。 As described above, according to the ethanol-producing yeast of the present invention, ethanol can be efficiently produced using xylose as a substrate. For this reason, the present invention can be said to be extremely useful because, for example, ethanol can be produced by a bioprocess using biomass such as the aforementioned waste as a raw material.
Claims (14)
（Ｘ）Ｈｓｔ１タンパク質が不活性化された酵母形質転換体
（Ｙ）ＱＮＳ１遺伝子の発現ベクターが導入された酵母形質転換体 An ethanol-producing yeast comprising a xylose-metabolizing enzyme gene and a transformant that satisfies at least one of the following conditions (X) or (Y):
(X) Yeast transformant in which Hst1 protein is inactivated (Y) Yeast transformant introduced with an expression vector of QNS1 gene
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