JP2013135640A - 神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】神経幹細胞から細胞凝集塊を経て、神経細胞及びグリア細胞を形成することが可能な培養方法の提供。
【解決手段】培養容器Ｄを用いて、増殖因子を含む培地Ｍ中で神経幹細胞Ｃを浮遊培養して細胞凝集塊Ｃ’を形成する工程と、培地Ｍに分化誘導因子を添加して細胞凝集塊Ｃ’を培養容器Ｄの底面に接着させて神経幹細胞Ｃを分化させる工程を有し、培養容器Ｄは、一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）で表される基が底面の表面近傍に存在する。
【選択図】図１

Description

本発明は、神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法に関する。

従来、神経幹細胞を神経細胞及び／又はグリア細胞に分化誘導する方法として、神経幹細胞を浮遊培養して細胞凝集塊を形成した後、神経細胞及び／又はグリア細胞に分化させる方法が知られている。

特許文献１には、貫通穴が形成された第一基材と、第一基材の一方側の表面に剥離可能に接着されて貫通穴の一方側を覆う第二基材と、貫通穴の一方側を第二基材で覆うことにより形成された細胞非接着性のウェルを有する細胞集合体形成器具が開示されている。

また、特許文献１には、細胞集合体形成器具と、細胞集合体形成器具の第一基材の他方側の表面を当接させる細胞接着性表面を有する培養器具を含む細胞集合体転写キットが開示されている。

さらに、特許文献１には、細胞集合体形成器具のウェル内で浮遊状態の細胞集合体を形成する集合体形成工程と、細胞集合体形成器具の第一基材の他方側の表面を所定の細胞接着性表面に当接させて、ウェル内の細胞集合体を細胞接着性表面上に沈降させるとともに第一基材から第二基材を剥離する転写工程と、細胞接着性表面に接着した細胞集合体を培養する集合体培養工程を含む細胞集合体の培養方法が開示されている。

しかしながら、細胞集合体形成器具と培養器具を併用しないと、神経幹細胞から細胞凝集塊を経て、神経細胞及び／又はグリア細胞を形成することができないという問題がある。

特開２０１０−２３３４５６号公報

本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、単一の培養容器を用いて、神経幹細胞から細胞凝集塊を経て、神経細胞及び／又はグリア細胞を形成することが可能な培養方法を提供することを目的とする。

本発明の培養方法は、神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法であって、培養容器を用いて、増殖因子を含む培地中で神経幹細胞を浮遊培養して細胞凝集塊を形成する工程と、該培地に分化誘導因子を添加して該細胞凝集塊を該培養容器に接着させて該神経幹細胞を分化させる工程を有し、前記培養容器は、一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在する。

本発明によれば、単一の培養容器を用いて、神経幹細胞から細胞凝集塊を経て、神経細胞及び／又はグリア細胞を形成することが可能な培養方法を提供することができる。

本発明の培養方法の一例を示す図である。 実施例１の神経幹細胞の浮遊培養を示す光学顕微鏡写真である。 実施例１の細胞凝集塊を構成する神経幹細胞の分化を示す光学顕微鏡写真である。

次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。

図１に、本発明の培養方法の一例を示す。

なお、本培養方法では、一般式（１）で表される基が底面の表面近傍に存在する培養容器Ｄを用いる。

まず、培養容器Ｄに、神経幹細胞Ｃ及び増殖因子（不図示）を含む培地Ｍを導入し（図１（ａ）参照）、神経幹細胞Ｃを浮遊培養すると、神経幹細胞Ｃが増殖すると共に、凝集し、細胞凝集塊Ｃ’が形成される（図１（ｂ）参照）。これは、神経幹細胞Ｃが非接着性細胞であることに加え、培養容器Ｄの底面の表面近傍に存在する一般式（１）で表される基が細胞凝集塊Ｃ’の接着を抑制するためであると考えられる。

次に、培地Ｍに分化誘導因子（不図示）を添加すると、細胞凝集塊Ｃ’が培養容器Ｄの底面に接着し（図１（ｃ）参照）、細胞凝集塊Ｃ’を構成する神経幹細胞Ｃが神経細胞及びグリア細胞に分化する。

神経幹細胞Ｃとしては、特に限定されないが、ヒト、ラット、マウス、霊長類等の哺乳類に由来する神経幹細胞を用いることができる。

培地としては、神経幹細胞Ｃを培養することが可能であれば、特に限定されないが、適量の抗生物質を含む無血清培地等が挙げられる。

増殖因子としては、神経幹細胞Ｃを増殖させることが可能であれば、特に限定されないが、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子等が挙げられる。

分化誘導因子としては、細胞凝集塊Ｃ’を構成する神経幹細胞Ｃを分化誘導することが可能であれば、特に限定されないが、ウシ胎児血清等が挙げられる。

培養容器Ｄの形態としては、特に限定されないが、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、ローラーボトル、細胞培養プロセスを有するデバイスのユニット等が挙げられる。

培養容器Ｄは、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させることにより製造することができる。このとき、表面改質剤は、分子量が３１５〜６５０である。

容器の表面近傍に加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基及び／又はシラノール基を導入する方法としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマー（以下、加水分解性ポリマーという）と、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布する方法が挙げられる。

加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布すると、加水分解性ポリマーとアルコキシシランが加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、シラノール基同士の脱水縮合により、加水分解性ポリマーが架橋され、シラノール基が導入された架橋ポリマー層が形成される。具体的には、材料に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを材料に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。

加水分解に用いられる酸又はアルカリとしては、加水分解させることが可能なものであれば、特に限定されず、二種以上混合して用いることができ、水溶液として用いてもよい。

塗布液としては、有機溶媒中に、加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量は、通常、０．００１〜２０質量％であり、０．１〜５質量％が好ましい。塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量が０．００１質量％未満であると、１回の塗布で十分な効果が得られないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。

また、アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比は、通常、０．０１〜２０％であり、０．２〜５％が好ましい。アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比が０．０１％未満であると、架橋ポリマー層の強度が不十分になることがあり、２０％を超えると、架橋ポリマー層に導入されるシラノール基の量が不十分になることがある。

塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＥＫ、フッ素系樹脂、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。

加水分解性ポリマーとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマーであれば、特に限定されないが、一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはプロピレン基であり、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルコキシル基、好ましくはメトキシル基又はエトキシル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−１）を重合することにより得られるホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ａ）という）を用いることができる。このとき、モノマー（Ａ−１）を二種以上用いてもよい。

また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２は、炭素数が１〜１８の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくはメチル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−２）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−２）を二種以上用いてもよい。

また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｘは、一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｘ−１）、一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ^７は、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはブチル基であり、ｘは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−２）又は一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ^７は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｒ^８は、水素原子又はメチル基であり、ｙは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−３）である。）
で表されるモノマー（Ａ−３）を共重合してもよい。なお、Ｘが基（Ｘ−２）又は（Ｘ−３）である場合、モノマー（Ａ−３）は、分子量が１０００〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００が特に好ましい。このとき、モノマー（Ａ−３）を二種以上用いてもよい。

また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基又はプロピレン基であり、Ｙは、一般式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｚ⁻は、ハロゲン化物イオン又は有機酸若しくは無機酸の共役イオンである。）
で表される基（Ｙ−１）又は一般式

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｙ−２）である。）
で表されるモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−４）を二種以上用いてもよい。

すなわち、ポリマー（Ａ）を合成する際に、モノマー（Ａ−１）と共に、モノマー（Ａ−２）、モノマー（Ａ−３）及び／又はモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。

ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が３０〜８５質量％であることが好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が３０質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、８５質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。

また、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量は、通常、１〜７５質量％であり、１０〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７５質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。

さらに、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量は、通常、１〜７０質量％であり、５〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７０質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。

また、モノマー（Ａ−１）、モノマー（Ａ−２）及びモノマー（Ａ−３）の総質量に対するモノマー（Ａ−４）の質量の比は、通常、０．０１〜１であり、０．０５〜０．５が好ましい。この比が０．０１未満であると、架橋ポリマー層の柔軟性が低下することがあり、１を超えると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがある。

ポリマー（Ａ）の数平均分子量は２０００〜１５００００であることが好ましい。ポリマー（Ａ）の数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、１５００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。

なお、ポリマー（Ａ）の具体例及び製造方法は、特開平１１−３０２１２９号公報等に開示されている。

また、加水分解性ポリマーとしては、一般式

（式中、Ｒ^１は、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−１）を有するホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ｂ）という）を用いることができる。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）を二種以上有してもよい。

また、ポリマー（Ｂ）は、一般式

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−２）を有してもよい。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）を二種以上有してもよい。

ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）の含有量が１〜９０質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−１）の含有量が１質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、９０質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。

さらに、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０〜９９質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０質量％未満であると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがあり、９９質量％を超えると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがある。

ポリマー（Ｂ）の数平均分子量は２０００〜５０００００であることが好ましい。数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、５０００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。

加水分解性ポリマーとして、ポリマー（Ａ）及びポリマー（Ｂ）を併用してもよいし、加水分解性ポリマーと非加水分解性ポリマーを併用してもよい。非加水分解性ポリマーとしては、特に限定されないが、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有さないポリマー（Ａ）、ポリマー（Ｂ）等が挙げられる。

容器の表面近傍にシラノール基を導入する方法としては、特に限定されないが、シリコーン樹脂を含む塗布液を容器に塗布することにより、シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜を形成する方法等が挙げられる。

シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜は、水の接触角が３〜５０°であることが好ましい。水の接触角が３°未満である膜を形成することは困難であり、水の接触角が５０°を超える膜を形成すると、一般式（１）で表される基を高密度で導入できなくなることがある。

塗布液に含まれるシリコーン樹脂としては、特に限定されないが、一般式
（Ｒ^１Ｏ）_ｎＳｉ（Ｒ^２）_４−ｎ
（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜８のアルキル基であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｎが１又は２である場合、複数のＲ^２は、同一であっても異なっていてもよく、ｎが２又は３である場合、複数のＲ^１は、同一であっても異なっていてもよい。）
で表されるアルコキシシランを加水分解した後、縮合することにより得られる樹脂が挙げられ、二種以上併用してもよい。このとき、水の接触角が３〜５０°である膜に含まれるシラノール基を有するシリコーン樹脂は、塗布液に含まれるシリコーン樹脂と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

塗布液に含まれる有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

塗布液中のシリコーン樹脂の含有量は、通常、０．００１〜１質量％であり、０．１〜１質量％が好ましい。塗布液中のシリコーン樹脂の含有量が０．００１質量％未満であると、均一な膜が形成されないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。

塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。

また、シラノール基が表面近傍に存在する容器として、ガラス製の容器、石英製の容器等を用いてもよい。

金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化クロム、酸化アルミニウム等が挙げられる。

半金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化ゲルマニウム、酸化ヒ素、酸化ホウ素等が挙げられる。

加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基に対して反応性を有する基としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が挙げられる。

また、表面改質剤は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。

加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基としては、ヒドロシリル基、アルコキシシリル基、ハロシリル基、アシルオキシシリル基、アミノシリル基等が挙げられるが、安定性、反応性等の点から、炭素数が１〜６のアルコキシシリル基又はヒドロシリル基が好ましい。

表面改質剤としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有していれば、特に限定されないが、特開２００６−１１３８０号公報に開示されている化合物が挙げられる。

次に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、一般式（１）で表される基を導入する方法について説明する。

まず、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、表面改質剤を含む塗布液を塗布する。このとき、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、容器の表面近傍に存在するシラノール基、半金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基及び／又は金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基と、表面改質剤の加水分解により生成したシラノール基の脱水縮合により、容器の表面が改質される。具体的には、容器に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを容器に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。

酸又はアルカリとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を加水分解させることが可能であれば、特に限定されず、二種以上併用してもよい。なお、加水分解に用いられる酸又はアルカリは、水溶液として用いてもよい。

塗布液としては、有機溶媒中に、表面改質剤を溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられる。

塗布液中の表面改質剤の含有量は、通常、０．１〜３０質量％であり、１〜１０質量％が好ましい。塗布液中の表面改質剤の含有量が０．１質量％未満であると、１回の塗布で第一の表面改質剤を十分に塗布できないことがあり、３０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。

塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。

なお、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、一般式（１）で表される基を導入する方法として、特開２０１１−２３６３４５号公報に開示されている方法を用いてもよい。

培養容器Ｄは、カルボキシル基（又はアミノ基）が表面近傍に存在する容器に、アミノ基（又はカルボキシル基）と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させることにより製造してもよい。このとき、表面改質剤は、分子量が２２５〜６５０である。

容器の表面近傍にアミノ基を導入する方法としては、特に限定されないが、窒素プラズマ処理、アンモニアプラズマ処理、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。

窒素プラズマ処理では、窒素ガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏａｔｉｎｇｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１６−１１９（１９９９）８０２−８０７，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ １９５（２００１）８１−９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００．９８９−９９６（１９９９）参照）。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスを導入し、グロー放電を行う。

アンモニアプラズマ処理では、アンモニアガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、アンモニアガスを導入し、グロー放電を行う。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ガラス等が挙げられる。

表面処理剤を反応させる方法では、アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、まず、容器内に水／２−プロパノール混合液を仕込み、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。次に、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。

シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、アミノ基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンと、容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルアミンを添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。

アミノ基を有するアルケンとしては、アリルアミンに限定されず、ビニル基を有するアミン、アクリル基を有するアミン等であればよい。また、アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等により保護されていてもよい。さらに、アミノ基を有するアルケンの代わりに、エポキシ基等の、例えば、ジアミンとの反応により、アミノ基を導入することが可能な基を有するアルケンを用いてもよい。

容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。

表面処理剤を反応させる方法では、カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する。具体的には、まず、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボンキシル基を有するシランカップリング剤を合成する。次に、容器に水／２−プロパノール混合液を仕込み、カルボキシル基を有するシランカップリング剤を添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。さらに、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。

シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、カルボキシル基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを入れた容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルカルボン酸を添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。

容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。

カルボキシル基を有するアルケンとしては、アリルカルボン酸に限定されず、ビニル基を有するカルボン酸、アクリル基を有するカルボン酸等であればよい。

また、表面改質剤は、アミノ基（又はカルボキシル基）がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。

次に、アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。

アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−７２０３号公報、特開２００６−７２０４号公報、特開２００８−１７４４９１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。

容器の表面近傍に存在するカルボキシル基と、表面改質剤が有するアミノ基は、一般的な反応により縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、容器にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を仕込み、容器の表面近傍に存在するカルボキシル基を活性エステル化させた後、表面改質剤を容器に仕込む。

次に、カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。

カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−１１３８１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。

容器の表面近傍に存在するアミノ基と、表面改質剤が有するカルボキシル基は、一般的な反応によりを縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を用いて、カルボキシル基を活性エステル化させた表面改質剤を容器に仕込む。

［培養容器の作製］
化学式

で表される化合物０．６ｇ、オルトケイ酸テトラエチル０．４ｍＬ、１Ｍ塩酸１ｍＬ及びメタノール１０ｍＬを混合させた液を、ガラス基板に浸漬塗布した後、室温で１時間乾燥させた。次に、水洗した後、乾燥し、ホスホリルコリン基が表面近傍に存在するガラス基板を得た。

ホスホリルコリン基が表面近傍に存在するガラス基板上に、シリコーン樹脂製の枠を取り付け、底面の面積が１ｃｍ^２の培養容器を得た。

［実施例１］
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、Ｎ−２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１質量％、上皮細胞増殖因子Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を２０ｎｇ／ｍＬ、繊維芽細胞増殖因子Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を２０ｎｇ／ｍＬ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１質量％添加し、培地を作製した。

細胞密度が２×１０^４個／ｍＬとなるように、マウス由来の神経幹細胞を分散させた培地０．５ｍＬを培養容器に導入し、神経幹細胞を播種した後、気温を３７℃、炭酸ガスの濃度を５％、湿度を１００％に保持したインキュベータに培養容器を移動させ、神経幹細胞を浮遊培養した。その結果、神経幹細胞が増殖すると共に、遊走し、神経幹細胞を播種してから約６０時間後に、細胞凝集塊が形成された（図２参照）。なお、図２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ神経幹細胞を播種してからの経過時間が０時間、２４時間、４８時間及び７２時間である場合である。

神経幹細胞を播種してから７２時間後に、濃度が１０質量％となるように、ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を培地に添加した。その結果、ウシ胎児血清を添加してから約６時間後から、ホスホリルコリン基が表面近傍に存在するガラス基板に細胞凝集塊が接着し始めた。また、ウシ胎児血清を添加してから約１２時間後に、細胞凝集塊を構成する神経幹細胞が神経細胞又はグリア細胞に分化し、扁平化して繊維状の突起を伸展させた。さらに、ウシ胎児血清を添加してから約２４時間後に、多数の神経細胞及びグリア細胞が複雑なネットワークを形成した（図３参照）。なお、図３（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれウシ胎児血清を添加してからの経過時間が０時間、２４時間及び４８時間である場合である。

Ｃ 神経幹細胞
Ｃ’ 細胞凝集塊
Ｄ 培養容器
Ｍ 培地

Claims (2)

1. 神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法であって、
   培養容器を用いて、増殖因子を含む培地中で神経幹細胞を浮遊培養して細胞凝集塊を形成する工程と、
   該培地に分化誘導因子を添加して該細胞凝集塊を該培養容器に接着させて該神経幹細胞を分化させる工程を有し、
   前記培養容器は、一般式
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
   で表される基が表面近傍に存在することを特徴とする培養方法。
2. 前記培養容器は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、前記一般式（１）で表される基を有し、分子量が３１５以上６５０以下である化合物を反応させることにより製造されていることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。