JP2012510060A - A method for measuring the activity of PEGylated blood clotting factors in a silica-based activated partial thromboplastin time assay - Google Patents
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Abstract
提供されるのは、シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイによる、ＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定方法である。ＰＥＧ化血液凝固因子は、シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでは活性の低下を示すと見出され、ＡＰＴＴ反応混合物へのＰＥＧの添加は、その活性を回復させると示された。ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定方法が提供される。 Provided is a method for measuring the clotting activity of a PEGylated blood clotting factor by a silica-based activated partial thromboplastin time (APTT) assay. PEGylated blood clotting factors were found to show reduced activity in the silica-based APTT assay, and the addition of PEG to the APTT reaction mixture was shown to restore its activity. A method for measuring the clotting activity of a PEGylated blood clotting factor in an APTT assay is provided.
Description
分野
提供されるのは、ポリエチレングリコールに結合した（「ＰＥＧ化」）血液凝固因子の凝固活性の測定方法である。この方法は、ＰＥＧを、シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイに加えることを含む。
Provided in the field are methods for measuring the clotting activity of blood clotting factors conjugated to polyethylene glycol (“PEGylated”). This method involves adding PEG to an activated partial thromboplastin time (APTT) assay based on silica.
背景
血液凝固は、血液が活性化物質と接触すると起こる、複雑な化学的および物理的反応である。血液凝固過程の全体は、一般的に、３つの活動として見ることができる：血小板粘着、血小板凝集およびフィブリン血餅の形成。インビボでは、血管の裏層、即ち内皮が、血小板の活性化を防止するので、血小板は不活性化状態で血管中を流れる。しかしながら、血管が損傷を受けると、内皮はその完全性を失い、血小板は損傷を受けた部位の下にある組織と接触することにより活性化される。血小板の活性化は、それらを「粘着性」にさせ、一体となって接着させる。この過程は、血小板の「栓」が形成されるまで継続する。この血小板の栓は、次いで、その上で凝血または凝固が進行するマトリックスとして働く。
Background blood clotting is a complex chemical and physical reaction that occurs when blood comes into contact with an activator. The entire blood clotting process can generally be viewed as three activities: platelet adhesion, platelet aggregation and fibrin clot formation. In vivo, the lining of the blood vessels, the endothelium, prevents platelet activation so that platelets flow through the blood vessels in an inactivated state. However, when a blood vessel is damaged, the endothelium loses its integrity and the platelets are activated by contact with the tissue beneath the damaged site. Activation of platelets makes them “sticky” and adheres together. This process continues until a platelet “plug” is formed. This platelet plug then serves as a matrix on which clotting or clotting proceeds.
血液の化学的バランスが適当であるならば、次いで、トロンビンが産生され、それは、フィブリノーゲンを、凝血塊の大部分を形成するフィブリンに変換させる。凝固中に、さらなる血小板が活性化され、形成中の血餅に取り込まれ、血餅形成に寄与する。凝固が進行するにつれて、フィブリンの重合およびクロスリンクは、持続性の血餅をもたらす。凝固は、第ＸＩＩ因子の活性化を伴う内因性経路により、または、組織因子の放出を伴う外因性経路により、開始され得る。 If the chemical balance of the blood is appropriate, then thrombin is produced, which converts fibrinogen into fibrin that forms the majority of the clot. During clotting, additional platelets are activated and taken up by the forming clot, contributing to clot formation. As clotting proceeds, fibrin polymerization and cross-linking results in a persistent clot. Coagulation can be initiated by the intrinsic pathway with factor XII activation or by the extrinsic pathway with tissue factor release.
いくつかの異なるインビトロアッセイを使用して凝固活性を評価でき、これには発色アッセイ、トロンビン生成アッセイ、全血凝固アッセイおよび活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイが含まれる。ＡＰＴＴアッセイは、内因性経路の血液凝固因子の活性を測定する。これらの因子には、第Ｉ（フィブリノーゲン）、第ＩＩ（プロトロンビン）、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩおよび第ＸＩＩ因子が含まれる。内因性経路では、凝固因子は不活性前駆体の形態で循環し、それが活性型に変換され、次の凝固因子を順に活性化する。例えば、プロ酵素の第ＸＩＩ因子は、その酵素の第ＸＩＩａ因子に変換され、それは、次いで、酵素原の第ＸＩ因子を酵素の第ＸＩａ因子に変換し、その後、それは、カルシウムの存在下で第ＩＸ因子を活性化する。酵素の第ＩＸａ因子は、第ＶＩＩＩａ因子およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性化する。この反応は、事前の第ＶＩＩＩ因子のトロンビンまたは第Ｘａ因子への曝露により、大幅に増大する。従って、ＡＰＴＴアッセイは、血漿に加えていくつかの成分を必要とし、これには、リン脂質の供給源、カルシウムおよび内因性経路の活性化物質、例えば、微粒子化シリカ、エラグ酸またはカオリンが含まれる。微粒子化シリカビーズは、内因性経路の活性化物質として使用され、ＦＸＩＩからＦＸＩＩａへの変換を開始させる。 Several different in vitro assays can be used to assess clotting activity, including chromogenic assays, thrombin generation assays, whole blood clotting assays, and activated partial thromboplastin time (APTT) assays. The APTT assay measures the activity of blood coagulation factors in the intrinsic pathway. These factors include factors I (fibrinogen), II (prothrombin), V, VIII, IX, X, XI and XII. In the intrinsic pathway, the clotting factor circulates in the form of an inactive precursor, which is converted to the active form and sequentially activates the next clotting factor. For example, the proenzyme factor XII is converted to its enzyme factor XIIa, which in turn converts the zymogen factor XI to the enzyme factor XIa, which in the presence of calcium. Activates factor IX. The enzyme Factor IXa activates Factor X in the presence of Factor VIIIa and phospholipids. This response is greatly increased by prior exposure of factor VIII to thrombin or factor Xa. Thus, the APTT assay requires several components in addition to plasma, including a source of phospholipids, calcium and endogenous pathway activators such as micronized silica, ellagic acid or kaolin. It is. Micronized silica beads are used as an activator of the intrinsic pathway and initiate the conversion of FXII to FXIIa.
ＡＰＴＴアッセイは、凝固因子の欠乏について患者の血漿をスクリーニングするために、そして、ヘパリンなどの抗凝固剤による処置を監視するために、臨床で一般的に使用される。このアッセイは、また、治療用の凝固因子の製造における品質管理の実施にも使用される。しかしながら、治療用タンパク質の共有結合による修飾は、ＡＰＴＴアッセイに干渉し、臨床適用および製造におけるその使用を制限する可能性がある。例えば、タンパク質のインビボでの半減期を延ばすために使用される共有結合による修飾の１つは、ＰＥＧ化である。ＰＥＧ化は、長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子のタンパク質または他の分子への共有結合である。タンパク質の半減期を延ばすことに加えて、ＰＥＧ化は、抗体の生成を減らし、タンパク質をプロテアーゼ分解から保護し、その物質を腎臓の濾液に入らせないために使用されてきた（Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51）。加えて、ＰＥＧ化は、タンパク質の包括的な安定性および溶解性も高め得る。 The APTT assay is commonly used clinically to screen patient plasma for coagulation factor deficiency and to monitor treatment with anticoagulants such as heparin. This assay is also used to perform quality control in the production of therapeutic clotting factors. However, covalent modification of therapeutic proteins can interfere with the APTT assay and limit its use in clinical applications and manufacturing. For example, one of the covalent modifications used to increase the in vivo half-life of proteins is PEGylation. PEGylation is the covalent attachment of long chain polyethylene glycol (PEG) molecules to proteins or other molecules. In addition to extending the half-life of the protein, PEGylation has been used to reduce antibody production, protect the protein from protease degradation, and prevent the substance from entering the kidney filtrate (Harris et al. , 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51). In addition, PEGylation can also increase the overall stability and solubility of the protein.
多くのタンパク質と同様に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）などの血液凝固因子への結合は、動物における半減期を延長し、治療剤としてのそれらの効力を高める。しかしながら、分子の生物学的活性がＰＥＧ化後に維持されていることを確認するために、ＰＥＧ化凝固因子の分析が必要である。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは他の凝固アッセイにおいて正常な生物学的活性を示すが、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の初期の試験は、微粒子化シリカを用いるＡＰＴＴアッセイにおいて、ＡＰＴＴアッセイがＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性を正確に測定しないことを示した。微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおける活性は、非常に信頼性が低い。ＡＰＴＴアッセイは広範に使用されているので、製造および臨床適用を支えるために、このアッセイをＰＥＧ化凝血因子の測定に適合させる必要性があった。 As with many proteins, the binding of polyethylene glycol (PEG) to blood clotting factors such as Factor VIII (FVIII) increases half-life in animals and increases their efficacy as therapeutic agents. However, analysis of PEGylated clotting factors is necessary to confirm that the biological activity of the molecule is maintained after PEGylation. While PEGylated FVIII shows normal biological activity in other clotting assays, early testing of PEGylated Factor VIII has shown that in the APTT assay using micronized silica, the APTT assay is a clotting activity of PEGylated blood clotting factor. Was not measured accurately. The activity in the APTT assay based on micronized silica is very unreliable. Since the APTT assay is widely used, there was a need to adapt the assay to the measurement of PEGylated clotting factors to support manufacturing and clinical applications.
要旨
微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の低下は、遊離ＰＥＧをアッセイに添加することにより克服され得、他の凝固アッセイで観察されるものと同様のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性レベルをもたらす。
Summary The decrease in the activity of PEGylated FVIII in the micronized silica-based APTT assay can be overcome by adding free PEG to the assay, and the activity of PEGylated FVIII similar to that observed in other coagulation assays Bring a level.
従って、提供されるのは、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの凝固活性の測定方法であって、ａ）シリカを活性化物質として有するトロンボプラスチン試薬および遊離ポリエチレングリコールを含むトロンボプラスチン試薬混合物を提供すること、および、ｂ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルを、該トロンボプラスチン試薬混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、ｃ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの凝固活性を測定することを含む方法である。 Accordingly, provided is a method for measuring the clotting activity of a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG, a) a thromboplastin reagent having silica as an activator and free Providing a thromboplastin reagent mixture comprising polyethylene glycol; and b) adding a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG to the thromboplastin reagent mixture and resulting reaction mixture And c) measuring the clotting time of the resulting reaction mixture, thereby measuring the clotting activity of the sample.
本発明は、また、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間の測定方法を提供し、それは、ａ）遊離ポリエチレングリコールを、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、並びに、シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬を含む活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ反応混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、ｂ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間を測定することを含む。 The present invention also provides a method for measuring the activated partial thromboplastin time of a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG, which comprises a) binding free polyethylene glycol to PEG Added to an activated partial thromboplastin time assay reaction mixture containing a thromboplastin reagent containing silica particles and a sample containing or suspected of containing blood clotting factors to form a resultant reaction mixture, b ) Measuring the clotting time of the resulting reaction mixture, thereby measuring the activated partial thromboplastin time of the sample.
本発明は、さらに、凝固活性化物質としてシリカを使用する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおいて、ＰＥＧに結合した血液凝固因子の活性を回復させる方法を提供し、それは、遊離ポリエチレングリコールを、ａ）該ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、ｂ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物に添加することを含む。 The present invention further provides a method for restoring the activity of blood clotting factor bound to PEG in an activated partial thromboplastin time assay using silica as a coagulation activator, which comprises free polyethylene glycol a) said Adding to a reaction mixture of an activated partial thromboplastin time assay comprising a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG and b) a thromboplastin reagent comprising silica particles.
加えて、本発明は、ＰＥＧに結合した凝固因子で処置された患者における凝固活性の測定方法を提供し、それは、ａ）患者由来の血液または血漿サンプル、シリカ粒子を活性化物質として含むトロンボプラスチン試薬、および、遊離ポリエチレングリコールを含む活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物を提供すること、および、ｂ）該反応混合物の凝固時間を測定し、それにより患者における凝固活性を測定することを含む。 In addition, the present invention provides a method for measuring clotting activity in a patient treated with a clotting factor conjugated to PEG, which comprises: a) a blood or plasma sample from the patient, a thromboplastin reagent comprising silica particles as an activator And providing a reaction mixture of an activated partial thromboplastin time assay comprising free polyethylene glycol, and b) measuring the clotting time of the reaction mixture, thereby measuring the clotting activity in the patient.
いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、ＰＥＧに結合した第Ｉ、第ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩまたは第ＸＩＩ因子である。いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子またはＢドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である。いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である。 In some embodiments, the blood clotting factor conjugated to PEG is Factor I, II, V, VIII, IX, X, XI or Factor XII conjugated to PEG. In some embodiments, the blood coagulation factor conjugated to PEG is Factor VIII or Factor VIII with the B domain removed. In some embodiments, the blood clotting factor conjugated to PEG is a blood clotting factor conjugated to recombinant PEG.
図面の説明Description of drawings
詳細な説明
提供されるのは、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおいて、ＰＥＧ化血液凝固因子の活性の信頼性が低いという課題の解決である。それは、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイの反応混合物に遊離ＰＥＧを添加することが、このアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの血液凝固活性を回復させることができるという発見に基づく。活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）またはＦＸＩａおよびＦＸＩＩａの添加によりＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性を回復させる以前の試みは成功しなかったので、この発見は予想外のものである。従って、それは、臨床適用および治療剤の製造に幅広く使用されている十分に確立されたアッセイでの、ＰＥＧ化血液凝固因子の分析を可能にする。
DETAILED DESCRIPTION Provided is a solution to the problem of low reliability of PEGylated blood clotting factor activity in an APTT assay based on micronized silica. It is based on the discovery that adding free PEG to the reaction mixture of the micronized silica based APTT assay can restore the blood clotting activity of PEGylated FVIII in this assay. This finding is unexpected because the addition of activated FIX (FIXa) or FXIa and FXIIa did not succeed in previous attempts to restore the activity of PEGylated FVIII in the APTT assay. It therefore enables the analysis of PEGylated blood clotting factors in well established assays that are widely used in clinical applications and the manufacture of therapeutic agents.
本明細書で使用する「ＰＥＧ」および「ポリエチレングリコール」は、互いに置き換え可能であり、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含む。典型的には、本発明の実施態様に従って使用するためのＰＥＧは、以下の構造「−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−−」を含み、ここで、（ｎ）は２ないし４０００である。本明細書で使用されるとき、ＰＥＧはまた、末端の酸素が置き換えられているか否かに応じて、「−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−」および「−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−−」も含む。明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「ＰＥＧ」は、様々な末端または「端部キャッピング」基、例えば、限定ではないが、ヒドロキシルまたはＣ１−２０アルコキシ基などを有する構造を含むことを念頭に置くべきである。用語「ＰＥＧ」は、また、大部分、即ち、５０％より多くの、−−ＯＣＨ２ＣＨ２−−繰り返しサブユニットを含有するポリマーも意味する。用語「遊離ポリエチレングリコール」または「遊離ＰＥＧ」は、他の分子に結合していないＰＥＧ分子を表す。具体的な形態に関しては、ＰＥＧは、無数の様々な分子量、並びに、構造または配置（geometries）、例えば、分枝状、直鎖状、分岐状および多官能性などをとり得る。いくつかの実施態様では、遊離ＰＥＧは、ＰＥＧ化凝固因子の結合に使用されたＰＥＧと同じ物であり得る。いくつかの実施態様では、ＡＰＴＴ反応混合物に添加するＰＥＧの分子量は、約２ないし１００ｋＤである。いくつかの実施態様では、ＡＰＴＴ反応混合物に添加するＰＥＧの分子量は、約２ないし３５ｋＤであり、いくつかの実施態様では、ＰＥＧの分子量は約３５ないし６４ｋＤであり、いくつかの実施態様では、ＰＥＧの分子量は約６４ないし１００ｋＤである。さらに、他のポリ（アルキル）グリコール類、例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはポリブチレングリコール（ＰＢＧ）の使用も、同様の結果を導き得るという見解である。 As used herein, “PEG” and “polyethylene glycol” are interchangeable with each other and include any water-soluble poly (ethylene oxide). Typically, PEG for use in accordance with embodiments of the present invention has the following structure "- (OCH 2 CH 2) n - " includes, where a 4000 to (n) is 2 to. As used herein, PEG can also be represented by “——CH 2 CH 2 —O (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH, depending on whether the terminal oxygen is replaced. 2 - "and" - (OCH 2 CH 2) n O-- "including. Throughout the specification and claims, the term “PEG” is intended to include structures having various terminal or “end capping” groups such as, but not limited to, hydroxyl or C 1-20 alkoxy groups. Should be put in. The term “PEG” also means a polymer containing the majority, ie, greater than 50%, of —OCH 2 CH 2 —repeating subunits. The term “free polyethylene glycol” or “free PEG” refers to a PEG molecule that is not conjugated to another molecule. With regard to specific forms, PEG can take a myriad of different molecular weights, as well as structures or geometries, such as branched, linear, branched and multifunctional. In some embodiments, the free PEG can be the same as the PEG used to attach the PEGylated coagulation factor. In some embodiments, the molecular weight of PEG added to the APTT reaction mixture is about 2 to 100 kD. In some embodiments, the molecular weight of PEG added to the APTT reaction mixture is about 2 to 35 kD, and in some embodiments, the molecular weight of PEG is about 35 to 64 kD, and in some embodiments, The molecular weight of PEG is about 64 to 100 kD. Furthermore, it is the view that the use of other poly (alkyl) glycols, such as polypropylene glycol (PPG) or polybutylene glycol (PBG), can lead to similar results.
遊離ＰＥＧは、ＡＰＴＴ反応混合物に様々な濃度範囲で添加できる。サンプル中のＰＥＧ化血液凝固因子の濃度が既知である場合、遊離ＰＥＧは、ＰＥＧ化凝固因子の数倍過剰で反応混合物に添加できる。いくつかの実施態様では、遊離ＰＥＧの濃度は、ＰＥＧの分子量に逆相関する。低分子量のＰＥＧには、高濃度の遊離ＰＥＧを使用できる。一方、高分子量のＰＥＧには、低濃度の遊離ＰＥＧを使用できる。本発明のいくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、ＰＥＧ化凝固因子の最終濃度よりも、約５０ないし１００、約１００ないし２００、約２００ないし５００、約１０００ないし５０００、約５０００ないし１０,０００、約１０,０００ないし２００,０００、または、約２００,０００ないし１０,０００,０００倍高い。いくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、ＰＥＧ化凝固因子の最終濃度よりも、約２００,０００ないし２,０００,０００倍高い。いくつかの場合では、サンプル中のＰＥＧ化凝固因子の濃度は、例えば、ＰＥＧ化凝固因子を投与された対象からサンプルを取る場合に、未知であり得る。従って、遊離ＰＥＧは、凝固因子の濃度に依存しない濃度で添加することもできる。ある実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、約１−２００ｎＭ、２００−１０００ｎＭ、１−１０μＭ、１０−１０００μＭまたはそれ以上である。濃度は、遊離ＰＥＧの溶解度を限度として、反応混合物の飽和点に到達するほど高くてもよい。いくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、約１０−２００μＭである。 Free PEG can be added to the APTT reaction mixture in various concentration ranges. If the concentration of PEGylated blood clotting factor in the sample is known, free PEG can be added to the reaction mixture in several fold excess of the PEGylated clotting factor. In some embodiments, the concentration of free PEG is inversely related to the molecular weight of PEG. For low molecular weight PEGs, high concentrations of free PEG can be used. On the other hand, a low concentration of free PEG can be used for the high molecular weight PEG. In some embodiments of the invention, the final concentration of free PEG in the reaction mixture is about 50-100, about 100-200, about 200-500, about 1000-5000, rather than the final concentration of PEGylated coagulation factor. About 5000 to 10,000, about 10,000 to 200,000, or about 200,000 to 10,000,000 times higher. In some embodiments, the final concentration of free PEG in the reaction mixture is about 200,000 to 2,000,000 times higher than the final concentration of PEGylated coagulation factor. In some cases, the concentration of PEGylated clotting factor in the sample may be unknown, for example when taking a sample from a subject that has been administered PEGylated clotting factor. Therefore, free PEG can be added at a concentration independent of the concentration of the coagulation factor. In certain embodiments, the final concentration of free PEG in the reaction mixture is about 1-200 nM, 200-1000 nM, 1-10 μM, 10-1000 μM or more. The concentration may be so high as to reach the saturation point of the reaction mixture, limited by the solubility of free PEG. In some embodiments, the final concentration of free PEG in the reaction mixture is about 10-200 μM.
ＰＥＧに結合したタンパク質は、１個またはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合しているタンパク質である。用語「ＰＥＧに結合した」および「ＰＥＧ化された」は、互換的に使用される。本発明は、ＰＥＧに結合した血液凝固因子に関するものである。血液凝固因子のＰＥＧ結合の方法は、例えば、米国特許第５,７６６,８９７号、米国特許第６,７５３,１６５号、ＷＯ９０／１２８７４および米国出願番号２００６０１１５８７６に記載されている。様々な方法でタンパク質をＰＥＧに結合させることができ、例えば、第一級アミン類（Ｎ末端およびリジン）のランダムな修飾により、または、部位特異的な戦略、例えば、非天然アミノ酸の導入と、それに続く、その非天然アミノ酸と特異的に反応するＰＥＧ誘導体の添加による。タンパク質の部位特異的ＰＥＧ結合への他のアプローチは、Ｎ末端の骨格のアミンをＰＥＧ−アルデヒドで標的化することによる。システインを挿入するか、または他のアミノ酸と置き換え、次いで、スルフヒドリル反応基を有するＰＥＧ部分を添加することによっても、タンパク質をＰＥＧに結合させることができる。 A protein attached to PEG is a protein that is covalently attached to one or more polyethylene glycol (PEG) molecules. The terms “PEG-conjugated” and “PEGylated” are used interchangeably. The present invention relates to a blood coagulation factor conjugated to PEG. Methods for PEG conjugation of blood clotting factors are described, for example, in US Pat. No. 5,766,897, US Pat. No. 6,753,165, WO 90/12874 and US Application No. 20060115876. Proteins can be coupled to PEG in a variety of ways, for example by random modification of primary amines (N-terminal and lysine) or by site-specific strategies such as the introduction of unnatural amino acids, By subsequent addition of a PEG derivative that reacts specifically with the unnatural amino acid. Another approach to site-specific PEG attachment of proteins is by targeting the N-terminal backbone amine with PEG-aldehyde. Proteins can also be attached to PEG by inserting cysteine or replacing other amino acids and then adding a PEG moiety with a sulfhydryl reactive group.
ＰＥＧに結合したタンパク質の例には、ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ−１４＋２が含まれるが、これらに限定されない。ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４は、アミノ酸位置４９１（Ｌ４９１Ｃ）に変異を有するＢＤＤ変異タンパク質である。ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４＋２は、アミノ酸位置４９１（Ｌ４９１Ｃ）および１８０４（Ｋ１８０４Ｃ）に変異を有するＢＤＤ変異タンパク質である。ＢＤＤ変異タンパク質のアミノ酸の位置番号は、完全長ＦＶＩＩＩタンパク質での位置を表す。 Examples of proteins conjugated to PEG include, but are not limited to, BDD-PEG-14 and BDD-PEG-14 + 2. BDD-PEG-14 is a BDD mutant protein having a mutation at amino acid position 491 (L491C). BDD-PEG-14 + 2 is a BDD mutant protein having mutations at amino acid positions 491 (L491C) and 1804 (K1804C). The amino acid position number of the BDD mutein represents the position in the full-length FVIII protein.
血液凝固因子には、血液凝固および凝血に関与するタンパク質および生理的に活性のあるそれらの断片が含まれる。このアッセイを使用して、第Ｉ、第ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩおよび第ＸＩＩ因子が含まれるがこれらに限定されない、内因性経路のＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性を測定できる。第ＶＩＩ因子は、部分トロンボプラスチン時間により影響を受けない唯一の因子であり、従って、その活性はＡＰＴＴアッセイでは検出できない。いくつかの実施態様では、本発明を使用して、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定する。他の実施態様では、Ｂドメインが除去された（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定する。いくつかの実施態様では、タンパク質は組換えタンパク質である。 Blood clotting factors include proteins involved in blood clotting and clotting and physiologically active fragments thereof. Using this assay, endogenous pathways of PEGylated blood coagulation factors include, but are not limited to, I, II, V, VIII, IX, X, XI and XII. Coagulation activity can be measured. Factor VII is the only factor that is not affected by the partial thromboplastin time and therefore its activity cannot be detected by the APTT assay. In some embodiments, the present invention is used to measure FVIII clotting activity. In another embodiment, the clotting activity of (BDD) FVIII from which the B domain has been removed is measured. In some embodiments, the protein is a recombinant protein.
血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、肝臓により合成され、血流に放出される糖タンパク質である。循環血中で、それはフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原としても知られている）に結合し、安定な複合体を形成している。トロンビンにより活性化されると、それは複合体から分離し、凝固カスケードの他の凝固因子と相互作用し、最終的に血栓の形成を導く。本明細書で使用される用語「第ＶＩＩＩ因子」には、天然産生の第ＶＩＩＩ因子の活性のある変異体が含まれる。 Blood coagulation factor VIII (FVIII) is a glycoprotein synthesized by the liver and released into the bloodstream. In the circulating blood, it binds to von Willebrand factor (vWF, also known as factor VIII-related antigen) and forms a stable complex. When activated by thrombin, it separates from the complex and interacts with other coagulation factors in the coagulation cascade, ultimately leading to thrombus formation. As used herein, the term “Factor VIII” includes active variants of naturally occurring Factor VIII.
本明細書で使用されるとき、Ｂドメインが除去されたＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）は、Ｂドメインの全部または一部が除去された第ＶＩＩＩ因子の分子である。ＦＶＩＩＩのＢドメインは、ＢＤＤが血友病Ａの補充療法として有効であるとも示されたので、不必要である。ある実施態様では、ＢＤＤは、Ｂドメインの最初の４アミノ酸がＢドメインの最後の１０残基に結合するように、ＦＶＩＩＩのＢドメインの１４アミノ酸を除く全てのアミノ酸の欠損を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする。 As used herein, FVIII with the B domain removed (BDD) is a factor VIII molecule with all or part of the B domain removed. The B domain of FVIII is unnecessary because BDD has also been shown to be effective as a replacement therapy for hemophilia A. In one embodiment, the BDD has an amino acid sequence that includes a deletion of all amino acids except the 14 amino acids of the B domain of FVIII such that the first 4 amino acids of the B domain bind to the last 10 residues of the B domain. It is characterized by that.
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイは、血餅形成時のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換に起因するサンプルの濁度または粘度の増加を測定することにより、サンプルの凝固因子活性を試験する。ＡＰＴＴアッセイは、内因性経路に関連する凝固を評価するために、内因性経路の活性化物質、例えば、微粒子化シリカ、エラグ酸またはカオリン、および、トロンボプラスチン試薬のリン脂質成分を用いる（組織因子なし）。血液凝固は、カルシウムの添加により開始される。カルシウムは、患者から抜き取る際にサンプルに典型的に添加されるシュウ酸塩またはクエン酸塩の抗凝固効果を打ち消すように作用する。凝固時間は、目視検査により、または、自動凝固器具により、測定できる。典型的には、殆どの器具は、光学的濁度または電気伝導度を監視することにより、血餅の形成を検出する。光学的濁度は、血餅の形成に起因する光の透過の減少により感知され得、一方、電気伝導度の増加は、血餅の形成に相関し得る。サンプルの凝固活性は、その凝固時間に対応し、短い凝固時間は高い凝固活性を反映する。ＡＰＴＴアッセイの実施方法は、例えば、米国特許第５,５０６,１４６号および第５,０９１,３０４号に記載されている。ＡＰＴＴアッセイは、様々な方法で、ＰＥＧ化血液凝固因子の分析に使用できる。本発明の方法は、それが患者に投与される前に、例えば、製造中の品質管理工程の一部として、ＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定に使用できる。他の実施態様では、本発明は、ＰＥＧ化血液凝固因子を投与された患者から採取されたサンプルにおいて、凝固活性を試験するのに使用し得る。 The activated partial thromboplastin time (APTT) assay tests the clotting factor activity of a sample by measuring the increase in turbidity or viscosity of the sample due to the conversion of fibrinogen to fibrin during clot formation. The APTT assay uses intrinsic pathway activators, such as micronized silica, ellagic acid or kaolin, and the phospholipid component of the thromboplastin reagent (without tissue factor) to assess coagulation associated with the intrinsic pathway. ). Blood clotting is initiated by the addition of calcium. Calcium acts to counteract the anticoagulant effect of oxalate or citrate typically added to the sample as it is withdrawn from the patient. The clotting time can be measured by visual inspection or by an automatic clotting instrument. Typically, most instruments detect clot formation by monitoring optical turbidity or electrical conductivity. Optical turbidity can be sensed by a decrease in light transmission due to clot formation, while an increase in electrical conductivity can correlate with clot formation. The clotting activity of the sample corresponds to its clotting time and a short clotting time reflects a high clotting activity. Methods for performing the APTT assay are described, for example, in US Pat. Nos. 5,506,146 and 5,091,304. The APTT assay can be used to analyze PEGylated blood clotting factors in a variety of ways. The method of the invention can be used to measure the clotting activity of a PEGylated blood clotting factor before it is administered to a patient, for example, as part of a quality control process during manufacture. In other embodiments, the present invention may be used to test clotting activity in a sample taken from a patient that has been administered a PEGylated blood clotting factor.
トロンボプラスチン試薬は、凝固活性化物質、例えば、シリカ、エラグ酸またはカオリン、および、リン脂質供給源、例えば、ウサギ脳リン脂質を含む。場合により、トロンボプラスチン試薬は、また、バッファー、抗菌薬およびカルシウム（血漿または血液サンプルにしばしば添加されるシュウ酸塩またはクエン酸塩の凝固効果を打ち消す）の１種またはそれ以上を含む。トロンボプラスチン試薬を、ＡＰＴＴアッセイで血液凝固活性を測定するサンプルと混合する。本発明は、シリカを含有するトロンボプラスチン試薬を用いて実施されるＡＰＴＴアッセイに関する。シリカをベースとするトロンボプラスチン試薬の例には、CEPHALINEX（商標）(Bio/Data Corporation) および Automated APTT 試薬 (BioMerieux）が含まれる。CEPHALINEX（商標）は、ウサギ脳リン脂質（セファリン）および粒子状微小シリカ活性化物質の凍結乾燥調製物である。Automated APTT 試薬は、ウサギ脳リン脂質および微粒子化シリカを適当なバッファー中に含有する。 Thromboplastin reagents include coagulation activators such as silica, ellagic acid or kaolin, and phospholipid sources such as rabbit brain phospholipids. Optionally, the thromboplastin reagent also includes one or more of a buffer, an antibacterial agent and calcium (which counteracts the clotting effect of oxalate or citrate often added to plasma or blood samples). Thromboplastin reagent is mixed with a sample whose blood clotting activity is measured in an APTT assay. The present invention relates to an APTT assay performed using a thromboplastin reagent containing silica. Examples of silica-based thromboplastin reagents include CEPHALINEX ™ (Bio / Data Corporation) and Automated APTT reagent (BioMerieux). CEPHALINEX ™ is a lyophilized preparation of rabbit brain phospholipid (cephalin) and particulate microsilica activator. Automated APTT reagent contains rabbit brain phospholipids and micronized silica in a suitable buffer.
本明細書で使用するとき、用語血漿は、一般的に、ＡＰＴＴ試薬と組み合わせられると凝血原活性を有するタンパク質を含む溶液を表す。血漿中のタンパク質には、血液凝固因子、トロンビンおよびフィブリノーゲンが含まれる。血漿は、また、他の血漿タンパク質、糖および／または塩も含有する。血漿は、ヒトまたは他の動物から得られる全血漿であり得る。血漿は、また、１種またはそれ以上の血液凝固因子を欠くもの、例えば、血友病Ａ患者に由来するＦＶＩＩＩ欠損血漿であり得る。血漿は、また、凝血原活性を有し、１種またはそれ以上の全血漿に由来する、血漿派生物であり得る。血漿派生物は、例えば、精製またはその他の処理によりいくつかのタンパク質、糖、塩または他の成分を除去した血漿画分または血漿であり得る。あるいは、血漿は、天然または人工成分を含む別々の供給源から得られる成分から形成される血漿置換物であり得る。例示的な人工成分には、天然の供給源から実質的に単離および／または精製された血漿タンパク質、および、組換え技術を使用して製造された血漿タンパク質が含まれる。使用し得る血漿の１つは、霊長類の血漿であり、いくつかの実施態様では、ヒトの血漿である。本明細書で使用されるとき、「血液」は、一般的に、全血、クエン酸血、濃縮血小板または血漿と血液細胞の制御混合物を表す。 As used herein, the term plasma generally refers to a solution containing a protein that has procoagulant activity when combined with an APTT reagent. Proteins in plasma include blood clotting factors, thrombin and fibrinogen. Plasma also contains other plasma proteins, sugars and / or salts. The plasma can be whole plasma obtained from humans or other animals. The plasma can also be one lacking one or more blood clotting factors, such as FVIII deficient plasma from a hemophilia A patient. Plasma can also be a plasma derivative that has procoagulant activity and is derived from one or more whole plasmas. The plasma derivative can be, for example, a plasma fraction or plasma from which some proteins, sugars, salts or other components have been removed by purification or other processing. Alternatively, the plasma can be a plasma substitute formed from components obtained from separate sources including natural or artificial components. Exemplary artificial components include plasma proteins substantially isolated and / or purified from natural sources, and plasma proteins produced using recombinant techniques. One plasma that may be used is primate plasma, and in some embodiments, human plasma. As used herein, “blood” generally refers to whole blood, citrated blood, concentrated platelets or a controlled mixture of plasma and blood cells.
実施例
実施例１. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイへの遊離ＰＥＧの添加は、測定されるＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の活性を高める。
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子は、発色（ＦＸａ−基質）アッセイにおいて、正常な生物学的活性または正常に近い生物学的活性を有する。しかしながら、それらの活性は、Automated APTT 試薬（BioMerieux）を Automatic Coagulation Analyzer（Electra 1800C または ACL Advance, Instrumentation Laboratory Co）で使用する、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでは、非常に信頼性が低い。ＢＤＤ−ＰＥＧ１４などのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、他のインビトロアッセイ（例えば、トロンビン生成アッセイ）および血友病の動物の薬力学モデルでは正常なＦＶＩＩＩ活性を示すので、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の欠如は、アッセイに特異的なものと思われた。ＡＰＴＴアッセイにおいてＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの生物学的活性を阻害するメカニズムを理解するために、高濃度の遊離ＰＥＧをアッセイに添加する効果を測定した。
Examples Example 1. Addition of free PEG to an APTT assay based on micronized silica enhances the measured activity of PEGylated Factor VIII.
PEGylated FVIII molecules have normal or near normal biological activity in a chromogenic (FXa-substrate) assay. However, their activity is very unreliable in APTT assays based on micronized silica using the Automated APTT reagent (BioMerieux) in an Automatic Coagulation Analyzer (Electra 1800C or ACL Advance, Instrumentation Laboratory Co). PEGylated FVIII, such as BDD-PEG14, shows normal FVIII activity in other in vitro assays (eg, thrombin generation assays) and pharmacodynamic models of hemophilia animals, so in microparticulated silica-based APTT assays The lack of activity of PEGylated FVIII appeared to be specific for the assay. To understand the mechanism of inhibiting the biological activity of PEGylated FVIII in the APTT assay, the effect of adding high concentrations of free PEG to the assay was measured.
ＡＰＴＴアッセイのために、使用した試薬は、１％ヒト血清アルブミンを含むトリス緩衝食塩水、血友病Ａ患者由来のＦＶＩＩＩ−欠損血漿、２５ｍＭ ＣａＣｌ２、２種のＡＰＴＴ試薬、即ち、微粒子化シリカを活性化物質として含む Platelet Factor 3 reagent Automated APTT (BioMerieux) またはエラグ酸を活性化物質として含む凝血終点（clot endpoint）試薬 AMAX ALEXIN（商標） (Trinity Biotech）のいずれかであった。Ｂドメインが除去されたＦＶＩＩＩおよび２種のＰＥＧ化ＢＤＤ分子、ＢＤＤ−ＰＥＧ１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４をこの研究で使用する。この実験では、０.０２５０ＩＵ／ｍｌおよび０.０１２５ＩＵ／ｍｌの２つの異なる最終濃度でＦＶＩＩＩサンプルを試験した。６４ｋＤ遊離ＰＥＧ（Sigma-Aldrich）を、最終濃度４３μＭで使用した。遊離ＰＥＧを、ＦＶＩＩＩサンプルに直接、または、反応混合物にＦＶＩＩＩを添加する前のＡＰＴＴ試薬に、添加した。Automatic Coagulation Analyzer (Electra 1800C, Instrumentation Laboratory Co）の製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。各サンプルの凝固時間を測定し、装置により自動的に収集した。
For the APTT assay, the reagents used were Tris buffered saline containing 1% human serum albumin, FVIII-deficient plasma from a hemophilia A patient, 25 mM CaCl 2 , two APTT reagents, ie micronized silica Was either
図１および表１に示す結果は、ＦＶＩＩＩサンプルまたはＡＰＴＴ試薬への遊離ＰＥＧの添加が、微粒子化シリカをベースとするアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの生物学的活性を回復させたことを示す。微粒子化シリカをベースとするアッセイに添加した遊離ＰＥＧがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性を回復させるという観察は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＰＥＧ部分が微粒子化シリカに吸着することを示唆する。本発明をどのようにも限定しないが、このシリカへの吸着が、ＦＶＩＩＩ分子が第Ｘ因子活性化複合体で集合および／または機能するのを妨げ得ると考えられる。 The results shown in FIG. 1 and Table 1 indicate that the addition of free PEG to the FVIII sample or APTT reagent restored the biological activity of PEGylated FVIII in a micronized silica-based assay. The observation that free PEG added to the micronized silica-based assay restores the activity of PEGylated FVIII suggests that the PEG moiety of PEGylated FVIII adsorbs to micronized silica. While not limiting the present invention in any way, it is believed that this adsorption to silica can prevent FVIII molecules from assembling and / or functioning in the factor X activation complex.
実施例２. 遊離ＰＥＧの添加は、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の微粒子化シリカへの結合を妨げる
微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴ試薬のＢＤＤおよびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４への結合に対する遊離ＰＥＧの効果を、改変したＡＰＴＴアッセイで測定した。遊離ＰＥＧを含有するサンプル中で、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴ試薬を、１００ｋＤ直鎖状遊離ＰＥＧと、最終ＰＥＧ濃度５００μＭで混合した。次いで、ＦＶＩＩＩをサンプルに、発色アッセイで測定される最終濃度１２ＩＵ／ｍｌで添加した。ＡＰＴＴアッセイを、ＣａＣｌ２の添加を省略することにより改変し、微粒子化シリカのアッセイ混合物からの分離を阻害するであろう迅速な凝固を回避した。３分間室温でインキュベートした後、微粒子化シリカを遠心沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、ウサギ抗−ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットで分析した。
Example 2. Addition of free PEG prevents binding of PEGylated Factor VIII to micronized silica Modifying the effect of free PEG on the binding of micronized silica based APTT reagent to BDD and BDD-PEG2 + 14 Measured by the APTT assay. In a sample containing free PEG, micronized silica-based APTT reagent was mixed with 100 kD linear free PEG at a final PEG concentration of 500 μM. FVIII was then added to the samples at a final concentration of 12 IU / ml as measured in the chromogenic assay. The APTT assay was modified by omitting the addition of CaCl 2 to avoid rapid clotting that would inhibit separation of micronized silica from the assay mixture. After incubating for 3 minutes at room temperature, the micronized silica was spun down, washed with PBS and analyzed by Western blot using a rabbit anti-FVIII polyclonal antibody.
図２に示す通り、遊離ＰＥＧの非存在下で、ＢＤＤおよびＰＥＧ化ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４は両方とも微粒子化シリカに結合したが、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩはより強く結合した（レーン１および３）。５００μＭ遊離ＰＥＧの存在下で、ＢＤＤもＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４も有意に微粒子化シリカに結合しなかった（レーン２および４）。これは、遊離ＰＥＧが微粒子化シリカへの結合と競合するならば、予想し得ることである。
As shown in FIG. 2, in the absence of free PEG, both BDD and PEGylated BDD-PEG2 + 14 bound to micronized silica, while PEGylated FVIII bound more strongly (
実施例３. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果は、ＰＥＧの大きさと濃度に依存する
このＡＰＴＴアッセイでは、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４を最終濃度０.０７７ｎＭ（０.１ＩＵ／ｍＬ）で使用した。４つの異なる大きさのＰＥＧ（２、３５、６４および１００ｋＤ）の１つを、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４が大過剰の７つの異なる濃度倍率（５０、１００、２００、５００、１,０００、５,０００および１０,０００倍高い）で添加した。これらの７つの異なる濃度倍率は、各々、最終ＰＥＧ濃度３.８、７.７、１５.４、３８.５、７７.０、３８５および７７０ｎＭに相当する。加えて、４つの異なる大きさのＰＥＧを、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４が大過剰の２００,０００および２,０００,０００の濃度倍率で添加した（図３に示す通り）。実施例１に記載の通りに反応を実施した。各サンプルの凝固時間を、微粒子化シリカ産物（Automated APTT, BioMerieux）をＡＰＴＴ試薬として使用して測定した。非ＰＥＧ化ＢＤＤを対照として使用した。
Example 3. The effect of free PEG in restoring the activity of PEGylated FVIII in a micronized silica-based APTT assay depends on the size and concentration of PEG In this APTT assay, BDD-PEG2 + 14 was brought to a final concentration of 0. Used at 077 nM (0.1 IU / mL). One of four different sized PEGs (2, 35, 64 and 100 kD) was added to seven different concentration magnifications (50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000 and BDD-PEG2 + 14 in large excess). 10,000 times higher). These seven different concentration magnifications correspond to final PEG concentrations of 3.8, 7.7, 15.4, 38.5, 77.0, 385 and 770 nM, respectively. In addition, four different sizes of PEG were added at 200,000 and 2,000,000 concentration magnification with a large excess of BDD-PEG2 + 14 (as shown in FIG. 3). The reaction was performed as described in Example 1. The clotting time of each sample was measured using micronized silica product (Automated APTT, BioMerieux) as the APTT reagent. Non-PEGylated BDD was used as a control.
図３は、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果が、ＰＥＧの大きさおよび濃度に依存し、大きいＰＥＧ分子および高い濃度が最大の効果を示すことを示す。ＰＥＧは同一部分の繰り返しからなるポリマーであるので、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果は、恐らく、ＰＥＧ部分（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）の濃度に応じて決まる。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩに対して百万倍の範囲で高い割合の遊離ＰＥＧが、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４の活性を回復させるために必要であり、これは、遊離ＰＥＧの微粒子化シリカとの相互作用は、比較的低い結合親和性であり得ることを示す。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの量に対して、微粒子化シリカビーズ上にＰＥＧと相互作用し得るかなり過剰の表面積があったという可能性もある。 FIG. 3 shows that the effect of free PEG in restoring the activity of PEGylated FVIII in the micronized silica-based APTT assay depends on the size and concentration of PEG, with larger PEG molecules and higher concentrations maximizing the effect. Indicates to show. Since PEG is a polymer consisting of repeats of the same moiety, the effect of free PEG in restoring the activity of PEGylated FVIII is likely dependent on the concentration of the PEG moiety (CH 2 CH 2 O—). A high percentage of free PEG, in the range of 1 million times that of PEGylated FVIII, is required to restore the activity of BDD-PEG2 + 14, which is the interaction of free PEG with micronized silica is relatively It shows that it can be a low binding affinity. There may also be a significant excess of surface area on the micronized silica beads that could interact with PEG relative to the amount of PEGylated FVIII.
実施例４. ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の低下は、微粒子化シリカをベースとするアッセイに特異的である
ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ活性の測定に伴う問題を克服するために、接触活性化物質として微粒子化シリカを使用しないＡＰＴＴアッセイ試薬を調べた。微粒子化シリカを含有する Automated APTT 試薬（BioMerieux）および微粒子化シリカを含まない凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標）(Trinity Biotech）をこの調査に使用した。様々な希釈のＢＤＤ、ＢＤＤ−ＰＥＧ１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４をこの研究で使用し、それらの凝固活性をこれらの２つのアッセイ系により測定した。全てのＦＶＩＩＩサンプルについてのＡＰＴＴアッセイは、ＭＬＡ１８００装置で実施した。実施例１に記載の通りにアッセイを実施した。
Example 4. Decreased activity of PEGylated FVIII in the APTT assay is specific for micronized silica based assays To overcome the problems associated with measuring PEGylated FVIII activity in the APTT assay, contact activation APTT assay reagents that did not use micronized silica as the material were investigated. Automated APTT reagent containing micronized silica (BioMerieux) and clotting endpoint reagent AMAX ALEXIN ™ (Trinity Biotech) without micronized silica were used for this study. Various dilutions of BDD, BDD-PEG14 and BDD-PEG2 + 14 were used in this study and their clotting activity was measured by these two assay systems. The APTT assay for all FVIII samples was performed on an MLA 1800 instrument. The assay was performed as described in Example 1.
結果は、微粒子化シリカをベースとする Automated APTT アッセイは、非ＰＥＧ化ＢＤＤ活性を検出し得たことを示す（図４）。しかしながら、Automated APTT アッセイは、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子の活性を正確に測定する能力を失った。一方、微粒子化シリカの代わりにエラグ酸を使用する凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイは、ＰＥＧ化のある、またはない、全ての３種のＦＶＩＩＩ分子の活性を測定することができた（図５）。微粒子化シリカを用いないＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子の正常な活性の立証は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子についての発色アッセイとＡＰＴＴアッセイの不一致は、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイに特異的であったことを示す。 The results show that the automated APTT assay based on micronized silica was able to detect non-PEGylated BDD activity (FIG. 4). However, the Automated APTT assay lost the ability to accurately measure the activity of PEGylated FVIII molecules. On the other hand, the AMAX ALEXIN ™ APTT assay, which uses ellagic acid instead of micronized silica, was able to measure the activity of all three FVIII molecules with or without PEGylation ( FIG. 5). Proof of normal activity of PEGylated FVIII molecules in an APTT assay without micronized silica is that the discrepancy between the chromogenic and APTT assays for PEGylated FVIII molecules is specific to the APTT assay based on micronized silica. It shows that.
Automated APTT アッセイ（図４）および凝血終点試薬AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイ（図５）の両方で測定された様々な濃度でのＢＤＤ−ＰＥＧ１４の活性を、それらの発色活性に対して編集した（図６）。結果は、Automated APTT アッセイはＰＥＧ化ＦＶＩＩＩには役に立たないが、凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイにより測定されたＢＤＤ−ＰＥＧ１４のＣｏａｇ単位は、それらの発色単位の２０％以内にあることを示す。従って、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの正常な活性は、接触活性化物質として微粒子化シリカではなくエラグ酸を使用する凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） アッセイで観察された。リン脂質（ウサギ脳セファリン）は、微粒子化シリカまたはエラグ酸を使用するＡＰＴＴ試薬の少なくともいくつかで同等であるので、微粒子化シリカがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの凝固活性を妨げる原因であると見込まれる。 The activities of BDD-PEG14 at various concentrations measured in both the Automated APTT assay (FIG. 4) and the clotting endpoint reagent AMAX ALEXIN ™ APTT assay (FIG. 5) were compiled for their chromogenic activity ( FIG. 6). The results show that the Automated APTT assay is not useful for PEGylated FVIII, but the Coag units of BDD-PEG14 measured by the clotting endpoint reagent AMAX ALEXIN ™ APTT assay are within 20% of their chromogenic units. Show. Thus, normal activity of PEGylated FVIII was observed with the AMAX ALEXIN ™ assay, which uses ellagic acid rather than micronized silica as the contact activator. Since phospholipids (rabbit brain sephaline) are equivalent in at least some of the APTT reagents that use micronized silica or ellagic acid, micronized silica is expected to be a cause of hindering the clotting activity of PEGylated FVIII.
表１. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性に対する遊離ＰＥＧの効果。全てのサンプルは、希釈倍率１であった。ダッシュは、値が検出範囲外であったことを示す。
Claims (27)
ａ）シリカを活性化物質として有するトロンボプラスチン試薬および遊離ポリエチレングリコールを含むトロンボプラスチン試薬混合物を提供すること、
ｂ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルを、該トロンボプラスチン試薬混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、
ｃ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの凝固活性を測定すること、
を含む方法。 A method for measuring the clotting activity of a sample containing or suspected of containing a blood clotting factor conjugated to PEG comprising:
a) providing a thromboplastin reagent mixture comprising a thromboplastin reagent having silica as an activator and free polyethylene glycol;
b) adding a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG to the thromboplastin reagent mixture to form a resulting reaction mixture; and
c) measuring the clotting time of the resulting reaction mixture, thereby measuring the clotting activity of the sample;
Including methods.
ａ）遊離ポリエチレングリコールを、
ｉ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、
ｉｉ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬
を含有する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ反応混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、
ｂ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間を測定すること、
を含む方法。 A method for measuring the activated partial thromboplastin time of a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to PEG, comprising:
a) free polyethylene glycol,
i) a sample containing or suspected of containing a blood clotting factor conjugated to PEG, and
ii) adding to an activated partial thromboplastin time assay reaction mixture containing a thromboplastin reagent containing silica particles to form a resulting reaction mixture; and
b) measuring the clotting time of the resulting reaction mixture, thereby measuring the activated partial thromboplastin time of the sample;
Including methods.
［請求項１３］
反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度が約１０μＭないし２００μＭである、請求項１２に記載の方法。 13. The method of claim 12, wherein the final concentration of free polyethylene glycol in the reaction mixture is about 200,000 to 2,000,000 times higher than the final concentration of blood clotting factor bound to PEG in the reaction mixture.
[Claim 13]
13. The method of claim 12, wherein the final concentration of free PEG in the reaction mixture is about 10 μM to 200 μM.
ａ）該ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、
ｂ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物に添加することを含む、方法。 In an activated partial thromboplastin time assay using silica as a coagulation activator, a method for restoring the activity of a blood clotting factor bound to PEG comprising free polyethylene glycol,
a) a sample containing or suspected of containing a blood coagulation factor conjugated to the PEG, and
b) adding to a reaction mixture of an activated partial thromboplastin time assay comprising a thromboplastin reagent comprising silica particles.
ａ）ｉ）患者由来の血液または血漿サンプル、
ｉｉ）シリカ粒子を活性化物質として含むトロンボプラスチン試薬、および、
ｉｉｉ）遊離ポリエチレングリコール
を含有する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物を提供すること、および、
ｂ）該反応混合物の凝固時間を測定し、それにより患者における凝固活性を測定すること、
を含む。 A method for measuring clotting activity in a patient treated with a clotting factor conjugated to PEG comprising:
a) i) a blood or plasma sample from the patient,
ii) a thromboplastin reagent containing silica particles as an activator, and
iii) providing a reaction mixture for an activated partial thromboplastin time assay containing free polyethylene glycol; and
b) measuring the clotting time of the reaction mixture, thereby measuring the clotting activity in the patient;
including.
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