JP2013101110A - 液体クロマトグラフ及び分析法 - Google Patents

Abstract

【課題】上記従来技術では、酸性物質をポストカラム法により誘導体化せずに高速液体クロマトグラフィーによって検出する際にＢＴＢ指示薬法よりも高感度に検出するという課題が知られていなかった。本発明は物質をポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーによって検出する際に誘導体化せずにＢＴＢ指示薬法の検出感度よりも高感度に検出することを目的とする。
【解決手段】上記課題を解決するために、本発明は蛍光検出可能な蛍光ｐＨ指示薬を利用し、蛍光検出器を有する液体クロマトグラフを提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は液体クロマトグラフ及び分析方法に関する。

従来、ポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーは、分離部から溶出された試料に１種類以上の反応試薬を混合し、試料を検出する方法であり、高い選択性を必要とする場合やＵＶ吸収を持たない物質の測定などに利用されている。

ポストカラム法は測定目的物質を誘導体化する方法と誘導体化をしない方法に大別される。目的物質を誘導体化する方法は目的物質と反応試薬として使用する誘導体化試薬を化学反応させ、測定目的物質を別の物質に変換したのち検出する方法である（例えば、非特許文献１参照）。目的物質を誘導体化しない方法は目的物質による環境変化（水素イオン濃度など）を反応試薬により検出する方法である（例えば特許文献１参照）。

従来、酸性物質をポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーによって検出する場合にはブロモチモールブルー（ＢＴＢ）水溶液を反応液に使用したＢＴＢ指示薬法が知られていた（例えば、非特許文献２参照）。この方法は測定目的物質を誘導体化しない方法である。

図１３は従来のＢＴＢ法によるポストカラム法を用いた高速液体クロマトグラフの構造図である。高速液体クロマトグラフは、移動相送液ポンプ１、試料を注入するためのインジェクタ２、分離カラム３、分離部を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を合流させるジョイント５、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬が混合されながら流れる配管６、ＵＶ検出器１８、及び反応試薬送液部１１を備えている。試料はインジェクタ２から注入され、移動相送液ポンプ１から送液される移動相によって分離部を通過し、分離する。分離した試料はジョイント５で反応試薬送液ポンプ８から送液される反応液と混合され、配管６を通過してＵＶ検出器１８で検出され、信号がデータ処理部９に送られデータ処理が行われる。

一方で、蛍光検出法の蛍光強度Ｆは式１で示させるように物質濃度Ｃ、モル吸光係数ε、量子収率φおよび励起光強度Ｉ_exに比例し増加するため、高感度な測定が可能な検出法として知られている（例えば、非特許文献３参照）。

Ｆ＝２.３０３Ｉ_exεＣφ （式１）
また、蛍光物質の蛍光強度に影響を与える要因として、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）がある。蛍光ｐＨ指示薬は自身の官能基がプロトン化もしくは脱プロトン化した状態において蛍光を発する。図２は蛍光ｐＨ指示薬のｐＨ曲線である。蛍光ｐＨ指示薬は酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２１（ここでは６、９ジクロロメトキシアクリジンを表示）と塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬（ここではフルオレセインを表示）２２に大別される（例えば非特許文献４参照）。

特開平２１１２７５９号公報

Ｈａｎｎｅｌｏｒｅ Ｋａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ． "Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ" Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９３ ４４５−４５２ （２００９） 江頭 暁．"指示薬発色法によるカルボン酸のイオン交換クロマトグラフィー"分析化学．１５．１３５６−１３６０ （１９６６） 御橋廣眞編 「蛍光分光とイメージングの手法」学会出版センター、２００６年６月１５日 Ｐ．１３−１５ Ｓｅｉｉｃｈｉ Ｕｃｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．"Ｄｉｇｉｔａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐＨ ｓｅｎｓｏｒｓｗ" Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２６４６−２５４８ （２００９） Ｙａｓｕｔｅｒｕ Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐＨ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ" Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５． １０４−１０９ （２００９） Ｄａｎｉｅｌ Ａｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ. "Ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｅｒｙｌｅｎｅ ｂｉｓｉｍｉｄｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ−ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｒｏａｄｂａｎｄ ｐＨ ｏｐｔｏｄｅｓ" Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏａｎａｌｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｍｉｓｔｒｙ ４００． ２４７５-２４８５ （２０１１） ＧＥバイオサイエンス株式会社 蛍光アプリケーション Ｎｏ． ７１２１３７−９１ 平木 敬三、西川 泰治「けい光指示薬を用いる酸―塩基滴定（示差滴定）」．分析化学．３０．４５−５０（１９８１） 杉田 創他「フルオレセインの蛍光強度に及ぼすｐＨおよび溶存イオンの影響」日本地学会誌 ２５．２１１２２５（２００３）

上記従来技術では、酸性物質をポストカラム法により誘導体化せずに高速液体クロマトグラフィーによって検出する際にＢＴＢ指示薬法よりも高感度に検出するという課題が知られていなかった。本発明は物質をポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーによって検出する際に誘導体化せずにＢＴＢ指示薬法の検出感度よりも高感度に検出することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は蛍光検出可能な蛍光ｐＨ指示薬を利用し、蛍光検出器を有する液体クロマトグラフを提供する。

本発明によれば、酸性物質を誘導体化しないポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーによって検出する際に蛍光検出可能な蛍光ｐＨ指示薬を使用し、蛍光検出器により検出することでＢＴＢ指示薬法よりも高感度に検出という効果を得ることができる。

本発明のポストカラム法を用いた液体クロマトグラフシステムの構成図。 蛍光ｐＨ指示薬のｐＨ曲線。 従来のＢＴＢ指示薬法にてポストカラム法を行い、酸性物質を検出したクロマトグラム。 本発明で酸性側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用し、酸性物質をポストカラム法で検出したクロマトグラム。 本発明で塩基性側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用し、塩基性物質をポストカラム法で検出したクロマトグラム。 本発明で塩基側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用し、酸性物質をポストカラム法で検出したクロマトグラム。 本発明で酸性側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用し、塩基性物質をポストカラム法で検出したクロマトグラム。 本発明において、塩基性側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬と酸性側において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を同時に使用し、酸性物質および塩基性物質を両方検出したクロマトグラム。 多方ジョイントを使用し、蛍光ｐＨ指示薬を含む反応溶液を２種類以上使用した場合の構成図。 図１の構成に加圧コイル１６を追加した構成図。 図１と同様の構成、同様の蛍光ｐＨ指示薬を使用し、キセノンランプとキセノンランプよりも高強度の光を照射できる光源の両者で酸性物質を検出し比較したクロマトグラム。 図１の構成に分取部を追加した構成図。 従来のポストカラム法を用いた高速液体クロマトグラフの構造図。

以下実施例を用いて説明する。

図１を用いて本実施例の液体クロマトグラフについて説明する。
高速液体クロマトグラフは、移動相送液ポンプ１、試料を注入するためのインジェクタ２、分離カラム３、分離部を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を合流させるジョイント５、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬が混合されながら流れる配管６、蛍光検出器７、及び反応試薬送液部１１を備えている。

試料はインジェクタ２から注入され、移動相送液ポンプ１から送液される移動相によって分離部を通過し、分離する。分離した試料はジョイント５で反応試薬送液ポンプ８から送液される反応液と混合され、配管６を通過して蛍光検出器７で検出され、信号がデータ処理部９に送られデータ処理が行われる。

本発明を実施する液体クロマトグラフは、システム、分離カラム３の耐圧が２０ＭＰａより大きく、モジュールを接続する配管は試料の拡散を最小限とするために内径０．１３ｍｍ以下の配管を用い、最短に構成された装置であることが望ましい。溶液混合部の容積は最小に設計されたものであることが望ましい。用いる蛍光検出器７はフローセルが低容量のものであり、負のピークも検出できることが望ましい。

図３は比較例として従来技術を説明するための図であり、ＢＴＢ指示薬法を利用した場合のクロマトグラムである。ＢＴＢ指示薬法はｐＨ変化によりＢＴＢ指示薬の吸収スペクトルが変化することを利用したものであり、一般的には４４０ｎｍの吸光度を測定する。
ＢＴＢ指示薬法は吸光度の変化を測定するＵＶ検出器を使用するため、数１０ｍｇ／Ｌ以下の酸性物質を検出することができなかった。

一方、図４は本実施例を説明するものであり、図２と同濃度の酸性物質を検出したクロマトグラムである。反応試薬として酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２１を含む反応溶液を中性に調製し、反応試薬送液ポンプ８により送液後、ジョイント５において試料と混合、配管６を通り、キセノンランプを光源とする蛍光検出器７により検出した。
本実施例では反応試薬として蛍光ｐＨ指示薬２１の例としてキニーネを使用し、検出器として蛍光検出器７を使用することにより、ＢＴＢ指示薬法の検出感度よりも高感度に酸性物質を正のピークとして検出することがわかる。図３、図４のノイズレベルが同等であるので、Ｓ／Ｎを比較すると図４の蛍光検出の方が図３のＵＶ検出より５倍程度良くなることが分かる。これはキニーネのキノリン環の窒素原子（ｐＫ４．９）が酸性側でプロトン付加しπ電子系が安定することにより、３４０−３８０ｎｍの吸収が増大することによる。吸収したエネルギーにより電子が励起状態となり、それが基底状態に戻るときに４００−５５０ｎｍの蛍光がでるが、吸収エネルギーの増加に伴い、蛍光も強くなる。また、より高感度に酸性物質を検出したい場合には、ｐＨ７前後から酸性側へのｐＨの変化によって蛍光を発するようになる蛍光ｐＨ指示薬の使用が望ましい。このような蛍光pH指示薬にはＥｔＭｅＮＢＤＰやＤｉＥｔＮＢＤＰ（非特許文献５）、Ｐｅｒｙｌｅｎｅ ｂｉｓｉｍｉｄｅ （ＰＢＩ） ｄｙｅｓ（非特許文献６）、ＣｙｐＨｐｅｒ５（非特許文献７）が挙げられる。ＥｔＮＢＤＰやＤｉＥｔＮＢＤＰではジアルキル化したアニリル基の窒素原子が酸性側でプロトン付加することにより蛍光強度が強くなる。

本実施例における酸性物質はカルボン酸およびスルホン酸を含む。

図５は本実施例を説明するものであり、図２と同濃度の塩基性物質を検出したクロマトグラムである。実施例１と同様の装置構成を用いて、反応試薬として塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２２の例としてフルオレセインを含む反応溶液を中性に調製し、ジョイント５において試料と混合後、蛍光検出した。本実施例では従来のＢＴＢ指示薬法で検出することのできなかった塩基性物質を正のピークとして検出することがわかる。
フルオレセイン（ｐＫａ＝６．４）はベンゼン環のオルト位にあるカルボキシル基が塩基性側でキサンテン骨格の炭素原子と、ケトン基を持つ環状構造を生成することにより蛍光が強くなる（非特許文献９）。高感度に塩基性物質を検出したい場合には、ｐＨ７前後から塩基性側へのｐＨの変化によって蛍光を発するようになる蛍光ｐＨ指示薬の使用が望ましい。このような蛍光ｐＨ指示薬にはフルオレセイン、ＨＰＴＳ （非特許文献４）が挙げられる。本実施例における塩基性物質はポリアミン、アンモニアを含む。

図６は酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２１の例としてキニーネを使用し、実施例２で使用した塩基性物質を測定した例である。実施例１と同様の装置構成を用いて、実施例２で使用した蛍光ｐＨ指示薬を含む反応液を酸性に調製後使用し、ジョイント５において試料と混合後、蛍光検出することで塩基性物質を負のピークとして検出することがわかる。

図７は塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２２の例としてフルオレセインを使用して、実施例１で測定した酸性物質を測定した例である。実施例１と同様の装置構成を用いて、実施例２で使用した蛍光ｐＨ指示薬を含む反応液を塩基性に調製後使用し、ジョイント５において試料と混合後、蛍光検出することで実施例１で測定した酸性物質を負のピークとして検出することがわかる。

図８は酸性物質と塩基性物質を同時に測定した例である。酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２１の例としてキニーネを使用し、塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２２の例としてフルオレセインを両方含む反応液を中性に調製後使用し、ジョイント５において試料と混合後、蛍光検出することで酸性物質と塩基性物質を同時に検出することがわかる。本実施例は酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２１と塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬２２をもつ蛍光ｐＨ指示薬を異なる励起、蛍光波長をタイムプログラムによって切り替えて検出した例であるが、複数の波長を検出できる蛍光検出器を用いることでも、両者を同士に同時に使用することが可能であり、このような構成も本発明の範疇に含まれる。

図９は蛍光ｐＨ指示薬を含む反応溶液を２種類以上使用した場合の構成図である。実施例５では実施例１と実施例２の蛍光ｐＨ指示薬を同一の反応溶液に調製することを前提とした。ただし、ジョイント５を４方ジョイント等の多方ジョイントへ適宜設定することで２種類以上の蛍光ｐＨ指示薬を反応液混合部で混合することにより、実施例５と同様の効果を奏することは可能であり、このような構成も本発明の範疇に含まれる。

図１０は実施例１の構成に加圧コイル１６を追加した構成図である。反応試薬送液ポンプ８とジョイント５の間に加圧コイル１６を加えることで、反応試薬送液ポンプ８に由来の圧力変動によるノイズを軽減させることが可能であり、このような構成も本発明の範疇に含まれる。

実施例１〜７では蛍光検出器７の光源としてキセノンランプを使用することを前提に記載した。図１１は実施例１と同様の構成、同様の蛍光ｐＨ指示薬を使用し、キセノンランプとキセノンランプよりも高強度の光を照射できる光源の両者で酸性物質を検出した場合のクロマトグラムである。キセノンランプよりも高強度の光を照射できる光源を使用することで更に高感度な検出が可能であり、このような構成も本発明の範疇に含まれる。光源としてはレーザ、ＬＥＤやランプを集積させたものを含む。

実施例１〜８では目的物質を検出した後に廃液として廃棄することを前提に記載した。
図１２は蛍光検出器７の後に分取部１７を追加した構成図である。分取部１７を組み合わせることにより、目的物質をインタクトな状態で分取することが可能であり、このような構成も本発明の範疇に含まれる。分取部としてはフラクションコレクタ、ビーカー、エッペンチューブ、マイクロプレート、試験管を含む。

１ 移動相送液ポンプ
２ インジェクタ
３ 分離カラム
４ カラムオーブン
５ ジョイント
６ 配管
７ 蛍光検出器
８ 反応試薬送液ポンプ
９ データ処理部
１０ 移動相容器
１１、１４、１５ 反応液容器
１２１３ 反応液送液ポンプ
１６ 加圧コイル
１７ 分取部
１８ ＵＶ検出器
２１ 酸性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬
２２ 塩基性側で蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬

Claims (11)

1. 移動相を送液する移動相送液部と、分離部と、前記分離部通過後の液体に対して測定目的物質を誘導体化しない反応試薬を送液する反応試薬送液部と、前記分離部から溶出された液体と前記反応試薬が混ざるジョイントと、検出部とを備えた液体クロマトグラフであって、検出部を蛍光検出部とすることを特徴とした液体クロマトグラフ。
2. 請求項１の液体クロマトグラフにおいて、測定目的物質を誘導体化しない反応試薬として酸性において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用することを特徴とする液体クロマトグラフ。
3. 請求項１の液体クロマトグラフにおいて、測定目的物質を誘導体化しない反応試薬として塩基性において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を使用することを特徴とする液体クロマトグラフ。
4. 請求項１の液体クロマトグラフにおいて、測定目的物質を誘導体化しない反応試薬として酸性において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬と塩基性において蛍光強度が上昇する蛍光ｐＨ指示薬を同時に使用することを特徴とする液体クロマトグラフ。
5. 請求項２の液体クロマトグラフにおいて、目的物質を負のピークとして検出することを特徴とする液体クロマトグラフ。
6. 請求項３の液体クロマトグラフにおいて、目的物質を負のピークとして検出することを特徴とする液体クロマトグラフ。
7. 請求項４の液体クロマトグラフにおいて、目的物質を負のピークとして検出することを特徴とする液体クロマトグラフ。
8. 請求項４において、２種類以上の蛍光ｐＨ指示薬を混合させることを特徴とする液体クロマトグラフ。
9. 請求項１〜８いずれかにおいて、抵抗コイルを有することを特徴とする液体クロマトグラフ。
10. 請求項１〜９いずれかにおいて、蛍光検出部の光源をキセノンランプ以上の高強度の光を照射できる光源とすることを特徴とした液体クロマトグラフ。
11. 請求項１〜１０のいずれかにおいて、分取装置を有することを特徴とした液体クロマトグラフ。