JP2013194049A - ヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト造血幹細胞を効率良く安全に増幅する方法を提供する。
【解決手段】IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor、胎盤成長因子）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)等、及びFGF20(線維芽細胞増殖因子）が造血幹細胞をSCF存在下で維持・増幅できる方法。
【選択図】なし
【解決手段】IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor、胎盤成長因子）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)等、及びFGF20(線維芽細胞増殖因子）が造血幹細胞をSCF存在下で維持・増幅できる方法。
【選択図】なし
Description
この発明は、ヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物及び方法に関する。
造血幹細胞を維持、未分化維持、自己複製又は増殖・増幅させる因子は長年にわたり探索されてきた。その結果、現在までに幹細胞因子(以下「ＳＣＦ（stem cell factor）」という。)、Flt3 ligand、TPO（トロンボポエチン）などの様々な因子やサイトカインを使って造血幹細胞を培養し増幅させる方法が考案されてきた（特許文献１〜５、非特許文献１〜４）。また、骨髄ストローマ細胞とヒト造血幹細胞を共培養することにより、ヒト造血幹細胞を増幅できることが知られており（特許文献１など）、ストローマ細胞に他のサイトカイン等を存在させた培地が提案されている（特許文献１、２、非特許文献２等）。
Blood Rev. 15, 191-197, 2001
Curr. Opin. Hematol. 15, 307-311, 2008
Blood 111, 3415-3423,2008
Oncol. Res. 13, 359-371, 2003
しかし、造血幹細胞を分化させずに幹細胞のまま増幅させることのできる、いわゆる「自己複製因子」は見つかっていない。更に、造血幹細胞を移植治療に十分な細胞数まで迅速に効率よく体外で増幅させる臨床応用可能な手法の確立には至っていない。
そのため、造血幹細胞を極力幹細胞のまま増幅させることができる因子の発見と、それを用いたヒト造血幹細胞を効率良く安全に増幅する移植治療に実用できる方法の開発が求められている。
そのため、造血幹細胞を極力幹細胞のまま増幅させることができる因子の発見と、それを用いたヒト造血幹細胞を効率良く安全に増幅する移植治療に実用できる方法の開発が求められている。
本発明者は、ヒト造血幹細胞をヒト骨髄ストローマ細胞（即ち、骨髄細胞を培養するとシャーレに付着して増殖する細胞集団）と共培養したが、ヒト造血幹細胞を維持・増幅することはできなかった。また、SCFはヒト造血幹細胞を維持・増幅できるものの、増幅率が十分ではなく更に増幅率を高める必要があった。しかし、造血幹細胞をSCF存在下で骨髄ストローマ細胞と共培養すると顕著な増幅が観察された。
そこで、本発明者は、ヒト骨髄ストローマ細胞を無血清培地で数日間培養した上清を、SCF存在下又は非存在下の無血清培地に添加して、ヒト造血幹細胞を培養した。その結果、骨髄ストローマ細胞培養上清だけでは造血幹細胞は増幅できなかったが、骨髄ストローマ細胞培養上清とSCFを同時に添加すると、造血幹細胞は十分に増幅できた。従って、ヒト骨髄ストローマ細胞から分泌されるタンパク質等とSCFだけでヒト造血幹細胞を増幅できることが分かった。
そこで、本発明者は、ヒト骨髄ストローマ細胞を無血清培地で数日間培養した上清を、SCF存在下又は非存在下の無血清培地に添加して、ヒト造血幹細胞を培養した。その結果、骨髄ストローマ細胞培養上清だけでは造血幹細胞は増幅できなかったが、骨髄ストローマ細胞培養上清とSCFを同時に添加すると、造血幹細胞は十分に増幅できた。従って、ヒト骨髄ストローマ細胞から分泌されるタンパク質等とSCFだけでヒト造血幹細胞を増幅できることが分かった。
そこで、骨髄ストローマ細胞から分泌産生される造血幹細胞を増幅又は自己複製させる因子を同定し、より純化した系での効率良い体外での造血幹細胞の増幅法の開発を試みた。先ず、ヒト骨髄ストローマ細胞からpolyA+ mRNAを調製し、DNAマイクロアレイ（Affymetrix GeneChip Microarray）解析を行い、骨髄ストローマ細胞で高発現（又は他の細胞と比較して特異的に高発現）している分泌タンパク質のリストを作成した。リストには、既知の造血幹細胞の自己複製因子、増幅因子、サイトカインもあったが、機能が未だ解明されていない分泌タンパク質の中から、造血幹細胞を増幅又は自己複製させる可能性がある因子を絞り込み、候補因子リストを作成した。これら候補因子から、造血幹細胞を実際に維持・増幅する活性を指標に新規因子をスクリーニングした。ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞（造血幹細胞）を、各候補因子を添加した無血清培地中で培養し、少しでも生存維持又は増殖させる活性のある因子をスクリーニングした。しかし、候補因子単独で造血幹細胞を維持又は増幅させるものはなかった。そこで、造血幹細胞の生存維持に最低限必要な因子であるSCFを無血清培地に低濃度で添加し、造血幹細胞がやっと生存維持できる環境を設定した。こうすることで、各候補因子の添加で造血幹細胞の維持・増幅効果を敏感に観測できる条件となり、造血幹細胞を維持又は増幅させる新規因子をスクリーニングした。その結果、IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor、PLGFとも表記する)（胎盤成長因子）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B)（血管内皮増殖（成長）因子B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6)（インスリン様成長因子結合タンパク質６）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19、FGF20(線維芽細胞増殖因子8, 9, 10, 17, 19, 20)の因子が新たに造血幹細胞をSCF存在下で維持・増幅させることができることを発見した。
即ち、本発明は、下記（１）及び（２）の因子から成るヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物である。
（１）幹細胞因子(SCF)
（２）IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor、胎盤成長因子）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B、血管内皮増殖因子B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6、インスリン様成長因子結合タンパク質６）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20(線維芽細胞増殖因子8, 9, 10, 17, 19及び20)から成る群から選択される少なくとも１種の因子
また本発明は、この組成物の存在下でヒト造血幹細胞を培養することから成る増幅したヒト造血幹細胞の製法である。
更に本発明は、この組成物を含む、無血清又はヒト血清から成るヒト造血幹細胞培養用の培地である。
（１）幹細胞因子(SCF)
（２）IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor、胎盤成長因子）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B、血管内皮増殖因子B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6、インスリン様成長因子結合タンパク質６）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20(線維芽細胞増殖因子8, 9, 10, 17, 19及び20)から成る群から選択される少なくとも１種の因子
また本発明は、この組成物の存在下でヒト造血幹細胞を培養することから成る増幅したヒト造血幹細胞の製法である。
更に本発明は、この組成物を含む、無血清又はヒト血清から成るヒト造血幹細胞培養用の培地である。
本発明の組成物により、造血幹細胞を体外で増幅することができるので、患者自身の骨髄（又は末梢血や出生時に保存した自家臍帯血）などから得た少量の造血幹細胞から移植治療に充分な量の造血幹細胞を調製することができ、HLA適合のドナーを待つことなく安全な移植治療が可能となる。即ち、自家移植が可能となり、移植に必要な幹細胞数も確保できる上に、拒絶反応の問題も解決できる。他家移植においても、細胞数が少なく移植治療できなかった臍帯血からでも、またドナーにリスクを与えない少量の骨髄採取からでも、成人の移植治療に必要な数の造血幹細胞の調達が可能となる。また、遺伝子治療に必要な造血幹細胞を容易に入手可能となり、リスクを伴うレトロウイルスを用いた遺伝子導入法を使わずとも、導入効率が悪くても安全な遺伝子導入法を用いることが可能となり、また、遺伝子導入した造血幹細胞を増幅することにも使用できることで、遅れている遺伝子治療の実用化と普及が期待できる。
本発明のヒト造血幹細胞を増殖させるための組成物は、（１）幹細胞因子(SCF)、及び
（２）IL31、PGF/PLGF、VEGF-B、EFEMP1、IGFBP6、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20から成る群から選択される少なくとも１種の因子から成る。
（２）IL31、PGF/PLGF、VEGF-B、EFEMP1、IGFBP6、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20から成る群から選択される少なくとも１種の因子から成る。
本発明の組成物を構成する因子である幹細胞因子（SCF）は、造血幹細胞の細胞死を抑制し、単独でもある程度生存させ維持も可能であり、他の因子と共に自己複製あるいは増幅させる因子である（非特許文献１）。
ヒトSCFは、転写の違い（Alternative transcripts）により２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトSCFは、転写の違い（Alternative transcripts）により２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列を有する。
本発明の組成物を構成する因子であるIL31はT細胞由来サイトカインであり、IL6ファミリー（IL6、IL11、IL27、IL31、Oncostatin M、Leukemia inhibitory factor(LIF)、Ciliary Neurotrophic Factor(CNTF), Cardiotrophin-1(CT-1)、neurotrophin-1/B cell stimulatory factor-3(NT-1/BCSF-3)からなる）の一員である。IL31はIL31RA/GPL(gp130-like)とOSMR(Oncostatin M receptor)のヘテロダイマーからなるレセプターに結合しシグナルを伝達する。過去にIL6、IL11、IL27、Oncostatin Mが造血幹細胞を増殖分化すると報告されている（Stem Cells 26, 2164-2172, 2008、Biochem. Biophys. Acta 1592, 313-321, 2002）。IL31の機能には免疫応答が知られているが、過去に造血幹細胞に対する作用は報告されておらず、本発明で初めて造血幹細胞に対する増幅活性が報告されることとなった。
ヒトIL31は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトIL31として、各種データベースに、NM_001014336、AY499343、BC132998、BC133000等のcDNA塩基配列が登録され、Q6EBC2、NP_001014358、EAW98310、AAI32999、AAI33001、AAS86448、BAJ21082、AAI17083、AAI17085等のアミノ酸配列が登録されており、ゲノム遺伝子配列、人工合成遺伝子も登録されている。他に、マウス、ラット、チンパンジー、イヌ等の遺伝子も登録されており、本発明においては、下等生物遺伝子や人工合成遺伝子も含めてIL31としての特異的生理活性を持つタンパク質はいずれも利用することができる。
ヒトIL31は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトIL31として、各種データベースに、NM_001014336、AY499343、BC132998、BC133000等のcDNA塩基配列が登録され、Q6EBC2、NP_001014358、EAW98310、AAI32999、AAI33001、AAS86448、BAJ21082、AAI17083、AAI17085等のアミノ酸配列が登録されており、ゲノム遺伝子配列、人工合成遺伝子も登録されている。他に、マウス、ラット、チンパンジー、イヌ等の遺伝子も登録されており、本発明においては、下等生物遺伝子や人工合成遺伝子も含めてIL31としての特異的生理活性を持つタンパク質はいずれも利用することができる。
本発明の組成物を構成する因子であるPGF/PLGFとVEGF-Bは、 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PGF/PLGFからなるVEGFファミリーのメンバーであり、他のメンバーと同様に血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つ。VEGFのレセプターにはVEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR、VEGFR-3/Flt-4の３種があり、PGF/PLGFはVEGFR-1/Flt-1のみに結合する。VEGFR-1/Flt-1にはVEGF-A、VEGF-Bも結合するが他のVEGFは結合しない。VEGF-AはVEGFR-2/Flk-1/KDRにも結合する。胎児初期発生の段階で、VEGF-Aは造血を促進し、PGF/PLGFは造血幹細胞の維持や移動に作用しSCF産生を促すことで間接的に造血幹細胞を増やすことが報告されている（Nature Med. 8, 841-849, 2002）。しかし、PGF/PLGF及びVEGF-Bが造血幹細胞に直接作用し増幅させる活性は報告されていない。本発明でPGF/PLGFとVEGF-Bが新たに造血幹細胞の増幅活性を持つことを発見したことから、VEGF-A、VEGF-B、PGF/PLGFに共通のレセプターであるVEGFR-1/Flt-1を介したシグナルが造血幹細胞の増幅に関与していると考えられる。
ヒトPGF/PLGFには、３つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトVEGF-Bには、２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号７〜８で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトPGF/PLGFには、３つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトVEGF-Bには、２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号７〜８で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトPGF/PLGFの３種のスプライスバリアント（アイソフォーム）には、NM_001207012、NM_002632、BC007789、BC007255、BC001422、AK023843、AK057973、AK309886、AK310608、AK310886、EU332861等のcDNA塩基配列が登録されており、NP_002623、NP_001193941、AAH07789、AAH07255、AAH01422、ABY87550、EAW81209、EAW81208、EAW81207等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアント、人工合成遺伝子も登録されている。また、マウス、ラット、ウシ、ブタ、チンパンジー、アカゲザル等の遺伝子配列も同様に登録されている。本発明においては、PGF/PLGFとしての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
ヒトVEGF-Bの２種のアイソフォームには、NM_003377、U52819、U48801、U43369、U43368、CR602359、BC008818等の塩基配列が登録されており、NP_003368、P49765、AAC50721、AAB06274、NP_001230662、AAL79001、AAL79000等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ウシ、カエル、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、VEGF-Bとしての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
ヒトVEGF-Bの２種のアイソフォームには、NM_003377、U52819、U48801、U43369、U43368、CR602359、BC008818等の塩基配列が登録されており、NP_003368、P49765、AAC50721、AAB06274、NP_001230662、AAL79001、AAL79000等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ウシ、カエル、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、VEGF-Bとしての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
本発明の組成物を構成する因子であるIGFBP6 (insulin-like growth factor（IGF） binding protein 6)の機能は不明である。幹細胞に関しては、IGFBP6が神経系幹細胞の細胞分化を抑制するとの報告があるが（Stem Cells Dev. 15, 407-421, 2006）、造血幹細胞への作用は報告がなく、本発明で初めて造血幹細胞への増幅作用が見出された。後述の実施例で示す通り、IGFBP6はIGFBP7/IGFBPrP1と同様に、IGF非存在下で活性があることから、IGFとの結合やそのレセプターを介さずに作用する。従って、IGFBP6のレセプターやその作用機序は不明であるが、IGFBP7/IGFBPrP1と共にIGFBP6の造血幹細胞に対する増幅活性が明らかとなった。
ヒトIGFBP6は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトIGFBP6として、NM_002178、M62402、M69054、AY443494、CR541791、CR590705、AK313158、BC003507、BC005007、BC010162、BC011708等の塩基配列が登録されており、NP_002169、CAG46590、AAD04730、AAB06187、AAG37059、AAA88070、AAR05445、AAH11708、AAH10162、AAH05007、AAH03507、EAW96664等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ブタ、サケ、ヒツジ、ウシ、チンパンジー、イヌ、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、IGFBP6としての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
ヒトIGFBP6は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトIGFBP6として、NM_002178、M62402、M69054、AY443494、CR541791、CR590705、AK313158、BC003507、BC005007、BC010162、BC011708等の塩基配列が登録されており、NP_002169、CAG46590、AAD04730、AAB06187、AAG37059、AAA88070、AAR05445、AAH11708、AAH10162、AAH05007、AAH03507、EAW96664等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ブタ、サケ、ヒツジ、ウシ、チンパンジー、イヌ、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、IGFBP6としての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
本発明の組成物を構成する因子であるEFEMP1の機能は不明であり、造血幹細胞との関係も過去に報告がない。唯一、Timp-3(Tissue inhibitor of metalloproteinase-3)という因子は、静止期にある造血幹細胞を細胞分裂期に入れる活性があるが（Blood 116, 4474-4482, 2010）、Timp-3はEFEMP1と結合するという報告がある（J. Biol. Chem. 279, 30469-30473, 2004）。しかしながら、本発明ではTimp-3存在下でも非存在下でもEFEMP1の活性に影響はなく、EFEMP1単独で造血幹細胞に対して増幅活性があることを見いだした。
ヒトEFEMP1には、４つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１０〜１３で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトEFEMP1の４種のスプライスバリアントには、NM_001039348、NM_001039349、NM_004105、AH010389、NG_009098、BC098561、BC014410、AB209212、AK092854、AK290599、AK293058、AK301402、AK301531、AK312639、CR590528、CR595300、CR604757、CR607072、CR611721、CR620563、U03877等の塩基配列が登録されており、NP_001034438、NP_001034437、NP_004096、AAK11491、AAH98561、AAH14410等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ウシ、ブタ、セブラフィッシュ、アフリカゾウ、チンパンジー、パンダ、カニクイザル、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、EFEMP1としての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
ヒトEFEMP1には、４つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１０〜１３で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトEFEMP1の４種のスプライスバリアントには、NM_001039348、NM_001039349、NM_004105、AH010389、NG_009098、BC098561、BC014410、AB209212、AK092854、AK290599、AK293058、AK301402、AK301531、AK312639、CR590528、CR595300、CR604757、CR607072、CR611721、CR620563、U03877等の塩基配列が登録されており、NP_001034438、NP_001034437、NP_004096、AAK11491、AAH98561、AAH14410等のアミノ酸配列、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。また、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ウシ、ブタ、セブラフィッシュ、アフリカゾウ、チンパンジー、パンダ、カニクイザル、人工合成遺伝子（タンパク質）等も同様に登録されている。本発明においては、EFEMP1としての特異的生理活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
本発明の組成物を構成する因子であるFGF（fibroblast growth factor）(繊維芽細胞増殖因子)ファミリーであるFGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19、FGF20は、過去に報告されているFGF1/aFGFとFGF2/bFGF(非特許文献２)に加えて、今回新たに造血幹細胞に対する増幅活性を持つことを発見した。一般にFGFは胚発生、創傷治癒、血管形成に関与し、骨、神経、血管組織への細胞分化を促進するが、今回発見した何れのFGFメンバーも、造血幹細胞に対する作用は報告が全くなく、今回初めて造血幹細胞を増幅させる活性の報告に至った。
FGFのレセプターには、FGFR1/CD331、FGFR2/CD332、FGFR3/CD333、FGFR4/CD334の４種が知られており、過去に報告されたFGF1/aFGF、FGF2/bFGF、FGF4に共通して強く結合するレセプターとして、FGFR3c及びFGFR4aがある。今回発見した6種のFGFメンバーもFGFR3c及びFGFR4aの両方又は何れかに強く結合することから、これらのレセプターを介したシグナルが造血幹細胞の増幅に関与していると考えられる。
ヒトFGF8には、４つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１４〜１７で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF9は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF10は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF17には、２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号２０〜２１で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF19は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF20は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有する。
FGFのレセプターには、FGFR1/CD331、FGFR2/CD332、FGFR3/CD333、FGFR4/CD334の４種が知られており、過去に報告されたFGF1/aFGF、FGF2/bFGF、FGF4に共通して強く結合するレセプターとして、FGFR3c及びFGFR4aがある。今回発見した6種のFGFメンバーもFGFR3c及びFGFR4aの両方又は何れかに強く結合することから、これらのレセプターを介したシグナルが造血幹細胞の増幅に関与していると考えられる。
ヒトFGF8には、４つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号１４〜１７で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF9は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF10は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF17には、２つのアイソフォーム（isoform）があり、配列番号２０〜２１で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF19は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有する。
ヒトFGF20は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有する。
各因子の塩基配列は、FGF8（４種のスプライスバリアント）としてNM_001206389、NM_006119、NM_033163、NM_0033164、NM_0033165、AB14615、BC069106、BC128235、BC128236、U36223、U46211、U46212、U46213、U46214等、FGF9としてNM_002010、AK095571、AK290792、BC069692、BC103978、BC103979、D4838等、FGF10としてNM_004465、AB002097、AF411527、AF508782、AK315314、BC069561、BC105021、BC105023、BC143772、CR541665、CR541688、GQ351295、U67918等、FGF17としてNM_003867、AB009249、AY358869、BC069475、BC105131、BC113489、BC143789等、FGF19としてNM_005117、AB18122、AF110400、AY358302、BC017664、BT006729、CR610453等、FGF20としてNM_019851、AB030648、AB044277、BC096720、BC098128、BC098153、BC098339、BC127125、BC137446、BC137447、BC141979、BC141980等が登録されている。アミノ酸配列としては、ヒトFGF8(４種のスプライスバリアント)としてNP_001193318、NP_006110、NP_149353、NP_149354、NP_149355等、FGF9としてNP_002001等、FGF10としてNP_004456等、FGF17としてNP_003858等、FGF19としてNP_005108等、FGF20としてNP_062825等が登録されている。他に各々、ゲノム遺伝子、変異体やスプライスバリアントも登録されている。更に、他の動物種、人工合成遺伝子も同様に登録されている。本発明においては、造血幹細胞に対する増幅活性がある限り、これらのいずれをも利用することができる。
本発明の造血幹細胞を増殖させるためには、本発明の組成物を含む適当な培地、好ましくは無血清培地で造血幹細胞を培養する。
培地は、造血幹細胞の生存や増殖が阻害されない限り特に限定されないが、例えば、StemSpan（Stem Cell technologies）、STEMα（STEM ALPHA）、StemPro-34無血清培地（Gibco Invitrogen）、StemPro MSC無血清培地（Invitorogen）、HSC-CFU培地(Miltenyl Biotech)、S-Clone無血清培地（SF-02、SF-03、CM-B、SF-B）（三光純薬）、HPGM培地（三光純薬）、AIM V培地（Invitorogen）、Marrow MAX骨髄培地（Invitrogen）、KnockOut DMEM/F-12培地（Invtrogen）、Stemline造血幹細胞増殖培地（Sigma）、SYN無血清培地（SYN H、SYN B）（AbCys SA）、SPE IV培地（AbCys SA）、MyeloCult培地（StemCell Technologies）、HPG無血清培地（Lonza）、UltraCULTURE培地（Lonza）、Opti-MEM培地（Gibco Invitrogen他）、MEM培地（Gibco Invitrogen他）、MEMα（Gibco Invitrogen他）、DMEM培地(Gibco Invitrogen他)、IMDM培地(Gibco Invitrogen他)、PRMI1640培地(Gibco Invitrogen他)、Ham F-12培地（Gibco他）、RD培地等を用いることができる。
培地には、造血幹細胞の増幅に効果があるLDLリポタンパク質、プロスタグランジンE1ないしE2、StemRegenin 1(SR１、アリル炭化水素受容体アンタゴニスト)、5-AzaD（5-aza-2'-deocycitidine D）、TSA（trichostatin）、TEPA（銅キレート剤）、等を添加してもよい。
培地は、造血幹細胞の生存や増殖が阻害されない限り特に限定されないが、例えば、StemSpan（Stem Cell technologies）、STEMα（STEM ALPHA）、StemPro-34無血清培地（Gibco Invitrogen）、StemPro MSC無血清培地（Invitorogen）、HSC-CFU培地(Miltenyl Biotech)、S-Clone無血清培地（SF-02、SF-03、CM-B、SF-B）（三光純薬）、HPGM培地（三光純薬）、AIM V培地（Invitorogen）、Marrow MAX骨髄培地（Invitrogen）、KnockOut DMEM/F-12培地（Invtrogen）、Stemline造血幹細胞増殖培地（Sigma）、SYN無血清培地（SYN H、SYN B）（AbCys SA）、SPE IV培地（AbCys SA）、MyeloCult培地（StemCell Technologies）、HPG無血清培地（Lonza）、UltraCULTURE培地（Lonza）、Opti-MEM培地（Gibco Invitrogen他）、MEM培地（Gibco Invitrogen他）、MEMα（Gibco Invitrogen他）、DMEM培地(Gibco Invitrogen他)、IMDM培地(Gibco Invitrogen他)、PRMI1640培地(Gibco Invitrogen他)、Ham F-12培地（Gibco他）、RD培地等を用いることができる。
培地には、造血幹細胞の増幅に効果があるLDLリポタンパク質、プロスタグランジンE1ないしE2、StemRegenin 1(SR１、アリル炭化水素受容体アンタゴニスト)、5-AzaD（5-aza-2'-deocycitidine D）、TSA（trichostatin）、TEPA（銅キレート剤）、等を添加してもよい。
更に細胞の増幅維持等に効果があるインスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、２−メルカプトエタノール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、HEPES、モノチオグリセロール、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、各種増殖因子、各種抗生物質、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、等を添加してもよい。
また、細胞外マトリックスであるコラーゲン（タイプI、III、IV、V、VI、VII、VIII等）、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、ラミニン、等を添加してもよい。
なお、培地に動物由来の血清を添加してもよいが、血清を使う場合はヒト血清が好ましく、移植予定患者の血清を用いることがより好ましい。
また、細胞外マトリックスであるコラーゲン（タイプI、III、IV、V、VI、VII、VIII等）、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、ラミニン、等を添加してもよい。
なお、培地に動物由来の血清を添加してもよいが、血清を使う場合はヒト血清が好ましく、移植予定患者の血清を用いることがより好ましい。
本発明の造血幹細胞を増殖させるためには、本発明の組成物を培地に添加し培養するが、骨髄ストローマ細胞など造血幹細胞を支持するフィーダー細胞等と共培養してもよいし、骨髄ストローマ細胞培養上清と共に培養してもよい。また、本発明の組成物を様々な担体を介して又は介さずにシャーレ等培養器（装置）に付着又は共有結合させて培養してもよいし、本発明の組成物の各因子を発現させたフィーダー細胞と共培養してもよい。
培地中のSCFの濃度は、0.1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは5〜500 ng/ml、より好ましくは10〜200 ng/mlである。
培地中のIL31、PGF/PLGF、VEGF-B、IGFBP6、EFEMP1、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19、FGF20の濃度は、それぞれ、通常約0.1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは5〜500 ng/ml、より好ましくは20〜200 ng/mlである。
造血幹細胞（未分画の造血幹細胞を含む細胞集団又は部分分画でもよい）は、培養用シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ等、あるいは自動培養装置に、本発明の組成物やその他の因子や化合物を添加した上記記載の培地、好ましくは無血清培地に浮遊させ、5% CO2、37℃のインキュベーター内で、数日から１ヶ月ほど、好ましくは１週間から３週間程度、培地交換し容量を増やしながら培養することができる。また、酸素分圧を調整した環境で培養しても良い。
培地中のSCFの濃度は、0.1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは5〜500 ng/ml、より好ましくは10〜200 ng/mlである。
培地中のIL31、PGF/PLGF、VEGF-B、IGFBP6、EFEMP1、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19、FGF20の濃度は、それぞれ、通常約0.1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは5〜500 ng/ml、より好ましくは20〜200 ng/mlである。
造血幹細胞（未分画の造血幹細胞を含む細胞集団又は部分分画でもよい）は、培養用シャーレ、フラスコ、プレート、バッグ等、あるいは自動培養装置に、本発明の組成物やその他の因子や化合物を添加した上記記載の培地、好ましくは無血清培地に浮遊させ、5% CO2、37℃のインキュベーター内で、数日から１ヶ月ほど、好ましくは１週間から３週間程度、培地交換し容量を増やしながら培養することができる。また、酸素分圧を調整した環境で培養しても良い。
本発明の組成物は、造血幹細胞を増幅しうる他の因子（自己複製因子、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、増幅因子、分化因子、造血因子等）や他の化合物と共に培地に添加することにより、他の因子の増幅能を格段に増加させる効果がある。
このような他の因子は、培養容器に直接固定又は種々のタンパク質（ペプチド）等の担体を介して共有結合又は非共有結合で固定化して、無血清培地又はヒト血清を含む培地で造血幹細胞を体外で増幅することもできる。
このような他の因子は、造血細胞の生存維持、増殖、増幅、自己複製、未分化維持等を少なくとも促進させる活性のある因子である。このような因子として、例えば、Flt3 ligand、NOV、JAG1細胞外ドメイン、Pleiotrophin、Timp3、Oncostatin M、BMP4、IGF2等が挙げられる。これら以外にも、IL6（interleukin 6）とsIL6R（可溶性IL6レセプター）、IL1、IL2、IL3、IL5、IL7、IL8、IL10、IL11、IL16、IL27（C19orf10）、TPO（thrombopoietin）、Notch ligand（Jaggedファミリー／Deltaファミリー）キメラタンパク質、FGF１（fibroblast growth factor 1）、FGF2、FGF4、FGF8b、Ang1（Angiopoietin 1/Tie2 ligand）、IGF1、 IGFBP2（IGF binding protein 2）、IGFBP3、IGFBP7/IGFBPrP1、TGFβ (transforming growth factor)、Angpl（Angiopoietin-like protein）ファミリーのAngpl2、Angpl3、Angpl5、Angptl7やMfap4、PRG4（Hemangiopoietin, Lubricin）、Galectin-1（LGAS1）、VEGFA、VEGFC、VEGF-D、Wnt2、Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10b、Wnt16、SDF-1、G-CSF、EPO、GM-CSF、CTC、CT-1、PDGF、PrP（prion protein）、Sonic hedgehog、PDGF、RANTES、種々のケモカイン、SDF-1、MIP-1α、EGF、LIF等が挙げられる。
また、他の化合物として、SB203580,SB239063、6-gingerol等のP38阻害剤、CHIR99021、Kenpaullone等のWntシグナル活性化剤（GSK3β阻害剤を含む）、SP600125、L-JNKi1 等のJNK阻害剤、2-Cl-C.OXT-A、dioleoyl phosphatidic acid(DOPA)、C6 ceramide、Trastuzumab等のERK活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、Valproic acid等のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を添加してもよい。
このような他の因子は、培養容器に直接固定又は種々のタンパク質（ペプチド）等の担体を介して共有結合又は非共有結合で固定化して、無血清培地又はヒト血清を含む培地で造血幹細胞を体外で増幅することもできる。
このような他の因子は、造血細胞の生存維持、増殖、増幅、自己複製、未分化維持等を少なくとも促進させる活性のある因子である。このような因子として、例えば、Flt3 ligand、NOV、JAG1細胞外ドメイン、Pleiotrophin、Timp3、Oncostatin M、BMP4、IGF2等が挙げられる。これら以外にも、IL6（interleukin 6）とsIL6R（可溶性IL6レセプター）、IL1、IL2、IL3、IL5、IL7、IL8、IL10、IL11、IL16、IL27（C19orf10）、TPO（thrombopoietin）、Notch ligand（Jaggedファミリー／Deltaファミリー）キメラタンパク質、FGF１（fibroblast growth factor 1）、FGF2、FGF4、FGF8b、Ang1（Angiopoietin 1/Tie2 ligand）、IGF1、 IGFBP2（IGF binding protein 2）、IGFBP3、IGFBP7/IGFBPrP1、TGFβ (transforming growth factor)、Angpl（Angiopoietin-like protein）ファミリーのAngpl2、Angpl3、Angpl5、Angptl7やMfap4、PRG4（Hemangiopoietin, Lubricin）、Galectin-1（LGAS1）、VEGFA、VEGFC、VEGF-D、Wnt2、Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10b、Wnt16、SDF-1、G-CSF、EPO、GM-CSF、CTC、CT-1、PDGF、PrP（prion protein）、Sonic hedgehog、PDGF、RANTES、種々のケモカイン、SDF-1、MIP-1α、EGF、LIF等が挙げられる。
また、他の化合物として、SB203580,SB239063、6-gingerol等のP38阻害剤、CHIR99021、Kenpaullone等のWntシグナル活性化剤（GSK3β阻害剤を含む）、SP600125、L-JNKi1 等のJNK阻害剤、2-Cl-C.OXT-A、dioleoyl phosphatidic acid(DOPA)、C6 ceramide、Trastuzumab等のERK活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、Valproic acid等のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を添加してもよい。
ヒト造血幹細胞は、臍帯血、胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、G-CSF等のサイトカインや抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、末梢血由来の細胞群等から純化することができる。ヒトES細胞、ヒトiPS細胞より造血幹細胞や造血系プロジェニター細胞に誘導された細胞、更にはヒト体細胞から遺伝子操作等で直接作成された造血幹細胞やプロジェニター細胞を用いることもできる。これらから、抗体を用いて免疫学的に染色し、セルソーター、磁気ビーズ等を用いて分離するか、ロゼット形成による細胞分離法や各種自動分離装置等を用いて分離することにより造血幹細胞を濃縮した分画を取得できる。
ヒト造血幹細胞のマーカーとしてはCD34陽性、CD38弱陽性（陰性）、CD133陽性、KDR陽性、CD90(Thy-1)陽性、CD117（c-Kit）陽性等が知られており、細胞分化抗原陰性等と組み合わせて用いることができる。さらに、ヒト骨髄や臍帯血や末梢血由来等の造血幹細胞としてSP(side population)細胞（Hoechst33342陰性細胞）を用いてもよい。
また、造血幹細胞を純化（単離）あるいは濃縮することなく、ヒト骨髄、臍帯血、抹消血等から赤血球等を除いた有核（又は単核）細胞又は幹細胞分画をそのまま培養に用いることもできる。ヒトES細胞やiPS細胞、またヒト体細胞から直接造血幹細胞や造血系プロジェニター細胞に誘導した細胞を純化することなく用いることもできるし、上記方法で純化した造血幹細胞やプロジェニター細胞を用いることもできる。
ヒト造血幹細胞のマーカーとしてはCD34陽性、CD38弱陽性（陰性）、CD133陽性、KDR陽性、CD90(Thy-1)陽性、CD117（c-Kit）陽性等が知られており、細胞分化抗原陰性等と組み合わせて用いることができる。さらに、ヒト骨髄や臍帯血や末梢血由来等の造血幹細胞としてSP(side population)細胞（Hoechst33342陰性細胞）を用いてもよい。
また、造血幹細胞を純化（単離）あるいは濃縮することなく、ヒト骨髄、臍帯血、抹消血等から赤血球等を除いた有核（又は単核）細胞又は幹細胞分画をそのまま培養に用いることもできる。ヒトES細胞やiPS細胞、またヒト体細胞から直接造血幹細胞や造血系プロジェニター細胞に誘導した細胞を純化することなく用いることもできるし、上記方法で純化した造血幹細胞やプロジェニター細胞を用いることもできる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
以下の実施例において、全細胞数はヘマトサイトメーターで測定した。全細胞増幅倍率は、増幅前後の全細胞数の変化（倍率）として表す。増幅比は、基準（SCFのみで培養した場合）の全細胞数に対する因子を添加して増幅した全細胞数の比として表す。幹細胞の割合については、増幅した全細胞を、FITCラベルCD34抗体とPEラベルCD133抗体で反応させて、フローサイトメーター(ミリポア社製easyCyte5)によって全細胞中の造血幹細胞（CD34陽性細胞）の割合(%)を測定した。幹細胞増幅倍率は、培養前の造血幹細胞数に対して、体外で増幅した造血幹細胞数の増幅倍率を表す。増幅倍率や増幅比等は3回の実験における平均値を示し、±20％程度の誤差があった。
以下の実施例において、全細胞数はヘマトサイトメーターで測定した。全細胞増幅倍率は、増幅前後の全細胞数の変化（倍率）として表す。増幅比は、基準（SCFのみで培養した場合）の全細胞数に対する因子を添加して増幅した全細胞数の比として表す。幹細胞の割合については、増幅した全細胞を、FITCラベルCD34抗体とPEラベルCD133抗体で反応させて、フローサイトメーター(ミリポア社製easyCyte5)によって全細胞中の造血幹細胞（CD34陽性細胞）の割合(%)を測定した。幹細胞増幅倍率は、培養前の造血幹細胞数に対して、体外で増幅した造血幹細胞数の増幅倍率を表す。増幅倍率や増幅比等は3回の実験における平均値を示し、±20％程度の誤差があった。
ヒト臍帯血CD34陽性細胞（Lonza社製、フローサイトメーター(FACS)解析で純度97％以上であることを確認）を造血幹細胞として用いた。無血清培地（StemCell Technologies社製StemSpan SFEM）に、ヒトSCF（Peprotech社）（20 ng/ml）を添加した。これに、ヒトIGFBP6（R&D Systems社）、ヒトPGF/PLGF（Peprotech社）、ヒトVEGF-B（Peprotech社）、ヒトEFEMP1（OriGene Technologies社）、ヒトIL31（Peprotech社）、ヒトFGF8（Peprotech社）、ヒトFGF9(Peprotech社)、ヒトFGF10(Peprotech社)、ヒトFGF17（Peprotech社）、ヒトFGF19（Peprotech社）、又はヒトFGF20（Peprotech社）を各100 ng/mlの濃度で添加した培地を準備した。FGFファミリーを添加した場合には、ヘパリン（1μg/ml）も添加した。
96穴プレート1穴に、上記各培地200μlにCD34陽性細胞を2.0〜6.0×104細胞（１.0〜3.0×105細胞/ml）を混ぜて、5%CO2、37℃で培養開始した。同じ成分を含む新鮮培地で適時部分交換し、48穴プレートに移し容量を増やしながら2週間培養した。
結果を表１に示す。
96穴プレート1穴に、上記各培地200μlにCD34陽性細胞を2.0〜6.0×104細胞（１.0〜3.0×105細胞/ml）を混ぜて、5%CO2、37℃で培養開始した。同じ成分を含む新鮮培地で適時部分交換し、48穴プレートに移し容量を増やしながら2週間培養した。
結果を表１に示す。
表１から、SCF存在下で、造血幹細胞は今回新たに発見したIGFBP6、IL31、PGF/PLGF、VEGF-B、EFEMP1、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19、FGF20の何れに因子の添加によっても、SCF単独と比較して全細胞の増幅倍率が増えることが分かる。造血幹細胞（CD34細胞）の割合はSCF単独とほぼ同じであり、結果として造血幹細胞の増幅倍率もSCF単独と比較して増加することが分かる。特に、SCF単独添加の場合に比べた増幅比が1.3以上、特に1.4以上の因子が好ましい。
Claims (8)
- 下記（１）及び（２）の因子から成るヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物である。
（１）幹細胞因子(SCF)
（２）IL31(interleukin-31)、PGF(placental growth factor）、VEGF-B(vascular endothelial growth factor B）、IGFBP6(insulin-like growth factor binding protein 6）、EFEMP1(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1)、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20(線維芽細胞増殖因子8, 9, 10, 17, 19及び20)から成る群から選択される少なくとも１種の因子 - 前記SCF、IL31、PGF/PLGF、VEGF-B、IGFBP6、EFEMP1、FGF8、FGF9、FGF10、FGF17、FGF19及びFGF20の各因子が、それぞれ配列番号１〜２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はその変異体である請求項１に記載の組成物。
- ヒト造血幹細胞を、請求項１又は２に記載の組成物の存在下で培養することから成る増殖したヒト造血幹細胞の製法。
- 前記培養が請求項１又は２に記載の組成物及び他の因子又は化合物の存在下で行われる請求項３に記載の製法。
- 無血清培地、又はヒト血清を含む培地で培養する請求項３又は４に記載の製法。
- 増殖したヒト造血幹細胞を移植する予定の患者の血清を含む培地で培養する請求項３又は４に記載の製法。
- 請求項１又は２に記載の組成物を含む、無血清又はヒト血清から成るヒト造血幹細胞培養用の培地。
- 前記ヒト血清が前記増殖したヒト造血幹細を移植する予定の患者の血清である請求項７に記載の培地。
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