JP2013173710A

JP2013173710A - アフラトキシン産生阻害剤及びその製造方法、アフラトキシン汚染防除方法、並びに、アフラトキシン産生阻害剤産生菌

Info

Publication number: JP2013173710A
Application number: JP2012040099A
Authority: JP
Inventors: Shohei Sakuta; 庄平作田; Hiromichi Nagasawa; 寛道長澤; Jermnak Usuma; ジャムナクウスマ; Akira Kawai; 亮河合
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2013-09-05
Also published as: WO2013129291A1

Abstract

【課題】アフラトキシン産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、並びに前記アフラトキシン産生阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法、前記アフラトキシン産生阻害剤を産生するアフラトキシン産生阻害剤産生菌の提供。
【解決手段】受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株の培養物を少なくとも含むアフラトキシン産生阻害剤である。
【選択図】図４

Description

本発明は、アフラトキシン産生阻害剤及びその製造方法、並びにアフラトキシン汚染防除方法、前記アフラトキシン産生阻害剤を産生する新規微生物であるアフラトキシン産生阻害剤産生菌に関する。

カビの二次代謝物には、有用な化合物が含まれる一方、マイコトキシンと呼ばれる毒性を示す化合物も多い。現在、マイコトキシンによる農作物の汚染は、世界的に深刻な問題となっており、安全な食糧を安定して得るために、マイコトキシン汚染防除の手段が求められている。

マイコトキシンによる農作物の汚染のうち、最も深刻な問題となっているのが、アフラトキシンによる農作物の汚染である。アフラトキシンは、既知の天然物質中で最も強い発ガン性や急性毒性を有することが知られており、また、通常の調理方法等では分解されない化合物であることから、その健康被害は深刻である。アフラトキシンに汚染された農作物の摂取による死亡の報告は頻繁にあり、またアフラトキシンが原因と推定される肝臓ガンによる死者は、中国だけでも毎年数十万人にのぼっている。

このような健康被害を防止するため、アフラトキシンの農作物汚染の規制値は、１０ｐｐｂ程度と低く設けられている。しかし、これにより、アフラトキシンで汚染された農作物を破棄することによる損害額も高額にのぼっている。例えば、米国でのアフラトキシン汚染による損失は、年間数百億円である。また、アジアにおけるアフラトキシン汚染による損失は更に大きく、年間１，０００億円以上にのぼると推定されている。

アフラトキシンの主な産生菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓであり、熱帯及び亜熱帯の環境下において、農作物の栽培や貯蔵の段階で、トウモロコシやピーナッツ等の農作物に感染してアフラトキシンを産生することが知られている（非特許文献１及び２参照）。熱帯及び亜熱帯以外の気候の地域においても、近年の地球温暖化現象による気候変動により、汚染地域の拡大が懸念されている。

従来から、アフラトキシン汚染防除の取り組みとして、アフラトキシン産生菌のゲノム解析やアフラトキシン産生に関与する遺伝子の同定等の基礎研究や、感染に抵抗性を有する品種の取得、アフラトキシン非産生菌との競合による汚染の軽減等の実用研究が行われている。しかしながら、アフラトキシン汚染防除の効果的かつ抜本的な方法は、未だ確立されていない。

アフラトキシン汚染防除方法としては、例えば、アフラトキシン産生菌の生育を阻害する抗カビ剤を使用する方法が考えられるが、強力な抗カビ剤は安全性に問題があり、また、該抗カビ剤の耐性菌の蔓延を引き起こす可能性がある。
一方、アフラトキシンは二次代謝物であるため、その産生を阻害しても産生菌の生育には影響を与えないと考えられることから、アフラトキシン産生のみを特異的に阻害する薬剤を利用することができれば、有効な汚染防除方法になりうると考えられる。

そこで、アフラトキシン産生を阻害する物質の探索が行なわれた結果、有機リン系の殺虫剤であるｄｉｃｈｌｏｒｖｏｓや、メラニン生合成系酵素を阻害するｔｒｉｃｙｃｌａｚｏｌｅに、アフラトキシン産生阻害活性が見出された（非特許文献３参照）。しかしながら、これらの化合物はアフラトキシン産生阻害活性が弱く、また該化合物自体の安全性に問題があることに加え、阻害活性の選択性に問題があることから実用化には至っていない。

このように、耐性菌の蔓延を引き起こすことなく、アフラトキシン産生のみを特異的に阻害する作用を有する化合物が求められており、探索の結果いくつかの化合物も見出されている（特許文献１及び２参照）。しかし、安全性が高く、かつ実用性の高いアフラトキシン産生阻害剤としては、未だ満足なものが見出されていないのが現状である。

特開平９−２４１１６７号公報特開平１１−７９９１１号公報

ＣｏｕｎｃｉｌｆｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．， "Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ：ＲｉｓｋｓｉｎＰｌａｎｔ，Ａｎｉｍａｌ，ａｎｄＨｕｍａｎＳｙｓｔｅｍｓ"，ＣＡＳＴ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ，２００３宇田川俊一，田端節子，中里光男："マイコトキシン"，中央法規，２００２Ｌ．Ｌ．ＺａｉｋａａｎｄＲ．Ｌ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｐｒｏｔ．，１９８７，５０，６９１

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アフラトキシン産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、並びに前記アフラトキシン産生阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法、前記アフラトキシン産生阻害剤を産生するアフラトキシン産生阻害剤産生菌を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、新規な微生物として、受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株を分離することに成功し、この菌株の培養物が、優れたアフラトキシン産生阻害活性を有することを見出し、本発明の完成に至った。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株の培養物を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤である。
＜２＞受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する工程を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤の製造方法である。
＜３＞前記＜１＞に記載のアフラトキシン産生阻害剤を用い、アフラトキシン産生菌によるアフラトキシン産生を阻害することを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法である。
＜４＞アフラトキシン産生阻害剤を、農作物に施用し、該農作物に感染したアフラトキシン産生菌のアフラトキシン産生を阻害する前記＜３＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。
＜５＞農作物が、穀類、ナッツ類、香辛料、豆類、ゴマ類、及び綿実から選択される少なくともいずれかである前記＜４＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。
＜６＞アフラトキシン産生阻害剤を、植物体に塗布し、該植物体に感染したアフラトキシン産生菌のアフラトキシン産生を抑制する前記＜３＞に記載のアフラトキシン汚染防除方法である。
＜７＞受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株であることを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤産生菌である。

本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、アフラトキシン産生を特異的かつ効果的に阻害し、安全性が高く、実用的なアフラトキシン産生阻害剤及びその効率的な製造方法、並びに前記アフラトキシン産生阻害剤を用いたアフラトキシン汚染防除方法、前記アフラトキシン産生阻害剤を産生するアフラトキシン産生阻害剤産生菌を提供することができる。

図１は、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌のグラム染色の結果を示す図である。スケールバーは１０μｍである。図２は、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌のコロニーを示す図である。図３は、Ｎｏ．２７株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づき簡易分子系統樹を表す図である。図４は、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌の培養物によるＡ．ｆｌａｖｕｓ及びＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンの産生阻害活性の一例を示すグラフである。図５Ａは、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌の培養物によるＡ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓのアフラトキシンの産生阻害活性の一例を示すグラフである。図５Ｂは、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌の培養物によるＡ．ｆｌａｖｕｓのアフラトキシンの産生阻害活性の一例を示すグラフである。

（アフラトキシン産生阻害剤）
本発明のアフラトキシン産生阻害剤は、受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株（以下、単に「Ｎｏ．２７株」と称することがある）の培養物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記アフラトキシン産生阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明のアフラトキシン産生阻害剤の製造方法により好適に製造される。

＜培養物＞
前記培養物としては、前記Ｎｏ．２７株の培養物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液、培養上清、培養菌体、培養菌体の破砕物などが挙げられる。
また、前記培養物の抽出物であってもよい。前記培養物の抽出物とは、例えば、該培養物に適当な有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトンなど）を加えて懸濁した後、遠心分離や濾過膜分離等を行い菌体と分離した抽出上清や、該抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を行ったものなどが挙げられる。
これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、培養液、培養上清が好ましい。
なお、前記Ｎｏ．２７株は、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、アフラトキシン産生阻害活性を高めるような処理を施されたものであってもよい。

前記アフラトキシン産生阻害剤中の前記培養物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記アフラトキシン産生阻害剤は、前記培養物そのものであってもよい。

＜その他の成分＞
前記アフラトキシン産生阻害剤中の前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、任意の農薬成分、農薬補助剤などが挙げられる。
前記アフラトキシン産生阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

＜＜農薬成分＞＞
前記農薬成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の農薬の有効成分が挙げられる。
前記農薬としては、例えば、殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

＜＜農薬補助剤＞＞
前記農薬補助剤は、担体と、界面活性剤と、その他の補助剤とを含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有する。

−担体−
前記担体としては、農園芸用に用いることができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体担体、固体担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記液体担体としては、例えば、水；イソプロピルアルコール、エチレングリコール等のアルコール類；シクロヘキサノン；メチルエチルケトン等のケトン類；プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル等のエーテル類；ケロシン、軽油等の脂肪族炭化水素類；キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタリン、ソルベントナフサ等の芳香族炭化水素類；Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；脂肪酸のグリセリンエステル等のエステル類；大豆油、ナタネ油等の植物油などが挙げられる。

前記固体担体としては、例えば、澱粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、魚粉、粉乳等の動植物性粉末；タルク、カオリン、ベントナイト、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫安等の鉱物性粉末などが挙げられる。

−界面活性剤−
前記界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの界面活性剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキレート、ポリオキシエチレンフェニルエーテルポリマー、ポリオキシエチレンアルキレンアリールフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーなどが挙げられる。

前記陰イオン性界面活性剤としては、例えば、リグニンスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホサクシネート、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルサルフェート、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルサルフェートなどが挙げられる。

前記陽イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルアミン塩などが挙げられる。
前記両性界面活性剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩アルキルベタイン、アミンオキサイドなどが挙げられる。

−その他の補助剤−
前記その他の補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粘結剤、増粘剤、固着剤、防腐防カビ剤、溶剤、農薬活性成分の安定化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、着色剤などが挙げられる。
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

＜剤型＞
前記アフラトキシン産生阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、液剤、ゾル剤（フロアブル剤）、顆粒水和剤、粉剤、細粒剤、粒剤、錠剤、油剤、噴霧剤、煙霧剤、エアゾール剤、ペースト剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
前記各剤の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法により製造することができる。

＜混用あるいは併用＞
前記アフラトキシン産生阻害剤は、他の殺菌剤（殺カビ剤、殺細菌剤、抗ウィルス剤、植物抵抗性誘導剤など）、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、昆虫生育調整剤、昆虫誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤、薬害軽減剤、鳥類忌避剤、肥料、土壌改良剤等との混用あるいは併用することもできる。

（アフラトキシン産生阻害剤の製造方法）
本発明のアフラトキシン産生阻害剤の製造方法は、受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する工程を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。

前記培養は、前記Ｎｏ．２７株を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記アフラトキシン産生阻害剤の産生に良好な温度で培養することによって行われる。

前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来ステノトロフォモナススピーシーズの培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されているペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、ＮＺ−アミン、カゼイン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源；トマトペースト、グリセリン、シュークロース、デンプン、グルコース、ガラクトース、マンノース、デキストリン、糖みつ、脂肪等の炭素源；食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等の無機塩；などが挙げられる。
また、前記培地中の成分として、前記栄養源の他、例えば、微量の金属塩、消泡剤としての動物油、植物油、鉱物油などを添加することもできる。
これらの材料は、前記Ｎｏ．２７株が利用し、アフラトキシン産生阻害剤の産生に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。

アフラトキシン産生阻害剤の産生のための種母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上で培養した前記Ｎｏ．２７株の生育物などが挙げられる。

前記培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件で培養することが好ましい。

前記培養の方法としては、斜面（スラント）培養、平板（プレート）培養などの固体（寒天）培養や、液体培養のいずれであってもよいが、前記アフラトキシン産生阻害剤を大量に産生させる観点から、液体培養が好ましい。前記液体培養としては、振とう培養、静置培養、攪拌培養のいずれであってもよいが、振とう培養が好ましく、回転振とう培養がより好ましい。なお、大量培養を行う場合には、発酵槽等を用いて培養を行ってもよい。

前記培養の温度としては、前記Ｎｏ．２７株の発育が実質的に阻害されずに、アフラトキシン産生阻害剤を産生しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する産生菌に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜３７℃が好ましい。

前記培養の期間としては、特に制限はなく、アフラトキシン産生阻害剤の蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜７日間でアフラトキシン産生阻害剤の蓄積が最高となる。

（アフラトキシン汚染防除方法）
本発明のアフラトキシン汚染防除方法は、本発明の前記アフラトキシン産生阻害剤を用い、アフラトキシン産生菌によるアフラトキシン産生を阻害する方法であり、前記アフラトキシン産生菌が付着及び／又は感染した対象物、若しくは、前記アフラトキシン産生菌の付着及び／又は感染の発生を防止したい対象物に対し、前記アフラトキシン産生阻害剤を施用する方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記対象物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物体、農作物などが挙げられる。
前記農作物としては、例えば、トウモロコシ、コメ、ソバ、ハトムギ等の穀類；ピーナッツ、ピスタチオナッツ、ブラジルナッツ等のナッツ類；ナツメグ、唐辛子、パプリカ等の香辛料；コーヒー豆等の豆類；ゴマ類；綿実；などが挙げられる。

前記アフラトキシン産生阻害剤を施用する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アフラトキシン産生阻害剤をそのまま、又は水等で希釈した状態のアフラトキシン産生阻害剤を、散布（例えば、噴霧、ミスティング、アトマイジング、散粉、散粒、水面施用、箱施用等）する方法、土壌施用（例えば、混入、潅注等）する方法、表面施用（例えば、塗布、粉衣、被覆等）する方法、浸漬する方法などが挙げられる。

前記アフラトキシン産生阻害剤の施用量としては、特に制限はなく、アフラトキシン産生阻害剤中の有効成分の濃度、製剤の形態、対象病害や作物の種類、病害による被害の程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用あるいは併用する薬剤や肥料等の種類や使用量、気象などの種々の条件に応じて、適宜選択することができる。

前記アフラトキシン産生阻害剤の施用濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

（アフラトキシン産生阻害剤産生菌）
本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌は、ステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株（受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７）であり、該アフラトキシン産生阻害剤産生菌の培養物は、アフラトキシン産生阻害活性を有する。そのため、前記アフラトキシン産生阻害剤の産生菌として使用され得る。前記Ｎｏ．２７株の菌学的性状は、以下の通りである。

１．形態
（１）細胞の形態
光学顕微鏡（ＢＸ５０Ｆ４、オリンパス株式会社製）で観察したＮｏ．２７株の形態は、運動性を有するグラム陰性の桿菌であり（図１参照）、胞子は形成せず、菌体の大きさは、約０．７μｍ〜０．８μｍ×１．５μｍ〜２．０μｍであった。
なお、グラム染色は、フェイバーＧ（日水製薬株式会社製）を用いて行った。
（２）コロニーの形態
普通寒天培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ；Ｏｘｆｏｒｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い、３０℃で４８時間、好気的条件下で培養した結果、コロニーの色は黄色で、周縁は全緑であり、コロニーの形状は円形で、その直径は約２．０ｍｍ〜３．０ｍｍであり、隆起状態はレンズ状であり、コロニーの表面の形状はスムーズであり、透明度は不透明であり、粘稠度はバター様であった（図２参照）。

２．生理的性質
（１）生育温度範囲
普通寒天培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ；Ｏｘｆｏｒｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い、４℃、２０℃、３０℃、３７℃、４０℃、及び４５℃の各温度で４８時間、好気的条件下で培養した結果、４０℃及び４５℃では生育は認められず、４℃〜３７℃の範囲で生育した。
（２）培地
普通寒天培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ；Ｏｘｆｏｒｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に、２質量％塩化ナトリウム又は４質量％塩化ナトリウムを添加して、３０℃で４８時間、好気的条件下で培養した結果、４質量％塩化ナトリウムでは生育は認められず、２質量％塩化ナトリウムでは生育が認められた。
（３）酸素要求性
普通寒天培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ；Ｏｘｆｏｒｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い、嫌気条件下で、３０℃にて４８時間培養した結果、弱いながらも育成は認められた。
（４）カタラーゼ反応
カタラーゼ反応は、陽性であった。
（５）オキシダーゼ反応
オキシダーゼ反応は、陰性であった。
（６）グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）
グルコースからの酸／ガス産生は、陰性／陰性であった。
（７）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）
Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）は、陽性／陰性であった。
（８）ガラクトースの酸化
ガラクトースの酸化は、陰性であった。
なお、前記（４）〜（７）は、ＢＡＲＲＯＷ，（Ｇ．Ｉ．）ａｎｄＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ．）：ＣｏｗａｎａｎｄＳｔｅｅｌ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ．に記載の方法に基づき試験した。

３．生化学試験、資性化試験
ＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いた生化学試験及び資性化試験の結果は、下記表１に示すとおりであった。

４．１６ＳｒＤＮＡ遺伝子解析
１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１，４７２ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベース（アポロンＤＢ−ＢＡＢＬＡＳＴ）に登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、Ｎｏ．２７株の塩基配列は、以下に示すように、ステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。特に、ステノトロフォモナスリゾフィラ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）ｅ−ｐ１０株（ＷＯＬＦ（Ａ．）ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，５２，１９３７−１９４４参照）との相同性は、９９．５％であった。
なお、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子解析は、以下の条件で行った。
・サイクルシークエンス：ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
・プライマー：９Ｆ、７８５Ｆ、８０２Ｒ、及び１５１０Ｒ
・装置：ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１３０ ×１ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）
・塩基配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ１．４（ＴｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍＰｔｙＬｔｄ．，Ｔｅｗａｎｔｉｎ，ＡＵＳ）
・相同性検索及び簡易分子系統解析：
ソフトウェア：アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）
データベース：アポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）
国際塩基配列データベース：ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ

下記表２及び表３に、アポロンＤＢ−ＢＡ及び国際塩基配列データベースをそれぞれ用いてＢＬＡＳＴ検索を行った結果得られた、前記Ｎｏ．２７株の塩基配列と、他の菌株との上位３０塩基配列の相同率を示す。
また、図３に、前記Ｎｏ．２７株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。図３において、左下の下線はスケールバーを表し、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を表し、株名の末尾のＴはその種の基準株（Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ）を表す。

以上の結果より、前記Ｎｏ．２７株は、ステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）に属するものと考えられた。これらの中でもステノトロフォモナスリゾフィラ（Ｓ．ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）と最も近縁であったが、硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し（β−グルコシダーゼ活性）、レシチナーゼ活性を示し、キシロースを資化しない点などは、ステノトロフォモナスリゾフィラ（Ｓ．ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ）の性状と異なっていた。そこで、前記Ｎｏ．２７株をステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株とした。
なお、前記Ｎｏ．２７株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託申請し、平成２４年２月１５日に、受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７として受託された。前記Ｎｏ．２７株は、東京大学農学部弥生キャンパスの土壌より分離されたものであり、毒性がなく安全な細菌である。

なお、他の菌にも見られるように、前記Ｎｏ．２７株は、性状が変化することがあるが、例えば、前記Ｎｏ．２７株に由来する突然変異株（自然発生又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、アフラトキシン産生阻害活性を有するものは、本発明のアフラトキシン産生阻害剤産生菌に含まれる。

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
＜アフラトキシン産生阻害剤の製造＞
ベネット寒天培地（１質量％グルコース、０．２質量％ポリペプトン（日本製薬株式会社製、名古屋）、０．１質量％肉エキス（極東製薬工業株式会社製、東京）、０．１質量％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製、ＭＤ、ＵＳＡ）、残部水；ｐＨ７．２）でＮｏ．２７株を２６．５℃で１週間培養後、このＮｏ．２７株を三角フラスコ（５００ｍＬ容量）に入ったベネット液体培地１００ｍＬに植菌し、２６．５℃で２日間静置培養することにより前培養を行った。
この前培養液５ｍＬを三角フラスコ（５００ｍＬ容量）に入ったベネット液体培地１００ｍＬに植菌し、２６．５℃で５日間静置培養することにより培養液を得た。この培養液を以下の試験例１に用いた。更にこの培養液を０．２５μｍの無菌フィルターに通し、菌体を除去して得られた培養上清を以下の試験例２に用いた。

（試験例１）
＜胞子懸濁液１の調製＞
アフラトキシンＢ_１及びＧ_１の産生菌として、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓＮＲＲＬ２９９９（ＵＳＤＡ、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ、ＵＳＡより入手）をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；Ｄｉｆｃｏ社製、ＭＤ，ＵＳＡ）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、２．５×１０^３ＣＦＵ／μＬになるようＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含む蒸留水に懸濁して胞子懸濁液を調製した。

＜胞子懸濁液２の調製＞
アフラトキシンＢ_１の産生菌としてＡ．ｆｌａｖｕｓＩＭＦ４７７９８（ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓより入手）をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地；Ｄｉｆｃｏ社製、ＭＤ，ＵＳＡ）の斜面培地上で、２７℃で１４日間培養後、その菌叢より胞子を白金耳で掻きとり、２．５×１０^３ＣＦＵ／μＬになるようＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含む蒸留水に懸濁して胞子懸濁液を調製した。

＜＜アフラトキシン産生阻害活性の評価＞＞
生ピーナッツ（約１．５ｇ／個）が２０個入った三角フラスコ（１００ｍＬ容量）に、蒸留水１０ｍＬを加え、１２０℃で１５分間オートクレーブを行った。オートクレーブしたピーナッツ（６個）を実施例１の培養液に浸漬した後、２４ウェルのマイクロプレートに１個／ウェルずつ移した。
コントロールとして、実施例１の培養液の代わりにベネット液体培地にピーナッツ（６個）を浸漬した後、２４ウェルのマイクロプレートに１個／ウェルずつ移した。
これらのウェルに入ったピーナッツに、前記調製した胞子懸濁液１（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓＮＲＲＬ２９９９）又は胞子懸濁液２（Ａ．ｆｌａｖｕｓＩＭＦ４７７９８）を１０μＬ／ウェルずつ植菌し、２７℃で３日間静置培養した。

３日間培養後、ピーナッツの表面はいずれもカビの菌糸で覆われたが、カビの生育は、実施例１の培養液に浸したもの、コントロール共に良好であった。
カビの生育したピーナッツを１個ずつバイアル（直径１６．５ｍｍ、高さ４０ｍｍ）に移し、クロロホルム２．０ｍＬを加えてスパーテルで破砕し抽出した。得られた破砕抽出液０．１ｍＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、風乾によりクロロホルムを留去後、得られた残渣を０．１ｍＬの９０容量％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液を０．２５μｍの無菌フィルターに通した後、下記測定条件にて高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりアフラトキシンの質量を測定した。
また、下記測定条件にてアフラトキシンＢ_１の標準品（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＢ_１；Ｓｉｇｍａ社製）及びアフラトキシンＧ_１の標準品（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＧ_１；Ｓｉｇｍａ社製）を用いて検量線を作成し、実施例１の培養液に浸したピーナッツ及びコントロールのピーナッツ１個あたり（約１．５ｇ／個）のアフラトキシン質量（μｇ）を定量し、アフラトキシンＢ_１及びアフラトキシンＧ_１の合計質量（μｇ）及び該合計質量のピーナッツ６個の平均値を算出した。結果を下記表４及び図４に示す。
［ＬＣ／ＭＳの測定条件］
−ＨＰＬＣ−
・装置：２６９５ＨＰＬＣｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）
・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋＣ１８ｃｏｌｕｍｎＵＧ１２０（直径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、資生堂株式会社製）
・溶出液：Ａ１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／Ｂアセトニトリル
・溶出条件：Ａ：Ｂ＝９０：１０からＡ：Ｂ＝０：１００で１０分間の直線グラジエント溶出
・流量：０．２ｍＬ／分間
・保持時間：アフラトキシンＢ_１（１１．４５分間）
アフラトキシンＧ_１（１１．７９分間）
−ＭＳ−
・装置：ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
・イオン化：ＥＳＩ、ポジティブモード
・ソース温度：１２０℃
・脱溶媒温度：３５０℃
・コーン電圧：３０Ｖ
・脱溶媒ガス量：６００Ｌ／時間
・コーンガス量：５０Ｌ／時間
・キャピラリー電圧：２，８００Ｖ
・検出：アフラトキシンＢ_１ｍ／ｚ３１３（Ｍ＋Ｈ）^＋
アフラトキシンＧ_１ｍ／ｚ３２９（Ｍ＋Ｈ）^＋

表１の結果より、実施例１の培養液に浸漬することにより、アフラトキシン産生菌によるピーナッツへのアフラトキシン蓄積が明白に減少した。特にＡ．ｆｌａｖｕｓのピーナッツへのアフラトキシン蓄積を強く阻害した。

（試験例２）
実施例１の培養上清を、２４ウェルのマイクロプレートに、０．１ｍＬ／ウェル、０．３ｍＬ／ウェル、０．５ｍＬ／ウェル、０．７ｍＬ／ウェル、又は０．９ｍＬ／ウェル入れ、各ウェルの液体合計量が１ｍＬとなるようにポテトデキストロース液体培地を加えた。また、コントロールとして、実施例１の培養上清の代わりにポテトデキストロース液体培地を１ｍＬ／ウェル添加した。
それぞれのウェルに、試験例１で調製した胞子懸濁液１（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓＮＲＲＬ２９９９）又は胞子懸濁液２（Ａ．ｆｌａｖｕｓＩＭＦ４７７９８）を１０μＬ／ウェルずつ植菌し、２７℃で３日間静置培養した。

３日間培養後、それぞれのウェルの培養液をミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）で濾過し、菌体と濾液（培養上清）とに分離した。
前記菌体は、５ｍＬの蒸留水で洗浄後１．５ｍＬのマイクロチューブに移し、１００℃で３時間乾燥させた。乾燥後、菌体入マイクロチューブの質量を測定し、空のマイクロチューブの質量を差し引いた質量を菌体質量とした。
前記濾液は、該濾液１ｍＬをクロロホルム０．２ｍＬで抽出し、風乾によりクロロホルムを留去後、０．１ｍＬの９０容量％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液を０．２５μｍの無菌フィルターに通した後、試験例１と同様の方法で、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりアフラトキシンの質量を定量した。結果を表５に示す。また、胞子懸濁液１（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓＮＲＲＬ２９９９）を植菌した結果を図５Ａに、胞子懸濁液２（Ａ．ｆｌａｖｕｓＩＭＦ４７７９８）を植菌した結果を図５Ｂに示す。

表５において、「ｎｄ」は、検出限界以下を表す。

表２の結果より、実施例１の培養上清を０．５ｍＬ／ウェルあるいは０．７ｍＬ／ウェルの割合で添加した場合、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓあるいはＡ．ｆｌａｖｕｓのアフラトキシン産生がほぼ完全に阻害された。しかし、その際、カビの菌体質量には大きな変化はなく、実施例１の培養上清は、カビの生育にはほとんど影響を及ぼさなかった。

試験例２の結果より、Ｎｏ．２７株は、その培養上清にカビの生育を阻害せず、かつアフラトキシンの産生を特異的に阻害する物質を産生していることがわかった。そのアフラトキシン産生阻害物質が試験例１の培養液を用いた試験において、ピーナッツにおけるアフラトキシン産生を阻害していると推察される。
この結果より、Ｎｏ．２７株の培養液及びＮｏ．２７株の産生するアフラトキシン産生阻害物質は、共にアフラトキシン汚染防除に有効であることが示唆された。

ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７

本発明の新規微生物である受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株は、アフラトキシン産生阻害剤を産生するアフラトキシン産生阻害剤産生菌であり、前記Ｎｏ．２７株の培養物は、優れたアフラトキシン産生阻害活性を有することから、アフラトキシン産生阻害剤及びアフラトキシン汚染防除方法に好適に利用可能である。

Claims

受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株の培養物を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤。
受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株を培養する工程を少なくとも含むことを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤の製造方法。
請求項１に記載のアフラトキシン産生阻害剤を用い、アフラトキシン産生菌によるアフラトキシン産生を阻害することを特徴とするアフラトキシン汚染防除方法。
受託番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１４６７のステノトロフォモナススピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．２７株であることを特徴とするアフラトキシン産生阻害剤産生菌。