JP2013009742A - Composition and method for suppressing growth of pluripotent stem cell - Google Patents
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Abstract
【課題】多分化能幹細胞から所望の細胞タイプに分化させた後、患者の体内に移植する際に、患者の体内で未分化状態の多分化能幹細胞が増殖することを防止する技術であって、前記多分化能幹細胞に突然変異を誘発するおそれのない技術を開発する。
【解決手段】本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質等を含む。本発明は、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質の発現を誘導できるポリヌクレオチドを含む多能性幹細胞を提供する。本発明は、本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を多能性幹細胞中に導入するステップを含む、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法を提供する。
【選択図】なしA technique for preventing undifferentiated pluripotent stem cells from proliferating in a patient's body when the pluripotent stem cell is differentiated into a desired cell type and transplanted into the patient's body. Develop a technique that does not induce a mutation in the pluripotent stem cells.
The present invention provides a composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells. The composition for inhibiting the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention contains p16 and p53 proteins and the like. The present invention provides pluripotent stem cells comprising a polynucleotide capable of inducing the expression of p16 and p53 proteins. The present invention provides a method for inhibiting the proliferation of pluripotent stem cells, comprising the step of introducing a composition for inhibiting the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention into the pluripotent stem cells.
[Selection figure] None
Description
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物及び方法に関し、具体的には、ｐ１６及び／又はｐ５３のタンパク質等を含む、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物と、該組成物を用いることを含む、多能性幹細胞の増殖を抑制する方法に関する。 The present invention relates to a composition and method for inhibiting the proliferation of pluripotent stem cells, and specifically, a composition for inhibiting the proliferation of pluripotent stem cells, including p16 and / or p53 proteins and the like. And a method for suppressing proliferation of pluripotent stem cells, comprising using the composition.
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多分化能幹細胞を用いる再生医療技術の課題のひとつは、多分化能幹細胞から所望の細胞タイプに分化させた後、患者の体内に移植する際に、前記多分化能幹細胞が未分化状態のまま残存し、分化した細胞とともに前記患者の体内に移植され、患者の体内で増殖する危険を如何に防止するかである（非特許文献１）。前記課題の解決策として、安全弁として提唱されている方策（非特許文献２、３）は、ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を前記多分化能幹細胞に安定的に導入しておくことである。すなわち、前記多分化能幹細胞由来の細胞が患者に移植された後望ましくない細胞増殖を起こすときには、ガンシクロビルを投与する。ガンシクロビルは、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ酵素には基質として認識されるが、ヒトのチミジンキナーゼ酵素には基質として認識されない。そこで、前記患者の細胞に影響を与えることなく、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子が導入された移植細胞の増殖だけを阻害することができる。しかし、今度は、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子が前記多分化能幹細胞に導入されることにより、該多分化能幹細胞に挿入突然変異が誘発される危険が生じる。 One of the challenges of regenerative medical technology using pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) is to differentiate patients from pluripotent stem cells into a desired cell type When transplanting into the body of the patient, how to prevent the risk that the pluripotent stem cells remain undifferentiated and transplanted together with the differentiated cells into the patient's body and proliferate in the patient's body ( Non-patent document 1). As a solution to the above problem, measures proposed as safety valves (Non-Patent Documents 2 and 3) are to stably introduce a herpesvirus-derived thymidine kinase gene into the multipotent stem cells. That is, ganciclovir is administered when the pluripotent stem cell-derived cells cause undesirable cell proliferation after being transplanted into a patient. Ganciclovir is recognized as a substrate by the thymidine kinase enzyme derived from the herpes virus, but is not recognized as a substrate by the human thymidine kinase enzyme. Therefore, it is possible to inhibit only the growth of transplanted cells into which the herpesvirus-derived thymidine kinase gene has been introduced without affecting the cells of the patient. However, this time, when the herpesvirus-derived thymidine kinase gene is introduced into the pluripotent stem cells, there is a risk that an insertion mutation is induced in the pluripotent stem cells.
したがって、患者の体内で未分化状態の多分化能幹細胞が増殖することを防止する技術であって、前記多分化能幹細胞に突然変異を誘発するおそれのない技術を開発する必要がある。 Therefore, it is necessary to develop a technique for preventing the proliferation of undifferentiated pluripotent stem cells in a patient's body without causing a mutation in the pluripotent stem cells.
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される、少なくとも１種類のタンパク質を含む。
The present invention provides a composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells. The composition for suppressing the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention comprises:
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) It has an amino acid sequence in which one, two or more, or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and suppresses proliferation of pluripotent stem cells A protein having the activity of
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and A protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(E) a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) The cell membrane permeable peptide contains at least one protein selected from the group consisting of the fusion protein linked to any one of the above (a) to (f).
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に、１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドと、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含む。
The composition for suppressing the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention comprises:
(A) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, having an amino acid sequence in which one, two or more, or several amino acids are deleted, substituted or added, and proliferate pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having inhibitory activity;
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having
(D) homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having activity of inhibiting proliferation;
(E) a polynucleotide encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions and has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) The polynucleotide encoding the cell membrane permeable peptide includes at least one polynucleotide selected from the group consisting of the fusion polynucleotide linked to any one of the above (a) to (f).
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物において、前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結される場合がある。 In the composition for suppressing proliferation of pluripotent stem cells of the present invention, the polynucleotide may be operably linked to a constitutive or inducible promoter.
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物において、前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターの場合がある。 In the composition for suppressing proliferation of pluripotent stem cells of the present invention, the inducible promoter may be a tetracycline inducible promoter.
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を含む、該多能性幹細胞の生体内での腫瘍化を防止するための医薬品組成物を提供する。 The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing in vivo tumorigenesis of the pluripotent stem cells, comprising a composition for suppressing the proliferation of pluripotent stem cells.
本発明の多能性幹細胞の生体内での腫瘍化を防止するための医薬品組成物において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。 In the pharmaceutical composition for preventing tumor formation of pluripotent stem cells of the present invention in vivo, the pluripotent stem cells may be artificial pluripotent stem cells (iPS cells) or embryonic stem cells (ES cells). is there.
本発明は多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法は、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたタンパク質を多能性幹細胞中に導入するステップとを含む。
The present invention provides a method for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells. The method for suppressing the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention comprises:
(1)
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) It has an amino acid sequence in which one, two or more, or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and suppresses proliferation of pluripotent stem cells A protein having the activity of
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and A protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(E) a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) providing at least one protein selected from the group consisting of a fusion protein in which a cell membrane permeable peptide is linked to any one of the above (a) to (f);
(2)
Introducing the protein prepared in step (1) into pluripotent stem cells.
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法は、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列との相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるヌクレオチド配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドと、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入するステップと、
（３）
ステップ（２）で導入されたポリヌクレオチドがエンコードするタンパク質を発現するステップとを含む。
The method for suppressing the proliferation of pluripotent stem cells of the present invention comprises:
(1)
(A) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) It has an amino acid sequence in which one, two or more, or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and suppresses proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having the activity of:
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having
(D) a pluripotent stem cell having a nucleotide sequence whose homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or more, and A polynucleotide encoding a protein having an activity of inhibiting the growth of
(E) a polynucleotide that encodes a protein that hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions and has an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) preparing at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide encoding a cell membrane permeable peptide and a fusion polynucleotide linked to any one of (a) to (f). Steps,
(2)
Introducing the polynucleotide prepared in step (1) into pluripotent stem cells;
(3)
Expressing the protein encoded by the polynucleotide introduced in step (2).
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結される場合がある。 In the method for suppressing proliferation of pluripotent stem cells of the present invention, the polynucleotide may be operably linked to a constitutive or inducible promoter.
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターの場合がある。 In the method for suppressing proliferation of pluripotent stem cells of the present invention, the inducible promoter may be a tetracycline inducible promoter.
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。 In the method for suppressing proliferation of pluripotent stem cells of the present invention, the stem cells may be induced pluripotent stem cells (iPS cells) or embryonic stem cells (ES cells).
本発明は多能性幹細胞を提供する。本発明の多能性幹細胞は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかに連結された融合タンパク質と
からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を誘導可能に発現するポリヌクレオチドを含む。
The present invention provides pluripotent stem cells. The pluripotent stem cell of the present invention is
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells; ,
(C) It consists of an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more And a protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells,
(E) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions, and has an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells Protein,
(F) a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to any of the above (a) to (e);
(G) The cell membrane-permeable peptide comprises a polynucleotide that inducibly expresses at least one protein selected from the group consisting of the fusion protein linked to any of (a) to (f).
本発明の多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。 The pluripotent stem cell of the present invention may be an induced pluripotent stem cell (iPS cell) or an embryonic stem cell (ES cell).
本発明は、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去するための方法を提供する。前記方法は、
（１）
多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を試験管内で分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を用意するステップと、
（４）
前記細胞医薬組成物に前記多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を曝露するステップとを含む。
The present invention provides a method for removing undifferentiated pluripotent stem cells mixed in a cell pharmaceutical composition containing differentiated cells derived from pluripotent stem cells. The method
(1)
Preparing pluripotent stem cells;
(2)
Differentiating the pluripotent stem cells in vitro to produce a cell pharmaceutical composition;
(3)
Providing a composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells of the present invention;
(4)
Exposing the cell pharmaceutical composition to a composition for inhibiting the proliferation of the pluripotent stem cells.
本発明は、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去するための方法を提供する。前記方法は、
（１）
本発明の多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を試験管内で分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
ステップ（２）の後、本発明の多能性幹細胞に含まれるポリヌクレオチドの発現を誘導するステップとを含む。
The present invention provides a method for removing undifferentiated pluripotent stem cells mixed in a cell pharmaceutical composition containing differentiated cells derived from pluripotent stem cells. The method
(1)
Providing a pluripotent stem cell of the present invention;
(2)
Differentiating the pluripotent stem cells in vitro to produce a cell pharmaceutical composition;
(3)
After the step (2), a step of inducing expression of a polynucleotide contained in the pluripotent stem cell of the present invention is included.
本明細書において、ｐ１６とはサイクリン依存性キナーゼ４インヒビター（ｐ１６−ＩＮＫ４又はｐ１６ＩＮＫ４ａ）をいい、ｐ５３とは腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）をいい、ｐ２１とはサイクリン依存性キナーゼ・インヒビター１Ａ（Ｃｉｐ１）をいう。ヒトｐ１６、ｐ５３及びｐ２１タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び５に列挙され、ヒトｐ１６、ｐ５３及びｐ２１タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３、４及び６に列挙される。 In the present specification, p16 refers to cyclin-dependent kinase 4 inhibitor (p16-INK4 or p16INK4a ), p53 refers to tumor protein p53 (TP53), and p21 refers to cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (Cip1). Say. The amino acid sequences of human p16, p53 and p21 proteins are listed in SEQ ID NOs: 1, 2 and 5, respectively, and the nucleotide sequences encoding human p16, p53 and p21 proteins are listed in SEQ ID NOs: 3, 4 and 6, respectively. .
本発明において、ヒトｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号１及び２に列挙されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ヒトｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号１及び２に列挙されるアミノ酸配列との同一性が、８０％又はこれ以上か、９０％又はこれ以上か、９５％又はこれ以上かであってもかまわない。前記ヒトｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ヒトｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列との同一性が、８０％又はこれ以上か、９０％又はこれ以上か、９５％又はこれ以上のヌクレオチド配列でもかまわない。 In the present invention, human p16 and p53 proteins lack one to several amino acids in the amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 1 and 2 on the condition that they have the activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells. Loss, substitution or insertion may be included. Alternatively, the human p16 and p53 proteins have 80% or more identity with the amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 1 and 2 on the condition that they have an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells. Or 90% or more, 95% or more. The human p16 and p53 polynucleotides are one in the nucleotide sequences listed in SEQ ID NOs: 3 and 4, provided that the protein encoded by the polynucleotide has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells. Or a nucleotide sequence containing several nucleotide deletions, substitutions or insertions. The human p16 and p53 polynucleotides are identical to the nucleotide sequences listed in SEQ ID NOs: 3 and 4 on the condition that the protein encoded by the polynucleotide has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells. The nucleotide sequence may be 80% or more, 90% or more, 95% or more.
本発明のｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチド及びタンパク質は、配列を特定せずに言及される場合には、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、該多能性幹細胞と同一の生物種であっても、異なる生物種であってもかまわない。前記生物種は、ヒトの他、サル、ブタ、マウス等の実験動物を含むが、これらに限られない。 The p16 and p53 polynucleotides and proteins of the present invention, when referred to without specifying a sequence, are identical to the pluripotent stem cells provided that they have the activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells. It may be a different species or a different species. Examples of the biological species include, but are not limited to, humans and laboratory animals such as monkeys, pigs, and mice.
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。 As used herein, “stringent conditions” refers to Sambrook, J. et al. And Russell, D .; W. This refers to the following experimental conditions in the Southern blot method described in Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). A polynucleotide having a nucleotide sequence to be compared is band-formed by agarose electrophoresis, and then immobilized on a nitrocellulose filter or other solid phase by capillary action or electrophoresis. Pre-wash with a solution consisting of 6x SSC and 0.2% SDS. A hybridization reaction between a probe obtained by labeling a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the present invention with a radioisotope or other labeling substance and a comparison target polynucleotide immobilized on the solid phase was subjected to 6 × SSC and 0.2 % Overnight in a solution consisting of SDS at 65 ° C. Thereafter, the solid phase was washed twice at 65 ° C. in a solution consisting of 1 × SSC and 0.1% SDS at 30 ° C. for 30 minutes each, and 65 ° C. in a solution consisting of 0.2 × SSC and 0.1% SDS. C. Wash twice for 30 minutes each. Finally, the amount of the probe remaining on the solid phase is determined by quantifying the labeling substance. In this specification, “hybridization under stringent conditions” means that the amount of the probe remaining on the solid phase immobilized with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence to be compared is equal to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the present invention. It refers to at least 25%, preferably at least 50%, more preferably at least 75% or more of the amount of probe remaining in the immobilized solid phase of the positive control experiment.
本発明において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。 In the present invention, the homology of nucleotide sequence and amino acid sequence can be calculated by using the sequence alignment program CLUSTALW well known to those skilled in the art.
本発明において、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される場合がある。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。 In the present invention, the p16 and p53 proteins are produced by expressing DNA or RNA encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention in an inanimate expression system or an expression system using a host organism and an expression vector. There is a case. The host organisms include prokaryotes such as E. coli and Bacillus subtilis and eukaryotes such as yeast, fungi, plants and animals. An expression system using the host organism and expression vector of the present invention may be a part of an organism such as a cell or tissue, or an entire individual of the organism.
本明細書において、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結された化合物を指す。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。 In the present specification, “protein”, “peptide”, “oligopeptide” or “polypeptide” refers to a compound in which two or more amino acids are linked by a peptide bond. “Proteins”, “peptides”, “oligopeptides” or “polypeptides” may include alkyl groups including methyl groups, phosphate groups, sugar chains, and / or ester bonds and other covalent modifications. .
本明細書において、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、２個以上のヌクレオチドがホスフォジエステル結合で連結された化合物を指す。「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。 As used herein, “DNA”, “RNA”, “oligonucleotide” or “polynucleotide” refers to a compound in which two or more nucleotides are linked by a phosphodiester bond. “DNA”, “RNA”, “oligonucleotide” or “polynucleotide” may include alkyl groups including methyl groups, phosphate groups, sugar chains, and / or ester bonds and other covalent modifications .
本明細書において、特異的結合タグとは、所望の機能を有するポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、前記所望の機能を有するポリペプチドとペプチド結合で連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂、シリコン等と特異的に結合するポリペプチドをいう。前記特異的結合タグは、水溶液中に溶解した物質又は固体支持体と結合する場合がある。前記特異的結合タグには、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。 In the present specification, the specific binding tag means that when a polypeptide having a desired function is prepared by gene recombination, it is expressed as a fusion protein linked to the polypeptide having the desired function by a peptide bond, In order to make it easier to separate, purify or detect expressed proteins from transformants, specifically with other proteins, polysaccharides, glycolipids, nucleic acids and their derivatives, resins, silicon, etc. A polypeptide that binds. The specific binding tag may bind to a substance or solid support dissolved in an aqueous solution. Specific binding tags include, but are not limited to, His tag, Myc tag, HA tag, intein tag, MBP, GST, and similar polypeptides. The specific binding tag may be selected from the group consisting of His tag, myc tag, HA tag, intein tag, MBP or GST.
本明細書において、細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合タンパク質を細胞外に添加すると、細胞膜を透過して前記融合タンパク質を細胞内に移行させることができるペプチドをいい、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ 結合領域（４８−６０位）由来のアルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）、アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチド、ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ 結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。 In the present specification, the cell membrane-penetrating peptide refers to a peptide that can pass through the cell membrane and transfer the fusion protein into the cell when a fusion protein with another peptide, polypeptide or protein is added outside the cell. , A basic peptide (TAT peptide) rich in arginine derived from the Tat protein RNA binding region (positions 48-60) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), an oligohomopeptide having 6 to 12 consecutive arginine residues A peptide having a basic amphipathic helix structure derived from the DNA binding region of the Drosophila-derived transcription factor Antennapedia protein, but is not limited thereto.
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に由来する少なくとも２種類の細胞タイプに分化することができ、かつ、未分化状態で増殖する細胞を指し、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）を含むが、これらに限定されない。ｉＰＳ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）が、患者に移植された細胞が治療に利用できる程度に適合する細胞から作成されることが好ましく、移植される患者本人の細胞から作成されることが最も好ましい。 As used herein, “pluripotent stem cell” refers to a cell that can differentiate into at least two cell types derived from ectoderm, mesoderm, and endoderm, and that proliferates in an undifferentiated state, Examples include, but are not limited to, induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). The iPS cells are preferably made from cells of the patient's own being transplanted, preferably the major histocompatibility complex (HLA) is adapted to the extent that the cells transplanted into the patient are available for treatment. Most preferred.
前記ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとして細胞に導入されてもかまわない。また、前記ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等を有するベクターに挿入されたコンストラクトとして細胞に導入されてもかまわない。前記ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の場合がある。前記プロモーターは、構成型プロモーター又は誘導型プロモーターを用いることができる。前記誘導型プロモーターは、プロモーターの活性を促進又は抑制する誘導因子の存在下で、前記プロモーターに連結された所望のポリヌクレオチドの転写を制御できる配列をいう。前記誘導因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ＩＰＴＧ等の化合物等を含むが、これらに限定されない。前記誘導型プロモーターは、前記誘導因子と特異的な相互作用を行うトランスアクチベータータンパク質によって転写が制御される。そこで、本発明のｐ１６又はｐ５３を発現する誘導型プロモーターを含むコンストラクトは、該誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するベクターが発現する宿主細胞に導入される必要がある。前記誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトは、前記ｐ１６又はｐ５３を発現する誘導型プロモーターを含むコンストラクトの導入前か、あるいは、導入と同時に、前記宿主細胞に導入される。前記誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトは、前記トランスアクチベータータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが、構成型プロモーター又は誘導型プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等を有するベクターに挿入されて作出される。 The polynucleotide may be introduced into cells as double-stranded DNA or RNA. The polynucleotide may be introduced into a cell as a construct inserted into a vector having a promoter, enhancer, terminator, polyadenylation site, cloning site, drug resistance gene and the like. The vector may be, for example, a retrovirus vector or an adenovirus vector. As the promoter, a constitutive promoter or an inducible promoter can be used. The inducible promoter refers to a sequence capable of controlling transcription of a desired polynucleotide linked to the promoter in the presence of an inducing factor that promotes or suppresses the activity of the promoter. Examples of the inducer include, but are not limited to, compounds such as tetracycline, doxycycline, and IPTG. Transcription of the inducible promoter is controlled by a transactivator protein that interacts specifically with the inducer. Therefore, a construct containing an inducible promoter that expresses p16 or p53 of the present invention needs to be introduced into a host cell that expresses a vector that expresses a transactivator protein involved in the transcriptional control of the inducible promoter. A construct that expresses a transactivator protein involved in transcriptional control of the inducible promoter is introduced into the host cell before or simultaneously with the introduction of the construct containing the inducible promoter that expresses p16 or p53. The The construct that expresses the transactivator protein involved in the transcriptional control of the inducible promoter is a constitutive promoter or inducible promoter, enhancer, terminator, polyadenylation site, cloning site. It is created by being inserted into a vector having a drug resistance gene or the like.
本発明のｐ１６又はｐ５３を発現するコンストラクトは、当業者に周知な方法を用いて多能性幹細胞に導入される。前記コンストラクトが誘導型プロモーターを含む場合、その転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトも、当業者に周知な方法を用いて前記多能性幹細胞に導入される。前記遺伝子の導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、微量注入法、電気穿孔法、パーティクル・ガン法等を含むが、これらに限定されない。前記コンストラクトが、レトロウイルス、アデノウイルス等の感染性粒子を産生する場合には、ヘルパーウイルス等を用いて培養液中に放出された前記感染性粒子が回収されて、多能性幹細胞に添加される。 The construct expressing p16 or p53 of the present invention is introduced into pluripotent stem cells using methods well known to those skilled in the art. When the construct contains an inducible promoter, a construct that expresses a transactivator protein involved in the transcriptional control is also introduced into the pluripotent stem cell using methods well known to those skilled in the art. Examples of the gene introduction method include, but are not limited to, the calcium phosphate method, the lipofection method, the microinjection method, the electroporation method, and the particle gun method. When the construct produces infectious particles such as retroviruses and adenoviruses, the infectious particles released into the culture solution using a helper virus or the like are collected and added to pluripotent stem cells. The
本発明において、多能性幹細胞の培養方法は、浮遊凝集培養法、フィーダー細胞を用いた共培養法等を含むが、これらに限定されない。多能性幹細胞から所望の細胞タイプへの分化誘導方法は、当業者に周知のいかなる方法を用いて実施されてもかまわない。本発明の多能性幹細胞に由来する分化細胞を患者に適用する経路は、目的の生体組織に送達されることを条件として特に問わない。前記細胞は、移植、静脈注射、皮下注射及び筋肉注射を含むが、これらに限定されない手段によって患者に適用される場合がある。 In the present invention, the method for culturing pluripotent stem cells includes, but is not limited to, a suspension aggregation culture method, a co-culture method using feeder cells, and the like. The method of inducing differentiation from a pluripotent stem cell to a desired cell type may be performed using any method known to those skilled in the art. The route for applying a differentiated cell derived from the pluripotent stem cell of the present invention to a patient is not particularly limited as long as it is delivered to a target living tissue. The cells may be applied to the patient by means including but not limited to transplantation, intravenous injection, subcutaneous injection and intramuscular injection.
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。 All documents mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。 The embodiments of the present invention described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the technical scope of the present invention. The technical scope of the present invention is limited only by the appended claims. Modifications of the present invention, for example, addition, deletion, and replacement of the configuration requirements of the present invention can be made on the condition that the gist of the present invention is not deviated.
以下の実施例に説明される研究は、「ヘルシンキ宣言（２００２年１０月改定）」、「疫学研究に関する倫理指針（平成１４年６月１７日文部科学省、厚生労働省）」、「臨床研究に関する倫理指針（平成１５年７月３０日厚生労働省）」、「実験動物の適正な実施に向けたガイドライン（平成１８年６月１日日本学術会議）」、「研究機関における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日文部科学省）」及び「厚生労働省における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日厚生労働省）」の趣旨に則り公立大学法人名古屋市立大学の倫理委員会によって承認された後に実施された。承認番号等は以下のとおりである。
（１）Ｈ２１Ｍ−６５
マウス胎児線維芽細胞初代培養フィーダーの作成
承認日 平成２２年２月１０日
（２）Ｈ２１Ｍ−７２
老化誘導カセット導入ｉＰＳおよびＥ細胞のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける造腫瘍性の検討
承認日 平成２２年４月６日
The studies described in the following examples include the “Declaration of Helsinki (revised in October 2002)”, “Ethical Guidelines for Epidemiological Research” (June 17, 2002, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, Ministry of Health, Labor and Welfare), “ "Ethical Guidelines (July 30, 2003, Ministry of Health, Labor and Welfare)", "Guidelines for Proper Implementation of Experimental Animals (June 1, 2006 Japan Science Council)", "Research on Animal Experiments at Research Organizations" Nagoya City University, a public university corporation, in accordance with the basic guidelines (June 1, 2006, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology) and "Basic Guidelines for Implementation of Animal Experiments in the Ministry of Health, Labor and Welfare (June 1, 2006, Ministry of Health, Labor and Welfare)" It was implemented after being approved by the Ethics Committee. The approval numbers are as follows.
(1) H21M-65
Approval date for creating mouse embryo fibroblast primary culture feeder February 10, 2010 (2) H21M-72
Approval date for examination of tumorigenicity in aging-inducing cassette-introduced iPS and E cell NOD-SCID mice April 6, 2010
ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３の遺伝子を誘導可能に発現するｉＰＳ細胞の樹立
１．材料及び方法
（１）ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞の調製
マウス胎仔線維芽細胞（以下、「ＭＥＦ細胞」という。）が、ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞として用いられた。胎齢１３．５〜１４．５日のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、日本エスエルシー株式会社）の胎仔が、内臓及び頭部以外の胴体をハサミで細かく切断された後、０．２５％のトリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、カルシウム及びマグネシウムイオン不含生理食塩水（０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ、２５２００、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）中で、３７°Ｃ、１０分間インキュベーションされた。１０％ ウシ胎仔血清、１％ ピルビン酸ナトリウム、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、１５１４０、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の１％）、及び、５０μＭ ２−メルカプトエタノールを添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（１２６９９−０１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、以下、「ＭＥＦ細胞用培地」という。）が調製された。前記マウス胎仔線維芽細胞は、培養ディッシュ（１４５．０／２０ｍｍ、６３９１６０、株式会社 グライナー・ジャパン）に１枚あたり２×１０６個播種され、前記ＭＥＦ細胞用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。
Establishment of iPS cells inducibly expressing p16, p21 or p53 gene Materials and Methods (1) Preparation of iPS cell culture feeder cells Mouse fetal fibroblasts (hereinafter referred to as “MEF cells”) were used as iPS cell culture feeder cells. After a fetus of a mouse of 13.5 to 14.5 days of gestation (C57BL / 6J, Nippon SLC Co., Ltd.) was cut finely with scissors other than the internal organs and head, scissors, 0.25% trypsin and 1 mM Incubation was carried out at 37 ° C. for 10 minutes in a physiological saline containing no EDTA and containing no calcium and magnesium ions (0.25% Trypsin-EDTA, GIBCO, 25200, Life Technologies Japan Ltd.). 10% fetal bovine serum, 1% sodium pyruvate, 1% non-essential amino acid (NEAA), 100 units / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin (1% of Pen Strep (GIBCO, 15140, Life Technologies Japan)), and , A high glucose Dulbecco's modified Eagle medium (12699-013, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd., hereinafter referred to as “MEF cell medium”) supplemented with 50 μM 2-mercaptoethanol was prepared. The mouse fetal fibroblasts were seeded in a culture dish (145.0 / 20 mm, 639160, Greiner Japan Co., Ltd.) at 2 × 10 6 cells per one plate, and the medium for MEF cells was used at 37 ° C., The cells were cultured in a 5% CO 2 and saturated water vapor atmosphere.
（２）ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞の凍結保存
継代３回までのＭＥＦは、１μｇ／ｍＬ マイトマイシン−Ｃ（ＭＯ５０３、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加したＭＥＦ細胞用培地で２時間培養された後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄され、０．２５％ トリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、カルシウム及びマグネシウムイオン不含生理食塩水（０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ、２５２００、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で処理された。その後、前記ＭＥＦは細胞凍結保存液バンバンカー（ＣＳ−０２−００１、日本ジェネティクス株式会社）に３×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁され、１ｍＬずつ凍結保存用チューブに移され、−１５０°Ｃで凍結保存された。
(2) Cryopreservation of iPS cell culture feeder cells Up to 3 passages of MEF were cultured in a medium for MEF cells supplemented with 1 μg / mL mitomycin-C (MO503, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) for 2 hours. , Phosphate buffered saline (PBS) three times and containing 0.25% trypsin and 1 mM EDTA, calcium and magnesium ion free saline (0.25% Trypsin-EDTA, GIBCO, 25200, Life Technologies Japan Co., Ltd.). Thereafter, the MEF was suspended in a cell cryopreservation solution bunker (CS-02-001, Nippon Genetics Co., Ltd.) at a concentration of 3 × 10 6 cells / mL, transferred 1 mL at a time to a cryopreservation tube, − It was stored frozen at 150 ° C.
（３）ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１（２００７））は、山中伸弥教授（国立大学法人京都大学 ｉＰＳ細胞研究所）から供与された。２０１Ｂ７細胞が培養される前日に、ＭＥＦ細胞は、解凍後、ゼラチンコートされた培養ディッシュ（３５３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１枚あたり１×１０６個播種され、前記ＭＥＦ細胞用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で終夜培養された。２０１Ｂ７細胞は、前記ＭＥＦ細胞上にディッシュ１枚あたり約１×１０５個播種された。その後、ヒトｉＰＳ細胞培養用培地を用いて、前記２０１Ｂ７細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地は、２０％ ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ、１０８２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）と、１％ Ｌ−グルタミンと、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、１５１４０、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の０．５％）と、１００μＭ ２−メルカプトエタノールと、５μｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、東洋紡績（株）ライフサイエンス事業部）とが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄ６４２１、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）である。前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地は、毎日交換された。
(3) Human iPS cell culture Human iPS cell 201B7 strain (Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861 (2007)) was provided by Professor Shinya Yamanaka (Kyoto University iPS Cell Research Institute). The day before 201B7 cells are cultured, MEF cells are seeded in a gelatin-coated culture dish (353003, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) at 1 × 10 6 cells per day, and the medium for MEF cells is used as a medium. And incubated overnight at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam atmosphere. About 1 × 10 5 201B7 cells were seeded on the MEF cells per dish. Thereafter, the 201B7 cells were cultured in a culture medium for human iPS cell culture at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated water vapor atmosphere. The human iPS cell culture medium contains 20% knockout serum replacement additive (KSR, 10828, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.), 1% non-essential amino acid (NEAA), 1% L-glutamine, 50 units / mL Penicillin, 50 μg / mL (0.5% of Pen Strep (GIBCO, 15140, Life Technologies Japan)), 100 μM 2-mercaptoethanol, and 5 μg / mL FGF-2 (PeproTech, Toyobo Life Co., Ltd.) Science Division) and DMEM / F12 medium (D6421, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.). The human iPS cell culture medium was changed daily.
（４）ヒトｉＰＳ細胞の継代培養
細胞分離溶液（ＲＣＨＥＴＰ００２、コスモ・バイオ株式会社）を用いて前記ディッシュから解離された２０１Ｂ７細胞が前記ディッシュ１枚あたり約１×１０５個に希釈されて継代培養に用いられた。
(4) Subculture of human iPS cells 201B7 cells dissociated from the dish using a cell separation solution (RCHETP002, Cosmo Bio Inc.) are diluted to about 1 × 10 5 cells per dish and are subcultured. Used for subculture.
（５）レンチウイルスベクターの作成
テトラサイクリン誘導型ｃＤＮＡ発現プラスミド（ＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴ）と、パッケージングプラスミド（ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ）とは、三好浩之氏（理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチーム）から供与された。Ｍｙｃタグとｐ１６との融合タンパク質（以下、「ｐ１６−ｍｙｃ」という。）と、Ｆｌａｇタグとｐ５３との融合タンパク質（以下、「Ｆｌａｇ−ｐ５３」という。）と、ＨＡタグとｐ２１との融合タンパク質（以下、「ｐ２１−ＨＡ」という。）とをエンコードするポリヌクレオチドが、それぞれ、プラスミド（ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ）にクローニングされた。前記ポリヌクレオチドは、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、それぞれ、前記テトラサイクリン誘導型ｃＤＮＡ発現プラスミド（ＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴ）のＲｆＡ（Ｇａｔｅｗａｙ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチド）を置換するように挿入された。構築されたプラスミドは、それぞれ、「ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター」、「Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター」及び「ｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクター」と命名された。
(5) Preparation of Lentiviral Vector Tetracycline-inducible cDNA expression plasmid (CSIV-TRE-RfA-UbC-KT) and packaging plasmids (pCAG-HIVgp and pCMV-VSV-G-RSV-Rev) are Hiroyuki Miyoshi Granted by Mr. (RIKEN BioResource Center Cell Fate Information Analysis Technology Development Subteam). A fusion protein of Myc tag and p16 (hereinafter referred to as “p16-myc”), a fusion protein of Flag tag and p53 (hereinafter referred to as “Flag-p53”), and a fusion protein of HA tag and p21 (Hereinafter referred to as “p21-HA”) were cloned into a plasmid (pENTR ™ 1A), respectively. The polynucleotides can be obtained by using Gateway LR Clonase (trademark) II Enzyme Mix (11791-020, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.), respectively, and the tetracycline-inducible cDNA expression plasmid (CSIV-TRE-RfA-UbC-KT). ) RfA (Gateway Reading Frame Cassette A (Invitrogen), a polynucleotide encoding a chloramphenicol resistance gene). The constructed plasmids were named “p16-myc induced expression vector”, “Flag-p53 induced expression vector” and “p21-HA induced expression vector”, respectively.
（６）宿主細胞の培養
前記誘導発現ベクターの挿入配列を含む自己不活性化レンチウイルス粒子を放出させるための宿主細胞として、継代回数の少ない２９３Ｔ細胞が用いられた。前記２９３Ｔ細胞は、０．０１％ ポリ−Ｌ−リジン溶液（Ｐ４８３２、シグマアルドリッチジャパン株式会社）で１０分間コーティングされた培養ディッシュ（３５３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）にディッシュ１枚あたり５×１０６個播種された。前記細胞は、１０％ ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（以下、「２９３Ｔ細胞用培地」という。）を用いて、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で２４時間培養された。
(6) Host cell culture As a host cell for releasing self-inactivating lentiviral particles containing the insertion sequence of the inducible expression vector, 293T cells with a small number of passages were used. The 293T cells are 5 × 10 5 per dish in a culture dish (353003, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) coated with a 0.01% poly-L-lysine solution (P4832, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) for 10 minutes. Six seeded. The cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter referred to as “293T cell medium”) supplemented with 10% fetal calf serum at 37 ° C., 10% CO 2 and saturated water vapor atmosphere for 24 hours. It was done.
（７）宿主細胞への感染
ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター又はｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクターは、リン酸カルシウム法によって２９３Ｔ細胞に２種類のパッケージングプラスミドｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖと同時にトランスフェクションされた。前記細胞は、３７°Ｃ、３％ＣＯ２で１２〜１８時間培養された。ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター及びｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクターがトランスフェクションされた前記細胞から放出される自己不活性化レンチウイルスは、それぞれ、「ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ウイルス」、「Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ウイルス」及び「ｐ２１−ＨＡ誘導発現ウイルス」という。その後、前記２９３Ｔ細胞用培地から、１０μＭフォルスコリン（Ｄ４５４６、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）と、１０％ ウシ胎仔血清とを添加したダルベッコ変法イーグル培地に切り換えられ、前記細胞は、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２で２日間培養された。
(7) Infection to host cells The p16-myc-inducible expression vector, the Flag-p53-inducible expression vector, or the p21-HA-inducible expression vector is transformed into two types of packaging plasmids pCAG-HIVgp and pCMV-VSV- by the calcium phosphate method. Co-transfected with G-RSV-Rev. The cells were cultured at 37 ° C., 3% CO 2 for 12-18 hours. Self-inactivating lentiviruses released from the cells transfected with p16-myc-induced expression vector, Flag-p53-induced expression vector, and p21-HA-induced expression vector are “p16-myc-induced expression virus”, It is referred to as “Flag-p53-induced expression virus” and “p21-HA-induced expression virus”. Thereafter, the medium for 293T cells was switched to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10 μM forskolin (D4546, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) and 10% fetal bovine serum. Incubated for 2 days in% CO 2 .
（８）レンチウイルスの濃縮
２日間培養後の前記培養液は、０．４５μｍのフィルターでろ過された後、超遠心分離用チューブに回収された。超遠心分離機（ｈｉｍａｃ ＳＣＰ ８５Ｇ、日立製作所）を用いて２０°Ｃ、５００００×ｇで２時間の超遠心分離が行われた。沈殿物の懸濁液は限外濾過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ、分画分子量１００，０００、ＵＦＣ５１００９６、日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮され、濃縮ウイルス液が調製された。
(8) Concentration of lentivirus The culture solution after culturing for 2 days was filtered through a 0.45 μm filter and then collected in an ultracentrifugation tube. Ultracentrifugation was performed at 20 ° C. and 50000 × g for 2 hours using an ultracentrifuge (himac SCP 85G, Hitachi, Ltd.). The suspension of the precipitate was concentrated using an ultrafiltration filter (Amicon ultra centrifugal filter units, fractional molecular weight 100,000, UFC510096, Nihon Millipore Corporation) to prepare a concentrated virus solution.
（９）ヒトｉＰＳ細胞への遺伝子導入
前記細胞分離溶液を用いて解離された２０１Ｂ７細胞は、前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地に懸濁された。この細胞懸濁液に対して体積比０．０５倍量のレンチウイルス液が添加され、３７°Ｃ、３％ＣＯ２で３時間静置された後、前記フィーダー細胞上に播種された。前記２０１Ｂ７細胞は終夜培養された後、培地が交換された。
(9) Gene introduction into human iPS cells The 201B7 cells dissociated using the cell separation solution were suspended in the human iPS cell culture medium. A 0.05-fold volume lentivirus solution was added to the cell suspension, allowed to stand at 37 ° C. and 3% CO 2 for 3 hours, and then seeded on the feeder cells. The 201B7 cells were cultured overnight and then the medium was changed.
（１０）遺伝子導入されたヒトｉＰＳ細胞の選択
ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ウイルス、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ウイルス又はｐ２１−ＨＡ誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞は、クサビラ−オレンジ蛍光タンパク質の赤色蛍光を指標として蛍光顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、株式会社キーエンス）により同定され、赤色蛍光陽性の細胞の分離、解離、及びコロニー形成を繰り返して、安定的にクサビラ−オレンジ蛍光タンパク質を発現するクローンが選択された。
(10) Selection of gene-introduced human iPS cells 201B7 cells into which p16-myc-induced expression virus, Flag-p53-induced expression virus or p21-HA-induced expression virus has been introduced are indicated by the red fluorescence of the wedge-orange fluorescent protein. Were identified by a fluorescence microscope (Biozero, Keyence Co., Ltd.), and a clone that stably expresses the wedge-orange fluorescent protein was selected by repeating separation, dissociation, and colony formation of red fluorescent positive cells.
（１１）アルカリフォスファターゼ染色
アルカリフォスファターゼ染色は、アルカリフォスファターゼキット（８６Ｌ３Ｒ、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いて製造者の指示書に従って行われた。観察には、顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、株式会社キーエンス）が用いられた。
(11) Alkaline phosphatase staining Alkaline phosphatase staining was performed using an alkaline phosphatase kit (86L3R, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) according to the manufacturer's instructions. A microscope (Biozero, Keyence Corporation) was used for the observation.
（１２）ドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導
２０１Ｂ７細胞に導入された外来遺伝子の発現誘導は、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄ９８９１、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地を用いて行われた。陰性対照には、ドキシサイクリンと同じ体積の水を添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地が用いられた。
(12) Induction of gene expression by doxycycline Induction of expression of a foreign gene introduced into 201B7 cells was performed by adding 1 μg / mL, 2 μg / mL, 5 μg / mL or 10 μg / mL of doxycycline (D9891, Sigma-Aldrich Japan). This was performed using a culture medium for human iPS cell culture. As a negative control, a human iPS cell culture medium supplemented with the same volume of water as doxycycline was used.
（１３）ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析は、当業者に周知の標準的な方法に従って行われた。１次抗体には、マウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０ Ｓｃ４０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、コスモ・バイオ株式会社）、マウス抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５ １１５８３８１６００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、及び、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２ Ｆ３１６５、シグマアルドリッチジャパン株式会社）が用いられた。２次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が用いられた。検出は、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＲＰＮ２２０９、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて行われた。
(13) Western blot analysis Western blot analysis was performed according to standard methods well known to those skilled in the art. Primary antibodies include mouse anti-c-myc antibody (9E10 Sc40, Santa Cruz Biotechnology, Cosmo Bio), mouse anti-HA antibody (12CA5 115838001, Roche Diagnostics), and mouse anti-Flag. An antibody (M2 F3165, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) was used. As the secondary antibody, an HRP-labeled goat anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare) was used. Detection was performed using an ECL western blotting detection reagent (RPN2209, GE Healthcare Japan, Inc.).
２．結果
（１）遺伝子導入されたヒトｉＰＳ細胞
ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３のそれぞれの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞から、クサビラ−オレンジ蛍光タンパク質の赤色蛍光陽性、かつ、未分化細胞の形態を示す細胞のクローンが単離された。これらの細胞は、アルカリフォスファターゼ染色で陽性であった（図示されない）ことから、ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ベクターの挿入配列が安定的にインテグレーションされた２０１Ｂ７細胞は、生化学的なマーカーからも未分化状態を維持していることが示された。
2. Results (1) Gene-introduced human iPS cells From 201B7 cells into which the respective induction-expressed viruses of p16-myc, p21-HA, and Flag-p53 have been introduced, red fluorescent positive of the wedge-orange fluorescent protein and undifferentiated A cell clone exhibiting cell morphology was isolated. Since these cells were positive by alkaline phosphatase staining (not shown), the 201B7 cells in which the insertion sequences of the p16-myc, p21-HA and Flag-p53 inducible expression vectors were stably integrated were viable. Chemical markers also indicated that the undifferentiated state was maintained.
（２）ドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導
図１は、前記誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞におけるドキシサイクリンによる発現誘導の実験結果を示すウェスタンブロット図である。ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ又はＦｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞が播種されて２４時間後から４８時間後までの間ドキシサイクリンを含む培地に切り替えられ、その後、細胞は解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで溶解され、ウェスタンブロッティング法に供された。ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１は、それぞれ、連結されたｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦｌａｇタグに特異的な抗体で検出された。その結果、図に示すとおり、１ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１は、いずれも、陰性対照（ｃｏｎｔ）では全く発現が認められなかったが、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン存在下の２４時間の培養では発現が十分に認められた。なお、最大限の誘導活性は、ドキシサイクリン濃度１μｇ／ｍＬで得られた。
(2) Gene Expression Induction by Doxycycline FIG. 1 is a Western blot diagram showing the results of an experiment of expression induction by doxycycline in 201B7 cells into which the induced expression virus has been introduced. 201B7 cells introduced with a p16-myc, p21-HA or Flag-p53 inducible expression virus were seeded and switched to a medium containing doxycycline for 24 to 48 hours, after which the cells were dissociated, It was dissolved in a sample buffer for SDS-PAGE and subjected to Western blotting. p16, p53 and p21 were detected with antibodies specific for the linked myc tag, HA tag and Flag tag, respectively. As a result, as shown in the figure, 1p16, p53 and p21 were not expressed at all in the negative control (cont), but 1 μg / mL, 2 μg / mL, 5 μg / mL and 10 μg / mL doxycycline. Expression was sufficiently observed in the culture for 24 hours in the presence. The maximum inducing activity was obtained at a doxycycline concentration of 1 μg / mL.
継続的に発現が誘導された遺伝子による未分化ｉＰＳ細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３のそれぞれの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養及び遺伝子発現誘導は、実施例１で説明された方法に従って行われた。遺伝子発現誘導による細胞増殖への影響を調べるためには、１２ウェルの培養プレート（３５３０４８、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に５×１０４個／ウェルのＭＥＦ細胞が播種された。翌日、２０１Ｂ７細胞は、１×１０４個／ウェルとなるように前記培養プレートに播種された。２４時間の培養後、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンか、同体積の水かを添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられ、培地交換は毎日行われた。毎日それぞれの実験条件ごとに２個のウェルの２０１Ｂ７細胞が細胞分離溶液によって解離され、細胞数が算出された。
Suppression of proliferation of undifferentiated iPS cells by genes whose expression is continuously induced Materials and Methods The culture and gene expression induction of 201B7 cells into which each of the p16-myc, p21-HA and Flag-p53 induction-expressed viruses was introduced were performed according to the method described in Example 1. In order to examine the effect of gene expression induction on cell proliferation, 5 × 10 4 cells / well of MEF cells were seeded on a 12-well culture plate (353048, Falcon, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.). The next day, 201B7 cells were seeded on the culture plate at 1 × 10 4 cells / well. After culturing for 24 hours, the medium was changed to human iPS cell culture medium supplemented with 1 μg / mL doxycycline or the same volume of water, and the medium was changed every day. Every day, for each experimental condition, two wells of 201B7 cells were dissociated by the cell separation solution, and the number of cells was calculated.
２．結果
図２−１、図２−２及び図２−３は、それぞれ、ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３の継続的な発現誘導が２０１Ｂ７細胞の増殖に与える効果を調べた実験結果を示すグラフである。図２−１、図２−２及び図２−３において、縦軸は、ウェルあたりの細胞数で、単位は１×１０４個である。横軸は、培養日数で、横軸の下の帯は培養１日目以後ドキシサイクリンによる誘導が継続されたことを示す。実線は培養１日目以後ドキシサイクリンによる誘導が継続された細胞の増殖曲線を示し、破線は全く誘導されなかった細胞の増殖曲線を示す。図２−１、図２−２及び図２−３に示されるとおり、ｐ１６及びｐ５３は２０１Ｂ７細胞の増殖をほぼ完全に抑制したが、ｐ２１は２０１Ｂ７細胞の増殖にはほとんど影響を与えなかった。本実施例の結果から、２０１Ｂ７細胞の増殖は、ｐ１６及びｐ５３によって顕著に抑制されるが、ｐ２１によっては抑制されないことが示された。なお、ｐ１６及びｐ５３の誘導開始から４８時間までの培養では、単離細胞の浮遊が観察された。
2. Results FIG. 2-1, FIG. 2-2, and FIG. 2-3 are graphs showing the results of experiments examining the effect of continuous expression induction of p16, p21, or p53 on the proliferation of 201B7 cells, respectively. In FIGS. 2-1, 2-2, and 2-3, the vertical axis represents the number of cells per well, and the unit is 1 × 10 4 . The horizontal axis represents the number of culture days, and the band below the horizontal axis indicates that induction by doxycycline was continued after the first day of culture. The solid line shows the growth curve of cells in which induction with doxycycline was continued after the first day of culture, and the broken line shows the growth curve of cells that were not induced at all. As shown in FIGS. 2-1, 2-2, and 2-3, p16 and p53 almost completely suppressed the growth of 201B7 cells, but p21 had little effect on the growth of 201B7 cells. From the results of this Example, it was shown that the growth of 201B7 cells was significantly suppressed by p16 and p53, but not by p21. In the culture from the start of induction of p16 and p53 to 48 hours, floating of isolated cells was observed.
ｐ１６の一過性の発現誘導による未分化ｉＰＳ細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
ｐ１６−ｍｙｃの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養、遺伝子発現誘導及び細胞数測定は、実施例２で説明された方法に従って行われた。２４時間培養後、培地は１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられた。さらに２４又は４８時間培養後、培地はドキシサイクリンを含まないヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられた。その後、ドキシサイクリンを含まないヒトｉＰＳ細胞培養用培地が毎日交換された。
Inhibition of proliferation of undifferentiated iPS cells by transient expression induction of p16 Materials and Methods Culture of 201B7 cells introduced with the p16-myc induced expression virus, induction of gene expression, and measurement of the number of cells were performed according to the method described in Example 2. After culturing for 24 hours, the medium was switched to a medium for culturing human iPS cells supplemented with 1 μg / mL doxycycline. After a further 24 or 48 hours of culture, the medium was switched to a human iPS cell culture medium without doxycycline. Thereafter, the human iPS cell culture medium without doxycycline was changed daily.
２．結果
図３は、ｐ１６の一過性の発現誘導による２０１Ｂ７細胞の増殖への影響を調べた実験結果を示すグラフである。図３のグラフはそれぞれ２回の実験結果の平均値がプロットされた。図３において、縦軸は、ウェルあたりの細胞数で、単位は１×１０４個である。横軸は、培養日数で、横軸の下の帯は培養１日目から２４時間だけドキシサイクリンによる誘導が行われたことを示す。実線は培養１日目から２４時間だけドキシサイクリンによるｐ１６発現誘導が行われた細胞の増殖曲線を示し、破線は全く誘導されなかった細胞の増殖曲線を示す。図３に示されるとおり、ｐ１６が２４時間発現誘導されただけで、２０１Ｂ７細胞の増殖は顕著に抑制された。また、発現誘導終了後も少なくとも５日間２０１Ｂ７細胞は増殖しなかった。ｐ１６が４８時間発現誘導された際に、ヒトｉＰＳ細胞の形態は扁平状に肥大化した（図示されない）。
2. Results FIG. 3 is a graph showing the experimental results of examining the influence of p16 transient expression on the proliferation of 201B7 cells. In the graph of FIG. 3, the average values of the two experimental results are plotted. In FIG. 3, the vertical axis represents the number of cells per well, and the unit is 1 × 10 4 . The horizontal axis indicates the number of culture days, and the band below the horizontal axis indicates that induction by doxycycline was performed for 24 hours from the first day of culture. The solid line shows the growth curve of cells in which p16 expression was induced by doxycycline for 24 hours from the first day of culture, and the broken line shows the growth curve of cells that were not induced at all. As shown in FIG. 3, the proliferation of 201B7 cells was remarkably suppressed only by the expression induction of p16 for 24 hours. In addition, 201B7 cells did not proliferate for at least 5 days after the end of expression induction. When the expression of p16 was induced for 48 hours, the morphology of human iPS cells became flattened (not shown).
以上の実験結果から、ヒトｉＰＳ細胞は、ｐ１６の一過的発現誘導によって、増殖抑制されること、及び、老化した細胞と同様の形態となることが示された。したがって、ｐ１６は、細胞分化を誘導ことによって幹細胞の増殖を抑制できることが示唆された。 From the above experimental results, it was shown that human iPS cells are inhibited from proliferation by the transient expression induction of p16, and have the same form as aging cells. Therefore, it was suggested that p16 can suppress the proliferation of stem cells by inducing cell differentiation.
ｉｎ ｖｉｖｏにおける未分化細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
（１）ヒトｉＰＳ細胞
Ｆｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養は、実施例１で説明された方法に従って行われた。
In vivo growth inhibition of undifferentiated cells Materials and Methods (1) Human iPS cells Culture of 201B7 cells into which a virus-inducible expression virus of Flag-p53 was introduced was performed according to the method described in Example 1.
（２）マウス
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６〜１５週齢、チャールズ・リバー）が移植実験に用いられた。
(2) Mouse NOD / SCID mice (6-15 weeks old, Charles River) were used for transplantation experiments.
（３）マウスへのヒトｉＰＳ細胞の移植
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは麻酔下で開頭され、Ｆｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞（２×１０５個／２μＬ）が、ブレグマ（矢状縫合と冠状縫合との交点）から前方１ｍｍ、右側２ｍｍ、及び、深さ３ｍｍの線条体に移植された。
(3) Transplantation of human iPS cells into mice NOD / SCID mice were craniopsied under anesthesia, and 201B7 cells (2 × 10 5 cells / 2 μL) into which Flag-p53-inducible expression virus was introduced were bregma (sagittal). From the intersection of the suture and the coronal suture), it was transplanted into a striatum 1 mm forward, 2 mm right, and 3 mm deep.
（４）ｐ５３の発現誘導
２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した飲水が、遮光した給水瓶で、実験群のマウスに移植日から３週間投与された。前記給水瓶の飲水は３日毎に交換された。陰性対照群のマウスには、ドキシサイクリンを添加しない飲水が投与された。
(4) Induction of p53 expression Drinking water supplemented with 2 mg / mL doxycycline was administered to mice in the experimental group for 3 weeks from the day of transplantation using a light-shielded water bottle. The drinking water in the water bottle was changed every 3 days. Mice in the negative control group were given drinking water without the addition of doxycycline.
（５）組織学的解析
２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した飲水投与３週間後、マウスは屠殺され、４％パラホルムアルデヒドを添加したリン酸緩衝生理食塩水で潅流固定された脳組織がビブラトームで薄切され、５０μｍ厚の連続切片が作成された。３６０μｍ間隔の切片が共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス株式会社）で観察され、脳内に移植されたｉＰＳ細胞塊の最大径が測定された。
(5) Histological analysis Three weeks after administration of drinking water supplemented with 2 mg / mL doxycycline, the mice were sacrificed, and the brain tissue perfused and fixed in phosphate buffered saline supplemented with 4% paraformaldehyde was diluted with a vibratome. Cut and 50 μm thick serial sections were made. Sections at intervals of 360 μm were observed with a confocal laser microscope (Olympus Corporation), and the maximum diameter of the iPS cell mass transplanted into the brain was measured.
２．結果
図４は、マウス脳内に移植された２０１Ｂ７細胞の増殖に対するドキシサイクリン添加飲水によるｐ５３誘導の影響を調べた実験結果を示す棒グラフである。縦軸はマウス脳内移植後３週間目の細胞塊の最大径の相対値を示す。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び実験群のマウスそれぞれ３匹の細胞塊の最大径相対値の標準偏差を示す。アステリスク（＊）は、スチューデントのｔ検定においてｐ値が０．２１％であることを示す。なお、陰性対照群の細胞塊の最大断面積の平均値は８．０２４ｍｍ２であったのに対し、実験群の細胞塊の最大断面積の平均値は０．２０７ｍｍ２であった。図４に示されるとおり、陰性対照群では３週間で２０１Ｂ７細胞がマウス脳内で増殖して大きな細胞塊を形成するのに対し、実験群では生体内に移植された２０１Ｂ７細胞でもドキシサイクリンにより細胞増殖が抑制された。
2. Results FIG. 4 is a bar graph showing the experimental results of examining the effect of p53 induction by doxycycline-added drinking water on the growth of 201B7 cells transplanted into the mouse brain. The vertical axis represents the relative value of the maximum diameter of the cell mass 3 weeks after transplantation into the mouse brain. The error bar for each experimental condition indicates the standard deviation of the relative maximum value of the cell mass of 3 mice each in the negative control group and the experimental group. An asterisk (*) indicates that the p-value is 0.21% in Student's t-test. The average value of the maximum cross-sectional area of the cell mass of the negative control group was 8.024 mm 2 , whereas the average value of the maximum cross-sectional area of the cell mass of the experimental group was 0.207 mm 2 . As shown in FIG. 4, in the negative control group, 201B7 cells proliferate in the mouse brain in 3 weeks to form a large cell mass, whereas in the experimental group, 201B7 cells transplanted in vivo also grew by doxycycline. Was suppressed.
以上の実験結果から、本発明の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞は、生体内に移植されても、体外からの遺伝子発現操作によって腫瘍化を有効に防止できることが示された。 From the above experimental results, it was shown that 201B7 cells introduced with the induced expression virus of the present invention can effectively prevent tumorigenesis by gene expression manipulation from outside the body even when transplanted in vivo.
ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３は、いずれも、細胞の早期老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）や、活性酸素種等に対するゲノム安定性に関係するタンパク質をエンコードする遺伝子である。ｐ５３遺伝子は多くの悪性腫瘍で突然変異を起こしており、ｐ５３遺伝子に欠失その他の突然変異がある細胞に野生型ｐ５３遺伝子を強制発現させるとアポトーシスによる細胞死が誘発される（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ、Ｍ．Ｖ．及びＥｌ−Ｄｅｉｒｙ、Ｗ．Ｓ．、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、６７：３８６（１９９６））。そこで、野生型ｐ５３遺伝子を発現するウイルスベクターを含む制がん剤が提案されている（ＷＯ０１／０８３７１０）。しかし、ヒトＥＳ細胞（Ｍｉｕｒａ、Ｔ．ら、Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ、３：３３３（２００４））及びｉＰＳ細胞（Ｇｈｏｓｈ、Ｚ．ら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、５：ｅ８９７５）ではｐ５３の発現が知られており、単純にｐ５３遺伝子を強制発現してもアポトーシスを起こすとは考えられてはいなかった。最近、ｐ１６、ｐ２１及びｐ５３は、いずれも、体細胞をｉＰＳ細胞に変換するリプログラミングを阻害する作用があることが報告された（Ｈｏｎｇ， Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ４６０：１１３２（２００９）， Ｌｉ， Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ４６０：１１３６（２００９）、Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４０（２００９）、Ｕｔｉｋａｌ， Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４５（２００９）、Ｍａｒｉｏｎ、Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４９（２００９））。しかし、ｐ５３及びｐ１６だけが本発明のｉＰＳ細胞の増殖抑制効果を奏し、ｐ２１は本発明の効果を奏さない。したがって、本発明は、従来のｐ１６、ｐ２１及びｐ５３に関する知見から当業者が予測することができない異質な作用効果を奏する発明である。 p16, p21, or p53 is a gene that encodes a protein involved in cell senescence, genome stability against reactive oxygen species, and the like. The p53 gene is mutated in many malignant tumors, and cell death due to apoptosis is induced when the wild-type p53 gene is forcibly expressed in cells with deletions or other mutations in the p53 gene (Blagosklonny, M. et al. V. and El-Deiry, W. S., Int. J. Cancer, 67: 386 (1996)). Thus, an anticancer drug containing a viral vector expressing the wild-type p53 gene has been proposed (WO01 / 083710). However, p53 expression is known in human ES cells (Miura, T. et al., Aging Cell, 3: 333 (2004)) and iPS cells (Ghosh, Z. et al., PLoS ONE, 5: e8975). Even if the p53 gene was forcibly expressed, it was not thought to cause apoptosis. Recently, p16, p21 and p53 were all reported to inhibit reprogramming to convert somatic cells into iPS cells (Hong, H. et al., Nature, 460: 1132 (2009), Li). , H. et al., Nature, 460: 1136 (2009), Kawamura, T. et al., Nature, 460: 1140 (2009), Utikal, J. et al., Nature, 460: 1145 (2009), Marion, RM. Et al., Nature, 460: 1149 (2009)). However, only p53 and p16 have the iPS cell growth inhibitory effect of the present invention, and p21 does not have the effect of the present invention. Therefore, the present invention is an invention that produces a foreign effect that cannot be predicted by those skilled in the art from the knowledge of conventional p16, p21, and p53.
Claims (14)
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される、少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物。 A composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells,
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells When,
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and A protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(E) a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) The cell membrane permeable peptide contains at least one protein selected from the group consisting of a fusion protein linked to any one of the above (a) to (f). A composition for inhibiting proliferation of potent stem cells.
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物。 A composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells,
(A) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having
(D) homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having activity of inhibiting proliferation;
(E) a polynucleotide encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions and has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells;
(F) the polynucleotide encoding the specific binding tag peptide comprises at least one polynucleotide selected from the group consisting of the fusion polynucleotide linked to any one of the above (a) to (e) A composition for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells,
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたタンパク質を多能性幹細胞中に導入するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法。 A method for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells,
(1)
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells When,
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and A protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(E) a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to any one of the above (a) to (e);
(G) providing at least one protein selected from the group consisting of a fusion protein in which a cell membrane permeable peptide is linked to any one of the above (a) to (f);
(2)
A method for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells, comprising the step of introducing the protein prepared in step (1) into pluripotent stem cells.
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列との相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるヌクレオチド配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入するステップと、
（３）
ステップ（２）で導入されたポリヌクレオチドがエンコードするタンパク質を発現するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法。 A method for inhibiting proliferation of pluripotent stem cells,
(1)
(A) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding
(C) an activity having an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A polynucleotide encoding a protein having
(D) a pluripotent stem cell having a nucleotide sequence whose homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or more, and A polynucleotide encoding a protein having an activity of inhibiting the growth of
(E) a polynucleotide that encodes a protein that hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 under stringent conditions and has an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells;
(F) preparing at least one polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide encoding a specific binding tag peptide and a fusion polynucleotide linked to any one of the above (a) to (e) And steps to
(2)
Introducing the polynucleotide prepared in step (1) into pluripotent stem cells;
(3)
A method for suppressing proliferation of pluripotent stem cells, comprising a step of expressing a protein encoded by the polynucleotide introduced in step (2).
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに連結された融合タンパク質と
からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を誘導可能に発現するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、多能性幹細胞。 (A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells; ,
(C) It consists of an amino acid sequence whose homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is 80%, 90%, 95% or more, and has an activity of suppressing the proliferation of pluripotent stem cells A protein having
(D) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide whose homology with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is 70%, 80%, 85%, 90% or 95% or more And a protein having an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells,
(E) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions, and has an activity of suppressing proliferation of pluripotent stem cells Protein,
(F) The specific binding tag peptide includes a polynucleotide that inducibly expresses at least one protein selected from the group consisting of the fusion protein linked to any of (a) to (e) above. A pluripotent stem cell characterized by
（１）
多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物を用意するステップと、
（４）
前記細胞医薬組成物に前記組成物を曝露するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去する方法。 A method for removing undifferentiated pluripotent stem cells mixed in a cell pharmaceutical composition containing differentiated cells derived from pluripotent stem cells,
(1)
Preparing pluripotent stem cells;
(2)
Differentiating the pluripotent stem cells to produce a cell pharmaceutical composition;
(3)
Providing a composition according to any one of claims 1 to 6;
(4)
Exposing the composition to the cell pharmaceutical composition. A method for removing undifferentiated pluripotent stem cells mixed in a cell pharmaceutical composition containing differentiated cells derived from pluripotent stem cells.
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|---|---|---|---|---|
| WO2014200117A1 (en) * | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Sucampo Ag | Method for suppressing tumorigenicity of stem cells |
| WO2015107888A1 (en) | 2014-01-14 | 2015-07-23 | 国立大学法人鹿児島大学 | Novel method for labelling cancerization-causing cell in stem cells, and therapy method |
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-
2011
- 2011-06-28 JP JP2011143202A patent/JP2013009742A/en not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014200117A1 (en) * | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Sucampo Ag | Method for suppressing tumorigenicity of stem cells |
| WO2015107888A1 (en) | 2014-01-14 | 2015-07-23 | 国立大学法人鹿児島大学 | Novel method for labelling cancerization-causing cell in stem cells, and therapy method |
| EP3690055A1 (en) | 2014-01-14 | 2020-08-05 | Kagoshima University | Method for labelling cancerization-causing cell in stem cells |
| WO2016114341A1 (en) * | 2015-01-14 | 2016-07-21 | 国立大学法人京都大学 | Compound for identifying pluripotent cells |
| US10689624B2 (en) | 2015-01-14 | 2020-06-23 | Kyoto University | Compound for identifying pluripotent cells |
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