JP2012168054A - 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤、液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】性能の再現性が良好なカラム充填剤を提供する。また、該カラム充填剤の製造方法、及び、該カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供する。
【解決手段】親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤であって、前記親水性架橋重合体粒子は、架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られるものである液体クロマトグラフィー用カラム充填剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤に関する。また、本発明は、該液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、及び、該液体クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。

親水性のカラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーは、親水性物質の測定に極めて有益な測定方法であり、現在汎用されている分析手法の一つである。親水性のカラム充填剤を用いた測定モードとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親水性ゲル浸透クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等が挙げられる。

親水性の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤（以下、単にカラム充填剤ともいう）は、無機系高分子粒子、又は、有機系高分子粒子に、親水性基を導入することにより得ることができる。無機系高分子粒子の素材としては、シリカ、セラミックス、ガラス等が挙げられ、有機系高分子粒子の素材としては、ポリスチレン系高分子やアクリル系高分子等の有機合成高分子系素材、ポリアミノ酸や多糖類等の天然高分子系素材等が挙げられる。

無機系カラム充填剤として汎用されているシリカ系充填剤は、中性以上のｐＨ条件下におけるシリカ自体の溶出や、残存するシラノール基による非特異吸着等の欠点が報告されている。また、有機高分子系の中でも天然高分子系充填剤は、親水性が大きく非特異吸着が少ない反面、機械的強度に乏しいため高流速での測定が行えず、測定時間が大幅に延長されるという問題がある。一方、有機合成高分子系カラム充填剤は、上記無機系カラム充填剤や上記天然高分子系カラム充填剤が有する欠点が少なく、簡便な方法により製造できる利点がある。

有機合成高分子系カラム充填剤として、例えば、特許文献１には、親水性基であるカルボキシル基を含有する単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合し、共重合して得られるイオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤が開示されている。また、特許文献２には、疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性基を有する親水性単量体を重合させたカラム充填剤が開示されている。

しかし、これらの有機合成高分子系カラム充填剤は、液体クロマトグラフィーに適用した場合の性能にロット間等のバラツキが認められる。再現性の良いカラム充填剤を得るためには、有機合成高分子を得るための重合反応の諸条件を、厳密に制御する必要があった。しかしながら、その制御は困難であり、収率の低下を招く場合が多い。一般に、カラム充填剤、及び、充填カラムは高価であるため、収率の低下はコスト抑制の大きな弊害となっていた。

特開昭５７−１７８１５７号公報 特開平０３−０７３８４８号公報

本発明は、性能の再現性が良好なカラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該カラム充填剤の製造方法、及び、該カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。

本発明１は、親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤であって、上記親水性架橋重合体粒子は、架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られるものである液体クロマトグラフィー用カラム充填剤である。
本発明２は、親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤であって、上記親水性架橋重合体粒子は、架橋性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られた架橋重合体粒子の表面に、親水性単量体を重合して得られるものである液体クロマトグラフィー用カラム充填剤である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者は、従来の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の性能の再現性が不良となる要因は、粒度分布の再現性が低いこと、及び、分離性能に大きな影響を及ぼす親水基の導入量の再現性が低いことであると考えた。そこで本発明者は、重合反応の精密制御ではなく、従来省みられなかった、重合反応を行う前の工程において攪拌条件を規定することにより、カラム充填剤の性能の再現性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明１のカラム充填剤は、架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られる親水性架橋重合体粒子からなる。
本発明１のカラム充填剤は、架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌する工程１と、上記工程１を行った後に重合反応を行う工程２を有する方法により、製造することができる。このような液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。

架橋性単量体は、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体であることが好ましい。また、架橋性単量体は、イオン交換基を有さない、又は、イオン交換基を有していても微量である架橋性単量体が好ましい。更に架橋性単量体は、アクリル系の架橋性単量体がより好ましい。
なお、本明細書において上記「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリルレート又はメタクリレート」を意味し、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を意味する。

架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

分散液は、架橋性単量体以外に、必要に応じて非架橋性単量体を含有してもよい。

非架橋性単量体は、アクリル系単量体が好ましく、具体的には例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体等が挙げられる。
（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

非架橋性単量体を用いる場合、非架橋性単量体の含有量は、架橋性単量体１００重量部に対して１００重量部以下であることが好ましい。非架橋性単量体の含有量が１００重量部を超えると、得られる架橋重合体粒子の架橋度が低下してカラム充填剤が耐圧性に劣るものとなり、膨潤や収縮が起きて分離精度が低下しやすくなる。

分散液は、架橋性単量体及び非架橋性単量体以外に、親水性官能基を有する親水性単量体を含有する。親水性官能基は、重合後に得られる架橋重合体粒子に親水性を付与し、かつ、液体クロマトグラフィーによる測定の際に、試料中の各成分との相互作用により分離を行う役割を担う。従って、親水性単量体は、カラム充填剤として適用する測定モードによって、適宜選択できる。

例えば、本発明１のカラム充填剤を、イオン交換クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、１分子中に１個以上のイオン交換基を有する親水性単量体（以下、イオン交換性単量体ともいう）であることが好ましい。
イオン交換基としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等のカチオン交換基、３級アミノ基、４級アンモニウム基等のアニオン交換基等が挙げられる。
なお、本明細書において、イオン交換基には、イオン交換基に付随する構造は問わないため、イオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む（以下、官能基を記載する場合は同様の構造を意味する）。

カルボキシル基を有する単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。

スルホン酸基を有する有単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。

リン酸基を有する単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体等が挙げられる。

３級アミノ基を有する単量体としては、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、及びこれらの誘導体等が挙げられる。

４級アンモニウム基を有する単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルトリエチルアンモニウムクロライド、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクロリイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド及びこれらの誘導体等が挙げられる。

本発明１のカラム充填剤を、イオン交換クロマトグラフィーに用いるための他の方法としては、イオン交換性単量体を用いる代わりに、イオン交換基を有する化合物（以下、イオン交換性化合物ともいう）と反応可能な官能基（以下、反応性基ともいう）を有する親水性単量体（以下、反応性単量体ともいう）を上記架橋重合体粒子の表面に重合し、その後に、該反応性基にイオン交換性化合物を反応させる方法が挙げられる。

反応性基は、非イオン性の親水性基であることが好ましい。
非イオン性の親水性基としては、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。

反応性単量体は、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン、シアノ（メタ）アクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ブチルシアノアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、等が挙げられる。
これらの反応性単量体は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

反応性基にイオン交換性化合物を反応させる方法は、公知の化学反応を用いることができる。架橋重合体粒子の分解等の反応を伴わない条件であれば、これらの公知の化学反応を限定なく用いることができる。

反応性基が水酸基の場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類やクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類をイオン交換性化合物として用いる。これらのイオン交換性化合物と、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子とを水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、イオン交換基を導入できる。
また、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール化反応により、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子と反応させることにより、イオン交換基を導入できる。
更に、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物と水酸基との脱水反応によるエステル化により、上記架橋重合体粒子の表面にカルボキシル基を導入できる。
加えて、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を、水酸化アルカリの水溶液中又は有機溶媒溶液中で、表面に水酸基を有する架橋重合体粒子と反応させることによっても架橋重合体粒子の表面にスルホン酸基を導入できる。

反応性基がエポキシ基又はグリシジル基の場合、表面にエポキシ基又はグリシジル基を有する架橋重合体粒子と硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のイオン交換性化合物とを反応させる方法、表面にエポキシ基又はグリシジル基を有する架橋重合体粒子と三フッ化ホウ素エーテラートとを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等によりイオン交換基を導入できる。

反応性基がアミノ基の場合、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリの水溶液中又は有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、上記のエポキシ基又はグリシジル基の場合と同様の処理を行うことによりイオン交換基を導入できる。

本発明１のカラム充填剤を、ゲル浸透クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、水酸基、又はエポキシ基のような非イオン性親水基を１分子中に１個以上有する親水性単量体であることが好ましい。例えば、上記のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類等の単量体類が挙げられる。

本発明１のカラム充填剤を、順相クロマトグラフィーに用いる場合に使用する親水性単量体は、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、水酸基のような非イオン性親水基を１分子中に１個以上有する親水性単量体であることが好ましい。例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類を有する単量体の他に、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、等のアクリルアミド類及びこれらの誘導体等の単量体類が挙げられる。

親水性単量体は、アクリル系単量体であることが好ましい。また、親水性単量体は、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩類、塩化物等でもよい。
親水性単量体は、２種類以上を混合して用いてもよく、上述した各測定モードに限定されず、他の測定モードに使用したり、他の測定モードに挙げた単量体と混合して用いたりしてもよい。また、親水性単量体として、１分子中に同一の複数の官能基を有する単量体を用いてもよく、１分子中に異なる種類の官能基を有する単量体を用いてもよい。

分散液における親水性単量体の含有量は、架橋性単量体、又は、架橋性単量体と非架橋性単量体との混合物（以下、両者を合わせて「単量体混合物」ともいう）１００重量部に対して、好ましい下限は１０重量部、好ましい上限は２００重量部である。上記親水性単量体の含有量が１０重量部未満であると、得られるカラム充填剤を用いた場合の分離性能が低下することがある。親水性単量体の含有量が２００重量部を超えると、親水性が大きくなり、耐圧性や耐膨潤性が低下することがある。また、複数の溶離液を用いて測定を行う場合に、溶離液の切り替え時における平衡化に長時間を要し、測定時間が延長することがある。

水性分散媒としては、水、水溶性有機溶媒、水と水溶性有機溶媒との混合物等が挙げられる。
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。
水溶性有機溶媒を水との混合物として用いる場合、上記水溶性有機溶媒の濃度の好ましい上限は２０重量％である。

水性分散媒の使用量は、上記単量体混合物及び上記親水性単量体（以下、単量体類ともいう）１００重量部に対して、好ましい下限は２００重量部、好ましい上限は１万重量部である。

分散液は、必要に応じて、界面活性効果を有する物質（以下、分散剤ともいう）を含有してもよい。
分散剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デンプン、ヒドロキシセルロース、ポリビニルエーテル等の水溶性高分子化合物や、リン酸カルシウム等の無機塩類や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤や、ポリオキシエチレンノニルフェニールエーテル、ポリエチレングリコールモノステアリレート、ソルビタンモノステアリレート等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

分散液中の分散剤の含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は２０重量％である。上記分散剤の含有量が０．０１重量％未満であると、添加した単量体が分散しにくくなり、凝集物が発生しやすくなる。分散剤の含有量が２０重量％を超えると、得られる親水性架橋重合体粒子の粒径が小さくなり、重合中に凝集物が発生しやすくなる。分散剤の含有量のより好ましい下限は０．１重量％、より好ましい上限は１０重量％である。

分散液は、その他に公知の各種添加剤を含有してもよい。
添加剤としては、例えば、ｐＨ調節剤、消泡剤、得られる親水性架橋重合体粒子にマクロポアを形成させるための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、単量体混合物の溶解度を調節するための有機化合物又は無機化合物等が挙げられる。

「架橋性単量体の融点以上」とは、複数の架橋性単量体を使用する場合は、全ての架橋性単量体の融点以上であることを意味し、上記非架橋性単量体を併用する場合は、全ての架橋性単量体、及び、非架橋性単量体の融点以上であることを意味する。
「実質的に重合反応が進行しない温度」とは、その温度で少なくとも１時間撹拌を行った場合に生じる重合物が、単量体類全量の１０重量％以下となる温度を意味する。具体的には、単量体類として上記例示したものを用い、重合開始剤として下記例示するものを用いる場合、５〜４０℃であることが好ましい。分散液を攪拌する際の温度が５℃未満であると、単量体類の一部が凍結して均一に撹拌することが困難となる。分散液を攪拌する際の温度が４０℃を超えると、撹拌中に単量体類の一部が重合し、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。分散液を攪拌する際の温度のより好ましい下限は１０℃、より好ましい上限は３０℃である。

架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度にて分散液を攪拌する際の撹拌時間の下限は１時間である。撹拌時間が１時間未満であると、分散液の単量体類が安定せず、得られる親水性架橋重合体粒子の粒径の再現性が悪くなる。撹拌時間の好ましい下限は３時間、より好ましい下限は５時間である。
撹拌時間は長時間行っても操作時間が延長するのみで再現性や分離性能を向上する効果は得られない。また、反応系が上述した「実質的に重合反応が進行しない温度」であっても、重合が進行してしまう可能性があるため、実質的には、撹拌時間の好ましい上限は４８時間である。

重合反応としては、公知の重合方法を用いることができる。例えば、ラジカル反応による重合反応を行う場合、ラジカル発生源である重合開始剤の存在下において、重合開始剤がラジカルを発生するための開始反応を行うことにより実施する。開始反応は、重合開始剤の添加操作、加温、エネルギー線照射など公知の技術により行うことができる。重合開始剤を添加した後に加温する方法が好ましく、重合開始剤を溶解した単量体類を水性分散媒中に添加し、加温する方法がより好ましい。

重合開始剤としては、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることが好ましく、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物や、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等のアゾ化合物や、これらの誘導体類等が挙げられる。

重合開始剤の使用量は、単量体類１００重量部に対して、好ましい下限は０．０５重量部、好ましい上限は５重量部である。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満であると、重合反応が充分に進行せず、未反応の単量体が反応系に残存する可能性がある。また、重合反応を完了させるために長時間を要し、作業効率が低下する。重合開始剤の使用量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生しやすくなる。

重合反応を加温により行う場合、反応温度の好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。反応温度が４０℃未満であると、温度を制御することが困難であり、反応に長時間を要する場合がある。反応温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
また、重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は４８時間である。反応時間が０．３時間未満であると、単量体類の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。反応時間が４８時間を超えると、凝集物が発生しやすくなる。

重合反応を行った後、得られた重合物を反応系より取り出し、必要に応じて、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合物等で洗浄することにより、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体を有する親水性架橋重合体粒子を得ることができる。また、得られた親水性架橋重合体粒子に、必要に応じて、公知の技術による親水化処理を行ってもよい。
親水化処理は、例えば、特開２００１−９１５０５号公報に開示されている、ヘモグロビン、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、糖類、ノニオン系界面活性剤等の親水基を有する化合物を吸着させる方法や、特開２００４−２９５３６８号公報に記載の方法によるオゾン処理を行う方法等が好ましい。

本発明２のカラム充填剤は、本発明１のカラム充填剤において、架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌する攪拌工程の前に単量体混合物とともに親水性単量体を水性分散媒に添加せず、単量体混合物の重合反応を進行させた後、得られた架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合させること以外は、本発明１と同様の条件により得られる親水性架橋重合体粒子からなる。
本発明２のカラム充填剤において、測定試料に相互作用を及ぼす親水性官能基は、架橋重合体の表面付近にのみ存在するため、より高い分離性能を得ることができる。

本発明２のカラム充填剤における架橋重合体粒子を構成する単量体混合物は、本発明１のカラム充填剤の場合と同様の単量体混合物であることが好ましく、用いる水性分散媒や重合開始剤も、本発明１のカラム充填剤の場合と同様のものを用いることが好ましい。本発明２のカラム充填剤における親水性単量体としては、本発明１のカラム充填剤の場合と同様に、カラム充填剤を適用する測定モードによって選択することができ、本発明１のカラム充填剤の場合と同様の親水性単量体が挙げられる。

本発明２のカラム充填剤において、「実質的に重合反応が進行しない温度」とは、その温度で少なくとも１時間撹拌を行った場合に生じる重合物が、単量体混合物全量の１０重量％以下となる温度を意味する。具体的には、単量体混合物として上記例示したものを用い、重合開始剤として上記例示するものを用いる場合、５〜４０℃であることが好ましい。分散液を攪拌する際の温度が５℃未満であると、単量体混合物の一部が凍結して均一に撹拌することが困難となる。分散液を攪拌する際の温度が４０℃を超えると、撹拌中に単量体混合物の一部が重合し、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。分散液を攪拌する際の温度のより好ましい下限は１０℃、より好ましい上限は３０℃である。

以下に、本発明２の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造する方法を示す。
まず、単量体混合物を分散してなる分散液を、本発明１のカラム充填剤の場合と同様にして攪拌した後、単量体混合物を、重合反応が完了するまで重合して得られた架橋重合体が水性分散媒に分散してなる分散液に、親水性単量体を添加する。その後、架橋重合体粒子及び親水性単量体を含有する分散液を用いて、重合開始剤の存在下で重合反応を行うことにより、架橋重合体粒子の表面において親水性単量体を重合させることができる。

架橋重合体粒子の表面で効率よく親水性単量体を重合させるには、予め架橋重合体粒子内に重合開始剤を含有させておくことが好ましい。架橋重合体粒子に重合開始剤を含有させる方法としては、例えば、架橋重合体粒子を膨潤させることができ、かつ重合開始剤を溶解できる有機溶媒に重合開始剤を溶解し、更に架橋重合体粒子をこの有機溶媒に含浸させる方法等が挙げられる。

加温により親水性単量体の重合反応を行う場合、反応温度の好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。親水性単量体の重合反応の反応温度が４０℃未満であると、反応に長時間を要する場合がある。親水性単量体の重合反応の反応温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
親水性単量体の重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は１２時間である。親水性単量体の重合反応における反応時間が０．３時間未満であると、親水性単量体の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。親水性単量体の重合反応における反応時間が１２時間を超えると、凝集物が発生しやすくなる。親水性単量体の重合反応における反応時間のより好ましい下限は１時間、より好ましい上限は６時間である。

親水性単量体の重合反応を行った後、得られた重合物を反応系より取り出し、必要に応じて、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合物等で洗浄することにより、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体を有する親水性架橋重合体粒子を得ることができる。また、本発明１のカラム充填剤の場合と同様に、得られた親水性架橋重合体粒子に、必要に応じて、公知の技術による親水化処理を行ってもよい。

本発明２のカラム充填剤の製造する別の方法としては、単量体混合物の重合反応によって架橋重合体粒子を調製する際の重合反応が完了する前、即ち、重合開始剤が完全に消費される前に、親水性単量体を添加して架橋重合体粒子の表面において親水性単量体を重合させる方法が挙げられ、この方法によれば、最初に添加した重合開始剤を利用して、架橋重合体粒子の表面に効率よく親水性単量体を重合させることができる。

本発明２のカラム充填剤を製造する方法であって、架橋性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、上記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌する工程１と、上記工程１を行った後に第１の重合反応を行い、架橋重合体粒子を得る工程２と、上記第１の重合反応が完了する前に親水性単量体を添加して第２の重合反応を行い、上記架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合する工程３を有するカラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。

第１の重合反応を加温により行う場合、第１の重合反応の反応温度は、使用する単量体の種類、及び、重合開始剤の種類により異なるが、好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。第１の重合反応の反応温度が４０℃未満であると、反応に長時間を要することがある。第１の重合反応の反応温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
第１の重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は１２時間である。第１の重合反応における反応時間が０．３時間未満の場合、単量体混合物の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。第１の重合反応における反応時間が１２時間を超えると、重合開始剤が消費され、第２の重合反応の反応率が低下することがある。第１の重合反応における反応時間のより好ましい下限は１時間、より好ましい上限は６時間である。

第１の重合反応が完了する前に、反応系に親水性単量体を添加する際の親水性単量体の添加方法は、使用する親水性単量体の種類、及び、添加量に応じて最適な手法を選択することができる。例えば、親水性単量体の全量を一括して添加する方法、その一部を分割して添加する方法、数分〜数時間かけて添加する方法等が挙げられる。また、親水性単量体の添加時に反応系の温度を変化させてもよい。

第２の重合反応を加温により行う場合、第２の重合反応の反応温度は、使用する単量体の種類、及び、重合開始剤の種類により異なるが、好ましい下限は４０℃、好ましい上限は１００℃である。第２の重合反応の反応温度が４０℃未満であると、温度を制御することが困難であり、反応に長時間を要する場合がある。第２の重合反応の反応温度が１００℃を超えると、凝集物が発生しやすくなる。
第２の重合反応における反応時間の好ましい下限は０．３時間、好ましい上限は１２時間である。第２の重合反応における反応時間が０．３時間未満であると、親水性単量体の重合が不充分となり、得られるカラム充填剤の性能の再現性が低下することがある。第２の重合反応における反応時間が１２時間を超えると、主に親水性単量体の単独重合物による凝集物が発生しやすくなる。第２の重合反応における反応時間のより好ましい下限は１時間、より好ましい上限は６時間である。

第２の重合反応を行った後、得られた重合物を反応系より取り出し、必要に応じて、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合物等で洗浄することにより、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体を有する親水性架橋重合体粒子を得ることができる。また、本発明１のカラム充填剤の場合と同様に、得られた親水性架橋重合体粒子に、必要に応じて、公知の技術による親水化処理を行ってもよい。

本発明１のカラム充填剤及び本発明２のカラム充填剤（以下、本発明のカラム充填剤ともいう）は、カラムに充填することにより、液体クロマトグラフィーに適用することができる。本発明のカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーでは、公知の構成による液体クロマトグラフ、及び、公知の組成による溶離液を用いることができる。

本発明のカラム充填剤は、特にヘモグロビン類の測定において有効である。
本発明１のカラム充填剤又は本発明２のカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。

本発明のヘモグロビン類の測定方法は、健常人血に含まれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を短時間で高精度に測定することができる。更に、異常ヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等を測定することができる。

本発明によれば、性能の再現性が良好なカラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該カラム充填剤の製造方法、及び、該カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。

実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例１で得られたカラム充填剤を用いて、健常人血のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例２で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例３で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例４で得られたカラム充填剤を用いて、糖類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例５で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例５で得られたカラム充填剤を用いて、健常人血のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例６で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例７で得られたカラム充填剤を用いて、タンパク質類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例８で得られたカラム充填剤を用いて、糖類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例５で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例５で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例５で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含むヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例５で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含むヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（実施例１）
実施例１では、カチオン交換クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明１のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１５０ｇ、並びに、親水性単量体として２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）１００ｇ、並びに、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、分散剤として５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、２５℃で８時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２４時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は８．２μｍであった。

（２）カラムへの充填
「（１）カラム充填剤の調製」で得られたカラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散して撹拌し、スラリー化した。５分間超音波処理した後、スラリー全量を、ステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（アズワン社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、圧力２０ＭＰａで送液して、定圧充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価１

「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、タンパク質類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ａ：１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ６．９）
溶出条件：溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント
流速 ：１．５ｍＬ／分
測定試料：トリプシノーゲン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の混合物

得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において、ピーク１はトリプシノーゲン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチームを示す。図１より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リゾチームの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリゾチームの保持時間のＣＶ値は３．２％となり、再現性は良好であった。

（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、健常人血中のヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビン類の測定を行った。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：４１５ｎｍ
溶離液Ｃ：３０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｄ：２２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）
溶出条件：溶離液Ｃ１００％から溶離液Ｄ１００％へのステップグラジエント
流速 ：１．５ｍＬ／分
測定試料：フッ化ナトリウム採血した健常人血を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１８０倍に溶血希釈したもの

得られたクロマトグラムを図２に示す。図２において、ピーク１１はヘモグロビンＦ、ピーク１２はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク１３はヘモグロビンＡ０を示す。図２より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は２．４％となり、再現性は良好であった。

（５）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２」を行い、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を確認した。なお、各ロットの測定を３回実施した際の平均値を該当ロットの測定値とした。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は３．８％となり、再現性は良好であった。

（実施例２）
実施例２では、アニオン交換クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明１のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、親水性単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇ、及び、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２０００ｍＬの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を２０℃で２０時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２４時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は６．７μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いてタンパク質類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ｅ：５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）
溶離液Ｆ：溶離液Ｅ＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ８．２）
溶出条件：溶離液Ｅ１００％から溶離液Ｆ１００％へのリニアグラジエント
流速 ：１．５ｍＬ／分
測定試料：コンアルブミン、オブアルブミン、トリプシンインヒビターの混合物

得られたクロマトグラムを図３に示す。図３において、ピーク２１はコンアルブミン、ピーク２２はオブアルブミン、ピーク２３はトリプシンインヒビターを示す。図３より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は３．４％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は４．７％となり、再現性は良好であった。

（実施例３）
実施例３では、水系ゲル浸透クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明１のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、親水性単量体として２−ヒドロキシエチルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇ、非架橋性単量体としてポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）１００ｇ、及び、トルエン４００ｇ、並びに、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２５００ｍＬの６重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を、１５℃で１０時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２４時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は１０．５μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤３．２ｇをステンレス製空カラム（６．０φ×１００ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて分子量標準物質の混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出器 ：示差屈折計ＳＥ−５１（昭和電工社製）
溶離液Ｇ：６０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウムを含む８０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
流速 ：１．２ｍＬ／分
測定試料：チログロブリン（分子量６４万）、γ−グロブリン（分子量１５５０００）、オブアルブミン（分子量４７０００）、リボヌクレアーゼ（分子量１３７００）（以上、いずれも和光純薬工業社製）の混合物

得られたクロマトグラムを図４に示す。図４において、ピーク３１はチログロブリン、ピーク３２はγ−グロブリン、ピーク３３はオブアルブミン、ピーク３４はリボヌクレアーゼを示す。図４より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は４．３％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は４．９％となり、再現性は良好であった。

（実施例４）
実施例４では、順相クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明１のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（共栄社化学社製）１００ｇ、及び、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、親水性単量体として２−アミノエチルメタクリレート（日油社製）１００ｇ、並びに、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２０００ｍＬの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を、３０℃で５時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２４時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は５．５μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて糖類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ｈ：アセトニトリル：水＝７５：２５の混合水溶液
流速 ：１．０ｍＬ／分
測定試料：フルクトース、グルコース、シュクロース、マルトース（以上、いずれも和光純薬工業社製）の混合物

得られたクロマトグラムを図５に示す。図５において、ピーク４１はフルクトース、ピーク４２はグルコース、ピーク４３はシュクロース、ピーク４４はマルトースを示す。図５より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、マルトースの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は３．２％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、マルトースの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は３．９％となり、再現性は良好であった。

（実施例５）
実施例５では、カチオン交換クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明２のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体として、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（新中村化学工業社製）６０ｇを混合して得られた単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール水溶液２０００ｍＬに分散させた。得られた分散液を、２５℃で１５時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行った。
次に、親水性単量体として２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）２００ｇ、及び、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）５０ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解して得られた混合物を添加し、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は７．５μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤０．７ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×２５ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価１

「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、タンパク質類の標準物質混合物を測定した。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：２８０ｎｍ
溶離液Ａ：１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ５．７）
溶出条件：溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント
流速 ：１．５ｍＬ／分
測定試料：トリプシノーゲン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の混合物

得られたクロマトグラムを図６に示す。図６より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リゾチームの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリゾチームの保持時間のＣＶ値は０．９％となり、再現性は良好であった。

（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用いて、健常人血中のヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビン類の測定を行った。測定条件を以下に示す。
システム：ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）
検出波長：４１５ｎｍ
溶離液Ｉ：１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｊ：３２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）
溶出条件：溶離液Ｉ１００％から溶離液Ｊ１００％へのステップグラジエント
流速 ：１．２ｍＬ／分
測定試料：フッ化ナトリウム採血した健常人血を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１８０倍に溶血希釈したもの

得られたクロマトグラムを図７に示す。図７より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は０．８％となり、再現性は良好であった。

（５）重合再現性の評価
「（１）カラム充填剤の調製」と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（４）液体クロマトグラフィーによる性能評価２」を行い、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のヘモグロビンＡ１ｃの保持時間のＣＶ値は２．１％となり、再現性は良好であった。

（実施例６）
実施例６では、アニオン交換クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明２のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてテトラメチロールプロパントリアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、及び、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、並びに、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２０００ｍＬの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を、１５℃で１０時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２時間重合反応を行った。
次に、親水性単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート（和光純薬工業社製）２００ｇを溶解した５０重量％のメタノール水溶液３００ｍＬを添加し、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で１．５時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は７．９μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用い、実施例２と同様の条件で、タンパク質類の標準物質混合物を測定した。得られたクロマトグラムを図８に示す。図８より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また、同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は１．０％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
実施例２と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、トリプシンインヒビターの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のトリプシンインヒビターの保持時間のＣＶ値は１．５％となり、再現性は良好であった。

（実施例７）
実施例７では、水系ゲル浸透クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明２のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、非架橋性単量体としてポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）１００ｇ、及び、トルエン３００ｇ、並びに、ベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２５００ｍＬの６重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を、１０℃で１８時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して０．８時間重合反応を行った。
次に、親水性単量体として２，３−ジヒドロキシルエチルメタクリレート（日油社製）２００ｇを溶解した４０重量％のメタノール水溶液３００ｍＬを添加し、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２．２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして、得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は１０．３μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤３．２ｇをステンレス製空カラム（６．０φ×１００ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用い、実施例３と同様の条件で、タンパク質類を測定した。得られたクロマトグラムを図９に示す。図９より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は１．９％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
実施例３と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、リボヌクレアーゼの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のリボヌクレアーゼの保持時間のＣＶ値は２．３％となり、再現性は良好であった。

（実施例８）
実施例８では、順相クロマトグラフィー用のカラム充填剤として本発明２のカラム充填剤を調製し、性能を確認した。

（１）カラム充填剤の調製
架橋性単量体としてテトラメチロールプロパントリアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、及び、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、並びに、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解し、２０００ｍＬの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。得られた分散液を、２０℃で１５時間撹拌した（撹拌工程）。
次に反応系を窒素雰囲気下で８０℃に加温して２４時間重合反応を行った。
次に、親水性単量体として２−アミノエチルメタクリレート（日油社製）２２０ｇを溶解した４０重量％のメタノール水溶液３００ｍＬを添加し、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２．２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様にして得られたカラム充填剤の粒度分布を測定した結果、平均粒子径は６．３μｍであった。

（２）カラムへの充填
実施例１と同様に操作して、得られたカラム充填剤１．４ｇをステンレス製空カラム（４．６φ×５０ｍｍ）に充填した。

（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価
「（２）カラムへの充填」で得られたカラムを用い、実施例３と同様の条件で糖類を測定した。得られたクロマトグラムを図１０に示す。図１０より、各ピークが短時間で良好に分離できることを確認した。また同様の測定を１０回連続して繰り返した際の、マルトースの保持時間の再現性を表１に示す。１０回連続して測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は１．４％となり、再現性は良好であった。

（４）重合再現性の評価
実施例４と同様の条件により、カラム充填剤を２０回（２０ロット）調製した。各ロットについて、「（３）液体クロマトグラフィーによる性能評価」を行い、マルトースの保持時間の再現性を確認した。得られた結果を表１に示す。２０ロット測定した際のマルトースの保持時間のＣＶ値は２．５％となり、再現性は良好であった。

（比較例１〜８）
比較例では、本発明における撹拌工程の条件を満たさないカラム充填剤を調製した。比較例１〜８における撹拌工程の条件を表１に示す。
撹拌工程以外の条件は、比較例１は実施例１、比較例２は実施例２、比較例３は実施例３、比較例４は実施例４、比較例５は実施例５、比較例６は実施例６、比較例７は実施例７、比較例８は実施例８と同様に操作してカラム充填剤を調製した。比較例４及び比較例６では、攪拌工程において、分散液中の単量体類や単量体混合物の一部が凍結して均一に撹拌することができなかった。
比較例における、保持時間による重合再現性（ｎ＝２０）の評価結果を表１に示す。実施例に比較してＣＶ値が大きな値となった。

（分離性能の性能評価）
撹拌工程の条件を規定したことによる、カラム充填剤の分離性能への影響を確認するため、実施例及び比較例のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、種々のヘモグロビン類を測定し、分離性能を評価した。

（１）修飾ヘモグロビン類の測定
実施例１、実施例５、比較例１、及び、比較例５のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類の測定を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温して調製した。試料Ａは、健常人血に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温して調製した。試料Ｃは、健常人血に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温して調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出し、両者を比較して評価した。結果を表２に示す。
表２より、実施例１、実施例５のカラム充填剤を用いた場合のΔ値は０．２％以下と小さく、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できた。一方、比較例１、比較例５のカラム充填剤を用いた場合はΔ値が大きく、ヘモグロビンＡ１ｃ値が、修飾ヘモグロビン類の影響を受けた。

（２）異常ヘモグロビン類の測定
実施例５及び比較例５のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンであるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を測定した。
実施例５のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図１１に示す。図１１において、ピーク１４はヘモグロビンＳ、ピーク１５はヘモグロビンＣを示す。図１１より、実施例５で得られたカラム充填剤を用いた場合は、異常ヘモグロビン類を良好に分離できた。比較例５で得られたカラム充填剤を用いた場合は、図１２に示すように、異常ヘモグロビン類の分離性能は悪かった。

（３）ヘモグロビンＡ２の測定
実施例５及び比較例５のカチオン交換クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料（バイオラッド社製、「Ａ２コントロール（レベル２）」）を測定した。
実施例５の充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図１３に示す。図１３において、ピーク１６はヘモグロビンＡ２を示す。図１３より、実施例５で得られたカラム充填剤を用いた場合は、ヘモグロビンＡ２を良好に分離できた。比較例５ので得られたカラム充填剤を用いた場合は、図１４に示すようにヘモグロビンＡ２を分離できなかった。
上記のヘモグロビン類の測定性能評価から、撹拌工程の条件を規定したことにより、カラム充填剤の重合再現性だけでなく、分離性能も向上した。

本発明によれば、性能の再現性が良好なカラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該カラム充填剤の製造方法、及び、該カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。

１ トリプシノーゲン
２ α−キモトリプシノーゲン
３ リボヌクレアーゼＡ
４ リゾチーム
１１ ヘモグロビンＦ
１２ ヘモグロビンＡ１ｃ
１３ ヘモグロビンＡ０
１４ ヘモグロビンＳ
１５ ヘモグロビンＣ
１６ ヘモグロビンＡ２
２１ コンアルブミン
２２ オブアルブミン
２３ トリプシンインヒビター
３１ チログロブリン
３２ γ−グロブリン
３３ オブアルブミン
３４ リボヌクレアーゼ
４１ フルクトース
４２ グルコース
４３ シュクロース
４４ マルトース

Claims (7)

1. 親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤であって、
   前記親水性架橋重合体粒子は、架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られるものである
   液体クロマトグラフィー用カラム充填剤。
2. 請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤を製造する方法であって、
   架橋性単量体及び親水性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌する工程１と、
   前記工程１を行った後に重合反応を行う工程２を有する
   液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
3. 架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合が進行しない温度が、５〜４０℃である請求項２記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
4. 親水性架橋重合体粒子からなる液体クロマトグラフィー用カラム充填剤であって、
   前記親水性架橋重合体粒子は、架橋性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌した後に重合反応を行って得られた架橋重合体粒子の表面に、親水性単量体を重合して得られるものである
   液体クロマトグラフィー用カラム充填剤。
5. 請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤を製造する方法であって、
   架橋性単量体が水性分散媒に分散してなる分散液を、前記架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合反応が進行しない温度で１時間以上撹拌する工程１と、
   前記工程１を行った後に第１の重合反応を行い、架橋重合体粒子を得る工程２と、
   前記第１の重合反応が完了する前に親水性単量体を添加して第２の重合反応を行い、前記架橋重合体粒子の表面に親水性単量体を重合する工程３を有する
   液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
6. 架橋性単量体の融点以上、かつ、実質的に重合が進行しない温度が、５〜４０℃である請求項５記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法。
7. 請求項１又は４記載の液体クロマトグラフィー用カラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法。

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