JP2013140170A - 前立腺癌の診断及び治療のためのバイオマーカー及びそれを用いて決定されるバイオマーカーアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】癌の診断、予後、治療及び治療のモニタリングのためのバイオマーカーアッセイ及び／又は薬剤標的を決定する改善された方法を提供する。
【解決手段】ヒト血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中のＡＳＰＮ；ＶＴＮ；ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４；ＡＫＡＰ１３；ＣＰ；ＣＰＥ；ＣＰＭ；ＩＣＡＭ１；ＭＳＭＢ：ＴＭ９ＳＦ３；ＧＡＬＮＴＬ４から得られる群から選択される、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定を用いた、特に良性の前立腺肥大との区別のための限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングの方法であって、前記測定が、これらのタンパク質／その断片の検出のために、タンデム質量分析技術に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌、特に前立腺癌（限局性であろうと非限局性であろうと）の診断及びその治療及び／又は予後のための、バイオマーカーアッセイ及び／又は薬剤標的の決定法の分野に関する。本発明のさらなる目的は、これらの診断目的及び／又は患者の層別化のための特異的バイオマーカーアッセイ、並びにこれらの特異的バイオマーカーアッセイを用いる診断法を提案する。

前立腺癌の診断及び治療は、１０年間の研究努力にもかかわらず、今もなお、臨床における主要な課題である。前立腺癌の進行は不幸にも無症状で、急速な進行及び潜在的に危険な病変を早期に発見することが患者の健康にとって極めて重要である。というのも、病気からの完全な回復及び治癒は、病気の初期の段階でのみ可能であるからだ。

前立腺癌に利用できる最も良い非侵襲診断検査は、直腸指診（ＤＲＥ）を併用した、血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検出である。ＰＳＡは、前立腺の上皮細胞によって生成されるタンパク質である。ＰＳＡは、カリクレインIII、セミニン、セミノゲラーゼ、γ−セミノプロテイン及びＰ−３０抗原としても知られており、正常な男性の血清に少量存在する３４ｋＤ糖タンパク質であるが、多くの場合、前立腺癌の存在下及び他の前立腺障害で上昇する。前立腺癌の早期発見のために現在利用できる最も効果的な検査は、ＤＲＥを伴用しての、ＰＳＡ測定のための血液検査である。正常値より高いＰＳＡは、限局性（ｌｏｃ）及び転移性（ｍｅｔ）前立腺癌（ＣａＰ）の両方に関係する。

ＰＳＡだけの診断精度は６０％ほどしかなく、その方法は選択性に主な欠点がある（不必要な前立腺生検又は手術を受ける間違った陽性症例が多すぎる）。実際、ＰＳＡレベルは、前立腺感染症、炎症、良性前立腺肥大症（肥大）又は過形成（ＢＰＨ）、及び射精直後（recent ejaculation）にも上昇し、誤った陽性結果を引き起こしてしまう。

従って、たとえ、各種パラメータ（例えばフリー及びトータルＰＳＡ）の同時測定に基づく新規の方法が、総合的な診断精度を上げるためのツールとして現れても、信頼性のある非侵襲性の診断／予後法はまだ不足している。血液中の大部分のＰＳＡは、血清タンパク質に結合しているが、少量はタンパク質に結合しておらず、フリーＰＳＡと呼ばれる。前立腺癌を有する男性では、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合は減少する。トータルＰＳＡに対するフリー（非結合）ＰＳＡの割合が２５％未満の場合、癌の危険性が高まる。この割合が低くなればなるほど、前立腺癌の確率は高くなる。しかしながら、トータル及びフリーＰＳＡはともに射精直後には上昇し、２４時間内に基準レベルまでゆっくりと戻るし、ＣａＰに関連しない他のメカニズムがトータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合に影響を与えることもあり得る。

診断同様、前立腺癌の治療及び／又は予後は、病気の多様性のために大きな課題を残している。前立腺癌の複合的なメカニズムが提案されたけれども、患者を層別化できる適切なシグネチャーや、治療介入法のためのキーとなる標的タンパク質の欠如は、今もなお実現可能な範囲にない。

従って、本発明の目的は、癌の診断、予後、治療及び治療のモニタリングのための、及び／又は、特に前立腺癌（限局性であろうと非限局性であろうと）の患者の層別化のためのバイオマーカーアッセイ及び／又は薬剤標的を決定する改善された方法を提供することである。留意すべき点は、原理的観点からは、提案の方法は癌に制限されることはなく、あらゆる種類のヒト又は動物の疾患又は機能障害に適応できる。実際の観点からは、以下に記載の翻訳アプローチのために使用できるモデル系の利用が限られる場合もある。

留意すべき点は、マウス（又は一般に動物、例えば非ヒト動物モデル）からの候補だけが本発明の一部ではないことである。潜在的なマーカー候補は、ヒト組織、近位体液（proximal fluids）、動物モデル細胞株、データマイニング等をも含む様々なソースから決めることができる。

しかしながら、バイオマーカー発見へのシステム生物学アプローチのより一般的な状況において、動物モデルの優位性はかなり際立っている。（様々な組織を襲う）様々な癌において、細胞網がかき乱されると仮定しよう。さらに、癌の異なる発現が同じ又は重複する擾乱を持ち得ると仮定すれば、どのように標的組織がこの擾乱に反応するかを究明するのに、マウス等の動物モデルは、擾乱を分離して又は擾乱を規定通り組み合わせて、特異的に適用することができる。その上さらに、この反応を構成するタンパク質のいくつかが、擾乱の直接の結果（例えばキナーゼが消失し又は変異した場合のホスホペプチドの喪失）又は代償性結果が標的組織に特定の指紋を残すと仮定すると、これらの指紋のいくつかは、我々が本明細書に記載する方法を用いて血清中に検出可能である。遺伝学的に明確なマウスモデルの顕著な特徴により、ヒト癌においても突然変異するとわかっている特定の遺伝子の突然変異と関連する変化を決定することが可能となり（我々の場合でいうと例えばＰＴＥＮ）、それゆえすぐに、検査及び治療される患者のサブクラスを提案する（オーダーメイド医療）。臨床試験を計画する際、有病率と罹患人口における分子マーカー種の頻度について確かな知識を持っていることが多くの場合重要となる。高い可能性で良い反応を示す患者を、いわゆる患者層別化プロセスで選択してもよい。この情報に基づいて、有効なコホートのサイズを、所定の正確なマーカープロファイルに対して推測できる。アーカイブした組織におけるレトロスペクティブ研究より、例えば、臨床段階のための計画が決定され本格的に開始される（fixed and committed）前に、素早く早期にこれらのパラメータを決定することができる。

本発明のさらなる目的は、これらの診断／治療／モニタリング／予後／患者層別化のための特異的バイオマーカーアッセイ、及びこれらの特異的バイオマーカーアッセイを用いる診断／治療／モニタリング／予後／患者層別化の方法を提案することである。

従って、第１の態様による本発明は、癌（又は一般的に言えば疾患／機能障害）の診断／治療／モニタリング／予後／患者層別化バイオマーカーアッセイの決定方法に関し、以下の工程を含む：
（ａ）健康な非ヒト哺乳類個体及び癌の非ヒト哺乳類個体由来の組織サンプルプロテオーム及び血清、血漿又はその他の血液派生物、又は血液そのもののサンプルプロテオーム中のタンパク質／ペプチド成分濃度（存在度）の測定に基づく、潜在的な候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーの同定、及び、健康なサンプルプロテオームと癌のサンプルプロテオームとの間で顕著な差のある動向（behavior)を示すものを、潜在的な候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーとして定性的に選択する行程。上述のように、この工程では、必ずしも非ヒトサンプルを用いなければならないわけではなく、ヒト組織、近位体液等のヒト源（human source）をこの工程のために用いることもできる。

この工程には、任意に、工程（ｂ）が続くことができる。つまり、健康な非ヒト哺乳類個体及び癌の非ヒト哺乳類個体由来の血清、血漿又はその他の血液派生物、又は血液そのもののサンプルプロテオーム中にある潜在的な候補タンパク質バイオマーカーの定量的な質量分析測定による、工程（ａ）で同定された潜在的な候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーの検証、及び、健康なサンプルプロテオームと癌のサンプルプロテオームとの間に質量分析測定可能な量的に差のある動向を示すものを、候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーとして選択する工程が続くことができる。もちろん、質量分析は１つの方法に過ぎないが、この検証工程における好ましい測定方法であることも確かである。例えば、親和性試薬を用いる別の方法も、診断／予後／治療のために最終的に用いられるべき方法と類似又は同一のやり方で使用することができる。

その後、工程（ｃ）が続く。つまり、工程（ａ）で同定され、又は任意に工程（ｂ）で検証された候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーの、健康なヒト個人及び癌のヒト個人由来の血清、血漿又はその他の血液派生物、又は血液そのもののサンプルプロテオーム中にある候補タンパク質バイオマーカーの質量分析測定及び／又は抗体に基づく決定による確認、及び、健康なサンプルプロテオームと癌のサンプルプロテオームとの間に、質量分析的に測定可能な、及び／又は親和性試薬に基づくアッセイ、好ましくは抗体に基づくアッセイで検出可能な差のある動向を示すものを、タンパク質／ペプチドバイオマーカーとして選択する工程が続き、
（ｄ）癌を有する患者を検出するためのシグネチャーとして、工程（ｃ）で確認されたタンパク質／ペプチドバイオマーカーの１つ又はその群を発見するために、統計的手法を適用する工程を含む。

好ましくは、上述のように、親和性試薬に基づく決定は、抗体に基づく決定方法／アッセイであり、例えば、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、又はマルチプレックス・ビーズ・アレイ・アッセイ（Multiplex Bead Array Assay）、又は特異的タンパク質濃度の測定を目的とする他の方法であるように選択される。

上述のように、この方法は、癌のバイオマーカーの系（systems）の決定に適用できるだけでなく、生命体の他の種類の疾病又は機能障害のためのバイオマーカーの系の決定にも適用できる。このような場合、上記方法においては（明細書の以下の詳解においても）、「癌の」（例えばサンプルに対して）という表現は、実質的に「病気の」又は「機能障害の」という表現によって置き換えられるべきである。

従って、本発明が提供するものの１つは、一方で、（前立腺）癌の発見のための非侵襲的診断法の精度を高めるための、及び臨床診療で用いられる新しい治療／画像化標的を同定するための概念である。我々は、（前立腺）癌バイオマーカー及び／又は薬剤標的同定用のプロトコルを確立した。これについては、図１に要約し、以下でより詳細に説明する。このアプローチは次の３つの主な特徴（aspect）に基づいている：
（Ｉ）明確な遺伝子マウスモデルを用いた、インビボでの、候補バイオマーカー及び／又は薬剤標的の最初の同定、及びヒトの臨床サンプルでのその後の確認に基づく翻訳アプローチ、
（II）Ｎ結合型糖タンパク質の分離、同定及び定量化のために、我々のラボで構築した、最先端の質量分析に基づく手法及びバイオインフォマティックス法、これに、
（III）前立腺癌を有する患者を発見するための特定のシグネチャーを見出すための多変量解析法が続く。

提案する方法の第１の好ましい実施形態によると、本発明の方法は前立腺癌の診断に適用される。この目的のために、癌のサンプルプロテオームを、前立腺癌を有する個体のサンプルプロテオームであるように選択する。さらに、組織サンプルは前立腺組織サンプルとし、これらは限局性又は非限局性前立腺癌を有するサンプルとすることができる。これに対応して、誘導タンパク質／ペプチドバイオマーカーを、前立腺癌の兆候であるとして選択し、前立腺癌の治療、又は前立腺癌の治療のモニタリングのために使用できる。

提案する方法のさらなる実施形態によると、工程（ａ）で、サンプルプロテオーム由来のタンパク質として、糖タンパク質、好ましくはＮ結合型糖タンパク質だけを選択する。というのも、これらが癌の薬剤標的及びバイオマーカーの発見との関連で、関連性の高いサブプロテオームを構成するからである。

好ましくは、この工程（ａ）の第１の段階で、対応するサンプルのプロテオームを、好ましくはトリプシン及び／又はＬｙｓ Ｃ（しかしながら他の消化系も可能）を用いて消化し、続いて固相抽出を用いて（好ましくは、以下でより詳しく説明するＳＰＥＧ法を用いて）抽出する。決定したバイオマーカーは、それに対応して、Ｎ結合型糖タンパク質及び／又はそのペプチド断片であることが好ましい。

原理的には、少なくとも工程（ａ）に対し、及び具体的にはその組織サンプルに対し細胞培養システムを用いることができる。しかしながら、ヒトの疾患又は機能障害の複雑さをより厳密に再現するために、サンプルを生体源由来であるように選択すると好ましく、最も好ましくは非ヒト哺乳類個体をマウスと選択し、好ましくは、工程（ａ）のサンプル用のマウスの前立腺組織を、プロテオームの分析及び／又はさらなる治療の前に、前立腺組織から血液を完全に取り除くためにかん流させる（他の疾患又は機能障害の場合は、対応する組織又は臓器を類似に処理することができる）。

既に上で明らかにしたように、いくつかの理由により、動物モデルが好ましい。この選択には以下の３つの主なポイントがある：
−サンプルが同種、すなわちサンプルの出所である個体が遺伝子的に同一で、同じ病変を有する
−病変が、ヒトの癌で観察される病変に相当し、正確に腫瘍成長をまねる
−再現可能：非常によく似たサンプルを何度も繰り返して作製でき、これはヒトでは不可能である
−定義済みの擾乱。ヒトでは、癌に至る擾乱を制御することはできない。動物モデルでは、擾乱を単独で又は組み合わせて、特定の時間、特定の方法で、組織に適用することが出来る。

工程（ａ）でタンパク質／その断片を単に同定した後、好ましくは、健康なサンプル源と癌のサンプル源との間に十分区別できる差のある動向を示すタンパク質／その断片だけを選択する。この目的のために、測定したシグナルの差のある動向（差のある存在量）を観察し、十分に差のある動向を示したシグナル（特定のタンパク質／その断片に相当）だけをさらなる評価のため次の工程のために選択する。

差のある動向とは、健康なサンプルのシグナルと癌のサンプルのシグナルとを比較したとき、特定のシグナルが十分に増加／減少している状態であるか、癌の（又は健康な）サンプルのシグナルにシグナルがなく、健康な（又は癌の）サンプルのシグナルに明らかに検知できるシグナルがある状態であってもよい。従って、好ましい実施形態によると、工程（ａ）において十分に差のある動向が存在すると決めるための選択基準は、以下の群から選択される：
前立腺組織及び血清で調節されるバイオマーカー；前立腺組織で調節され血清で検出される潜在的バイオマーカー；前立腺組織で調節され分泌される潜在的バイオマーカー；癌を有するマウスの前立腺組織及び血清で検出されるだけの潜在的バイオマーカー；癌の組織又は血清で調節される、前立腺に特異的な潜在的バイオマーカー；前立腺に特異的で分泌される潜在的バイオマーカー；好ましくは４より大きい倍数分で(by a factor of more than four)、前立腺組織又は血清で高度に調節される(highly regulated)潜在的バイオマーカー；好ましくは癌の進行時の公知の生物学的機能によって特徴付けられる、知識に基づく選択に優先する（prior）潜在的バイオマーカー；又はこれらの組み合わせ、好ましくは、これらの基準のうち少なくとも５つ又は最も好ましくは全ての組み合わせが使用される。これらのうち、好ましくは特に、以下の基準の組み合わせが、人間の診断／治療のために最終的に使用できるバイオマーカーの系につながる：前立腺組織及び血清で調節されるバイオマーカー；前立腺組織で調節され血清で検出される潜在的バイオマーカー；前立腺組織で調節され分泌される潜在的バイオマーカー；好ましくは４より大きい倍数分で(by a factor of more than four)、前立腺組織又は血清で高度に調節される(highly regulated)潜在的バイオマーカー；好ましくは癌の進行時の公知の生物学的機能によって特徴付けられる、知識に基づく選択に優先する潜在的バイオマーカー。

好ましくは、選択（選択とは、対応するタンパク質／その断片（タンパク質又はこのようなタンパク質の断片を意味する）が次の工程に入ることを意味する）は、健康なサンプルのシグナルと癌のサンプルのシグナルの間の比（factor）が、１．５を超えるか、又は０．７５未満の場合に起こる。これは特に、上記選択基準の最初の３つに適用される。

通常、工程（ａ）では、サンプルの消化されたタンパク質のタンパク質／ペプチドが、（ショットガン）質量分析技術を用いて、第１の段階で同定され、第２の段階で、液体クロマトグラフィー／質量分析技術の組み合わせ、好ましくはラベルフリー定量法が、健康なサンプル及び癌のサンプルとの間の差のある特性（通常は差のある存在度）の識別のために使用される。好ましくは、工程（ａ）で、質量分析的に検出されたタンパク質／タンパク質断片のシグナルを、質量分析シグナルを特定のタンパク質／タンパク質断片に起因させるデータベース情報を用いることによって、対応するタンパク質に起因させる。

さらなる好ましい実施形態によると、工程（ｂ）にて、量的内標準、好ましくは特異的に合成した（specifically synthesised）内標準を用いて、絶対的定量を達成する。

さらに好ましくは、工程（ｂ）及び／又は工程（ｃ）で、質量分析法として、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）を好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせた、タンデム質量分析技術を用いる。本明細書を妥当な範囲に維持するため、これらの技術及びその定義及びパラメータに関しては、出版物B. Domon and R. Aebersold, 「質量分析及びタンパク質分析」（Science 312, 121 (2006)）及びこれに引用されている対応する参考文献を参考されたい。これらの文献の開示は、プロテオーム解析のためのこれらの解析ツールに関して、本明細書に明示的に含まれる。

本発明はさらに、上記の方法を用いて決定され得る、又はそのような方法を用いて特異的に決定され得る、癌診断バイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的に関する。特に、このようなバイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的は、対応する方法の説明にてさらに以下で述べるようなセット（set）から成ってよく、例えば、限局性前立腺癌のための癌診断／治療バイオマーカーアッセイは、限局性前立腺癌のモニタリング、特に良性の前立腺肥大との区別のために、ヒト血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ；ＶＴＮ；ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４；ＡＫＡＰ１３；ＣＰ；ＣＰＥ；ＣＰＭ；ＩＣＡＭ１；ＭＳＭＢ：ＴＭ９ＳＦ３；ＧＡＬＮＴＬ４から得られる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定に基づくことができる。ここに挙げた遺伝子名、本明細書全体において一般的に使用されるエントリー名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義される通りである。これらのタンパク質／その断片の検出のために、好ましくは、測定はタンデム質量分析技術、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）をより好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせたもの、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行われる。

さらに、本発明は、上記の方法を用いて決定され得る、又はそのような方法を用いて特異的に決定され得る、癌診断バイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的に関する。特に、このようなバイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的は、対応する方法の説明にてさらに以下で述べるようなセットから成ってよく、例えば、限局性前立腺癌のための癌診断／治療バイオマーカーアッセイは、ＡＳＰＮ、及び任意にＶＴＮに、ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４誘導タンパク質及び／又はその断片の１つを組み合わせたものに基づくことができる。

さらに、本発明は、ヒト血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもの中の、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ又は少なくとも５つのタンパク質／ペプチドバイオマーカー（例えば上に挙げた方法に従って決定される）の測定を含む、（ヒトの）疾患又は機能不全の、好ましくは癌の、最も好ましくは前立腺癌（限局性又は非限局性）の診断、治療及び／又は治療モニタリングのための癌診断／治療バイオマーカーアッセイに関する。このアッセイは、例えば、酵素免疫吸着法等の抗体に基づくアッセイであってよいが、ＬＣ−ＳＲＭアッセイであってもよい。

このような癌診断バイオマーカーアッセイの信頼性を高めるため、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等のさらなる系の検出のために、親和性試薬に基づくアッセイ、例えば、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイと組み合わすことができる。また、これに関しては、例えばビーズテクニックを用いる一連の抗体の多重化技術も可能である。

本発明は、さらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片、及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の（好ましくは組み合わせた）測定を用いた、限局性前立腺癌の診断方法に関する。精度を高めるために、１つの（又はいくつかの）さらなる測定、つまり、ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１から得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定を行うことが好ましい。ＰＳＡ測定と組み合わせる場合、さらなるタンパク質／その断片は、さらに、ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２から選択することができる。

好ましくは、このような方法において、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）を液体クロマトグラフィー（通常先に行う）と組み合わせて使用して測定が行われる。選択的に又は付加的に、これらのタンパク質／その断片の検出のために、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いることができる。組み合わせアプローチが可能であり、例えば、１つの系（又は系の群）をＳＲＭ（例えばＥＬＩＳＡが利用できない場合）を用いて決定し、残りの系をＥＬＩＳＡ技術等の抗体に基づく技術を用いることによって決定することができる。

このような方法では、通常、限局性前立腺癌の確定診断のためには、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、任意で同時に、ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が３５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

好ましくは（as preferred）、さらに、上述の付加的な系の１つを測定する場合、
ＡＯＣ３誘導タンパク質／その断片の濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２２０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＬＯＸ誘導タンパク質／その断片の濃度は５８０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＰＧＣＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は５５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５７０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は３３０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３２５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは３２２５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＴＨＢＳ１誘導タンパク質／その断片の濃度は１２５００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３５００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＬＧＡＬＳ３ＢＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は３９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＧＯＬＰＨ２誘導タンパク質／その断片の濃度は８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度は３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度は３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度は２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

好ましくは、このような方法において、測定は、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の、ＡＳＰＮ；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４から得られる群から選択される少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定を用いて、良性の前立腺肥大から区別するための限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのために行われる。診断／モニタリングのために、好ましくは、さらに、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、親和性試薬に基づく、好ましくは酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いて測定する。さらに好ましくは、確定診断のためには、前立腺特異抗原の濃度が、２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

本明細書において、好ましくは、限局性前立腺癌の確定診断又はモニタリングのためには、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、及び／又は、ＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が、３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、及び／又は、ＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度が、３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、及び／又は、ＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度が、２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

上に挙げた及び以下で詳しく説明する閾値濃度に関して留意すべきは、これらは、特定の測定技術に依存してもよく、例えばここで用いる方法、つまりＳＲＭは全種、つまり例えば遊離種及び結合種を測定するが、例えば、ＥＬＩＳＡ等の抗体に基づくアッセイは、これら２つの形を区別することができるため、後者の方法を用いる場合には異なる閾値濃度となる。従ってここで挙げる値は、特にＳＲＭ法を用いる測定に関するものであって、異なる方法を用いる場合には類推によって（by analogy）値を状況に合わせて変えなければならない。しかしながら、これは、この分野の当業者の技術範囲内の変更の範疇である。

本発明はさらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもの中の、ＡＳＰＮ及びＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１及びＧＡＬＮＴＬ４及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の測定を、好ましくはＰＳＡＰ；ＧＳＰＴ１；ＣＥＡＣＡＭ１；ＨＹＯＵ１；ＥＦＮＡ５；ＫＩＴから得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定を組み合わせて用いる、転移性前立腺癌の診断のための極めて高精度な方法に関する。

好ましくは、限局性前立腺癌の診断方法の上記場合のように、測定は、これらのタンパク質／その断片の検出のために、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を、より好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせて用いて、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づく方法を用いて行われる。

非局限性（転移性）前立腺癌の確定診断のためには、
ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは６８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
ＣＴＳＤ誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３３ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
ＴＨＢＳ１誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１１５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０７５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、同時に、
ＧＡＬＮＩＬ４誘導タンパク質／断片の濃度が、１４００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１６００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１６５０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が、３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３１５０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

好ましくは、さらに、上述の付加的な系の１つを測定する場合、
ＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が３３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３４０００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＧＳＰＴ１誘導タンパク質／その断片の濃度が４５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌより高く、より好ましくは５１０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＣＥＡＣＡＭ１誘導タンパク質／その断片の濃度が３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず（この閾値はＥＬＳＡ決定に関連して計算したものでしかない）、
及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは８９ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＥＦＮＡ５誘導タンパク質／その断片の濃度が６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＫＩＴ誘導タンパク質／その断片の濃度が９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９５ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

上述のように、限局性又は非限局性前立腺癌診断のために、上述の系の測定を、上記のようなバイオマーカー決定法の結果ではない、血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもののさらなるパラメータの測定と組み合わせることが有利である。例えば、診断のために、さらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのものの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の対応する抗体に基づくアッセイを用いて測定することが可能で、この場合確定診断のためには、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度が通常２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

本発明のさらなる実施形態は、従属請求項に示す。

図１は、バイオマーカーの探索、検証及び確認のための統合プロテオミクス手法の概略である。このスキームは２つの主要なセクションに分けられ、つまり、１つ目は、動物モデルを用いて行われる発見及び検証段階であり、２つ目は、人間の患者のサンプルを用いての確認段階である。イタリック体の数字は、次の行程のために同定及び考慮される糖タンパク質の数を示し、ａ）では、Ｃａｐのマウスモデルからの前立腺組織を用いてインビボＣａｐ−特異的シグネチャーを発見するため、健康なマウスと癌のマウスからの組織及び血清からＮ−グリコペプチドの選択的濃縮を行った。これにより、後の行程のためのリソースとして機能する７８５の糖タンパク質の目録（catalogue）が作成可能である。ＭＳに基づくラベルフリー定量を、同じマウスの組織及び血清サンプルに行った。この結果、癌サンプルと良性サンプルを比べて３５２の糖タンパク質の相対定量ができた。その後、基準に合致する１６４の糖タンパク質をさらなる調査のために選んだ。ｂ）で、これらのバイオマーカー候補４１を、マウスの血清で確認できた。ｃ）にて、ＭＳに基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）及びＥＬＩＳＡにより、人間の患者で４３の候補が確認できた。ヒト段階と動物段階との間の境界はフレキシブルであり、例えば、このような収集が実際に利用可能であれば、人間のサンプルにおいて検証段階を行うこともできる。 図２は、マウスのグリコプロテオーム目録の概略であり、マウスの前立腺組織及び血清で同定されたタンパク質の数をベン図に表す。定量化できたタンパク質の数を下に示す。 図３は、多変量法での選択した候補の判別精度を示す。患者を、統計ソフトウエアによって生成したルールに従って分類する。正しい予測の％を、モデルの精度として定義する。上に示したように、遺伝子名は欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義された通りである。最初の行の影付きの項目は、どの系が１つのアッセイ内で交換可能かを示す。

添付の図に、本発明の好ましい実施例を示す。
図に関して、これらは本発明の目下の好ましい実施形態を説明するためのものであって、これを制限するためのものではない。図１はバイオマーカーの探索、検証及び確認のための統合プロテオミクス手法の概略を示す。このスキームは２つの主要なセクションに分けられる、つまり、１つ目は、動物モデル（マウス）を用いて行われる発見及び検証段階（ａ）及び（ｂ）であり、２つ目は、人間の患者のサンプルでの確認段階（ｃ）である。

以下の例では、本方法を前立腺癌用のバイオマーカーの決定に適用する。上記のように、しかしながら、これは、本方法を同等に乳癌、肺癌、卵巣癌等の他の種類の癌に適用してよく、また、一般的に、多尿（糖尿病及び他のタイプのもの）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病等の神経変性疾患、多発性硬化症、関節リュウマチ等の自己免疫疾患、マラリア、ＨＩＶ等の感染病、高血圧、アテローム性動脈硬化等の心疾患等の他のタイプの疾患又は機能障害にも同等に適用してもよいため、本発明の実際の主旨と解釈されるべきではない。上記のように、動物モデル研究の主な強みは、特定の定義された擾乱を適用でき、これらの因果関係が測定されることである。同じ擾乱はまた他の種類の癌にも関係することができ、このことは、疾患関連等の一般用語が示唆することとは対称的に、誘導される擾乱の合理的根拠の結果としてマーカーを見ることができるということを意味する。

最初の発見段階では、健康なマウスと前立腺癌のマウスそれぞれに対し、前立腺組織サンプル、血清サンプル及び両方が使用され、その結果４つの異なるシリーズの実験となるが、差のある動向の決定のために、健康な／癌のマウスの組織サンプルだけを比較し、他方、健康な／癌のマウスの血清を比較した。

第１の工程（ａ）では、組織（以下より詳細に記載するように作製した）及び血清サンプルをトリプシンを用いて消化し、対応するプロテオーム消化物から、Ｎ結合型糖化タンパク質断片を選択し、ＳＰＥＧ技術（以下より詳細に記載する）を用いて抽出した。

その後、この段階では差のある動向を決定せずに、糖タンパク質同定を質量分析法、特にショットガン法を用いて行った。この結果、トータルで、前立腺組織中に検出された糖タンパク質が５３２、血清中に検出された糖タンパク質が２５３であった。組織及び血清中に検出されたタンパク質は１１０であり、計７８５の糖タンパク質が検出された（図２に図示した）。

ラベルフリー定量と名付けた次の段階は、タンパク質断片のシグナルの差のある動向の検出を目的とする。この実験は液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた実験で、クロマトグラフィーの溶出プロフィールに従って質量分析が行われる。この実験を用いて、健康なサンプルと癌のサンプルとの間の差のある動向を追跡することができる。このラベルフリー定量段階で差のある動向を示さなかったシグナル／タンパク質断片は、前述の７８５の糖タンパク質から棄却し、定量化タンパク質は３５２となった。このうち２７９は組織サンプルから生じたもので、１６０は血清サンプルから生じたものである（図２に示す）。

これら３５２の定量化タンパク質は、さらに、顕著な差のある動向を示し、以下の表１に挙げて論じる８個の論理的根拠の少なくとも1つに適合するものだけが維持されるように選択される。これは、論理的根拠を用いたフィルタリング後、１６４の潜在的候補バイオマーカーの系となり、これらは、電子アノテーションを用いた、特定の糖タンパク質へシグナルを帰属させた結果として生じたものである。

第２工程（ｂ）では任意で、非ヒト系を用いた検証、というより認定（qualification）が行われるが、最終的なバイオマーカーアッセイ法のために使用される最終的な分析ツールが使用される。それに従って、この工程（ｂ）では、健康な／癌のマウスの血清だけが分析され、同じく消化されて、（ａ）について述べたように糖タンパク質が抽出されるが、その後、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、すなわち液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を、特異的に定めた（合成した）絶対量測定のための内標準を用いた系の絶対量測定のために使用する。

工程（ｂ）に入った１６４の系から、４１だけが、主に実際の理由から、絶対的に定量することができた。対応する４１の系を、以下より詳しく説明した表２に挙げる。

従って、次の工程に対しては、工程（ａ）から結果として生じた１６４の系全てを、確認である最終工程（ｃ）のために使用する。工程（ｂ）の結果を、さらに、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ウエスタンブロット法を用いて検証する。

工程（ｃ）では、基本的に、工程（ｂ）と同じ処置が行われるが、今度は、健康な／癌の個人のヒト由来の血清サンプルを用いて行われる。ＳＲＭ側から、これは、３７候補に至った。可能な限り、工程（ｃ）に入った１６４候補を利用可能なＥＬＩＳＡ法を用いてさらに確認し、さらに１１の可能性のある候補に至った。

一定の系はＳＲＭ検証及びＥＬＩＳＡ確認によって生じるという事実により、これは、最終的に４３の候補バイオマーカー系となった。これらを表３に載せる。

主要な観点から、これらのいずれかを、できる限り１つ又は数個組み合わせて、前立腺癌の検出のための分析において使用することができる。

できるだけ高精度を保ちながら、必要な測定の数を減らすことを考え、患者のデータ収集物との相関関係において、統計的手法（より詳細な説明については以下で見る）を４３全ての系に適応し、図３に挙げる最終的な分析に至った。

５つの特に高精度な分析を図３Ａ）に挙げるが、これらのすべてに、ＡＳＰＮ及びＶＴＮが存在することに留意しなければならない。従って、これに対応して、これらの遺伝子由来の糖タンパク質、というよりもこれらの糖タンパク質の断片は、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）と限局性前立腺癌（ｌｏｃＰＣａ）との区別の高い指標となる。対応する精度は、８０％を超え、ＰＳＡ法の現状の精度より約２０％ほど高い。

ＥＬＩＳＡを用いたＰＳＡ測定を付加的に組み込むと、図３Ｂ）に挙げるような、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａとを識別するためのバイオマーカーアッセイがさらに９個統計的に見つかる。これらの系の全てにも、ＡＳＰＮ及びＶＴＮ誘導糖タンパク質が存在する。これらの組み合わせ測定の精度は、ＰＳＡ測定を考慮しない場合よりさらに１０％高く、前立腺癌の検出に対し、今までのところ未到の極めて高い精度となった。

ＥＬＩＳＡを用いるＰＳＡ測定を付加的に組み込んで、より多くのデータを用いると、図３Ｃ）に挙げるような、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａとを識別するためのバイオマーカーアッセイがさらに５個統計的に見つかる。これら系のそれぞれには、ＡＳＰＮ、ＯＬＦＭ４、ＨＹＯＵ１、ＣＴＳＤ誘導糖タンパク質の群の系のうちの３つが存在する。対応する精度は、同じく８０％を超え、ＰＳＡ法の現状の精度より約２０％ほど高い。

最後に、図３Ｄ）には、ｌｏｃＰＣａとｍｅｔＣＰａとを識別するためのバイオマーカーアッセイに対する統計的結果を挙げる。各アッセイにおいて６個の系を組み合わせて測定することにより、１００％の精度が達成される。

このように、提案する方法は、高精度のバイオマーカーアッセイの開発を目的とする強力なツールを提供するだけでなく、さらに、前立腺癌の特定の状況に対し、対応して決定されたバイオマーカーアッセイが、これまでに文献で報告されているものを超える予想外に高い精度を有することを示すのがわかる。

実験の詳細：
（Ｉ）翻訳アプローチ：
翻訳アプローチは、前立腺癌に対するマウスモデルでの興味ある（interesting）候補バイオマーカーの最初の同定、及びヒトの臨床サンプルでのこのような候補の確認に基づく。臨床で使用される候補バイオマーカーを確定した診断又は治療標的として同定するために、我々は、前立腺癌を発症している遺伝子的に明確なマウス（Ｐｔｅｎ条件付きノックアウト、ｃＫＯ、例えばＵＳ ２００６／００６４７６８参照）及び正常なＰｔｅｎ対立遺伝子を有しこのような腫瘍を発症しない対照マウスからの前立腺組織及び血液の分析を開始した。

マウスモデルを用いるための論理的根拠：
我々は、遺伝子的に明確なＰｔｅｎ条件付きノックアウトモデルを用いることを決めた。なぜならば、これらのマウスは腫瘍抑制遺伝子Ｐｔｅｎの欠失を受けて、早期の上皮前立腺癌を発症するためである。この表現型はヒトの限局性前立腺癌と密接に関係しており、そのため、良性の過形成病変（良性前立腺肥大症又はＢＰＨ）からヒト限局性前立腺癌を区別することのできる新規のバイオマーカーの同定のための理想的な出発点となる。さらに、Ｐｔｅｎ ｃＫＯマウスモデルを使用することによって、ＰＴＥＮ突然変異を有するか、又はＰＴＥＮシグナル伝達経路に沿った突然変異によって生じる何らかのアンバランスを有する層別化された患者専用に用いられる、治療／画像標的及びバイオマーカーが同定できるようになる。マウスモデルの使用は、高度に不均一なヒト組織とは対照的に、前立腺組織が非常に均一で、環境条件及びタイミング等の主要変数を制御することができるため、候補バイオマーカーの最初の同定を容易にする。興味深いことに、前立腺癌組織量と総血液量の比は、人間に比べマウスでは４０〜４００００倍も高い。これは、もちろん、血液プロテオーム中の変化がヒトの患者サンプルよりこのようなモデルにおいてよりはっきりわかることが期待されるため、本質的な利点である。最後に、血液汚染を除去するために、マウスの組織だけを効果的にかん流させることができる（以下を参照）。組織の血液タンパク質汚染は、多くの場合、特に低濃度で存在するタンパク質の同定を隠してしまう。さらに、かん流後組織に血液が存在しないことにより、なんら潜在的なバイアスなしに、比較プロテオミクス（血液−組織）を適応できるようになる（表１、論理的根拠１，２，４，７参照）。

ヒト血清での確認のための興味あるタンパク質の選択
マウスの血清及び組織中に検出した１６５の糖タンパク質を、ターゲット質量分析を通した検証及びその後のヒト臨床サンプルでの確認のために選択した。この明細書で通常使用される、遺伝子名、エントリー名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義された通りである。注釈又は予測される細胞局在は、Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H.(2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc. 2, 953-711に従う。

マウスを用いて細胞培養系を用いない論理的根拠：
プロテオミクス技術は、インビトロの細胞株に容易に適応されるが、インビボモデルの使用には、より複雑な取り扱い及び初期のトラブルシューティングが必要とされる。しかしながら、我々は、インビボモデルを用いることに決めた。なぜならば、これは、インビトロモデルに比べて、ヒト疾患の複雑さをより厳密に模倣するからである。従って、今日、新鮮分離臓器に適用されるスクリーンはわずかなので、ここに呈示するアプローチは珍しい。

組織及び血液の抽出法：
マウスを麻酔して、左心室をピンで留めて血液を抜き出す。次にマウスの心臓をかん流させる。これにより、前立腺組織から血液を完全に抜き出すことができる。その後、組織サンプルを解剖し、純粋な前立腺組織を、液体窒素の存在下で、直ちに瞬間凍結させ（snap-frozen）、乳鉢と乳棒を用いて細かく砕く。血清を血液から抽出し、−８０℃にて使用するまで保存する。

（II）最新の質量分析法（ＭＳ）及びバイオインフォマティクス：Ｎ結合型グリコプロテオームに焦点を合わせる論理的根拠：
候補バイオマーカーを見つけるために、我々は、特に関連の高いサブプロテオームである、Ｎ結合型糖化タンパク質に焦点を合わせることに決めた。タンパク質のグリコシル化は、長い間、共通の翻訳後修飾として認識されてきた。通常、グリカンはセリン又はトレオニン残基に結合されるか（Ｏ結合型グリコシル化）、又はアスパラギン残基に結合される（Ｎ結合型グリコシル化）。Ｎ結合型グリコシル化部位は大抵、ＮｘＳ／Ｔ配列モチーフ（ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸を示す）に該当する（fall into）。タンパク質のグリコシル化は、細胞外空間に存在するタンパク質の特徴的な翻訳後修飾である。これは、腫瘍によって特異的に分泌され又は流され、血流に放出されるタンパク質（それらを価値の高いバイオマーカー候補とする）の大部分がグリコシル化されることを意味する。さらに、糖タンパク質の濃縮により、特に低濃度で存在する興味ある候補の正体を暴露できる。なぜなら、組織サンプル中の細胞骨格タンパク質及び血清サンプル中のアルブミン（３５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する）等の、非常に豊富なグリコシル化されていない関係のないタンパク質は、測定から排除されるからである。

Ｎ結合型グリコペプチド抽出法及び定量化：
Ｎ結合型糖タンパク質を同定するために、我々は、Zhang, H., Li, X. J., Martin, D.B., and Aebersold, R.(2003) ヒドラジド化学、安定同位体標識法及び質量分析法を用いるＮ結合型糖タンパク質の同定及び定量化、Nat Biotechnol 21, 660-666（この開示は、ＳＰＥＧに関する説明に明示的に含まれる）に従う、組織及び血清からのＮ−グリコペプチド固相抽出法（ＳＰＥＧ）を用いた。グリコペプチドをそのグリカン部分を介して固体担体に結合させる。その後、グリコシル化されてないペプチドを洗い流して、Ｎ−グリコペプチドを酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて特異的に放出できる。この方法は組織及び血清に同様に適用することができる。

トランスプロテオミクスパイプライン（ＴＰＰ）ソフトウエア・スイート及びＳｕｐｅｒＨｉｒｎ（例えば、Mueller et al. 定量的プロテオミクスデータに基づく質量分析のためのソフトウエア・ソリューションの評価、J Proteome Res (2008) vol.7 (1) pp.51-61参照）と組み合わせて、使用する質量分析機器セットアップ（ＬＴＱ−ＦＴインスツルメント）の高い質量精度及び保持時間再現性により、共通のペプチド特性の同定及びダイレクトなラベルフリー定量が可能となった。これにより、異なるパイプ（run）からのペプチド溶出プロフィールを比較し、糖タンパク質比率を、同じタンパク質に属するＮ−グリコペプチドから計算した。

検証及び確認段階：
最初の発見段階からの我々の結果を検証するために、様々な論理的根拠によって選択された興味あるタンパク質のリストを、選択反応モニタリング（ＳＲＭ、例えば、Stahl-Zeng, J., Lange, V., Ossola, R., Eckhardt, K., Krek, W., Aebersold, R., and Domon, B. (2007) Ｎ−グリコサイトの多重反応モニタリングによる血漿タンパク質の高感度検出、Mol Cell Proteomics 6, 1809-1817参照）を用いたターゲット質量分析によって、対応するマウス血清中で定量化した。

この新規のアプローチは、感度という点で従来の免疫検出法（例えば、酵素免疫吸着法ＥＬＩＳＡ）に匹敵するタンパク質の検出及び定量を同時に可能とし、バイオマーカー候補それぞれに対する面倒な最適化ステップや新しい抗体の生成を必要としないという利点を有する。ＳＲＭ実験は、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーション用の化合物のペアレントマス（parent mass）を特定し、その後単独のフラグメントイオンを具体的にモニタリングすることにより達成される。このようにして、ＳＲＭは、非常に複雑なマトリックスの真ん中にモニタリング及び定量可能な特有のフラグメントイオンを送る。標的Ｎ−グリコサイト（脱グリコシル化された形の、無傷のタンパク質中でＮ−グリコシル化されたペプチド）に対応する、安定同位体ラベルのペプチドを合成し、内標準として使用した。これにより、マウスの血清中に存在する内因性糖タンパク質の絶対的定量が可能となった（表２）。

生後８週及び１８週での、対照及び前立腺癌を有するマウスからのマウス血清中のＳＲＭによって測定された４１の血清糖タンパク質のリスト。０．０５未満（ｂｅｌｏｗ）のｐ値は、対応するタンパク質に対し、通常のマウス（ｎ＝３）と前立腺癌を有するマウス（ｎ＝３）との間に統計的に顕著な差があることを示す。実験は、８週及び１８週のマウスに対して行った。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。

対照マウス（健常）及び前立腺癌を有する（癌の）マウスの血清中の興味ある各ペプチドに特異的なフラグメンテーションチャンネルをモニタリングすることにより、高感度・高選択な分析を行った。その後、マウスで検出した潜在的バイオマーカーのヒトの相同分子種を、標準ＥＬＩＳＡ技術及び同じくターゲット質量分析を用いて、ヒト血清で確認した。

（III）多変量統計法：多変量法を用いることの論理的根拠及び利点：
シグネチャー又はバイオマーカーの組み合わせ検出は、単独バイオマーカー検出の使用に比べ、診断精度を高めることになり得る。これは、トータル及びフリーＰＳＡを前立腺癌の診断のために同時に用いる場合にも当てはまる。われわれのケースでは、一団の候補バイオマーカーを測定して、ＢＰＨと限局性前立腺癌（ｌｏｃＰＣａ）とを、又は限局性と非限局性、つまり転移性前立腺癌（ｍｅｔＰＣａ）とを、最も良く判別することのできるシグネチャーが何かを求めることができる。さらに、我々は、全てのシグネチャーで共通に共有されるバイオマーカーが何かを見出し、これらを知的財産に関して価値が高いものとすることができる。バイオマーカーシグネチャーに基づいて患者を分類するために、我々は、二次判別分析を行った。二次判別分析の目的は、個体で測定される独立変数（バイオマーカー）に基づき、個体を２以上のグループ（例えば、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａ）の１つに配分するルールを決定することである。このルールを記述するパラメータは、既に公知の分類を有する全ての個体の変数分析から算出される。判別ルールのバイアスを見積もるために、我々は、Ｊａｃｋｎｉｆｅ ｌｅａｖｅ ｏｎｅ−ｏｕｔ交差検定を適用する。分析は、統計ソフトウエアパッケージＳＹＳＴＡＴ１２及びＳＰＳＳ１４．０を用いて行った。

結果：
最初に、我々は、対照及び癌を患っているマウスの両方のかん流前立腺組織及び血清から、Ｎ−グリコペプチドを抽出した。我々は、前立腺組織から全部で６４２の糖タンパク質を、血清から２５３の糖タンパク質を同定し、１１０のタンパク質を共通に検出した。我々は全部で７８５のＮ−糖タンパク質を含む目録を作成することができた。最初のマウスの糖タンパク質の目録から、我々は、癌を有するマウスからのサンプルと、それらそれぞれの対照とを比較して、組織から２７９の糖タンパク質を、血清から１６０の糖タンパク質を定量化することができた（図２）。これらのタンパク質から、表１に挙げた論理的根拠の少なくとも１つを満たす１６５の糖タンパク質が、潜在的なバイオマーカーであると発見し、さらなる検証のために選択した。

マウスの血清サンプルにＳＲＭを用いることにより、我々は、１６５の最初の候補から４１を検証し定量化できた（表２）。

ＳＲＭによってマウスの血清で既にテストされた、あるいはマウスの前立腺組織から最初の発見段階で目立った有望な候補であった４６の候補バイオマーカー（表３）を、さらに、５２のヒトの血清サンプルで確認した。これは、ＥＬＩＳＡ及びＳＲＭを適用することにより行った。

ヒト血清で測定された４６の血清糖タンパク質のリスト。
選択したバイオマーカー候補を、ＳＲＭ又はＥＬＩＳＡによって分析した。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。

統計的分析：
統計的分析を受けて、我々は、アスポリン（ＡＳＰＮ）、ビトロネクチン（ＶＴＮ）及び膜銅アミンオキシダーゼ（ＡＯＣ３）からなる３−バイオマーカーシグネチャーを同定できた。このシグネチャーは、ＢＰＨ（ｎ＝１５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）患者の識別で８１％の精度を有した。つまり、このことは、我々の３−バイオマーカーシグネチャーによって、分析された患者の８１％が正確に診断されたことを意味する。ＡＯＣ３は、最も弱い寄与因子であることがわかった。従って我々はこのタンパク質を他の潜在的なバイオマーカーで置き換え、同様又はより高い精度（≧８０％）を得るものを維持した。このようにして、次のタンパク質を個々に付け加えることができた：ＬＯＸ、ＰＧＣＰ、ＰＳＡＰ、ＴＨＢＳ１（図３Ａ）。

ＰＳＡ自身の判別も同様に測定し、７１％の精度で、ＢＰＨ（ｎ＝１５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）患者を識別した。

さらに、我々は、ＰＳＡのデータをＡＳＰＮ及びＶＴＮのコアシグネチャーに加えた。次のタンパク質の１つを含むことにより、最大９０％の精度を達成した（図３Ｂ）。ＡＯＣ３、ＣＦＨ、ＣＬＵ、ＫＩＴ、ＬＯＸ、ＴＦＲＣ、ＴＨＢＳ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＧＯＬＰＨ２。

より多くのデータを用いた統計的分析を受けて、我々は、アスポリン（ＡＳＰＮ）、カテプシン（ＣＴＳＤ）、低酸素上方調節タンパク質１（ＨＹＯＵ１）、及びオルファクトメジン−４（ＯＬＦＭ４）を含む５−バイオマーカーシグネチャーをさらに同定できた。このシグネチャーは、ＢＰＨ（ｎ＝３５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝４１）の患者の識別で８７％の精度を有した。つまりこのことは、分析された患者の８７％が、我々の５−バイオマーカーシグネチャーによって正確に診断できたことを意味する。ＰＳＡ自身の識別も同様に測定したが、その結果、ＢＰＨ（ｎ＝４１）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝６４）の患者の識別は７２％の精度であった（図３Ｃ）。

さらに、各ケースでこれら４つのタンパク質の１つだけを取り除くことにより、最大８３％の精度を達成した（図３Ｃ）。

同じデータセットを用いて、表３による系からの選択にいくらかあまり厳しくない基準（somewhat less stringent criterion）を適用することにより、バイオマーカーの精密なリストを決めて表４に集める。表４に挙げる系の少なくとも３つの群を、ＰＳＡ（ＥＬＩＳＡ）測定と組み合わせて用いた分析により、約８０％かそれを超える精度に至った。ＰＳＡ（ＥＬＩＳＡ）測定と組み合わせて、表４に挙げる系の少なくとも４つを選択すると、約８５％かそれを超える精度にさえ至った。

表４に挙げる系のそれぞれに対する閾値は濃度閾値を示し、この上側又は下側（示すように）で確定診断を下すことができる。１つのアッセイ（例えば、表４から選択した３つのバイオマーカーの群）のマーカーの全ての濃度が、これらの濃度値を超える場合、上述の精度で確定診断を下すことができる。

統計的分析（ＢＰＨ（ｎ＝３５）及びｌｏｘＰＣａ（ｎ＝４１））後のヒトの血清で測定される１５の血清糖タンパク質の精密なリスト。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。１つ目の列には、基本濃度の閾値をｎｇ／ｍｌで示し、２つ目の列には、好ましい濃度の閾値をｎｇ／ｍｌで示す。ＯＤと記されたところは、４０５ｎｍで測定が行われ、相対値は市販の抗体（ＣＲＥ：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ポリクローナル：Ｎｒ．ＡＦ３５８７、及びＲ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、モノクローナル：ＭＡＢ３５８７； ＭＳＭＢ：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ポリクローナル：Ｎｒ．ＡＦ３７８０、及びＡｂｎｏｖａ、モノクローナル：Ｈ００００４４７７−Ｍ０８）を用いて与える。

ｂ）以下のバイオマーカーを含むバイオマーカーシグネチャーを用いて、我々は、ケースの１００％で、ｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）とｍｅｔＰＣａ（ｎ＝２１）患者を正確に区別できた：アスポリン（ＡＳＰＮ）、ビトロネクチン（ＶＴＮ）、カテプシンＤ（ＣＳＴＤ）、ポリペプチド・Ｎ−アセチル−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ ＧＡＬＮＴＬ４、ポリアクチベーター・ポリペプチド（ＰＳＡＰ）及びトロンボスポンジン−１（ＴＨＢＳ−１）。ＰＳＡＰは、最も弱い寄与因子であることが分かった。これを除外しても、識別分析の９７％精度が達成された。従って、我々は、他の潜在的バイオマーカーでこのタンパク質を置き換え、精度を高めたもの（＞９７％）を維持した。このようにして、以下のタンパク質を個々に加えることができた：ＣＥＡＣＡＭ１、ＥＦＮＡ５、ＧＳＰＴ１、ＨＹＯＵ１、ＫＩＴ（全てにおいて１００％の精度が得られた）（図３）。

留意しなければならない点は、表３に挙げる系のいずれか、好ましくは２つの組み合わせ、最も好ましくは少なくとも３つ（又はちょうど３つ）の組み合わせ、少なくとも４つ（又はちょうど４つ）の、又は少なくとも５つ
（又はちょうど５つ）の糖タンパク質の組み合わせとしての系が、本発明によってカバーされるアッセイであり得る点である。上記のような特定の統計的に評価される系は、これらの統計的なテストに取り組まれる診断的側面に対し最も効果を発揮すると示し得るものである。異なる診断／予後／治療側面又は異なる統計的評価法を使用するために、異なる組み合わせもまた可能であり、本発明によるものと見なされるべきである。

本発明は、癌、特に前立腺癌の診断目的及び／又は患者の層別化のための特異的バイオマーカーアッセイ、並びにこれらの特異的バイオマーカーアッセイを用いる診断法に関す る。

前立腺癌の診断及び治療は、１０年間の研究努力にもかかわらず、今もなお、臨床における主要な課題である。前立腺癌の進行は不幸にも無症状で、急速な進行及び潜在的に危険な病変を早期に発見することが患者の健康にとって極めて重要である。というのも、病気からの完全な回復及び治癒は、病気の初期の段階でのみ可能であるからだ。

前立腺癌に利用できる最も良い非侵襲診断検査は、直腸指診（ＤＲＥ）を併用した、血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検出である。ＰＳＡは、前立腺の上皮細胞によって生成されるタンパク質である。ＰＳＡは、カリクレインIII、セミニン、セミノゲラーゼ、γ−セミノプロテイン及びＰ−３０抗原としても知られており、正常な男性の血清に少量存在する３４ｋＤ糖タンパク質であるが、多くの場合、前立腺癌の存在下及び他の前立腺障害で上昇する。前立腺癌の早期発見のために現在利用できる最も効果的な検査は、ＤＲＥを伴用しての、ＰＳＡ測定のための血液検査である。正常値より高いＰＳＡは、限局性（ｌｏｃ）及び転移性（ｍｅｔ）前立腺癌（ＣａＰ）の両方に関係する。

ＰＳＡだけの診断精度は６０％ほどしかなく、その方法は選択性に主な欠点がある（不必要な前立腺生検又は手術を受ける間違った陽性症例が多すぎる）。実際、ＰＳＡレベルは、前立腺感染症、炎症、良性前立腺肥大症（肥大）又は過形成（ＢＰＨ）、及び射精直後（recent ejaculation）にも上昇し、誤った陽性結果を引き起こしてしまう。

従って、たとえ、各種パラメータ（例えばフリー及びトータルＰＳＡ）の同時測定に基づく新規の方法が、総合的な診断精度を上げるためのツールとして現れても、信頼性のある非侵襲性の診断／予後法はまだ不足している。血液中の大部分のＰＳＡは、血清タンパク質に結合しているが、少量はタンパク質に結合しておらず、フリーＰＳＡと呼ばれる。前立腺癌を有する男性では、トータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合は減少する。トータルＰＳＡに対するフリー（非結合）ＰＳＡの割合が２５％未満の場合、癌の危険性が高まる。この割合が低くなればなるほど、前立腺癌の確率は高くなる。しかしながら、トータル及びフリーＰＳＡはともに射精直後には上昇し、２４時間内に基準レベルまでゆっくりと戻るし、ＣａＰに関連しない他のメカニズムがトータルＰＳＡに対するフリーＰＳＡの割合に影響を与えることもあり得る。

診断同様、前立腺癌の治療及び／又は予後は、病気の多様性のために大きな課題を残している。前立腺癌の複合的なメカニズムが提案されたけれども、患者を層別化できる適切なシグネチャーや、治療介入法のためのキーとなる標的タンパク質の欠如は、今もなお実現可能な範囲にない。

従って、本発明の目的は、癌の診断、予後、治療及び治療のモニタリングのための、及び／又は、特に前立腺癌（限局性であろうと非限局性であろうと）の患者の層別化のための改善されたバイオマーカーアッセイ及び／又は薬剤標的を提供することである。留意すべき点は、原理的観点からは、提案の方法は癌に制限されることはなく、あらゆる種類のヒト又は動物の疾患又は機能障害に適応できる。実際の観点からは、以下に記載の翻訳アプローチのために使用できるモデル系の利用が限られる場合もある。

留意すべき点は、マウス（又は一般に動物、例えば非ヒト動物モデル）からの候補だけが本発明の一部ではないことである。潜在的なマーカー候補は、ヒト組織、近位体液（proximal fluids）、動物モデル細胞株、データマイニング等をも含む様々なソースから決めることができる。

しかしながら、バイオマーカー発見へのシステム生物学アプローチのより一般的な状況において、動物モデルの優位性はかなり際立っている。（様々な組織を襲う）様々な癌において、細胞網がかき乱されると仮定しよう。さらに、癌の異なる発現が同じ又は重複する擾乱を持ち得ると仮定すれば、どのように標的組織がこの擾乱に反応するかを究明するのに、マウス等の動物モデルは、擾乱を分離して又は擾乱を規定通り組み合わせて、特異的に適用することができる。その上さらに、この反応を構成するタンパク質のいくつかが、擾乱の直接の結果（例えばキナーゼが消失し又は変異した場合のホスホペプチドの喪失）又は代償性結果が標的組織に特定の指紋を残すと仮定すると、これらの指紋のいくつかは、我々が本明細書に記載する方法を用いて血清中に検出可能である。遺伝学的に明確なマウスモデルの顕著な特徴により、ヒト癌においても突然変異するとわかっている特定の遺伝子の突然変異と関連する変化を決定することが可能となり（我々の場合でいうと例えばＰＴＥＮ）、それゆえすぐに、検査及び治療される患者のサブクラスを提案する（オーダーメイド医療）。臨床試験を計画する際、有病率と罹患人口における分子マーカー種の頻度について確かな知識を持っていることが多くの場合重要となる。高い可能性で良い反応を示す患者を、いわゆる患者層別化プロセスで選択してもよい。この情報に基づいて、有効なコホートのサイズを、所定の正確なマーカープロファイルに対して推測できる。アーカイブした組織におけるレトロスペクティブ研究より、例えば、臨床段階のための計画が決定され本格的に開始される（fixed and committed）前に、素早く早期にこれらのパラメータを決定することができる。

本発明の目的は、これらの診断／治療／モニタリング／予後／患者層別化のための特異的バイオマーカーアッセイ、及びこれらの特異的バイオマーカーアッセイを用いる診断／治療／モニタリング／予後／患者層別化の方法を提案することである。

好ましくは、上述のように、親和性試薬に基づく決定は、抗体に基づく決定方法／アッセイであり、例えば、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、又はマルチプレックス・ビーズ・アレイ・アッセイ（Multiplex Bead Array Assay）、又は特異的タンパク質濃度の測定を目的とする他の方法であるように選択される。

上述のように、この方法は、癌のバイオマーカーの系（systems）の決定に適用できるだけでなく、生命体の他の種類の疾病又は機能障害のためのバイオマーカーの系の決定にも適用できる。このような場合、上記方法においては（明細書の以下の詳解においても）、「癌の」（例えばサンプルに対して）という表現は、実質的に「病気の」又は「機能障害の」という表現によって置き換えられるべきである。

従って、本発明が提供するものの１つは、一方で、（前立腺）癌の発見のための非侵襲的診断法の精度を高めるための、及び臨床診療で用いられる新しい治療／画像化標的を同定するための概念である。

本発明はさらに、上記の方法を用いて決定され得る、又はそのような方法を用いて特異的に決定され得る、癌診断バイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的に関する。特に、このようなバイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的は、対応する方法の説明にてさらに以下で述べるようなセット（set）から成ってよく、例えば、限局性前立腺癌のための癌診断／治療バイオマーカーアッセイは、限局性前立腺癌のモニタリング、特に良性の前立腺肥大との区別のために、ヒト血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ；ＶＴＮ；ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４；ＡＫＡＰ１３；ＣＰ；ＣＰＥ；ＣＰＭ；ＩＣＡＭ１；ＭＳＭＢ：ＴＭ９ＳＦ３；ＧＡＬＮＴＬ４から得られる群から選択される、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定に基づくことができる。ここに挙げた遺伝子名、本明細書全体において一般的に使用されるエントリー名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義される通りである。これらのタンパク質／その断片の検出のために、好ましくは、測定はタンデム質量分析技術、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）をより好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせたもの、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行われる。

本発明は、癌診断バイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的に関する。特に、このようなバイオマーカーアッセイ及び／又は治療標的は、対応する方法の説明にてさらに以下で述べるようなセットから成ってよく、例えば、限局性前立腺癌のための癌診断／治療バイオマーカーアッセイは、ＡＳＰＮ、及び任意にＶＴＮに、ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４誘導タンパク質及び／又はその断片の１つを組み合わせたものに基づくことができる。

本発明は、ヒト血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもの中の、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ又は少なくとも５つのタンパク質／ペプチドバイオマーカーの測定を含む、（ヒトの）疾患又は機能不全の、好ましくは癌の、最も好ましくは前立腺癌（限局性又は非限局性）の診断、治療及び／又は治療モニタリングのための癌診断／治療バイオマーカーアッセイに関する。このアッセイは、例えば、酵素免疫吸着法等の抗体に基づくアッセイであってよいが、ＬＣ−ＳＲＭアッセイであってもよい。

このような癌診断バイオマーカーアッセイの信頼性を高めるため、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等のさらなる系の検出のために、親和性試薬に基づくアッセイ、例えば、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイと組み合わすことができる。また、これに関しては、例えばビーズテクニックを用いる一連の抗体の多重化技術も可能である。

本発明は、さらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片、及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の（好ましくは組み合わせた）測定を用いた、限局性前立腺癌の診断方法に関する。精度を高めるために、１つの（又はいくつかの）さらなる測定、つまり、ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１から得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定を行うことが好ましい。ＰＳＡ測定と組み合わせる場合、さらなるタンパク質／その断片は、さらに、ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２から選択することができる。

好ましくは、このような方法において、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）を液体クロマトグラフィー（通常先に行う）と組み合わせて使用して測定が行われる。選択的に又は付加的に、これらのタンパク質／その断片の検出のために、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いることができる。組み合わせアプローチが可能であり、例えば、１つの系（又は系の群）をＳＲＭ（例えばＥＬＩＳＡが利用できない場合）を用いて決定し、残りの系をＥＬＩＳＡ技術等の抗体に基づく技術を用いることによって決定することができる。

このような方法では、通常、限局性前立腺癌の確定診断のためには、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、任意で同時に、ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が３５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

好ましくは（as preferred）、さらに、上述の付加的な系の１つを測定する場合、
ＡＯＣ３誘導タンパク質／その断片の濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２２０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＬＯＸ誘導タンパク質／その断片の濃度は５８０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＰＧＣＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は５５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５７０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は３３０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３２５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは３２２５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＴＨＢＳ１誘導タンパク質／その断片の濃度は１２５００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３５００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＬＧＡＬＳ３ＢＰ誘導タンパク質／その断片の濃度は３９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＧＯＬＰＨ２誘導タンパク質／その断片の濃度は８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度は３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度は３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
及び／又はＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度は２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

好ましくは、このような方法において、測定は、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の、ＡＳＰＮ；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４から得られる群から選択される少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定を用いて、良性の前立腺肥大から区別するための限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのために行われる。診断／モニタリングのために、好ましくは、さらに、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、親和性試薬に基づく、好ましくは酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いて測定する。さらに好ましくは、確定診断のためには、前立腺特異抗原の濃度が、２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

本明細書において、好ましくは、限局性前立腺癌の確定診断又はモニタリングのためには、ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、及び／又は、ＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が、３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、及び／又は、ＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度が、３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、及び／又は、ＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度が、２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない。

上に挙げた及び以下で詳しく説明する閾値濃度に関して留意すべきは、これらは、特定の測定技術に依存してもよく、例えばここで用いる方法、つまりＳＲＭは全種、つまり例えば遊離種及び結合種を測定するが、例えば、ＥＬＩＳＡ等の抗体に基づくアッセイは、これら２つの形を区別することができるため、後者の方法を用いる場合には異なる閾値濃度となる。従ってここで挙げる値は、特にＳＲＭ法を用いる測定に関するものであって、異なる方法を用いる場合には類推によって（by analogy）値を状況に合わせて変えなければならない。しかしながら、これは、この分野の当業者の技術範囲内の変更の範疇である。

本発明はさらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもの中の、ＡＳＰＮ及びＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１及びＧＡＬＮＴＬ４及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の測定を、好ましくはＰＳＡＰ；ＧＳＰＴ１；ＣＥＡＣＡＭ１；ＨＹＯＵ１；ＥＦＮＡ５；ＫＩＴから得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定を組み合わせて用いる、転移性前立腺癌の診断のための極めて高精度な方法に関する。

好ましくは、限局性前立腺癌の診断方法の上記場合のように、測定は、これらのタンパク質／その断片の検出のために、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を、より好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせて用いて、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づく方法を用いて行われる。

非局限性（転移性）前立腺癌の確定診断のためには、
ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは６８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、ＣＴＳＤ誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３３ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
ＴＨＢＳ１誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１１５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０７５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、同時に、
ＧＡＬＮＩＬ４誘導タンパク質／断片の濃度が、１４００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１６００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１６５０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が、３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３１５０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

好ましくは、さらに、上述の付加的な系の１つを測定する場合、
ＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が３３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３４０００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＧＳＰＴ１誘導タンパク質／その断片の濃度が４５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌより高く、より好ましくは５１０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＣＥＡＣＡＭ１誘導タンパク質／その断片の濃度が３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず（この閾値はＥＬＳＡ決定に関連して計算したものでしかない）、
及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは８９ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＥＦＮＡ５誘導タンパク質／その断片の濃度が６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
及び／又はＫＩＴ誘導タンパク質／その断片の濃度が９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９５ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

上述のように、限局性又は非限局性前立腺癌診断のために、上述の系の測定を、上記のようなバイオマーカー決定法の結果ではない、血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのもののさらなるパラメータの測定と組み合わせることが有利である。例えば、診断のために、さらに、ヒトの血清、血漿又はその他の血液の派生物、又は血液そのものの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の対応する抗体に基づくアッセイを用いて測定することが可能で、この場合確定診断のためには、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度が通常２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならない。

本発明のさらなる実施形態は、従属請求項に示す。

図１は、バイオマーカーの探索、検証及び確認のための統合プロテオミクス手法の概略である。このスキームは２つの主要なセクションに分けられ、つまり、１つ目は、動物モデルを用いて行われる発見及び検証段階であり、２つ目は、人間の患者のサンプルを用いての確認段階である。イタリック体の数字は、次の行程のために同定及び考慮される糖タンパク質の数を示し、ａ）では、Ｃａｐのマウスモデルからの前立腺組織を用いてインビボＣａｐ−特異的シグネチャーを発見するため、健康なマウスと癌のマウスからの組織及び血清からＮ−グリコペプチドの選択的濃縮を行った。これにより、後の行程のためのリソースとして機能する７８５の糖タンパク質の目録（catalogue）が作成可能である。ＭＳに基づくラベルフリー定量を、同じマウスの組織及び血清サンプルに行った。この結果、癌サンプルと良性サンプルを比べて３５２の糖タンパク質の相対定量ができた。その後、基準に合致する１６４の糖タンパク質をさらなる調査のために選んだ。ｂ）で、これらのバイオマーカー候補４１を、マウスの血清で確認できた。ｃ）にて、ＭＳに基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）及びＥＬＩＳＡにより、人間の患者で４３の候補が確認できた。ヒト段階と動物段階との間の境界はフレキシブルであり、例えば、このような収集が実際に利用可能であれば、人間のサンプルにおいて検証段階を行うこともできる。 図２は、マウスのグリコプロテオーム目録の概略であり、マウスの前立腺組織及び血清で同定されたタンパク質の数をベン図に表す。定量化できたタンパク質の数を下に示す。 図３は、多変量法での選択した候補の判別精度を示す。患者を、統計ソフトウエアによって生成したルールに従って分類する。正しい予測の％を、モデルの精度として定義する。上に示したように、遺伝子名は欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義された通りである。最初の行の影付きの項目は、どの系が１つのアッセイ内で交換可能かを示す。

添付の図に、本発明の好ましい実施例を示す。
図に関して、これらは本発明の目下の好ましい実施形態を説明するためのものであって、これを制限するためのものではない。図１はバイオマーカーの探索、検証及び確認のための統合プロテオミクス手法の概略を示す。このスキームは２つの主要なセクションに分けられる、つまり、１つ目は、動物モデル（マウス）を用いて行われる発見及び検証段階（ａ）及び（ｂ）であり、２つ目は、人間の患者のサンプルでの確認段階（ｃ）である。

以下の例では、本方法を前立腺癌用のバイオマーカーの決定に適用する。上記のように、しかしながら、これは、本方法を同等に乳癌、肺癌、卵巣癌等の他の種類の癌に適用してよく、また、一般的に、多尿（糖尿病及び他のタイプのもの）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病等の神経変性疾患、多発性硬化症、関節リュウマチ等の自己免疫疾患、マラリア、ＨＩＶ等の感染病、高血圧、アテローム性動脈硬化等の心疾患等の他のタイプの疾患又は機能障害にも同等に適用してもよいため、本発明の実際の主旨と解釈されるべきではない。上記のように、動物モデル研究の主な強みは、特定の定義された擾乱を適用でき、これらの因果関係が測定されることである。同じ擾乱はまた他の種類の癌にも関係することができ、このことは、疾患関連等の一般用語が示唆することとは対称的に、誘導される擾乱の合理的根拠の結果としてマーカーを見ることができるということを意味する。

最初の発見段階では、健康なマウスと前立腺癌のマウスそれぞれに対し、前立腺組織サンプル、血清サンプル及び両方が使用され、その結果４つの異なるシリーズの実験となるが、差のある動向の決定のために、健康な／癌のマウスの組織サンプルだけを比較し、他方、健康な／癌のマウスの血清を比較した。

第１の工程（ａ）では、組織（以下より詳細に記載するように作製した）及び血清サンプルをトリプシンを用いて消化し、対応するプロテオーム消化物から、Ｎ結合型糖化タンパク質断片を選択し、ＳＰＥＧ技術（以下より詳細に記載する）を用いて抽出した。

その後、この段階では差のある動向を決定せずに、糖タンパク質同定を質量分析法、特にショットガン法を用いて行った。この結果、トータルで、前立腺組織中に検出された糖タンパク質が５３２、血清中に検出された糖タンパク質が２５３であった。組織及び血清中に検出されたタンパク質は１１０であり、計７８５の糖タンパク質が検出された（図２に図示した）。

ラベルフリー定量と名付けた次の段階は、タンパク質断片のシグナルの差のある動向の検出を目的とする。この実験は液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた実験で、クロマトグラフィーの溶出プロフィールに従って質量分析が行われる。この実験を用いて、健康なサンプルと癌のサンプルとの間の差のある動向を追跡することができる。このラベルフリー定量段階で差のある動向を示さなかったシグナル／タンパク質断片は、前述の７８５の糖タンパク質から棄却し、定量化タンパク質は３５２となった。このうち２７９は組織サンプルから生じたもので、１６０は血清サンプルから生じたものである（図２に示す）。

これら３５２の定量化タンパク質は、さらに、顕著な差のある動向を示し、以下の表１に挙げて論じる８個の論理的根拠の少なくとも1つに適合するものだけが維持されるように選択される。これは、論理的根拠を用いたフィルタリング後、１６４の潜在的候補バイオマーカーの系となり、これらは、電子アノテーションを用いた、特定の糖タンパク質へシグナルを帰属させた結果として生じたものである。

第２工程（ｂ）では任意で、非ヒト系を用いた検証、というより認定（qualification）が行われるが、最終的なバイオマーカーアッセイ法のために使用される最終的な分析ツールが使用される。それに従って、この工程（ｂ）では、健康な／癌のマウスの血清だけが分析され、同じく消化されて、（ａ）について述べたように糖タンパク質が抽出されるが、その後、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、すなわち液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を、特異的に定めた（合成した）絶対量測定のための内標準を用いた系の絶対量測定のために使用する。

工程（ｂ）に入った１６４の系から、４１だけが、主に実際の理由から、絶対的に定量することができた。対応する４１の系を、以下より詳しく説明した表２に挙げる。

従って、次の工程に対しては、工程（ａ）から結果として生じた１６４の系全てを、確認である最終工程（ｃ）のために使用する。工程（ｂ）の結果を、さらに、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ウエスタンブロット法を用いて検証する。

工程（ｃ）では、基本的に、工程（ｂ）と同じ処置が行われるが、今度は、健康な／癌の個人のヒト由来の血清サンプルを用いて行われる。ＳＲＭ側から、これは、３７候補に至った。可能な限り、工程（ｃ）に入った１６４候補を利用可能なＥＬＩＳＡ法を用いてさらに確認し、さらに１１の可能性のある候補に至った。

一定の系はＳＲＭ検証及びＥＬＩＳＡ確認によって生じるという事実により、これは、最終的に４３の候補バイオマーカー系となった。これらを表３に載せる。

主要な観点から、これらのいずれかを、できる限り１つ又は数個組み合わせて、前立腺癌の検出のための分析において使用することができる。

できるだけ高精度を保ちながら、必要な測定の数を減らすことを考え、患者のデータ収集物との相関関係において、統計的手法（より詳細な説明については以下で見る）を４３全ての系に適応し、図３に挙げる最終的な分析に至った。

５つの特に高精度な分析を図３Ａ）に挙げるが、これらのすべてに、ＡＳＰＮ及びＶＴＮが存在することに留意しなければならない。従って、これに対応して、これらの遺伝子由来の糖タンパク質、というよりもこれらの糖タンパク質の断片は、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）と限局性前立腺癌（ｌｏｃＰＣａ）との区別の高い指標となる。対応する精度は、８０％を超え、ＰＳＡ法の現状の精度より約２０％ほど高い。

ＥＬＩＳＡを用いたＰＳＡ測定を付加的に組み込むと、図３Ｂ）に挙げるような、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａとを識別するためのバイオマーカーアッセイがさらに９個統計的に見つかる。これらの系の全てにも、ＡＳＰＮ及びＶＴＮ誘導糖タンパク質が存在する。これらの組み合わせ測定の精度は、ＰＳＡ測定を考慮しない場合よりさらに１０％高く、前立腺癌の検出に対し、今までのところ未到の極めて高い精度となった。

ＥＬＩＳＡを用いるＰＳＡ測定を付加的に組み込んで、より多くのデータを用いると、図３Ｃ）に挙げるような、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａとを識別するためのバイオマーカーアッセイがさらに５個統計的に見つかる。これら系のそれぞれには、ＡＳＰＮ、ＯＬＦＭ４、ＨＹＯＵ１、ＣＴＳＤ誘導糖タンパク質の群の系のうちの３つが存在する。対応する精度は、同じく８０％を超え、ＰＳＡ法の現状の精度より約２０％ほど高い。

最後に、図３Ｄ）には、ｌｏｃＰＣａとｍｅｔＣＰａとを識別するためのバイオマーカーアッセイに対する統計的結果を挙げる。各アッセイにおいて６個の系を組み合わせて測定することにより、１００％の精度が達成される。

このように、提案する方法は、高精度のバイオマーカーアッセイの開発を目的とする強力なツールを提供するだけでなく、さらに、前立腺癌の特定の状況に対し、対応して決定されたバイオマーカーアッセイが、これまでに文献で報告されているものを超える予想外に高い精度を有することを示すのがわかる。

実験の詳細：
（Ｉ）翻訳アプローチ：
翻訳アプローチは、前立腺癌に対するマウスモデルでの興味ある（interesting）候補バイオマーカーの最初の同定、及びヒトの臨床サンプルでのこのような候補の確認に基づく。臨床で使用される候補バイオマーカーを確定した診断又は治療標的として同定するために、我々は、前立腺癌を発症している遺伝子的に明確なマウス（Ｐｔｅｎ条件付きノックアウト、ｃＫＯ、例えばＵＳ ２００６／００６４７６８参照）及び正常なＰｔｅｎ対立遺伝子を有しこのような腫瘍を発症しない対照マウスからの前立腺組織及び血液の分析を開始した。

マウスモデルを用いるための論理的根拠：
我々は、遺伝子的に明確なＰｔｅｎ条件付きノックアウトモデルを用いることを決めた。なぜならば、これらのマウスは腫瘍抑制遺伝子Ｐｔｅｎの欠失を受けて、早期の上皮前立腺癌を発症するためである。この表現型はヒトの限局性前立腺癌と密接に関係しており、そのため、良性の過形成病変（良性前立腺肥大症又はＢＰＨ）からヒト限局性前立腺癌を区別することのできる新規のバイオマーカーの同定のための理想的な出発点となる。さらに、Ｐｔｅｎ ｃＫＯマウスモデルを使用することによって、ＰＴＥＮ突然変異を有するか、又はＰＴＥＮシグナル伝達経路に沿った突然変異によって生じる何らかのアンバランスを有する層別化された患者専用に用いられる、治療／画像標的及びバイオマーカーが同定できるようになる。マウスモデルの使用は、高度に不均一なヒト組織とは対照的に、前立腺組織が非常に均一で、環境条件及びタイミング等の主要変数を制御することができるため、候補バイオマーカーの最初の同定を容易にする。興味深いことに、前立腺癌組織量と総血液量の比は、人間に比べマウスでは４０〜４００００倍も高い。これは、もちろん、血液プロテオーム中の変化がヒトの患者サンプルよりこのようなモデルにおいてよりはっきりわかることが期待されるため、本質的な利点である。最後に、血液汚染を除去するために、マウスの組織だけを効果的にかん流させることができる（以下を参照）。組織の血液タンパク質汚染は、多くの場合、特に低濃度で存在するタンパク質の同定を隠してしまう。さらに、かん流後組織に血液が存在しないことにより、なんら潜在的なバイアスなしに、比較プロテオミクス（血液−組織）を適応できるようになる（表１、論理的根拠１，２，４，７参照）。

ヒト血清での確認のための興味あるタンパク質の選択
マウスの血清及び組織中に検出した１６５の糖タンパク質を、ターゲット質量分析を通した検証及びその後のヒト臨床サンプルでの確認のために選択した。この明細書で通常使用される、遺伝子名、エントリー名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）から成る、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に従って定義された通りである。注釈又は予測される細胞局在は、Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H.(2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related
tools. Nat Protoc. 2, 953-711に従う。

マウスを用いて細胞培養系を用いない論理的根拠：
プロテオミクス技術は、インビトロの細胞株に容易に適応されるが、インビボモデルの使用には、より複雑な取り扱い及び初期のトラブルシューティングが必要とされる。しかしながら、我々は、インビボモデルを用いることに決めた。なぜならば、これは、インビトロモデルに比べて、ヒト疾患の複雑さをより厳密に模倣するからである。従って、今日、新鮮分離臓器に適用されるスクリーンはわずかなので、ここに呈示するアプローチは珍しい。

組織及び血液の抽出法：
マウスを麻酔して、左心室をピンで留めて血液を抜き出す。次にマウスの心臓をかん流させる。これにより、前立腺組織から血液を完全に抜き出すことができる。その後、組織サンプルを解剖し、純粋な前立腺組織を、液体窒素の存在下で、直ちに瞬間凍結させ（snap-frozen）、乳鉢と乳棒を用いて細かく砕く。血清を血液から抽出し、−８０℃にて使用するまで保存する。

（II）最新の質量分析法（ＭＳ）及びバイオインフォマティクス：Ｎ結合型グリコプロテオームに焦点を合わせる論理的根拠：
候補バイオマーカーを見つけるために、我々は、特に関連の高いサブプロテオームである、Ｎ結合型糖化タンパク質に焦点を合わせることに決めた。タンパク質のグリコシル化は、長い間、共通の翻訳後修飾として認識されてきた。通常、グリカンはセリン又はトレオニン残基に結合されるか（Ｏ結合型グリコシル化）、又はアスパラギン残基に結合される（Ｎ結合型グリコシル化）。Ｎ結合型グリコシル化部位は大抵、ＮｘＳ／Ｔ配列モチーフ（ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸を示す）に該当する（fall into）。タンパク質のグリコシル化は、細胞外空間に存在するタンパク質の特徴的な翻訳後修飾である。これは、腫瘍によって特異的に分泌され又は流され、血流に放出されるタンパク質（それらを価値の高いバイオマーカー候補とする）の大部分がグリコシル化されることを意味する。さらに、糖タンパク質の濃縮により、特に低濃度で存在する興味ある候補の正体を暴露できる。なぜなら、組織サンプル中の細胞骨格タンパク質及び血清サンプル中のアルブミン（３５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する）等の、非常に豊富なグリコシル化されていない関係のないタンパク質は、測定から排除されるからである。

Ｎ結合型グリコペプチド抽出法及び定量化：
Ｎ結合型糖タンパク質を同定するために、我々は、Zhang, H., Li, X. J., Martin, D.B., and Aebersold, R.(2003) ヒドラジド化学、安定同位体標識法及び質量分析法を用いるＮ結合型糖タンパク質の同定及び定量化、Nat Biotechnol 21, 660-666（この開示は、ＳＰＥＧに関する説明に明示的に含まれる）に従う、組織及び血清からのＮ−グリコペプチド固相抽出法（ＳＰＥＧ）を用いた。グリコペプチドをそのグリカン部分を介して固体担体に結合させる。その後、グリコシル化されてないペプチドを洗い流して、Ｎ−グリコペプチドを酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて特異的に放出できる。この方法は組織及び血清に同様に適用することができる。

トランスプロテオミクスパイプライン（ＴＰＰ）ソフトウエア・スイート及びＳｕｐｅｒＨｉｒｎ（例えば、Mueller et al. 定量的プロテオミクスデータに基づく質量分析のためのソフトウエア・ソリューションの評価、J Proteome Res (2008) vol.7 (1)
pp.51-61参照）と組み合わせて、使用する質量分析機器セットアップ（ＬＴＱ−ＦＴインスツルメント）の高い質量精度及び保持時間再現性により、共通のペプチド特性の同定及びダイレクトなラベルフリー定量が可能となった。これにより、異なるパイプ（run）からのペプチド溶出プロフィールを比較し、糖タンパク質比率を、同じタンパク質に属するＮ−グリコペプチドから計算した。

検証及び確認段階：
最初の発見段階からの我々の結果を検証するために、様々な論理的根拠によって選択された興味あるタンパク質のリストを、選択反応モニタリング（ＳＲＭ、例えば、Stahl-Zeng, J., Lange, V., Ossola, R., Eckhardt, K., Krek, W., Aebersold, R.,
and Domon, B. (2007) Ｎ−グリコサイトの多重反応モニタリングによる血漿タンパク質の高感度検出、Mol Cell Proteomics 6, 1809-1817参照）を用いたターゲット質量分析によって、対応するマウス血清中で定量化した。

この新規のアプローチは、感度という点で従来の免疫検出法（例えば、酵素免疫吸着法ＥＬＩＳＡ）に匹敵するタンパク質の検出及び定量を同時に可能とし、バイオマーカー候補それぞれに対する面倒な最適化ステップや新しい抗体の生成を必要としないという利点を有する。ＳＲＭ実験は、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーション用の化合物のペアレントマス（parent mass）を特定し、その後単独のフラグメントイオンを具体的にモニタリングすることにより達成される。このようにして、ＳＲＭは、非常に複雑なマトリックスの真ん中にモニタリング及び定量可能な特有のフラグメントイオンを送る。標的Ｎ−グリコサイト（脱グリコシル化された形の、無傷のタンパク質中でＮ−グリコシル化されたペプチド）に対応する、安定同位体ラベルのペプチドを合成し、内標準として使用した。これにより、マウスの血清中に存在する内因性糖タンパク質の絶対的定量が可能となった（表２）。

生後８週及び１８週での、対照及び前立腺癌を有するマウスからのマウス血清中のＳＲＭによって測定された４１の血清糖タンパク質のリスト。０．０５未満（ｂｅｌｏｗ）のｐ値は、対応するタンパク質に対し、通常のマウス（ｎ＝３）と前立腺癌を有するマウス（ｎ＝３）との間に統計的に顕著な差があることを示す。実験は、８週及び１８週のマウスに対して行った。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。

対照マウス（健常）及び前立腺癌を有する（癌の）マウスの血清中の興味ある各ペプチドに特異的なフラグメンテーションチャンネルをモニタリングすることにより、高感度・高選択な分析を行った。その後、マウスで検出した潜在的バイオマーカーのヒトの相同分子種を、標準ＥＬＩＳＡ技術及び同じくターゲット質量分析を用いて、ヒト血清で確認した。

（III）多変量統計法：多変量法を用いることの論理的根拠及び利点：
シグネチャー又はバイオマーカーの組み合わせ検出は、単独バイオマーカー検出の使用に比べ、診断精度を高めることになり得る。これは、トータル及びフリーＰＳＡを前立腺癌の診断のために同時に用いる場合にも当てはまる。われわれのケースでは、一団の候補バイオマーカーを測定して、ＢＰＨと限局性前立腺癌（ｌｏｃＰＣａ）とを、又は限局性と非限局性、つまり転移性前立腺癌（ｍｅｔＰＣａ）とを、最も良く判別することのできるシグネチャーが何かを求めることができる。さらに、我々は、全てのシグネチャーで共通に共有されるバイオマーカーが何かを見出し、これらを知的財産に関して価値が高いものとすることができる。バイオマーカーシグネチャーに基づいて患者を分類するために、我々は、二次判別分析を行った。二次判別分析の目的は、個体で測定される独立変数（バイオマーカー）に基づき、個体を２以上のグループ（例えば、ＢＰＨとｌｏｃＰＣａ）の１つに配分するルールを決定することである。このルールを記述するパラメータは、既に公知の分類を有する全ての個体の変数分析から算出される。判別ルールのバイアスを見積もるために、我々は、Ｊａｃｋｎｉｆｅ ｌｅａｖｅ ｏｎｅ−ｏｕｔ交差検定を適用する。分析は、統計ソフトウエアパッケージＳＹＳＴＡＴ１２及びＳＰＳＳ１４．０を用いて行った。

結果：
最初に、我々は、対照及び癌を患っているマウスの両方のかん流前立腺組織及び血清から、Ｎ−グリコペプチドを抽出した。我々は、前立腺組織から全部で６４２の糖タンパク質を、血清から２５３の糖タンパク質を同定し、１１０のタンパク質を共通に検出した。我々は全部で７８５のＮ−糖タンパク質を含む目録を作成することができた。最初のマウスの糖タンパク質の目録から、我々は、癌を有するマウスからのサンプルと、それらそれぞれの対照とを比較して、組織から２７９の糖タンパク質を、血清から１６０の糖タンパク質を定量化することができた（図２）。これらのタンパク質から、表１に挙げた論理的根拠の少なくとも１つを満たす１６５の糖タンパク質が、潜在的なバイオマーカーであると発見し、さらなる検証のために選択した。

マウスの血清サンプルにＳＲＭを用いることにより、我々は、１６５の最初の候補から４１を検証し定量化できた（表２）。

ＳＲＭによってマウスの血清で既にテストされた、あるいはマウスの前立腺組織から最初の発見段階で目立った有望な候補であった４６の候補バイオマーカー（表３）を、さらに、５２のヒトの血清サンプルで確認した。これは、ＥＬＩＳＡ及びＳＲＭを適用することにより行った。

ヒト血清で測定された４６の血清糖タンパク質のリスト。
選択したバイオマーカー候補を、ＳＲＭ又はＥＬＩＳＡによって分析した。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。

統計的分析：
統計的分析を受けて、我々は、アスポリン（ＡＳＰＮ）、ビトロネクチン（ＶＴＮ）及び膜銅アミンオキシダーゼ（ＡＯＣ３）からなる３−バイオマーカーシグネチャーを同定できた。このシグネチャーは、ＢＰＨ（ｎ＝１５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）患者の識別で８１％の精度を有した。つまり、このことは、我々の３−バイオマーカーシグネチャーによって、分析された患者の８１％が正確に診断されたことを意味する。ＡＯＣ３は、最も弱い寄与因子であることがわかった。従って我々はこのタンパク質を他の潜在的なバイオマーカーで置き換え、同様又はより高い精度（≧８０％）を得るものを維持した。このようにして、次のタンパク質を個々に付け加えることができた：ＬＯＸ、ＰＧＣＰ、ＰＳＡＰ、ＴＨＢＳ１（図３Ａ）。

ＰＳＡ自身の判別も同様に測定し、７１％の精度で、ＢＰＨ（ｎ＝１５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）患者を識別した。

さらに、我々は、ＰＳＡのデータをＡＳＰＮ及びＶＴＮのコアシグネチャーに加えた。次のタンパク質の１つを含むことにより、最大９０％の精度を達成した（図３Ｂ）。ＡＯＣ３、ＣＦＨ、ＣＬＵ、ＫＩＴ、ＬＯＸ、ＴＦＲＣ、ＴＨＢＳ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＧＯＬＰＨ２。

より多くのデータを用いた統計的分析を受けて、我々は、アスポリン（ＡＳＰＮ）、カテプシン（ＣＴＳＤ）、低酸素上方調節タンパク質１（ＨＹＯＵ１）、及びオルファクトメジン−４（ＯＬＦＭ４）を含む５−バイオマーカーシグネチャーをさらに同定できた。このシグネチャーは、ＢＰＨ（ｎ＝３５）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝４１）の患者の識別で８７％の精度を有した。つまりこのことは、分析された患者の８７％が、我々の５−バイオマーカーシグネチャーによって正確に診断できたことを意味する。ＰＳＡ自身の識別も同様に測定したが、その結果、ＢＰＨ（ｎ＝４１）とｌｏｃＰＣａ（ｎ＝６４）の患者の識別は７２％の精度であった（図３Ｃ）。

さらに、各ケースでこれら４つのタンパク質の１つだけを取り除くことにより、最大８３％の精度を達成した（図３Ｃ）。

同じデータセットを用いて、表３による系からの選択にいくらかあまり厳しくない基準（somewhat less stringent criterion）を適用することにより、バイオマーカーの精密なリストを決めて表４に集める。表４に挙げる系の少なくとも３つの群を、ＰＳＡ（ＥＬＩＳＡ）測定と組み合わせて用いた分析により、約８０％かそれを超える精度に至った。ＰＳＡ（ＥＬＩＳＡ）測定と組み合わせて、表４に挙げる系の少なくとも４つを選択すると、約８５％かそれを超える精度にさえ至った。

表４に挙げる系のそれぞれに対する閾値は濃度閾値を示し、この上側又は下側（示すように）で確定診断を下すことができる。１つのアッセイ（例えば、表４から選択した３つのバイオマーカーの群）のマーカーの全ての濃度が、これらの濃度値を超える場合、上述の精度で確定診断を下すことができる。

統計的分析（ＢＰＨ（ｎ＝３５）及びｌｏｘＰＣａ（ｎ＝４１））後のヒトの血清で測定される１５の血清糖タンパク質の精密なリスト。遺伝子名、タンパク質名（短縮形）及び登録番号は表１に挙げるように定義する。１つ目の列には、基本濃度の閾値をｎｇ／ｍｌで示し、２つ目の列には、好ましい濃度の閾値をｎｇ／ｍｌで示す。ＯＤと記されたところは、４０５ｎｍで測定が行われ、相対値は市販の抗体（ＣＲＥ：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ポリクローナル：Ｎｒ．ＡＦ３５８７、及びＲ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、モノクローナル：ＭＡＢ３５８７； ＭＳＭＢ：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ポリクローナル：Ｎｒ．ＡＦ３７８０、及びＡｂｎｏｖａ、モノクローナル：Ｈ００００４４７７−Ｍ０８）を用いて与える。

ｂ）以下のバイオマーカーを含むバイオマーカーシグネチャーを用いて、我々は、ケースの１００％で、ｌｏｃＰＣａ（ｎ＝１６）とｍｅｔＰＣａ（ｎ＝２１）患者を正確に区別できた：アスポリン（ＡＳＰＮ）、ビトロネクチン（ＶＴＮ）、カテプシンＤ（ＣＳＴＤ）、ポリペプチド・Ｎ−アセチル−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ ＧＡＬＮＴＬ４、ポリアクチベーター・ポリペプチド（ＰＳＡＰ）及びトロンボスポンジン−１（ＴＨＢＳ−１）。ＰＳＡＰは、最も弱い寄与因子であることが分かった。これを除外しても、識別分析の９７％精度が達成された。従って、我々は、他の潜在的バイオマーカーでこのタンパク質を置き換え、精度を高めたもの（＞９７％）を維持した。このようにして、以下のタンパク質を個々に加えることができた：ＣＥＡＣＡＭ１、ＥＦＮＡ５、ＧＳＰＴ１、ＨＹＯＵ１、ＫＩＴ（全てにおいて１００％の精度が得られた）（図３）。

留意しなければならない点は、表３に挙げる系のいずれか、好ましくは２つの組み合わせ、最も好ましくは少なくとも３つ（又はちょうど３つ）の組み合わせ、少なくとも４つ（又はちょうど４つ）の、又は少なくとも５つ
（又はちょうど５つ）の糖タンパク質の組み合わせとしての系が、本発明によってカバーされるアッセイであり得る点である。上記のような特定の統計的に評価される系は、これらの統計的なテストに取り組まれる診断的側面に対し最も効果を発揮すると示し得るものである。異なる診断／予後／治療側面又は異なる統計的評価法を使用するために、異なる組み合わせもまた可能であり、本発明によるものと見なされるべきである。

Claims (9)

1. ヒト血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中のＡＳＰＮ；ＶＴＮ；ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４；ＡＫＡＰ１３；ＣＰ；ＣＰＥ；ＣＰＭ；ＩＣＡＭ１；ＭＳＭＢ：ＴＭ９ＳＦ３；ＧＡＬＮＴＬ４から得られる群から選択される、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定を用いた、特に良性の前立腺肥大との区別のための限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングの方法であって、
   前記測定が、これらのタンパク質／その断片の検出のために、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応検出法（ＳＲＭ）をより好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせて、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して行われる方法。
2. 好ましくは、ＡＯＣ３；ＬＯＸ；ＰＧＣＰ；ＰＳＡＰ；ＴＨＢＳ１；ＣＦＨ；ＣＬＵ；ＫＩＴ；ＴＦＲＣ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＧＯＬＰＨ２；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４から得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定を組み合わせて、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の、任意でＶＴＮ誘導タンパク質／その断片と組み合わせたＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の組み合わせ測定を用いる、請求項１に記載の限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングの方法であって、
   好ましくは、限局性前立腺癌の確定診断又はモニタリングのために、
   ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
   好ましくは付加的に測定した場合、ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が３５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   ＡＯＣ３誘導タンパク質／その断片の濃度が２５０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２２０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   及び／又はＬＯＸ誘導タンパク質／その断片の濃度が５８０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   及び／又はＰＧＣＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が５５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５７０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が３３０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは３２５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは３２２５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   及び／又はＴＨＢＳ１誘導タンパク質／その断片の濃度が１２５００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３５００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＬＧＡＬＳ３ＢＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が３９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＧＯＬＰＨ２誘導タンパク質／その断片の濃度が８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度が３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   及び／又はＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度が２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない方法。
3. ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の、ＡＳＰＮ；ＨＹＯＵ１；ＣＴＳＤ；ＯＬＦＭ４から得られる群から選択される少なくとも３つのタンパク質及び／又はタンパク質の断片の濃度の組み合わせ測定を用いる、良性の前立腺肥大から区別するための限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのための方法であって、
   前記診断／モニタリングのために、さらに、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのもの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、親和性試薬に基づく、好ましくは酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いて測定し、好ましくは、確定診断のためには、前記前立腺特異抗原の濃度が、２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならない方法。
4. 限局性前立腺癌の確定診断又はモニタリングのためには、
   ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、５５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又は、ＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が、３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又は、ＣＴＳＤ誘導タンパク質／その断片の濃度が、３２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、
   及び／又は、ＯＬＦＭ４誘導タンパク質／その断片の濃度が、２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ未満でなければならない、請求項３に記載の限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのための方法。
5. 好ましくは、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ及びＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１及びＧＡＬＮＴＬ４及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の組み合わせ測定を用いる、特に限局性前立腺癌からの区別のための、非限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのための方法であって、
   好ましくは前記測定が、これらのタンパク質／その断片の検出のために、タンデム質量分析技術、好ましくは選択反応モニタリング（ＳＲＭ）をより好ましくは液体クロマトグラフィーと組み合わせて、及び／又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して行われる方法。
6. 好ましくは、ＰＳＡＰ；ＧＳＰＴ１；ＣＥＡＣＡＭ１；ＨＹＯＵ１；ＥＦＮＡ５；ＫＩＴから得られる群から選択される、１つのさらなるタンパク質／その断片の測定と組み合わせて、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中の、ＡＳＰＮ及びＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１及びＧＡＬＮＴＬ４及びＶＴＮ誘導タンパク質／その断片の濃度の組み合わせ測定を用いる、限局性前立腺癌からの区別のための、請求項５に記載の非限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのための方法。
7. 転移性前立腺癌の確定診断のためには、
   ＡＳＰＮ誘導タンパク質／その断片の濃度が、６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは６８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
   ＣＴＳＤ誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１３０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１３３ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
   ＴＨＢＳ１誘導タンパク質／断片の濃度が、１２０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１１５００ｎｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０７５０ｎｇ／ｍｌ未満でなければならず、同時に、
   ＧＡＬＮＩＬ４誘導タンパク質／断片の濃度が、１４００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１６００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１６５０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、同時に、
   ＶＴＮ誘導タンパク質／断片の濃度が、３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３１５０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは３３００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   好ましくは、付加的に測定される場合、
   ＰＳＡＰ誘導タンパク質／その断片の濃度が３３０００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３４０００ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＧＳＰＴ１誘導タンパク質／その断片の濃度が４５０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは５１０ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＣＥＡＣＡＭ１誘導タンパク質／その断片の濃度が３５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは３８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず（この閾値はＥＬＳＡ決定に関連して計算したものでしかない）、
   及び／又はＨＹＯＵ１誘導タンパク質／その断片の濃度が８０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは８９ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＥＦＮＡ５誘導タンパク質／その断片の濃度が６０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   及び／又はＫＩＴ誘導タンパク質／その断片の濃度が９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは９５ｎｇ／ｍｌより高くなければならない、請求項５又は６に記載の非限局性前立腺癌の診断及び／又は治療及び／又はモニタリングのための方法。
8. 前記診断／モニタリングのために、付加的に、ヒトの血清、血漿又は血液の派生物、又は血液そのものの中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を、親和性試薬に基づく、好ましくは酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づくアッセイを用いて測定し、
   確定診断のためには、前記前立腺特異抗原の濃度が２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは４ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   特に、限局性前立腺癌の診断／モニタリングのためには、前記前立腺特異抗原の濃度が好ましくは、２ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは５ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは８ｎｇ／ｍｌより高くなければならず、
   非限局性前立腺癌の確定診断のためには、前記前立腺特異抗原の濃度が好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１５０ｎｇ／ｍｌより高く、最も好ましくは１７５ｎｇ／ｍｌより高くなければならない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 特に限局性前立腺癌の早期発見及び診断のための病期分類及び／又は診断目的のための、及び／又は治療選択及び／又は治療モニタリングのための、請求項１〜８のいずれかに記載の方法の使用。
   

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