JP2012120507A - Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method - Google Patents
Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012120507A JP2012120507A JP2010275733A JP2010275733A JP2012120507A JP 2012120507 A JP2012120507 A JP 2012120507A JP 2010275733 A JP2010275733 A JP 2010275733A JP 2010275733 A JP2010275733 A JP 2010275733A JP 2012120507 A JP2012120507 A JP 2012120507A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hgpr119
- vector
- receptor
- transmembrane receptor
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
本発明は組換え真核細胞、並びに、細胞内シグナル伝達抑制方法に関し、さらに詳細には、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入された組換え真核細胞、並びに、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する細胞内シグナル伝達抑制方法に関する。 The present invention relates to a recombinant eukaryotic cell and a method for suppressing intracellular signal transduction, and more specifically, a recombinant eukaryotic cell into which a gene encoding a transmembrane receptor is introduced, and a transmembrane receptor. The present invention relates to a method for suppressing intracellular signal transduction in which a gene to be introduced is introduced into a eukaryotic cell.
膜貫通受容体の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。ＧＰＣＲは７回膜貫通型受容体であり、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。一方、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。 Among the transmembrane receptors, G protein-coupled receptor (GPCR) is particularly focused on drug development because about half of the low-molecular-weight pharmaceuticals currently on the market are targeted to this receptor. Collecting. GPCR is a 7-transmembrane receptor, and exists with its N-terminus directed outside the cell and its C-terminus directed into the cell. That is, the extracellular domain of GPCR is composed of an N-terminal domain, an extracellular first loop, an extracellular second loop, and an extracellular third loop. On the other hand, the intracellular domain of GPCR is composed of an intracellular first loop, an intracellular second loop, an intracellular third loop, and a C-terminal domain.
医薬品スクリーニングの為のリガンド結合評価や膜貫通受容体の結晶化、又は膜貫通受容体そのものの基礎的研究を行う為には大量の受容体が必要である。そのためには、膜貫通受容体が細胞膜における構造とリガンド結合活性を維持した状態で、大量発現が可能な技術が必要不可欠である。ところが、一般的に、膜貫通受容体を大量発現させることは可溶性タンパク質に比べて困難である。 Large quantities of receptors are required for ligand binding evaluation for drug screening, crystallization of transmembrane receptors, or basic research of transmembrane receptors themselves. For this purpose, a technique capable of mass expression in a state where the transmembrane receptor maintains the structure and ligand binding activity in the cell membrane is indispensable. However, in general, it is more difficult to express a large amount of transmembrane receptors than soluble proteins.
例として、ＧＰＣＲの一種であるヒト由来ＧＰＲ１１９（以下、「ｈＧＰＲ１１９」と称する。）を挙げる。ｈＧＰＲ１１９はグルコース依存性インスリン分泌性受容体であり、糖尿病に関連するターゲットである。ｈＧＰＲ１１９は、主に膵臓及び消化管に発現している。生理活性脂質であるリゾホスファチジルコリン及びオレイルエタノールアミド（ＯＥＡ）をリガンドとして相互に作用し、グルコース依存性インクレチンおよびインスリンの分泌を促進することが知られている。 As an example, human-derived GPR119 (hereinafter referred to as “hGPR119”), which is a kind of GPCR, is mentioned. hGPR119 is a glucose-dependent insulinotropic receptor and a target related to diabetes. hGPR119 is mainly expressed in pancreas and gastrointestinal tract. It is known that bioactive lipids lysophosphatidylcholine and oleylethanolamide (OEA) interact with each other as a ligand to promote secretion of glucose-dependent incretin and insulin.
ｈＧＰＲ１１９のｃＤＮＡが導入された組換え細胞は、例えばMultispan社から供給されており、市場から入手可能である。この細胞は、発現量指標となるＦＬＡＧタグをｈＧＰＲ１１９のＮ末端に挿入して発現させた細胞である。この細胞は、受容体そのもののリガンド結合活性はあるものの、抗ＦＬＡＧ抗体の染色では検出できない程度の発現量であるとされている。そこで、ｈＧＰＲ１１９の発現量を増加させる技術が求められている。 Recombinant cells into which hGPR119 cDNA has been introduced are supplied by, for example, Multispan and are available from the market. This cell is a cell in which a FLAG tag serving as an expression level index is inserted into the N-terminus of hGPR119 for expression. Although this cell has the ligand binding activity of the receptor itself, it is said that the expression level is such that it cannot be detected by staining with anti-FLAG antibody. Therefore, a technique for increasing the expression level of hGPR119 is required.
ｈＧＰＲ１１９の発現量を増加させる方法に関し、Flp-In T-Rex ベクターsystem（インビトロジェン社）を用いた方法が知られている（非特許文献１）。そして、このベクターを用いて発現させた細胞に対してテトラサイクリンを添加すると、ｍＲＮＡ量を増加させることが報告されている。しかし、ｈＧＰＲ１１９発現量の増加については明記されておらず、実際のｈＧＰＲ１１９発現量の増加は定かでない。また、発現を行う宿主細胞にとって、ターゲットタンパク質が毒性または細胞の増殖阻害性を示す場合、ｍＲＮＡ量を増加させることで発現量を増加させることは、発現量増加の目的に対しては逆効果である。なぜなら、細胞に対しての毒性または増殖阻害性を示すタンパク質をより増やすことは、細胞へのダメージをより増やすことになるからである。根本的な解決には膜貫通受容体の性質に基づいて抜本的な改善手法を発明することが必要である。 Regarding a method for increasing the expression level of hGPR119, a method using Flp-In T-Rex vector system (Invitrogen) is known (Non-patent Document 1). And it has been reported that when tetracycline is added to cells expressed using this vector, the amount of mRNA is increased. However, the increase in hGPR119 expression level is not specified, and the actual increase in hGPR119 expression level is not clear. In addition, when the target protein shows toxicity or cell growth inhibitory activity for the host cell that expresses, increasing the amount of mRNA by increasing the amount of mRNA is counterproductive for the purpose of increasing the amount of expression. is there. This is because increasing the number of proteins that exhibit toxicity or growth inhibitory properties to cells increases the damage to the cells. The fundamental solution involves inventing a radical improvement technique based on the nature of the transmembrane receptor.
非特許文献２によれば、動物細胞でＧＰＣＲの高発現株が取得できないのは、ＧＰＣＲが高発現になることでリガンドがなくてもシグナルが流れるようになり、細胞が正常に増殖しなくなるためと考えられている。 According to Non-Patent Document 2, a high expression strain of GPCR cannot be obtained in animal cells because GPCR becomes highly expressed, so that a signal flows even without a ligand, and the cells do not grow normally. It is believed that.
また非特許文献３によれば、ｈＧＰＲ１１９においては、過剰発現によってＧｓタンパク質の恒常的な活性化が引き起こされていることが示唆されている。このことから、ＧＰＣＲの発現における恒常的な活性化を抑えることが細胞増殖、ひいては大量発現に良い結果をもたらすと考えられる。Ｇタンパク質の活性化を抑える方法としては、Ｇタンパク阻害剤を加える方法が挙げられる。しかし、この方法は目的受容体以外のシグナル伝達も阻害するため、増殖阻害を引き起こすと考えられ、不適である。また目的受容体のアンタゴニストが公知である場合、アンタゴニストを培地に添加することで目的受容体に対して特異的にシグナル伝達を阻害することは可能であるが、非常にコストがかかる。また、アンタゴニストが公知でない場合は、この方法は適用できない。 Non-patent document 3 suggests that overexpression of hGPR119 causes constitutive activation of Gs protein. From this, it is considered that suppressing the constitutive activation in the expression of GPCR has a good result for cell proliferation and, consequently, mass expression. Examples of a method for suppressing the activation of G protein include a method of adding a G protein inhibitor. However, since this method also inhibits signal transduction other than the target receptor, it is considered to cause growth inhibition and is not suitable. In addition, when an antagonist of the target receptor is known, it is possible to inhibit signal transmission specifically for the target receptor by adding the antagonist to the medium, but it is very expensive. Moreover, this method is not applicable when the antagonist is not known.
ｈＧＰＲ１１９以外のＧＰＣＲにも、嗅覚受容体など、発現が非常に難しいものが数多くあると考えられ、それらの発現をうまくハンドリングできるようにすることで、医薬品開発や新たな創薬ターゲットの探索を効率的に進められるようになる。 There are many GPCRs other than hGPR119, such as olfactory receptors, which are very difficult to express. By enabling them to be handled well, drug development and discovery of new drug discovery targets can be performed efficiently. Will be advanced.
このように、細胞膜における構造とリガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることには、多くの困難性がある。そこで本発明は、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させる技術を提供することを目的とする。 Thus, there are many difficulties in expressing a large amount of transmembrane receptors while maintaining the structure and ligand binding activity in the cell membrane. Therefore, an object of the present invention is to provide a technique for expressing a large amount of transmembrane receptors while maintaining ligand binding activity.
本発明者らは上記課題を解決するための方策を種々検討した。その結果、膜貫通受容体のＣ末端に所定以上の分子量を有するタンパク質を付加することにより、当該膜貫通受容体の発現量が増大させることができるとともに、その発現量、リガンド結合活性、及び細胞の状態（例えば形態）を長期間にわたって維持できることを見出した。さらに、これらの効果の要因として、細胞内シグナル伝達の抑制が関係していることを見出し、本発明を完成した。上記した課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。 The present inventors have studied various measures for solving the above problems. As a result, by adding a protein having a molecular weight of a predetermined value or more to the C-terminus of the transmembrane receptor, the expression level of the transmembrane receptor can be increased, and the expression level, ligand binding activity, and cell It has been found that the state (for example, form) can be maintained over a long period of time. Furthermore, the present inventors have found that suppression of intracellular signal transduction is involved as a factor of these effects and completed the present invention. The present invention provided to solve the above-described problems is as follows.
請求項１に記載の発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能であることを特徴とする組換え真核細胞である。 The invention according to claim 1 is a recombinant eukaryotic cell into which a gene encoding a transmembrane receptor is introduced, and the transmembrane receptor can be expressed on a cell membrane, wherein the transmembrane receptor is a cell membrane. A protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminus, and the transmembrane receptor can be expressed in a state of retaining ligand binding activity. Recombinant eukaryotic cells.
本発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞に係るものである。本発明の組換え真核細胞においては、当該膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、当該膜貫通受容体のＣ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（以下、「付加タンパク質」と称することがある。）が連結されている。この構成により、膜貫通受容体のリガンド結合活性を維持しつつ、膜貫通受容体の発現量を増加させることができる。本発明の組換え真核細胞によれば、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることができる。 The present invention relates to a recombinant eukaryotic cell into which a gene encoding a transmembrane receptor has been introduced and the transmembrane receptor can be expressed on the cell membrane. In the recombinant eukaryotic cell of the present invention, the transmembrane receptor has a C-terminal inside the cell membrane, and a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more (hereinafter referred to as the C-terminal of the transmembrane receptor). , Sometimes referred to as “addition protein”). With this configuration, it is possible to increase the expression level of the transmembrane receptor while maintaining the ligand binding activity of the transmembrane receptor. According to the recombinant eukaryotic cell of the present invention, a transmembrane receptor can be expressed in a large amount while maintaining the ligand binding activity.
膜貫通受容体のＣ末端に連結される分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）は、１つのタンパク質又はポリペプチドで構成されていてもよいし、複数のタンパク質又はポリペプチドからなる集合体であってもよい。また、連結の様式は、共有結合（ペプチド結合等）と非共有結合のいずれでもよい。 A protein or polypeptide (addition protein) having a molecular weight of 30,000 or more linked to the C-terminus of the transmembrane receptor may be composed of one protein or polypeptide, or an assembly composed of a plurality of proteins or polypeptides. It may be a body. The mode of linkage may be either a covalent bond (such as a peptide bond) or a non-covalent bond.
請求項２に記載の発明は、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組換え真核細胞である。 The invention according to claim 2 is characterized in that a gene encoding a transmembrane receptor in which a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminus is introduced. The described recombinant eukaryotic cell.
本発明の組換え真核細胞は、「Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子」、換言すれば「膜貫通受容体のＣ末端に付加タンパク質が連結されてなる融合タンパク質又は融合ポリペプチドをコードする遺伝子」が導入されている。すなわち本発明の組換え真核細胞では、膜貫通受容体と付加タンパク質とがペプチド結合を介して連結され、１つの融合タンパク質又は融合ポリペプチドを構成している。かかる構成により、付加タンパク質の連結が確実となり、膜貫通受容体の大量発現がより確実となる。 The recombinant eukaryotic cell of the present invention is “a gene encoding a transmembrane receptor having a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more linked to the C-terminus”, in other words, “added to the C-terminus of the transmembrane receptor”. A gene encoding a fusion protein or fusion polypeptide in which proteins are linked has been introduced. That is, in the recombinant eukaryotic cell of the present invention, the transmembrane receptor and the additional protein are linked via a peptide bond to constitute one fusion protein or fusion polypeptide. Such a configuration ensures that the additional protein is linked and more reliably expresses a large amount of transmembrane receptors.
請求項３に記載の発明は、前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換え真核細胞である。 The invention according to claim 3 is the recombinant eukaryotic cell according to claim 1 or 2, wherein the protein or polypeptide has a molecular weight of 60,000 or more and 180,000 or less.
かかる構成により、膜貫通受容体の発現量が特に大きいものとなる。 With this configuration, the expression level of the transmembrane receptor is particularly large.
請求項１〜３のいずれかに記載の組換え真核細胞において、前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることが好ましい（請求項４）。 In the recombinant eukaryotic cell according to any one of claims 1 to 3, the transmembrane receptor is preferably a seven-transmembrane receptor (claim 4).
請求項４に記載の組換え真核細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体であることが好ましい（請求項５）。 The recombinant eukaryotic cell according to claim 4 is preferably a G protein-coupled receptor (claim 5).
請求項５に記載の組換え真核細胞において、前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであってもよい（請求項６）。 In the recombinant eukaryotic cell according to claim 5, the G protein-coupled receptor may be GPR119 or angiotensin II receptor type I (claim 6).
請求項７に記載の発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制することを特徴とする細胞内シグナル伝達抑制方法である。 The invention according to claim 7 includes a step of introducing a gene encoding a transmembrane receptor into a eukaryotic cell, wherein the transmembrane receptor has a C-terminal inside a cell membrane, and the C A method for suppressing intracellular signal transduction, comprising inhibiting a signal transduction while maintaining a ligand binding activity of the transmembrane receptor by linking a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more to a terminal. .
本発明は細胞内シグナル伝達抑制方法に係るものである。本発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、当該膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものである。そして、当該膜貫通受容体のＣ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）を連結する。これにより、膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制する。本発明を真核細胞に適用することにより、細胞内シグナル伝達抑制に起因する膜貫通受容体の大量発現を実現することができる。 The present invention relates to a method for suppressing intracellular signal transduction. The present invention includes a step of introducing a gene encoding a transmembrane receptor into a eukaryotic cell, and the transmembrane receptor has a C-terminal inside the cell membrane. Then, a protein or polypeptide (addition protein) having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminus of the transmembrane receptor. This suppresses intracellular signal transduction while retaining the ligand binding activity of the transmembrane receptor. By applying the present invention to eukaryotic cells, a large amount of transmembrane receptors resulting from suppression of intracellular signal transduction can be realized.
本発明においても、膜貫通受容体のＣ末端に連結される分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）は、１つのタンパク質又はポリペプチドで構成されていてもよいし、複数のタンパク質又はポリペプチドからなる集合体であってもよい。また、連結の様式は、共有結合（ペプチド結合等）と非共有結合のいずれでもよい。 Also in the present invention, the protein or polypeptide (addition protein) having a molecular weight of 30,000 or more linked to the C-terminus of the transmembrane receptor may be composed of one protein or polypeptide, The aggregate which consists of polypeptide may be sufficient. The mode of linkage may be either a covalent bond (such as a peptide bond) or a non-covalent bond.
請求項７に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子を細胞に導入することが好ましい（請求項８）。 The method for suppressing intracellular signal transduction according to claim 7, wherein a gene encoding a transmembrane receptor in which a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminus is preferably introduced into a cell (claim). 8).
請求項７又は８に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることが好ましい（請求項９）。 In the method for suppressing intracellular signal transduction according to claim 7 or 8, the molecular weight of the protein or polypeptide is preferably 60,000 or more and 180,000 or less (claim 9).
請求項７〜９のいずれかに記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることが好ましい（請求項１０）。 The method for suppressing intracellular signal transduction according to any one of claims 7 to 9, wherein the transmembrane receptor is preferably a seven-transmembrane receptor (claim 10).
請求項１０に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記７回膜貫通型受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であることが好ましい（請求項１１）。 The method for suppressing intracellular signal transduction according to claim 10, wherein the seven-transmembrane receptor is a G protein-coupled receptor (claim 11).
請求項１１に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであってもよい（請求項１２）。 12. The method for suppressing intracellular signal transduction according to claim 11, wherein the G protein-coupled receptor may be GPR119 or angiotensin II receptor type I (claim 12).
本発明の組換え真核細胞によれば、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることができる。また、長期継代培養が可能である。その結果、膜画分の大量調製及び精製が容易になり、膜貫通受容体の結晶化プロセスにおいて膜画分調製のコストが低減できる。また、医薬品スクリーニングのための膜貫通受容体のリガンド結合評価において、低コスト化が可能となる。 According to the recombinant eukaryotic cell of the present invention, a transmembrane receptor can be expressed in a large amount while maintaining the ligand binding activity. In addition, long-term subculture is possible. As a result, large-scale preparation and purification of the membrane fraction are facilitated, and the cost of membrane fraction preparation can be reduced in the transmembrane receptor crystallization process. In addition, the cost can be reduced in the ligand binding evaluation of a transmembrane receptor for drug screening.
本発明の細胞内シグナル伝達抑制方法についても同様であり、細胞内シグナル伝達抑制に起因する膜貫通受容体の大量発現と長期継代培養を実現することができる。 The same applies to the method for suppressing intracellular signal transduction according to the present invention, and it is possible to realize large-scale expression of transmembrane receptors and long-term subculture due to suppression of intracellular signal transduction.
本発明の１つの様相は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能であることを特徴とする組換え真核細胞である。 One aspect of the present invention is a recombinant eukaryotic cell into which a gene encoding a transmembrane receptor has been introduced and is capable of expressing the transmembrane receptor on a cell membrane, wherein the transmembrane receptor is a cell membrane receptor. A C-terminal is present on the inside, and a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminal, and the transmembrane receptor can be expressed in a state of retaining ligand binding activity. Recombinant eukaryotic cells.
膜貫通受容体としては、Ｃ末端が細胞膜の内側に存在するものであれば特に限定はない。貫通の回数は、１回でもよいし、３回以上でもよい。またシグナル伝達機構についても限定はなく、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル型受容体、酵素連結型受容体のいずれでもよい。 The transmembrane receptor is not particularly limited as long as the C-terminal is present inside the cell membrane. The number of penetrations may be one time or three or more times. There is no limitation on the signal transduction mechanism, and for example, any of a G protein coupled receptor (GPCR), an ion channel receptor, and an enzyme-linked receptor may be used.
好ましい実施形態では、膜貫通受容体が７回膜貫通型受容体であり、より好ましくはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＣＲの例としては、ＧＰＲ１１９、アンジオテンシンＩＩ受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、嗅覚受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、セロトニン受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、ガストリン受容体、オピオイド受容体、ロドプシン、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、オーファン受容体、などが挙げられる。 In a preferred embodiment, the transmembrane receptor is a seven-transmembrane receptor, more preferably a G protein coupled receptor (GPCR). Examples of GPCRs include GPR119, angiotensin II receptor, CC chemokine receptor, CXC chemokine receptor, C chemokine receptor, CX3C chemokine receptor, olfactory receptor, muscarinic acetylcholine receptor, adenosine receptor, adrenergic receptor GABA receptor, serotonin receptor, angiotensin receptor, cannabinoid receptor, cholecystokinin receptor, dopamine receptor, P2Y receptor, glucagon receptor, histamine receptor, gastrin receptor, opioid receptor, rhodopsin, secretin Receptor, somatostatin receptor, orphan receptor, and the like.
本発明の組換え真核細胞では、導入された遺伝子により発現される膜貫通受容体のＣ末端に、分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）が連結されている。付加タンパク質は、分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドで、且つリガンド結合活性を保持した状態で当該膜貫通受容体を発現可能とするものであれば特に限定はない。付加タンパク質は、細胞内で可溶性の状態で発現されるものであることが好ましい。 In the recombinant eukaryotic cell of the present invention, a protein or polypeptide (addition protein) having a molecular weight of 30,000 or more is linked to the C-terminus of the transmembrane receptor expressed by the introduced gene. The additional protein is not particularly limited as long as it is a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more and can express the transmembrane receptor in a state in which the ligand binding activity is retained. The additional protein is preferably expressed in a soluble state in the cell.
好ましい実施形態では、付加タンパク質の分子量が６万以上１８万以下である。この範囲であれば、膜貫通受容体の発現量がより大きくなる。例えば、分子シャペロンの一種であるシャペロニン（chaperonin）を構成するサブユニット（「ＨＳＰ６０」ともいう）は、分子量が約６万であり、付加タンパク質として好適に採用される。複数のシャペロニンサブユニットを直列に連結させたシャペロニンサブユニットの連結体（特許第４０３８５５５号公報に記載）も、付加タンパク質として好適に採用される。シャペロニンの例として、大腸菌由来シャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、宿主となる動物細胞との関係においてマイナーコドンを含んでおらず、特に好適に採用される。ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号４に示す。 In a preferred embodiment, the molecular weight of the additional protein is 60,000 or more and 180,000 or less. If it is this range, the expression level of a transmembrane receptor will become larger. For example, a subunit (also referred to as “HSP60”) constituting chaperonin, which is a kind of molecular chaperone, has a molecular weight of about 60,000, and is suitably employed as an additional protein. A linked body of chaperonin subunits (described in Japanese Patent No. 40385555) in which a plurality of chaperonin subunits are connected in series is also preferably used as the additional protein. An example of chaperonin is GroEL, which is E. coli-derived chaperonin. The GroEL subunit gene does not contain a minor codon in relation to the host animal cell, and is particularly preferably employed. The base sequence of the GroEL subunit gene is shown in SEQ ID NO: 4.
なお、細胞内における局在の標識マーカーとして、膜貫通受容体のＣ末端に緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；分子量２万７千）を連結させる技術が公知である。しかし、後述の実施例で示されるように、本発明における付加タンパク質としてＥＧＦＰを用いても、膜貫通受容体の発現量を増大させることはできない。本発明における付加タンパク質は、分子量が３万以上であることが必要である。 As a labeling marker for localization in a cell, a technique for linking green fluorescent protein (EGFP; molecular weight 27,000) to the C-terminus of a transmembrane receptor is known. However, as shown in Examples described later, even when EGFP is used as the additional protein in the present invention, the expression level of the transmembrane receptor cannot be increased. The additional protein in the present invention needs to have a molecular weight of 30,000 or more.
膜貫通型受容体と付加タンパク質との連結の態様としては、これらがペプチド結合を介して連結された態様が代表的である。この場合は、膜貫通型受容体のＣ末端に付加タンパク質が連結されてなる融合タンパク質又は融合ポリペプチドを、細胞内で発現させればよい。具体的には、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現可能な状態で導入すればよい。 A typical example of the mode of linking the transmembrane receptor and the additional protein is a mode in which these are linked via a peptide bond. In this case, a fusion protein or fusion polypeptide in which an additional protein is linked to the C-terminus of the transmembrane receptor may be expressed in the cell. Specifically, the gene encoding the fusion protein may be introduced in a state where it can be expressed.
ペプチド結合以外の連結様式を利用することもできる。一例を挙げると、ＦＬＡＧタグのようなタグ配列を膜貫通型受容体のＣ末端に連結する。そして、このタグ配列を認識する抗体を結合させる。これにより、タグ配列と抗体とからなる集合体が付加タンパク質として機能できるようになる。この場合には、膜貫通受容体とタグ配列との融合タンパク質と、タグ配列を認識する抗体を、別々のベクター上で共発現させればよい。抗体としては、例えば、Ｆｖ型抗体等の抗体断片を用いることができる。付加タンパク質の分子量は、タグ配列の数およびタグ配列に結合する抗体の数を調整することにより、自由に設定することができる。タグ配列の例としては、ＦＬＡＧタグの他、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｈａｌｏタグ、ＧＦＰなどが挙げられる。 Linkage patterns other than peptide bonds can also be used. As an example, a tag sequence such as a FLAG tag is linked to the C-terminus of a transmembrane receptor. Then, an antibody that recognizes the tag sequence is bound. Thereby, the assembly consisting of the tag sequence and the antibody can function as an additional protein. In this case, a fusion protein of a transmembrane receptor and a tag sequence and an antibody that recognizes the tag sequence may be co-expressed on separate vectors. As the antibody, for example, an antibody fragment such as an Fv type antibody can be used. The molecular weight of the additional protein can be freely set by adjusting the number of tag sequences and the number of antibodies that bind to the tag sequences. Examples of tag sequences include FLAG tags, c-myc tags, Halo tags, GFP, and the like.
膜貫通受容体のＮ末端には、シグナル配列を付与してもよい。これにより、細胞内で発現した膜貫通受容体の細胞膜への移行を容易にすることができる。当該シグナル配列としては、小胞体輸送に関連するものであれば特に限定はない。例として、ＳｉｇｎａｌＩＰのソフト解析から推定されるマウスエンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列（以下、「ｍＡｓｓ」と称する。）が挙げられる。 A signal sequence may be added to the N-terminus of the transmembrane receptor. Thereby, the transmembrane receptor expressed in the cell can be easily transferred to the cell membrane. The signal sequence is not particularly limited as long as it is related to endoplasmic reticulum transport. An example is a mouse endothelin receptor type A signal sequence (hereinafter referred to as “mAss”) deduced from the soft analysis of SignalIP.
本発明の組換え真核細胞の宿主となる細胞としては、動物細胞が好ましく用いられる。動物細胞の例としては、ＣＯＳ−７細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、ラットＧＨ３細胞，ラットＭｔＴ細胞，マウスＭＩＮ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｌ９２９細胞などが挙げられる。動物細胞以外の例としては、酵母が挙げられる。 Animal cells are preferably used as cells that serve as hosts for the recombinant eukaryotic cells of the present invention. Examples of animal cells include COS-7 cells, mouse AtT-20 cells, rat GH3 cells, rat MtT cells, mouse MIN6 cells, Vero cells, CHO cells, HeLa cells, L cells, BHK cells, BALB3T3 cells, HEK293 cells. HEK293T cells, L929 cells and the like. Examples other than animal cells include yeast.
膜貫通受容体をコードする遺伝子の細胞への導入は、発現ベクターに組み込まれた状態で行うことが好ましい。例えば、膜貫通受容体（例えばｈＧＰＲ１１９）の遺伝子の３’末端に付加タンパク質（例えばＧｒｏＥＬサブユニット）の遺伝子を連結し、融合遺伝子を作製する。この融合遺伝子を発現ベクターに組み込んでプロモーターの制御下に置き、宿主細胞に導入する。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳなどが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。 It is preferable to introduce a gene encoding a transmembrane receptor into a cell in a state of being incorporated into an expression vector. For example, a gene for an additional protein (for example, GroEL subunit) is linked to the 3 'end of a gene for a transmembrane receptor (for example, hGPR119) to prepare a fusion gene. This fusion gene is incorporated into an expression vector, placed under the control of a promoter, and introduced into a host cell. Examples of expression vectors include pCI, pSI, pAdVantage, pTriEX, pKA1, pCDM8, pS and the like. Examples of the promoter on the expression vector include CMV promoter, AML promoter, SV40 promoter, SRα promoter, EF-1α promoter, and the like. Furthermore, an enhancer that enhances promoter activity may be included in the expression vector.
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、公知の方法を採用することができる。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、遺伝子銃を用いた方法が挙げられる。 A method for introducing the vector into the host cell is not particularly limited, and a known method can be employed. Examples include calcium phosphate transfection method, electroporation method, lipofection method, and method using gene gun.
本発明の他の様相は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制することを特徴とする細胞内シグナル伝達抑制方法である。本発明の細胞内シグナル伝達抑制方法においても、上記した実施形態と同様の実施形態が可能である。 Another aspect of the present invention includes a step of introducing a gene encoding a transmembrane receptor into a eukaryotic cell, wherein the transmembrane receptor has a C-terminal inside a cell membrane, It is a method for suppressing intracellular signal transduction, wherein the signal transduction is inhibited while maintaining the ligand binding activity of the transmembrane receptor by linking a protein or polypeptide having a molecular weight of 30,000 or more. Also in the intracellular signal transduction suppression method of the present invention, an embodiment similar to the above-described embodiment is possible.
ＧＰＣＲは、他のＧＰＣＲとヘテロダイマーを形成したり、また他のタンパク質と会合することが報告されている（Nakahataら，YAKUGAKU ZASSHI, 127, 3-14(2007)）。ＧＰＣＲは種類によっては、発現や活性の調節に必要な別の因子が関与していることがある。本発明によって膜貫通受容体の大量精製が可能となることで実験が容易となり、これまで未知であったＧＰＣＲの活性調節に関与する因子を発見できる可能性がある。未知の因子を見出すことは、ＧＰＣＲの発現制御をより容易に行うことにつながる。 GPCRs have been reported to form heterodimers with other GPCRs and to associate with other proteins (Nakahata et al., YAKUGAKU ZASSHI, 127, 3-14 (2007)). Depending on the type of GPCR, other factors necessary for regulation of expression and activity may be involved. The present invention makes it possible to conduct large-scale purification of transmembrane receptors, thereby facilitating experiments, and the possibility of discovering factors involved in GPCR activity regulation that have been unknown so far. Finding unknown factors leads to easier control of GPCR expression.
また、ＧｒｏＥＬは天然状態では７量体を１つのリングとした構造を形成する。よって、Ｃ末端に６個以下のＧｒｏＥＬサブユニットを連結させたＧＰＣＲを精製し、ＧｒｏＥＬサブユニット単体を後から添加することで７量体を形成させ、ＧｒｏＥＬの構造体が形成するリング構造内にＧＰＣＲを閉じ込めた複合体を形成させることが可能である。ＧｒｏＥＬは２次元結晶が作製可能であることから、この複合体を用いた結晶構造解析も可能である。 In addition, GroEL forms a structure in which the heptamer is one ring in the natural state. Therefore, a GPCR in which 6 or less GroEL subunits are linked to the C-terminal is purified, and a 7-mer is formed by adding a GroEL subunit alone later, and the GroEL structure forms a ring structure. It is possible to form a complex confining the GPCR. Since GroEL can produce a two-dimensional crystal, crystal structure analysis using this complex is also possible.
膜貫通受容体のＣ末端と付加タンパク質との連結部分に、プロテアーゼによる切断サイトを導入しておくと、膜貫通受容体を大量発現させた後にプロテアーゼを添加することにより、膜貫通受容体のみを大量精製することができる。当該プロテアーゼと切断サイトの例としては、トロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼ等とそれらの切断サイトが挙げられる。 If a cleavage site by a protease is introduced at the junction between the C-terminus of the transmembrane receptor and the additional protein, by adding the protease after mass-expressing the transmembrane receptor, only the transmembrane receptor can be obtained. It can be purified in large quantities. Examples of the protease and cleavage site include thrombin, enterokinase, and limited-degradation proteases such as activated blood coagulation factor 10 and their cleavage sites.
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（１）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にストップコドン（ＴＡＡ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ａに含まれるＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
(1) Preparation of DNA fragment containing GroEL subunit gene Genomic DNA was extracted and purified from Escherichia coli HMS174 (DE3) strain (Novagen). PCR was performed using this genomic DNA as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 as primer pairs to amplify a DNA fragment containing the GroEL subunit gene (SEQ ID NO: 4) (hereinafter referred to as “DNA fragment A”). "). In DNA fragment A, a SalI site at the 5 ′ end and a sequence encoding a stop codon (TAA) at the 3 ′ end and a NotI site were introduced into the DNA fragment A. That is, the GroEL subunit gene contained in DNA fragment A has a stop codon.
一方、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び３示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｂに含まれるＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。 On the other hand, PCR was performed using the genomic DNA as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 3 as primer pairs to amplify a DNA fragment containing the GroEL subunit gene (SEQ ID NO: 4) (hereinafter “DNA”). Referred to as Fragment B)). In DNA fragment B, a SalI site was introduced at the 5 ′ end and an XhoI site was introduced at the 3 ′ end from the primer. That is, the GroEL subunit gene contained in the DNA fragment B has no stop codon.
（２）ヒト由来ＧＰＲ１１９（ｈＧＰＲ１１９）遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
ＮＣＢＩデータベースのヌクレオチド番号NM_178471の情報に基づいて、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（ＤＮＡ）（配列番号１２）を人工遺伝子合成（GenScript社）にて取得した。この人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（配列番号１２）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にストップコドンをコードする配列及びＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｃに含まれるｈＧＰＲ１１９遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
(2) Preparation of DNA fragment containing human-derived GPR119 (hGPR119) gene Based on the information of nucleotide number NM_178471 in the NCBI database, hGPR119 gene (DNA) (SEQ ID NO: 12) was obtained by artificial gene synthesis (GenScript). . Using this artificially synthesized DNA as a template, PCR was performed using oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 as primer pairs, and a DNA fragment containing the hGPR119 gene (SEQ ID NO: 12) was amplified (hereinafter referred to as “DNA fragment C” "). In DNA fragment C, an NheI site at the 5 ′ end and a sequence encoding a stop codon at the 3 ′ end and an XhoI site were introduced from the primer. That is, the hGPR119 gene contained in the DNA fragment C has a stop codon.
一方、前記人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び７示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（配列番号１２）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｄ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｄには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｄに含まれるｈＧＰＲ１１９遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。 On the other hand, PCR was performed using the artificially synthesized DNA as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 7 as primer pairs to amplify a DNA fragment containing the hGPR119 gene (SEQ ID NO: 12) (hereinafter referred to as “DNA fragment”). D ”). In DNA fragment D, an NheI site was introduced at the 5 ′ end and an XhoI site was introduced at the 3 ′ end from the primer. That is, the hGPR119 gene contained in the DNA fragment D has no stop codon.
（３）ヒト由来アンジオテンシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
NCBIのACCESSION番号NM_000685の情報に基づいて、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（ｈＡＧＴＲ１）遺伝子（配列番号１６）を人工遺伝子合成（GenScript社）にて取得した。人工合成したｈＡＧＴＲ１遺伝子を鋳型とし、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＡＧＴＲ１遺伝子（配列番号１６）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｅ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｅには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にストップコドンをコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｅに含まれるｈＡＧＴＲ１遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
(3) Preparation of DNA fragment containing human-derived angiotensin receptor gene
Based on the information of NCBI ACCESSION No. NM_000685, the human angiotensin II receptor type I (hAGTR1) gene (SEQ ID No. 16) was obtained by artificial gene synthesis (GenScript). PCR was performed using the artificially synthesized hAGTR1 gene as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 14 as primer pairs to amplify a DNA fragment containing the hAGTR1 gene (SEQ ID NO: 16) (hereinafter referred to as “DNA fragment”). E "). A DNA fragment E was introduced with a NheI site at the 5 ′ end and a sequence encoding a stop codon at the 3 ′ end and a NotI site derived from the primer. That is, the hAGTR1 gene contained in the DNA fragment E has a stop codon.
一方、前記人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１５示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＡＧＴＲ１遺伝子（配列番号１６）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｆ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｆには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にＳａｌＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｆに含まれるｈＡＧＴＲ１遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。 On the other hand, PCR was performed using the artificially synthesized DNA as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 15 as primer pairs to amplify a DNA fragment containing the hAGTR1 gene (SEQ ID NO: 16) (hereinafter referred to as “DNA fragment”). F ”). In DNA fragment F, an NheI site was introduced at the 5 ′ end and a SalI site was introduced at the 3 ′ end from the primer. That is, the hAGTR1 gene contained in the DNA fragment F has no stop codon.
（４）ＥＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（GenBank Accession#U55762、BD Biosciences, Clontech、CA、USA）を鋳型とし、配列番号１７及び１８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１９）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｇ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｇには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｇに含まれるＥＧＦＰ遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。
(4) Preparation of DNA fragment containing EGFP gene Using pEGFP-N1 vector (GenBank Accession # U55762, BD Biosciences, Clontech, CA, USA) as a template, oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 and 18 as primer pairs PCR was performed to amplify a DNA fragment containing the EGFP gene (SEQ ID NO: 19) (hereinafter referred to as “DNA fragment G”). In DNA fragment G, a SalI site was introduced at the 5 ′ end and an XhoI site was introduced at the 3 ′ end from the primer. That is, the EGFP gene contained in the DNA fragment G has no stop codon.
（５）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（一過性発現用）
哺乳動物細胞の一過性発現用ベクターであるpCI mammalian Expression Vector（プロメガ社）を、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ（タカラバイオ社）を用いて制限酵素処理を行った。また、上記（１）で作製したＤＮＡ断片Ａ（ストップコドンを有するＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）も同様に制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理を行った。これらの断片をライゲーションキット（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、pCI mammalian Expression VectorにＧｒｏＥＬサブユニット（分子量６万）遺伝子が挿入されたベクター（以下、「pCGベクター」と称する。）が作製された。
(5) Production of various vectors containing hGPR119 gene (for transient expression)
PCI mammalian Expression Vector (Promega), which is a transient expression vector for mammalian cells, was subjected to restriction enzyme treatment using restriction enzymes SalI and NotI (Takara Bio). Similarly, the DNA fragment A (fragment containing GroEL gene having a stop codon) prepared in the above (1) was subjected to restriction enzyme treatment using restriction enzymes SalI and NotI. These fragments were ligated using a ligation kit (Takara Bio). As a result, a vector in which the GroEL subunit (molecular weight 60,000) gene was inserted into the pCI mammalian Expression Vector (hereinafter referred to as “pCG vector”) was prepared.
pCGベクターを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社）で処理を用いて制限酵素処理を行った。同様に、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｄ（ストップコドンを有しないｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む断片）についても制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで制限酵素処理を行った。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。これにより、pCGベクターにｈＧＰＲ１１９が挿入されたベクター（以下、「pCG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。 The pCG vector was treated with restriction enzymes using treatment with restriction enzymes NheI and SalI (Takara Bio). Similarly, the DNA fragment D prepared in (2) above (a fragment containing the hGPR119 gene having no stop codon) was also treated with restriction enzymes NheI and SalI. These fragments were ligated using a ligation kit. As a result, a vector in which hGPR119 was inserted into the pCG vector (hereinafter referred to as “pCG-hGPR119 vector”) was prepared.
PCG-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理したサイトに、配列番号１０及び配列番号１１で示されるプライマー断片の等モル混合溶液を１００℃で３分インキュベートさせて室温に戻すことでアニールさせた断片（以下、「mAssFLAG断片」と称する。）をライゲーション反応させた。これにより、pCG-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にマウス由来エンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列（ｍＡｓｓ）とＦＬＡＧタグを付加したベクター（以下、「pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。 The PCG-hGPR119 vector was annealed at a site treated with the restriction enzyme NheI by incubating an equimolar mixed solution of the primer fragments represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 at 100 ° C. for 3 minutes and returning to room temperature. The fragment (hereinafter referred to as “mAssFLAG fragment”) was ligated. As a result, a vector in which the signal sequence (mAss) of mouse-derived endothelin receptor type A and the FLAG tag are added to the N-terminus of hGPR119 in the pCG-hGPR119 vector (hereinafter referred to as “pCG-mAssFLAG-hGPR119 vector”) is prepared. It was done.
また、同様に、PCG-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理したサイトに、配列番号８及び配列番号９で示されるプライマー断片の等モル混合溶液を１００℃で３分インキュベートさせて室温に戻すことでアニールさせた断片（以下、「FLAG断片」と称する。）をライゲーション反応させた。これにより、pCG-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたベクター（以下、「pCG-FLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。 Similarly, an equimolar mixed solution of the primer fragments represented by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 is incubated at 100 ° C. for 3 minutes at a site obtained by treating the PCG-hGPR119 vector with the restriction enzyme NheI and returned to room temperature. The fragments annealed in this manner (hereinafter referred to as “FLAG fragments”) were subjected to a ligation reaction. As a result, a vector in which a FLAG tag was added to the N-terminus of hGPR119 in the pCG-hGPR119 vector (hereinafter referred to as “pCG-FLAG-hGPR119 vector”) was prepared.
pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理した。また、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂ（ストップコドンを有しないＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ（タカラバイオ社）で制限酵素処理した。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。ＳａｌＩの制限酵素断片とＸｈｏＩの制限酵素断片はライゲーション可能であり、ＧｒｏＥＬ遺伝子が正方向の連結体としてライゲーションすることが可能である。これにより、pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクターにさらにＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子が１個から６個付加された（ＧｒｏＥＬが２連結から７連結された）ベクター（以下、「pCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG3-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG4-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG5-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG6-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG7-mAssFLAG-hGPR119ベクター」とそれぞれ称する。）が得られた。 The pCG-mAssFLAG-hGPR119 vector was digested with the restriction enzyme SalI. Further, the DNA fragment B (fragment containing GroEL gene having no stop codon) prepared in the above (1) was subjected to restriction enzyme treatment with restriction enzymes SalI and XhoI (Takara Bio Inc.). These fragments were ligated using a ligation kit. The restriction enzyme fragment of SalI and the restriction enzyme fragment of XhoI can be ligated, and the GroEL gene can be ligated as a ligation in the forward direction. As a result, vectors (hereinafter referred to as “pCG2-mAssFLAG-hGPR119 vector”, “pCG3-mAssFLAG-hGPR119 vector”, in which 1 to 6 GroEL subunit genes were further added to the pCG-mAssFLAG-hGPR119 vector (GroEL was linked from 2 to 7). -mAssFLAG-hGPR119 vector "," pCG4-mAssFLAG-hGPR119 vector "," pCG5-mAssFLAG-hGPR119 vector "," pCG6-mAssFLAG-hGPR119 vector ", and" pCG7-mAssFLAG-hGPR119 vector "). It was.
（６）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（安定発現用）
哺乳動物細胞の安定発現用ベクターであるpIRESneo3ベクター（クロンテック社）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。同様に、上述のpCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクターも制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行い、ｈＧＰＲ１１９とＧｒｏＥＬ２量体融合体に相当する遺伝子断片（以下、「hGPR119-(GroEL)2断片」と称する。）を得た。hGPR119-(GroEL)2断片とpIRESneo3ベクターをライゲーションキットを用いて連結し、pIRESneo3-hGPR119-(GroEL)2ベクターを得た。
(6) Preparation of various vectors containing hGPR119 gene (for stable expression)
A pIRESneo3 vector (Clontech), which is a vector for stable expression of mammalian cells, was treated with restriction enzymes NheI and NotI. Similarly, the above-described pCG2-mAssFLAG-hGPR119 vector is also treated with restriction enzymes NheI and NotI, and a gene fragment corresponding to hGPR119 and GroEL dimer fusion (hereinafter referred to as “hGPR119- (GroEL) 2 fragment”). .) The hGPR119- (GroEL) 2 fragment and the pIRESneo3 vector were ligated using a ligation kit to obtain a pIRESneo3-hGPR119- (GroEL) 2 vector.
pIRESneo3-hGPR119-(GroEL)2ベクターを再度制限酵素ＮｈｅＩで処理し、先に述べたmAssFLAG断片を挿入してpIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクターを得た。 The pIRESneo3-hGPR119- (GroEL) 2 vector was again treated with the restriction enzyme NheI, and the mAssFLAG fragment described above was inserted to obtain a pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 vector.
続いて、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理した後に、上記（４）で調製したＤＮＡ断片Ｇ（ストップコドンを有さないＥＧＦＰ遺伝子を含む断片）の制限酵素ＳａｌＩ処理済みの断片を挿入した。これにより、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2ベクターを得た。 Subsequently, after restriction treatment of the pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 vector with the restriction enzyme SalI, restriction of the DNA fragment G (fragment containing the EGFP gene having no stop codon) prepared in (4) above The fragment that had been treated with the enzyme SalI was inserted. As a result, the pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-EGFP- (GroEL) 2 vector was obtained.
（７）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（ＥＧＦＰ融合、比較例）
pEGFP-N1ベクター（GenBank Accession番号 #U55762）のＮｈｅＩ制限酵素サイトとＸｈｏＩ制限酵素サイトを、それぞれ制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩで切断した。このサンプルの電気泳動を行い、ベクター断片側をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収した。回収したベクター断片をバクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて脱リン酸化処理を行った。一方、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｄ（ストップコドンを有しないｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む断片）についても同様に、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩで切断後に電気泳動を行い、ｈＧＰＲ１１９に相当する断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemによって回収した。これらのＤＮＡ断片を、ライゲーションキットを用いて連結し、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰが連結された融合タンパク質の遺伝子を含むベクター（以下、「pEGFP-hGPR119ベクター」と称する。）を得た。
(7) Production of various vectors containing hGPR119 gene (EGFP fusion, comparative example)
The NheI restriction enzyme site and the XhoI restriction enzyme site of the pEGFP-N1 vector (GenBank Accession No. # U55762) were cleaved with restriction enzymes NheI and XhoI, respectively. This sample was subjected to electrophoresis, and the vector fragment side was recovered by Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). The recovered vector fragment was dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (BAP). On the other hand, the DNA fragment D prepared in the above (2) (a fragment containing the hGPR119 gene having no stop codon) is similarly subjected to electrophoresis after digestion with restriction enzymes NheI and XhoI, and the fragment corresponding to hGPR119 is subjected to Wizard SV Collected by Gel and PCR Clean-Up System. These DNA fragments were ligated using a ligation kit to obtain a vector (hereinafter referred to as “pEGFP-hGPR119 vector”) containing a fusion protein gene in which EGFP was linked to the C-terminus of hGPR119.
pEGFP-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理し、そのサイトに、FLAG断片を挿入した。これにより、pEGFP-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されたベクター（以下、「pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター」と称する。）を得た。 The pEGFP-hGPR119 vector was treated with a restriction enzyme NheI and a FLAG fragment was inserted into the site. As a result, a vector in which the FLAG sequence was added to the N-terminus of hGPR119 in the pEGFP-hGPR119 vector (hereinafter referred to as “pEGFP-FLAG-hGPR119 vector”) was obtained.
pEGFP-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理した断片に、mAssFLAG断片を挿入し、pEGFP-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にマウス由来エンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列が付加されたベクター（以下、「pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。 A vector obtained by inserting a mAssFLAG fragment into a fragment obtained by treating a pEGFP-hGPR119 vector with a restriction enzyme NheI and adding a signal sequence of a mouse-derived endothelin receptor type A to the N-terminus of hGPR119 in the pEGFP-hGPR119 vector (hereinafter, (Referred to as “pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 vector”).
（８）ｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む各種ベクターの作製（一過性発現用）
上記（５）で作製したpCGベクターを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩを用いて制限酵素処理を行った。同様に、上記（３）で調製したＤＮＡ断片Ｆ（ストップコドンを有しないｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む断片）についても制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで制限酵素処理を行った。それぞれの断片をライゲーションキット用いて連結した。これにより、pCGベクターにｈＡＧＴＲ１遺伝子が挿入されたベクター（以下、「pCG-hAGTR1ベクター」と称する。）が作製された。
(8) Production of various vectors containing hAGTR1 gene (for transient expression)
The pCG vector prepared in (5) above was subjected to restriction enzyme treatment using restriction enzymes NheI and SalI. Similarly, the DNA fragment F prepared in (3) above (a fragment containing the hAGTR1 gene having no stop codon) was also treated with restriction enzymes NheI and SalI. Each fragment was ligated using a ligation kit. Thus, a vector in which the hAGTR1 gene was inserted into the pCG vector (hereinafter referred to as “pCG-hAGTR1 vector”) was produced.
続いて、pCG-hAGTR1ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理し、そのサイトにFLAG断片を挿入した。これにより、pCG-hAGTR1ベクターにおけるｈＡＧＴＲ１のＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されたベクター（以下、「pCG-FLAG-hAGTR1ベクター」と称する。）を得た。 Subsequently, the pCG-hAGTR1 vector was treated with the restriction enzyme NheI and the FLAG fragment was inserted into the site. As a result, a vector in which a FLAG sequence was added to the N-terminus of hAGTR1 in the pCG-hAGTR1 vector (hereinafter referred to as “pCG-FLAG-hAGTR1 vector”) was obtained.
pCG-FLAG-hAGTR1ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理し、続いて上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂ（ストップコドンを有しないＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理した。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。ＳａｌＩの制限酵素断片とＸｈｏＩの制限酵素断片はライゲーション可能であり、ＧｒｏＥＬ遺伝子が正方向の連結体としてライゲーションすることが可能である。これにより、pCG-FLAG-hAGTR1ベクターにさらにＧｒｏＥＬ遺伝子が１個から２個付加された（ＧｒｏＥＬが２連結から３連結された）ベクター（以下、「pCG2-FLAG-hAGTR1ベクター」、「pCG3-FLAG-hAGTR1ベクター」とそれぞれ称する。）が得られた。 The pCG-FLAG-hAGTR1 vector is treated with the restriction enzyme SalI, and then the DNA fragment B (fragment containing the GroEL gene having no stop codon) prepared in the above (1) is treated with the restriction enzymes SalI and XhoI. did. These fragments were ligated using a ligation kit. The restriction enzyme fragment of SalI and the restriction enzyme fragment of XhoI can be ligated, and the GroEL gene can be ligated as a ligation in the forward direction. Thus, one to two GroEL genes were added to the pCG-FLAG-hAGTR1 vector (GroEL was linked from two to three) (hereinafter referred to as “pCG2-FLAG-hAGTR1 vector”, “pCG3-FLAG”). -hAGTR1 vector ", respectively).
哺乳動物細胞の安定発現用ベクターであるpIRESneo3ベクター（クロンテック社）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。同様に、上記（３）で調製したＤＮＡ断片Ｅ（ストップコドンを有するｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む断片）も制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。これらの断片とpIRESneo3ベクターをライゲーションキットを用いて連結し、pIRESneo3-hAGTR1ベクターを得た。このベクターを再度制限酵素ＮｈｅＩで処理し、先に述べたＦＬＡＧ断片を挿入してpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターを得た。 A pIRESneo3 vector (Clontech), which is a vector for stable expression of mammalian cells, was treated with restriction enzymes NheI and NotI. Similarly, the DNA fragment E prepared in (3) (a fragment containing the hAGTR1 gene having a stop codon) was also treated with restriction enzymes NheI and NotI. These fragments and the pIRESneo3 vector were ligated using a ligation kit to obtain a pIRESneo3-hAGTR1 vector. This vector was again treated with the restriction enzyme NheI, and the FLAG fragment described above was inserted to obtain the pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector.
構築した各ベクターと発現される膜貫通受容体の構成を表１に纏めた。
（９）ｈＧＰＲ１１９の安定発現細胞の作製
宿主細胞としてＨＥＫ２９３細胞（Stratagene社）を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はネオマイシン耐性であるため、安定発現細胞の作製にはＨＥＫ２９３細胞が宿主細胞として適している。
pEGFP-mAssFLAG-h119ベクター、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクター、またはpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを、Lipofectamine 2000（インビトロジェン社）およびOpti-MEM（ギブコ社）を用いて、プロトコールに従い、DNA(μg)/Opti-MEM(ml)=192μg / 2.4 ml、Lipofectamine(μl)/Opti-MEM(ml)=180μl / 2.4mlの組成でＨＥＫ２９３細胞へ導入した。
遺伝子導入２日後、細胞をトリプシンで剥離・回収し、フローサイトメーター（ＦＣＭ; FACS Calibur、ベクトンディッキンソン社）にて発現を確認した。さらに遺伝子が導入された細胞を６ウェルプレート（コーニング社）へ２．０×１０5cellsずつ播種し、通常培地に抗生物質Ｇ４１８を２００μg／ｍＬ〜１２００μg／ｍＬの濃度範囲で加え、薬剤選択培地にて培養を行った。培地交換を行いながら遺伝子未導入細胞が死滅後、ウェルがコンフルエントになったら再びＦＣＭにて発現を確認した。
各Ｇ４１８濃度で得られた薬剤耐性株から、限界希釈を行い、通常培地にて２週間培養後にコロニーを形成しているウェルから６ウェルへ移した（これ以後、２００μg／ｍＬの選択培地（１０％ＦＢＳ、0.1 mM ＮＥＡＡ混合ＤＭＥＭ培地）にて培養、必要に応じて濃度を変えた）。ウェルがコンフルエントになった時点でＦＣＭにて発現を確認し、発現量が高いクローンをスクリーニングした。
この操作によって得られた安定発現細胞株を、それぞれ、「mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞」、「mAssFLAG-hGPR119-（GroEL）2/HEK293細胞」、「mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞」とした。
(9) Production of cells stably expressing hGPR119 HEK293 cells (Stratagene) were used as host cells. Since HEK293T cells are resistant to neomycin, HEK293 cells are suitable as host cells for the production of stably expressing cells.
pEGFP-mAssFLAG-h119 vector, pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 vector, or pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP- (GroEL) 2 vector to Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and Opti-MEM (Gibco) Then, according to the protocol, it was introduced into HEK293 cells at a composition of DNA (μg) / Opti-MEM (ml) = 192 μg / 2.4 ml and Lipofectamine (μl) / Opti-MEM (ml) = 180 μl / 2.4 ml.
Two days after gene introduction, the cells were detached and collected with trypsin, and expression was confirmed with a flow cytometer (FCM; FACS Calibur, Becton Dickinson). Furthermore, 2.0 × 10 5 cells of the cells into which the gene has been introduced are seeded in 6-well plates (Corning), and antibiotic G418 is added to a normal medium in a concentration range of 200 μg / mL to 1200 μg / mL. Incubated at After the non-gene-introduced cells died while exchanging the medium, when the wells became confluent, the expression was confirmed again by FCM.
From the drug-resistant strains obtained at each G418 concentration, limiting dilution was performed, and the colony-forming wells were transferred to 6 wells after culturing in normal media for 2 weeks (hereinafter, 200 μg / mL selective medium (10 % FBS, 0.1 mM NEAA mixed DMEM medium), and the concentration was changed as necessary). When wells became confluent, expression was confirmed by FCM, and clones with high expression levels were screened.
The stable expression cell lines obtained by this manipulation were respectively referred to as “mAssFLAG-hGPR119-EGFP / HEK293 cell”, “mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 / HEK293 cell”, “mAssFLAG-hGPR119-EGFP- (GroEL) 2 / HEK293 cells ".
（１０）ｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の作製
宿主細胞として、ＣＨＯ細胞を用いた。
pIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターを用い、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の操作を行った。この操作によって得られたｈＡＧＴＲ１安定発現細胞株を、「FLAG-hAGTR1/CHO細胞」とした。
(10) Preparation of cells stably expressing hAGTR1 CHO cells were used as host cells.
Using the pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector, the same operation as in the above (9) was performed using Lipofectamine 2000 and Opti-MEM. The hAGTR1 stable expression cell line obtained by this operation was designated as “FLAG-hAGTR1 / CHO cell”.
作製した各安定発現細胞と発現される膜貫通受容体の構成を表２に纏めた。
（１１）ｈＧＰＲ１１９のＦＣＭによる発現量測定
Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の操作を行い、pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター、pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG-FLAG-hGPR119ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入し、ｈＧＰＲ１１９を一過性発現させた。
細胞表面に発現しているhGPR119の量を知るために、ＦＬＡＧ抗体の結合量を調べた。すなわち、濃度１０μｇ／ｍＬのＡＮＴＩ-ＦＬＡＧ Ｍ２ マウスモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社）（以下、単に「ＦＬＡＧ抗体」と略記することがある。）のＰＢＳ溶液（以下、「ＦＬＡＧ抗体溶液」と略記することがある。）を調製した。
pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター、pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG-FLAG-hGPR119ベクターが導入された各ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した後、ＦＬＡＧ抗体溶液を各細胞と混合し、４℃で１時間インキュベーションを行った。その後、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製）を添加した後、４℃で３０分間インキュベーションを行った。各細胞をＰＢＳで洗浄後、フローサイトメーター（FACSCalibur）を用いて、各細胞とＦＬＡＧ抗体との相互作用を解析した。２次抗体染色操作の対照として、２次抗体染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析も行った。
(11) Measurement of expression level of hGPR119 by FCM
The same operation as in (9) above was performed using Lipofectamine 2000 and Opti-MEM, and the pEGFP-FLAG-hGPR119 vector, pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 vector, or pCG-FLAG-hGPR119 vector was introduced into HEK293T cells, and hGPR119 was introduced. It was expressed transiently.
In order to know the amount of hGPR119 expressed on the cell surface, the binding amount of the FLAG antibody was examined. That is, a PBS solution (hereinafter abbreviated as “FLAG antibody solution”) of ANTI-FLAG M2 mouse monoclonal antibody (Sigma Aldrich) (hereinafter sometimes simply referred to as “FLAG antibody”) at a concentration of 10 μg / mL. Prepared).
Each HEK293T cell introduced with the pEGFP-FLAG-hGPR119 vector, pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 vector, or pCG-FLAG-hGPR119 vector was washed with PBS, and the FLAG antibody solution was mixed with each cell. Time incubation was performed. Thereafter, each cell was washed with PBS, and an anti-mouse IgG antibody (manufactured by Beckman Coulter) labeled with phycoerythrin (PE) was added as a secondary antibody, followed by incubation at 4 ° C. for 30 minutes. After each cell was washed with PBS, the interaction between each cell and the FLAG antibody was analyzed using a flow cytometer (FACSCalibur). As a control for the secondary antibody staining operation, HEK293T cells not stained with the secondary antibody were also analyzed.
結果を図１（ａ）〜（ｄ）に示す。図１（ａ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行わなかったpEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１(ｂ)は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１（ｃ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpEGFP-mAssFLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１（ｄ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpCG-FLAG-hGPR119（Ｃ末端ＧｒｏＥＬ１量体融合）一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果である。図１（ａ）の領域Ｃは、２次抗体染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞に相当する部分である。 The results are shown in FIGS. FIG. 1 (a) shows pEGFP-FLAG-hGPR119 transiently expressed HEK293T cells not stained with FLAG antibody, and FIG. 1 (b) shows pEGFP-FLAG-hGPR119 transiently stained with FLAG antibody. Sex-expressing HEK293T cells, FIG. 1 (c) shows pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 transiently expressed HEK293T cells stained with FLAG antibody, FIG. 1 (d) shows pCG-FLAG stained with FLAG antibody. -hGPR119 (C-terminal GroEL monomer fusion) is a result of transiently expressing HEK293T cells. Region C in FIG. 1 (a) is a portion corresponding to HEK293T cells not stained with a secondary antibody.
図１（ａ）と図１（ｂ）との比較より、pEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではＦＬＡＧ抗体による染色の差が見られなかった。このことから、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰ（分子量２万７千）を付加してもｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することはなく、ｈＧＰＲ１１９は一般的な方法では発現できないことが分かった。 From a comparison between FIG. 1 (a) and FIG. 1 (b), there was no difference in staining with the FLAG antibody in pEGFP-FLAG-hGPR119 transiently expressed HEK293T cells. From this, it was found that even when EGFP (molecular weight 27,000) was added to the C-terminus of hGPR119, the expression level of hGPR119 did not increase, and hGPR119 could not be expressed by a general method.
図１（ｃ）に示すように、Ｎ末端にシグナル配列（ｍＡｓｓ）を付加することによって、細胞膜上でのｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することが分かった。なお、図中の領域Ｒ２は、ＥＧＦＰ融合ベクターの発現をバックグラウンドとした場合に比して、ＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域に相当する。Ｒ２領域に含まれる、ＦＬＡＧ抗体の結合における平均蛍光強度は５５であった。 As shown in FIG. 1 (c), it was found that the expression level of hGPR119 on the cell membrane was increased by adding a signal sequence (mAss) to the N-terminus. The region R2 in the figure corresponds to a region where binding of the FLAG antibody is observed as compared with the case where the expression of the EGFP fusion vector is used as a background. The average fluorescence intensity in the binding of the FLAG antibody contained in the R2 region was 55.
図１（ｄ）に示すように、Ｃ末端にＧｒｏＥＬ（分子量６万）を付加することによっても、細胞膜上でのｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することが分かった。領域Ｒ１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をバックグランドにした場合に比して、ＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域に相当する。なお、Ｒ１領域に含まれるＦＬＡＧ抗体の結合における平均蛍光強度は６０であり、図１（ｃ）の平均蛍光強度（５５）よりも大きかった。
これにより、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬを付加することによりｈＧＰＲ１１９の発現量が増大することが示された。さらにＧｒｏＥＬの付加は、シグナル配列（ｍＡｓｓ）を付加して細胞膜への膜移行を行う従来の手法に比してより発現量を増加させることが分かった。
As shown in FIG. 1 (d), it was found that the expression level of hGPR119 on the cell membrane also increased by adding GroEL (molecular weight 60,000) to the C-terminus. The region R1 corresponds to a region where binding of the FLAG antibody is observed as compared with the case where HEK293T cells are used as a background. The average fluorescence intensity in binding of the FLAG antibody contained in the R1 region was 60, which was larger than the average fluorescence intensity (55) in FIG.
Thereby, it was shown that the expression level of hGPR119 increases by adding GroEL to the C-terminus of hGPR119. Furthermore, it has been found that the addition of GroEL increases the expression level as compared with the conventional method in which a signal sequence (mAss) is added to translocate to the cell membrane.
（１２）ＧｒｏＥＬ多量体を付加した場合の発現量検討
pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG3-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG4-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG5-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG6-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG7-mAssFLAG-hGPR119ベクターを用いて、上記（１１）と同様のＦＣＭを行い、ＧｒｏＥＬ多量体（ｎ＝１〜７）をＣ末端に付加した場合のｈＧＰＲ１１９発現量の増加を調べた。結果を図２（ａ）〜（ｈ）に示す。図２（ａ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のみ（陰性対照）、図２（ｂ）〜（ｈ）はそれぞれｎ＝１〜７の場合を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に相当するバックグランド領域を図２（ａ）の領域Ｃとした。図２（ｂ）〜（ｈ）において、領域Ｃに対してＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域Ｒ１とし、その領域に含まれる平均蛍光強度を解析した。その結果、ｎ＝１の場合（分子量６万）は平均蛍光強度が７５、ｎ＝２（分子量１２万）の場合は平均蛍光強度が１１２、ｎ＝３の場合（分子量１８万）は平均蛍光強度が６１、ｎ＝４の場合（分子量２４万）は平均蛍光強度が５０、ｎ＝５の場合（分子量３０万）は平均蛍光強度が４４、ｎ＝６の場合（分子量３６万）は平均蛍光強度が３４、ｎ＝７の場合（分子量４２万）は平均蛍光強度が４１であった。
以上より、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬ多量体を付加することによってもｈＧＰＲ１１９の発現量が増大することが示された。また発現量に関し、ｎ＝２の場合に最も高い値が得られ、ｎ＝１，３の場合もそれに次ぐ高い値が得られた。
(12) Examination of expression level when GroEL multimer is added
pCG-mAssFLAG-hGPR119 vector, pCG2-mAssFLAG-hGPR119 vector, pCG3-mAssFLAG-hGPR119 vector, pCG4-mAssFLAG-hGPR119 vector, pCG5-mAssFLAG-hGPR119 vector, pCG6-mAssFLAG-hGPR119 vector, or pCG7-mAssFLAG-hGPR119 Using the same FCM as in (11) above, the increase in the expression level of hGPR119 when GroEL multimers (n = 1 to 7) were added to the C-terminal was examined. A result is shown to Fig.2 (a)-(h). FIG. 2 (a) shows only HEK293T cells (negative control), and FIGS. 2 (b) to (h) show cases where n = 1 to 7, respectively. A background region corresponding to HEK293T cells was defined as region C in FIG. In FIGS. 2B to 2H, the region R1 in which the binding of the FLAG antibody is observed to the region C was taken, and the average fluorescence intensity contained in the region was analyzed. As a result, when n = 1 (molecular weight 60,000), the average fluorescence intensity is 75, when n = 2 (molecular weight 120,000), the average fluorescence intensity is 112, and when n = 3 (molecular weight 180,000), the average fluorescence intensity When the intensity is 61 and n = 4 (molecular weight 240,000), the average fluorescence intensity is 50, when n = 5 (molecular weight 300,000), the average fluorescence intensity is 44, and when n = 6 (molecular weight 360,000), the average When the fluorescence intensity was 34 and n = 7 (molecular weight 420,000), the average fluorescence intensity was 41.
From the above, it was shown that the expression level of hGPR119 is increased by adding a GroEL multimer to the C-terminus of hGPR119. Regarding the expression level, the highest value was obtained when n = 2, and the second highest value was obtained when n = 1 or 3.
（１３）顕微鏡観察による細胞におけるｈＧＰＲ１１９の発現分布
ＧｒｏＥＬ付加によってｈＧＰＲ１１９の発現量が増加した細胞について、細胞の状態を蛍光顕微鏡を用いて観察した。ベクターとしてpEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクターとpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞による一過性発現の系で行った。一過性発現は、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の方法で行った。
プレート上の細胞を蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７０、ＷＩＢフィルター、倍率４００倍）により観察した。結果を図３（ａ），（ｂ）に示す。図３（ａ）はpEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞の場合、図３（ｂ）はpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを用いた一過性発現細胞の場合の結果をそれぞれ示す。
(13) Expression distribution of hGPR119 in cells by microscopic observation With respect to cells in which the expression level of hGPR119 was increased by adding GroEL, the state of the cells was observed using a fluorescence microscope. A pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 vector and a pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP- (GroEL) 2 vector were used as a vector, and a transient expression system using HEK293T cells was used. Transient expression was performed using Lipofectamine 2000 and Opti-MEM in the same manner as in (9) above.
The cells on the plate were observed with a fluorescence microscope (Olympus IX70, WIB filter, 400 times magnification). The results are shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b). FIG. 3 (a) shows transient expression cells using the pEGFP-mAssFLAG-hGPR119 vector, and FIG. 3 (b) shows transient expression cells using the pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP- (GroEL) 2 vector. The results in the case of.
その結果、pEGFP-mAssFAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ａ））は、pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2 ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ｂ））に比して、細胞内にタンパク質が局在しており、あまり細胞膜上に発現していないことが分かった。また細胞の形態についても、pEGFP-mAssFAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ａ））は丸みがかった細胞になっており、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞とは異なった形態をとっているため、細胞に非常にストレスがかかった状態であった。それに対し、pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ｂ））の場合は、細胞の形態は、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に近い状態であり、発現も細胞膜により局在していることが分かった。 As a result, transient expression cells using the pEGFP-mAssFAG-hGPR119 vector (FIG. 3 (a)) were transient expression cells using the pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2 vector (FIG. 3 (b)). ), The protein was localized in the cell, and it was found that the protein was not expressed much on the cell membrane. As for the cell morphology, the transiently expressed cells using the pEGFP-mAssFAG-hGPR119 vector (FIG. 3 (a)) are rounded cells and have a morphology different from that of normal HEK293T cells. Therefore, the cells were very stressed. In contrast, in the case of transiently expressing cells using the pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2 vector (FIG. 3 (b)), the cell morphology is close to that of normal HEK293T cells, and the expression is also cell membrane. It was found that it was localized.
（１４）継代によるｈＧＰＲ１１９安定発現細胞における発現安定性検討
上記（９）で作製した、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞、mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2/HEK293細胞、およびmAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞を、安定発現株取得完了時点を０日目として継代を続け、経過時間ごとのｈＧＰＲ１１９の細胞表面におけるｈＧＰＲ１１９の発現量の経時変化をプロットした。発現量の測定は、上述のＦＬＡＧ抗体を用いたＦＣＭにて行った。結果を図４に示す。各プロットは、ＦＬＡＧ抗体で染色された細胞集団の蛍光強度の平均値である。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰのみ（分子量２万７千）を付加した場合は、継代を重ねるごとに発現量が低下し、１４日目以降で発現量がほぼバックグランド程度に低下した（図４の（●））。これに対し、ＧｒｏＥＬ２量体（分子量１２万）またはＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰ（分子量１４万７千）を付加した場合は、継代を重ねても長期間にわたって高発現が維持された（図４の（■）と（▲））。
(14) Expression stability study in hGPR119 stably expressing cells by subculture mAssFLAG-hGPR119-EGFP / HEK293 cells, mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 / HEK293 cells, and mAssFLAG-hGPR119-EGFP prepared in (9) above -(GroEL) 2 / HEK293 cells were continuously passaged on the 0th day when the stable expression strain acquisition was completed, and the changes over time in the expression level of hGPR119 on the cell surface of hGPR119 for each elapsed time were plotted. The expression level was measured by FCM using the FLAG antibody described above. The results are shown in FIG. Each plot is the mean fluorescence intensity of the cell population stained with the FLAG antibody. That is, when only EGFP (molecular weight 27,000) was added to the C-terminus of hGPR119, the expression level decreased with each passage, and the expression level decreased to about the background after the 14th day ( (●) in FIG. In contrast, when GroEL dimer (molecular weight 120,000) or GroEL dimer and EGFP (molecular weight 147,000) were added, high expression was maintained over a long period even after repeated passages (FIG. 4). (■) and (▲)).
（１５）ｈＧＰＲ１１９のｃＡＭＰシグナル測定
上記（９）で作製した、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞、mAssFLAG-hGPR119-（GroEL）2/HEK293細胞、及びmAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞、並びにＨＥＫ２９３細胞（陰性対照）を用い、ｈＧＰＲ１１９のｃＡＭＰシグナルを測定した。ｈＧＰＲ１１９に対するリガンドとして、N-Oleoylethanolamine（ＯＥＡ）（シグマアルドリッチ社）を用いた。ｃＡＭＰ測定は、ｃＡＭＰ測定キット（CatchPoint Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit, モレキュラーデバイス社）を用いて行い、ＥＣ５０値を算出した。
(15) cAMP signal measurement of hGPR119 mAssFLAG-hGPR119-EGFP / HEK293 cells, mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 / HEK293 cells, and mAssFLAG-hGPR119-EGFP- (GroEL) 2 / HEK293 prepared in (9) above The hAMPR119 cAMP signal was measured using cells as well as HEK293 cells (negative control). N-Oleoylethanolamine (OEA) (Sigma Aldrich) was used as a ligand for hGPR119. The cAMP measurement was performed using a cAMP measurement kit (CatchPoint Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit, Molecular Devices), and the EC50 value was calculated.
結果を図５に示す。まず、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞（■）では、ＥＣ５０が６．７×１０-6Ｍであった。この値は非特許文献１に記載の値とほぼ同等であり、ｈＧＰＲ１１９が有する本来の活性と考えられた。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰを付加してもｈＧＰＲ１１９の立体構造に変化はなく、かつシグナル抑制も起こっていないと考えられた。
一方、mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2/HEK293細胞（▼）では、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞（■）の曲線と比較して、ｃＡＭＰシグナル変異量がＯＥＡの添加量に対して小さく、ｃＡＭＰシグナルが抑制されていた。ＥＣ５０については１．７×１０-6Ｍであり、非特許文献１に記載の値とほぼ同等であることから、ｈＧＰＲ１１９が有する本来の活性と考えられた。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体を付加してもｈＧＰＲ１１９の立体構造に変化はないと考えられた。
さらに、mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞（◆）では、シグナル強度の変化が観察されず（ＥＣ５０が算出不能）、ＨＥＫ２９３細胞（陰性対照）と同レベルまでｃＡＭＰシグナルが抑制されていた。
以上より、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にタンパク質を付加した場合、ＥＧＦＰのみ（分子量２万７千）の付加ではｃＡＭＰシグナルが抑制されないが、ＧｒｏＥＬ２量体（分子量１２万）の付加及びＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰ（分子量１４万７千）の付加ではｃＡＭＰシグナルが抑制されることが示された。
なお、ＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰを付加した場合の方がＧｒｏＥＬ２量体のみの付加よりもシグナル伝達がより抑制されたのは、可能性として、分子量の違いによる立体障害の差によるものと考えられる。
The results are shown in FIG. First, in the case of mAssFLAG-hGPR119-EGFP / HEK293 cells (■), EC50 was 6.7 × 10 −6 M. This value was almost equivalent to the value described in Non-Patent Document 1, and was considered to be the original activity of hGPR119. That is, it was considered that even when EGFP was added to the C-terminus of hGPR119, there was no change in the three-dimensional structure of hGPR119 and no signal suppression occurred.
On the other hand, in mAssFLAG-hGPR119- (GroEL) 2 / HEK293 cells (▼), the amount of cAMP signal mutation is smaller than the amount of OEA added compared to the curve of mAssFLAG-hGPR119-EGFP / HEK293 cells (■). cAMP signal was suppressed. The EC50 is 1.7 × 10 −6 M, which is almost the same as the value described in Non-Patent Document 1, and thus was considered to be the original activity of hGPR119. That is, it was considered that there was no change in the three-dimensional structure of hGPR119 even when a GroEL dimer was added to the C-terminus of hGPR119.
Furthermore, in mAssFLAG-hGPR119-EGFP- (GroEL) 2 / HEK293 cells (♦), no change in signal intensity is observed (EC50 cannot be calculated), and cAMP signal is suppressed to the same level as HEK293 cells (negative control). It was.
From the above, when a protein is added to the C-terminus of hGPR119, the addition of EGFP alone (molecular weight 27,000) does not suppress the cAMP signal, but the addition of GroEL dimer (molecular weight 120,000) and GroEL dimer and EGFP ( It was shown that the addition of a molecular weight of 147,000) suppresses the cAMP signal.
In addition, it is thought that the signal transmission was more suppressed when GroEL dimer and EGFP were added than when only GroEL dimer was added due to a difference in steric hindrance due to a difference in molecular weight.
（１６）フローサイトメトリーを用いたｈＡＧＴＲ１の蛍光リガンド結合実験
上記（１０）で作製したＦＬＡＧ-ｈＡＧＴＲ１/ＣＨＯ細胞（ｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞）、並びに、pIRESneo3-FLAG-hAGTR１ベクター、pCG2-hAGTR１ベクター、又はpCG3-hAGTR1ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性発現させた細胞を用いて、ＦＣＭによる蛍光リガンド結合実験を行った。一過性発現は、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の方法で行った。蛍光色素（Ａｌeｘa４８８）を結合したＡＴＩＩのリガンドとして、ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８（インビトロジェン社、Ｅｘ＝４９５ｎｍ、Ｅｍ＝５１９ｎｍ）を用いた。
(16) Fluorescent ligand binding experiment of hAGTR1 using flow cytometry FLAG-hAGTR1 / CHO cells (cells stably expressing hAGTR1) prepared in (10) above, and pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector, pCG2-hAGTR1 vector, Alternatively, fluorescent ligand binding experiments using FCM were performed using cells in which the pCG3-hAGTR1 vector was transiently expressed in HEK293T cells. Transient expression was performed using Lipofectamine 2000 and Opti-MEM in the same manner as in (9) above. ATII-Alexa488 (Invitrogen, Ex = 495 nm, Em = 519 nm) was used as a ligand of ATII bound with a fluorescent dye (Alexa488).
各細胞を培養フラスコから剥がし、ＰＢＳで洗浄した後、３０μＭのＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８のＰＢＳ溶液で、４℃で１時間インキュベーションを行った。その後、各細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（FACSCalibur）を用いて、ｈＡＧＴＲ１発現細胞とＡＴＩＩの結合相互作用を解析した。 Each cell was detached from the culture flask, washed with PBS, and then incubated with 30 μM ATII-Alexa488 in PBS at 4 ° C. for 1 hour. Thereafter, each cell was washed with PBS, and the binding interaction between hAGTR1-expressing cells and ATII was analyzed using a flow cytometer (FACSCalibur).
結果を図６（ａ）〜（ｅ）に示す。図６（ａ）はリガンドを添加していないｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の測定結果であり、バックグランドに相当する（陰性対照）。図６（ｂ）はリガンドを添加した場合のｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の測定結果である（陽性対照）。図６（ｂ）のように、安定発現細胞では細胞の集団全体がＸ軸方向（ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８の蛍光強度の増加方向）にシフトしており、リガンドが結合したことを示している。
図６（ｃ）はpIRESneo3-FLAG-hAGTR１ベクターを用いた一過性発現細胞、図６（ｄ）はpCG2-FLAG-hAGTR１ベクターを用いた一過性発現細胞、図６（ｅ）はpCG3-FLAG-hAGTR1ベクターを用いた一過性発現細胞の結果である。いずれの場合も、細胞の集団全体がＸ軸方向（ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８の蛍光強度の増加方向）にシフトしており、リガンドが結合していた。これは、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体またはＧｒｏＥＬ３量体を付加した場合でも、リガンド結合活性を保持していることを示していた。なお、宿主細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた場合はＸ軸方向へのシフトはみられなかった。
The results are shown in FIGS. FIG. 6 (a) shows the measurement results of cells stably expressing hAGTR1 to which no ligand was added, and corresponds to the background (negative control). FIG. 6 (b) shows the measurement results of cells stably expressing hAGTR1 when a ligand was added (positive control). As shown in FIG. 6B, in the stably expressing cells, the entire cell population is shifted in the X-axis direction (in the increasing direction of the fluorescence intensity of ATII-Alexa488), indicating that the ligand is bound.
6 (c) shows transient expression cells using the pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector, FIG. 6 (d) shows transient expression cells using the pCG2-FLAG-hAGTR1 vector, and FIG. 6 (e) shows pCG3- It is the result of the transient expression cell using a FLAG-hAGTR1 vector. In any case, the whole cell population was shifted in the X-axis direction (in the increasing direction of the fluorescence intensity of ATII-Alexa488), and the ligand was bound. This indicated that even when GroEL dimer or GroEL trimer was added to the C-terminus of hAGTR1, ligand binding activity was retained. When HEK293T cells, which are host cells, were used, no shift in the X-axis direction was observed.
（１７）ｈＡＧＴＲ１のカルシウムシグナル測定実験
pCG2-hAGTR1ベクターとpCG3-hAGTR1ベクターの一過性発現ＣＨＯ細胞を用いて、細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価を行った。陽性対照としてpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターの一過性発現ＣＨＯ細胞を用いた（ｈＡＧＴＲ１発現、シグナル伝達あり）。陰性対照として、宿主細胞であるＣＨＯ細胞（ｈＡＧＴＲ１未発現、シグナル伝達なし）を用いた。
(17) Calcium signal measurement experiment of hAGTR1
Intracellular Ca 2+ signaling activity was evaluated using transiently expressed CHO cells of the pCG2-hAGTR1 vector and the pCG3-hAGTR1 vector. As a positive control, transiently expressed CHO cells of the pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector were used (hAGTR1 expression, with signal transduction). As a negative control, CHO cells (hAGTR1 unexpressed, no signal transduction) as host cells were used.
各細胞２×１０4個を９６穴マイクロタイタープレートに蒔き、播種したプレートの各穴にリガンドであるＡＴＩＩ（ペプチド研究所）を１０μＭになるように添加した。ＡＴＩＩを添加した後、各細胞がＡＴＩＩによって刺激された際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇度を測定した。測定はＮ＝３で実施し、シグナル変化量をベースライン値（１０秒までの値）と最大との差分の平均値として算出した。Ｃａ2+濃度変化測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。 2 × 10 4 cells were seeded in a 96-well microtiter plate, and ATII (Peptide Institute) as a ligand was added to each well of the seeded plate so as to have a concentration of 10 μM. After adding ATII, the transient increase in intracellular Ca 2+ concentration was measured when each cell was stimulated by ATII. The measurement was performed at N = 3, and the signal change amount was calculated as an average value of the difference between the baseline value (value up to 10 seconds) and the maximum. The Ca 2+ concentration change measurement was performed using a Ca 2+ signal analyzer (FLIPR; Molecular Devices) and an intracellular Ca staining kit (Ca3kit; Molecular Devices).
結果を図７に示す。（ａ）はpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクター（陽性対照）、（ｂ）はpCG2-FLAG-hAGTR1ベクター、（ｃ）はpCG3-FLAG-hAGTR1ベクターの、各一過性発現ＣＨＯ細胞の結果である。（ｄ）はＣＨＯ細胞の結果である（陰性対照）。図７においてリガンドであるＡＴＩＩを添加した横軸１０秒の地点をベース（最小値）とし、Ｃａ2+シグナル変化量の最大値との差に相当するシグナル変化量は、（ａ）：８４．３、（ｂ）：７４．２、（ｃ）：４９．５、（ｄ）：４７．０であった。
以上より、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体またはＧｒｏＥＬ３量体を連結することにより、細胞内Ｃａ2+シグナル伝達を抑制することができた。また、分子量が大きいＧｒｏＥＬ３量体（ｃ）の方が、ＧｒｏＥＬ２量体（ｂ）に比べてシグナル伝達抑制効果が高かった。
The results are shown in FIG. (A) is the result of each transiently expressed CHO cell of the pIRESneo3-FLAG-hAGTR1 vector (positive control), (b) is the pCG2-FLAG-hAGTR1 vector, and (c) is the pCG3-FLAG-hAGTR1 vector. (D) is the result of CHO cells (negative control). In FIG. 7, the signal change amount corresponding to the difference from the maximum value of the Ca 2+ signal change amount is (a): 84. 3, (b): 74.2, (c): 49.5, (d): 47.0.
From the above, intracellular Ca 2+ signaling could be suppressed by linking GroEL dimer or GroEL trimer to the C-terminus of hAGTR1. In addition, the GroEL trimer (c) having a higher molecular weight had a higher signal transduction inhibitory effect than the GroEL dimer (b).
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010275733A JP2012120507A (en) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010275733A JP2012120507A (en) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012120507A true JP2012120507A (en) | 2012-06-28 |
Family
ID=46502674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010275733A Pending JP2012120507A (en) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012120507A (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002052029A1 (en) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Process for producing recombinant protein and fused protein |
| WO2006041157A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method of immunizing animal, composition for immunization, method of producing antibody, method of producing hybridoma and method of producing monoclonal antibody |
| JP2008058104A (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-13 | Sekisui Chem Co Ltd | Composition for evaluating binding to G protein-coupled receptor and method for evaluating binding |
| JP2009215211A (en) * | 2008-03-10 | 2009-09-24 | Sekisui Chem Co Ltd | Fusion protein, method for producing oxytocin receptor, compound screening method and composition for screening |
| JP2009292759A (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-17 | Sekisui Chem Co Ltd | Anti-histamine receptor type 1 monoclonal antibody and hybridoma |
| JP2010246522A (en) * | 2009-03-27 | 2010-11-04 | Sekisui Chem Co Ltd | Fusion proteins and genes |
-
2010
- 2010-12-10 JP JP2010275733A patent/JP2012120507A/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002052029A1 (en) * | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Process for producing recombinant protein and fused protein |
| WO2006041157A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method of immunizing animal, composition for immunization, method of producing antibody, method of producing hybridoma and method of producing monoclonal antibody |
| JP2008058104A (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-13 | Sekisui Chem Co Ltd | Composition for evaluating binding to G protein-coupled receptor and method for evaluating binding |
| JP2009215211A (en) * | 2008-03-10 | 2009-09-24 | Sekisui Chem Co Ltd | Fusion protein, method for producing oxytocin receptor, compound screening method and composition for screening |
| JP2009292759A (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-17 | Sekisui Chem Co Ltd | Anti-histamine receptor type 1 monoclonal antibody and hybridoma |
| JP2010246522A (en) * | 2009-03-27 | 2010-11-04 | Sekisui Chem Co Ltd | Fusion proteins and genes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blott et al. | Fas ligand is targeted to secretory lysosomes via a proline-rich domain in its cytoplasmic tail | |
| Shao et al. | Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1 (LETM1) forms a Ca2+/H+ antiporter | |
| Rorbach et al. | The human mitochondrial ribosome recycling factor is essential for cell viability | |
| Chandler et al. | BIM1, a bHLH protein involved in brassinosteroid signalling, controls Arabidopsis embryonic patterning via interaction with DORNRÖSCHEN and DORNRÖSCHEN-LIKE | |
| Van Itallie et al. | A complex of ZO-1 and the BAR-domain protein TOCA-1 regulates actin assembly at the tight junction | |
| KR20200019126A (en) | Oligomeric Particle Reagents and Methods of Use thereof | |
| MXPA04011134A (en) | Method of identifying transmembrane protein-interacting compounds. | |
| KR20210100624A (en) | Methods of making genetically engineered T cells | |
| JP2015519344A (en) | Translocation of non-natural chemical entities through the anthrax protective antigen pore | |
| Eagle et al. | Cellular expression, trafficking, and function of two isoforms of human ULBP5/RAET1G | |
| WO2017070742A1 (en) | Use of spycatcher as a protein scaffold for peptide display; and spycatcher/spytag cyclised peptides displayed on bacteriophage | |
| Tigue et al. | MEDI1873, a potent, stabilized hexameric agonist of human GITR with regulatory T-cell targeting potential | |
| US20200072820A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
| JP2023542312A (en) | Downregulation of membrane-bound proteins by receptor TAC technology | |
| Guo et al. | The SpyCatcher-SpyTag interaction mediates tunable anti-tumor cytotoxicity of NK cells | |
| WO2006023248A2 (en) | Processes for producing and crystallizing g-protein coupled receptors | |
| EP2893020B1 (en) | Compositions and methods for increasing the expression and signalling of proteins on cell surfaces | |
| JP2024507867A (en) | Fusion protein containing two RING domains | |
| US20190359937A1 (en) | Chimeric receptors, biosensor host cells and methods/uses thereof | |
| JP2012120507A (en) | Recombinant eukaryotic cell, and intracellular signaling inhibition method | |
| JP2015097523A (en) | Polypeptide combinations and screening methods for searching for drugs that induce nucleolar stress response | |
| Yang et al. | Biochemical features of the adhesion G protein-coupled receptor CD97 related to its auto-proteolysis and HeLa cell attachment activities | |
| von Nickisch-Rosenegk et al. | Construction of an artificial cell membrane anchor using DARC as a fitting for artificial extracellular functionalities of eukaryotic cells | |
| US7879978B2 (en) | Macaca fascicularis ST2L | |
| WO2012082069A1 (en) | Protein aptamers based on unstructured scaffold proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130308 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140717 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140908 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150205 |