JP2012123039A - 顕微鏡、領域判定方法、及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】プレパラート内に空気が含まれる場合でも、当該空気の領域以外の領域を、合焦処理等の対象となる領域として判定することができる顕微鏡、領域判定方法、プログラムを提供すること。
【解決手段】本発明に係る顕微鏡は、スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射する暗視野照明系と、前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像する撮像部と、前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定する領域判定部とを具備する。
【選択図】図５

Description

本発明は、撮像された試料画像に対し領域判定処理を行うことが可能な顕微鏡、領域判定方法、及びプログラムに関する。

近年、光学顕微鏡により得られる生体の細胞や組織等の拡大画像がデジタル化され、そのデジタル画像に基づき、医師や病理学者等がその組織等を検査したり、患者を治療したりするシステムが知られている。例えばバーチャルスライド装置により、生体の組織等が封入されたプレパラートがスキャンされ、組織等のデジタル画像が作成される。

例えば特許文献１には、病理細胞等の検体を顕微鏡で観察するために用いられるプレパラートについて記載されている。特許文献１の段落［００２１］や図５に記載されているように、スライドガラス(３)上に検体(４)が載せられ、封入剤(５)を介してカバーガラス(１)が被せられる。これによりプレパラート(６)が作成される。

特開２０１０−１９７４２５号公報

上記したように生体の組織等のデジタル画像が作成される際には、プレパラートに封入された検体にフォーカスを合わせることが重要である。しかしながら、プレパラート作成時に、スライドガラスとカバーガラスとの間に気泡が発生してしまうことがある。そうすると、プレパラートをスキャンするときに検体に対してフォーカスを合わせることが難しくなる。また例えば撮像されたデジタルデータから自動診断が行われる場合に、気泡の部分が診察対象の領域に含まれてしまい、正確な診断が妨げられる可能性もある。

以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、プレパラート内に空気が含まれる場合でも、当該空気の領域以外の領域を、合焦処理等の対象となる領域として判定することができる顕微鏡、領域判定方法、プログラムを提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る顕微鏡は、暗視野照明系と、撮像部と、領域判定部とを具備する。
暗視野照明系は、スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射する。
前記撮像部は、前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像する。
前記領域判定部は、前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定する。

この顕微鏡では、試料が封入されたプレパラートに暗視野照明が照射され、当該プレパラートの暗視野画像が撮像される。暗視野画像は、暗視野照明により生じる散乱光等の画像であり、これをもとにプレパラート内の空気と封入剤との境界が検出される。この結果、プレパラート内における空気の領域以外の領域を、合焦処理等の対象となる関心領域として判定することができる。

前記領域判定部は、前記暗視野画像において閉領域を形成する領域線を前記境界として検出してもよい。
この顕微鏡では、閉領域を形成する領域線が境界として検出される。これにより空気と封入剤との境界を容易に検出することができる。

前記領域判定部は、前記閉領域の内部領域及び外部領域を比較し、いずれか一方の領域を前記関心領域として判定してもよい。
この顕微鏡では、閉領域の内部領域及び外部領域を比較し、その結果をもとに関心領域が判定される。これにより、確実に関心領域を判定することができる。

前記顕微鏡は、前記内部領域における合焦位置と、前記外部領域における合焦位置とをそれぞれ算出する合焦処理部をさらに具備してもよい。この場合、前記領域判定部は、前記算出された領域ごとの合焦位置を比較し、前記関心領域を判定してもよい。
このように内部領域における合焦位置と、外部領域における合焦位置とが比較され、その結果をもとに関心領域が判定されてもよい。

前記顕微鏡は、照射部と、反射光検出部とをさらに具備してもよい。前記照射部は、前記内部領域及び前記外部領域のそれぞれに検出光を照射する。前記反射光検出部は、前記各領域に照射された前記検出光の反射光を検出する。
この場合、前記領域判定部は、前記反射光検出部により検出された前記領域ごとの反射光に、前記空気の領域で反射した反射光が含まれるかを判定し、その判定結果をもとに前記関心領域を判定してもよい。
このように内部領域及び外部領域に検出光がそれぞれ照射され、その反射光に基づいて関心領域が判定されてもよい。

本発明の一形態に係る領域判定方法は、スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射することを含む。
前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像が撮像される。
前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界が検出され、前記空気の領域以外の領域が前記試料に対する関心領域として判定される。

本発明の一形態に係るプログラムは、照射ステップと、撮像ステップと、判定ステップとを、コンピュータを搭載した顕微鏡に実行させる。
前記照射ステップは、スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射する。
前記撮像ステップは、前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像する。
前記判定ステップは、前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定する。
前記プログラムは、記録媒体に記録されていてもよい。

以上のように、本発明によれば、プレパラート内に空気が含まれる場合でも、当該空気の領域以外の領域を、合焦処理等の対象となる領域として判定することができる。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡の構成例を示す模式的な図である。 図１に示すプレパラートの構成例を示す模式的な図である。 図１に示すステージを模式的に示す平面図である。 図３に示すステージにプレパラートが載置された状態を示す図である。 第１の実施形態に係る暗視野照明系としての境界検出用照明系を示す模式的な斜視図である。 スライドガラス及びカバーガラスの間に空気が混入した状態のプレパラートを示す平面図である。 図６に示すプレパラートに明視野照明による透過光を照射して撮像されたサムネイル画像の写真である。 図６に示すプレパラートに染色用暗視野照明による透過光を照射して撮像されたサムネイル画像の写真である。 図６に示すプレパラートに、本実施形態に係る境界検出用照明系により暗視野照明光が照射されて撮像されたサムネイル画像の写真である。 図１に示す統括制御部の構成例を模式的に示すブロック図である。 図１に示す顕微鏡の動作例を示すフローチャートである。 気泡を含むプレパラートの模式的な断面図である。 気泡を含むプレパラートの拡大画像の一部を示す写真である。 本実施形態に係る関心領域の設定処理、及び関心領域の拡大画像の撮像処理を示すフローチャートである。 プレパラートの暗視野画像の別の例を示す平面図である。 図１に示す統括制御部として機能するコンピュータの構成例を模式的に示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係る関心領域の設定処理、及び関心領域の拡大画像の撮像処理を示すフローチャートである。 図１７に示す関心領域の設定処理について説明するための図である。 図１４に示す顕微鏡の処理の変形例を示すフローチャートである。 図１７に示す第２の実施形態に係る顕微鏡の処理の変形例を示すフローチャートである。 図５に示す境界検出用照明系の変形例を示す模式的な斜視図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。

＜第１の実施形態＞
［顕微鏡］
図１は、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡１００の構成例を示す模式的な図である。顕微鏡１００は、試料としての生体サンプルが封入されたプレパラート１８０全体のサムネイル画像を撮像するサムネイル画像撮像部１１０を有する。また顕微鏡１００は、所定の倍率で拡大された生体サンプルの拡大画像を撮像する拡大画像撮像部１２０を有する。本実施形態では、サムネイル画像撮像部１１０が、撮像部として機能する。

図２は、プレパラート１８０の構成例を示す模式的な図である。図２（Ａ）はプレパラート１８０の平面図である。図２（Ｂ）はプレパラート１８０の短手方向に沿う線での断面図（Ａ−Ａ線での断面図）である。

プレパラート１８０は、生体サンプル１９０が所定の固定手法によりスライドガラス１６０に固定されたものである。本実施形態では、スライドガラス１６０とカバーガラス１６１との間に封入剤１６５を用いて生体サンプル１９０が封入されている。

生体サンプル１９０は、例えば血液等の結合組織、上皮組織又はそれら双方の組織等の組織切片又は塗抹細胞からなる。これらの組織切片又は塗抹細胞には、必要に応じて各種の染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ（Fluorescence In-Situ Hybridization）や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。

封入剤１６５としては、例えば高分子ポリマーを芳香族系有機溶剤に溶解させたものが用いられる。しかしながら封入剤１６５の種類は、特に限定されない。染色剤を含む封入剤が用いられてもよい。

図２（Ａ）に示すように、プレパラート１８０に、対応する生体サンプル１９０を特定するための付帯情報（例えば、サンプルを採取した人の氏名、採取日時、染色の種類等）が記載されたラベル１６２が貼付されていてもよい。

図１に示すように顕微鏡１００は、プレパラート１８０が載置されるステージ１３０を有する。図３は、ステージ１３０を模式的に示す平面図である。図４は、ステージ１３０にプレパラート１８０が載置された状態を示す図である。

図３に示すように、ステージ１３０には、プレパラート１８０よりも略１回り面積が小さい開口部１３１が設けられている。ステージ１３０の開口部１３１の周囲には、プレパラート１８０の周辺１８１を固定する突起部１３２ａ〜１３２ｃが設けられる。

突起部１３２ａは、開口部１３１に対応した位置でステージ１３０に載置されるプレパラート１８０の短辺１８１ａを支持する。突起部１３２ｂ、１３２ｃは、プレパラート１８０の長辺１８１ｂを支持する。またステージ１３０には、短辺１８１ａ及び長辺１８１ｂの間の角１８２の対角となる角１８３を指示する抑止部１３３が設けられる。図３及び図４に示すように、抑止部１３３は、支点１３３ａを中心として回転可能に設けられ、かつ開口部１３１側に付勢されている。

ステージ１３０のプレパラート１８０が載置される載置面１３８には、ステージ１３０の位置を認識するためのマーク１３４ａ〜１３４ｄが付されている。例えばステージ１３０の画像がサムネイル画像撮像部等により撮像される。そのときのマーク１３４ａ〜１３４ｄの撮像位置に基づいて、ステージ１３０の位置が調整される。マーク１３４ａ〜１３４ｄとしては、例えばそれぞれ異なる位置関係で配置された「○」及び「△」のマーク等が用いられる。

図１に示すように、顕微鏡１００は、ステージ１３０を所定の方向に移動させるステージ駆動機構１３５を有する。ステージ駆動機構１３５により、ステージ１３０を、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）とに自由に移動させることができる。

拡大画像撮像部１２０は、光源１２１と、コンデンサレンズ１２２と、対物レンズ１２３と、撮像素子１２４とを有する。また拡大画像撮像部１２０は、図示しない視野絞り等を有する。

本実施形態に係る光源１２１は、ステージ１３０の載置面１３８とは逆の面１３９側に設けられる。光源１２１により、例えば一般染色が施された生体サンプル１９０を照明する光（以下、明視野照明光、又は、単に照明光ともいう）が照射される。又は光源１１１により、特殊染色が施された生体サンプル１９０を照明する光（以下、染色用暗視野照明光ともいう）が照射されてもよい。

あるいは、光源１２１として、明視野照明光及び染色用暗視野照明光を切り換えて照射可能なものが用いられてもよい。この場合、光源１２１として、明視野照明光を照射する光源と、染色用暗視野照明光を照射する光源の２種類の光源が設けられる。なお光源１２１は、ステージ１３０の載置面１３８側に設けられてもよい。

コンデンサレンズ１２２は、光源１２１から照射された明視野照明光や、染色用暗視野照明用の光源から照射された暗視野照明光を集光して、ステージ１３０上のプレパラート１８０に導くレンズである。このコンデンサレンズ１２２は、ステージ１３０の載置面１３８における拡大画像撮像部１２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、光源１２１とステージ１３０との間に配置される。

所定倍率の対物レンズ１２３は、ステージ１３０の載置面１３８における拡大画像撮像部１２０の基準位置の法線を光軸ＥＲＡとして、ステージ１３０の載置面１３８側に配置される。ステージ１３０に載置されたプレパラート１８０を透過した透過光は、この対物レンズ１２３によって集光されて、対物レンズ１２３の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子１２４に結像する。なお拡大画像撮像部１２０では、対物レンズ１２３を適宜交換することで、生体サンプル１９０を様々な倍率に拡大して撮像することが可能である。

撮像素子１２４には、ステージ１３０の載置面１３８における所定の横幅及び縦幅からなる撮像範囲の像が結像される。すなわち対物レンズ１２３により、生体サンプル１９０の一部が拡大されて撮像される。撮像範囲の大きさは、撮像素子１２４の画素サイズ及び対物レンズ１２３の倍率等に応じて定められる。撮像範囲の大きさは、サムネイル画像撮像部１１０により撮像される撮像範囲と比べて十分に小さい範囲となる。

サムネイル画像撮像部１１０は、光源１１１と、対物レンズ１１２と、撮像素子１１３とを有する。またサムネイル画像撮像部１１０は、図１には図示しない本実施形態に係る暗視野照明系としての、境界検出用照明系を有する。この境界検出用照明系については後述する。

光源１１１は、ステージ１３０の載置面１３８とは逆の面１３９側に設けられる。光源１１１として、明視野照明光を照射するもの又は染色用暗視野照明光を照射するものが用いられてもよい。あるいは双方の照明光を切り換えて照明するものが用いられてもよい。また光源１１１は、ステージ１３０の載置面１３８側に設けられてもよい。

所定倍率の対物レンズ１１２は、プレパラート１８０が載置される載置面１３８におけるサムネイル画像撮像部１１０の基準位置の法線を光軸ＳＲＡとして、ステージ１３０の載置面１３８側に配置される。ステージ１３０に載置されたプレパラート１８０を透過した透過光は、この対物レンズ１１２によって集光されて、対物レンズ１１２の後方（すなわち、照明光の進行方向）に設けられた撮像素子１１３に結像する。

撮像素子１１３には、載置面１３８に載置されたプレパラート１８０全体を包括する撮像範囲の光（プレパラート１８０略全体を透過した透過光）が結像する。この撮像素子１１３上に結像した像が、プレパラート１８０全体を撮像した顕微鏡画像であるサムネイル画像となる。また撮像素子１１３により、後述する境界検出用照明系により暗視野照明が照射されたプレパラート１８０のサムネイル画像が撮像される。

図１に示すように、拡大画像撮像部１２０及びサムネイル画像撮像部１１０は、それぞれの基準位置の法線である光軸ＳＲＡと光軸ＥＲＡとがＹ軸方向に距離Ｄだけ離れるように配置される。この距離Ｄは、撮像素子１１３の撮像範囲に拡大画像撮像部１２０の対物レンズ１２３を保持する図示しない鏡筒が写り込むことがないように設定される。一方、距離Ｄは、顕微鏡１００の小型化のために可能な限り小さく設定される。

上記した撮像素子１２４及び１１３は、１次元撮像素子であってもよく、２次元撮像素子であってもよい。

図５は、本実施形態に係る暗視野照明系としての境界検出用照明系を示す模式的な斜視図である。境界検出用照明系５００は、プレパラート１８０に暗視野照明光を照射するＬＥＤ（Light Emitting Diode）リング照明１１４を有する。ＬＥＤリング照明１１４は、ステージ１３０に載置されたプレパラート１８０と撮像素子１１３との間に配置される。すなわち光源１１１とは逆側に設けられる。またＬＥＤリング照明１１４は、プレパラート１８０の縁部１８４側から斜めに暗視野照明を照射可能なように、その位置及び形状が設定されている。

暗視野照明光の照射角度は適宜設定可能である。例えばＬＥＤリング照明１１４が、プレパラート１８０の略同一面上に、リング内にプレパラート１８０を含むように設けられる。そしてプレパラート１８０の略真横から暗視野照明光が照射されてもよい。

ここで本実施形態に係る境界検出用照明系５００により暗視野照明光が照射されたプレパラート１８０のサムネイル画像について説明する。図６〜図９は、その説明のための図である。

図６に示すように、プレパラート１８０に生体サンプル１９０が封入されるときに、スライドガラス１６０及びカバーガラス１６１の間に空気が混入し、気泡５０が発生してしまう場合がある。

図７は、このプレパラート１８０に明視野照明による透過光を照射して撮像されたサムネイル画像２１０の写真である。図７に示すように、封入剤１６５と気泡５０の境界５５におけるコントラストは低い。従って当該境界５５を検出することが困難である。

図８は、このプレパラート１８０に染色用暗視野照明による透過光を照射して撮像されたサムネイル画像２２０の写真である。図８に示すように、このサムネイル画像２２０においても、封入剤１６５と気泡５０の境界５５におけるコントラスト低く、当該境界５５を検出することは困難である。

図９は、本実施形態に係る境界検出用照明系５００により暗視野照明光が照射されて撮像されたサムネイル画像２００の写真である。このサムネイル画像２００は暗視野画像として撮像される。図９に示すように、サムネイル画像２００では、封入剤１６５と気泡５０の境界５５におけるコントラストが強調されて撮像される。これは封入剤１６５と気泡５０との境界５５において、暗視野照明光が散乱し、その散乱光等が撮像素子１１３に結像されるからである。

一般的な光の特性として、短波長の光は散乱されやすく（すなわち散乱率が高く）、長波長の光は散乱されにくい（すなわち散乱率が低い）。波長によって散乱率の異なる散乱をレーリー散乱という。レーリー散乱による散乱率は、波長の４乗に反比例する。光が大きく散乱するほど散乱率の変化の差分を光の濃淡差として撮像することができるので、境界５５を明確に検出することが可能となる。従って散乱率の高い、短波長の光（例えば、青色、紫糸、白色等）が暗視野照明光として用いられてもよい。しかしながら、暗視野照明光の波長は適宜設定可能である。

なお、本実施形態としては、境界検出用照明系として、ＬＥＤ照明が用いられた。しかしながらこれに限られず、例えば、暗視野照明系としてレーザ光が用いられてもよい。

図１に示すように顕微鏡１００には、顕微鏡１００の各プロックを制御するための制御部が接続されている。例えば顕微鏡１００には、光源１１１、光源１２１及びＬＥＤリング照明１１４を含む、顕微鏡１００が備える各種の光源を制御するための照明制御部１４１が接続されている。ステージ駆動機構１３５にはステージ駆動制御部１４２が接続されている。

サムネイル画像を撮像するための撮像素子１１３には、サムネイル画像撮像制御部１４３が接続されており、生体サンプル１９０の拡大画像を撮像するための撮像素子１２４には、拡大画像撮像制御部１４４が接続されている。これらの制御部は、各種のデータ通信路を介して顕微鏡１００の各ブロックに接続される。

また図１に示すように、顕微鏡１００には、顕微鏡１００全体の制御を行う統括制御部１５０が別途設けられている。上記した各種の制御部は、各種のデータ通信路を介して、統括制御部１５０に接続される。統括制御部１５０は、領域判定部等として機能する。

各制御部及び統括制御部１５０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、例えばＨＤＤ（Hard disk drive）等のストレージ装置、通信装置及び演算回路等により実現されるものである。

照明制御部１４１は、統括制御部１５０から生体サンプル１９０の照明方法を示す情報が出力されると、その情報に基づいて、対応する光源の照射制御を行う。例えばサムネイル画像撮像部１１０の光源１１１により照明光が照射される場合、照明制御部１４１は照明方法の情報を参照し、撮像モードを判定する。すなわち照明制御部１４１は、明視野画像を取得すべきモード（以下、明視野モードともいう）又は暗視野像を取得すべきモード（以下、暗視野モードともいう）のどちらが実行されるかを判定する。

照明制御部１４１は、各モードに応じたパラメータを光源１１１に対して設定し、光源１１１に各モードに適した照明光を照射させる。これにより光源１１１から照射された照明光が、ステージ１３０の開口部１３１を介して、生体サンプル１９０に照射される。なお、照明制御部１４１が設定するパラメータとしては、例えば照明光の強度や光源種類の選択等がある。

拡大画像撮像部１２０の光源１２１により照明光が照射される場合、照明制御部１４１は照明方法の情報を参照し、明視野モード又は暗視野モードのどちらが実行されるかを判定する。照明制御部１４１は、各モードに応じたパラメータを光源１２１に対して設定し、光源１２１から、各モードに適した照明光を照射させる。これにより、光源１２１から照射された照明光が、ステージ１３０の開口部１３１を介して、生体サンプル１９０に照射される。

明視野モードにおける照射光は、典型的には可視光である。暗視野モードにおける照射光は、典型的には、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起可能な波長を含む光である。暗視野モードでは、蛍光マーカに対する背景部分はカットアウトされる。

ステージ駆動制御部１４２は、統括制御部１５０から生体サンプル１９０の撮像方法を示す情報が出力されると、その情報に基づいて、ステージ駆動機構１３５を制御する。例えば統括制御部１５０からステージ駆動制御部１４２に生体サンプル１９０のサムネイル画像を撮像する旨の情報が出力される。そうするとステージ駆動制御部１４２はステージ駆動機構１３５を駆動制御し、ステージ面方向（Ｘ―Ｙ軸方向）でステージ１３０を移動させる。ステージ１３０は、プレパラート１８０全体が撮像素子１１３の撮像範囲に入るように移動される。またステージ駆動制御部１４２は、対物レンズ１１２の合焦処理のために、ステージ１３０をステージ面に直交する方向（Ｚ軸方向、生体サンプル１９０の奥行方向）に移動させる。

統括制御部１５０から生体サンプル１９０の拡大画像を撮像する旨の情報が出力されると、ステージ駆動制御部１４２は、サムネイル画像撮像部１１０から拡大画像撮像部１２０へステージを移動させる。ステージ１３０は、コンデンサレンズ１２２と対物レンズ１２３との間の位置に生体サンプル１９０が配置されるように、ステージ面方向に移動される。またステージ１３０は、撮像素子１２４により撮像される撮像範囲に生体サンプル１９０の所定の部位が配置されるように移動される。さらにステージ駆動制御部１４２は、対物レンズ１１２の合焦処理のために、ステージ１３０をＺ軸方向に移動させる。

サムネイル画像撮像制御部１４３は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを撮像素子１１３に設定する。またサムネイル画像撮像制御部１４３は、撮像素子１１３の結像面に結像した像についての出力信号をもとに、サムネイル画像についての画像データを出力する。なおサムネイル画像撮像制御部１４３が設定するパラメータとして、例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングがある。

拡大画像撮像制御部１４４は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを、撮像素子１２４に設定する。また拡大画像撮像制御部１４４は、撮像素子１２４の結像面に結像した像についての出力信号をもとに、拡大画像についての画像データを出力する。当該画像データは、統括制御部１５０に出力される。

図１０は、統括制御部１５０の構成例を模式的に示すブロック図である。統括制御部１５０は、位置制御部１５１と、画像処理部１５２と、サムネイル画像取得部１５３と、拡大画像取得部１５４とを備える。

位置制御部１５１は位置制御処理を実行し、ステージ１３０を、目標とする位置に移動させる。位置制御部１５１は、目標位置決定部１５１ａと、ステージ画像取得部１５１ｂと、ステージ位置検出部１５１ｃとを有する。

サムネイル画像が取得される場合、目標位置決定部１５１ａにより、ステージ１３０の目標位置が決定される。ステージ１３０の目標位置は、撮像素子１１３の撮像範囲にプレパラート１８０全体が入る位置に定められる。

ステージ画像取得部１５１ｂは、照明制御部１４１を介して光源１１１やマーク１３４ａ〜１３４ｄを照明する光源等を駆動させる。そしてサムネイル画像撮像制御部１４３を介して撮像素子１１３により撮像される撮像範囲全体のステージ画像を所定のタイミング間隔で取得する。

ステージ位置検出部１５１ｃは、取得されたステージ画像の各画素と、予めＨＤＤ（ストレージ装置）に格納されたマーク１３４ａ〜１３４ｄの形状データとの相関値を算出する。そしてステージ画像におけるマーク１３４ａ〜１３４ｄの位置を算出する。これらステージ画像における各マークの位置に基づいて、例えばＨＤＤに格納された対応テーブル等を利用することで、実際のステージ１３０の位置が検出される。

位置制御部１５１は、目標位置決定部１５１ａにより決定された目標位置と、ステージ位置検出部１５１ｃにより検出されたステージ１３０の位置との差分を算出する。そして該差分をステージ駆動制御部１４２に出力する。

ステージ駆動制御部１４２は、位置制御部１５１から供給される差分に応じてステージ駆動機構１３５を制御し、ステージ１３０を目標位置へと移動させる。位置制御部１５１は、撮像素子１１３により撮像されるステージ画像を取得するたびに、上記差分の情報をステージ駆動制御部１４２に出力することが可能である。

本実施形態に係る画像処理部１５２は、サムネイル画像撮像制御部１４３から出力されたサムネイル画像に基づいて種々の処理を実行する。例えば図９に示すような境界検出用照明系５００により照明されたサムネイル画像２００をもとに、気泡５０と封入剤１６５との境界５５を検出する。また気泡５０の領域である空気層領域５１以外の領域を生体サンプル１９０に対する関心領域（ROI：Region Of Interest）１９５として判定する（図６参照）。これらの処理については、後に詳述する。

また画像処理部１５２により、複数の拡大画像が撮像される対象領域が設定されてもよい。あるいは、画像処理部１５２により、プレパラート１８０に付されたラベル１６２の画像が取得されたり、プレパラート１８０内の異物等によるノイズが除去されてもよい。画像処理部１５２により生成されたデータやパラメータ等は、サムネイル画像取得部１５３及び拡大画像取得部１５４に出力される。

サムネイル画像取得部１５３は、例えば顕微鏡１００に対するユーザの操作に基づいて、サムネイル画像撮像制御部１４３に、各種設定条件でのサムネイル画像の撮像を要求する。ステージ１３０にプレパラート１８０が載置されたときに、自動的にサムネイル画像の撮像の要求が行われてもよい。

またサムネイル画像取得部１５３は、画像処理部１５２から出力されたサムネイル画像のデータを所定の記憶部に格納させてもよい。またはサムネイル画像取得部１５３により、サムネイル画像データが、図示しない通信部を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力されてもよい。

拡大画像取得部１５４は、例えば顕微鏡１００に対するユーザの操作に基づいて、拡大画像撮像制御部１４４に、各種設定条件での拡大画像の撮像を要求する。プレパラート１８０のサムネイル画像が撮像された後に、自動的に拡大画像の撮像の要求が行われてもよい。

また拡大画像取得部１５４は、拡大画像撮像制御部１４４から出力された拡大画像のデータを所定の記憶部に格納させてもよい。または拡大画像取得部１５４により、拡大画像データが、図示しない通信部を介して、外部に設けられた画像データ格納サーバ等に出力されてもよい。

＜顕微鏡の動作＞
図１１は、本実施形態に係る顕微鏡１００の動作例を示すフローチャートである。サムネイル画像撮像部１１０の、光源１１１と対物レンズ１１２との間の位置に、ステージ１３０が移動する（ステップ１０１）。境界検出用照明系５００のＬＥＤリング照明１１４により、プレパラート１８０に暗視野照明光が照射される（ステップ１０２）。プレパラートの暗視野画像が撮像される（ステップ１０３）。これにより図９に示すようなサムネイル画像２００が生成される。なお、サムネイル画像２００が撮像された後に、暗視野照明光の照射がＯＦＦとなってもよい。

撮像されたサムネイル画像２００において、コントラストが強調されている強調部分５６が検出される（ステップ１０４）。この強調部分５６が、プレパラート１８０における、封入剤１６５と気泡５０の境界５５として検出される。

強調部分５６は、例えばサムネイル画像２００の各画素の輝度値に基づいて検出される。例えば、予め設定された閾値よりも輝度値が大きい部分が、強調部分５６として検出されてもよい。又は周波数成分や標準偏差値を用いて強調部分５６が検出されてもよい。その他、コントラストの強調部分５６を検出する方法は適宜設定可能である。

検出された封入剤１６５と気泡５０の境界５５の情報をもとに、気泡５０の領域である空気層領域５１以外の領域が生体サンプル１９０に対する関心領域１９５として判定される。そして関心領域１９５に対して適宜合焦処理等が行われ、プレパラート１８０がスキャンされる（ステップ１０５）。

図１２及び図１３は、プレパラート１８０に対する合焦処理について説明するための図である。図１２は、気泡５０を含むプレパラート１８０の模式的な断面図である。図１３は、気泡５０を含むプレパラート１８０の拡大画像の一部を示す写真である。

本実施形態では、サムネイル画像撮像部１１０及び拡大画像撮像部１２０は、合焦処理部としてのオートフォーカス機構を有する。オートフォーカス機構により合焦位置が算出され、当該合焦位置を基準としてフォーカスが合わせられる。

図１２に示すように、スライドガラス１６０とカバーガラス１６１の間に、封入剤１６５により生体サンプル１９０が封入されている。そしてスライドガラス１６０とカバーガラス１６１の間に気泡が生じている。ここでプレパラート１８０の外部（空気）、及び気泡５０内の屈折率Ｎ₄の値を１とする。スライドガラス１６０の屈折率Ｎ₁、封入剤１６５の屈折率Ｎ₂、及びカバーガラス１６１の屈折率Ｎ₃はそれぞれ略等しいものとする。そしてその値は空気の屈折率よいも大きい、例えば１．５程度の値とする。

図１２に示すように、気泡５０が存在しない関心領域１９５に対して合焦処理が実行される場合、合焦位置Ｆ₁を基準としてフォーカスが合わせられる。図１３（Ａ）には、関心領域１９５に対して合焦処理が実行されたときの写真が示されている。

一方、気泡５０内の空気層領域５１に対して合焦処理が実行される場合、合焦位置Ｆ₂を基準としてフォーカスが合わせられる。空気層領域５１での屈折率Ｎ₄の値と、カバーガラス等の屈折率Ｎ₁〜Ｎ₃の値との相違により、合焦位置Ｆ₂は合焦位置Ｆ₁と異なる位置となる。図１２に示すように、合焦位置Ｆ₂は、合焦位置Ｆ₁よりも深い位置、すなわちＺ軸方向において対物レンズ１１２から遠ざかる位置となる。図１３（Ｂ）には、気泡５０内の空気層領域５１に対して合焦処理が実行されたときの写真が示されている。

このように、プレパラート１８０に気泡５０が混入すると、プレパラート１８０がスキャンされるときに、診察等の対象となる関心領域１９５にフォーカスを合わせることが難しくなる。また例えば撮像された拡大画像をもとに自動診断が行われる場合に、気泡５０の部分が診察対象の領域に含まれてしまうことで、正確な診断が妨げられる可能性もある。また気泡５０内の意味のない部分の撮影により、生成される拡大画像等のデジタルデータの容量が無駄に大きくなってしまう、といった悪影響が考えられる。

本実施形態に係る顕微鏡１００では、境界検出用照明系５００により、生体サンプル１９０が封入されたプレパラート１８０に暗視野照明光が照射される。そしてプレパラート１８０のサムネイル画像２００が暗視野画像として撮像される。暗視野画像には、プレパラート１８０内の気泡５０と封入剤１６５との境界５５における散乱光による強調部分５６が写される。従って強調部分５６を境界５５として検出することが可能となる。この結果、プレパラート１８０内における気泡５０内の空気層領域５１以外の領域を、合焦処理等の対象となる関心領域１９５として判定することができる。また空気層領域５１を自動診断の診断対象から除き、関心領域１９５を診断対象とすることで、正確な診断が実現される。また空気層領域５１の撮像を省くことができるので、生成されるデジタルデータの容量を削減し、処理リソースへの負担を軽減することができる。

以下、境界検出用照明系５００により暗視野照明光が照射されたプレパラート１８０のサムネイル画像２００（以下、暗視野画像２００ともいう）から、関心領域１９５を設定する方法について詳しく説明する。図１４は、関心領域１９５の設定処理、及び関心領域１９５の拡大画像の撮像処理を示すフローチャートである。

プレパラート１８０の暗視野画像２００より閉領域及び開領域とが検出される（ステップ２０１）。図９に示すように、強調部分５６は閉領域５７を形成する領域線となっている。すなわち本実施形態では、暗視野画像２００内において閉領域５７を形成する強調部分５６が、気泡５０と封入剤１６５との境界５５として検出される。そして閉領域５７でない領域が開領域５８として検出される。

例えばプレパラート１８０に塵等が付着している場合、その付着部分で散乱光が発生する可能性がある。そうすると暗視野画像２００において、気泡５０と封入剤１６５との境界５５ではない部分が強調部分５６として写される可能性がある。しかしながら本実施形態では、閉領域５７を形成する強調部分５６が境界５５として検出される。これにより気泡５０と封入剤１６５との境界５５を、容易に検出することができる。

図１５は、プレパラート１８０の暗視野画像２００の別の例を示す平面図である。図１５（Ａ）では、カバーガラス１６１の略全体に封入剤１６５が設けられ、複数の気泡５０が発生している。すなわち強調部分５６により形成された閉領域５７が気泡５０であり、開領域５８が関心領域１９５となる。

図１５（Ｂ）では、カバーガラス１６１内の一部分に対応する領域に封入剤１６５が滴下されている。すなわち図１５（Ｂ）では、強調部分５６により形成された閉領域５７が関心領域１９５である。そして開領域５８が空気層領域５１となる。

なお図１５に示すように、ここでいう閉領域５７は、強調部分５６と、スライドガラス１６０又はカバーガラス１６１の縁部１５９とにより形成されるものも含む。その場合、閉領域５７を形成する強調部分５６と縁部１５９との割合が算出されてもよい。例えば縁部１５９の割合が所定の値より大きい場合、その領域は閉領域５７ではないと判定されてもよい。その他、強調部分５６の形状や強調部分５６の長さ等に基づいて閉領域５７が判定されてもよい。

このように封入剤１６５の設け方により、閉領域５７と開領域５８とのいずれかの領域が関心領域１９５に該当するかが異なってくる。従って本実施形態では、設定された閉領域５７及び開領域５８のそれぞれの合焦位置が測定される（ステップ２０２）。

合焦位置が対物レンズ１１２に近い方（図１２に示す合焦位置Ｆ₁）の領域が関心領域１９５に設定される（ステップ２０３）。合焦位置が対物レンズ１１２から遠い方（図１２に示す合焦位置Ｆ₂）の領域が空気層領域５１に設定される（ステップ２０４）。

このように本実施形態では、閉領域５７及び開領域５８、換言すると閉領域５７の内部領域及び外部領域が比較される。そしてその結果をもとにいずれか一方の領域が関心領域１９５として設定される。これにより関心領域１９５を確実に判定することができる。

プレパラート１８０全体が、拡大画像の視野の大きさで区分される。すなわち拡大画像を撮像するための撮像範囲の大きさで、プレパラート１８０がメッシュ状に区切られる。（ステップ２０５）。これにより拡大画像撮像部１２０により撮像される複数の撮影領域が定められる。

各撮影領域（各メッシュ）について、撮影領域内に関心領域１９５と空気層領域５１とが混在するか否かが判定される（ステップ２０６）。双方の領域１９５及び５１が混在すると判定された場合（ステップ２０６のＹｅｓ）、合焦処理の対象となるフォーカス検出領域から、空気層領域５１が除外される（ステップ２０７）。すなわち関心領域１９５がフォーカス検出領域として設定される。

フォーカス検出領域として設定された関心領域１９５を基準としてオートフォーカス処理が実行される（ステップ２０８）。算出された合焦位置に基づいて、撮影領域の拡大画像が撮像される（ステップ２０９）。

ステップ２０６で、撮影領域内に関心領域１９５と空気層領域５１とが混在しないと判定された場合、ステップ２１０において撮影領域内に関心領域１９５のみが存在するか判定される。撮影領域内に関心領域１９５が存在しないと判定された場合（ステップ２１０のＮｏ）、当該撮影領域の拡大画像は撮像されない（ステップ２１１）。

ステップ２１０で、撮影領域内に関心領域１９５のみが存在すると判定された場合、当該関心領域１９５を基準としてオートフォーカス処理が実行される（ステップ２１２）。算出された合焦位置に基づいて、撮影領域の拡大画像が撮像される（ステップ２１３）。

全ての撮影領域について図１４に示す処理が実行されると、生体サンプル１９０を封入したプレパラート１８０の拡大画像の撮像処理は終了となる。

図１６は、本実施形態に係る統括制御部１５０として機能するコンピュータの構成例を模式的に示すブロック図である。なお統括制御部１５０による処理は、ハードウェアにより実行されてもよいし、ソフトウェアにより実行されもよい。

統括制御部１５０は、ＣＰＵ１０１と、ＲＯＭ１０２と、ＲＡＭ１０３と、ホストバス１０４ａとを備える。また統括制御部１５０は、ブリッジ１０４と、外部バス１０４ｂと、インタフェース１０５と、入力装置１０６と、出力装置１０７と、ストレージ装置（ＨＤＤ）１０８と、ドライブ１０９と、接続ポート１１５と、通信装置１１６とを備える。

ＣＰＵ１０１は、演算処理装置および制御装置として機能し、各種プログラムに従って統括制御部１５０内の動作全般を制御する。ＣＰＵ１０１は、マイクロプロセッサであってもよい。

ＲＯＭ１０２は、ＣＰＵ１０１が使用するプログラムや演算パラメータ等を記憶する。ＲＡＭ１０３は、ＣＰＵ１０１の実行において使用するプログラムや、その実行において適宜変化するパラメータ等を一時記憶する。これらはＣＰＵバスなどから構成されるホストバス１０４ａにより相互に接続されている。

ホストバス１０４ａは、ブリッジ１０４を介して、ＰＣＩ（Peripheral Component Interconnect／Interface）バスなどの外部バス１０４ｂに接続されている。なお、必ずしもホストバス１０４ａ、ブリッジ１０４および外部バス１０４ｂを分離構成する必要はなく、１つのバスにこれらの機能が実装されてもよい。

入力装置１０６は、マウス、キーボード、タッチパネル又はボタン等の、ユーザが情報を入力するための入力手段と、ユーザによる入力に基づいて入力信号を生成しＣＰＵ１０１に出力する入力制御回路等から構成される。

出力装置１０７は、例えば液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）装置やＯＬＥＤ（Organic Light Emitting Diode）装置等の表示装置や、スピーカなどの音声出力装置を含む。

ストレージ装置１０８は、統括制御部１５０の記憶部の一例であり、データ格納用の装置である。ストレージ装置１０８は、例えば記憶媒体、記憶媒体にデータを記録する記録装置、記憶媒体からデータを読み出す読出し装置、又は記憶媒体に記録されたデータを削除する削除装置等を含む。ストレージ装置１０８は、ハードディスクを駆動し、ＣＰＵ１０１が実行するプログラムや各種データを格納する。

ドライブ１０９は、記憶媒体用リーダライタであり、統括制御部１５０に内蔵、あるいは外付けされる。ドライブ１０９は、装着されている磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、または半導体メモリ等のリムーバブル記録媒体に記録されている情報を読み出して、ＲＡＭ１０３に出力する。

接続ポート１１５は、外部機器と接続されるインタフェースであって、例えばＵＳＢ（Universal Serial Bus）等によりデータ伝送可能な外部機器との接続口である。

通信装置１１６は、例えば通信網１０に接続するための通信デバイス等で構成された通信インタフェースである。また通信装置１１６は、無線ＬＡＮ（Local Area Network）対応通信装置であっても、ワイヤレスＵＳＢ対応通信装置であっても、有線による通信を行うワイヤー通信装置であってもよい。

＜第２の実施形態＞
本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡について説明する。これ以降の説明では、第１の実施形態で説明した顕微鏡１００の構成及び作用と同様な部分については、その説明を省略又は簡略化する。

図１７は、本実施形態に係る関心領域の設定処理、及び関心領域の拡大画像の撮像処理を示すフローチャートである。図１８は、図１７に示す関心領域の設定処理について説明するための図である。

本実施形態に係る顕微鏡は、図１７に示すステップ３０２〜ステップ３０４で実行される関心領域の設定処理が、第１の実施形態に係る顕微鏡１００による処理と異なる。図１７に示すステップ３０１、ステップ３０５〜ステップ３１３は、図１４に示すステップ２０１、ステップ２０５〜ステップ２１３と同様である。

図１８に示すように、本実施形態に係る顕微鏡は、ステージの載置面を基準としたプレパラート１８０の高さ（Ｚ軸方向での大きさ）、すなわちプレパラート１８０の厚みを検出する高さ検出部２９０を有する。高さ検出部２９０は、プレパラート１８０のカバーガラスにレーザ光を照射する照射部２９１と、カバーガラス１６１により反射された反射光Ｌ₁を検出する反射光検出センサ２９２とを有する。カバーガラス１６１で反射された反射光Ｌ₁が検出されるまでの時間や照射角度等をもとに、プレパラート１８０の高さが検出される。

ステップ３０１にて検出された閉領域５７及び開領域５８に、高さ検出用のレーザ光がそれぞれ照射される（ステップ３０２）。図１８に示すように、スライドガラス１６０及びカバーガラス１６１の間に空気層領域５１が存在する場合、高さ検出部２９０の反射光検出センサ２９２により、空気層領域５１での反射光Ｌ₂が検出される。当該反射光Ｌ₂が検出された閉領域５７又は開領域５８は、空気層領域５１として設定される（ステップ３０３）。当該反射光が検出されない閉領域５７又は開領域５８は、関心領域１９５として設定される（ステップ３０４）。

このように本実施形態では、空気層領域５１からの反射光Ｌ₂の有無に基づいて、関心領域１９５が設定される。関心領域１９５の設定のための機構して個別にレーザ光照射部等が設けられてもよい。本実施形態では、プレパラート１８０の高さを検出するための高さ検出部２９０により、空気層領域５１における反射光Ｌ₂が検出される。これにより新たな機構を設ける必要がなくコストを抑えることができる。また顕微鏡の小型化に有利である。

＜変形例＞
本発明に係る実施形態は、以上説明した実施形態に限定されず種々変形される。

図１９は、図１４に示す顕微鏡１００の処理の変形例を示すフローチャートである。この変形例では、図１９に示すステップ４０５及び４０６の処理が、図１４に示す処理と異なる。その他のステップは図１４に示すステップと同様である。

ステップ４０５において、自動領域検出処理が実行される。そして拡大画像撮像部１２０により撮像される撮影領域の候補が決定される。例えば明視野照明光が照射されたプレパラート１８０のサムネイル画像に基づいて、生体サンプルの位置する領域が自動的に検出される。そして生体サンプルが位置する領域が、複数の撮像領域に区分けされることで、上記撮影候補領域が決定される。その他、生体サンプルの位置情報の算出方法や、撮影候補領域の決定方法等は適宜設定されてよい。

ステップ４０５で決定された各撮影候補領域内に、関心領域と空気層領域とが混在するか否かが判定される（ステップ４０６）。以下上記したステップ２０７〜ステップ２１３の処理が行われる。

図２０は、図１７に示す第２の実施形態に係る顕微鏡の処理の変形例を示すフローチャートである。この変形例においても、ステップ５０５にて自動領域検出処理が実行され、撮影候補領域が決定される。そしてステップ５０６において、各撮影候補領域内に関心領域と空気層領域とが混在するか否かが判定される。他のステップの処理は、図１７に示す処理と同様である。

図１９及び図２０に示す、自動領域検出処理及び撮影候補領域決定処理により、生体サンプルが現れていない部分の拡大画像の撮像を省くことができる。この結果、拡大画像の取得処理の負荷が軽減され、拡大画像の取得の効率化を図ることができる。

図２１は、図５に示す境界検出用照明系５００の変形例を示す模式的な斜視図である。この境界検出用照明系６００は、図５に示すＬＥＤリング照明１１４の代わりに、４つのＬＥＤバー照明６１４を有する。このＬＥＤバー照明６１４により、プレパラート１８０に暗視野照明光が照射される。このように、１つ又は複数のＬＥＤバー照明６１４が用いられてもよい。また境界検出用照明系として、他の構成が採用されてもよい。

第１の実施形態では、閉領域５７及び開領域５８におけるそれぞれ合焦位置Ｆ₁及びＦ₂に基づいて関心領域１９５が設定された。第２の実施形態では、閉領域５７及び開領域５８にそれぞれ照射された検出光の反射状況により空気層領域５１の有無が判定され、関心領域１９５が判定された。これらの方法に限られず、関心領域１９５の判定方法は適宜設定されてよい。例えば各領域５７又は５８の明視野画像が撮像され、各画像の輝度値の平均値や標準偏差値等に基づいて関心領域１９５が判定されてもよい。あるいは各領域５７又は５８の明視野画像の周波数成分をもとに関心領域１９５が判定されてもよい。

上記では、判定された関心領域１９５を基準として合焦処理が実行され、これにより適正な拡大画像が撮像された。しかしながら判定された関心領域１９５を利用した処理は、合焦処理に限られない。例えば関心領域１９５が診断対象の領域として利用されてもよい。又は、関心領域１９５がプレパラート１８０の厚みを検出するための検出光照射領域として利用されてもよい。その他、本実施形態に係る顕微鏡により、関心領域１９５を利用した処理が適宜実行される。またプレパラート１８０内の空気層領域５１と封入剤１６５との境界５５の情報が、種々の処理のために適宜利用されてもよい。

Ｆ₁，Ｆ₂…合焦位置
Ｌ₁，Ｌ₂…反射光
５０…気泡
５１…空気層領域
５５…境界
５７…閉領域
５８…開領域
１００…顕微鏡
１１０…サムネイル画像撮像部
１５０…統括制御部
１６０…スライドガラス
１６１…カバーガラス
１６５…封入剤
１８０…プレパラート
１９０…生体サンプル
１９５…関心領域
２００…サムネイル画像、暗視野画像
２９０…高さ検出部
２９１…照射部
２９２…反射光検出センサ
５００、６００…境界検出用照明系

Claims (7)

1. スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射する暗視野照明系と、
   前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像する撮像部と、
   前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定する領域判定部と
   を具備する顕微鏡。
2. 請求項１に記載の顕微鏡であって、
   前記領域判定部は、前記暗視野画像において閉領域を形成する領域線を前記境界として検出する顕微鏡。
3. 請求項２に記載の顕微鏡であって、
   前記領域判定部は、前記閉領域の内部領域及び外部領域を比較し、いずれか一方の領域を前記関心領域として判定する顕微鏡。
4. 請求項３に記載の顕微鏡であって、
   前記内部領域における合焦位置と、前記外部領域における合焦位置とをそれぞれ算出する合焦処理部をさらに具備し、
   前記領域判定部は、前記算出された領域ごとの合焦位置を比較し、前記関心領域を判定する
   顕微鏡。
5. 請求項３に記載の顕微鏡であって、
   前記内部領域及び前記外部領域のそれぞれに検出光を照射する照射部と、前記各領域に照射された前記検出光の反射光を検出する反射光検出部とをさらに具備し、
   前記領域判定部は、前記反射光検出部により検出された前記領域ごとの反射光に、前記空気の領域で反射した反射光が含まれるかを判定し、その判定結果をもとに前記関心領域を判定する
   顕微鏡。
6. スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射し、
   前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像し、
   前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定する
   領域判定方法。
7. スライドガラスとカバーガラスとの間に封入剤を用いて試料が封入されたプレパラートに暗視野照明を照射するステップと、
   前記暗視野照明が照射された前記プレパラートの暗視野画像を撮像するステップと、
   前記撮像された暗視野画像をもとに、前記スライドガラス及び前記カバーガラスの間に含まれる空気と前記封入剤との境界を検出し、前記空気の領域以外の領域を前記試料に対する関心領域として判定するステップと
   をコンピュータを搭載した顕微鏡に実行させるプログラム。