JP2013066430A - Composition containing pyrroloquinoline quinone - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ピロロキノリンキノンと、リン酸カルシウム系化合物とを含んでなる、ピロロキノリンキノン含有組成物およびその製造方法に関する。本発明は、また、ピロロキノリンキノンの安定化方法や変色方法に関する。 The present invention relates to a pyrroloquinoline quinone-containing composition comprising pyrroloquinoline quinone and a calcium phosphate compound, and a method for producing the same. The present invention also relates to a method for stabilizing or changing color of pyrroloquinoline quinone.
ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」と表すことがある）は、新しいビタミンの可能性があることが提案されて（非特許文献１）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。ＰＱＱについては、近年までに、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキサラ−ゼＩ阻害作用、制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。よって、ＰＱＱは、安定性や吸収性がより向上されることが求められている。吸収性を向上させる一般的な方法としては、シクロデキストリンによる包接化やリポソーム化が知られている。しかしながら、シクロデキストリンはそれ自体が高価であり、また、リポソーム化は製造に費用がかかる。そのため、より安価で簡便に吸収性を向上させる方法が求められている。 Pyrroloquinoline quinone (hereinafter sometimes referred to as “PQQ”) has been proposed as a potential new vitamin (Non-patent Document 1), and has attracted attention as a useful substance for health supplements, cosmetics, etc. ing. PQQ is present not only in bacteria but also in eukaryotic molds and yeasts, and plays an important role as a coenzyme. As for PQQ, until recently, cell growth promoting action, anti-cataract action, liver disease prevention and treatment action, wound healing action, anti-allergy action, reverse transcriptase inhibition action, glyoxalase I inhibition action, anticancer action, etc. Many physiological activities have been revealed. Therefore, PQQ is required to have improved stability and absorbability. As a general method for improving the absorbability, inclusion with cyclodextrin and liposome formation are known. However, cyclodextrins are themselves expensive and liposome formation is expensive to manufacture. Therefore, there is a demand for a method for improving the absorbability more inexpensively and easily.
また、ピロロキノリンキノンやその塩は赤から濃赤色であるが、アスコルビン酸等の物質と反応すると黒く変色する。黒色は見た目が好ましく思われないことが多く、そのため、変色させないようにする技術が求められている。一方、食品等の嗜好性の観点から、赤色も好ましく思われないことが多い。着色料により色を変える方法もあるが、濃い赤色は十分に色を変えることが困難であり、また、近年では、着色料の添加が好まれない傾向にある。 In addition, pyrroloquinoline quinone and its salts are red to dark red, but turn black when reacted with substances such as ascorbic acid. In many cases, the appearance of black does not seem to be preferable. Therefore, a technique for preventing discoloration is demanded. On the other hand, red is often not preferred from the viewpoint of palatability of foods and the like. Although there is a method of changing the color with a colorant, it is difficult to sufficiently change the color of dark red, and in recent years, the addition of a colorant tends to be less preferred.
本発明は、ピロロキノリンキノンの安定性、吸収性が向上したピロロキノリンキノンおよびその製造方法を提供することを目的とする。本発明は、また、ピロロキノリンキノンの安定化方法や変色方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a pyrroloquinoline quinone having improved stability and absorbability of pyrroloquinoline quinone and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a method for stabilizing or changing the color of pyrroloquinoline quinone.
本発明者らは、今般、ピロロキノリンキノンとリン酸カルシウム系化合物とを混合することにより、ピロロキノリンキノンの安定性、吸収性が向上したピロロキノリンキノン含有組成物を製造できることを見出した。本発明者らは、また、該ピロロキノリンキノン含有組成物を使用することで着色料を用いることなくピロロキノリンキノンの色を変化させることできることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventors have now found that a pyrroloquinoline quinone-containing composition with improved stability and absorbability of pyrroloquinoline quinone can be produced by mixing pyrroloquinoline quinone and a calcium phosphate compound. The present inventors have also found that the color of pyrroloquinoline quinone can be changed without using a colorant by using the pyrroloquinoline quinone-containing composition. The present invention is based on these findings.
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを含んでなる、ピロロキノリンキノン含有組成物。
（２）ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを混合して得られる、（１）に記載の組成物。
（３）混合するピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比が、１：２０〜１：１００００である、（２）に記載の組成物。
（４）ピロロキノリンキノンまたはその塩を溶液として用い、該溶液のｐＨが、２〜８である、（２）または（３）に記載の組成物。
（５）ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とが複合体を形成してなる、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）複合体が、ピロロキノリンキノンまたはその塩がリン酸カルシウム系化合物へ吸着して形成される、（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）カルボニル反応性物質、アルカリ、または多価カルボン酸をさらに含んでなる、（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のピロロキノリンキノン含有組成物の乾燥物。
（９）ピロロキノリンキノンまたはその塩の安定化方法であって、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを混合させることを含んでなる、方法。
（１０）ピロロキノリンキノンまたはその塩の変色方法であって、リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩と、着色用物質を混合させることを含んでなる、方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A pyrroloquinoline quinone-containing composition comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound.
(2) The composition according to (1), obtained by mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound.
(3) The composition according to (2), wherein a weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound to be mixed is 1:20 to 1: 10000.
(4) The composition according to (2) or (3), wherein pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is used as a solution, and the pH of the solution is 2 to 8.
(5) The composition according to any one of (1) to (4), wherein pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound form a complex.
(6) The composition according to any one of (1) to (5), wherein the complex is formed by adsorbing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to a calcium phosphate compound.
(7) The composition according to any one of (1) to (6), further comprising a carbonyl-reactive substance, an alkali, or a polyvalent carboxylic acid.
(8) A dried product of the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to any one of (1) to (7).
(9) A method for stabilizing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, which comprises mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof with a calcium phosphate compound.
(10) A method for changing the color of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, comprising mixing a coloring substance with pyrroloquinoline quinone or a salt thereof mixed with a calcium phosphate compound.
本発明によれば、安定性や吸収性が向上したピロロキノリンキノンを製造することができる。本発明によれば、また、目的の色のピロロキノリンキノンを製造することができる。本発明によれば、安定性や吸収性が向上し、さらには目的の色に変化させたピロロキノリンキノンを効率的に製造できる点で有利である。 According to the present invention, pyrroloquinoline quinone having improved stability and absorbability can be produced. According to the present invention, pyrroloquinoline quinone having the desired color can also be produced. According to the present invention, stability and absorbency are improved, and further, pyrroloquinoline quinone changed to a target color can be efficiently produced.
ピロロキノリンキノン含有組成物およびその製造方法
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、ピロロキノリンキノンとリン酸カルシウム系化合物とを含んでなる。
A pyrroloquinoline quinone containing composition and its manufacturing method The pyrroloquinoline quinone containing composition by this invention comprises pyrroloquinoline quinone and a calcium-phosphate type compound.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、下記式（１）で表される化合物を意味する。
本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、ピロロキノリンキノン（フリー体）として使用することもできるし、ピロロキノリンキノンの塩として使用することもできる。 The pyrroloquinoline quinone used in the present invention can be used as a pyrroloquinoline quinone (free form) or a salt of pyrroloquinoline quinone.
本発明において用いられる「ピロロキノリンキノンの塩」としてはピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩が挙げられるが、好ましくは、アルカリ金属塩である。 Examples of the “pyrroloquinoline quinone salt” used in the present invention include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and ammonium salts of pyrroloquinoline quinone, with alkali metal salts being preferred.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。好ましくは、入手しやすい点で、ナトリウム塩およびカリウム塩がより好ましい。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩における塩の置換数は、１〜３であり、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくは、ジナトリウム塩およびジカリウム塩である。 Examples of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used in the present invention include sodium, potassium, lithium, cesium, rubidium and the like. Preferably, a sodium salt and a potassium salt are more preferable in terms of easy availability. The substitution number of the salt in the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is 1 to 3, and any of a monoalkali metal salt, a dialkali metal salt, and a trialkali metal salt may be used, but a dialkali metal salt is preferable. As the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone, disodium salt and dipotassium salt are particularly preferable.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、入手しやすい点で、好ましくは、フリー体、ジナトリム塩、またはジカリウム塩である。 The pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention is preferably a free form, a dinatrim salt, or a dipotassium salt in terms of availability.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。例えば、ピロロキノリンキノンまたはその塩は、有機化学的合成法（ＪＡＣＳ、第１０３巻、第５５９９〜５６００頁（１９８１））、発酵法（特開平１−２１８５９７号公報）などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、晶析により結晶化し（特表２００６−５０８５１９号公報）、乾燥して得ることができる。 As pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention, a commercially available one can be obtained, and it can be produced by a known method. For example, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is obtained by PQQ obtained by a method such as an organic chemical synthesis method (JACS, Vol. 103, pages 5599-5600 (1981)), a fermentation method (Japanese Patent Laid-Open No. 1-218597), and the like. Is subjected to chromatography, and the PQQ section in the effluent is concentrated, crystallized by crystallization (Japanese Patent Publication No. 2006-508519), and dried.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、後述する他の素材と組み合わせることにより、還元型ピロロキノリンキノンとなってもよい。 The pyrroloquinoline quinone used in the present invention may be reduced pyrroloquinoline quinone by combining with other materials described later.
本発明において用いられるリン酸カルシウム系化合物は、リン酸（Ｐ）とカルシウム（Ｃａ）とが化学的に結合されたリン酸カルシウムであれば、その種類は特に限定されず、水和物であってもよい。リン酸カルシウム系化合物のＣａ／Ｐモル比は、０．２〜４．０とすることができ、好ましくは、１．０〜２．０である。リン酸カルシウム系化合物としては、例えば、３リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）、フッ素リン灰石（フッ素アパタイト）等のアパタイト、リン酸二水素カルシウム（第一リン酸カルシウム）、リン酸一水素カルシウム（第二リン酸カルシウム）、リン酸三カルシウム（第三リン酸カルシウム）、リン酸四カルシウム、またはこれらの水和物等が挙げられる。好ましくは、３リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、またはリン酸三カルシウムであり、より好ましくは、３リン酸カルシウムである。 The type of calcium phosphate compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is calcium phosphate in which phosphoric acid (P) and calcium (Ca) are chemically bound, and may be a hydrate. The Ca / P molar ratio of the calcium phosphate compound can be 0.2 to 4.0, and is preferably 1.0 to 2.0. Examples of calcium phosphate compounds include apatite such as calcium triphosphate (hydroxyapatite) and fluoroapatite (fluorapatite), calcium dihydrogen phosphate (primary calcium phosphate), calcium monohydrogen phosphate (dibasic calcium phosphate), phosphorus Examples thereof include tricalcium acid (tricalcium phosphate), tetracalcium phosphate, and hydrates thereof. Preferred is calcium triphosphate, calcium dihydrogen phosphate, or tricalcium phosphate, and more preferred is calcium triphosphate.
本発明において用いられるリン酸カルシウム系化合物が水和物である場合、水和物としては、例えば、０．５〜１０水和物等が挙げられるが、好ましくは、二水和物である。 When the calcium phosphate compound used in the present invention is a hydrate, examples of the hydrate include 0.5 to 10 hydrate, and the dihydrate is preferable.
本発明において用いられるリン酸カルシウム系化合物は、経口摂取においても害がないだけでなく、細胞レベルでも毒性がない点で有利である。また、リン酸カルシウム系化合物は、細胞内でピロロキノリンキノンまたはその塩を遊離させることができ、また、リン酸カルシウム系化合物自身の溶解が期待できる点で有利である。 The calcium phosphate compound used in the present invention is advantageous in that it is not harmful even when taken orally and is not toxic at the cellular level. In addition, the calcium phosphate compound is advantageous in that it can release pyrroloquinoline quinone or a salt thereof in the cell and can be expected to dissolve the calcium phosphate compound itself.
本発明において用いられるリン酸カルシウム系化合物は、市販されているものを入手することもできるし、公知の方法により製造することもできる。 As the calcium phosphate compound used in the present invention, a commercially available one can be obtained, or can be produced by a known method.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを混合することにより製造することができる。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be produced by mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound.
本願明細書において、「混合」については、一方の混合対象物を他方の混合対象物に添加して行うこともできるし、混合対象物を別の容器に添加して行うこともできる。 In the present specification, “mixing” can be performed by adding one mixed object to the other mixed object or by adding the mixed object to another container.
本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩の量は、リン酸カルシウム系化合物と接触できれば特に限定されないが、リン酸カルシウム系化合物に対して過剰量で混合させることができる。 The amount of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention is not particularly limited as long as it can come into contact with the calcium phosphate compound, but it can be mixed in an excessive amount with respect to the calcium phosphate compound.
ピロロキノリンキノンまたはその塩の量が、リン酸カルシウム系化合物に対して過剰量であるか否かは、リン酸カルシウム系化合物の比表面積に基づいて決定することができる。具体的には、リン酸カルシウム系化合物の比表面積に対して接触できるピロロキノリンキノンまたはその塩の量を超えた場合に、リン酸カルシウム系化合物に対して過剰量であるということができる。 Whether the amount of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is excessive with respect to the calcium phosphate compound can be determined based on the specific surface area of the calcium phosphate compound. Specifically, when the amount of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof that can be brought into contact with the specific surface area of the calcium phosphate compound is exceeded, it can be said that the amount is excessive with respect to the calcium phosphate compound.
本発明において、「リン酸カルシウム系化合物の比表面積」は、リン酸カルシウム系化合物の質量あたりの表面積を意味する。リン酸カルシウム系化合物の比表面積は、市販の比表面積測定装置を用いて測定することができる。リン酸カルシウム系化合物の比表面積は、使用するリン酸カルシウム系化合物により異なるが、０．１〜５００ｍ２／ｇとすることができる。例えば、ヒドロキシアパタイトの比表面積は、１〜５００ｍ２／ｇ、好ましくは、５０〜６０ｍ２／ｇとすることができる。 In the present invention, the “specific surface area of the calcium phosphate compound” means the surface area per mass of the calcium phosphate compound. The specific surface area of the calcium phosphate compound can be measured using a commercially available specific surface area measuring device. Although the specific surface area of a calcium phosphate type compound changes with calcium phosphate type compounds to be used, it can be 0.1-500 m < 2 > / g. For example, the specific surface area of the hydroxyapatite, 1 to 500 2 / g, preferably, may be 50 to 60 m 2 / g.
ピロロキノリンキノンまたはその塩の、リン酸カルシウム系化合物の比表面積に対する最大量は、使用するリン酸カルシウム系化合物や温度条件等に基づいて、当業者であれば適宜決定することができる。 The maximum amount of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof relative to the specific surface area of the calcium phosphate compound can be appropriately determined by those skilled in the art based on the calcium phosphate compound used, temperature conditions, and the like.
混合させるピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比は、例えば、１：０．１〜１：１００００とすることができるが、好ましくは、１：２０〜１：１００００、より好ましくは、１：５０〜１：１０００、さらに好ましくは、１：５０〜１：５００とすることができる。 The weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and the calcium phosphate compound to be mixed may be, for example, 1: 0.1 to 1: 10000, preferably 1:20 to 1: 10000, more preferably 1: 50-1: 1000, more preferably 1: 50-1: 500.
ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを混合させる工程（以下、「混合工程」ということがある）は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを接触させることができればよく、例えば、溶媒中で行うことができる。 The step of mixing the pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and the calcium phosphate compound (hereinafter sometimes referred to as “mixing step”) is sufficient if the pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and the calcium phosphate compound can be brought into contact with each other. For example, it can be performed in a solvent.
具体的には、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とリン酸カルシウム系化合物とを混合することもできるし、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とを混合させた後、溶媒と混合することもできる。例えば、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物を混合しておき、口腔内、胃、腸で溶媒に相当する唾液、胃液等と接触させることもできる。 Specifically, a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound can be mixed, or a mixture of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound can be mixed with a solvent. . For example, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound can be mixed and brought into contact with saliva, gastric juice or the like corresponding to a solvent in the oral cavity, stomach, or intestine.
混合工程において、ピロロキノリンキノンまたはその塩を、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液として使用する場合、用いられる溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド、エタノール、プロピレングリコール、イソプロパノール、グリセリン等が挙げられる。これらの溶媒は単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて使用することもできる。製品に残留しても大きな問題とならないという点から、水（水溶液）が好ましい。 In the mixing step, when pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is used as a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, examples of the solvent used include water, dimethyl sulfoxide, ethanol, propylene glycol, isopropanol, and glycerin. These solvents can be used alone or in combination of two or more. Water (aqueous solution) is preferred because it does not cause a big problem even if it remains in the product.
ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液は、例えば、０．０１〜４０ｇ／Ｌとなるように調製することができるが、好ましくは、０．５〜１５ｇ／Ｌである。 The solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be prepared to be 0.01 to 40 g / L, for example, but preferably 0.5 to 15 g / L.
ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨは、１〜９であり、好ましくは、２〜８であり、より好ましくは、２．５〜７であり、さらにより好ましくは、２．５〜４である。ｐＨを調整するために、酸性物質（例えば、塩酸等）やアルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム等）を使用することができる。 The pH of the solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is 1-9, preferably 2-8, more preferably 2.5-7, and even more preferably 2.5-4. is there. In order to adjust the pH, an acidic substance (for example, hydrochloric acid or the like) or an alkaline substance (for example, sodium hydroxide or the like) can be used.
混合工程を行う温度は特に制限はないが、例えば、−２０℃〜２００℃であり、操作性の観点から、好ましくは、４℃〜１４０℃とすることができる。安定性、操作性を考慮して適宜決定することができるが、２０〜１３０℃とすることによりピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との相互作用を早く完了させることができる。 Although the temperature which performs a mixing process does not have a restriction | limiting in particular, For example, it is -20 degreeC-200 degreeC, From the viewpoint of operativity, Preferably it can be 4 degreeC-140 degreeC. Although it can determine suitably considering stability and operativity, by setting it as 20-130 degreeC, the interaction of pyrroloquinoline quinone or its salt, and a calcium-phosphate type compound can be completed quickly.
混合工程を行う時間は特に制限はないが、１分から７日程度で行うことができる。５分から３日が実際的に使用することができる。 Although the time for performing the mixing step is not particularly limited, it can be performed in about 1 minute to 7 days. 5 minutes to 3 days can be practically used.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物において、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とは複合体を形成することができる。 In the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound can form a complex.
ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との複合体においては、ピロロキノリンキノンまたはその塩は、リン酸カルシウム系化合物の表面に吸着することができる。すなわち、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、溶解性の低いリン酸カルシウム系化合物とを、溶媒中で混合させることにより、ピロロキノリンキノンまたはその塩をリン酸カルシウム系化合物に吸着させることができる。ここで、「吸着」とは、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との相互作用により、ピロロキノリンキノンまたはその塩がリン酸カルシウム系化合物の表面に濃縮（集合）されることを意味する。相互作用は、化学結合を伴わないもの（物理吸着）であっても、化学結合を伴うもの（化学吸着）であってもよいが、好ましくは、化学結合を伴うものである。 In the complex of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be adsorbed on the surface of the calcium phosphate compound. That is, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound having low solubility are mixed in a solvent to adsorb the pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to the calcium phosphate compound. Here, “adsorption” means that pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is concentrated (assembled) on the surface of the calcium phosphate compound due to the interaction between pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and the calcium phosphate compound. The interaction may be one with no chemical bond (physical adsorption) or one with chemical bond (chemisorption), but is preferably with chemical bond.
本発明によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とからなる複合体が提供される。 According to the present invention, a complex comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound is provided.
本発明によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とからなる複合体の製造方法であって、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とを混合することを含んでなる製造方法が提供される。ここで、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比は、１：２０〜１：１００００とすることができる。また、ピロロキノリンキノンまたはその塩を溶液として用いる場合は、該溶液のｐＨを、２〜８とすることができる。 According to the present invention, there is provided a method for producing a complex comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound, the method comprising mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound. Provided. Here, the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to a calcium phosphate compound can be 1:20 to 1: 10000. Moreover, when using pyrroloquinoline quinone or its salt as a solution, pH of this solution can be set to 2-8.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物とを含んでなる懸濁液として提供することもできるし、該懸濁液から分離された固体（沈殿物）として提供することもできる。例えば、ろ過、遠心分離、デカンテーションで分離することができる。また、これを水洗やアルコールで洗うこともできる。さらに乾燥して固体（粉末）を得ることも可能である。乾燥法としては、減圧乾燥、加熱乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be provided as a suspension comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound, or a solid (precipitate) separated from the suspension. Can also be provided. For example, it can be separated by filtration, centrifugation, and decantation. It can also be washed with water or alcohol. Further, it is possible to obtain a solid (powder) by drying. Examples of the drying method include reduced pressure drying, heat drying, freeze drying, and spray drying.
本発明によれば、本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物の乾燥物が提供される。 According to this invention, the dried material of the pyrroloquinoline quinone containing composition by this invention is provided.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物において、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比（特には、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物における複合体の重量比）は、１：２０〜１：１００００、好ましくは、１：５０〜１：１０００、より好ましくは、１：５０〜１：５００とすることができる。 In the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention, the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound (particularly, the weight ratio of the complex of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound) is 1: It can be set to 20 to 1: 10000, preferably 1:50 to 1: 1000, and more preferably 1:50 to 1: 500.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、飲食品、医薬、化粧品、園芸、酪農、研究用途において用いることができる。ピロロキノリンキノン含有組成物は、ピロロキノリンキノン含有組成物自体を飲食品、医薬、化粧品、園芸品、酪農品、試験または研究用試薬とすることもできるし、他の成分と組み合わせて飲食品、医薬、化粧品、園芸品、酪農品、試験または研究用試薬とすることもできる。例えば、飲食品において用いる場合、飲食品を構成する成分にピロロキノリンキノン含有組成物を添加することにより目的の飲食品（ピロロキノリンキノン含有飲食品）を製造することができる。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be used in foods and drinks, medicines, cosmetics, horticulture, dairy farming, and research applications. The pyrroloquinoline quinone-containing composition can be a pyrroloquinoline quinone-containing composition itself as a food, drink, medicine, cosmetics, horticultural product, dairy product, test or research reagent, or a food or drink in combination with other ingredients. It can also be a pharmaceutical, cosmetic, horticultural, dairy, test or research reagent. For example, when used in a food or drink, the target food or drink (pyrroloquinoline quinone-containing food or drink) can be produced by adding a pyrroloquinoline quinone-containing composition to a component constituting the food or drink.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物の投与剤形は、特に制限されることなく、使用する用途により適宜選択することができる。本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、経口摂取用組成物として、例えば、ヒト用または動物用の食品、機能性食品、医薬品または医薬部外品として使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味している。具体的な形態としてはカプセル剤、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The dosage form of the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended use. The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be used as a composition for oral consumption, for example, as a food for humans or animals, a functional food, a pharmaceutical or a quasi-drug. The functional food here means foods taken for the purpose of maintaining nutrition or supplementing nutrition, such as health foods, nutritional supplements, functional nutritional foods, and nutrition insurance foods. Specific forms include, but are not limited to, capsules, tablets, chewable tablets, drinks and the like.
機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防菌防黴剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等を用いることができる。一般的には通常の食品、例えば味噌、醤油、インスタントみそ汁、ラーメン、焼きそば、カレー、コーンスープ、マーボードーフ、マーボーなす、パスタソース、プリン、ケーキ、パン等に加えることも可能である。 When commercialized as a functional food, additives used in food, such as sweeteners, coloring agents, preservatives, thickening stabilizers, antioxidants, coloring agents, bleaching agents, antibacterial and antifungal agents, gum bases Bitterings, enzymes, brighteners, acidulants, seasonings, emulsifiers, fortifiers, manufacturing agents, fragrances, spice extracts and the like can be used. In general, it can also be added to ordinary foods such as miso, soy sauce, instant miso soup, ramen, fried noodles, curry, corn soup, merbaudofu, marvo eggplant, pasta sauce, pudding, cake, bread and the like.
医薬として製品化する場合には、薬剤学的に許容されている製剤素材を常法により適宜添加混合することができる。添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤などが挙げられる。 In the case of commercialization as a medicine, pharmaceutically acceptable preparation materials can be appropriately added and mixed by a conventional method. The preparation material that can be added is not particularly limited, and examples thereof include emulsifiers, tensioning agents, buffering agents, solubilizing agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, and antioxidants.
化粧品、園芸品、酪農品、試験または研究用試薬として製品化する場合も、それぞれ、各分野で許容されている製剤素材を常法により適宜添加混合することができる。 Even in the case of commercialization as cosmetics, horticultural products, dairy products, test or research reagents, formulation materials allowed in each field can be appropriately added and mixed by conventional methods.
また、使用する用途により、注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存用溶液、研究用試薬として用いることができる。 Depending on the application, injections, infusions, solutions, eye drops, liquids for internal use, lotions, hair tonics, cosmetic emulsions, sprays, aerosols, drinks, liquid fertilizers, storage solutions, research reagents Can be used.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、他の素材と組み合わせても使用することもできる。組み合わせ可能な素材としては、例えば、ビタミンＢ 群、ビタミンＣ およびビタミンＥ 等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類、リン脂質等が挙げられる。後述する着色用物質と組み合わせても使用することもできる。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be used in combination with other materials. Examples of materials that can be combined include vitamins such as vitamin B group, vitamin C and vitamin E, amino acids, carotenoids such as astaxanthin, α-carotene and β-carotene, ω3 fatty acids such as docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid , Ω6 fatty acids such as arachidonic acid, phospholipids and the like. It can also be used in combination with a coloring substance to be described later.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物を懸濁液の形態で使用する場合は、好適には、飲料、化粧品、培地として用いることができる。本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物を乾燥物の形態で使用する場合は、好適には、飲食品、化粧品、培地、医薬品の製造に用いることができる。 When the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention is used in the form of a suspension, it can be suitably used as a beverage, cosmetic, or culture medium. When the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention is used in the form of a dried product, it can be suitably used for the production of foods and drinks, cosmetics, culture media and pharmaceuticals.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物の保存方法としては、特に限定されず、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。 The method for storing the pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention is not particularly limited, and low temperature storage, anaerobic storage using a sealed container, light-shielding storage, and the like can be used.
本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物は、冷蔵あるいは室温で保存した際に、析出物なく安定に保存できる。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be stably stored without precipitation when stored at refrigeration or at room temperature.
本発明の好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩を含むｐＨ２〜８の溶液と、リン酸カルシウム系化合物とを、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比を１：２０〜１：１００００で混合して得られる、ピロロキノリンキノン含有組成物である。 According to a preferred embodiment of the present invention, a solution having a pH of 2 to 8 containing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound is used, and a weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to a calcium phosphate compound is 1:20 to 1. : A pyrroloquinoline quinone-containing composition obtained by mixing at 10,000.
本発明の好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩を含むｐＨ２〜８の溶液と、リン酸カルシウム系化合物とを、ピロロキノリンキノンまたはその塩とリン酸カルシウム系化合物との重量比を１：５０〜１：５００で混合して得られる、ピロロキノリンキノン含有組成物である。 According to a preferred embodiment of the present invention, a solution having a pH of 2 to 8 containing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a calcium phosphate compound is used at a weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to a calcium phosphate compound of 1:50 to 1. : A pyrroloquinoline quinone-containing composition obtained by mixing at 500.
ピロロキノリンキノンの安定化方法
本発明によれば、また、ピロロキノリンキノンの安定化方法であって、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、リン酸カルシウム系化合物とを混合させることを含んでなる方法が提供される。本発明の安定化方法によれば、ピロロキノリンキノンの化学的安定性や吸収性を向上させることができ、また、色の安定性も向上させること（すなわち、黒色等の好ましくない色への変化を抑制すること）ができる。
Method for stabilizing pyrroloquinoline quinone According to the present invention, there is also provided a method for stabilizing pyrroloquinoline quinone, comprising mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof with a calcium phosphate compound. The According to the stabilization method of the present invention, chemical stability and absorbability of pyrroloquinoline quinone can be improved, and color stability can be improved (that is, change to an unfavorable color such as black). Can be suppressed).
ピロロキノリンキノンの変色方法
本発明によれば、さらに、ピロロキノリンキノンまたはその塩の変色方法であって、リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩と、着色用物質を混合させることを含んでなる方法が提供される。本発明の変色方法によれば、着色料を使用せずに、ピロロキノリンキノンまたはその塩を変色させることができる。
According to the present invention, there is further provided a method for discoloring pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, comprising mixing a pyrroloquinoline quinone or a salt thereof mixed with a calcium phosphate compound with a coloring substance. A method comprising is provided. According to the discoloration method of the present invention, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be discolored without using a colorant.
本願明細書において「変色」とは、元の色から別の色に変化することを意味し、必ずしも退色を意味するものではない。 In the present specification, “discoloration” means changing from an original color to another color, and does not necessarily mean fading.
本発明の変色方法において使用されるリン酸カルシウム系化合物は、特に限定されないが、３リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）、フッ素リン灰石（フッ素アパタイト）等のアパタイト、リン酸二水素カルシウム（第一リン酸カルシウム）、リン酸一水素カルシウム（第二リン酸カルシウム）、リン酸三カルシウム（第三リン酸カルシウム）、リン酸四カルシウム、またはこれらの水和物等が挙げられる、好ましくは、アパタイト、より好ましくは、ヒドロキシアパタイトである。 The calcium phosphate compound used in the color changing method of the present invention is not particularly limited, but apatite such as tricalcium phosphate (hydroxyapatite), fluorapatite (fluorapatite), calcium dihydrogen phosphate (primary calcium phosphate), phosphorus Examples thereof include calcium monohydrogen phosphate (dicalcium phosphate), tricalcium phosphate (tricalcium phosphate), tetracalcium phosphate, and hydrates thereof, preferably apatite, more preferably hydroxyapatite.
ピロロキノリンキノンは赤〜濃赤色であるが、リン酸カルシウム系化合物を混合するとピロロキノリンキノンまたはその塩はピンク色になる。これに、さらに着色用物質を混合させることにより、目的の色に変化させることができる。 Although pyrroloquinoline quinone is red to deep red, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof becomes pink when mixed with a calcium phosphate compound. The color can be changed to a target color by further mixing a coloring substance.
本願明細書において「着色用物質」とは、リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩の色を変化させることができる物質を意味する。着色用物質としては、例えば、カルボニル反応性物質、アルカリ、多価カルボン酸が挙げられる。 In the present specification, the “coloring substance” means a substance capable of changing the color of pyrroloquinoline quinone mixed with a calcium phosphate compound or a salt thereof. Examples of the coloring substance include a carbonyl reactive substance, an alkali, and a polyvalent carboxylic acid.
本発明の変色方法において使用されるカルボニル反応性物質は、カルボニル基と反応する物質を意味し、例えば、還元剤、アミノ基含有化合物等が挙げられる。還元剤としては、例えば、アスコルビン酸、ＮＡＤＰＨ、グルタチオン、ナトリウムボロハイドライド等が挙げられる。アミノ基含有化合物としては、例えば、アミノ酸（システイン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、アラニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシン等）等が挙げられる。 The carbonyl-reactive substance used in the color changing method of the present invention means a substance that reacts with a carbonyl group, and examples thereof include a reducing agent and an amino group-containing compound. Examples of the reducing agent include ascorbic acid, NADPH, glutathione, sodium borohydride and the like. Examples of the amino group-containing compound include amino acids (cysteine, methionine, glycine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, histidine, asparagine, alanine, phenylalanine, serine, tryptophan, tyrosine, and the like).
本発明の変色方法において使用されるアルカリとしては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、コリン水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、生石灰、石灰、リン酸トリナトリウム、リン酸トリカリウム、アンモニア等が挙げられる。 Examples of the alkali used in the color changing method of the present invention include alkali metal or alkaline earth metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, choline hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, Examples include potassium carbonate, sodium bicarbonate, quicklime, lime, trisodium phosphate, tripotassium phosphate, and ammonia.
本発明の変色方法において使用される多価カルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。 Examples of the polyvalent carboxylic acid used in the color changing method of the present invention include citric acid and tartaric acid.
具体的には、リン酸カルシウム系化合物としてヒドロキシアパタイトを使用する場合、着色用物質としてカルボニル反応性物質を使用することによりピロロキノリンキノンまたはその塩を青色にすることができ、着色用物質としてアルカリを使用することによりピロロキノリンキノンまたはその塩を黄色にすることができ、また、着色用物質として多価カルボン酸を使用することによりピロロキノリンキノンまたはその塩を白色にすることができる。 Specifically, when hydroxyapatite is used as the calcium phosphate compound, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be made blue by using a carbonyl-reactive substance as a coloring substance, and an alkali is used as a coloring substance By doing so, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be made yellow, and by using polyvalent carboxylic acid as a coloring substance, pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be made white.
本発明の変色方法で使用される「リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩」は、本発明によるピロロキノリンキノン含有組成物を使用することができる。ここで、使用されるピロロキノリンキノン含有組成物は、好ましくは、懸濁液または粉末である。 The pyrroloquinoline quinone-containing composition according to the present invention can be used as the “pyrroloquinoline quinone or salt thereof mixed with the calcium phosphate compound” used in the color changing method of the present invention. The pyrroloquinoline quinone-containing composition used here is preferably a suspension or a powder.
リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩と、着色用物質とを混合させる温度は、特に制限はないが、一般的な取り扱いやすさの点から、−２０℃〜２００℃、より好ましくは、４℃〜１４０℃とすることができる。 The temperature at which pyrroloquinoline quinone or a salt thereof mixed with a calcium phosphate compound and the coloring substance are mixed is not particularly limited, but is preferably −20 ° C. to 200 ° C. in terms of general handling ease. Can be set to 4 ° C to 140 ° C.
リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩と、着色用物質とを混合させる時間は、０．５時間から７日で行うことができるが、好ましくは、１時間から３日である。 The time for mixing the pyrroloquinoline quinone or its salt mixed with the calcium phosphate compound and the coloring substance can be 0.5 to 7 days, but preferably 1 to 3 days.
リン酸カルシウム系化合物と混合させたピロロキノリンキノンまたはその塩と、着色用物質とを混合させるｐＨは、特に制限はないが、一般的な取り扱いやすさの点から、０．５〜１４、より好ましくは、１〜８とすることができる。 The pH at which pyrroloquinoline quinone or a salt thereof mixed with a calcium phosphate compound and a coloring substance are mixed is not particularly limited, but 0.5 to 14, more preferably, from the viewpoint of general handling ease 1-8.
変色したピロロキノリンキノンまたはその塩は、懸濁液として提供することもできるし、該懸濁液から分離された固体として提供することもできる。例えば、ろ過、遠心分離、デカンテーションで分離することができる。また、これを水洗やアルコールで洗うこともできる。さらに減圧乾燥で乾燥して固体（粉末）を得ることも可能である。 The discolored pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be provided as a suspension, or can be provided as a solid separated from the suspension. For example, it can be separated by filtration, centrifugation, and decantation. It can also be washed with water or alcohol. It is also possible to obtain a solid (powder) by drying under reduced pressure.
色を変えたピロロキノリンキノンまたはその塩は単独で使用することもできるし、混合して使用することもできる。異なる色を組み合わせて混合する場合、さらに別の色にすることができる。 The pyrroloquinoline quinone or its salt whose color has been changed can be used alone or in combination. If different colors are combined and mixed, they can be further different colors.
実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。また、特に断りのない限り本文中の％は重量％を示す。 The present invention will be described more specifically with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, “%” in the text indicates “% by weight”.
実施例Ｉ：ピロロキノリンキノンに対するリン酸カルシウム系化合物の作用の確認
ピロロキノリンキノンジナトリウム（三菱瓦斯化学社製）２ｇ／Ｌ水溶液を、塩酸および水酸化ナトリウムで表１に示すｐＨに調整し、該水溶液４ｍｌを、３リン酸カルシウム（太平化学産業社製）、リン酸水素カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）、リン酸三カルシウム（和光純薬工業社製）それぞれ０．５ｇと混合し、４０℃で１．５時間置いた。得られた混合物（懸濁液）を遠心分離し、上清をリン酸バッファー（和光純薬工業社製；ｐＨ７．４）で希釈したものをＵＶスペクトル（日立社製）測定し、上清のピロロキノリンキノンジナトリウム濃度を測定した。ピロロキノリンキノンジナトリウムの減少量を、各リン酸カルシウム系化合物へ吸着した量とし、リン酸カルシウム系化合物１ｇ当たりの吸着量として算出した（実施例１〜１２）。
Example I: Confirmation of action of calcium phosphate compound on pyrroloquinoline quinone A 2 g / L aqueous solution of pyrroloquinoline quinone disodium (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc.) was adjusted to the pH shown in Table 1 with hydrochloric acid and sodium hydroxide. 4 ml is mixed with 0.5 g each of calcium triphosphate (manufactured by Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.), calcium hydrogen phosphate dihydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and tricalcium phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Placed at 40 ° C. for 1.5 hours. The obtained mixture (suspension) was centrifuged, and the supernatant diluted with a phosphate buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; pH 7.4) was measured for UV spectrum (manufactured by Hitachi), and the supernatant was measured. The pyrroloquinoline quinone disodium concentration was measured. The decrease amount of pyrroloquinoline quinone disodium was defined as the amount adsorbed to each calcium phosphate compound, and was calculated as the amount adsorbed per 1 g of calcium phosphate compound (Examples 1 to 12).
ピロロキノリンキノンジナトリウム２ｇ／Ｌの水溶液を、塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨ３．５に調整し、該水溶液４ｍｌを、酸化アルミニウム（活性アルミナ；和光純薬工業社製）、シリカゲル（ワコーゲルーＣ１００；和光純薬工業社製）、大豆レシチン（和光純薬工業社製）それぞれ１ｇと混合し、４０℃に１．５時間置いた。得られた混合物を遠心分離し、上清をリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で希釈したものをＵＶスペクトル測定し、上清のピロロキノリンキノンジナトリウム濃度を測定した。ピロロキノリンキノンジナトリウムの減少量を、各物質への吸着量とし、各物質１ｇ当たりの量として算出した（比較例１〜３）。 An aqueous solution of pyrroloquinoline quinone disodium 2 g / L was adjusted to pH 3.5 with hydrochloric acid and sodium hydroxide, and 4 ml of the aqueous solution was mixed with aluminum oxide (activated alumina; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), silica gel (Wakogel C100; 1 g of Soybean Lecithin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1 g of each were mixed and placed at 40 ° C. for 1.5 hours. The obtained mixture was centrifuged, and the supernatant diluted with a phosphate buffer (pH 7.4) was measured for UV spectrum, and the pyrroloquinoline quinone disodium concentration in the supernatant was measured. The amount of decrease in pyrroloquinoline quinone disodium was defined as the amount adsorbed on each substance and calculated as the amount per 1 g of each substance (Comparative Examples 1 to 3).
その結果は以下の通りであった。
ピロロキノリンキノンは、広範囲のｐＨで各種リン酸カルシウムに吸着することが確認された（実施例１〜１２）。また、ピロロキノリンキノンは、各種リン酸カルシウムに比べてやや少ないが酸化アルミニウムにも吸着することが確認された（比較例１）。一方、ピロロキノリンキノンは、シリカゲルや大豆レシチンには吸着しないことが確認された（比較例２および３）。特に、大豆レシチンは分離していた。 It was confirmed that pyrroloquinoline quinone adsorbs to various calcium phosphates in a wide range of pH (Examples 1 to 12). In addition, pyrroloquinoline quinone was confirmed to be adsorbed to aluminum oxide although it was slightly less than various calcium phosphates (Comparative Example 1). On the other hand, it was confirmed that pyrroloquinoline quinone does not adsorb on silica gel or soybean lecithin (Comparative Examples 2 and 3). In particular, soy lecithin was separated.
実施例ＩＩ：アスコルビン酸による変性試験
ピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液２ｇ／Ｌ（ｐＨ３．５）１６ｍｌを、３リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物それぞれ４ｇと混合し、５０℃で一晩処理した（ともに１ｇリン酸カルシウム当たり、ピロロキノリンキノン８ｍｇ吸着相当）。得られた懸濁液１ｍｌに０．２％アスコルビン酸水溶液を０．１ｍｌ加え、アスコルビン酸処理に対するピロロキノリンキノンの安定性を確認した（実施例１３および１４）。対照として、アスコルビン酸処理を行わずにピロロキノリンキノンの安定性を確認したものを比較例６および７とした。また、比較例１および２で得られた混合物１ｍｌに０．２％アスコルビン酸水溶液を０．１ｍｌ加え、アスコルビン酸処理に対するピロロキノリンキノンの安定性を確認したものを比較例４および５とした。
Example II: Denaturation test with ascorbic acid 16 ml of pyrroloquinoline quinone disodium aqueous solution 2 g / L (pH 3.5) was mixed with 4 g of each of calcium triphosphate and calcium hydrogenphosphate dihydrate and treated at 50 ° C. overnight. (Equal to 8 mg pyrroloquinoline quinone adsorbed per 1 g calcium phosphate). 0.1 ml of 0.2% ascorbic acid aqueous solution was added to 1 ml of the obtained suspension, and the stability of pyrroloquinoline quinone with respect to ascorbic acid treatment was confirmed (Examples 13 and 14). As controls, Comparative Examples 6 and 7 were obtained by confirming the stability of pyrroloquinoline quinone without performing ascorbic acid treatment. Comparative Examples 4 and 5 were prepared by adding 0.1 ml of 0.2% ascorbic acid aqueous solution to 1 ml of the mixture obtained in Comparative Examples 1 and 2 and confirming the stability of pyrroloquinoline quinone with respect to ascorbic acid treatment.
アスコルビン酸処理による変化は目視により確認した。ピロロキノリンキノンの安定性は、抽出試験により確認した。具体的には、２％リン酸ジナトリウム水溶液（ｐＨ９．２）を用いてピロロキノリンキノンジナトリウムの抽出を行い、抽出回収率（抽出量／リン酸カルシウムへ吸着したピロロキノリンキノンジナトリウムの全量）を算出し、これをピロロキノリンキノンの安定性の指標とした。 Changes due to ascorbic acid treatment were confirmed visually. The stability of pyrroloquinoline quinone was confirmed by an extraction test. Specifically, pyrroloquinoline quinone disodium was extracted using a 2% aqueous solution of disodium phosphate (pH 9.2), and the extraction recovery rate (extracted amount / total amount of pyrroloquinoline quinone disodium adsorbed on calcium phosphate) was determined. This was calculated and used as an indicator of the stability of pyrroloquinoline quinone.
その結果は以下の通りであった。
リン酸水素カルシウム二水和物で処理したピロロキノリンキノンジナトリウムは、アスコルビン酸処理を行っても変色がなく、また、抽出回収率も高く、化学的に安定化していることが確認された（実施例１４および比較例７）。３リン酸カルシウムで処理したピロロキノリンキノンジナトリウムは、青い色に変色するが、抽出回収率は大きく減少しておらず、化学的に安定化していることが確認された（実施例１３および比較例６）。一方、酸化アルミニウムで処理したピロロキノリンキノンジナトリウムは、茶色に変化し、また、ピロロキノリンキノンジナトリウムを抽出できなかった（比較例４）。また、シリカゲルで処理したピロロキノリンキノンジナトリウム（すなわち、未処理に相当）は、黒色に変化し、また、ピロロキノリンキノンジナトリウムを抽出できなかった（比較例５）。 It was confirmed that pyrroloquinoline quinone disodium treated with calcium hydrogen phosphate dihydrate was not discolored even when treated with ascorbic acid, and had a high extraction recovery rate and was chemically stabilized ( Example 14 and Comparative Example 7). Although pyrroloquinoline quinone disodium treated with tricalcium phosphate changes to a blue color, the extraction recovery rate was not greatly reduced, and it was confirmed that it was chemically stabilized (Example 13 and Comparative Example 6). ). On the other hand, pyrroloquinoline quinone disodium treated with aluminum oxide turned brown and pyrroloquinoline quinone disodium could not be extracted (Comparative Example 4). Further, pyrroloquinoline quinone disodium treated with silica gel (that is, untreated) turned black, and pyrroloquinoline quinone disodium could not be extracted (Comparative Example 5).
以上の結果から、リン酸カルシウムで処理したピロロキノリンキノンは、アスコルビン酸と接触しても食品として好ましくないような変色はせず、また、アスコルビン酸に対して化学的に安定であることが分かった。 From the above results, it was found that pyrroloquinoline quinone treated with calcium phosphate did not discolor unfavorable as food even when contacted with ascorbic acid, and was chemically stable to ascorbic acid.
実施例ＩＩＩ：変色実験
実施例１３で得られた懸濁液１ｍｌに表３で示す各種物質を１０ｍｇ（８Ｎ 水酸化ナトリウムのみ２０ｍｇ）添加して色の変化を観察した（実施例１５〜１９）。ピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液２ｇ／Ｌ １ｍｌに８Ｎ 水酸化ナトリウム２０ｍｇを添加したものを比較例８、アスコルビン酸（還元性または付加性を有する物質）１０ｍｇを添加したものを比較例９とした。
Example III: Discoloration experiment 10 mg of various substances shown in Table 3 (20 mg of 8N sodium hydroxide only) were added to 1 ml of the suspension obtained in Example 13, and the color change was observed (Examples 15 to 19). . Comparative Example 8 was obtained by adding 20 mg of 8N sodium hydroxide to 1 g of pyrroloquinoline quinone disodium aqueous solution 2 g / L, and Comparative Example 9 was obtained by adding 10 mg of ascorbic acid (a substance having reducibility or addition).
その結果は以下の通りであった。
リン酸カルシウム系化合物による処理後のピロロキノリンキノンジナトリウムは淡いピンク色であるが、各種物質で処理を行うことにより白色、青色、黄色に変化させることができることが確認された（実施例１５〜１９）。一方、リン酸カルシウム系化合物による処理を行わないピロロキノリンキノンではこのような変化は生じないか（比較例８）、あるいは、黒色に変化した（比較例９）。 Although pyrroloquinoline quinone disodium after the treatment with the calcium phosphate compound is light pink, it was confirmed that it can be changed to white, blue and yellow by treatment with various substances (Examples 15 to 19). . On the other hand, pyrroloquinoline quinone that was not treated with a calcium phosphate compound did not cause such a change (Comparative Example 8) or changed to black (Comparative Example 9).
実施例ＶＩ：細胞吸収性試験
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ；大日本住友製薬より入手）を一つの穴に６０００個になるように細胞を撒き、１日後、試験培地１００μｌに交換した。試験培地は、実施例１および４で得られた混合物をオートクレーブ処理後に培地で希釈したものを実施例２０および２１とした。３リン酸カルシウム（単独）を培地で希釈したものを比較例１０、ピロロキノリンキノンジナトリウム（リン酸カルシウム系化合物処理なし）を培地で希釈したものを比較例１１とした。培地はα‐ＭＥＭに１０％牛胎児血清を添加したものを使用し、試験培地の濃度は１０００μＭから１／２ずつ希釈して１μＭまで準備した。５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、２日後、培地を抜き、新しい培地で洗浄後、同仁化学製Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を使って処理し、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。各条件２個測定し、その平均値で解析した。
Example VI: Cell Absorbency Test Chinese hamster ovary cells (CHO; obtained from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were seeded at 6000 cells in one well, and after 1 day, they were replaced with 100 μl of test medium. The test medium was obtained by diluting the mixture obtained in Examples 1 and 4 with a medium after autoclaving and was designated as Examples 20 and 21. Comparative Example 10 was obtained by diluting tricalcium phosphate (alone) with a medium, and Comparative Example 11 was obtained by diluting pyrroloquinoline quinone disodium (without calcium phosphate compound treatment) with a medium. The medium used was α-MEM supplemented with 10% fetal calf serum, and the concentration of the test medium was prepared from 1000 μM to 1/2 by 1 to 1 μM. The cells were cultured in a 5% CO 2 incubator, and after 2 days, the medium was removed, washed with a new medium, treated with a cell counting kit-8 manufactured by Dojindo Chemical, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. Two conditions were measured and analyzed with the average value.
増殖阻害濃度（細胞濃度が減少始める濃度）および増殖促進濃度（細胞濃度がふえる濃度）のピロロキノリンキノンによる影響を測定し、吸収性を評価した。 The effect of pyrroloquinoline quinone on the growth inhibitory concentration (concentration at which the cell concentration begins to decrease) and the growth promoting concentration (concentration at which the cell concentration increases) was measured, and the absorbability was evaluated.
その結果は以下の通りであった。
ピロロキノリンキノンジナトリウム単独（比較例１１）と比べて、増殖阻害濃度、増殖促進濃度ともに低濃度化していることが確認された（実施例２０および２１）。これは吸収性が向上していることを示している。なお、リン酸カルシウム自身は増殖に悪影響を与えていない（比較例１０）。水溶性のピロロキノリンキノンは細胞膜を通過できないが、リン酸カルシウム系化合物で処理することで粒子としての取り込みが生じるエンドサイトーシスにより、細胞への吸収性が上がっていると考えられる。 It was confirmed that both the growth inhibitory concentration and the growth promoting concentration were lowered compared to pyrroloquinoline quinone disodium alone (Comparative Example 11) (Examples 20 and 21). This indicates that the absorbency is improved. Note that calcium phosphate itself does not adversely affect growth (Comparative Example 10). Although water-soluble pyrroloquinoline quinone cannot pass through the cell membrane, it is considered that the absorption into cells is increased by endocytosis in which particles are taken up by treatment with a calcium phosphate compound.
実施例ＶＩＩ：色分析試験
実施例２、６および１０で得られた混合物を実施例２２〜２４とし、３リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、ピロロキノリンキノンジナトリウムをそれぞれ比較例１２〜１５とし、これらを遠心分離した後、減圧乾燥（８０℃）を３時間行い、粉末を得た。キャノンＭＰ５００を使って粉末状態の写真を取り込み、ウインドーズＸＰ付属のペイントソフトを使用して色分析を行った。その結果は以下の通りであった。
リン酸カルシウム系化合物はいずれも白色であった（比較例１２〜１４）。ピロロキノリンキノンジナトリウムは茶色であった（比較例１５）。これに対し、実施例２２および２４は薄いグレー色であり、実施例２５は薄いピンク色であり、比較例１２〜１４と比較して明るさが下がっていることが確認された。また、色成分をみると、ピロロキノリンキノンジナトリウムでは、赤に比べて緑と青の比率が低くなっているが、リン酸カルシウム系化合物で処理されることにより、赤、緑、青の比率の差が小さくなり、赤色が目立たなくなることが分かった。リン酸カルシウム系化合物での処理により赤、緑、青の比率が大きく変わっていることから、ピロロキノリンキノンジナトリウムとリン酸カルシウム系化合物との相互作用（吸着）が化学結合を伴うもの（化学吸着）である可能性が示唆された。 All of the calcium phosphate compounds were white (Comparative Examples 12 to 14). The pyrroloquinoline quinone disodium was brown (Comparative Example 15). On the other hand, Examples 22 and 24 were light gray, and Example 25 was light pink. It was confirmed that the brightness was lowered as compared with Comparative Examples 12-14. In terms of color components, pyrroloquinoline quinone disodium has a lower ratio of green to blue than red, but the difference in the ratio of red, green, and blue can be achieved by treatment with calcium phosphate compounds. It became clear that red became inconspicuous. Since the ratio of red, green, and blue is greatly changed by the treatment with calcium phosphate compounds, the interaction (adsorption) of pyrroloquinoline quinone disodium with calcium phosphate compounds is accompanied by chemical bonds (chemical adsorption). The possibility was suggested.
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