JP2012509661A - バチルス属菌株を用いた発酵茶の製造方法 - Google Patents
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Abstract
韓国の伝統的な発酵食品から分離したバチルス属菌株を利用して、香味に優れた発酵茶を製造する方法を開示する。
Description
本発明は、病原性菌又は雑菌の汚染がなく、香味を改善させた発酵茶を製造する方法に関する。
一般的に、茶が微生物発酵の過程を経ると、微生物の代謝過程により、味、香り、色が変化して既存の風味が変わるようになる。これは、それぞれの微生物が持っている独特の酵素により、茶が持っている炭水化物、タンパク質、カテキン、その他無機物が代謝されるとともに、茶の有機酸やポリフェノール等の組成が変わることとなるが、この代謝の結果により、茶の味、香り、色が変化するようになる。発酵後の茶の味の変化は、微生物の種類、茶の構成成分の含量比、発酵液の組成、発酵温度及び時間等により異なって表れる。
そのため、嗜好度の良い茶の発酵のためには、適切な微生物の選定と発酵液の組成、発酵温度と時間の決定等が重要である。一般的に、発酵茶は、熱処理した茶葉を樽に漬け込んで放置する過程を通じて作られる。このとき、空気中からの落下菌や、茶葉に付着した不特定の嫌気性菌や一般細菌、特に、カビによる作用を多く受けることになる。具体的には、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌等の病原微生物が作り出す毒素やカビが作り出すアフラトキシンのような毒素に容易に晒され、危険度が増加し得る。のみならず、微生物の種類や数を調整することができないため、一定の茶の味を再現するのに困難があった。
本発明は、韓国の伝統発酵食品であるカンジャン（醤油）、テンジャン（味噌）、ジョッカル（塩辛）、白菜キムチ、大根キムチ、水キムチ等から分離された食品の微生物を利用して緑茶を発酵させることにより、微生物の代謝による香味に優れ、病原性細菌から安全な発酵茶を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態に係る発酵茶の製造方法は、（ｉ）バチルス属菌株を準備するステップ；（ｉｉ）前記バチルス属菌株を安定化させるステップ；（ｉｉｉ）前記安定化されたバチルス属菌株を茶葉に処理して発酵させるステップを含むことを特徴とする。
本発明の他の一実施形態に係る発酵茶の製造方法は、バチルス属菌株として、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択された１以上の菌株を使用して発酵させることを特徴とする。
本発明の一実施形態によれば、香味に優れ、渋味及び苦味が改善されて、総合的な嗜好度が向上し、病原性菌又は雑菌が増殖しない、安全な発酵緑茶を製造することができる。
本明細書において、「発酵液」とは、タンパク質粉末を含まない、発酵のための菌株と培養液との混合物を意味する。
本明細書において、「発酵菌液」とは、タンパク質粉末を含む、発酵のための菌株と培養液との混合物を意味する。
本明細書において、「発酵食品から分離されたバチルス菌株」とは、醤油、味噌、塩辛、白菜キムチ等の発酵食品から分離されたバチルス菌株を意味する。発酵食品は、特に、韓国の伝統発酵食品であることが好ましい。
本発明の一実施形態において、バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２３２、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６８、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２００、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｆ１３３７、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）Ｆ１００５、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１００４、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２３６及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２７９からなる群から選択された１以上の菌株とすることができる。その中でも、特に、嗜好性の観点から、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７が好ましい。前記菌株は、韓国食品研究院に寄託されている菌株であり、韓国食品研究院から誰でも容易に分譲を受けて使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉ）は、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄して培地を除去することが好ましい。培地が残留すると、茶の香味に影響を及ぼすため、培地を完全に除去することが好ましい。場合により、菌株を凍結乾燥して粉末形態でバチルス属菌株を準備している場合、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄する前記プロセスを経ずに、すぐにバチルス属菌株安定化のステップ（ｉｉ）に進めることもできる。
本発明の他の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉ）は、タンパク質粉末を含まない滅菌発酵液にバチルス属菌株を入れて培養することにより、菌株を安定化させることを含む。
前記タンパク質粉末が含まれていない発酵液は、砂糖、果糖及び水を含むことが好ましい。菌株安定化のステップにおいてタンパク質粉末を入れない理由は、微生物が分解して悪臭が出る問題を解決するためである。
場合により、本発明に係る製造方法は、ステップ（ｉｉｉ）の前にステップ（ｉｉ）で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加するステップをさらに含めることができる。菌株安定化のステップにおいて、タンパク質粉末を入れずにバチルス属菌株を安定化させた後、安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して、優れた風味の発酵茶を製造することができる。
前記タンパク質粉末は、タンパク質を粉末化させたことを意味するもので、タンパク質成分の粉末であればいずれも使用することができる。動物性タンパク質粉末又は植物性タンパク質粉末を使用することができる。動物性タンパク質の例としては、牛肉粉末、又は乳タンパク粉末等を挙げることができる。牛肉粉末は、狂牛病などの危険性があるため、安全性の面から植物性タンパク質粉末が好ましい。
前記植物性タンパク質粉末の例としては、大豆粉末を挙げることができる。大豆粉末は、大豆を粉末化させたものを意味する。大豆粉末の例として、大豆タンパク質粉末、大豆レシチン粉末、大豆ペプタイド粉末などが挙げられる。
その後、前記ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で安定化したバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して得られた発酵菌液を、茶葉に処理して発酵させるステップとすることもできる。
一実施形態において、前記発酵菌液は、発酵菌液全体の重量を基準に、砂糖０．０５〜１０．０重量％、果糖０．００５〜１０．０重量％、及び、タンパク質粉末０．００５〜１．０重量％含むことが好ましい。前記範囲内で、菌株の発酵が最も最適に起こるためである。
一実施形態において、前記発酵菌液を、時間間隔を開けて、３〜５回に分割して茶葉に処理することが好ましい。一度に緑茶に混合させると、均等な発酵菌液の混合が困難なためである。一方、発酵菌液を茶葉に加えるとき、茶葉を攪拌させ続けることが好ましい。緑茶乾燥葉に水分を混合する場合に発熱反応が表れるが、急速な温度の増加により菌株が損傷を受けないようにするためである。
発酵菌液を処理する茶葉は、緑茶生葉とすることもでき、緑茶生葉を乾燥させた乾燥葉とすることもできる。乾燥葉の場合でも、発酵が可能である。乾燥した緑茶の在庫を利用することができるという点で、乾燥葉を有用に使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉｉ）の発酵菌液は、１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのバチルス属菌株を含むことが好ましい。前記範囲内の菌株を含めると、発酵を円滑に行うことができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉｉ）は、優れた風味の発酵茶製造のための適切な温度で行われるものであれば特に制限されないが、例えば、１５〜７０℃の温度、具体的には４０〜７０℃の温度で行うことができる。１５〜４０℃での発酵は、例えば、低温発酵とすることができ、この場合、有機酸等を処理すると、雑菌の増殖を抑えて発酵させることができる。
また、４０℃以上の範囲では、別途に付加する物質なく、温度制御を通じて雑菌の増殖を抑えることができ、茶固有の香りを害さないようにすることができる。発酵温度が４０℃以上であると、バチルス属菌株を除く他の菌株の成長が難しくなるため、他の雑菌の増殖を抑えることができる。バチルス属菌株の生長が円滑に行われるには、７０℃以下であることが好ましい。
以下では、本発明の一実施形態に係る発酵茶製造方法について、各ステップごとに説明することとする。
＜緑茶葉及び接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表１の菌株を三角フラスコ（例えば、１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２０〜４０℃、６０〜８０時間培養する。
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表１の菌株を三角フラスコ（例えば、１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２０〜４０℃、６０〜８０時間培養する。
＜接種菌株の準備＞
振動培養器で６０〜８０時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．８〜１．０％の生理食塩水を用いて菌株を２〜４回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように３０秒〜１分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を２〜４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
振動培養器で６０〜８０時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．８〜１．０％の生理食塩水を用いて菌株を２〜４回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように３０秒〜１分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を２〜４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
＜発酵液の製造及び菌株の安定化＞
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％と、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％となるように溶解させた後、１００〜１４０℃で１０〜２０分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合する。
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％と、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％となるように溶解させた後、１００〜１４０℃で１０〜２０分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合する。
洗浄過程で損傷を受けた菌株の円滑な発酵代謝のため、発酵液において菌株を安定化させる過程が必要である。タンパク質粉末を入れる前の発酵液１００〜５００ｍＬに、生理食塩水で２〜４回洗浄された菌株を混合し、インキュベーターで２０〜４０℃、１２〜３６時間培養しつつ安定化させる。
＜緑茶の発酵及び乾燥方法＞
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように製造する。緑茶乾燥葉（水分含量５％未満）重量に対する水分比率が６０％よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、３０％未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、３０〜６０％となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の２０〜３０％ずつを３〜５回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。５〜３０分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度２０〜７０℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が４０度を超えると、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低２４時間から最長２８日間実施し、熱風乾燥で８０〜１２０℃、３〜７時間乾燥させる。
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように製造する。緑茶乾燥葉（水分含量５％未満）重量に対する水分比率が６０％よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、３０％未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、３０〜６０％となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の２０〜３０％ずつを３〜５回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。５〜３０分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度２０〜７０℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が４０度を超えると、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低２４時間から最長２８日間実施し、熱風乾燥で８０〜１２０℃、３〜７時間乾燥させる。
前記本発明の一実施形態の結果、製造された発酵緑茶の最終製品内の総菌数（Ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｃｏｕｎｔ）は、１０２〜１０８ＣＦＵ／ｇ以下と規格範囲を得ることができ、また、病原性微生物は、検出されなかった。
以下、本発明の好ましい一実施形態を挙げて本発明をより具体的に説明する。しかし、後述の実施例は、本発明の例示であるに過ぎず、本発明の範囲がその実施例に限定されるものではない。
本発明の一実施形態に係る発酵緑茶の製造方法は、以下のとおりである。
実施例１〜１０：発酵茶の製造
＜緑茶葉と接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表１の各菌株を三角フラスコ（１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用活性培地［Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ（組成培地１００ｍＬ当たりＰｏｔａｔｏ ｓｔａｒｃｈ（ジャガイモ澱粉）０．４％、Ｄｅｘｔｏｒｓｅ（デキストロース）２％）］に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で、２５℃、７２時間培養した。
＜緑茶葉と接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表１の各菌株を三角フラスコ（１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用活性培地［Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ（組成培地１００ｍＬ当たりＰｏｔａｔｏ ｓｔａｒｃｈ（ジャガイモ澱粉）０．４％、Ｄｅｘｔｏｒｓｅ（デキストロース）２％）］に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で、２５℃、７２時間培養した。
本実施例において選定された菌株は、韓国食品研究院の「食品微生物遺伝子バンク」から分譲された菌株である。本実施例では、味噌、辛い味噌、醤油又は麹から分離されたバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７（実施例１）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２３２（実施例２）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６７（実施例３）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６８（実施例４）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２００（実施例５）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｆ１３３７（実施例６）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）Ｆ１００５（実施例７）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１００４（実施例８）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２３６（実施例９）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２７９（実施例１０）を使用した。
＜接種菌株の準備＞
振動培養器で７２時間培養された各菌株を回収して、１回目として、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．９％の生理食塩水を用いて菌株を４回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように１分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした：菌株活性用活性培地（Ｄｉｆｃｏ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）に菌株を接種後７２時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の９倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ（ｓｐｒａｙｄｒｙｉｎｇ）機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
振動培養器で７２時間培養された各菌株を回収して、１回目として、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．９％の生理食塩水を用いて菌株を４回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように１分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした：菌株活性用活性培地（Ｄｉｆｃｏ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）に菌株を接種後７２時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の９倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ（ｓｐｒａｙｄｒｙｉｎｇ）機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
＜発酵液の製造及び菌株の安定化＞
発酵液重量全体を基準に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を溶解させた後、１２０℃で１５分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で２５℃まで冷却させた。冷却された発酵液２５０ｍＬに菌株を入れ、インキュベーターで２４時間培養した。
発酵液重量全体を基準に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を溶解させた後、１２０℃で１５分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で２５℃まで冷却させた。冷却された発酵液２５０ｍＬに菌株を入れ、インキュベーターで２４時間培養した。
＜緑茶の発酵と乾燥の方法＞
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー（Ｋｉｍｏｏｎ）１．０重量％を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、１０６ＣＦＵ／ｍＬであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し５０％となるように混合した。このとき、発酵液全体の２０％ずつ、計５回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。２０分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度５０℃の恒温発酵槽で１０日間発酵を行い、その後、１００℃で５時間熱風乾燥した。
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー（Ｋｉｍｏｏｎ）１．０重量％を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、１０６ＣＦＵ／ｍＬであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し５０％となるように混合した。このとき、発酵液全体の２０％ずつ、計５回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。２０分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度５０℃の恒温発酵槽で１０日間発酵を行い、その後、１００℃で５時間熱風乾燥した。
その結果、発酵緑茶の最終製品内の総菌数（Ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｃｏｕｎｔ）が１０２〜１０８ＣＦＵ／ｇ以下の規格範囲を得ることができる。
実験例１：微生物汚染検査
前記実施例１〜１０により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表２の結果を得た。
前記実施例１〜１０により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表２の結果を得た。
実験例２：官能評価
実施例１〜１０により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト（Ｐａｎｅｌ Ｔｅｓｔ）を実施した。検査方法は、専門評価者１０人が、実施例１〜１０により製造された発酵緑茶１０種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票（Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｔｉｎｇ）する評価法を利用し、その評価結果を下記表３に示した。
実施例１〜１０により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト（Ｐａｎｅｌ Ｔｅｓｔ）を実施した。検査方法は、専門評価者１０人が、実施例１〜１０により製造された発酵緑茶１０種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票（Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｔｉｎｇ）する評価法を利用し、その評価結果を下記表３に示した。
本発明は、病原性菌又は雑菌の汚染がなく、香味を改善させた発酵茶を製造する方法に関する。
一般的に、茶が微生物発酵の過程を経ると、微生物の代謝過程により、味、香り、色が変化して既存の風味が変わるようになる。これは、それぞれの微生物が持っている独特の酵素により、茶が持っている炭水化物、タンパク質、カテキン、その他無機物が代謝されるとともに、茶の有機酸やポリフェノール等の組成が変わることとなるが、この代謝の結果により、茶の味、香り、色が変化するようになる。発酵後の茶の味の変化は、微生物の種類、茶の構成成分の含量比、発酵液の組成、発酵温度及び時間等により異なって表れる。
そのため、嗜好度の良い茶の発酵のためには、適切な微生物の選定と発酵液の組成、発酵温度と時間の決定等が重要である（特許文献１〜３）。一般的に、発酵茶は、熱処理した茶葉を樽に漬け込んで放置する過程を通じて作られる。このとき、空気中からの落下菌や、茶葉に付着した不特定の嫌気性菌や一般細菌、特に、カビによる作用を多く受けることになる。具体的には、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌等の病原微生物が作り出す毒素やカビが作り出すアフラトキシンのような毒素に容易に晒され、危険度が増加し得る。のみならず、微生物の種類や数を調整することができないため、一定の茶の味を再現するのに困難があった。
本発明は、韓国の伝統発酵食品であるカンジャン（醤油）、テンジャン（味噌）、ジョッカル（塩辛）、白菜キムチ、大根キムチ、水キムチ等から分離された食品の微生物を利用して緑茶を発酵させることにより、微生物の代謝による香味に優れ、病原性細菌から安全な発酵茶を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態に係る発酵茶の製造方法は、（ｉ）バチルス属菌株を準備するステップ；（ｉｉ）前記バチルス属菌株を安定化させるステップ；（ｉｉｉ）前記安定化されたバチルス属菌株を茶葉に処理して発酵させるステップを含むことを特徴とする。
本発明の他の一実施形態に係る発酵茶の製造方法は、バチルス属菌株として、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択された１以上の菌株を使用して発酵させることを特徴とする。
本発明の一実施形態によれば、香味に優れ、渋味及び苦味が改善されて、総合的な嗜好度が向上し、病原性菌又は雑菌が増殖しない、安全な発酵緑茶を製造することができる。
本明細書において、「発酵液」とは、タンパク質粉末を含まない、発酵のための菌株と培養液との混合物を意味する。
本明細書において、「発酵菌液」とは、タンパク質粉末を含む、発酵のための菌株と培養液との混合物を意味する。
本明細書において、「発酵食品から分離されたバチルス菌株」とは、醤油、味噌、塩辛、白菜キムチ等の発酵食品から分離されたバチルス菌株を意味する。発酵食品は、特に、韓国の伝統発酵食品であることが好ましい。
本発明の一実施形態において、バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２３２、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６８、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２００、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｆ１３３７、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）Ｆ１００５、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１００４、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２３６及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２７９からなる群から選択された１以上の菌株とすることができる。その中でも、特に、嗜好性の観点から、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７が好ましい。前記菌株は、韓国食品研究院に寄託されている菌株であり、韓国食品研究院から誰でも容易に分譲を受けて使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉ）は、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄して培地を除去することが好ましい。培地が残留すると、茶の香味に影響を及ぼすため、培地を完全に除去することが好ましい。場合により、菌株を凍結乾燥して粉末形態でバチルス属菌株を準備している場合、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄する前記プロセスを経ずに、すぐにバチルス属菌株安定化のステップ（ｉｉ）に進めることもできる。
本発明の他の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉ）は、タンパク質粉末を含まない滅菌発酵液にバチルス属菌株を入れて培養することにより、菌株を安定化させることを含む。
前記タンパク質粉末が含まれていない発酵液は、砂糖、果糖及び水を含むことが好ましい。菌株安定化のステップにおいてタンパク質粉末を入れない理由は、微生物が分解して悪臭が出る問題を解決するためである。
場合により、本発明に係る製造方法は、ステップ（ｉｉｉ）の前にステップ（ｉｉ）で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加するステップをさらに含めることができる。菌株安定化のステップにおいて、タンパク質粉末を入れずにバチルス属菌株を安定化させた後、安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して、優れた風味の発酵茶を製造することができる。
前記タンパク質粉末は、タンパク質を粉末化させたことを意味するもので、タンパク質成分の粉末であればいずれも使用することができる。動物性タンパク質粉末又は植物性タンパク質粉末を使用することができる。動物性タンパク質の例としては、牛肉粉末、又は乳タンパク粉末等を挙げることができる。牛肉粉末は、狂牛病などの危険性があるため、安全性の面から植物性タンパク質粉末が好ましい。
前記植物性タンパク質粉末の例としては、大豆粉末を挙げることができる。大豆粉末は、大豆を粉末化させたものを意味する。大豆粉末の例として、大豆タンパク質粉末、大豆レシチン粉末、大豆ペプタイド粉末などが挙げられる。
その後、前記ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で安定化したバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して得られた発酵菌液を、茶葉に処理して発酵させるステップとすることもできる。
一実施形態において、前記発酵菌液は、発酵菌液全体の重量を基準に、砂糖０．０５〜１０．０重量％、果糖０．００５〜１０．０重量％、及び、タンパク質粉末０．００５〜１．０重量％含むことが好ましい。前記範囲内で、菌株の発酵が最も最適に起こるためである。
一実施形態において、前記発酵菌液を、時間間隔を開けて、３〜５回に分割して茶葉に処理することが好ましい。一度に緑茶に混合させると、均等な発酵菌液の混合が困難なためである。一方、発酵菌液を茶葉に加えるとき、茶葉を攪拌させ続けることが好ましい。緑茶乾燥葉に水分を混合する場合に発熱反応が表れるが、急速な温度の増加により菌株が損傷を受けないようにするためである。
発酵菌液を処理する茶葉は、緑茶生葉とすることもでき、緑茶生葉を乾燥させた乾燥葉とすることもできる。乾燥葉の場合でも、発酵が可能である。乾燥した緑茶の在庫を利用することができるという点で、乾燥葉を有用に使用することができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉｉ）の発酵菌液は、１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのバチルス属菌株を含むことが好ましい。前記範囲内の菌株を含めると、発酵を円滑に行うことができる。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（ｉｉｉ）は、優れた風味の発酵茶製造のための適切な温度で行われるものであれば特に制限されないが、例えば、１５〜７０℃の温度、具体的には４０〜７０℃の温度で行うことができる。１５〜４０℃での発酵は、例えば、低温発酵とすることができ、この場合、有機酸等を処理すると、雑菌の増殖を抑えて発酵させることができる。
また、４０℃以上の範囲では、別途に付加する物質なく、温度制御を通じて雑菌の増殖を抑えることができ、茶固有の香りを害さないようにすることができる。発酵温度が４０℃以上であると、バチルス属菌株を除く他の菌株の成長が難しくなるため、他の雑菌の増殖を抑えることができる。バチルス属菌株の生長が円滑に行われるには、７０℃以下であることが好ましい。
以下では、本発明の一実施形態に係る発酵茶製造方法について、各ステップごとに説明することとする。
＜緑茶葉及び接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表１の菌株を三角フラスコ（例えば、１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２０〜４０℃、６０〜８０時間培養する。
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表１の菌株を三角フラスコ（例えば、１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２０〜４０℃、６０〜８０時間培養する。
＜接種菌株の準備＞
振動培養器で６０〜８０時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．８〜１．０％の生理食塩水を用いて菌株を２〜４回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように３０秒〜１分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を２〜４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
振動培養器で６０〜８０時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．８〜１．０％の生理食塩水を用いて菌株を２〜４回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように３０秒〜１分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、２０００〜４５００ｒｐｍの速度で５〜１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を２〜４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
＜発酵液の製造及び菌株の安定化＞
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％と、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％となるように溶解させた後、１００〜１４０℃で１０〜２０分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合する。
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％と、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖０．０５〜１０．０％、果糖０．００５〜１０．０％となるように溶解させた後、１００〜１４０℃で１０〜２０分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末０．００５〜１．０％を混合する。
洗浄過程で損傷を受けた菌株の円滑な発酵代謝のため、発酵液において菌株を安定化させる過程が必要である。タンパク質粉末を入れる前の発酵液１００〜５００ｍＬに、生理食塩水で２〜４回洗浄された菌株を混合し、インキュベーターで２０〜４０℃、１２〜３６時間培養しつつ安定化させる。
＜緑茶の発酵及び乾燥方法＞
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように製造する。緑茶乾燥葉（水分含量５％未満）重量に対する水分比率が６０％よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、３０％未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、３０〜６０％となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の２０〜３０％ずつを３〜５回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。５〜３０分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度２０〜７０℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が４０度を超えると、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低２４時間から最長２８日間実施し、熱風乾燥で８０〜１２０℃、３〜７時間乾燥させる。
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように製造する。緑茶乾燥葉（水分含量５％未満）重量に対する水分比率が６０％よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、３０％未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、３０〜６０％となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の２０〜３０％ずつを３〜５回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。５〜３０分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度２０〜７０℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が４０度を超えると、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低２４時間から最長２８日間実施し、熱風乾燥で８０〜１２０℃、３〜７時間乾燥させる。
前記本発明の一実施形態の結果、製造された発酵緑茶の最終製品内の総菌数（Ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｃｏｕｎｔ）は、１０２〜１０８ＣＦＵ／ｇ以下と規格範囲を得ることができ、また、病原性微生物は、検出されなかった。
以下、本発明の好ましい一実施形態を挙げて本発明をより具体的に説明する。しかし、後述の実施例は、本発明の例示であるに過ぎず、本発明の範囲がその実施例に限定されるものではない。
本発明の一実施形態に係る発酵緑茶の製造方法は、以下のとおりである。
実施例１〜１０：発酵茶の製造
＜緑茶葉と接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表１の各菌株を三角フラスコ（１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用活性培地［Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ（組成培地１００ｍＬ当たりＰｏｔａｔｏ ｓｔａｒｃｈ（ジャガイモ澱粉）０．４％、Ｄｅｘｔｏｒｓｅ（デキストロース）２％）］に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で、２５℃、７２時間培養した。
＜緑茶葉と接種菌準備段階＞
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質（Ｍａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表１の各菌株を三角フラスコ（１０００ｍｌ）に入れた菌株活性化用活性培地［Ｄｉｆｃｏ（登録商標）Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ（組成培地１００ｍＬ当たりＰｏｔａｔｏ ｓｔａｒｃｈ（ジャガイモ澱粉）０．４％、Ｄｅｘｔｏｒｓｅ（デキストロース）２％）］に接種した後、振動培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で、２５℃、７２時間培養した。
本実施例において選定された菌株は、韓国食品研究院の「食品微生物遺伝子バンク」から分譲された菌株である。本実施例では、味噌、辛い味噌、醤油又は麹から分離されたバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７（実施例１）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２３２（実施例２）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６７（実施例３）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６８（実施例４）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２００（実施例５）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｆ１３３７（実施例６）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）Ｆ１００５（実施例７）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１００４（実施例８）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２３６（実施例９）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２７９（実施例１０）を使用した。
＜接種菌株の準備＞
振動培養器で７２時間培養された各菌株を回収して、１回目として、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．９％の生理食塩水を用いて菌株を４回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように１分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした：菌株活性用活性培地（Ｄｉｆｃｏ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）に菌株を接種後７２時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の９倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ（ｓｐｒａｙｄｒｙｉｎｇ）機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
振動培養器で７２時間培養された各菌株を回収して、１回目として、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、０．９％の生理食塩水を用いて菌株を４回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように１分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を４回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした：菌株活性用活性培地（Ｄｉｆｃｏ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）に菌株を接種後７２時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の９倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ（ｓｐｒａｙｄｒｙｉｎｇ）機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
＜発酵液の製造及び菌株の安定化＞
発酵液重量全体を基準に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を溶解させた後、１２０℃で１５分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で２５℃まで冷却させた。冷却された発酵液２５０ｍＬに菌株を入れ、インキュベーターで２４時間培養した。
発酵液重量全体を基準に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖５．０重量％及び果糖５．０重量％を溶解させた後、１２０℃で１５分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で２５℃まで冷却させた。冷却された発酵液２５０ｍＬに菌株を入れ、インキュベーターで２４時間培養した。
＜緑茶の発酵と乾燥の方法＞
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー（Ｋｉｍｏｏｎ）１．０重量％を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、１０６ＣＦＵ／ｍＬであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し５０％となるように混合した。このとき、発酵液全体の２０％ずつ、計５回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。２０分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度５０℃の恒温発酵槽で１０日間発酵を行い、その後、１００℃で５時間熱風乾燥した。
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー（Ｋｉｍｏｏｎ）１．０重量％を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、１０６ＣＦＵ／ｍＬであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し５０％となるように混合した。このとき、発酵液全体の２０％ずつ、計５回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。２０分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度５０℃の恒温発酵槽で１０日間発酵を行い、その後、１００℃で５時間熱風乾燥した。
その結果、発酵緑茶の最終製品内の総菌数（Ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｃｏｕｎｔ）が１０２〜１０８ＣＦＵ／ｇ以下の規格範囲を得ることができる。
実験例１：微生物汚染検査
前記実施例１〜１０により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表２の結果を得た。
前記実施例１〜１０により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表２の結果を得た。
実験例２：官能評価
実施例１〜１０により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト（Ｐａｎｅｌ Ｔｅｓｔ）を実施した。検査方法は、専門評価者１０人が、実施例１〜１０により製造された発酵緑茶１０種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票（Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｔｉｎｇ）する評価法を利用し、その評価結果を下記表３に示した。
実施例１〜１０により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト（Ｐａｎｅｌ Ｔｅｓｔ）を実施した。検査方法は、専門評価者１０人が、実施例１〜１０により製造された発酵緑茶１０種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票（Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｔｉｎｇ）する評価法を利用し、その評価結果を下記表３に示した。
Claims (16)
- （ｉ）バチルス属菌株を準備するステップ；
（ｉｉ）前記バチルス属菌株を安定化させるステップ；及び
（ｉｉｉ）前記安定化バチルス属菌株を茶葉に処理して発酵させるステップ
を含む発酵茶の製造方法。 - 前記バチルス属菌株は、発酵食品から分離されたバチルス属菌株であることを特徴とする、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択された１以上の菌株であること特徴とする、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２３２、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６７、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２６８、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１２００、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｆ１３３７、バチルス・ソノレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）Ｆ１００５、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１００４、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２３６及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ１２７９からなる群から選択された１以上の菌株であることを特徴とする、請求項３記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｆ１０１７であることを特徴とする、請求項４記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉ）は、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄して培地を除去することを含む、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉｉ）は、タンパク質粉末を含まない滅菌発酵液にバチルス属菌株を入れて培養することを含む、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵液は、砂糖、果糖及び水を含む、請求項７記載の発酵茶の製造方法。
- 前記製造方法は、ステップ（ｉｉｉ）以前に、ステップ（ｉｉ）で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加するステップをさらに含む、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して得られた発酵菌液を茶葉に処理して発酵させる、請求項９記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵菌液は、発酵菌液全体の重量を基準に、砂糖０．０５〜１０．０重量％、果糖０．００５〜１０．０重量％、及びタンパク質粉末０．００５〜１．０重量％を含むことを特徴とする、請求項１０記載の発酵茶の製造方法。
- 前記タンパク質粉末は、大豆粉末である、請求項９記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉｉｉ）は、時間間隔を置いて３〜５回に分割して発酵菌液を茶葉に処理する、請求項１０記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵菌液を茶葉に処理する際及び処理した後、茶葉を攪拌することを特徴とする、請求項１０記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉｉｉ）の発酵菌液は、１０３〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのバチルス属菌株を含むことを特徴とする、請求項１０記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ（ｉｉｉ）は、４０〜７０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１記載の発酵茶の製造方法。
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