JP2012019742A - イネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】イネスターチシンターゼ及びイネ枝作り酵素の変異した新規イネ変異体を提供する。
【解決手段】
イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されているイネ変異体を得る。このイネ変異体は、ＳＳＩＩＩａ活性が野生型に比べて低下している。また、野生型や親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている。さらに、このこのイネ変異体により生成される澱粉は、イネでは類い希な高アミロースの澱粉であり、アミロースの割合が４０％以上であることを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、イネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法に係り、特にイネスターチシンターゼ及びイネ枝作り酵素に変異をもったイネ変異体、澱粉の製造方法、澱粉、及びイネ変異体の製造方法に関する。

澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖およびα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。

澱粉の生合成には、少なくとも４種類の酵素が関与していることが分かっている。この４種類の酵素は、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付加した余分な枝分かれ構造をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）である。
しかしながら、澱粉生合成に関与する酵素は、他にもあると考えられている（非特許文献１参照）。

このように、植物の澱粉生合成には少なくとも４種類の酵素が関与している。
加えて、高等植物の場合、これらの酵素には多数のアイソザイムが存在し、澱粉生合成に関与している。アイソザイムは、同様の酵素反応を触媒するアミノ酸配列の異なる酵素群のことである。たとえば、イネには、１０種類ものＳＳ、３種類ものＢＥ、４種類ものＤＢＥが存在する。
近年、これらのアイソザイムは、組織特異性や、微妙な基質特異性によって、役割分担をしていることが分かってきた。
このようなアイソザイムの働きや役割を解明することは、アイソザイムの機能解明につながる。そして、アイソザイムの機能解明は、植物の澱粉生合成メカニズムの全体像の解明には欠かせない。
このため、従来から各アイソザイムの変異体が開発されてきた。特定のアイソザイムが欠失した変異体の表現型を調べることで、そのアイソザイムの働きや役割を知ることができる。

たとえば、各アイソザイムの機能を明確にするために、イネにおいて既に単離され、分析されている変異体には、ＳＳＩ（非特許文献２、特許文献１）、ＳＳＩＩａ（非特許文献３、特許文献２）、ＳＳＩＩＩａ（非特許文献４、特許文献３）、ＧＢＳＳＩ（非特許文献５）、ＢＥＩ（非特許文献６）、ＢＥＩＩｂ（非特許文献７、特許文献２）、ＩＳＡ１（非特許文献８）、ＰＵＬ（非特許文献９、特許文献４）、ＰＨＯ（非特許文献１０）などがある。
これらの変異体は、胚乳に蓄積する澱粉の構造が野生型とは異なることがある。その構造の違いに伴い、澱粉粒の大きさが異なる等の物性を示すことがある。

特開２００３−７９２６０号公報 特許第４３５８００６号 特開２００６−５１０２３号公報 特開２００７−２０４７５号公報

Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ： ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、、ｐ．７１８−７２５ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ， ２００６年、１４０、、ｐ．１０７０−１０８４ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． 、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、、、２００５年、５８、、ｐ．２１３−２２７ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）； ｔｈｅ ｆｕｃｎｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ＳＳＩＩＩａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００７年４月、１４４、４、ｐ．２００９−２０２３ Ｙ． Ｓａｎｏ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｘｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ、、、１９８４年、６８、、ｐ．４６７−４７３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｓｔａｒｃｈ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｉ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、１３３、、ｐ．１１１１−１１２１ Ａ． Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、、ｐ．４５９−４７２ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ α−ｐｏｌｙｇｌｕｃａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ ｏｆ ｓｕｇａｒｙ−１ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、イギリス、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９９７年、１２、、ｐ．１４３−１５３ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００９年３月、６０、３、ｐ．１００９−１０２３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｐｌａｓｔｉｄｉｃ α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、２０、、ｐ．１８３３−１８４９ Ｔ． Ｈｉｒｏｓｅ他、Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）．、Ｐｌａｎｔａ、、、２００４、２２０、、ｐ．９−１６ Ｔ． Ｏｈｄａｎ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｉｎｋ ａｎｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｒｉｃｅ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００５年１２月、５６、４２２、ｐ．３２２９−３２４４

このように、従来の澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、それぞれの単一の変異体の効果については、明らかになりつつあった。
しかしながら、複数の変異体を組み合わせた劣性ホモの作成は難しいものの、特に特別な表現型を示すとは考えられていなかった。
このうち、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の組み合わせについても知られていなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

本発明のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されていることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、更に、ＳＳＩＩＩａ活性及びＢＥＩＩｂ活性が野生型に比べて低下したことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、野生型、ＳＳＩＩＩａの遺伝子座が劣性の親系統、又はＢＥＩＩｂの遺伝子座が劣性の親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されていることを特徴とする。
本発明の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体を用いたことを特徴とする。
本発明の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体の胚乳を用いたことを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉の製造方法により製造されたことを特徴とする。
本発明の澱粉は、野生型イネ、ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉とは形状が異なることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、大きさに差異のある澱粉粒が含まれ、該大きさに差異のある澱粉粒の表面がなめらかであることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、糊化粘度特性が異なることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉は、アミロースの割合が４０％以上であることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉のアミロペクチンは、Ｂ形結晶であることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉の糊化粘度パターンが低粘度であることを特徴とする。
本発明の澱粉は、前記澱粉は、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、老化性が高いことを特徴とする。
本発明のイネ変異体の製造方法は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体とイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）変異体との二重劣性ホモであることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ変異体の製造方法により製造することを特徴とする。

本発明によれば、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの両方の遺伝子座が劣性ホモであることで、ＳＳＩＩＩａ単独の変異体、ＢＥＩＩｂ単独の変異体、野生型とは形状や性質が違う澱粉を製造できるイネ変異体を提供することができる。

本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴、金南風）の完熟玄米および切片の形態を示す写真である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）との完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布（Ａ，Ｍｏｌａｒ ％）と、それぞれから野生型（日本晴）のパターンを引いた差分（Ｂ，ΔＭｏｌａｒ ％）を示すグラフである。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉および精製アミロペクチンのゲル濾過パターンを示すグラフである。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉粒を走査型電子顕微鏡で観察した写真である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉粒のＸ線回折パターンを示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉懸濁液の糊化特性パターン（動的粘弾性）を示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉糊の粘度特性パターンを示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉糊の冷却時の貯蔵弾性率を示す図である。 本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法およびウエスタンブロッティングによる酵素活性およびタンパク質の欠失の結果を示す図である。

＜実施の形態＞
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
従来、いくつかの澱粉生合成に係るアイソザイムの変異体については、研究が進んでいる。たとえば、ＳＳＩＩＩａの変異体（ΔＳＳＩＩＩａ）と、ＢＥＩＩｂの変異体（ΔＢＥＩＩｂ）においては、既に澱粉の構造、物性が分かってきていた。
しかしながら、ＳＳＩＩＩａの変異体とＢＥＩＩｂの変異体を組み合わせた二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）は存在しなかった。この理由として、二重変異体は、通常、２つの変異体の表現型を合わせたものになるだけであり、また作成が難しいため、当業者においては二重変異体を作成するという動機付けがなかったためである。
これに対して、本発明の発明者は、イネの澱粉の代謝系を網羅的に研究し、有益な表現型をもつ二重変異体を探索し、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）には予想できない効果が得られることを見いだした。
本発明の発明者が作出したＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）は、両親変異体及び野生型と比べて、以下の特徴があった。

まず、図１を参照して、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）のクローン＃４０１９、その親変異体であるＳＳＩＩＩａの単一変異体（ΔＳＳＩＩＩａ）のクローンｅ１、もう１つの親変異体であるＢＥＩＩｂの単一変異体（ΔＢＥＩＩｂ）のクローンＥＭ１０と、コントロールである日本晴の野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のクローンの完熟玄米および切片の形態について説明する。各クローンにおいて、左図は完熟玄米の全体形状の写真、右図は切片の形態の写真である。以下、同一の符号を付したクローンは、同一のものを示す。
なお、ＥＭ１０は、胚の突然変異源であるＭＮＵ（メタンニトロソウレア）処理を用いて選抜した。ＭＮＵ処理は、文献（Ｙａｎｏ， Ｍ．， Ｏｋｕｎｏ， Ｋ．， Ｋａｗａｋａｍｉ， Ｊ．， Ｓａｔｏｈ， Ｈ． ａｎｄ Ｏｍｕｒａ， Ｔ． （１９８５） Ｈｉｇｈ ａｍｙｌｏｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ， Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ６９： ２５３−２５７．）に記載された方法に従って行った。

図１において、ＳＳＩＩＩａ単一変異体（ΔＳＳＩＩＩａ）のクローンであるｅ１の種子は、玄米の中央が白く濁る「心白」形態を示した。一方、ＢＥＩＩｂ単一変異体（ΔＢＥＩＩｂ）のクローンであるＥＭ１０の種子は白濁し、野生型より小さかった。
これに対して、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）のクローンである＃４０１９の種子は、ＢＥＩＩｂ単一変異体のＥＭ１０と同様、玄米全体が白く濁る「白濁」の形態を示したが、種子の大きさはＥＭ１０と比べて大きかった。また、＃４０１９の種子は、種子断片は、中央が白濁しているが、種皮に近い外側は透明であるという特徴を備えていた。

また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの種子重量を測定したところ、野生型の８割以上であった。この測定結果を以下の表１に示す。

表１は、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体のクローンである＃４０１９（ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ）、それらの親変異体のクローンであるｅ１（ΔＳＳＩＩＩａ）及びＥＭ１０（ΔＢＥＩＩｂ）、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）の日本晴と金南風の玄米重量（ｍｇ）について計測したデータを示している。
この表１に示すように、ＳＳＩＩＩａ単一変異体のクローンであるｅ１は、日本晴や金南風の野生型とほぼ同一の大きさであった。
一方、ＢＥＩＩｂ単一変異体のクローンであるＥＭ１０は、野生型の６割程度の種子重量であった。
また、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの二重変異体のクローンである＃４０１９の玄米重量は、野生型の８割以上の８３％と、やや小さかったが、ＥＭ１０よりは大きかった。

次に、図２を参照して、ＳＳＩＩＩａ変異体のアミロペクチンの鎖長分布について説明する。
図２Ａは、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）、それらの親変異体であるΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）及びΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、コントロールの日本晴（野生形）の完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布を示すグラフである。
図２Ｂは、それぞれから野生型である日本晴のＭｏｌａｒ ％を引いた差分をモル比（ΔＭｏｌａｒ ％）にて示すグラフである。ＤＰ（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、グルコースの重合度を示す値である。
まず、ＳＳＩＩＩａの単一変異体のクローンであるｅ１は、代表的な特徴として、鎖長ＤＰ≧３７の長鎖が野生型と比べて７割程度に減少していた。一方、ＢＥＩＩｂの単一変異体のクローンであるＥＭ１０は、ＤＰ≦１３の短鎖が野生型と比べて激減し、その代わりＤＰ≧１４の長鎖が増加していた。
また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのクローン＃４０１９は、ＥＭ１０のパターンに類似してＤＰ６〜１２の短鎖の減少が大きいのが特徴であったが、ＤＰ１０〜１５でＥＭ１０より増加しており、ＤＰ≧１７の長鎖は、ＥＭ１０より減少していた。長鎖の量に関しては、両親の性質を受け継ぎ、二重変異体では両親系統の中間的な量であり、結果的に、野生型よりやや増加していた。

次に、図３を参照して、ゲル濾過パターンについて説明する。図３は、それぞれΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）、親変異体であるΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）及びΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、野生型である日本晴の各クローンのゲル濾過パターンである。それぞれのクローンにおいて、黒い実線は、澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンのグラフである。また、黒の波線「ＡＰ」は、澱粉からアミロペクチンをブタノール法で精製し、これらを澱粉と同様に枝切したものの、ゲル濾過パターンのグラフである。また、灰色の点線「λ ｍａｘ」は、澱粉をゲル濾過した際の澱粉ヨウ素複合体の最大吸光度の波長（λ ｍａｘ（ｎｍ））を示すグラフである。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。
これらを数値化したものを、以下の表２に示す。この表２では、各フラクションの割合と、アミロペクチンの長鎖に対する短鎖の割合（ＩＩＩ／ＩＩ）を示す。

非特許文献４を参照すると、ＳＳＩＩＩａ単一変異体（ΔＳＳＩＩＩａ）は、枝切りした澱粉のゲル濾過の結果、見かけのアミロース含量が日本晴に比べて約１．５倍高い。本実施形態の実験結果においても、日本晴の見かけのアミロース含量は２３．５％であるのに対し、ΔＳＳＩＩＩａのクローンｅ１は３２．５％と約１．４倍の値を示した。
これに対して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのアミロース含量は４６．６％と、ΔＳＳＩＩＩａのクローンｅ１よりもさら１．４倍高かった。また、ΔＢＥＩＩｂでは、短鎖の割合であるＩＩＩ／ＩＩ値が１．１と非常に小さいことから、アミロペクチンの長鎖の割合が非常に大きかった。ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂはΔＢＥＩＩｂほどアミロペクチンの長鎖の割合が大きくはなかったが、日本晴やΔＳＳＩＩＩａよりは高いことが分かった。この結果は、鎖長分布でＤＰ≧３７の長鎖が、ΔＳＳＩＩＩａのクローンｅ１よりは増加していたことと一致する。
澱粉から精製したアミロペクチンのゲル濾過から得られたフラクションＩは、アミロペクチン超長鎖（Ｅｘｔｒａ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ． ＥＬＣ）量を示す。ΔＳＳＩＩＩａおよびΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂは、日本晴やＥＭ１０よりこの値がやや高かかった。
また、見かけのアミロース含量からＥＬＣ量を引いた値が、真のアミロース含量を示す。ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂでは、この真のアミロース含量が４６．６％−２．４％＝４４．２％であり、高い値を示した。
以上のことから、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのアミロース含量は、これまでのイネでは類い希に高い値を示すことが明らかとなった。
これにより、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は、独特の食感が得られ、食品加工分野や添加剤および工業資材として特徴的な製品を製造できると考えられる。

次に、図４を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＳＳＩＶｂの澱粉粒の形状と粒径について説明する。
図４は、走査型電子顕微鏡で観察したΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのクローン＃４０１９、それらの親変異体のクローンｅ１、ＥＭ１０、及び野生型の日本晴の澱粉粒の写真である。
図４を参照すると、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）である日本晴の澱粉粒は、約３〜５μｍの多角形であった。これに対して、ΔＳＳＩＩＩａであるクローンｅ１の澱粉粒は、日本晴のそれよりやや小さく、丸みを帯びた澱粉粒が混入していた。一方、ΔＢＥＩＩｂの澱粉粒は、大小さまざまで表面がごつごつした特徴があった。ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのクローン＃４０１９は、ΔＢＥＩＩｂと同様に大小さまざまな澱粉粒が存在したが、表面がなめらかであり、ピーナッツ状の澱粉粒が見られた。
このピーナッツ状の澱粉粒は、高アミロース澱粉に特徴的な形状である。たとえば、文献（Ｊｉａｎｇ Ｈ， Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｍ， Ｂｌａｎｃｏ Ｍ， Ｊａｎｅ Ｊ−Ｌ （２０１０） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｍｙｌａｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ （ａｅ） ｍｕｔａｎｔ ｓｔａｒｃｈｅｓ： Ｐａｒｔ ＩＩ． Ｓｔｒｕｃｕｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｔ ｂｏｉｌｉｎｇ−ｗａｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ８０： １−１２）を参照すると、トウモロコシの高アミロース澱粉も、ピーナッツ状の澱粉粒を備えていた。

次に、図５を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの胚乳澱粉の結晶性について説明する。
図５の澱粉粒のＸ線回折パターンによると、野生型である日本晴は、典型的なＡ形結晶の特徴を示し、ΔＳＳＩＩＩａであるクローンｅ１も同様にＡ形結晶の特徴を示すが、後者の方が高アミロースであることから、結晶性が低い。なお、高アミロースの澱粉では結晶性が低くなることが、非特許文献４に記載されている。
一方、ΔＢＥＩＩｂであるＥＭ１０の結晶性は、ジャガイモ澱粉等にみられる典型的なＢ形結晶の特徴を示す。なお、Ｂ形結晶の定義については、文献（Ｔａｎａｋａ Ｎ， Ｆｕｊｉｔａ Ｎ， Ｎｉｓｈｉ Ａ， Ｓａｔｏｈ Ｈ， Ｈｏｓａｋａ Ｙ， Ｕｇａｋｉ Ｍ， Ｋａｓａｗａｋｉ Ｓ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ． （２００４） Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩｂ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２： ５０７−５１６．）に記載されている。
ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの胚乳澱粉の結晶性は、ΔＢＥＩＩｂと同様のＢ形結晶の特徴を示したが、ピークの鋭さがΔＢＥＩＩｂと比べて低かったため、高アミロースになったことで結晶性が低下したと考えられる。

次に、図６を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉懸濁液の糊化特性パターンについて説明する。この糊化特性パターンの測定は、所定の温度プログラムにより、動的粘弾性、すなわち粘度特性値の変化をグラフ化することで行う。
野生型である日本晴の粘度特性パターンは、加熱時における明瞭なピークと直後の急激な低下を示した。一方、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）は、粘度特性値の立ち上がり温度が最も高く、ピークを持たず、粘度特性値も低いまま推移した。親変異体であるΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）およびΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）も野生型よりもピーク粘度は低かったが、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）よりも大きかった。
ピーク粘度の低下は澱粉粒の膨潤・糊化が抑制されることを示す（高橋徹、篠田和雄、三浦靖、金哲、小林昭一、加熱処理が米粉の物理化学的特性に及ぼす影響（２００２） 日本食品科学工学会、４９、７５７−７６４．を参照）。

次に、図７を参照して、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）及びそれらの親変異体（ｅ１、ＥＭ１０）と野生型（日本晴）の澱粉糊の粘度特性パターンについて説明する。
３５℃の一定温度で１０分間、一定速度での撹拌した際、野生型である日本晴とΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）の粘度特性パターンは、平坦であった。
一方、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）とΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）の粘度特性パターンは、時間の経過にしたがって上昇し、粘度特性値はΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）のほうが大きかった。このことから、この温度条件におけるΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）の粘度特性パターンは、ΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）の形質に由来していることが示唆された。

次に、図８を参照して、冷却時における動的粘弾性測定による貯蔵弾性率について説明する。
具体的には、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）、これらの親変異体ΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）及びΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）、野生型である日本晴の各澱粉糊試料を３０℃から一定速度（毎分１℃）で下降させ、貯蔵弾性率を測定した。
野生型である日本晴は、温度を下降させても貯蔵弾性率は平坦であり、硬化しなかった。一方、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）、ΔＳＳＩＩＩａ（ｅ１）、ΔＢＥＩＩｂ（ＥＭ１０）の貯蔵弾性率は、温度下降にしたがって急激に増大し、中でも、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）は基の値の３倍以上となり、速やかに硬化することがわかった。これは、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂ（＃４０１９）のアミロース含量が極めて高いことに起因するものである。

また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂは、ΔＢＥＩＩｂに比べて、老化が著しかった。実際に、図８を参照すると、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの二重変異体が他の系統よりも貯蔵弾性率が高いことは、老化が著しいことを示すことを裏付けるデータである。

以上のような本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂから、以下のような性質、効果を得ることができる。
従来の澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、ΔＳＳＩＩＩａとΔＢＥＩＩｂにおいては、澱粉の構造、物性が明らかになっており、各酵素の機能もある程度明確になっている。
しかしながら、ΔＳＳＩＩＩａとΔＢＥＩＩｂを組み合わせた二重変異体は存在せず、両酵素を欠損させた場合の影響については、不明であった。
ここで、通常の場合、二重変異体を作成しても、各変異体のそれぞれの形質がそのまま現れるだけである。たとえば、古典的な遺伝学のメンデルの法則においては、「しわ」の豆の変異体と、「緑色」の豆の変異体を掛け合わせると、「しわ」があり「緑」の変異体となる。また、変異体の作成については、かなりの手間を要する。このような理由から、通常、当業者は二重変異体を作成する動機をもたない。
ところが、本発明の発明者らは、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの二重変異体を作成して両酵素を欠損させた場合の澱粉性質に対する影響を解明したところ、上述したように予期しない効果が得られた。

具体的には、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの変異体からは、特に通常のイネの澱粉とは異なった性質と形状をもつ特性の澱粉を得られる。
これらの特性の中で、特にユニークであるのは、両親変異体より遙かに高いアミロース含量であり、これまで報告されたイネの中では類をみない。また、高いアミロースに起因するであろう老化性の高さから、ピラフやリゾット等の食品に好適に用いることができる。
また、アミロースの含量が高くなると難消化性になるため、各種健康食品やダイエット食品に利用可能である。
また、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの変異体の種子を粉砕した米粉は、パンや麺等に混合させて利用することができる。これにより、通常の米粉のパンとは味わいが異なる風味、口触りの、食感のパンや麺等を製造することができる。
さらに、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの変異体の粉砕物や澱粉は、アミロースの含量が高いことにより、工業的な用途にて使用可能である。これは、生分解性プラスチックなど、整形が必要な場合は、老化性が高い方が有利であるためである。たとえば、アミロースは温水に溶けるため、フィルム状に成形して、生分解性フィルム、医療用材料、縫合糸のような用途に用いることができる。また、体内で吸収分解される性質を用いて、再生医療の「足場」用の部材として用いることが可能である。
さらに、グラスファイバー作成時の資材、工業用糊、建築材料の配合剤、植物栽培用の資財等、様々な工業用途に利用可能である。
このように、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂである二重変異体は産業上利用することができる。

また、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのイネ変異体から作成された澱粉は、アミロペクチンの構造も独特であった。
アミロース含量と異なり、アミロペクチンの構造は、両親変異体の性質を受け継いだ特徴をもっていたものの、それぞれの親変異体の特質を単に組み合わせた以上の顕著な特性をもっていた。
たとえば、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は、ΔＢＥＩＩｂの澱粉と同様に短鎖が大きく減少する特徴があるため、澱粉結晶性はΔＢＥＩＩｂと同様のＢ形結晶であった。このＢ形結晶は、通常のイネ澱粉では見られず、ジャガイモ澱粉等が示す種類の結晶形態である。
しかしながら、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は、ΔＢＥＩＩｂとは澱粉粒の形態が異なっていた。具体的には、大小さまざまな粒が混じることについてはΔＢＥＩＩｂと類似していたが、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は表面がなめらかである点が異なっていた。
さらに、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は、糊化粘度パターンが通常のイネの澱粉とは全く異なり、非常に低粘度であり、老化性も著しく高かった。
これらの特性は、これらの構造及び澱粉粒の特徴に由来すると考えられ、単独の変異体であるΔＳＳＩＩＩａ及びΔＢＥＩＩｂとは大きく異なっている。
これにより、通常とは食感が違う食品、加工品、工業用製品にΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂである二重変異体を用いることが考えられる。
また、本実施形態のΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの澱粉は、これらの特性から、微粉化して醸造用に用いることで、従来よりも糖化、発酵の時間を短縮できると考えられる。

さらに、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのイネ変異体は、既に遺伝的に固定された系統であり、この種子を植えて自殖によって稔った種子は、全て同型質になる。
また、片親であるΔＢＥＩＩｂの種子が野生型に比べて６割程度であるのに対し、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂのイネ変異体は、二つの酵素を欠失しているにもかかわらず、種子重量は８割以上を維持しており、稔性、生育も野生型と遜色ない。すなわち、農業的形質に低下がみられず、農業形質が維持されている。さらに、遺伝子組換体ではないので、一般の水田に植えることが可能であり、大規模栽培も可能である。

以上のように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の製造方法においては、類い希な高アミロース澱粉をもつジャポニカ米品種のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）変異体およびその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉およびその製造方法を得ることができる。さらに、本発明は、当該澱粉を利用する飲食品及び工業製品に用いることができる。

以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。

（ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂが欠損した二重変異体の単離）
ＳＳＩＩＩａ変異体とＢＥＩＩｂ変異体を交配することで、二重変異体を作出し、その性質を調べた。

以下で、図９を参照して二重変異体の交配について説明する。本発明の発明者らは、ＢＥＩＩｂ変異体であるＥＭ１０（白濁種子）にＳＳＩＩＩａ変異体（心白種子）であるｅ１を交配し、交配当代のＦ１種子を次年度に播種し、Ｆ２種子を得た。この中には、白濁種子が約２５％含まれていた。次年度に白濁種子を播種し、その後、ＳＳＩＩＩａ遺伝子が劣性ホモである種子をＰＣＲ法（非特許文献４参照）で選抜した。これらの登熟種子から得た可溶性画分のＳＳＩＩＩａ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）およびＢＥＩＩｂタンパク質の有無をウエスタンブロッティング法を用いて検討した（図９参照）。これにより、ＳＳＩＩＩａ活性とＢＥＩＩｂタンパク質の両方の欠損が認められたクローンを得て、＃４０１９のクローンと名付けた。なお、ＢＥＩＩｂタンパク質の欠損は、即ちＢＥＩＩｂ活性の欠損を意味する。

具体的に、ＳＳＩＩＩａ活性およびＢＥＩＩｂタンパク質の検出は、非特許文献２に記載の方法に従って、以下のように行った。
開花後１０〜１５日くらいの登熟種子１粒のもみ、胚、果皮を除去し、３倍体積の抽出バッファー［５０ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）、１２．５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、８ｍＭの塩化マグネシウム、５００ｍＭの２−メルカプトエタノール］を加え、マイクロチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［０．３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１％のブロモフェノールブルー、５０％のグリセロール］を１／２体積加えて電気泳動に用いた。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法の電気泳動にはグルコシルトランスフェラーゼ反応に必要なプライマーとしてカキグリコーゲンを６０℃で溶かし込んだ７．５％のアクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから６０分で電流を止めた。
その後、基質であるＡＤＰグルコースを除いた反応液［クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＣｉｔｒａｔｅ−Ｎａ、１００ｍＭのＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＡＤＰグルコース］で２回洗浄し（各１５分）、ＡＤＰＧを加えて２０時間、３０℃でシーソーで反応させた。反応後、ヨード・ヨードカリ液（１％のＫＩ／０．１％のＩ２）で染色した。
ウエスタンブロッティングのためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動には、０．１％のＳＤＳを含んだ７．５％のアクリルアミドゲルを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル上に分離されたタンパク質を転写するためのメンブレン（ＰＶＤＦ膜）１枚と、ろ紙６枚とをゲルとほぼ同じ大きさに切断し、メンブレンは１００％ ｍｅｔｈａｎｏｌに一度浸してから、ろ紙はそのまま、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ （２５ｍＭ ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ＳＤＳ）に３０分以上浸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒの入ったプラスチックケースに移して１５分間浸とうした。ブロッティング用電極の陽極側にｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙を３枚泡が入らないように重ね、その上にメンブレンを泡が入らないように重ね、次にゲルを泡が入らないように重ね、更にろ紙３枚を泡が入らないように重ねた。上部電極板（陰極）をセットし、１０ Ｖにて１時間、通電した。１時間後、通電を止めてメンブレンをプラスチック容器に移し、ＴＢＳＴ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で浸とうしながら１５分間メンブレンを洗浄した。その後ＴＢＳ（１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）で浸とうしながら５分間洗う作業を２回行った。ＴＢＳを除き、３％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳを入れて１時間浸とうした。１時間後、３％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳを除き、１％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳと共に１次抗体（抗ＢＥＩＩｂ血清（非特許文献７）を１％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳで１０００倍希釈したもの）を添加して一晩ゆっくり浸とうさせた。翌日、メンブレンをＴＢＳＴ２で１５分間ずつ３回洗い、ＴＢＳで５分間ずつ３回洗った。ＴＢＳを除き１％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳと共に２次抗体（抗ウサギ血清（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を１％ ｇｅｒａｔｉｎ／ＴＢＳで２０００倍希釈したもの）を添加して約６時間ゆっくり浸とうさせた。その後メンブレンをＴＢＳＴ２で１５分間ずつ３回洗い、ＴＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。ＴＢＳを除き、発色液（４−ｃｈｌｒｏ−１−ｎａｐｈｔｏｌ １５ｍｇをｍｅｔｈａｎｏｌ ５ｍｌに溶かしてからＴＢＳ ２０ｍｌを加えてよく混ぜ、使用直前にＨ₂Ｏ₂ ２５μｌを加えたもの）を加えてしばらく浸し、メンブレンを蒸留水で十分に洗浄した後よく水分をふき取り乾燥させた。
以上のようにして、ΔＳＳＩＩＩａ／ΔＢＥＩＩｂの系統を確立できた。

〔ＲＶＡおよび動的粘弾性等の測定〕
（ラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ）による熱糊化粘度特性の測定）
精製した胚乳澱粉の水分含量を赤外線水分含量測定器（ザルトリウス・メカトロニクス・ジャパン株式会社製、ベーシック水分計ＭＡ１５０）で測定し、実質の乾燥重量が２．５ｇになるように計算し、ＲＶＡ用アルミカップに測りとる。これに合計２５．０ｇになるように蒸留水を加えた。
プラスチック製の羽を入れ、ＲＶＡ（フォスジャパン社製、ＲＶＡ３Ｄ）で粘度特性値を測定した。温度プログラムは、図６に示したような温度（℃）にて行った。これは、非特許文献４に記載の方法と同様である。
測定終了後、澱粉糊の入ったＲＶＡ用アルミカップの重量を秤量し、蒸発した分の蒸留水を加えて試料の重量を補正した。再度、ＲＶＡ（フォスジャパン社製、ＲＶＡ３Ｄ）にアルミカップを装着し、３５℃で１０分間だけ撹拌して粘度特性値を測定した。

（動的粘弾性測定装置による澱粉糊の貯蔵弾性率及び損失弾性率の測定）
ＲＶＡ測定で調製した澱粉糊を動的粘弾性測定装置（サーモサイエンティフィック・ハーケ製、ＭＡＲＳ）の３０℃に制御した下部円板にのせ、直径３５ｍｍのチタン製上部平行円板で間隙を１．００ｍｍとなるように挟み込んだ。事前にひずみ依存性測定にて各糊試料の線形範囲を求め、弾性限界の８０％に相当するひずみ（振幅）を角速度（周波数）が毎秒１．０ｒａｄで印加して、３０℃〜４℃の範囲において毎分１℃で温度下降時の貯蔵弾性率を測定した。

（走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による澱粉粒の観察）
精製した胚乳澱粉を銀製両面テープを貼り付けた真鍮製ステージの上に貼り付け、金蒸着した。
ＳＥＭ（ＩＥＴ社製、Ｊｅｏｌ ５６００）で１０００倍および４０００倍に拡大して観察した。具体的には非特許文献４に記載の方法に従って観察を行った。

（Ｘ線回折装置による胚乳澱粉の結晶性の観察）
精製した胚乳澱粉０．５ｇを蒸留水の入った密封容器の中で、２４時間１００％湿度にさらした。
その後、深さ０．５ｍｍのスリットに澱粉を貼り付けて、Ｘ線回折装置（理学ＲＩＮＴ２０００）で２θ＝４〜４０°の回折パターンを検出した。
具体的には、非特許文献４に記載の方法に従って同様に観察を行った。

（澱粉の精製方法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ ２８：２４１−２４４（１９８１））を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍｌ加えて一晩４℃で放置した。
翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍｌ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。

（澱粉からのアミロペクチンの精製方法）
アミロペクチンの精製法は、ブタノール沈殿法（例えば、「Ｓｃｈｏｃｈ ＴＪ （１９５４） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３：５−６」を参照）を用いた。フラスコに精製澱粉１ｇを量りとり、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を１００ｍｌ加えよく攪拌した。フラスコにＮ₂を充填しフラスコ内の空気とＮ₂と置換した。Ｎ₂を充填しつつ、８０〜８５℃で２時間ゆっくりで攪拌した。温度を６０℃まで徐々に下げ、エタノール５００ｍｌを加えフラスコの口をラップで閉じ、４℃で一晩置いた。５０ｍｌチューブに移し、２，０００ Ｇ、５℃、１５ｍｉｎで遠心分離して沈殿を集め、フラスコに移した。沈殿にＤＭＳＯ １００ｍｌ加え攪拌し、同様の方法でＮ₂を充填し８０〜８５℃で２時間ゆっくり攪拌した。反応後、４℃で一晩置いた。これを５０ｍｌチューブに移し、２，０００ Ｇ、５℃、１５ｍｉｎで遠心分離した。６０℃の蒸留水１７０ｍｌで沈殿を溶かし、フラスコに移した。Ｎ₂を充填しながら７０〜８０℃でゆっくり攪拌し、沈殿を溶かした。フラスコにｎ−ブタノール（ｎ−Ｂｕｔｙｌ Ａｌｃｏｈｏｌ）、イソミルアルコール（３−Ｍｅｔｈｙｌ−１−Ｂｕｔａｎｏｌ）をそれぞれ１０ｍｌ加え、８０℃で３時間ゆっくり攪拌した。温度を６０℃まで徐々に下げ、フラスコの口をラップで閉じ、発泡スチロール容器にいれ、常温で一晩置いた。翌日発泡スチロール容器を４℃冷蔵庫に移し、二日間置いた。溶液をよく攪拌し、５０ｍｌチューブに移し８，５００ Ｇ、５℃、２０ｍｉｎで遠心分離した。沈殿に２０ｍｌエタノールを加え、乳鉢で細かくすりつぶした。溶液を５０ｍｌチューブに移し２，０００ Ｇ、５℃、１０ｍｉｎで遠心分離を行った。上清を捨て、エタノール２０ｍｌを加えて攪拌し、同様の条件で遠心分離した。上清を捨て、アセトン２０ｍｌを加えて攪拌し、同様の条件で遠心分離した。これをもう一度くり返した。上清を捨て、ジエチルエーテル２０ｍｌを加えて攪拌し、同様の条件で遠心分離した。これをもう一度くり返した。上清を捨て、チューブのふたにキムワイプをかぶせ輪ゴムで固定し、沈殿をドラフトチャンバー内で自然乾燥させた。乾燥サンプルは使用するまで−３０℃で保存した。

（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉およびアミロペクチン２２．５ｍｇに蒸留水０．２５ｍｌ加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍｌ加えて３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．２６ｍｌを加え、５ＮのＨＣｌを９０μｌ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を５ｍｌ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μｌ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、４０℃で２４時間揺らしながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍｌ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍｌ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍｌ加えて、５℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。

使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００×２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００×２０ｍｍ）３本（両カラムともＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍｌずつ分取し、６８本に分画し、各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλ ｍａｘを求めた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＴＯＳＯＨ ＲＩ８０２０）で検出した。

（鎖長分布解析）
鎖長分布解析について、図２を参照して説明する。
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末を用いた。
各々に５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍｌ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μｌ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水を１０８９μｌ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μｌ、２％のアジ化ナトリウムを１５μｌ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所）を２μｌ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。
次に、イソアミラーゼを２μｌ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。
次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９４、２０５−２１３（１９８１）参照）の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液［２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸］を２μｌ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液［１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン］を２μｌ添加し、５５℃で９０分間反応させた。
分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒｓ）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌｅ ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌｅ ％）のグラフを作成した。

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明は、イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）活性と、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の活性とが低下したイネ変異体を提供でき、このイネ変異体の澱粉はイネでは類い希な高アミロース澱粉であり、産業上利用可能である。

Claims (16)

1. イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）及びイネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されている
   ことを特徴とするイネ変異体。
2. 更に、ＳＳＩＩＩａ活性及びＢＥＩＩｂ活性が野生型に比べて低下した
   ことを特徴とする請求項１に記載のイネ変異体。
3. 野生型、ＳＳＩＩＩａの遺伝子座が劣性の親系統、又はＢＥＩＩｂの遺伝子座が劣性の親系統と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイネ変異体。
4. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイネ変異体を用いた
   ことを特徴とする澱粉の製造方法。
5. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイネ変異体の胚乳を用いた
   ことを特徴とする澱粉の製造方法。
6. 請求項４又は５に記載の澱粉の製造方法により製造された
   ことを特徴とする澱粉。
7. 野生型イネ、ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉とは形状が異なる
   ことを特徴とする請求項６に記載の澱粉。
8. 前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、大きさに差異のある澱粉粒が含まれ、該大きさに差異のある澱粉粒の表面がなめらかである
   ことを特徴とする請求項６又は７に記載の澱粉。
9. 前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なる
   ことを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の澱粉。
10. 前記野生型イネ、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ、又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、糊化粘度特性が異なる
    ことを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載の澱粉。
11. 前記澱粉は、アミロースの割合が４０％以上である
    ことを特徴とする請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の澱粉。
12. 前記澱粉のアミロペクチンは、Ｂ形結晶である
    ことを特徴とする請求項６乃至１１のいずれか１項に記載の澱粉。
13. 前記澱粉の糊化粘度パターンが低粘度である
    ことを特徴とする請求項６乃至１２のいずれか１項に記載の澱粉。
14. 前記澱粉は、前記ＳＳＩＩＩａの活性低下に起因する親系統イネ又は前記ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、老化性が高い
    ことを特徴とする請求項６乃至１３のいずれか１項に記載の澱粉。
15. イネスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体と
    イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）変異体との二重劣性ホモである
    ことを特徴とするイネ変異体の製造方法。
16. 請求項１５に記載のイネ変異体の製造方法により製造する
    ことを特徴とするイネ変異体。

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